超解像顕微鏡
【課題】ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供する。
【解決手段】ポンプ光光源３１からのポンプ光とイレース光光源３２からのイレース光とを、光学系７２により一部重ね合わせて試料７４に集光して走査手段５２，５３により走査し、試料７４からの光応答信号を検出手段５８で検出する超解像顕微鏡において、ポンプ光光源３１から出射されるポンプ光と、イレース光光源３２から出射されるイレース光とを、光ファイバ３５により同軸上に結合する。
【解決手段】ポンプ光光源３１からのポンプ光とイレース光光源３２からのイレース光とを、光学系７２により一部重ね合わせて試料７４に集光して走査手段５２，５３により走査し、試料７４からの光応答信号を検出手段５８で検出する超解像顕微鏡において、ポンプ光光源３１から出射されるポンプ光と、イレース光光源３２から出射されるイレース光とを、光ファイバ３５により同軸上に結合する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡、より詳しくは、ある波長の１色目の光を試料に照射して、その試料内の分子を基底状態から別の量子状態に遷移させ、さらに１色目の波長と異なる２色目の光を試料に照射して、試料が発する各種光応答を観測する光学顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１６〜図１９を参照して説明する。図１６は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１６に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１７に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１８に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１９に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１７の吸収過程や図１９の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１７のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１８のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１８の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１６に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図２０は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図２０はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図２０に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図２１は、図２０と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図２１において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図２１の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光と呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
図２２は、従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１１０、スキャンユニット１３０および顕微鏡ユニット１５０からなっている。
【００１８】
光源ユニット１１０は、例えば波長５３２ｎｍのコヒーレント光であるポンプ光を出射するＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１１と、波長６４７ｎｍのコヒーレント光であるイレース光を出射するＫrレーザ１１２と、イレース光空間変調用の位相板１１３と、イレース光およびポンプ光を融合させるためのビームコンバイナ１１４とを有している。位相板１１３は、図２３に示すように、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜が蒸着されている。図２３では、光軸の周りに独立した４領域を有し、イレース光波長に対して４分１ずつ位相が異なっている。この位相板１１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００１９】
スキャンユニット１３０は、光源ユニット１１０から出射される同じ光学軸を共有するポンプ光とイレース光とを、ハーフミラー１３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー１３２および１３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット１５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット１５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフミラー１３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１３４、ピンホール１３５、ノッチフィルタ１３６および１３７を経て光電子増倍管１３８で受光するようになっている。図２２では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー１３２，１３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１３６および１３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２０】
顕微鏡ユニット１５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット１３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフミラー１５１で反射させて、対物レンズ１５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１５３上に集光させると共に、観察試料１５３で発光した蛍光を、再び対物レンズ１５２でコリメートしてハーフミラー１５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット１３０に戻すと同時に、ハーフミラー１５１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００２１】
この超解像蛍光顕微鏡によると、観察試料１５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは対物レンズ１５２の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびイレース光をスキャンユニット１３０で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の２次元蛍光像を得ることができる。
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
ところが、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡にあっては、特に、ポンプ光とイレース光との光学調整に関して、以下に説明するような問題がある。
【００２３】
すなわち、通常のレーザ走査型顕微鏡では、単一波長のレーザ光を、システムの光軸を目安に合わせ込めばよいが、超解像蛍光顕微鏡では、対物レンズの結像面においてポンプ光の中心部とイレース光の中心部とを合わせることで、集光したポンプ光の辺縁部の蛍光を消去することが最大のキーテクノロジーであり、もし、ポンプ光およびイレース光の集光位置がずれると、ポンプ光の中央部の蛍光も消去してしまい、結果として全体の蛍光強度が低下するだけで、空間分解能は一向に向上せず、Ｓ／Ｎだけが悪くなるという極めて好ましくない状況になる。
【００２４】
そこで、従来の超解像蛍光顕微鏡では、ポンプ光とイレース光とを独立の光学系で個別に調整して、ポンプ光およびイレース光の集光位置を対物レンズの焦点に正確に合わせるようにしている。
【００２５】
しかし、ポンプ光およびイレース光を回折限界まで絞り込んだサイズは、数１００ｎｍで、その位置合わせ精度は、少なくとも１００ｎｍのオーダーを上回ことになるため、ポンプ光およびイレース光の集光位置を個別に調整して対物レンズの焦点に正確に合わせることは極めて困難である。
【００２６】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、上記イレース光光源から出射されるイレース光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００２８】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバは、上記イレース光に対してシングルモードが励磁できるコア径を有することを特徴とするものである。
【００２９】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、それぞれ強度変調する独立した強度変調手段を有することを特徴とするものである。
【００３０】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の超解像顕微鏡において、上記強度変調手段は、電気光学変調素子または音響光変調素子を有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項５に係る発明は、請求項３または４に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光の強度変調手段と上記イレース光の強度変調手段とが、独立して制御されることを特徴とするものである。
【００３２】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光およびイレース光を、上記光学系の有効瞳径のサイズに平行光とするコリメータレンズを有することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項７に係る発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、独立して光軸調整する偏向手段を有することを特徴とするものである。
【００３４】
請求項８に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有することを特徴とするものである。
【００３５】
請求項９に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とするものである。
【００３６】
請求項１０に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有すると共に、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有し、
上記分光素子は、上記光学系の有効瞳面内で光軸対称な分光特性を有しており、上記空間変調手段および上記分光素子の光軸中心が一致していることを特徴とするものである。
【００３７】
請求項１１に係る発明は、請求項８または１０に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子の分光領域は、光軸に対して同心円状に分割されていることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項１２に係る発明は、請求項８、１０または１１に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子は、光学多層膜からなることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項１３に係る発明は、請求項９または１０に記載の超解像顕微鏡において、上記空間変調手段は、イレース光に対して透明な光学基板にエッチングまたは光学薄膜をコートして構成されていることを特徴とするものである。
【００４０】
請求項１４に係る発明は、請求項１０に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子および上記空間変調手段は、同一の基板に形成されていることを特徴とするものである。
【００４１】
請求項１５に係る発明は、請求項１４に記載の超解像顕微鏡において、上記基板の一方の表面に上記分光素子が形成され、他方の表面に上記空間変調手段が形成されていることを特徴とするものである。
【００４２】
請求項１６に係る発明は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光は、それぞれ波長が固定であることを特徴とするものである。
【００４３】
請求項１７に係る発明は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれガスレーザ、イオンレーザあるいは固体レーザのいずれかであることを特徴とするものである。
【００４４】
請求項１８に係る発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれ連続発振レーザであることを特徴とするものである。
【００４５】
請求項１９に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１の光源から出射される第１のコヒーレント光と、上記第２の光源から出射される第２のコヒーレント光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００４６】
以下、本発明の超解像顕微鏡における特徴的構成について、図１を参照して説明する。図１は、超解像顕微鏡の光源ユニットの構成を示すもので、第１の光源であるポンプ光光源１からの第１のコヒーレント光であるポンプ光、および第２の光源であるイレース光光源２からの第２のコヒーレント光であるイレース光は、それぞれ強度変調手段３および４で強度変調されて擬似パルス化された後、光ファイバである分岐ファイバ５の２つの入射端から入射されて、１つの出射端から光結合されて出射される。この分岐ファイバ５で光結合されて出射されるポンプ光およびイレース光は、コリメータレンズ６で平行ビームにされた後、分光素子８および空間変調手段９を経てイレース光のみが空間変調されて、図２２で示したようにスキャンユニットを経て顕微鏡ユニットに導かれて観察試料に照射される。
【００４７】
ここで、本発明の超解像顕微鏡における第１の特徴的構成は、分岐ファイバ５からなる光ファイバを具える点にある。具体的には、分岐ファイバ５として、イレース光波長に対してシングルモードのみを励磁ができる、所謂シングルモードファイバを用いて、この分岐ファイバ５の２つの入射端にイレース光およびポンプ光を光学的に導入して光結合する。すなわち、この分岐ファイバ５は、イレース光に対してシングルモードのみを励磁できるように、コア径が設定されている。したがって、分岐ファイバ５から出射されるイレース光は、完全に球面波となる。これに対し、ポンプ光は、高次のモードが励磁される可能性もあるが、一般に、超解像顕微鏡の場合には、蛍光光励起用のポンプ光の波長が、イレース光の波長よりも若干（１割から２割）短い程度であるので、高次のモード成分は極め少なく、分岐ファイバ５から出射されるポンプ光も、ほぼ球面波と見なすことができる。
【００４８】
したがって、分岐ファイバ５から光結合されて出射されるイレース光およびポンプ光を、色収差の無い同じコリメータレンズ６で平行ビームにすれば、それらの光は光軸が完全に同軸に調整された完全な均一波面を有するものとなる。しかも、この平行ビームを、顕微鏡対物レンズで集光すれば、ポンプ光とイレース光との集光点をミクロンメータ領域で３次元空間の一点に完全に一致させることができる。このように、分岐ファイバ５を用いることで、従来のようにポンプ光とイレース光とを独立の光学系で個別に調整する場合に比べて、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現することが可能となる。
【００４９】
次に、本発明の超解像顕微鏡における第２の特徴的構成は、分光素子８とイレース光に関する空間変調手段９とを具える点にある。すなわち、本発明では、前述のような分岐ファイバ５の使用を前提としているので、同軸となったイレース光およびポンプ光のうちイレース光のみを空間変調する必要ある。具体的には、イレース光により蛍光領域を効果的に消去し、空間分解能を向上させるために、中空状のビームに整形する必要がある。その一方で、ポンプ光に関しては、ビーム整形を受けず、試料面で１点に集光することが不可欠である。
【００５０】
分光素子８は、例えば図２に示すように構成され、空間変調手段９は、例えば図３に示すように構成される。図２に示す分光素子８は、少なくとも平面基板に異なる分光特性をもつ２つの領域８Ａ，８Ｂを有しており、領域８Ａはポンプ光を透過せず、イレース光のみを透過させ、領域８Ｂは、反対にポンプ光を透過させて、イレース光は透過させない分光特性を有している。これらの領域８Ａ，８Ｂ、具体的には、光学多層膜で形成される。
【００５１】
このように分光素子８を構成すると、例えば、領域８Ａでは、ポンプ光が直入射の条件で干渉により反射され、イレース光は干渉条件を満たさず透過することになる。また、領域８Ｂでは、イレース光が直入射の条件で干渉により反射され、ポンプ光は干渉条件を満たさず透過することになる。例えば、図２に示すように、領域８Ａ，８Ｂを同心円状にパターン化し、同軸のポンプ光とイレース光とを透過させると、イレース光は中央部の円形の領域８Ａを通過し、ポンプ光は外側の輪帯状の領域８Ｂを通過する。したがって、この分光素子８の後段に、図３に示すように、イレース光と同じビーム径を有し、光軸の周りにイレース光波長に対してπ／２ずつ位相差を与える独立した４領域を有する位相板からなる空間変調手段９を配置してイレース光を空間変調すれば、外側のポンプ光を空間変調することなく、イレース光のみをビーム整形することができる。
【００５２】
一方、ポンプ光は、輪帯状のビームであるが、これを顕微鏡対物レンズで集光すると、ｘ−ｙ結像面における波長λのポンプの強度プロファイルは、ベッセルの１次関数Ｊ1(z)を用いて下記のように表される。
【００５３】
【数１】
【００５４】
ここで、ρは、図４に示すように、ポンプ光の瞳面動径方向における輪帯部の遮光率を示し、輪帯瞳の内径（半径）をｒ、外径（半径）をＲとするとき、ρ＝ｒ／Ｒ、で表される。
【００５５】
図５は、顕微鏡対物レンズによるポンプ光の結像面における強度プロファイルを示すもので、太線は輪帯状のビームの強度プロファイルを示し、細線は通常の円状のビームにおける強度プロファイルを示している。図５から明らかなように、輪帯状のポンプ光は、多少サイドローブに弱いピークをもつが、通常の円状のビームとは異なり、光軸中央で強いピークをもつ。したがって、このようなポンプ光を試料面に集光させると、蛍光を発するポンプ光辺縁部にて蛍光が抑制されるため、蛍光スポットはポンプ光の回折限界以下のサイズ、すなわち超解像サイズになる。このように工夫された分光素子８と空間変調手段９とを用いることで、ポンプ光とイレース光とを完全同軸で光学調整できるので、従来の超解像顕微鏡と比較すると格段にシステム調整作業が容易になる。
【００５６】
さらに、本発明の超解像顕微鏡における第３の特徴的構成は、ポンプ光光源１からのポンプ光およびイレース光光源２からのイレース光を、それぞれ強度変調して擬似パルス化する強度変調手段３および４を具える点にある。すなわち、従来は、ポンプ光光源１およびイレース光光源２として、パルスレーザ等を用いたが、本発明では、発振が安定な例えばイオンレーザやガスレーザあるいは固体レーザ等の連続発振（ＣＷ）レーザを用い、そのレーザ光を音響光学素子や電気光学素子を有する強度変調手段により強度変調して疑似パルス化する。
【００５７】
ここで、音響光学素子とは、音波が光に及ぼす効果（例えば、偏向、回折、変調、位相シフト、周波数シフト、複屈折など）を利用したものである。この音響光学素子では、音波により光学的な屈折率を音速の周期で変動させ、その際に音と光の波長によって、以下の３種類の効果が現れる。
【００５８】
１）音の波長が長いときは、十分に細い光束を音の進行方向と直角方向に通すと、屈折率勾配が生じて光線が湾曲し、音の周波数で光線が偏向走査される。
２）音の波長が短くなると、音波は光束に対して回折格子として作用する。
３）音の波長が更に短くなって、光の波長オーダになると、垂直入射では回折が生じなくなり、特定の入射角において強いブラッグ回折を起す。
【００５９】
周波数ｆの音波によるｍ次の回折光は、ドプラー効果によりｍｆだけ、その周波数をずらす。また、その回折角θｍは、光の波長をλ、音波の波長をΛとすると、sinθｍ＝ｍλ／Λ、で与えられる。
【００６０】
レーザ光偏向や変調に用いる音響光学変調器は、この効果を応用したもので、図６はその原理的構成を示している。図６に示すように、音響光学変調器１１は、音響光学素子１２に圧電素子１３を接着して構成され、圧電素子１３により超音波を発生させて音響光学素子１２を伝播させ、その状態で音響光学素子１２に光を入射させることにより、入射光を回折させるもので、図６はブラッグ反射による回折を示している。この音響光学変調器１１は、音響光学素子１２として、例えばＰｂＭｏＯ４やＴｅＯ２結晶を用いれば、１０ＭＨｚ帯域まで変調が可能である。
【００６１】
また、電気光学素子は、物質に外部から電場を印加したときに、その物質の屈折率が変化する現象を利用したもので、その際の屈折率の変化が印加電場に比例する場合をポッケルス効果と言われている。圧電結晶では、印加電場の周波数が圧電共鳴周波数より小さいときは、圧電効果による結晶の弾性変形が印加電場の変化に追従して、弾性変形による屈折率の変化が同時に起きる。一方、周波数が高い場合には、圧電結晶の弾性変形が追従できず、この場合を束縛状態の電気光学効果と呼ばれる。この電気光学効果は、光の強度変調に応用できる。
【００６２】
図７は、電気光学素子を用いた電気光学変調器の原理的構成を示すものである。この電気光学変調器１５は、ポッケルス効果を利用したポッケルスセルで、光の入射側から出射側に向けて順次に配置された偏光子１６、電気光学素子１７、１／４波長板１８、および検光子１９を有しており、偏光子１６と検光子１９とは偏光軸が直交している。電気光学素子１７は、ＫＤＰ（リン酸二水化カリウム）等のポッケルス効果の大きい圧電結晶を用い、この圧電結晶に電極（図示せず）を介して電源２０を選択的に接続することにより電場を印加する。電源２０の接続方法すなわち電場の印加方法には、光の進行方向と直角方向に印加する横型光強度変調法と、平行に電場を印加する縦型光変調方法とがある。図７は、縦型光変調方法の場合を示しており、この場合には電気光学素子１７の入射端面および出射端面に、光路を遮らないように、リング状の電極や透明電極を設けて電源２０を選択的に接続するようにしている。
【００６３】
図７に示す電気光学変調器１５において、電気光学素子１７の圧電結晶が一軸性結晶の場合には、電源２０により光軸方向に電場を印加すると複屈折を生じ、偏光子１６を経て電気光学素子１７に入射した直線偏光は楕円偏光に変換されて、１／４波長板１８を経て検光子１９に入射し、検光子１９の偏光軸方向の成分が透過することになる。これに対し、電気光学素子１７に電場を印加しない状態では、電気光学素子１７は一軸性で光は全く透過しない。このように、電気光学素子１７に選択的に電場を印加することにより、入射光を変調でき、例えばナノ秒オーダの光スイッチングが可能となる。
【００６４】
上記の音響光学変調器１１または電気光学変調器１５を、ＣＷレーザの光路に挿入して電気的に制御することにより、超解像顕微鏡システムと相応しいパルス光源を実現する。これにより、Ｈｅ・Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ、Ｋｒレーザ、Ｔｉサファイアレーザ等のＣＷレーザの優れたビーム品質を保持したまま、パルス化が可能となる。しかも、電気的制御により任意の発振周波数を選ぶことができるので、例えばポンプ光とイレース光とのパルス発振のタイミングおよびパルス幅を電気的に簡便に制御でき、これにより超解像顕微鏡の基礎をなす蛍光抑制効果を効率的に誘起することが可能となる。
【００６５】
特に、本発明では、強度変調手段をレーザ光源と光ファイバとの間に挿入することにより、強度変調手段で発生する波面のゆがみをシングルモードしか励磁できない光ファイバで除去できるので、超解像効果を効率的に発現させることが可能となる。その結果、超解像性も向上し、分解能において差別化された高機能な顕微鏡を提供することが可能となる。また、既にレーザ走査型顕微鏡システムにおいて幅広く導入され、実績も高いＨｅ・Ｎｅレーザ等のガスレーザの利用も可能となり、より実用面において優れたユーザーフレンドリーな顕微鏡システムを提供することが可能となる。
【００６６】
以上の３つの特徴的構成を上手く組み合わせることで、今まで類を見ないシステム調整が可能な超解像顕微鏡を実現することができ、製品の組み立て工程の簡素化と簡略化、さらには製品導入の現場におけるメンテナンスにおいて、限りない利便性を提供することができる。
【発明の効果】
【００６７】
本発明によれば、ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、イレース光光源から出射されるイレース光とを、位置安定性および波面の均一性に優れた光ファイバを用いて同軸上に結合するようにしたので、ポンプ光およびイレース光の波面の均一性を保ちつつ、これらの光の光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下、本発明による超解像顕微鏡の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００６９】
（第１実施の形態）
図８は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。本実施の形態の超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット３０、スキャンユニット５０および顕微鏡ユニット７０からなっている。
【００７０】
光源ユニット３０は、第１のコヒーレント光であるＣＷのポンプ光を発生する第１の光源であるポンプ光光源３１と、第２のコヒーレント光であるＣＷのイレース光を発生する第２の光源であるイレース光光源３２と、ポンプ光光源３１からのＣＷのポンプ光を擬似パルス化する強度変調手段であるＫＤＰ結晶からなる電気光学変調器（ＥＯＭ）３３と、イレース光光源３２からのＣＷのイレース光を擬似パルス化する強度変調手段であるＫＤＰ結晶からなるＥＯＭ３４と、ＥＯＭ３３，３４でそれぞれ擬似パルス化されるポンプ光およびイレース光を同軸上の光結合して出射する光ファイバである分岐ファイバ３５と、分岐ファイバ３５で光結合されて出射されるポンプ光およびイレース光を平行ビームに変換するコリメータレンズ３６と、このコリメータレンズ３６で平行ビームにされたポンプ光およびイレース光を分光する分光素子３８と、分光素子３８を経たイレース光のみを空間変調する空間変調手段３９とを有しており、この空間変調手段３９を経たポンプ光およびイレース光をスキャンユニット５０に入射させるようになっている。
【００７１】
以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される強い吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い電子励起状態（Ｓｎ）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、E.Sahar and D.Treves:IEEE,J.Quantum Electron.,QE-13,692(1977)参照）。
【００７２】
そこで、本実施の形態では、ポンプ光光源３１として、Ｎｄ：ＹＡＧ固体レーザを用い、その２倍波の波長５３２ｎｍの光をポンプ光とする。また、イレース光光源３２は、Ｋｒレーザを用いて、その波長６４７．１ｎｍの光をイレース光とする。
【００７３】
ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２から発生したポンプ光およびイレース光は、それぞれシングルモードファイバを介してＥＯＭ３３，３４に導入されて強度変調される。すなわち、ＥＯＭ３３，３４は、例えば独立のパルス発生器（図示せず）から所望のパルス幅と周期で電圧が印加され、これにより電圧印加時に電気光学効果により入射光が変調されてＥＯＭ３３，３４を通過することで、ポンプ光およびイレース光がそれぞれ擬似パルス光として出射される。なお、擬似パルス光の生成条件は、蛍光抑制効果が最適条件で誘起できるように、ＥＯＭ３３，３４に印加する電圧のパルス幅およびタイミングが調整されている。
【００７４】
ＥＯＭ３３，３４を通過したポンプ光およびイレース光は、分岐ファイバ３５に導入される。この分岐ファイバ３５は、その径が、イレース光に関してシングルモードが励磁される条件に設定されている。ポンプ光に対しては、若干径が大きいが、高次モードが励磁される確率は極めて低いので、分岐ファイバ３５を伝達できるポンプ光は、シングルモードと見なすことができる。この分岐ファイバ３５により、ポンプおよびイレース光は、同軸上に光結合されて、同じ点光源位置すなわち分岐ファイバ３５の出射端から球面波として出射される。
【００７５】
分岐ファイバ３５から出射されるポンプ光およびイレース光は、コリメータレンズ３６により完全に同軸でコリメートされる。なお、コリメータレンズ３６は、例えばダブレットレンズのように、ポンプ光およびイレース光の波長に対して色収差補正がなされており、それらのビーム径は、後述する顕微鏡ユニット７０内の対物レンズ７２の瞳径に一致している。本実施の形態では、その有効瞳径が８ｍｍとなっている。
【００７６】
コリメータレンズ３６でコリメートされたポンプ光およびイレース光は、分光素子３８および位相板からなる空間変調手段３９を順次通過する。分光素子３８は、図９に示すような平面構造からなっている。本実施の形態では、対物レンズ７２の有効瞳径すなわちビーム径が８ｍｍであるので、中央部の直径６ｍｍの領域３８Ａに、直入射するポンプ光（波長５３２ｎｍ）を反射させ、イレース光（波長６４７．１ｎｍ）は透過させる光学フィルタが形成され、残る外側の輪帯部の領域３８Ｂには、ポンプ光は透過させ、イレース光は反射させる光学フィルタが形成されている。なお、領域３８Ａ，３８Ｂの光学フィルタは、干渉性を高めるために、屈折率の異なる薄膜を交互に積層した光学多層膜としても良い。
【００７７】
空間変調手段３９は、イレース光のみを位相変調する位相板からなるもので、その中央部には、図１０に示すように、直径６ｍｍの円形領域に光軸の周りを１周すると連続的にイレース光を２π位相変調するエッチングパターンが形成されている。したがって、この空間変調手段３９をイレース光が透過すると、ビーム面内の光軸対称位置において、イレース光の位相差がπとなるので、集光すると光軸上の電場強度が相殺されて、超解像顕微鏡に相応しい中空ビームが得られる。
【００７８】
なお、図１０に示す空間変調手段３９は、石英基板からなっており、光軸の周りは８つの領域３９Ａ〜３９Ｈに等分割されて、イレース光の波長に対してλ／８ずつ段階的に位相差を与えるエッチングパターンが形成されている。より具体的には、化学エッチング法により、石英基板がエッチングされて光路長が制御されている。その具体的なエッチング深さを、表１に示す。
【００７９】
【表１】
【００８０】
この空間変調手段３９を通すことで、イレース光のみが光軸中央で光強度がゼロとなるように位相変調される。これに対し、輪帯状のポンプ光は、空間変調手段３９のエッチング部分の外側を通過するので、全く位相変調を受けることなく透過する。
【００８１】
分光素子３８および空間変調手段３９を透過したポンプ光およびイレース光は、スキャンユニット５０に入射する。
【００８２】
スキャンユニット５０は、ハーフミラー５１、２枚のガルバノミラー５２，５３、投影レンズ５４、ピンホール５５、ポンプ光およびイレース光を除去するノッチフィルタ５６，５７、光電子増倍管５８を有している。また、顕微鏡ユニット７０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、ハーフミラー７１、対物レンズ７２、接眼レンズ７３を有している。
【００８３】
光源ユニット３０からスキャンユニット５０に入射したポンプ光およびイレース光は、ハーフミラー５１を透過した後、２枚のガルバノミラー５２，５３により２次元方向に偏向されて顕微鏡ユニット７０に入射され、そのハーフミラー７１で反射されて対物レンズ７２により、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料７４に集光されて、試料面上で二次元走査される。なお、図８では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー５２，５３を同一平面内で揺動可能に示している。
【００８４】
一方、観察試料７４へのポンプ光およびイレース光の照射により、観察試料７４から発光した蛍光は、入射レーザ光とは逆の光路を辿って、スキャンユニット５０のハーフミラー５１に入射して、該ハーフミラー５１で反射される。このハーフミラー５１で反射された蛍光は、投影レンズ５４で集光されてピンホール５５を透過し、ノッチフィルタ５６，５７によりポンプ光およびイレース光が除去されて光電子増倍管５８で受光される。なお、ピンホール５５は、観察試料７４上の集光点と共焦点位置に設置され、これにより空間フィルタ機能と同時に、観察試料１０内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを透過させる３次元空間分解機能を果たすようなっている。光電子増倍管５８から得られる蛍光信号データは、ガルバノミラー５２，５３の走査に同期させて、コンピュータ内のメモリに格納することにより、観察試料７４の２次元蛍光顕微像が得られる。なお、顕微鏡ユニット７０のハーフミラー７１を通過した光は、接眼レンズ７３により結像され、これにより蛍光スポット像を直接観察でき、観察位置の調整や、ピント合わせ等に利用できるようになっている。
【００８５】
以上のように、本実施の形態では、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２としてそれぞれＣＷレーザを用い、これらＣＷレーザからのポンプ光およびイレース光を、ＫＤＰ結晶からなるＥＯＭ３３，３４により擬似パルス化している。ここで、ＫＤＰ結晶は、入力電気パルスに対する立ち上がり時間応答が５nsec程度であるので、ナノ秒パルスレーザと同等のパルス幅で、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数を得ることができる。
【００８６】
ここで、ＥＯＭ３３，３４によるポンプ光およびイレース光の擬似パルス化は、図１１に示すように、イレース光のパルス幅がポンプ光のそれより長くなるように設定している。これにより、時間領域でのポンプ光とイレース光との重複が確実となり、蛍光抑制効果を確実に誘導することができる。そのためには、好ましくは、上述したようにＥＯＭ３３，３４を独立したパルス発生器で制御して、ポンプ光およびイレース光の擬似パルスの位相および周波数を調整する。特に、位相に関しては、ＫＤＰ結晶の個体差により、数ナノ秒程度の変調時の位相差が発生するで、対応するパルス発生器により蛍光抑制効果の発現を最適化する。
【００８７】
なお、本実施の形態では、強度変調手段としてＥＯＭ３３，３４を用いて、それぞれＣＷレーザからなるポンプ光光源３１およびイレース光光源３２からのポンプ光およびイレース光を強度変調して擬似パルス化したが、強度変調手段としてＥＯＭ３３および／または３４に代えて、音響光学素子を利用して擬似パルス化することもできる。例えば、音響光学素子としてＴｅＯ２結晶を用いれば、耐レーザしきい値も高いので、比較的強度の高いイレース光も確実に擬似パルス化することができる。
【００８８】
（第２実施の形態）
図１２は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。本実施の形態は、光源ユニット３０の構成が第１実施の形態と異なり、その他の構成は第１実施の形態と同様であるので、第１実施の形態と同様の作用をなす部材には同一参照符号を付してその説明を省略する。
【００８９】
本実施の形態では、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２として、それぞれパルスレーザを用いている。ここで、第１実施の形態と同様に、ローダミン６Ｇで染色された生体試料７４を観察する場合には、ポンプ光光源３１として、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザを用い、その２倍波の波長５３２ｎｍのコヒーレント光をポンプ光とする。また、イレース光光源３２は、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザを用い、その基本波長１０６４ｎｍのコヒーレント光をイレース光とする。したがって、この場合、イレース光は近赤外領域におけるローダミン６Ｇの二重共鳴吸帯を用いて蛍光抑制を行うことになる。
【００９０】
ポンプ光光源３１から出射されたポンプ光は、偏向ミラー４１ａ，４１ｂおよび集光レンズ４２を経てハーフミラーキューブ等のビームコンバイナ４３に入射される。また、イレース光光源３２から出射されたイレース光は、同様に、偏向ミラー４４ａ，４４ｂおよび集光レンズ４５を経てビームコンバイナ４３に入射され、このビームコンバイナ４３でポンプ光と同軸に結合される。ビームコンバイナ４３で結合されたポンプ光およびイレース光は、イレース光に対してシングルモードを励磁する光ファイバ４６を透過した後、コリメータレンズ３６により平行ビームに変換され、さらに、分光素子４７および位相板からなる空間変調手段４８を経てスキャンユニット５０に入射される。その他の構成および作用は、第１実施の形態と同様である。
【００９１】
すなわち、本実施の形態では、第１実施の形態の分岐ファイバを用いず、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２に対して独立に設けられた２枚の１組の偏向ミラー４１ａ，４１ｂ、４４ａ，４４ｂにより、ポンプ光およびイレース光が、共通の１本の光ファイバ４６に直接導入される。詳しくは、ポンプ光およびイレース光は、偏向ミラー４１ａ，４１ｂ、４４ａ，４４ｂにより空間的に光軸調整されて、ビームコンバイナ４３により同軸上に結合されると共に、それらのビーム径が、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２に対して独立に設けられた集光レンズ４２，４５により、光ファイバ４６への入射効率が最大になるように調整される。
【００９２】
ここで、空間変調手段４８は、図１０に示した空間変調手段３９と同様に構成することもできるが、図１３に示すような輪帯型とすることもできる。すなわち、内側の円形領域４８Ａは、イレース光に対してπだけ位相変調を与えるように、石英基板にエッチングを施し、それ以外の外側の輪帯領域４８Ｂは、イレース光の位相を変えないようにする。したがって、この空間変調手段４８を通してイレース光を集光すれば、位相が反転する波面成分が混合するので、やはり焦点上の中央部では電場強度がゼロとなるドーナッツ状のスポットが得られる。
【００９３】
また、このような空間変調手段４８を用いれば、分光素子４７も、図１４に示すように構造が簡単になる。すなわち、空間変調手段４８の内側の円形領域４８Ａのみで、ポンプ光を反射し、イレース光は透過させるダイクロイックミラーとすることができる。具体的には、空間変調手段４８の内側の円形領域４８Ａに対応して、前述のような分光特性をもつ光学薄膜をコートすればよい。さらには、図１５（ａ）に示すように、石英基板４９の表面に、図１５（ｂ）に示すような分光素子４９Ａを形成し、裏面には、図１５（ｃ）に示すような位相領域４９Ｂを形成して、分光素子と空間変調手段とを一体化することもできる。このようにすれば、部品点数を削減でき、コストダウンが図れると共に、光学調整も容易にできる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の超解像顕微鏡における特徴的構成を説明するための図である。
【図２】図１の分光素子を示す図である。
【図３】同じく、空間変調手段を示す図である。
【図４】同じく、ポンプ光の瞳面動径方向における輪帯部の遮光率を説明するための図である。
【図５】顕微鏡対物レンズによるポンプ光の結像面における強度プロファイルを示す図である。
【図６】音響光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図７】電気光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図８】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図９】図８の分光素子を示す図である。
【図１０】同じく、空間変調手段を示す図である。
【図１１】同じく、ポンプ光とイレース光との擬似パルスを示す図である。
【図１２】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図１３】図１２の空間変調手段を示す図である。
【図１４】同じく、分光素子を示す図である。
【図１５】図１２の分光素子および空間変調手段の変形例を説明するための図である。
【図１６】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１７】図１６の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１８】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１９】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図２０】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２１】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２２】従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図２３】図２２の位相板を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ ポンプ光光源
２ イレース光光源
３，４ 強度変調手段
５ 分岐ファイバ
６ コリメータレンズ
８ 分光素子
９ 空間変調手段
３０ 光源ユニット
３１ ポンプ光光源
３２ イレース光光源
３３，３４ 電気光学変調器（ＥＯＭ）
３５ 分岐ファイバ
３６ コリメータレンズ
３８ 分光素子
３９ 空間変調手段
４１ａ，４１ｂ，４４ａ，４４ｂ 偏向ミラー
４２，４５ 集光レンズ
４３ ビームコンバイナ
４６ 光ファイバ
４７ 分光素子
４８ 空間変調手段
５０ スキャンユニット
５１ ハーフミラー
５２，５３ ガルバノミラー
５４ 投影レンズ
５５ ピンホール
５６，５７ ノッチフィルタ
５８ 光電子増倍管
７０ 顕微鏡ユニット
７１ ハーフミラー
７２ 対物レンズ
７３ 接眼レンズ
７４ 観察試料
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の超解像顕微鏡、より詳しくは、ある波長の１色目の光を試料に照射して、その試料内の分子を基底状態から別の量子状態に遷移させ、さらに１色目の波長と異なる２色目の光を試料に照射して、試料が発する各種光応答を観測する光学顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１６〜図１９を参照して説明する。図１６は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１６に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１７に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１８に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１９に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１７の吸収過程や図１９の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１７のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１８のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１８の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１６に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図２０は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図２０はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図２０に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図２１は、図２０と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図２１において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図２１の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光と呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
図２２は、従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１１０、スキャンユニット１３０および顕微鏡ユニット１５０からなっている。
【００１８】
光源ユニット１１０は、例えば波長５３２ｎｍのコヒーレント光であるポンプ光を出射するＬＤ励起型モードロックＮｄ：ＹＡＧレーザ１１１と、波長６４７ｎｍのコヒーレント光であるイレース光を出射するＫrレーザ１１２と、イレース光空間変調用の位相板１１３と、イレース光およびポンプ光を融合させるためのビームコンバイナ１１４とを有している。位相板１１３は、図２３に示すように、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜が蒸着されている。図２３では、光軸の周りに独立した４領域を有し、イレース光波長に対して４分１ずつ位相が異なっている。この位相板１１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００１９】
スキャンユニット１３０は、光源ユニット１１０から出射される同じ光学軸を共有するポンプ光とイレース光とを、ハーフミラー１３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー１３２および１３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット１５０に出射するようになっていると共に、顕微鏡ユニット１５０で検出された蛍光を、往路と逆の経路を辿ってハーフミラー１３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ１３４、ピンホール１３５、ノッチフィルタ１３６および１３７を経て光電子増倍管１３８で受光するようになっている。図２２では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー１３２，１３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ１３６および１３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール１３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００２０】
顕微鏡ユニット１５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット１３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフミラー１５１で反射させて、対物レンズ１５２により少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料１５３上に集光させると共に、観察試料１５３で発光した蛍光を、再び対物レンズ１５２でコリメートしてハーフミラー１５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット１３０に戻すと同時に、ハーフミラー１５１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ１５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００２１】
この超解像蛍光顕微鏡によると、観察試料１５３の集光点上においてイレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光が抑制されて、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは対物レンズ１５２の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。したがって、ポンプ光およびイレース光をスキャンユニット１３０で走査しながら蛍光信号を測定すれば、超解像の２次元蛍光像を得ることができる。
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
ところが、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡にあっては、特に、ポンプ光とイレース光との光学調整に関して、以下に説明するような問題がある。
【００２３】
すなわち、通常のレーザ走査型顕微鏡では、単一波長のレーザ光を、システムの光軸を目安に合わせ込めばよいが、超解像蛍光顕微鏡では、対物レンズの結像面においてポンプ光の中心部とイレース光の中心部とを合わせることで、集光したポンプ光の辺縁部の蛍光を消去することが最大のキーテクノロジーであり、もし、ポンプ光およびイレース光の集光位置がずれると、ポンプ光の中央部の蛍光も消去してしまい、結果として全体の蛍光強度が低下するだけで、空間分解能は一向に向上せず、Ｓ／Ｎだけが悪くなるという極めて好ましくない状況になる。
【００２４】
そこで、従来の超解像蛍光顕微鏡では、ポンプ光とイレース光とを独立の光学系で個別に調整して、ポンプ光およびイレース光の集光位置を対物レンズの焦点に正確に合わせるようにしている。
【００２５】
しかし、ポンプ光およびイレース光を回折限界まで絞り込んだサイズは、数１００ｎｍで、その位置合わせ精度は、少なくとも１００ｎｍのオーダーを上回ことになるため、ポンプ光およびイレース光の集光位置を個別に調整して対物レンズの焦点に正確に合わせることは極めて困難である。
【００２６】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現できる超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、上記イレース光光源から出射されるイレース光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００２８】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバは、上記イレース光に対してシングルモードが励磁できるコア径を有することを特徴とするものである。
【００２９】
請求項３に係る発明は、請求項１または２に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、それぞれ強度変調する独立した強度変調手段を有することを特徴とするものである。
【００３０】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の超解像顕微鏡において、上記強度変調手段は、電気光学変調素子または音響光変調素子を有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項５に係る発明は、請求項３または４に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光の強度変調手段と上記イレース光の強度変調手段とが、独立して制御されることを特徴とするものである。
【００３２】
請求項６に係る発明は、請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光およびイレース光を、上記光学系の有効瞳径のサイズに平行光とするコリメータレンズを有することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項７に係る発明は、請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、独立して光軸調整する偏向手段を有することを特徴とするものである。
【００３４】
請求項８に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有することを特徴とするものである。
【００３５】
請求項９に係る発明は、請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とするものである。
【００３６】
請求項１０に係る発明は、請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有すると共に、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有し、
上記分光素子は、上記光学系の有効瞳面内で光軸対称な分光特性を有しており、上記空間変調手段および上記分光素子の光軸中心が一致していることを特徴とするものである。
【００３７】
請求項１１に係る発明は、請求項８または１０に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子の分光領域は、光軸に対して同心円状に分割されていることを特徴とするものである。
【００３８】
請求項１２に係る発明は、請求項８、１０または１１に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子は、光学多層膜からなることを特徴とするものである。
【００３９】
請求項１３に係る発明は、請求項９または１０に記載の超解像顕微鏡において、上記空間変調手段は、イレース光に対して透明な光学基板にエッチングまたは光学薄膜をコートして構成されていることを特徴とするものである。
【００４０】
請求項１４に係る発明は、請求項１０に記載の超解像顕微鏡において、上記分光素子および上記空間変調手段は、同一の基板に形成されていることを特徴とするものである。
【００４１】
請求項１５に係る発明は、請求項１４に記載の超解像顕微鏡において、上記基板の一方の表面に上記分光素子が形成され、他方の表面に上記空間変調手段が形成されていることを特徴とするものである。
【００４２】
請求項１６に係る発明は、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光は、それぞれ波長が固定であることを特徴とするものである。
【００４３】
請求項１７に係る発明は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれガスレーザ、イオンレーザあるいは固体レーザのいずれかであることを特徴とするものである。
【００４４】
請求項１８に係る発明は、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれ連続発振レーザであることを特徴とするものである。
【００４５】
請求項１９に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１の光源から出射される第１のコヒーレント光と、上記第２の光源から出射される第２のコヒーレント光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とするものである。
【００４６】
以下、本発明の超解像顕微鏡における特徴的構成について、図１を参照して説明する。図１は、超解像顕微鏡の光源ユニットの構成を示すもので、第１の光源であるポンプ光光源１からの第１のコヒーレント光であるポンプ光、および第２の光源であるイレース光光源２からの第２のコヒーレント光であるイレース光は、それぞれ強度変調手段３および４で強度変調されて擬似パルス化された後、光ファイバである分岐ファイバ５の２つの入射端から入射されて、１つの出射端から光結合されて出射される。この分岐ファイバ５で光結合されて出射されるポンプ光およびイレース光は、コリメータレンズ６で平行ビームにされた後、分光素子８および空間変調手段９を経てイレース光のみが空間変調されて、図２２で示したようにスキャンユニットを経て顕微鏡ユニットに導かれて観察試料に照射される。
【００４７】
ここで、本発明の超解像顕微鏡における第１の特徴的構成は、分岐ファイバ５からなる光ファイバを具える点にある。具体的には、分岐ファイバ５として、イレース光波長に対してシングルモードのみを励磁ができる、所謂シングルモードファイバを用いて、この分岐ファイバ５の２つの入射端にイレース光およびポンプ光を光学的に導入して光結合する。すなわち、この分岐ファイバ５は、イレース光に対してシングルモードのみを励磁できるように、コア径が設定されている。したがって、分岐ファイバ５から出射されるイレース光は、完全に球面波となる。これに対し、ポンプ光は、高次のモードが励磁される可能性もあるが、一般に、超解像顕微鏡の場合には、蛍光光励起用のポンプ光の波長が、イレース光の波長よりも若干（１割から２割）短い程度であるので、高次のモード成分は極め少なく、分岐ファイバ５から出射されるポンプ光も、ほぼ球面波と見なすことができる。
【００４８】
したがって、分岐ファイバ５から光結合されて出射されるイレース光およびポンプ光を、色収差の無い同じコリメータレンズ６で平行ビームにすれば、それらの光は光軸が完全に同軸に調整された完全な均一波面を有するものとなる。しかも、この平行ビームを、顕微鏡対物レンズで集光すれば、ポンプ光とイレース光との集光点をミクロンメータ領域で３次元空間の一点に完全に一致させることができる。このように、分岐ファイバ５を用いることで、従来のようにポンプ光とイレース光とを独立の光学系で個別に調整する場合に比べて、ポンプ光とイレース光との光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現することが可能となる。
【００４９】
次に、本発明の超解像顕微鏡における第２の特徴的構成は、分光素子８とイレース光に関する空間変調手段９とを具える点にある。すなわち、本発明では、前述のような分岐ファイバ５の使用を前提としているので、同軸となったイレース光およびポンプ光のうちイレース光のみを空間変調する必要ある。具体的には、イレース光により蛍光領域を効果的に消去し、空間分解能を向上させるために、中空状のビームに整形する必要がある。その一方で、ポンプ光に関しては、ビーム整形を受けず、試料面で１点に集光することが不可欠である。
【００５０】
分光素子８は、例えば図２に示すように構成され、空間変調手段９は、例えば図３に示すように構成される。図２に示す分光素子８は、少なくとも平面基板に異なる分光特性をもつ２つの領域８Ａ，８Ｂを有しており、領域８Ａはポンプ光を透過せず、イレース光のみを透過させ、領域８Ｂは、反対にポンプ光を透過させて、イレース光は透過させない分光特性を有している。これらの領域８Ａ，８Ｂ、具体的には、光学多層膜で形成される。
【００５１】
このように分光素子８を構成すると、例えば、領域８Ａでは、ポンプ光が直入射の条件で干渉により反射され、イレース光は干渉条件を満たさず透過することになる。また、領域８Ｂでは、イレース光が直入射の条件で干渉により反射され、ポンプ光は干渉条件を満たさず透過することになる。例えば、図２に示すように、領域８Ａ，８Ｂを同心円状にパターン化し、同軸のポンプ光とイレース光とを透過させると、イレース光は中央部の円形の領域８Ａを通過し、ポンプ光は外側の輪帯状の領域８Ｂを通過する。したがって、この分光素子８の後段に、図３に示すように、イレース光と同じビーム径を有し、光軸の周りにイレース光波長に対してπ／２ずつ位相差を与える独立した４領域を有する位相板からなる空間変調手段９を配置してイレース光を空間変調すれば、外側のポンプ光を空間変調することなく、イレース光のみをビーム整形することができる。
【００５２】
一方、ポンプ光は、輪帯状のビームであるが、これを顕微鏡対物レンズで集光すると、ｘ−ｙ結像面における波長λのポンプの強度プロファイルは、ベッセルの１次関数Ｊ1(z)を用いて下記のように表される。
【００５３】
【数１】
【００５４】
ここで、ρは、図４に示すように、ポンプ光の瞳面動径方向における輪帯部の遮光率を示し、輪帯瞳の内径（半径）をｒ、外径（半径）をＲとするとき、ρ＝ｒ／Ｒ、で表される。
【００５５】
図５は、顕微鏡対物レンズによるポンプ光の結像面における強度プロファイルを示すもので、太線は輪帯状のビームの強度プロファイルを示し、細線は通常の円状のビームにおける強度プロファイルを示している。図５から明らかなように、輪帯状のポンプ光は、多少サイドローブに弱いピークをもつが、通常の円状のビームとは異なり、光軸中央で強いピークをもつ。したがって、このようなポンプ光を試料面に集光させると、蛍光を発するポンプ光辺縁部にて蛍光が抑制されるため、蛍光スポットはポンプ光の回折限界以下のサイズ、すなわち超解像サイズになる。このように工夫された分光素子８と空間変調手段９とを用いることで、ポンプ光とイレース光とを完全同軸で光学調整できるので、従来の超解像顕微鏡と比較すると格段にシステム調整作業が容易になる。
【００５６】
さらに、本発明の超解像顕微鏡における第３の特徴的構成は、ポンプ光光源１からのポンプ光およびイレース光光源２からのイレース光を、それぞれ強度変調して擬似パルス化する強度変調手段３および４を具える点にある。すなわち、従来は、ポンプ光光源１およびイレース光光源２として、パルスレーザ等を用いたが、本発明では、発振が安定な例えばイオンレーザやガスレーザあるいは固体レーザ等の連続発振（ＣＷ）レーザを用い、そのレーザ光を音響光学素子や電気光学素子を有する強度変調手段により強度変調して疑似パルス化する。
【００５７】
ここで、音響光学素子とは、音波が光に及ぼす効果（例えば、偏向、回折、変調、位相シフト、周波数シフト、複屈折など）を利用したものである。この音響光学素子では、音波により光学的な屈折率を音速の周期で変動させ、その際に音と光の波長によって、以下の３種類の効果が現れる。
【００５８】
１）音の波長が長いときは、十分に細い光束を音の進行方向と直角方向に通すと、屈折率勾配が生じて光線が湾曲し、音の周波数で光線が偏向走査される。
２）音の波長が短くなると、音波は光束に対して回折格子として作用する。
３）音の波長が更に短くなって、光の波長オーダになると、垂直入射では回折が生じなくなり、特定の入射角において強いブラッグ回折を起す。
【００５９】
周波数ｆの音波によるｍ次の回折光は、ドプラー効果によりｍｆだけ、その周波数をずらす。また、その回折角θｍは、光の波長をλ、音波の波長をΛとすると、sinθｍ＝ｍλ／Λ、で与えられる。
【００６０】
レーザ光偏向や変調に用いる音響光学変調器は、この効果を応用したもので、図６はその原理的構成を示している。図６に示すように、音響光学変調器１１は、音響光学素子１２に圧電素子１３を接着して構成され、圧電素子１３により超音波を発生させて音響光学素子１２を伝播させ、その状態で音響光学素子１２に光を入射させることにより、入射光を回折させるもので、図６はブラッグ反射による回折を示している。この音響光学変調器１１は、音響光学素子１２として、例えばＰｂＭｏＯ４やＴｅＯ２結晶を用いれば、１０ＭＨｚ帯域まで変調が可能である。
【００６１】
また、電気光学素子は、物質に外部から電場を印加したときに、その物質の屈折率が変化する現象を利用したもので、その際の屈折率の変化が印加電場に比例する場合をポッケルス効果と言われている。圧電結晶では、印加電場の周波数が圧電共鳴周波数より小さいときは、圧電効果による結晶の弾性変形が印加電場の変化に追従して、弾性変形による屈折率の変化が同時に起きる。一方、周波数が高い場合には、圧電結晶の弾性変形が追従できず、この場合を束縛状態の電気光学効果と呼ばれる。この電気光学効果は、光の強度変調に応用できる。
【００６２】
図７は、電気光学素子を用いた電気光学変調器の原理的構成を示すものである。この電気光学変調器１５は、ポッケルス効果を利用したポッケルスセルで、光の入射側から出射側に向けて順次に配置された偏光子１６、電気光学素子１７、１／４波長板１８、および検光子１９を有しており、偏光子１６と検光子１９とは偏光軸が直交している。電気光学素子１７は、ＫＤＰ（リン酸二水化カリウム）等のポッケルス効果の大きい圧電結晶を用い、この圧電結晶に電極（図示せず）を介して電源２０を選択的に接続することにより電場を印加する。電源２０の接続方法すなわち電場の印加方法には、光の進行方向と直角方向に印加する横型光強度変調法と、平行に電場を印加する縦型光変調方法とがある。図７は、縦型光変調方法の場合を示しており、この場合には電気光学素子１７の入射端面および出射端面に、光路を遮らないように、リング状の電極や透明電極を設けて電源２０を選択的に接続するようにしている。
【００６３】
図７に示す電気光学変調器１５において、電気光学素子１７の圧電結晶が一軸性結晶の場合には、電源２０により光軸方向に電場を印加すると複屈折を生じ、偏光子１６を経て電気光学素子１７に入射した直線偏光は楕円偏光に変換されて、１／４波長板１８を経て検光子１９に入射し、検光子１９の偏光軸方向の成分が透過することになる。これに対し、電気光学素子１７に電場を印加しない状態では、電気光学素子１７は一軸性で光は全く透過しない。このように、電気光学素子１７に選択的に電場を印加することにより、入射光を変調でき、例えばナノ秒オーダの光スイッチングが可能となる。
【００６４】
上記の音響光学変調器１１または電気光学変調器１５を、ＣＷレーザの光路に挿入して電気的に制御することにより、超解像顕微鏡システムと相応しいパルス光源を実現する。これにより、Ｈｅ・Ｎｅレーザ、Ａｒレーザ、Ｋｒレーザ、Ｔｉサファイアレーザ等のＣＷレーザの優れたビーム品質を保持したまま、パルス化が可能となる。しかも、電気的制御により任意の発振周波数を選ぶことができるので、例えばポンプ光とイレース光とのパルス発振のタイミングおよびパルス幅を電気的に簡便に制御でき、これにより超解像顕微鏡の基礎をなす蛍光抑制効果を効率的に誘起することが可能となる。
【００６５】
特に、本発明では、強度変調手段をレーザ光源と光ファイバとの間に挿入することにより、強度変調手段で発生する波面のゆがみをシングルモードしか励磁できない光ファイバで除去できるので、超解像効果を効率的に発現させることが可能となる。その結果、超解像性も向上し、分解能において差別化された高機能な顕微鏡を提供することが可能となる。また、既にレーザ走査型顕微鏡システムにおいて幅広く導入され、実績も高いＨｅ・Ｎｅレーザ等のガスレーザの利用も可能となり、より実用面において優れたユーザーフレンドリーな顕微鏡システムを提供することが可能となる。
【００６６】
以上の３つの特徴的構成を上手く組み合わせることで、今まで類を見ないシステム調整が可能な超解像顕微鏡を実現することができ、製品の組み立て工程の簡素化と簡略化、さらには製品導入の現場におけるメンテナンスにおいて、限りない利便性を提供することができる。
【発明の効果】
【００６７】
本発明によれば、ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、イレース光光源から出射されるイレース光とを、位置安定性および波面の均一性に優れた光ファイバを用いて同軸上に結合するようにしたので、ポンプ光およびイレース光の波面の均一性を保ちつつ、これらの光の光学調整を簡単かつ正確に行うことができ、超解像効果を確実に発現することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６８】
以下、本発明による超解像顕微鏡の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００６９】
（第１実施の形態）
図８は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。本実施の形態の超解像顕微鏡は、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット３０、スキャンユニット５０および顕微鏡ユニット７０からなっている。
【００７０】
光源ユニット３０は、第１のコヒーレント光であるＣＷのポンプ光を発生する第１の光源であるポンプ光光源３１と、第２のコヒーレント光であるＣＷのイレース光を発生する第２の光源であるイレース光光源３２と、ポンプ光光源３１からのＣＷのポンプ光を擬似パルス化する強度変調手段であるＫＤＰ結晶からなる電気光学変調器（ＥＯＭ）３３と、イレース光光源３２からのＣＷのイレース光を擬似パルス化する強度変調手段であるＫＤＰ結晶からなるＥＯＭ３４と、ＥＯＭ３３，３４でそれぞれ擬似パルス化されるポンプ光およびイレース光を同軸上の光結合して出射する光ファイバである分岐ファイバ３５と、分岐ファイバ３５で光結合されて出射されるポンプ光およびイレース光を平行ビームに変換するコリメータレンズ３６と、このコリメータレンズ３６で平行ビームにされたポンプ光およびイレース光を分光する分光素子３８と、分光素子３８を経たイレース光のみを空間変調する空間変調手段３９とを有しており、この空間変調手段３９を経たポンプ光およびイレース光をスキャンユニット５０に入射させるようになっている。
【００７１】
以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される強い吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ〜６５０ｎｍの帯域に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い電子励起状態（Ｓｎ）に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、E.Sahar and D.Treves:IEEE,J.Quantum Electron.,QE-13,692(1977)参照）。
【００７２】
そこで、本実施の形態では、ポンプ光光源３１として、Ｎｄ：ＹＡＧ固体レーザを用い、その２倍波の波長５３２ｎｍの光をポンプ光とする。また、イレース光光源３２は、Ｋｒレーザを用いて、その波長６４７．１ｎｍの光をイレース光とする。
【００７３】
ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２から発生したポンプ光およびイレース光は、それぞれシングルモードファイバを介してＥＯＭ３３，３４に導入されて強度変調される。すなわち、ＥＯＭ３３，３４は、例えば独立のパルス発生器（図示せず）から所望のパルス幅と周期で電圧が印加され、これにより電圧印加時に電気光学効果により入射光が変調されてＥＯＭ３３，３４を通過することで、ポンプ光およびイレース光がそれぞれ擬似パルス光として出射される。なお、擬似パルス光の生成条件は、蛍光抑制効果が最適条件で誘起できるように、ＥＯＭ３３，３４に印加する電圧のパルス幅およびタイミングが調整されている。
【００７４】
ＥＯＭ３３，３４を通過したポンプ光およびイレース光は、分岐ファイバ３５に導入される。この分岐ファイバ３５は、その径が、イレース光に関してシングルモードが励磁される条件に設定されている。ポンプ光に対しては、若干径が大きいが、高次モードが励磁される確率は極めて低いので、分岐ファイバ３５を伝達できるポンプ光は、シングルモードと見なすことができる。この分岐ファイバ３５により、ポンプおよびイレース光は、同軸上に光結合されて、同じ点光源位置すなわち分岐ファイバ３５の出射端から球面波として出射される。
【００７５】
分岐ファイバ３５から出射されるポンプ光およびイレース光は、コリメータレンズ３６により完全に同軸でコリメートされる。なお、コリメータレンズ３６は、例えばダブレットレンズのように、ポンプ光およびイレース光の波長に対して色収差補正がなされており、それらのビーム径は、後述する顕微鏡ユニット７０内の対物レンズ７２の瞳径に一致している。本実施の形態では、その有効瞳径が８ｍｍとなっている。
【００７６】
コリメータレンズ３６でコリメートされたポンプ光およびイレース光は、分光素子３８および位相板からなる空間変調手段３９を順次通過する。分光素子３８は、図９に示すような平面構造からなっている。本実施の形態では、対物レンズ７２の有効瞳径すなわちビーム径が８ｍｍであるので、中央部の直径６ｍｍの領域３８Ａに、直入射するポンプ光（波長５３２ｎｍ）を反射させ、イレース光（波長６４７．１ｎｍ）は透過させる光学フィルタが形成され、残る外側の輪帯部の領域３８Ｂには、ポンプ光は透過させ、イレース光は反射させる光学フィルタが形成されている。なお、領域３８Ａ，３８Ｂの光学フィルタは、干渉性を高めるために、屈折率の異なる薄膜を交互に積層した光学多層膜としても良い。
【００７７】
空間変調手段３９は、イレース光のみを位相変調する位相板からなるもので、その中央部には、図１０に示すように、直径６ｍｍの円形領域に光軸の周りを１周すると連続的にイレース光を２π位相変調するエッチングパターンが形成されている。したがって、この空間変調手段３９をイレース光が透過すると、ビーム面内の光軸対称位置において、イレース光の位相差がπとなるので、集光すると光軸上の電場強度が相殺されて、超解像顕微鏡に相応しい中空ビームが得られる。
【００７８】
なお、図１０に示す空間変調手段３９は、石英基板からなっており、光軸の周りは８つの領域３９Ａ〜３９Ｈに等分割されて、イレース光の波長に対してλ／８ずつ段階的に位相差を与えるエッチングパターンが形成されている。より具体的には、化学エッチング法により、石英基板がエッチングされて光路長が制御されている。その具体的なエッチング深さを、表１に示す。
【００７９】
【表１】
【００８０】
この空間変調手段３９を通すことで、イレース光のみが光軸中央で光強度がゼロとなるように位相変調される。これに対し、輪帯状のポンプ光は、空間変調手段３９のエッチング部分の外側を通過するので、全く位相変調を受けることなく透過する。
【００８１】
分光素子３８および空間変調手段３９を透過したポンプ光およびイレース光は、スキャンユニット５０に入射する。
【００８２】
スキャンユニット５０は、ハーフミラー５１、２枚のガルバノミラー５２，５３、投影レンズ５４、ピンホール５５、ポンプ光およびイレース光を除去するノッチフィルタ５６，５７、光電子増倍管５８を有している。また、顕微鏡ユニット７０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、ハーフミラー７１、対物レンズ７２、接眼レンズ７３を有している。
【００８３】
光源ユニット３０からスキャンユニット５０に入射したポンプ光およびイレース光は、ハーフミラー５１を透過した後、２枚のガルバノミラー５２，５３により２次元方向に偏向されて顕微鏡ユニット７０に入射され、そのハーフミラー７１で反射されて対物レンズ７２により、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む観察試料７４に集光されて、試料面上で二次元走査される。なお、図８では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー５２，５３を同一平面内で揺動可能に示している。
【００８４】
一方、観察試料７４へのポンプ光およびイレース光の照射により、観察試料７４から発光した蛍光は、入射レーザ光とは逆の光路を辿って、スキャンユニット５０のハーフミラー５１に入射して、該ハーフミラー５１で反射される。このハーフミラー５１で反射された蛍光は、投影レンズ５４で集光されてピンホール５５を透過し、ノッチフィルタ５６，５７によりポンプ光およびイレース光が除去されて光電子増倍管５８で受光される。なお、ピンホール５５は、観察試料７４上の集光点と共焦点位置に設置され、これにより空間フィルタ機能と同時に、観察試料１０内の特定の深さ部分から発光した蛍光のみを透過させる３次元空間分解機能を果たすようなっている。光電子増倍管５８から得られる蛍光信号データは、ガルバノミラー５２，５３の走査に同期させて、コンピュータ内のメモリに格納することにより、観察試料７４の２次元蛍光顕微像が得られる。なお、顕微鏡ユニット７０のハーフミラー７１を通過した光は、接眼レンズ７３により結像され、これにより蛍光スポット像を直接観察でき、観察位置の調整や、ピント合わせ等に利用できるようになっている。
【００８５】
以上のように、本実施の形態では、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２としてそれぞれＣＷレーザを用い、これらＣＷレーザからのポンプ光およびイレース光を、ＫＤＰ結晶からなるＥＯＭ３３，３４により擬似パルス化している。ここで、ＫＤＰ結晶は、入力電気パルスに対する立ち上がり時間応答が５nsec程度であるので、ナノ秒パルスレーザと同等のパルス幅で、ＭＨｚオーダの繰り返し周波数を得ることができる。
【００８６】
ここで、ＥＯＭ３３，３４によるポンプ光およびイレース光の擬似パルス化は、図１１に示すように、イレース光のパルス幅がポンプ光のそれより長くなるように設定している。これにより、時間領域でのポンプ光とイレース光との重複が確実となり、蛍光抑制効果を確実に誘導することができる。そのためには、好ましくは、上述したようにＥＯＭ３３，３４を独立したパルス発生器で制御して、ポンプ光およびイレース光の擬似パルスの位相および周波数を調整する。特に、位相に関しては、ＫＤＰ結晶の個体差により、数ナノ秒程度の変調時の位相差が発生するで、対応するパルス発生器により蛍光抑制効果の発現を最適化する。
【００８７】
なお、本実施の形態では、強度変調手段としてＥＯＭ３３，３４を用いて、それぞれＣＷレーザからなるポンプ光光源３１およびイレース光光源３２からのポンプ光およびイレース光を強度変調して擬似パルス化したが、強度変調手段としてＥＯＭ３３および／または３４に代えて、音響光学素子を利用して擬似パルス化することもできる。例えば、音響光学素子としてＴｅＯ２結晶を用いれば、耐レーザしきい値も高いので、比較的強度の高いイレース光も確実に擬似パルス化することができる。
【００８８】
（第２実施の形態）
図１２は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。本実施の形態は、光源ユニット３０の構成が第１実施の形態と異なり、その他の構成は第１実施の形態と同様であるので、第１実施の形態と同様の作用をなす部材には同一参照符号を付してその説明を省略する。
【００８９】
本実施の形態では、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２として、それぞれパルスレーザを用いている。ここで、第１実施の形態と同様に、ローダミン６Ｇで染色された生体試料７４を観察する場合には、ポンプ光光源３１として、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザを用い、その２倍波の波長５３２ｎｍのコヒーレント光をポンプ光とする。また、イレース光光源３２は、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザを用い、その基本波長１０６４ｎｍのコヒーレント光をイレース光とする。したがって、この場合、イレース光は近赤外領域におけるローダミン６Ｇの二重共鳴吸帯を用いて蛍光抑制を行うことになる。
【００９０】
ポンプ光光源３１から出射されたポンプ光は、偏向ミラー４１ａ，４１ｂおよび集光レンズ４２を経てハーフミラーキューブ等のビームコンバイナ４３に入射される。また、イレース光光源３２から出射されたイレース光は、同様に、偏向ミラー４４ａ，４４ｂおよび集光レンズ４５を経てビームコンバイナ４３に入射され、このビームコンバイナ４３でポンプ光と同軸に結合される。ビームコンバイナ４３で結合されたポンプ光およびイレース光は、イレース光に対してシングルモードを励磁する光ファイバ４６を透過した後、コリメータレンズ３６により平行ビームに変換され、さらに、分光素子４７および位相板からなる空間変調手段４８を経てスキャンユニット５０に入射される。その他の構成および作用は、第１実施の形態と同様である。
【００９１】
すなわち、本実施の形態では、第１実施の形態の分岐ファイバを用いず、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２に対して独立に設けられた２枚の１組の偏向ミラー４１ａ，４１ｂ、４４ａ，４４ｂにより、ポンプ光およびイレース光が、共通の１本の光ファイバ４６に直接導入される。詳しくは、ポンプ光およびイレース光は、偏向ミラー４１ａ，４１ｂ、４４ａ，４４ｂにより空間的に光軸調整されて、ビームコンバイナ４３により同軸上に結合されると共に、それらのビーム径が、ポンプ光光源３１およびイレース光光源３２に対して独立に設けられた集光レンズ４２，４５により、光ファイバ４６への入射効率が最大になるように調整される。
【００９２】
ここで、空間変調手段４８は、図１０に示した空間変調手段３９と同様に構成することもできるが、図１３に示すような輪帯型とすることもできる。すなわち、内側の円形領域４８Ａは、イレース光に対してπだけ位相変調を与えるように、石英基板にエッチングを施し、それ以外の外側の輪帯領域４８Ｂは、イレース光の位相を変えないようにする。したがって、この空間変調手段４８を通してイレース光を集光すれば、位相が反転する波面成分が混合するので、やはり焦点上の中央部では電場強度がゼロとなるドーナッツ状のスポットが得られる。
【００９３】
また、このような空間変調手段４８を用いれば、分光素子４７も、図１４に示すように構造が簡単になる。すなわち、空間変調手段４８の内側の円形領域４８Ａのみで、ポンプ光を反射し、イレース光は透過させるダイクロイックミラーとすることができる。具体的には、空間変調手段４８の内側の円形領域４８Ａに対応して、前述のような分光特性をもつ光学薄膜をコートすればよい。さらには、図１５（ａ）に示すように、石英基板４９の表面に、図１５（ｂ）に示すような分光素子４９Ａを形成し、裏面には、図１５（ｃ）に示すような位相領域４９Ｂを形成して、分光素子と空間変調手段とを一体化することもできる。このようにすれば、部品点数を削減でき、コストダウンが図れると共に、光学調整も容易にできる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】本発明の超解像顕微鏡における特徴的構成を説明するための図である。
【図２】図１の分光素子を示す図である。
【図３】同じく、空間変調手段を示す図である。
【図４】同じく、ポンプ光の瞳面動径方向における輪帯部の遮光率を説明するための図である。
【図５】顕微鏡対物レンズによるポンプ光の結像面における強度プロファイルを示す図である。
【図６】音響光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図７】電気光学変調器の原理的構成を示す図である。
【図８】本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図９】図８の分光素子を示す図である。
【図１０】同じく、空間変調手段を示す図である。
【図１１】同じく、ポンプ光とイレース光との擬似パルスを示す図である。
【図１２】本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図１３】図１２の空間変調手段を示す図である。
【図１４】同じく、分光素子を示す図である。
【図１５】図１２の分光素子および空間変調手段の変形例を説明するための図である。
【図１６】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１７】図１６の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１８】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１９】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図２０】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２１】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図２２】従来提案されている超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図２３】図２２の位相板を示す図である。
【符号の説明】
【００９５】
１ ポンプ光光源
２ イレース光光源
３，４ 強度変調手段
５ 分岐ファイバ
６ コリメータレンズ
８ 分光素子
９ 空間変調手段
３０ 光源ユニット
３１ ポンプ光光源
３２ イレース光光源
３３，３４ 電気光学変調器（ＥＯＭ）
３５ 分岐ファイバ
３６ コリメータレンズ
３８ 分光素子
３９ 空間変調手段
４１ａ，４１ｂ，４４ａ，４４ｂ 偏向ミラー
４２，４５ 集光レンズ
４３ ビームコンバイナ
４６ 光ファイバ
４７ 分光素子
４８ 空間変調手段
５０ スキャンユニット
５１ ハーフミラー
５２，５３ ガルバノミラー
５４ 投影レンズ
５５ ピンホール
５６，５７ ノッチフィルタ
５８ 光電子増倍管
７０ 顕微鏡ユニット
７１ ハーフミラー
７２ 対物レンズ
７３ 接眼レンズ
７４ 観察試料
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、上記イレース光光源から出射されるイレース光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
上記光ファイバは、上記イレース光に対してシングルモードが励磁できるコア径を有することを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、それぞれ強度変調する独立した強度変調手段を有することを特徴とする請求項１または２に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
上記強度変調手段は、電気光学変調素子または音響光変調素子を有することを特徴とする請求項３に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
上記ポンプ光の強度変調手段と上記イレース光の強度変調手段とが、独立して制御されることを特徴とする請求項３または４に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
上記光ファイバから出射されるポンプ光およびイレース光を、上記光学系の有効瞳径のサイズに平行光とするコリメータレンズを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、独立して光軸調整する偏向手段を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項９】
上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１０】
上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有すると共に、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有し、
上記分光素子は、上記光学系の有効瞳面内で光軸対称な分光特性を有しており、上記空間変調手段および上記分光素子の光軸中心が一致していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１１】
上記分光素子の分光領域は、光軸に対して同心円状に分割されていることを特徴とする請求項８または１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１２】
上記分光素子は、光学多層膜からなることを特徴とする請求項８、１０または１１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１３】
上記空間変調手段は、イレース光に対して透明な光学基板にエッチングまたは光学薄膜をコートして構成されていることを特徴とする請求項９または１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１４】
上記分光素子および上記空間変調手段は、同一の基板に形成されていることを特徴とする請求項１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１５】
上記基板の一方の表面に上記分光素子が形成され、他方の表面に上記空間変調手段が形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１６】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光は、それぞれ波長が固定であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１７】
上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれガスレーザ、イオンレーザあるいは固体レーザのいずれかであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１８】
上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれ連続発振レーザであることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１９】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１の光源から出射される第１のコヒーレント光と、上記第２の光源から出射される第２のコヒーレント光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項１】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するポンプ光を出射するポンプ光光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するイレース光を出射するイレース光光源と、
上記ポンプ光と上記イレース光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光と、上記イレース光光源から出射されるイレース光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とする超解像顕微鏡。
【請求項２】
上記光ファイバは、上記イレース光に対してシングルモードが励磁できるコア径を有することを特徴とする請求項１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項３】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、それぞれ強度変調する独立した強度変調手段を有することを特徴とする請求項１または２に記載の超解像顕微鏡。
【請求項４】
上記強度変調手段は、電気光学変調素子または音響光変調素子を有することを特徴とする請求項３に記載の超解像顕微鏡。
【請求項５】
上記ポンプ光の強度変調手段と上記イレース光の強度変調手段とが、独立して制御されることを特徴とする請求項３または４に記載の超解像顕微鏡。
【請求項６】
上記光ファイバから出射されるポンプ光およびイレース光を、上記光学系の有効瞳径のサイズに平行光とするコリメータレンズを有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項７】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光を、独立して光軸調整する偏向手段を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項８】
上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項９】
上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１０】
上記光ファイバから出射されるポンプ光を透過してイレース光を反射する分光領域と、ポンプ光を反射してイレース光を透過する分光領域とを、空間的に独立して設けた分光素子を有すると共に、上記光ファイバから出射されるイレース光を空間変調する空間変調手段を有し、
上記分光素子は、上記光学系の有効瞳面内で光軸対称な分光特性を有しており、上記空間変調手段および上記分光素子の光軸中心が一致していることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１１】
上記分光素子の分光領域は、光軸に対して同心円状に分割されていることを特徴とする請求項８または１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１２】
上記分光素子は、光学多層膜からなることを特徴とする請求項８、１０または１１に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１３】
上記空間変調手段は、イレース光に対して透明な光学基板にエッチングまたは光学薄膜をコートして構成されていることを特徴とする請求項９または１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１４】
上記分光素子および上記空間変調手段は、同一の基板に形成されていることを特徴とする請求項１０に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１５】
上記基板の一方の表面に上記分光素子が形成され、他方の表面に上記空間変調手段が形成されていることを特徴とする請求項１４に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１６】
上記ポンプ光光源から出射されるポンプ光および上記イレース光光源から出射されるイレース光は、それぞれ波長が固定であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１７】
上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれガスレーザ、イオンレーザあるいは固体レーザのいずれかであることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１８】
上記ポンプ光光源および上記イレース光光源は、それぞれ連続発振レーザであることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡。
【請求項１９】
少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起する第１のコヒーレント光を出射する第１の光源と、
上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起する第２のコヒーレント光を出射する第２の光源と、
上記第１のコヒーレント光と上記第２のコヒーレント光とを一部重ね合わせて上記試料に集光する光学系と、
上記光学系により集光される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記光学系からの光照射により上記試料から発生する光応答信号を検出する検出手段とを有する超解像顕微鏡において、
上記第１の光源から出射される第１のコヒーレント光と、上記第２の光源から出射される第２のコヒーレント光とを同軸上に結合する光ファイバを有することを特徴とする超解像顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００６−５８４７７（Ｐ２００６−５８４７７Ａ）
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２３８６８８（Ｐ２００４−２３８６８８）
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月１８日（２００４．８．１８）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【Ｆターム（参考）】
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