【課題】宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、外因性遺伝子を含む組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞、およびそのような宿主細胞を連続的な形質導入またはトランスフェクションにより作製する方法を提供する。
【解決手段】関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを用いて、宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させ、より高いレベルのタンパク質を発現する方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、宿主細胞に形質導入を行うための方法：
a) i)ゲノムを含む少なくとも1つの宿主細胞、および
ii)関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクター
を提供する段階；ならびに
b)該宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、該少なくとも1つの宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させる段階；
c)組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞を提供するために、段階a)およびb)を複数回繰り返す段階。
【請求項２】
段階aおよびbが少なくとも3回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
段階aおよびbが少なくとも4回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
段階aおよびbが少なくとも5回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
段階aおよびbが少なくとも6回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
段階aおよびbが少なくとも7回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
段階aおよびbが少なくとも8回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
段階aおよびbが少なくとも10回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
段階aおよびbが少なくとも20回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
段階aおよびbが約3〜20回繰り返される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
組み込まれた複数のベクターを含む宿主細胞が、約10〜約100個の組み込まれたレトロウイルスベクターを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
段階1および2において利用されるレトロウイルスベクターが、外被プラスミドおよびベクタープラスミドによりトランスフェクトされたパッケージング細胞より作製される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
d)関心対象の遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを用いてパッケージング細胞に形質導入を行い、かつ外被タンパク質を発現するプラスミドを用いて該パッケージング細胞にトランスフェクションを行うことにより作製されたパッケージング細胞から作製されるベクターを用いて段階1および2により作製された、組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞に、形質導入を行う段階。
【請求項１４】
パッケージング細胞がレトロウイルスのgagおよびpolタンパク質を発現する、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
パッケージング細胞が293-GP細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
外被プラスミドがGタンパク質をコードする、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
Gタンパク質がVSV-Gタンパク質である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
レトロウイルスベクターがMoMLV因子を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
条件が、約10〜1000の感染多重度で、宿主を接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
関心対象の遺伝子が外因性プロモーターと機能的に結合した、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
関心対象の遺伝子がシグナル配列と機能的に結合した、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
レトロウイルスベクターが少なくとも2つの関心対象の遺伝子をコードする、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも2つの関心対象の遺伝子が多シストロン性配列に配置される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも2つの関心対象の遺伝子が免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ヒト293細胞、およびウシ乳腺上皮細胞より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
形質導入された宿主細胞をクローン的に（clonally）選択する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
関心対象の遺伝子によりコードされる関心対象のタンパク質が産生されるような条件下で、クローン的に選択された宿主細胞を培養する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
関心対象のタンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
培養条件が、回転瓶培養、灌流培養、流加培養（batch fed culture）、およびペトリ皿培養からなる群より選択される、請求項28記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。
【請求項３５】
レトロウイルスベクターが増幅可能なマーカーをさらにコードする、請求項1記載の方法。
【請求項３６】
増幅可能なマーカーがDHFRおよびグルタミン合成酵素からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
組み込まれたレトロウイルスベクターの増幅を可能にする条件下で、形質導入された宿主細胞を培養する段階をさらに含む、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
条件が、メトトレキセート、ホスフィノトリシン(phosphinothricin)、およびメチオニンサルフォキシム(methionine sulphoxime)からなる群より選択される選択物質の存在下において、形質導入された宿主細胞を培養する段階を含む、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
免疫グロブリンがIgG、IgA、IgM、IgD、IgE、およびsIgからなる群より選択される、請求項24記載の方法。
【請求項４０】
宿主細胞に、異なる関心対象の遺伝子をコードする少なくとも2つの異なるベクターによって形質導入が行われる、請求項1記載の方法。
【請求項４１】
請求項1記載の方法により作製される、宿主細胞。
【請求項４２】
以下の段階を含む、宿主細胞に形質導入を行うための方法：
a) i)ゲノムを含む少なくとも1つの宿主細胞を提供する段階、および
ii)関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクター
を提供する段階；ならびに
b)該宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、該少なくとも1つの宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させる段階；
c)組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞を提供するために、段階1)および2)を複数回繰り返す段階;
d)該関心対象の遺伝子を発現する宿主細胞をクローン的に選択する段階；ならびに
e)該関心対象の遺伝子によりコードされる関心対象のタンパク質を精製する段階。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１０Ｃ】

【図１０Ｄ】

【図１１Ａ】

【図１１Ｂ】

【図１１Ｃ】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３Ａ】

【図１３Ｂ】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５】

【図１６Ａ】

【図１６Ｂ】

【図１６Ｃ】

【図１７】

【図１８】

【図１９Ａ】

【図１９Ｂ】

【図１９Ｃ】

【図１９Ｄ】

【図２０】

【図２１Ａ】

【図２１Ｂ】

【図２１Ｃ】

【図２１Ｄ】

【図２２Ａ】

【図２２Ｂ】

【図２２Ｃ】

【図２２Ｄ】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２３Ｃ】

【図２４Ａ】

【図２４Ｂ】

【図２４Ｃ】

【図２５Ａ】

【図２５Ｂ】

【図２５Ｃ】

【公開番号】特開２０１２−１３９２２９（Ｐ２０１２−１３９２２９Ａ）
【公開日】平成２４年７月２６日（２０１２．７．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２４２８（Ｐ２０１２−５２４２８）
【出願日】平成２４年３月９日（２０１２．３．９）
【分割の表示】特願２００６−５４９６１４（Ｐ２００６−５４９６１４）の分割
【原出願日】平成１７年１月１４日（２００５．１．１４）
【出願人】（５１０３３７５１７）キャタレント　ファーマ　ソリューションズ　リミテッド　ライアビリティ　カンパニー (2)
【Ｆターム（参考）】