遊離カルボン酸の製造方法
本発明の主題は、以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の主題は、以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
【０００２】
先行技術
カルボン酸の生化学的製造は例えば乳酸又はクエン酸生成を基礎として良く知られている。この大抵の発酵プロセスは製造すべきカルボン酸のｐＫa値の上方にある媒体のｐＨ値で実施されるので、このカルボン酸は大部分が塩として生じ、遊離酸としては生じない。これらカ−ボナートは大抵は酸の添加によりその遊離酸に移行する。
【０００３】
WO9815517は、塩基性の、有機溶媒又は水混合不能アミンを用いた乳酸の抽出方法を記載する。
【０００４】
DE 102006052311は、遊離α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法であって、第３級アミンの存在下でこの相応するアンモニウムカルボキシラートを、発生するアンモニアを蒸留により除去しながら加熱し、この後に更なる留去及びこれに伴う第３級アミン及び遊離α−ヒドロキシカルボン酸の形成が引き続く方法を記載する。
【０００５】
US 4,275,234は、抽出剤としてアミンを用いたカルボン酸の抽出方法を記載し、これはカルボン酸を再度水溶液中に存在させる付加的な水性逆抽出工程を含む。
【０００６】
US 4,444,881は、発酵ブイヨンから有機酸を単離するための方法であって、この酸をそのカルシウム塩に移行させ、トリアルキルアンモニウム塩及び沈殿する炭酸カルシウムの形成下で水溶性第三級アミン−カーボナートを添加し、このトリアルキルアンモニウム塩溶液を濃縮し、かつ、加熱によってこのトリアルキルアミン塩を分解することによる方法を記載する。
【０００７】
EP 1385593は、短鎖カルボン酸をそのアルキルアンモニウム錯体の溶液から後処理するための方法であって、共沸性（azeotrophierend）炭化水素の添加下で、このアルキルアンモニウム錯体がこの遊離の短鎖カルボン酸及びアルキルアミンに分解する条件で蒸留することによる方法を記載する。
【０００８】
US 5,510,526は発酵ブイヨンから遊離乳酸を後処理するための方法であって、水と混合可能でない、少なくとも１８個の炭素原子数を有するトリアルキルアミンを含有する抽出剤で、ＣＯ2の存在下で抽出し、この有機相を水相から分離し、引き続きこの遊離乳酸をこの有機相から分離することによる方法を記載する。
【０００９】
WO02090312は、水溶液から遊離カルボン酸を精製するための方法であって、この水溶液を有機溶媒との混合物として加熱し、このようにして遊離酸が得られる方法を記載する。
【００１０】
US 5,132,456は、水性媒体から遊離カルボン酸を精製するための多工程方法を記載し、ここでまずこのカルボン酸を酸吸収剤で抽出し、水溶性アミンを用いてこの水性媒体からこの酸吸収剤から／のこの剤の分離後にこのカルボン酸を新たにアンモニウムカルボキシラートとして再抽出する。引き続きこのアンモニウムカルボキシラートを分解する。
【００１１】
全ての方法では、大量の水性物質流が発生するか又は生成物が生じることが欠点であり、これはこの方法に再度供給することができず、したがって廃棄物として残存する。
【００１２】
本発明の課題は、先行技術の前述の欠点を克服する方法を提供することであった。
【００１３】
発明の説明
意外なことに、アミンの添加下で生物学的細胞によりカルボン酸を製造する方法工程、及び場合により、この添加されたアミンが水溶性である場合には、更なる、水不溶性アミンを添加する方法工程、この水不溶性相を分離する方法工程、及び、遊離カルボン酸の放出下でこれを加熱する方法工程を含む遊離のカルボン酸の製造方法が、本発明の課題を解決することが見出された。
【００１４】
本発明の利点は、反応溶液の例えば鉱酸又は二酸化炭素を用いた酸性化の省略である。これにより大量の酸、例えば硫酸アンモニウム又は石膏の発生が省略され、これは他のプロセスでしばしば生じる。
【００１５】
更なる利点は、水が早期に方法においてエネルギー的に有利に、例えば相分離により分離されることであり、これにより更にエネルギー消費性物質流が方法において減少されることである。同様に、この物質流を蒸発する必要はない。
【００１６】
さらに本発明の利点は、この生物化学的プロセスではしばしば生じる生成物阻害（Produktinhibierung）が水溶性でないアミンの使用により回避されることができるとの事実である。
【００１７】
本発明の範囲内において概念「カルボン酸」とは、遊離カルボン酸（−ＣＯＯＨ）もまた同様にこの相応する塩（−ＣＯＯ-）も含む。
【００１８】
本発明の範囲内において概念「ヒドロキシカルボン酸」とは、少なくとも１のヒドロキシル基及びカルボン酸基を有するカルボン酸を記し、かつ、遊離カルボン酸（−ＣＯＯＨ）もまた同様にこの相応する塩（−ＣＯＯ-）も含む。
【００１９】
本発明の範囲内において概念「アンモニウムカルボキシラート」とは、四価の窒素を有する、一価の正に荷電した基の全てのカルボキシラートを含む。例として以下の一般式
【化２】
［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'及びＲ4'は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨである］
が挙げられる。
【００２０】
本発明の範囲内において概念「水不溶性」とは１００ｇ／ｋｇ水溶液より少ない溶解性として定義されている。
【００２１】
本発明の範囲内において概念「水溶性」とは１００ｇ／ｋｇ水溶液以上の溶解性として定義されている。
【００２２】
全ての記載されたパーセント（％）は、他のことが記載されていない場合には、質量パーセントである。
【００２３】
したがって、本発明の主題は、以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化３】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程、
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からはこの相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
【００２４】
本発明の範囲内において好ましいカルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、マロン酸及びコハク酸を含む群から選択されている。
【００２５】
本発明の範囲内においてカルボン酸がヒドロキシカルボン酸であることも同様に好ましい。
【００２６】
好ましいヒドロキシカルボン酸の群は、α−ヒドロキシカルボン酸を含む。ここで好ましくはこれは乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸及び２−ヒドロキシイソ酪酸であり、その際２−ヒドロキシイソ酪酸が特に好ましい。
【００２７】
好ましいヒドロキシカルボン酸の更なる群は、β−ヒドロキシカルボン酸を含む。ここで好ましくはこれは３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸及び３−ヒドロキシイソ酪酸であり、その際３−ヒドロキシイソ酪酸が特に好ましい。
【００２８】
方法工程Ａにおいてカルボン酸は水性媒体中に存在する生物学的細胞により当業者に知られている方法に応じて製造される。使用される細胞及び製造されるカルボン酸に応じてこの方法パラメーターは相応して適合される。この方法は例えば発酵による方法であることができる。
【００２９】
方法工程Ａ）において使用される細胞が微生物であることが好ましい。
【００３０】
好ましくはこの使用される細胞は次のものを含む属の群から選択されている：
アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）。
【００３１】
特に好ましくは使用される細胞はアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・ エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、メチロバクテリウム・エキストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）を含む群から選択されており、特にラルストニア・ユートロファＨ１６（Ralstonia eutropha H16）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む群から選択されており、その際大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、コリネバクテリウム・グルタミクム及びラルストニア・ユートロファが特にとりわけ好ましい。
【００３２】
本発明による方法の特別な一実施態様は、方法工程Ａ）において、二酸化炭素及び一酸化炭素からなる群から選択される少なくとも１の炭素供給源からカルボン酸を形成することができる細胞が使用されることにより特徴付けられるしたがって、この場合にこれはアセトゲン（acetogen）として又は独立栄養的に成長可能な細胞の使用であり、好ましくはアセトゲニウム・キブイ（Acetogenium kivui）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アセトアンアエロビウム・ノテラ（Acetoanaerobium notera）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・テルモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）、ユウバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）及びクロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）を含む群から選択されたものである。
【００３３】
方法工程Ａ）において添加されるアミンとしてアンモニア及びアルキルアミンが使用されることができる；この場合に第一級、第二級及び第三級アルキルアミン並びに第四級アミン塩が使用されることができる。
【００３４】
方法工程Ａ）において添加されるアミンを、この水性媒体のｐＨ値に影響を及ぼすために、好ましくはこのｐＨ値を高めるために使用することが好ましい。好ましくはこのｐＨ値は方法工程Ａ）において添加されるアミンにより２〜９、好ましくは４〜８、特に好ましくは５〜７の範囲に維持される。
【００３５】
好ましくはアミンとして方法工程Ａ）において水不溶性アミンが使用される。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換のアルキル基であって好ましくは２〜２０個、特に好ましくは４〜１６個、特にとりわけ好ましくは６〜１２個のＣ原子を有する基、又はＨであるアミンが方法工程Ａ）において使用される。
【００３６】
好ましくは方法工程Ａ）において水不溶性アミンは、少なくとも１６個のＣ原子を有するアルキルアミン、特にトリアルキルアミン、特に好ましくはトリアルキルアミンであって、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、トリカプリルアミン、トリドデシルアミンを含む群から選択されるものである。
【００３７】
本発明による方法の特別な一実施態様において、方法工程Ａ）においてより大きな塩基強度を有するアミンを使用することが好ましくあることができる；この場合に、アミンとしてジアルキルアミン、好ましくはジ−イソ−トリデシルアミン、ビス（２−エチルヘキシルアミン）、ラウリル−トリアルキルメチルアミン、ジウンデシルアミン、ジデシルアミンを含む群から選択されたジアルキルアミンを使用することが好ましい。
【００３８】
このアミンを方法工程Ａ）においてカルボン酸に対して少なくとも１．１：１、好ましくは１．５〜５：１のモル比で添加する。
【００３９】
方法工程Ａ）の後又は常にその間にこの液状含分又はこの液状含分の一部が当業者に知られている方法、例えば遠心分離、タンジェント濾過その他に応じて、及び生物学的細胞が相互に分離されることができる。場合により、分離された成分、例えば水性媒体又は細胞は本方法に新たに供給されることができる。
【００４０】
場合によりこの方法工程Ａ）で得られた液状成分は更なる方法工程前に濃縮されることができる。
【００４１】
方法工程Ｂ）において添加されるアミンとして当業者に知られている全ての水不溶性アミン、好ましくはアルキルアミンが使用されることができる。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換のアルキル基であって好ましくは２〜２０個、特に好ましくは４〜１６個、特にとりわけ好ましくは６〜１２個のＣ原子を有する基、又はＨである水不溶性アミンが方法工程Ｂ）において使用される。
【００４２】
更に好ましく使用されるアミンは方法工程Ａ）における上述の水不溶性アミンに相当する。
【００４３】
このアミンを方法工程Ｂ）においてカルボン酸に対して少なくとも１．１：１、好ましくは１．５〜５：１のモル比で添加する。
【００４４】
方法工程Ｂ）においてはこの方法工程Ａ）の水不溶性アミンは少なくとも部分的に除去されることができる。特に、方法工程Ｂ）においてこの水溶性アミンよりもより弱塩基である（より小さいｐＫBを有する）水不溶性アミンが使用される場合には、この水溶性アミンの少なくとも一部が除去されることが好ましい。
【００４５】
これは例えば抽出、イオン交換により、加熱により、すなわちこの水溶性アミンの熱による追い出し（Austreiben）により達成されることができるか、しかし又は、ＣＯ2の導入により達成されることができ、その際水溶性アミンはカーボナートとして沈殿する。水溶性アミンの分離のための例示的方法はDE 102006052311に記載されている。
【００４６】
この除去された水溶性アミンは方法工程Ａ）に新たに供給されることができる。
【００４７】
方法工程Ａ）又はＢ）後に多相系が存在し、かつ水不溶性アミン及びカルボン酸からこの相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される。
【００４８】
このアンモニウムカルボキシラートは好ましくは−有機相に対する水相の同じ体積に対して−大部分が、好ましくは６０％より多くが、特に好ましくは８０％より多くが、特にとりわけ好ましくは９０％より多くが水不溶性相に存在する。
【００４９】
更なる水不溶性溶媒が、水不溶性アミンに場合により添加されることができ、これは好ましい特性、例えばより良好な相分離又はより安定な相を保証するため、このアミンの粘度を減少させるため、又はこのカルボキシル酸の溶解性を高めるためである。
【００５０】
更なる水不溶性溶媒として、例えば少なくとも８個の炭素原子を有するアルコール、ケトン、例えばメチルイソブチルケトン、芳香族溶媒、例えばトルエン及びキシレン、脂肪族非極性溶媒、例えばケロシン及びヘキサンが使用されることができる。好ましくはオレイルアルコール及びドデカノールが使用される。
【００５１】
好ましくは沸点が水不溶性アミンの上方にある更なる溶媒が使用される。
【００５２】
方法工程Ｃ）においてはアンモニウムカルボキシラートを含有する水不溶性相がこの水相から分離される。これは、有機相を水相から分離できる当業者に知られている全ての方法、例えばデカンテーション、遠心分離により、又は蒸留によっても行うことができる。このための例は特にPerry's Chemical Engineers ' Handbook (Section 15); By Robert H Perry, Don W Green, James O Malone; Published 1999; McGraw-Hillに見出される。
【００５３】
本発明の方法の範囲内では、この分離された水相が本方法に再度供給されることが好ましくあることができる。
【００５４】
同様に、この分離された水不溶性相を更に精製することが好ましくあることができ、これは例えば抽出、濾過、遠心分離イオン交換又は濃縮、例えば蒸留、抽出によるものであることができる。
【００５５】
方法工程Ｄ）における遊離カルボン酸の放出はこの水不溶性相の加熱により、好ましくは減圧下で、このアンモニウムカルボキシラートの分解により行われる。
【００５６】
減圧は本発明の範囲内において１＊１０5Ｐａ未満、好ましくは０．９＊１０5Ｐａ未満、特に好ましくは０．８＊１０5Ｐａ未満の圧力を意味する。
【００５７】
この加熱の種類は使用される装置／設備に依存し、例えば熱浴、温度調節可能な反応器ジャケットにより、又はこの水不溶性相と加熱したガス流との接触により行うことができる。この温度は、熱による塩分解が起こり、かつ副生成物の形成が最低限にされるように、使用される圧力に依存して選択される。好ましくは同時に、この反応の間に形成されたカルボン酸の少なくとも一部を蒸留により除去する。適した温度範囲及び圧力範囲は、熱処理の必要な期間と同様に当業者により決定されることができ、例えばこれは形成されるアミン又はカルボン酸の量又はこの反応溶液の温度経過の監視による。
【００５８】
好ましい一実施態様において方法工程Ｄ）においてこの温度は８０℃〜３００℃、好ましくは１２０℃〜２５０℃、特に好ましくは１５０℃〜２２０℃の温度範囲内にある。
【００５９】
この方法工程Ｄ）において得られる水不溶性アミンは再度本方法に供給されることができる。
【００６０】
この方法工程Ｄ）において得られる、カルボン酸を含有する生成物分画は更なる精製無く反応生成物（Folgeprodukt）へと変換されることができる。好ましくは本発明の範囲内において例えばヒドロキシカルボン酸の不飽和カルボン酸への脱水である。
【００６１】
ヒドロキシカルボン酸の脱水のための一連の方法は当業者に知られており、これは例えばPCT/EP2007/055394, US 3,666,805及びUS 5,225,594に記載されている。
【００６２】
本発明による方法は更にこの生成物分画からのカルボン酸の精製及び単離のための１又は複数の後続の工程を含むことができる。適した方法工程は特に濃縮、結晶化、イオン交換クロマトグラフィ、電気透析、反応性溶媒を用いた抽出、及び、カルボン酸と適したアルコールでエステル化し、この得られるエステルを引き続き蒸留し、かつこのエステルを遊離酸へと引き続き加水分解することによる精製、並びに、これら工程の組み合わせである。この生成物分画中に含有される副生成物はこの熱による塩分解の際に形成される遊離カルボン酸の単離前又は後に除去されるか、又はカルボン酸へと反応させられることができる。
【００６３】
以下に記載の実施例は、この全体の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から適用の幅が明らかである本発明をこの実施例に挙げる実施態様に限定することなく、本発明を例示的に記載する。
【００６４】
以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】様々なＴＯＡ濃度の存在下での細胞の成長。
【図２】様々なＴＯＡ濃度の存在下での２−ヒドロキシイソ酪酸の製造。
【図３】方法工程Ａ）における水不溶性アミンの使用と一緒のプロセス略図。
【図４】方法工程Ａ）における水溶性アミンの使用と一緒のプロセス略図。
【００６６】
実施例：
ＴＯＡ（トリオクチルアミン）とラルストニア・ユートロファとの生体親和性
配列番号１を有するプラスミド: pBBR1MCS-2 : licmA-icmBでトランスフォーメーションしたラスルストニア・ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類、ＤＳＭＺ５４１）の培養物を４００ｍｌの規模で標準培地中で４６時間ＯＤ（６００ｎｍでの光学密度）約３０まで、ＣＦＵ（colony formed units）１×１０11／ｍｌに相当、標準条件（３０℃；ｐＨ６．８、ｒｐｍ２５０−７５０；ｐＯ2 ２０％）で発酵させた。発酵時間４８時間後に０．５％、１％、５％及び１０％（ｗ／ｖ）トリオクチルアミン（ＴＯＡ）を滅菌して添加した。更なる６及び２０時間後にこのＣＦＵを測定した。
【００６７】
このＣＦＵの算出のためにこのブイヨンの希釈系列を作成した。この希釈物を寒天プレートに播き、２４時間３０℃でインキュベーションした。この後にこの希釈物１０7及び１０8の測定を４回行った。
【００６８】
結果：２０時間の期間（発酵時間４６−６５時間）にわたりこのＣＦＵはＴＯＡ（０．５％、１％、５％及び１０％（ｗ／ｖ））の存在下で更に増加した。
【００６９】
この値は以下の表にまとめてあり、このＣＦＵ値は１ｍｌの発酵ブイヨンに対して規格化標準化してある。
【表１】
【００７０】
トリアルキルアミンの存在下での水性媒体中に存在する生物学的細胞によるカルボン酸の製造
プラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmB、配列番号１、でトランスフォーメーションしてある２−ヒドロキシイソ酪酸を産生するラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類、ＤＳＭＺ５４１）を、２つの５０ｍｌの培養物として振盪インキュベーター中で標準条件（３０℃、１４０ｒｐｍ、２０ｈ）下でＬＢ培地中で成長させた。
【００７１】
ここからバイオマス生成のために５×１０ｍｌを４０ｍｌの改変した無機塩培地（Schlegel et al . , 1961による）に植え付け、１０時間標準条件下でインキュベーションした。
【００７２】
このバイオマス培養物を遠心分離により分離し、１０ｍｌの改変した無機塩培地中に再懸濁した。この再懸濁物を用いてRamos振盪インキュベーター（Respiration Activity Monitoring System）の５つのフラスコを植え付けた。このフラスコはビタミンＢ１２（６０ｍｇ／ｌ）を有する改変した無機塩培地（１ｇ／Ｌの酵母エキス及び１５ｇ／Ｌのフルクトースの添加）で充填されていた。３つのフラスコは更に１、５及び１０％（ｗ／ｖ）のトリオクチルアミン（ＴＯＡ）を含有した。
【００７３】
このフラスコを２４時間標準条件（３０℃、１４０ｒｐｍ）下でインキュベーションした。
【００７４】
０、１５及び２４時間後に試料を取り出し、ＣＦＵ（ＯＤ）、ｐＨ及び２ＨＩＢ−濃度をこのブイヨン中で測定した。
【００７５】
このＣＦＵ測定のためにこのブイヨンの希釈系列を製造した。この希釈物を３００ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬＢ寒天プレート上に播き、２４時間３０℃でインキュベーションした。この後に希釈物１０-8及び１０-9の測定を４回行った。
【００７６】
図１は、この培養の結果を示し、ＣＦＵ値は１ｍｌの発酵ブイヨンに対して標準化されている。この細胞成長は明らかにアルキルアミンの存在により影響されていない。
【００７７】
この生成したカルボン酸２−ヒドロキシイソ酪酸の濃度の測定をイオンクロマトグラフィ（IC(Methrom 761 Compact、オートサンプラー付き, Methode Dionex AS154 x 250mm＋前カラムAG 154 x 350ml）及びＨＰＬＣ（Agilent Technologies HPLC 1200系列, Methode Aminex）を用いて行った。
【００７８】
図２は、この２−ＨＩＢ−濃度の上述の培養のＩＣ測定値を示す。
【００７９】
全てのバッチにおいてこの全試験期間を超えて２−ヒドロキシイソ酪酸が形成される。
【００８０】
アルキルアンモニウム−塩の熱による分解
トリオクチルアンモニウム塩溶液を２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢ）のトリオクチルアミン（ＴＯＡ）との混合により作成した。このために２−ヒドロキシイソ酪酸１０ｇを秤量し、ＴＯＡ９０ｇ中に溶解させた。この秤量物からＴＯＡ／２−ヒドロキシイソ酪酸の化学量論比２．６４が生じる。
【００８１】
反応蒸発器中にこのトリオクチルアンモニウム塩溶液５０．６ｇを装入した。真空ポンプを使用して熱による塩分解のために絶対圧２７ｍｂａｒが調整された。この使用されたオイルバスはこの装入物の温度調節のために１８０℃に調整され、一定に維持された。約２０分間後にこの冷たいガラス部分に白色結晶が晶出した。約４時間後にこの試験を中断した。熱による分解後のこの装入物の計量は３．５ｇの質量減少を生じた。ガラスに存在する白色結晶を水で洗浄し、ＨＰＬＣを用いて分析した。この分析はこの結晶が２−ヒドロキシイソ酪酸であることを示した。元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ）によりこの試料を試験開始前にもまた同様にこの実験終了後にも分析した。この分析を基礎としてこのそれぞれの物質の濃度及び物質量が算出されることができた。供給されたＴＯＡ量の９８．４％がこの試験後にまだ装入物中に存在した；２−ヒドロキシイソ酪酸の当初の物質量の３４．４％が試験終了時にまだトリアルキルアンモニウム塩としてこの装入物中に存在した。秤量した２−ヒドロキシイソ酪酸の質量の６５．６％が熱により塩から分解されることができ、部分的に結晶としてこの冷たいガラス部分に回収されることができた。
【００８２】
方法工程Ａ）における水不溶性アミンの使用と一緒の例示的なプロセス略図
図３は、本発明による方法の一構成を記載し、この場合に方法工程Ａ）において水不溶性アミンが使用される。これは発酵器中でｐＨ値制御のために使用される。これにより発酵器中でアンモニウムカルボキシラートが形成される。バイオマス分離後にこの水不溶性相及びこの水相が分離されることができる。この水相は場合による精製後に発酵器中に返送されることができる。この水不溶性相中にはアンモニウムカルボキシラートが存在した。これは後続の熱による塩分解においてこの遊離酸及びこの相応するアミンに分解されることができる。場合による精製後にこのアミンは再度発酵器中にｐＨ値制御のために返送され、これにより循環されることができる。
【００８３】
方法工程Ａ）における水溶性アミンの使用と一緒の例示的なプロセス略図
図４は、本発明による方法の一構成を記載し、この場合に方法工程Ａ）において水溶性アミンがｐＨ値制御のために使用される。これにより発酵器中でアンモニウムカルボキシラートが形成される。バイオマス分離後にこの水溶液に水不溶性アミンを添加する。この方法工程Ｂ）においてこのカルボキシラートは有機相に移行され、場合によりこの水不溶性アミンは部分的に除去される。この有機相は熱による塩分解に供給され、これにより一方ではこの遊離酸が、他方ではこのアミンが形成される。両方の物質流は必要な場合には別個の精製段階で精製されることができる（方法では考慮されていない）。このようにして取得されたアミンはこのプロセスに再度供給されることができる。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の主題は、以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
【０００２】
先行技術
カルボン酸の生化学的製造は例えば乳酸又はクエン酸生成を基礎として良く知られている。この大抵の発酵プロセスは製造すべきカルボン酸のｐＫa値の上方にある媒体のｐＨ値で実施されるので、このカルボン酸は大部分が塩として生じ、遊離酸としては生じない。これらカ−ボナートは大抵は酸の添加によりその遊離酸に移行する。
【０００３】
WO9815517は、塩基性の、有機溶媒又は水混合不能アミンを用いた乳酸の抽出方法を記載する。
【０００４】
DE 102006052311は、遊離α−ヒドロキシカルボン酸の製造方法であって、第３級アミンの存在下でこの相応するアンモニウムカルボキシラートを、発生するアンモニアを蒸留により除去しながら加熱し、この後に更なる留去及びこれに伴う第３級アミン及び遊離α−ヒドロキシカルボン酸の形成が引き続く方法を記載する。
【０００５】
US 4,275,234は、抽出剤としてアミンを用いたカルボン酸の抽出方法を記載し、これはカルボン酸を再度水溶液中に存在させる付加的な水性逆抽出工程を含む。
【０００６】
US 4,444,881は、発酵ブイヨンから有機酸を単離するための方法であって、この酸をそのカルシウム塩に移行させ、トリアルキルアンモニウム塩及び沈殿する炭酸カルシウムの形成下で水溶性第三級アミン−カーボナートを添加し、このトリアルキルアンモニウム塩溶液を濃縮し、かつ、加熱によってこのトリアルキルアミン塩を分解することによる方法を記載する。
【０００７】
EP 1385593は、短鎖カルボン酸をそのアルキルアンモニウム錯体の溶液から後処理するための方法であって、共沸性（azeotrophierend）炭化水素の添加下で、このアルキルアンモニウム錯体がこの遊離の短鎖カルボン酸及びアルキルアミンに分解する条件で蒸留することによる方法を記載する。
【０００８】
US 5,510,526は発酵ブイヨンから遊離乳酸を後処理するための方法であって、水と混合可能でない、少なくとも１８個の炭素原子数を有するトリアルキルアミンを含有する抽出剤で、ＣＯ2の存在下で抽出し、この有機相を水相から分離し、引き続きこの遊離乳酸をこの有機相から分離することによる方法を記載する。
【０００９】
WO02090312は、水溶液から遊離カルボン酸を精製するための方法であって、この水溶液を有機溶媒との混合物として加熱し、このようにして遊離酸が得られる方法を記載する。
【００１０】
US 5,132,456は、水性媒体から遊離カルボン酸を精製するための多工程方法を記載し、ここでまずこのカルボン酸を酸吸収剤で抽出し、水溶性アミンを用いてこの水性媒体からこの酸吸収剤から／のこの剤の分離後にこのカルボン酸を新たにアンモニウムカルボキシラートとして再抽出する。引き続きこのアンモニウムカルボキシラートを分解する。
【００１１】
全ての方法では、大量の水性物質流が発生するか又は生成物が生じることが欠点であり、これはこの方法に再度供給することができず、したがって廃棄物として残存する。
【００１２】
本発明の課題は、先行技術の前述の欠点を克服する方法を提供することであった。
【００１３】
発明の説明
意外なことに、アミンの添加下で生物学的細胞によりカルボン酸を製造する方法工程、及び場合により、この添加されたアミンが水溶性である場合には、更なる、水不溶性アミンを添加する方法工程、この水不溶性相を分離する方法工程、及び、遊離カルボン酸の放出下でこれを加熱する方法工程を含む遊離のカルボン酸の製造方法が、本発明の課題を解決することが見出された。
【００１４】
本発明の利点は、反応溶液の例えば鉱酸又は二酸化炭素を用いた酸性化の省略である。これにより大量の酸、例えば硫酸アンモニウム又は石膏の発生が省略され、これは他のプロセスでしばしば生じる。
【００１５】
更なる利点は、水が早期に方法においてエネルギー的に有利に、例えば相分離により分離されることであり、これにより更にエネルギー消費性物質流が方法において減少されることである。同様に、この物質流を蒸発する必要はない。
【００１６】
さらに本発明の利点は、この生物化学的プロセスではしばしば生じる生成物阻害（Produktinhibierung）が水溶性でないアミンの使用により回避されることができるとの事実である。
【００１７】
本発明の範囲内において概念「カルボン酸」とは、遊離カルボン酸（−ＣＯＯＨ）もまた同様にこの相応する塩（−ＣＯＯ-）も含む。
【００１８】
本発明の範囲内において概念「ヒドロキシカルボン酸」とは、少なくとも１のヒドロキシル基及びカルボン酸基を有するカルボン酸を記し、かつ、遊離カルボン酸（−ＣＯＯＨ）もまた同様にこの相応する塩（−ＣＯＯ-）も含む。
【００１９】
本発明の範囲内において概念「アンモニウムカルボキシラート」とは、四価の窒素を有する、一価の正に荷電した基の全てのカルボキシラートを含む。例として以下の一般式
【化２】
［式中、Ｒ1'、Ｒ2'、Ｒ3'及びＲ4'は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨである］
が挙げられる。
【００２０】
本発明の範囲内において概念「水不溶性」とは１００ｇ／ｋｇ水溶液より少ない溶解性として定義されている。
【００２１】
本発明の範囲内において概念「水溶性」とは１００ｇ／ｋｇ水溶液以上の溶解性として定義されている。
【００２２】
全ての記載されたパーセント（％）は、他のことが記載されていない場合には、質量パーセントである。
【００２３】
したがって、本発明の主題は、以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化３】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程、
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からはこの相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法である。
【００２４】
本発明の範囲内において好ましいカルボン酸は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、マロン酸及びコハク酸を含む群から選択されている。
【００２５】
本発明の範囲内においてカルボン酸がヒドロキシカルボン酸であることも同様に好ましい。
【００２６】
好ましいヒドロキシカルボン酸の群は、α−ヒドロキシカルボン酸を含む。ここで好ましくはこれは乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸及び２−ヒドロキシイソ酪酸であり、その際２−ヒドロキシイソ酪酸が特に好ましい。
【００２７】
好ましいヒドロキシカルボン酸の更なる群は、β−ヒドロキシカルボン酸を含む。ここで好ましくはこれは３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸及び３−ヒドロキシイソ酪酸であり、その際３−ヒドロキシイソ酪酸が特に好ましい。
【００２８】
方法工程Ａにおいてカルボン酸は水性媒体中に存在する生物学的細胞により当業者に知られている方法に応じて製造される。使用される細胞及び製造されるカルボン酸に応じてこの方法パラメーターは相応して適合される。この方法は例えば発酵による方法であることができる。
【００２９】
方法工程Ａ）において使用される細胞が微生物であることが好ましい。
【００３０】
好ましくはこの使用される細胞は次のものを含む属の群から選択されている：
アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）。
【００３１】
特に好ましくは使用される細胞はアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・サチラス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、大腸菌（Escherichia coli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・ エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、メチロバクテリウム・エキストルクエンス（Methylobacterium extorquens）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）を含む群から選択されており、特にラルストニア・ユートロファＨ１６（Ralstonia eutropha H16）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、パラコッカス・ベルスタス（Paracoccus versutus）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）及びピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む群から選択されており、その際大腸菌、ヤロウイア・リポリティカ、コリネバクテリウム・グルタミクム及びラルストニア・ユートロファが特にとりわけ好ましい。
【００３２】
本発明による方法の特別な一実施態様は、方法工程Ａ）において、二酸化炭素及び一酸化炭素からなる群から選択される少なくとも１の炭素供給源からカルボン酸を形成することができる細胞が使用されることにより特徴付けられるしたがって、この場合にこれはアセトゲン（acetogen）として又は独立栄養的に成長可能な細胞の使用であり、好ましくはアセトゲニウム・キブイ（Acetogenium kivui）、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodii）、アセトアンアエロビウム・ノテラ（Acetoanaerobium notera）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）、ブチリバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・テルモアセチカム（Clostridium thermoaceticum）、ユウバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、クロストリジウム・リュングダリイ（Clostridium ljungdahlii）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）及びクロストリジウム・カルボキシディボランス（Clostridium carboxidivorans）を含む群から選択されたものである。
【００３３】
方法工程Ａ）において添加されるアミンとしてアンモニア及びアルキルアミンが使用されることができる；この場合に第一級、第二級及び第三級アルキルアミン並びに第四級アミン塩が使用されることができる。
【００３４】
方法工程Ａ）において添加されるアミンを、この水性媒体のｐＨ値に影響を及ぼすために、好ましくはこのｐＨ値を高めるために使用することが好ましい。好ましくはこのｐＨ値は方法工程Ａ）において添加されるアミンにより２〜９、好ましくは４〜８、特に好ましくは５〜７の範囲に維持される。
【００３５】
好ましくはアミンとして方法工程Ａ）において水不溶性アミンが使用される。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換のアルキル基であって好ましくは２〜２０個、特に好ましくは４〜１６個、特にとりわけ好ましくは６〜１２個のＣ原子を有する基、又はＨであるアミンが方法工程Ａ）において使用される。
【００３６】
好ましくは方法工程Ａ）において水不溶性アミンは、少なくとも１６個のＣ原子を有するアルキルアミン、特にトリアルキルアミン、特に好ましくはトリアルキルアミンであって、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、トリカプリルアミン、トリドデシルアミンを含む群から選択されるものである。
【００３７】
本発明による方法の特別な一実施態様において、方法工程Ａ）においてより大きな塩基強度を有するアミンを使用することが好ましくあることができる；この場合に、アミンとしてジアルキルアミン、好ましくはジ−イソ−トリデシルアミン、ビス（２−エチルヘキシルアミン）、ラウリル−トリアルキルメチルアミン、ジウンデシルアミン、ジデシルアミンを含む群から選択されたジアルキルアミンを使用することが好ましい。
【００３８】
このアミンを方法工程Ａ）においてカルボン酸に対して少なくとも１．１：１、好ましくは１．５〜５：１のモル比で添加する。
【００３９】
方法工程Ａ）の後又は常にその間にこの液状含分又はこの液状含分の一部が当業者に知られている方法、例えば遠心分離、タンジェント濾過その他に応じて、及び生物学的細胞が相互に分離されることができる。場合により、分離された成分、例えば水性媒体又は細胞は本方法に新たに供給されることができる。
【００４０】
場合によりこの方法工程Ａ）で得られた液状成分は更なる方法工程前に濃縮されることができる。
【００４１】
方法工程Ｂ）において添加されるアミンとして当業者に知られている全ての水不溶性アミン、好ましくはアルキルアミンが使用されることができる。好ましくは、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換のアルキル基であって好ましくは２〜２０個、特に好ましくは４〜１６個、特にとりわけ好ましくは６〜１２個のＣ原子を有する基、又はＨである水不溶性アミンが方法工程Ｂ）において使用される。
【００４２】
更に好ましく使用されるアミンは方法工程Ａ）における上述の水不溶性アミンに相当する。
【００４３】
このアミンを方法工程Ｂ）においてカルボン酸に対して少なくとも１．１：１、好ましくは１．５〜５：１のモル比で添加する。
【００４４】
方法工程Ｂ）においてはこの方法工程Ａ）の水不溶性アミンは少なくとも部分的に除去されることができる。特に、方法工程Ｂ）においてこの水溶性アミンよりもより弱塩基である（より小さいｐＫBを有する）水不溶性アミンが使用される場合には、この水溶性アミンの少なくとも一部が除去されることが好ましい。
【００４５】
これは例えば抽出、イオン交換により、加熱により、すなわちこの水溶性アミンの熱による追い出し（Austreiben）により達成されることができるか、しかし又は、ＣＯ2の導入により達成されることができ、その際水溶性アミンはカーボナートとして沈殿する。水溶性アミンの分離のための例示的方法はDE 102006052311に記載されている。
【００４６】
この除去された水溶性アミンは方法工程Ａ）に新たに供給されることができる。
【００４７】
方法工程Ａ）又はＢ）後に多相系が存在し、かつ水不溶性アミン及びカルボン酸からこの相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される。
【００４８】
このアンモニウムカルボキシラートは好ましくは−有機相に対する水相の同じ体積に対して−大部分が、好ましくは６０％より多くが、特に好ましくは８０％より多くが、特にとりわけ好ましくは９０％より多くが水不溶性相に存在する。
【００４９】
更なる水不溶性溶媒が、水不溶性アミンに場合により添加されることができ、これは好ましい特性、例えばより良好な相分離又はより安定な相を保証するため、このアミンの粘度を減少させるため、又はこのカルボキシル酸の溶解性を高めるためである。
【００５０】
更なる水不溶性溶媒として、例えば少なくとも８個の炭素原子を有するアルコール、ケトン、例えばメチルイソブチルケトン、芳香族溶媒、例えばトルエン及びキシレン、脂肪族非極性溶媒、例えばケロシン及びヘキサンが使用されることができる。好ましくはオレイルアルコール及びドデカノールが使用される。
【００５１】
好ましくは沸点が水不溶性アミンの上方にある更なる溶媒が使用される。
【００５２】
方法工程Ｃ）においてはアンモニウムカルボキシラートを含有する水不溶性相がこの水相から分離される。これは、有機相を水相から分離できる当業者に知られている全ての方法、例えばデカンテーション、遠心分離により、又は蒸留によっても行うことができる。このための例は特にPerry's Chemical Engineers ' Handbook (Section 15); By Robert H Perry, Don W Green, James O Malone; Published 1999; McGraw-Hillに見出される。
【００５３】
本発明の方法の範囲内では、この分離された水相が本方法に再度供給されることが好ましくあることができる。
【００５４】
同様に、この分離された水不溶性相を更に精製することが好ましくあることができ、これは例えば抽出、濾過、遠心分離イオン交換又は濃縮、例えば蒸留、抽出によるものであることができる。
【００５５】
方法工程Ｄ）における遊離カルボン酸の放出はこの水不溶性相の加熱により、好ましくは減圧下で、このアンモニウムカルボキシラートの分解により行われる。
【００５６】
減圧は本発明の範囲内において１＊１０5Ｐａ未満、好ましくは０．９＊１０5Ｐａ未満、特に好ましくは０．８＊１０5Ｐａ未満の圧力を意味する。
【００５７】
この加熱の種類は使用される装置／設備に依存し、例えば熱浴、温度調節可能な反応器ジャケットにより、又はこの水不溶性相と加熱したガス流との接触により行うことができる。この温度は、熱による塩分解が起こり、かつ副生成物の形成が最低限にされるように、使用される圧力に依存して選択される。好ましくは同時に、この反応の間に形成されたカルボン酸の少なくとも一部を蒸留により除去する。適した温度範囲及び圧力範囲は、熱処理の必要な期間と同様に当業者により決定されることができ、例えばこれは形成されるアミン又はカルボン酸の量又はこの反応溶液の温度経過の監視による。
【００５８】
好ましい一実施態様において方法工程Ｄ）においてこの温度は８０℃〜３００℃、好ましくは１２０℃〜２５０℃、特に好ましくは１５０℃〜２２０℃の温度範囲内にある。
【００５９】
この方法工程Ｄ）において得られる水不溶性アミンは再度本方法に供給されることができる。
【００６０】
この方法工程Ｄ）において得られる、カルボン酸を含有する生成物分画は更なる精製無く反応生成物（Folgeprodukt）へと変換されることができる。好ましくは本発明の範囲内において例えばヒドロキシカルボン酸の不飽和カルボン酸への脱水である。
【００６１】
ヒドロキシカルボン酸の脱水のための一連の方法は当業者に知られており、これは例えばPCT/EP2007/055394, US 3,666,805及びUS 5,225,594に記載されている。
【００６２】
本発明による方法は更にこの生成物分画からのカルボン酸の精製及び単離のための１又は複数の後続の工程を含むことができる。適した方法工程は特に濃縮、結晶化、イオン交換クロマトグラフィ、電気透析、反応性溶媒を用いた抽出、及び、カルボン酸と適したアルコールでエステル化し、この得られるエステルを引き続き蒸留し、かつこのエステルを遊離酸へと引き続き加水分解することによる精製、並びに、これら工程の組み合わせである。この生成物分画中に含有される副生成物はこの熱による塩分解の際に形成される遊離カルボン酸の単離前又は後に除去されるか、又はカルボン酸へと反応させられることができる。
【００６３】
以下に記載の実施例は、この全体の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から適用の幅が明らかである本発明をこの実施例に挙げる実施態様に限定することなく、本発明を例示的に記載する。
【００６４】
以下の図面は実施例の一部である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】様々なＴＯＡ濃度の存在下での細胞の成長。
【図２】様々なＴＯＡ濃度の存在下での２−ヒドロキシイソ酪酸の製造。
【図３】方法工程Ａ）における水不溶性アミンの使用と一緒のプロセス略図。
【図４】方法工程Ａ）における水溶性アミンの使用と一緒のプロセス略図。
【００６６】
実施例：
ＴＯＡ（トリオクチルアミン）とラルストニア・ユートロファとの生体親和性
配列番号１を有するプラスミド: pBBR1MCS-2 : licmA-icmBでトランスフォーメーションしたラスルストニア・ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類、ＤＳＭＺ５４１）の培養物を４００ｍｌの規模で標準培地中で４６時間ＯＤ（６００ｎｍでの光学密度）約３０まで、ＣＦＵ（colony formed units）１×１０11／ｍｌに相当、標準条件（３０℃；ｐＨ６．８、ｒｐｍ２５０−７５０；ｐＯ2 ２０％）で発酵させた。発酵時間４８時間後に０．５％、１％、５％及び１０％（ｗ／ｖ）トリオクチルアミン（ＴＯＡ）を滅菌して添加した。更なる６及び２０時間後にこのＣＦＵを測定した。
【００６７】
このＣＦＵの算出のためにこのブイヨンの希釈系列を作成した。この希釈物を寒天プレートに播き、２４時間３０℃でインキュベーションした。この後にこの希釈物１０7及び１０8の測定を４回行った。
【００６８】
結果：２０時間の期間（発酵時間４６−６５時間）にわたりこのＣＦＵはＴＯＡ（０．５％、１％、５％及び１０％（ｗ／ｖ））の存在下で更に増加した。
【００６９】
この値は以下の表にまとめてあり、このＣＦＵ値は１ｍｌの発酵ブイヨンに対して規格化標準化してある。
【表１】
【００７０】
トリアルキルアミンの存在下での水性媒体中に存在する生物学的細胞によるカルボン酸の製造
プラスミドpBBR1MCS-2 : : icmA-icmB、配列番号１、でトランスフォーメーションしてある２−ヒドロキシイソ酪酸を産生するラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４（カプリアビダス・ネカトール（Cupriavidus necator）として再分類、ＤＳＭＺ５４１）を、２つの５０ｍｌの培養物として振盪インキュベーター中で標準条件（３０℃、１４０ｒｐｍ、２０ｈ）下でＬＢ培地中で成長させた。
【００７１】
ここからバイオマス生成のために５×１０ｍｌを４０ｍｌの改変した無機塩培地（Schlegel et al . , 1961による）に植え付け、１０時間標準条件下でインキュベーションした。
【００７２】
このバイオマス培養物を遠心分離により分離し、１０ｍｌの改変した無機塩培地中に再懸濁した。この再懸濁物を用いてRamos振盪インキュベーター（Respiration Activity Monitoring System）の５つのフラスコを植え付けた。このフラスコはビタミンＢ１２（６０ｍｇ／ｌ）を有する改変した無機塩培地（１ｇ／Ｌの酵母エキス及び１５ｇ／Ｌのフルクトースの添加）で充填されていた。３つのフラスコは更に１、５及び１０％（ｗ／ｖ）のトリオクチルアミン（ＴＯＡ）を含有した。
【００７３】
このフラスコを２４時間標準条件（３０℃、１４０ｒｐｍ）下でインキュベーションした。
【００７４】
０、１５及び２４時間後に試料を取り出し、ＣＦＵ（ＯＤ）、ｐＨ及び２ＨＩＢ−濃度をこのブイヨン中で測定した。
【００７５】
このＣＦＵ測定のためにこのブイヨンの希釈系列を製造した。この希釈物を３００ｍｇ／ｌのカナマイシンを有するＬＢ寒天プレート上に播き、２４時間３０℃でインキュベーションした。この後に希釈物１０-8及び１０-9の測定を４回行った。
【００７６】
図１は、この培養の結果を示し、ＣＦＵ値は１ｍｌの発酵ブイヨンに対して標準化されている。この細胞成長は明らかにアルキルアミンの存在により影響されていない。
【００７７】
この生成したカルボン酸２−ヒドロキシイソ酪酸の濃度の測定をイオンクロマトグラフィ（IC(Methrom 761 Compact、オートサンプラー付き, Methode Dionex AS154 x 250mm＋前カラムAG 154 x 350ml）及びＨＰＬＣ（Agilent Technologies HPLC 1200系列, Methode Aminex）を用いて行った。
【００７８】
図２は、この２−ＨＩＢ−濃度の上述の培養のＩＣ測定値を示す。
【００７９】
全てのバッチにおいてこの全試験期間を超えて２−ヒドロキシイソ酪酸が形成される。
【００８０】
アルキルアンモニウム−塩の熱による分解
トリオクチルアンモニウム塩溶液を２−ヒドロキシイソ酪酸（２−ＨＩＢ）のトリオクチルアミン（ＴＯＡ）との混合により作成した。このために２−ヒドロキシイソ酪酸１０ｇを秤量し、ＴＯＡ９０ｇ中に溶解させた。この秤量物からＴＯＡ／２−ヒドロキシイソ酪酸の化学量論比２．６４が生じる。
【００８１】
反応蒸発器中にこのトリオクチルアンモニウム塩溶液５０．６ｇを装入した。真空ポンプを使用して熱による塩分解のために絶対圧２７ｍｂａｒが調整された。この使用されたオイルバスはこの装入物の温度調節のために１８０℃に調整され、一定に維持された。約２０分間後にこの冷たいガラス部分に白色結晶が晶出した。約４時間後にこの試験を中断した。熱による分解後のこの装入物の計量は３．５ｇの質量減少を生じた。ガラスに存在する白色結晶を水で洗浄し、ＨＰＬＣを用いて分析した。この分析はこの結晶が２−ヒドロキシイソ酪酸であることを示した。元素分析（Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ）によりこの試料を試験開始前にもまた同様にこの実験終了後にも分析した。この分析を基礎としてこのそれぞれの物質の濃度及び物質量が算出されることができた。供給されたＴＯＡ量の９８．４％がこの試験後にまだ装入物中に存在した；２−ヒドロキシイソ酪酸の当初の物質量の３４．４％が試験終了時にまだトリアルキルアンモニウム塩としてこの装入物中に存在した。秤量した２−ヒドロキシイソ酪酸の質量の６５．６％が熱により塩から分解されることができ、部分的に結晶としてこの冷たいガラス部分に回収されることができた。
【００８２】
方法工程Ａ）における水不溶性アミンの使用と一緒の例示的なプロセス略図
図３は、本発明による方法の一構成を記載し、この場合に方法工程Ａ）において水不溶性アミンが使用される。これは発酵器中でｐＨ値制御のために使用される。これにより発酵器中でアンモニウムカルボキシラートが形成される。バイオマス分離後にこの水不溶性相及びこの水相が分離されることができる。この水相は場合による精製後に発酵器中に返送されることができる。この水不溶性相中にはアンモニウムカルボキシラートが存在した。これは後続の熱による塩分解においてこの遊離酸及びこの相応するアミンに分解されることができる。場合による精製後にこのアミンは再度発酵器中にｐＨ値制御のために返送され、これにより循環されることができる。
【００８３】
方法工程Ａ）における水溶性アミンの使用と一緒の例示的なプロセス略図
図４は、本発明による方法の一構成を記載し、この場合に方法工程Ａ）において水溶性アミンがｐＨ値制御のために使用される。これにより発酵器中でアンモニウムカルボキシラートが形成される。バイオマス分離後にこの水溶液に水不溶性アミンを添加する。この方法工程Ｂ）においてこのカルボキシラートは有機相に移行され、場合によりこの水不溶性アミンは部分的に除去される。この有機相は熱による塩分解に供給され、これにより一方ではこの遊離酸が、他方ではこのアミンが形成される。両方の物質流は必要な場合には別個の精製段階で精製されることができる（方法では考慮されていない）。このようにして取得されたアミンはこのプロセスに再度供給されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
カルボン酸がα−又はβ−ヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法工程Ａ）において一般式（Ｉ）の水不溶性アミンが添加されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
方法工程Ａ）又はＢ）においてＲ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換アルキル基又はＨであることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
方法工程Ｄ）においてこの遊離カルボン酸を減圧下で放出させることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
方法工程Ｄ）においてこの遊離カルボン酸を８０℃〜３００℃、好ましくは１２０℃〜２５０℃、特に好ましくは１５０℃〜２２０℃の温度範囲で放出させることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが、この水性媒体のｐＨ値に影響を及ぼすために使用されることを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
方法工程Ｄ）において一般式（Ｉ）の化合物が回収され、本方法に再度供給されることを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
方法工程Ａ）において使用される細胞が微生物であることを特徴とする請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
方法工程Ａ）において使用される細胞が、次のもの：
アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）を含む属の群から選択されていることを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１】
以下の方法工程：
Ａ）水性媒体中に存在する生物学的細胞により一般式（Ｉ）
【化１】
［式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は相互に独立して同じか又は異なる、分枝又は非分枝の、場合により置換された炭化水素基又はＨを表す］
のアミンの添加下でカルボン酸を製造する方法工程
Ｂ）方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが水溶性である場合には、一般式（Ｉ）の水不溶性アミンを添加する方法工程、
その際、この方法工程Ａ）又はＢ）においては多相系が得られ、かつ、この水不溶性アミン及びカルボン酸からは相応するアンモニウムカルボキシラートが形成される、及び
Ｃ）この水不溶性相を分離する方法工程、及び
Ｄ）この水不溶性相を遊離カルボン酸の放出下で加熱する方法工程
を含む遊離カルボン酸の製造方法。
【請求項２】
カルボン酸がα−又はβ−ヒドロキシカルボン酸であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
方法工程Ａ）において一般式（Ｉ）の水不溶性アミンが添加されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
方法工程Ａ）又はＢ）においてＲ1、Ｒ2及びＲ3が相互に独立して同じか又は異なる、非分枝の、非置換アルキル基又はＨであることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
方法工程Ｄ）においてこの遊離カルボン酸を減圧下で放出させることを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
方法工程Ｄ）においてこの遊離カルボン酸を８０℃〜３００℃、好ましくは１２０℃〜２５０℃、特に好ましくは１５０℃〜２２０℃の温度範囲で放出させることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
方法工程Ａ）においてこの添加されたアミンが、この水性媒体のｐＨ値に影響を及ぼすために使用されることを特徴とする請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
方法工程Ｄ）において一般式（Ｉ）の化合物が回収され、本方法に再度供給されることを特徴とする請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
方法工程Ａ）において使用される細胞が微生物であることを特徴とする請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
方法工程Ａ）において使用される細胞が、次のもの：
アスペルギルス（Aspergillus）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、バシラス（Bacillus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、アルカリゲネス（Alcaligenes）、ラクトバシラス（Lactobacillus）、パラコッカス（Paracoccus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）、ハンゼヌラ（Hansenula）、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）、サッカロマイセス（Saccharomyces）、エシェリキア（Escherichia）、ザイモモナス（Zymomonas）、ヤロウイア（Yarrowia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、ラルストニア（Ralstonia）、シュードモナス（Pseudomonas）、ロドスピリルム（Rhodospirillum）、ロドバクター（Rhodobacter）、バークホルデリア（Burkholderia）、クロストリジウム（Clostridium）及びクプリアビダス（Cupriavidus）を含む属の群から選択されていることを特徴とする請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５２６１４９（Ｐ２０１１−５２６１４９Ａ）
【公表日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１５２６１（Ｐ２０１１−５１５２６１）
【出願日】平成２１年４月２９日（２００９．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５１６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００５０６
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（３９０００９１２８）エボニック レーム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (293)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｒｏｅｈｍ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｋｉｒｓｃｈｅｎａｌｌｅｅ，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月６日（２０１１．１０．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２９日（２００９．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５５１６３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０００５０６
【国際公開日】平成２２年１月７日（２０１０．１．７）
【出願人】（３９０００９１２８）エボニック レーム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (293)
【氏名又は名称原語表記】Ｅｖｏｎｉｋ Ｒｏｅｈｍ ＧｍｂＨ
【住所又は居所原語表記】Ｋｉｒｓｃｈｅｎａｌｌｅｅ，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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