運動神経細胞・感覚神経細胞特異的エンハンサー
運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に、遺伝子の発現効率を高める。以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、任意の遺伝子の発現を特異的に増強できるエンハンサーに関する。
【背景技術】
Ａｒｂｅｒら（Ｎｅｕｒｏｎ，１９９９ Ａｕｇｕｓｔ ２３：６５９−６７４）により、運動神経細胞特異的な発現を示すマウスＨｂ９遺伝子のプロモーターが単離されている。このプロモーターは、トランスジェニックマウスにおいて体性運動神経細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ）に特異的にレポーター遺伝子の発現を誘導することが知られている。しかし、Ｈｂ９遺伝子の運動神経細胞での発現は一過性のものであり、成熟した細胞にはレポーター遺伝子の発現を誘導することは困難であると考えられる。さらに、この系では内臓運動神経（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ）にはレポーター遺伝子の発現を誘導しない。また、このプロモーターは、Ｈｂ９遺伝子の転写開始点から上流約９ｋｂｐを含んでおり、組み換え体作製などの作業において取扱いの煩雑さを伴うことが予想される。また、マウス由来のプロモーターであることから、仮に治療で用いられることがあるとすると、倫理的な問題も生じかねない。
一方、エンハンサーとは、ＲＮＡポリメラーゼによる転写効率を高める特定の塩基配列である。エンハンサーは、特定の遺伝子の上流或いは下流に存在し、遺伝子発現制御能を有する制御タンパク質等が結合することによって、特定の遺伝子の転写を促進することができる。
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に、遺伝子の発現効率を高めることができるエンハンサーを提供することを目的とする。また、本発明は、当該エンハンサーを有するベクター、トラスジェニック動物、遺伝子発現調節方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、当該エンハンサーを用いた多能性幹細胞の分化判別方法及び運動神経・感覚神経の再生方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（３）上記運動神経細胞は、背側に軸索を進展する運動神経細胞であることを特徴とする（１）又は（２）記載のエンハンサー。
（４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（５）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（６）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサーを有するベクター。
（７）プロモーターと、コード領域を含む遺伝子とを更に有することを特徴とする（６）記載のベクター。
（８）（６）又は（７）記載のベクターを有する遺伝子導入細胞。
（９）（６）又は（７）記載のベクターを有するトランスジェニック動物。
（１０）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサーの制御下で、所定の遺伝子の発現効率を向上させることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
（１１）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー及び上記所定の遺伝子とを有する核酸構築物を細胞に導入する工程を有し、
運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、上記所定の遺伝子の発現効率を高めることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
（１２）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程とを有し、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別することを特徴とする多能性幹細胞の分化判別方法。
（１３）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程と、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別し、運動神経細胞又は感覚神経細胞を選択する工程と、
選択された運動神経細胞又は感覚神経細胞を移植する工程とを有する
運動神経・感覚神経の再生方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００２−２５４８２９号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ゼブラフィッシュゲノムにおけるＩｓｌｅｔ−１遺伝子近傍のＥｃｏＲＩ制限酵素地図を示す図である。
図２は、ＩＣＰ−ＧＦＰプラスミドの一部を示す模式図である。
図３は、ＣＭ領域の部分断片を有するプラスミドの設計を示す図である。
図４は、ｈｓｐ−ＧＦＰプラスミドの一部を示す模式図である。
図５は、ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図６は、ＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図７は、ＳＳ領域の部分断片を有するプラスミドの設計を示す図である。
図８は、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図９は、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１０は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図１１は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１２は、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図１３は、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１４は、ｚＣＭ、ｈｕＣＭ、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭ間での相同性を調べた結果をアライメントして示す図である。
図１５は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ或いはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図１６は、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ或いはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１７は、ｚＳＳ及びｈｕＳＳ間での相同性を調べた結果をアライメントして示す図である。
図１８は、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュにおける頭部及び脊髄を側面から撮像した写真である。
図１９は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図２０は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を全面から撮像した写真である。
図２１は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける肋骨を側面から撮像した写真である。
図２２は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける肋骨を内側から撮像した写真である。
図２３は、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図２４は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュ及び、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ並びにｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの写真である。
図２５は、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュ及びｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号１の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号１の塩基配列は、ゼブラフィッシュゲノムにおいて、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在する領域（以下、ＣＭ領域と呼ぶ）に含まれている。配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、運動神経細胞核において特異的に遺伝子発現効率を高める作用を有するエンハンサーである。なお、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子は、分化した運動神経細胞の早期マーカーの一つであり、ゼブラフィッシュ２４時間胚においては、運動神経細胞ならびに感覚神経細胞に強く発現する。
また、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号２、３又は４に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号２、３又は４の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号２、３又は４の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号１の塩基配列に基づいて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）で公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって配列番号２の塩基配列を同定することができる。また、配列番号１の塩基配列に基づいて、ＮＣＢＩで公開されているマウスゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、配列番号３の塩基配列を同定することができる。また、配列番号１の塩基配列に基づいて、ＮＣＢＩで公開されているフグゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、配列番号４の塩基配列を同定することができる。
すなわち、配列番号１の塩基配列はゼブラフィッシュゲノム由来のエンハンサーであり、配列番号２の塩基配列はヒトゲノム由来のエンハンサーであり、配列番号３の塩基配列はマウス由来のエンハンサーであり、配列番号４の塩基配列はフグゲノム由来のエンハンサーである。
なお、以下の説明において、（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡからなるエンハンサー、（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサー及び（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサーをまとめてＣＭエンハンサーと呼ぶ。
一方、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号５の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、感覚神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、感覚神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号５の塩基配列は、ゼブラフィッシュゲノムにおいて、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在する領域（以下、ＳＳ領域と呼ぶ）に含まれている。配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、感覚神経細胞核及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において特異的に遺伝子発現効率を高める作用を有するエンハンサーである。
また、配列番号５の塩基配列に基づいて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって配列番号６の塩基配列を同定することができる。したがって、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号６の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。なお、配列番号６の塩基配列からなるエンハンサーは、感覚神経細胞においては活性を示さない。
なお、以下の説明において、（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡからなるエンハンサー、（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサー及び（ｃ）配列番号５又は６に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサーをまとめてＳＳエンハンサーと呼ぶ。
ここで、配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列とは、例えば、１〜３０塩基、好ましくは１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を意味する。特に、欠失、置換又は付加する領域としては、配列番号１における２３５〜５６０番目以外の領域、配列番号２における２０４〜５２８番目以外の領域、配列番号３における２０６〜５３０番目以外の領域、配列番号４における２１１〜５５５番目以外の領域、配列番号５における３７８〜５５３番目以外の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目以外の領域が好ましい。
配列番号１における２３５〜５６０番目の領域、配列番号２における２０４〜５２８番目の領域、配列番号３における２０６〜５３０番目の領域、及び配列番号４における２１１〜５５５番目の領域は、互いに高い相同性を示す領域であり、生物種間において高度に保存されている。このため、配列番号１乃至４におけるこれらの領域は、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高めるといったエンハンサーの機能に寄与する領域であると示唆される。また、配列番号５における３７８〜５５３番目の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目の領域は、互いに高い相同性を示す領域であり、生物種間において高度に保存されている。このため、配列番号５及び６におけるこれらの領域は、感覚神経細胞及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高めるといったエンハンサーの機能に寄与する領域であると示唆される。
配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列に１以上の塩基を欠失、置換又は付加する際には、従来公知の手法を特に限定することなく、適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばＴ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，４８８−４９２（１９８５））、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する１〜２本の改変用オリゴヌクレオチドを、最高１６本のオリゴヌクレオチドを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、あるいは、宝酒造社製のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
また、配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列の相補的な塩基配列にしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、ストリンジェントな条件下において、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことを意味する。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合はハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件においてハイブリダイズすることを意味する。
ここで、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能とは、特に、任意の遺伝子の転写効率を高める機能が運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に出現することを意味する。任意の塩基配列を有するＤＮＡ断片が当該機能を有するか否かは、任意のプロモーター及びレポーター遺伝子を有する発現ベクターに当該ＤＮＡ断片を組み込んで組換えベクターを作製し、組換えベクターを用いて作製したトランスジェニック動物の運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が増大しているか否かを検討する。トラスジェニック動物の運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が増大している場合、当該ＤＮＡ断片は上記機能を有する。
特に、ＣＭエンハンサーは、運動神経細胞のなかでも背側に軸索を進展する運動神経細胞においてエンハンサー活性を示すとともに、全ての運動神経細胞において一過的なエンハンサー活性を示す。また、ＳＳエンハンサーは、運動神経のなかでも腹側に軸索を進展する運動神経細胞において特異的なエンハンサー活性を示す。なお、ゼブラフィッシュ由来のＳＳエンハンサーは、感覚神経細胞においてもエンハンサー活性を示すが、ヒト由来のＳＳエンハンサーは感覚神経細胞においてエンハンサー活性を示さない。
ここで、作製するトランスジェニック動物としては、特に限定されないが、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が容易に判別可能なトランスジェニック動物を作製することが好ましい。例えば、トランスジェニック動物としては、トランスジェニックゼブラフィッシュやトランスジェニックマウス等を用いることができる。
また、ゼブラフィッシュ１細胞卵に顕微鏡注入等の手法によって上述した組換えベクターを注入し、２４時間後、胚におけるレポーター遺伝子の発現を確認することで、任意のＤＮＡ断片について、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有するか否かを確認できる。
ここで、レポーター遺伝子としては、蛍光緑色タンパク質をコードするＧＦＰ遺伝子（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）やアルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子等を使用することができる。
また、プロモーターとしては、ゼブラフィッシュ由来のＩｓｌｅｔ−１遺伝子上流約４ｋｂｐに存在するＩｓｌｅｔ−１プロモーター（Ｉｓｌｅｔ−１ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、以下、ＩＣＰと呼ぶ）や、ゼブラフィッシュ由来熱ショック７０プロモーターや、ヒト由来のプロモーター、具体的にはβグロビンプロモーター等を用いることができる 一方、上述した本発明に係るエンハンサーを用いて、所望の遺伝子を運動神経細胞或いは感覚神経細胞において特異的に発現量を増大できる発現ベクターを構築することができる。プロモーターとしては、上述した各種プロモーターを用いることができる。特に、ヒトに対する遺伝子治療用発現ベクターの場合には、プロモーターとして、ヒト由来のプロモーター、具体的には、βグロビンプロモーターを用いることが好ましい。
また、運動神経細胞或いは感覚神経細胞において特異的に発現量を増大させる遺伝子としては、何ら限定されないが、例えば、家族性ＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）のうちＳＯＤ１遺伝子に変異を持つ群に対して、過剰発現することにより生命予後を改善することが知られている原癌遺伝子Ｂｃｌ−２（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，Ｊｕｌｙ ２５：２７７，５５９−５６２）挙げることができる。本発明に係るエンハンサー、プロモーター及び原癌遺伝子Ｂｃｌ−２を有する発現ベクターを用いて遺伝子治療を行う場合には、Ｂｃｌ−２を運動神経細胞において特異的に発現させることができる。これにより、家族性ＡＬＳに罹患した患者の生命予後を改善する効果を期待することができる。
さらに、例えば、感覚神経細胞に特異的に発現を増大させる遺伝子としては、プレプロエンケファリン遺伝子があげられる。プレプロエンケファリンは内因性麻薬様物質の一つであるエンケファリンの前駆物質であり、これを感覚神経細胞に過剰に発現誘導することにより例えば慢性関節リウマチなどの慢性疼痛を緩和することが可能であると期待することができる。（Ｂｒａｚ Ｊ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００１ Ｏｃｔ １５；２１（２０）：７８８１−８）。
また、上述した本発明に係るエンハンサーは、多能性幹細胞の分化判別方法に用いることができる。この場合、先ず、上記エンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を有する核酸構築物を作製する。ここで核酸構築物とは、上述したような、上記エンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を有する発現ベクターであってもよい。多能性幹細胞とは、発生初期に存在する個体を構成する全ての組織細胞に分化する能力、すなわち多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）をもつ幹細胞を意味する。多能性幹細胞としては、発生初期に存在する多能性を有する幹細胞を選別し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できるように株化した胚性幹細胞（ＥＳ細胞；ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を挙げることができる。
多能性幹細胞に対して核酸構築物を導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、顕微鏡を用いた注入方法、エレクトロポレーション等を挙げることができる。
次に、核酸構築物を導入した多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化すべく、当該多能性幹細胞に対して分化誘導を行う。分化誘導方法としては、例えば、レチノイン酸を含む培養液を用いて培養するなどの方法を挙げることができる。
次に、分化した多能性幹細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検定する。すなわち、レポーター遺伝子の発現量が対照と比較して有意に増加している細胞を、運動神経細胞に分化したものであると判断することができる。そして、レポーター遺伝子の発現量が有意に増加した細胞を選択することによって、多能性幹細胞から分化した運動神経細胞を容易に且つ精度よく選別することができる。
さらに、選別した運動神経細胞は、いわゆる再生医療に用いることができる。具体的には、選別した運動神経細胞を更に培養した後、対照となる動物、例えばヒトに移植することによって、運動神経を欠損した患者に対して有効な治療方法を提供することができる。
一方、上述した本発明に係るエンハンサーは、いわゆる遺伝子治療に用いることができる。具体的には、上述したエンハンサーが制御しうる形で導入対象の遺伝子を有する核酸構築物を作製する。核酸構築物としては、遺伝子治療に用いることができるものであれば特に限定されないが、上記エンハンサー、プロモーター及び導入対象の遺伝子を有するアデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター及びレトロウィルスベクター等を用いることができる。
導入対象の遺伝子は、特に限定されないが、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に発現させることによって、所定の疾患に対する治療・改善効果を奏することが知られている遺伝子を挙げることができる。例えば、導入対象の遺伝子としては、上述したような、原癌遺伝子Ｂｃｌ−２（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，Ｊｕｌｙ ２５：２７７，５５９−５６２）、プレプロエンケファリン遺伝子等を挙げることができる。
次に、核酸構築物を用いて治療対象である患者に対して定法に従って遺伝子治療を行う。
以上のように遺伝子治療を行うことによって、当該遺伝子治療が施された患者では、運動神経細胞又は感覚神経細胞において導入対象の遺伝子を特異的に発現させることができる。本発明に係るエンハンサーを用いた遺伝子治療によれば、運動神経細胞又は感覚神経細胞において、特異的に導入対象の遺伝子を発現させることができるため、より効果的な治療・改善効果を期待することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕エンハンサー領域の同定
先ず、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在するＣＭ領域及び約５５ｋｂｐ下流に存在するＳＳ領域に含まれるエンハンサー機能を示す領域を、以下のように特定した。
ｉ）Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子プロモーターの同定
ゼブラフィッシュゲノムライブラリーを、Ｉｓｌｅｔ−１ ｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子全長並びにその上流のゲノム配列約４．１Ｋｂｐを含む陽性クローンを単離した。この陽性クローンを鋳型として標準的なＰＣＲ法を用いてＩＣＰを単離した（図１参照）。
なお、具体的にゼブラフィッシュゲノムライブラリーは、定法に従いファージベクターとしてλ ＤＡＳＨ ＩＩを用いて調製した。上記ＰＣＲ法には、プライマーとして、ファージベクター由来の配列（ＩＣＰ５ｐｒｉｍｅ）と３’端に制限酵素Ｋｐｎ１認識配列を付加したＩｓｌｅｔ１遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列（ＩＣＰ３ｐｒｉｍｅ）を用いた。プライマーの配列を以下に示す。
上記ＰＣＲによって増幅した領域がプロモーターとしての機能を有するか否かを以下のように確認した。すなわち、先ず、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片のすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルス由来のイントロン／ポリＡ付加シグナルを連結したＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）をレポーター遺伝子として連結したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を構築した（図２参照）。構築したプラスミドをＩＣＰ−ＧＦＰと命名した。
ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入した。具体的には、顕微注入には、プラスチック製注射筒を繋いだホルダーにガラス製マイクロピペットを用いた。ガラス製マイクロピペットに約２５ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒの濃度に調整したＤＮＡ溶液を入れ、実体顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製）下に、細胞質の径約１／３程度に溶液が拡散するくらいの量を注入した。顕微注入後、通常の飼育条件下に飼育し、ＧＦＰの発現を２４時間胚について蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）下で検定した。
その結果、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子のプロモーターを同定するとともに、単離することができた。
ｉｉ）ＣＭ領域及びＳＳ領域の同定
ゼブラフィッシュＢＡＣライブラリーから、Ｉｓｌｅｔ−１ｃＤＮＡを鋳型としてＩｓｌｅｔ−１遺伝子を含む約１００Ｋｂｐのクローンを単離した。
単離したＩｓｌｅｔ−１遺伝子を含む約１００Ｋｂｐのクローンを、制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて完全消化し、得られた断片をそれぞれＩＣＰ−ＧＦＰのＩＣＰ上流に挿入した。ＢＡＣクローンのＥｃｏＲ１処理断片を含むＩＣＰ−ＧＦＰを、それぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＧＦＰによる蛍光の発現を一過性発現系において検定した。
その結果、脳神経運動核に特異的にＧＦＰを発現誘導するゲノム断片（約１５Ｋｂｐ）を同定した。このゲノム断片はＩｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在した。なお、このゲノム断片をＣＭ領域と命名した（図１）。
また、感覚神経に特異的にＧＦＰを発現誘導するゲノム断片（約４．５Ｋｂｐ）を同定した。このゲノム断片はＩｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在した。なお、このゲノム断片をＳＳ領域と命名した（図１）。
ｉｉｉ）ＣＭ領域及びＳＳ領域に含まれるエンハンサーの解析
上記ｉｉ）で同定したＣＭ領域及びＳＳ領域に関して、エンハンサー機能を示す最小領域を解析した。
ＣＭ領域については、図３に示すように、ＣＭ領域中に存在するＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＸＩ認識部位を用いてＣＭ領域の部分断片を設計した。これら部分断片のエンハンサー機能を解析するために、図４に示したプラスミドｈｓｐ−ＧＦＰを用い、ＧＦＰの発現を検定した。なお、ｈｓｐ−ＧＦＰは、ゼブラフィッシュ熱ショックタンパク（ｈｓｐ）７０プロモーターをｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ（図４においてＥＧＦＰと表す）の上流に挿入したものである。
ＣＭ領域の部分断片については、ＰＣＲで増幅したＣＭ領域を所定の制限酵素（ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＸＩ）で処理することによって調製した。ＣＭ領域の部分断片それぞれを、ｈｓｐ−ＧＦＰにおけるｈｓｐの直上に挿入し、８種類のプラスミド、ＣＭＥＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＸＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ１−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ４−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ２−ｈｓｐ−ＧＦＰを構築した（図３）。
次に、これら８種類のプラスミドを、それぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＥＧＦＰによる蛍光の発現を検定した。
その結果、ＣＭＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入した場合には、蛍光を観察することができ、ＥＧＦＰの発現が認められた。ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間後の写真を図５に示す。また、比較のため、ＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＰＣの直上にＣＭ領域全体を挿入したＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを、ゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間後の写真を図６に示す。なお、図５及び６中、「ｎ．ＩＩＩ」は脳神経である動眼神経を示し、「ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「ｎ．Ｘ」は迷走神経を示している。図５及び６から判るように、脳神経である動眼神経、滑車神経、三叉神経、顔面神経と迷走神経の細胞体並びに軸索にＧＦＰが発現している様子が観察できた。
以上の結果より、ＣＭ領域における約８００ｋｂｐの領域を、エンハンサー機能を示す最小領域とした。この約８００ｋｂｐの領域の塩基配列を決定することによって（配列番号１）、運動神経細胞において所定の遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを同定することができた。なお、このエンハンサーが存在する領域は、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約２０ｋｂｐ下流に存在する領域であった。
一方、ＳＳ領域に関しては、適当な制限酵素認識部位がないことからｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラ社製）を使用し、図７に示すように、所定の領域を欠失した部分断片を有する５種類のプラスミド、ＳＳｄ２５−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ３０ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＳＳｄ２５ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰを構築した。
次に、これら５種類のプラスミドと、ＳＳ領域全体を有するプラスミドＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰと、ＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＰＣの直上にＳＳ領域全体を挿入したＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰとを、それぞれそれぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＥＧＦＰによる蛍光の発現を検定した。
その結果、ＳＳｄ２５−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＳＳｄ３０ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入した場合には、蛍光を観察することができ、ＥＧＦＰの発現が認められた。ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図８及び９に示す。また、比較のため、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図１０及び１１に示す。さらに、比較のため、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図１２及び１３に示す。なお、図８〜１３中、「Ｔ．Ｇ」は三叉神経細胞を示し、「Ｒ．Ｂ」はＲｏｈｏｎ−Ｂｅａｒｄ（ローハン・ベアード）細胞を示し、「ｅｙｅ」は目を示し、「ｙｏｌｋ」は卵黄を示している。
図８、１０及び１２から、三叉神経節細胞にＧＦＰが発現している様子が確認できた。一方、図９、１１及び１３から、脊髄内に存在する一次感覚神経細胞であるローハン・ベアード細胞にＧＦＰが発現している様子が確認できた。
以上の結果より、ＳＳ領域における約６００ｋｂｐの領域を、エンハンサー機能を示す最小領域とした。この約６００ｋｂｐの領域の塩基配列を決定することによって（配列番号５）、感覚神経細胞において所定の遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを同定することができた。なお、このエンハンサーが存在する領域は、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在する領域であった。
〔実施例２〕他生物由来エンハンサーの同定
運動神経細胞におけるエンハンサーの塩基配列（以下、ｚＣＭと呼ぶ。配列番号１）に基づいて、ＮＣＢＩのデータベースを用いて相同性検索を行った。相同性検索はＢＬＡＳＴを使用した。その結果、ヒトゲノムデータベースから、配列番号１の塩基配列と約２３０ｂｐにわたり高度に相同性（８１％）を持つ配列が得られた（以下、ｈｕＣＭと呼ぶ。配列番号２）。また、マウスゲノムデータベース及びフグゲノムデータベースからも、配列番号１の塩基配列と高い相同性を持つ配列が得られた（以下、それぞれ以下、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭと呼ぶ。それぞれ配列番号３及び４）。これらｚＣＭ、ｈｕＣＭ、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭ間での相同性を調べた結果を図１４に示す。図１４に示した相同性の結果を検討したところ、相同性の高低に基づいて３つの領域に分類することができた。すなわち、最も相同性が高く、生物種を超えて高度に保存されている領域２、領域２に次いで相同性が高い領域３、及び領域３に次いで相同性が高い領域１に分類することができた。なお、ｚＣＭとｈｕＣＭとの間では、領域２における相同性が８１％であり、領域３における相同性が６３％であり、領域１における相同性が５３％であった。
ｚＣＭにおける領域２は配列番号１における２３５〜５６０番目に相当し、ｈｕＣＭにおける領域２は配列番号２における２０４〜５２８番目に相当し、ｍＣＭにおける領域２は配列番号３における２０６〜５３０番目に相当し、ｆｕｇｕＣＭにおける領域２は配列番号４における２１１〜５５５番目に相当する。領域２は、生物種を超えて高度に保存された領域であるため、エンハンサー機能にとって最も重要な領域であると示唆される。
次に、ｈｕＣＭ及びｍＣＭそれぞれについて、周辺の配列を含むようにプライマーを設計し、ＰＣＲ法で各ゲノムＤＮＡより増幅を行い、単離した。具体的には、ｈｕＣＭをヒトゲノムより増幅する目的でプライマー（ｈｕＣＭｆｏｒｗａｒｄ，ｈｕＣＭｒｅｖｅｒｓｅ）を設計した。以下にその配列を示す。
なお、これらプライマーには、後のプラスミドコンストラクト構築のために制限酵素ＥｃｏＲ１認識配列をそれぞれ両端に付加した。
同様に、ｍＣＭをマウスゲノムより増幅する目的でプライマー（ｍＣＭｆｏｒｗａｒｄ，ｍＣＭｒｅｖｅｒｓｅ）を設計した。配列を以下に示す。
これらのプライマーを用いて、ヒト及びマウス各ゲノムから標準的なＰＣＲ法を用いてそれぞれゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を増幅し、ＴＡクローニング法によりｐＧＥＭＴ ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、単離した。単離されたゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を含むプラスミドを、アルカリＳＤＳ法を用いて大量調整し、制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し、目的とするゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）をアガロースゲルによる電気泳動で回収した。回収したゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を、制限酵素ＥｃｏＲ１で消化したＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＣＰの上流にサブクローニングし、プラスミドｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを構築した。
次に、得られたプラスミドｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞卵に顕微注入し、ＧＦＰの発現を検定した。その結果を図１５及び図１６に示す。なお、図１５中、ＡはｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真であり、ＢはｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真であり、ＣはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真である。また、図１５中、「ｎ．ＩＩＩ」は動眼神経を示し、「ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「ｎ．Ｘ」は迷走神経を示している。
図１６中、ＡはｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合の脊髄を側面から撮像した写真であり、ＢはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合の脊髄を側面から撮像した写真である。図１６中、「ＣａＰ」はＣａｕｄａｌ ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ＭｉＰ」はＭｉｄｄｌｅ Ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ＲｏＰ」はＲｏｓｔｒａｌ ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ｓｍｎ」は二次運動神経細胞を示している。これらＲｏＰ、ＭｉＰ及びＣａＰは、ゼブラフィッシュ胚の各体節ごとに３つづつ存在する一次運動神経細胞であり、それぞれ体幹の中隔部、背側部及び腹側部に軸索を伸ばすことが知られている。その役割は詳細には分かっていないが、体節の筋肉を最終的に支配する二次運動神経細胞の軸索進展のガイダンスの役割を担っていると考えられている。
図１５から判るように、ｈｕＣＭ及びｍＣＭを用いた場合には、ｚＣＭを用いた場合と同様に、脳神経である動眼神経、滑車神経、三叉神経、顔面神経と迷走神経の細胞体並びに軸索にＧＦＰが発現している様子が観察できた。このことから、ｈｕＣＭ及びｍＣＭについても、運動神経細胞において遺伝子の発現効率を高めるエンハンサー機能を示すことが実証された。
また、図１６からは、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合とは異なり、ｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｈｕＣＭ−ＴＣＰ−ＧＦＰを用いた場合においてのみ、脊髄運動神経細胞にＧＦＰの発現が見られた。このことから、ｈｕＣＭ及びｍＣＭを用いた場合には、運動神経細胞のなかでも脊髄運動神経細胞において遺伝子の発現効率を高めるエンハンサー機能を示すことが明らかとなった。
一方、感覚神経細胞におけるエンハンサーの塩基配列（以下、ｚＳＳと呼ぶ。配列番号５）に基づいて、ＮＣＢＩのデータベースを用いて相同性検索を行った。相同性検索はＢＬＡＳＴを使用した。その結果、ヒトゲノムデータベースから、配列番号５の塩基配列と約１２０ｂｐにわたり高度に相同性（８０％）を持つ配列が得られた（以下、ｈｕＳＳと呼ぶ。配列番号６）。これらｚＳＳ及びｈｕＳＳ間での相同性を調べた結果を図１７に示す。
図１７に示した相同性の結果を検討したところ、１）おおまかに解析されたヒトゲノムの全配列と比較してもｈｕＳＳが明らかな繰り返し配列を持たないこと、２）ｈｕＳＳとｚＳＳが比較的長い配列において高度に相同性を示すこと（配列番号５における３７８〜５５３番目の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目の領域は）、３）ｈｕＳＳがヒトＩｓｌｅｔ−１遺伝子の比較的近傍に存在することなどから、その感覚神経細胞におけるエンハンサー活性も有しているものと考えられる。
〔実施例３〕トラスジェニック動物の作製１
１）トラスジェニックゼブラフィッシュ
先ず、実施例２で作製したプラスミドのうちｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを、ＮｏｔＩで処理してエンハンサー領域の上流で切断し、直鎖状のプラスミドとした。次に、直鎖状プラスミドをゼブラフィッシュ１細胞胚にそれぞれ顕微注入した。このとき、直鎖状プラスミドを、ＤＮＡの濃度が５０ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒとなるように調製した。
その後、２４時間胚においてＧＦＰが強く発現している個体のみを選別し成魚（Ｆ０世代）へと育成した。得られた成魚をかけ合わせ、Ｆ１世代を蛍光実体顕微鏡下にスクリーニングした。得られたトラスジェニックゼブラフィッシュのうち、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点画像（ＺＥＩＳＳ社製ＬＳＭ５１０）を図１８に示す。なお、図１８中、Ａは三叉神経細胞を示し、Ｂは脊髄内のローハン・ベアード細胞を示している。図１８から判るように、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュにおいては、感覚神経細胞である三叉神経節細胞と脊髄内のローハン・ベアード細胞とにＧＦＰの発現が見られた。
２）トランスジェニックマウス
トランスジェニックマウス作製にあたりレポーター遺伝子をＧＦＰからヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）に変更した。ＰＬＡＰはＧＰＩリンカー型のタンパク質で、神経細胞に発現させた際に膜への移行が非常に良く、神経軸索を良好に染色できる。また、マウスの内在性アルカリフォスファターゼは熱に弱いのに対して、ＰＬＡＰは熱耐性であることから、熱処理を行うことによりＰＬＡＰの活性のみを検出することが可能となる。以上のことから、トランスジェニックマウスを作製する際には、レポーター遺伝子としてＰＬＡＰを用いることとした。
先ず、ＩＣＰの下流にＰＬＡＰ遺伝子を配置した基本ベクター（ＩＣＰ−ＰＬＡＰ）を作製した。具体的には、先ず、ＰＬＡＰ遺伝子はＺ／ＡＰベクター（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｅｎｔｅｒのＣｏｒｒｉｎｎｅ Ｇ．Ｌｏｂｅ博士から分与）から標準的なＰＣＲ法を用いて増幅、単離した。このＰＣＲで使用するプライマー（ＰＬＡＰ５ｐｒｉｍｅ，ＰＬＡＰ３ｐｒｉｍｅ）は、５’側に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を、３’側にＢｇｌＩＩ認識配列を加えて設計した。配列は以下に示す通りである。
次に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴ ｅａｓｙベクターへサブクローニングし、このベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化することによってＰＬＡＰ遺伝子をベクターから切断し、アガロースゲルによる電気泳動を用いてＰＬＡＰ遺伝子を回収した。回収したＰＬＡＰ遺伝子を、ＳＶ４０ウイルス由来のイントロン／ポリＡ付加シグナルをＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ制限酵素認識部位に組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩベクターのＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に組み込んだ。このＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを組み込んだプラスミドをアルカリＳＤＳ法で大量調整した。大量調整したプラスミドから制限酵素ＫｐｎＩ，ＸｂａＩを用いてベクターからＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを切断し、アガロースゲルによる電気泳動を用いて回収した。回収したＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを、同様に制限酵素Ｋｐｎ１，Ｘｂａ１で消化したＩＣＰプラスミドのＩＣＰ下流に挿入した。なお、ＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルはｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に由来する。次に、ｚＣＭ及びｚＳＳを、ＩＣＰ−ＧＦＰプラスミド構築の時と同様に、それぞれＩＣＰ−ＰＬＡＰにおけるＩＣＰ（プロモーター）の上流に挿入した。
ｚＣＭをＩＣＰ−ＰＬＡＰに挿入したプラスミドをｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰと命名し、ｚＳＳをＩＣＰ−ＰＬＡＰに挿入したプラスミドをｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰと命名した。
次に、作製したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰをアルカリＳＤＳ法により大量に調製した。次に、大量調整したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを制限酵素ＮｏｔＩ並びにＸｂａＩを用いて消化することによりベクターからｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを切り出した。そして、切り出したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを、最終濃度が３０ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒとなるように調整した。回収したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰをＢ６マウス受精卵に顕微注入し、注入された受精卵を偽妊娠マウスの卵管内に移植した。離乳した産仔の尾からゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲ法によりトランスジーン陽性個体を選別した。
選別したトランスジーン陽性個体（Ｆ０世代産仔（Ｐ０））のうち死産したものを用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。具体的には、当該個体をリン酸バッファーに浸漬し、その後、断頭しマイクロピンセットを用いて脳を摘出した。体幹は内臓を除去し、筋骨格が露出するように剥皮した。摘出した脳及び体幹部を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で３時間固定し、そののちリン酸バッファーで漱いだ。十分漱いだ後、内在性のアルカリフォスファターゼを失活させる目的で、熱処理（７２度、４５分）を行った。その後、発色バッファー（１００ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、ＢＭ ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて発色を行った。
ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体（死産）について各部位を撮像した結果を図１９〜２２に示す。図１９は側面から頭部を撮像した写真であり、図２０は全面から頭部を撮像した写真であり、図２１は側面から肋骨を撮像した写真であり、図２２は内側から肋骨を撮像した写真である。図１９〜２２中、「Ｎ．ＩＩＩ」は動眼神経を示し、「Ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「Ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「Ｎ．ＶＩ」は動眼神経を示し、「Ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「Ｎ．ＩＸ」は舌下神経を示し、「Ｎ．Ｘ」は迷走神経を示し、「Ｎ．ＸＩ」は副神経を示し、「ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅ」は交感神経を示している。図１９〜２２に示した写真から、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体では、脳神経の神経軸索が染色されている様子と、体幹部での肋間神経と交感神経幹が染色されている様子を確認できた。
また、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体（死産）について各部位を撮像した結果を図２３に示す。図２３は側面から頭部を撮像した写真である。図２３中、「Ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｓｅｎｓｏｒｙ」として矢印を付した箇所が三叉神経感覚枝の軸索である。図２３に示した写真から、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体では三叉神経感覚枝の軸索が染色されている様子を確認できた。
〔実施例４〕トラスジェニック動物の作製２
本例では、ＣＭ領域のエンハンサー活性及びＳＳ領域のエンハンサー活性の局在性をさらに詳細に検討した。先ず、ＳＳ領域のエンハンサー活性の局所性を検討するため、実施例２で作製したＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰ（ｈｓｐ−ＧＦＰにおけるｈｓｐの直上にＳＳ領域全体を挿入したベクター）を用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックゼブラフィッシュを作製するとともに、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックマウスを作製した。
ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュの各部位を撮像した結果を図２４中ａ、ｂ及びｃに示す。図２４中、ａは三叉神経細胞を示し、ｂは胸ビレの外転筋を示し、ｃは体幹の腹側を示している。図２４ｂ及びｃ、中矢印は軸索の進展方向を示している。
ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの各部位を撮像した結果を図２４中ｄ、ｆ及びｇに示す。図２４中、ｄはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の側面から全体を撮像した写真であり、ｆはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の頚髄を撮像した写真であり、ｇはトランスジェニックマウス（Ｅ１４．５）の頚髄を撮像した写真である。また、ｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の頚髄を撮像した写真を図２４中ｅに示す。図２４ｄ及びｅ中、矢印は三叉神経細胞を示している。図２４中「ＤＲＧ」は後根神経節細胞を意味している。
図２４ａ〜ｂに示すように、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュでは、三叉神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＧＦＰ）を発現していることが判った。また、図２４ｄ、ｆ及びｇに示すように、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスでは、三叉神経細胞（図２４ｄ）、腋芽の腹側の体幹筋に軸索を進展する運動神経細胞（図２４ｆ）及び後根神経節細胞（図２４ｇ）においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。
これに対して、図２４ｅに示すように、ｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスでは、三叉神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現しておらず、腹側に軸索を進展する神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。
以上の結果から、ｚＳＳ領域に基づくエンハンサー活性及びｈｕＳＳ領域に基づくエンハンサー活性は、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において共通して認められることが明らかとなった。また、感覚神経細胞では、ｚＳＳ領域に基づくエンハンサー活性しか認められず、ｈｕＳＳ領域に基づくエンハンサー活性は認められなかった。
次に、ＣＭ領域のエンハンサー活性の局所性を検討するため、実施例２で作製したｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックゼブラフィッシュを作製するとともに、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックマウスを作製した。
ｚＣＭを含むさらに大きなゼブラフィッシュのゲノム断片を用いて作製した７２時間のトランスジェニック胚の脊髄を撮像した結果を図２５ａに示す。ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの各部位を撮像した結果を図２５中ｂ、ｃ及びｄに示す。図２５ｂはトランスジェニックマウス（Ｅ１２．５）の凍結切片における胸髄を抗Ｉｓｌｅｔ−１抗体（緑色）と抗ＰＬＡＰ抗体（赤色）を用いて二重染色した写真であり、図２５ｃはトランスジェニックマウス（Ｅ１０．５）全体を側面から撮像した写真であり、図２５ｄはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の凍結切片における胸髄を抗Ｉｓｌｅｔ−１抗体（緑色）と抗ＰＬＡＰ抗体（赤色）を用いて二重染色した写真である。
図２５ａに示すように、トランスジェニックゼブラフィッシュでは、脊髄二次運動神経細胞のうち背側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＧＦＰ）を発現していることが判った。また、図２５ｂに示すように、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいても、背側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。また、図２５ｃ及びｄに示すように、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいては、全ての脳神経運動核並びに脊髄運動神経細胞及びＩｓｌｅｔ−１陽性運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を一過的に発現していることが判った。
以上の結果から、ｈｕＣＭ領域に基づくエンハンサー活性は、全ての運動神経細胞において一過的に認められるとともに、背側に軸索を進展する運動神経細胞に特異的に認められることが明らかとなった。
本例で示したように、ＳＳ領域及びＣＭ領域は、それぞれ異なる種類の運動神経細胞において特異的にエンハンサー活性を示すことが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、任意の遺伝子の発現効率を高める新規なエンハンサーを提供することができる。また、本発明によれば、当該エンハンサーを有するベクター、遺伝子導入細胞、トランスジェニック動物、遺伝子発現調節方法、多能性幹細胞の分化判別方法及び運動神経・感覚神経の再生方法を提供することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【技術分野】
本発明は、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、任意の遺伝子の発現を特異的に増強できるエンハンサーに関する。
【背景技術】
Ａｒｂｅｒら（Ｎｅｕｒｏｎ，１９９９ Ａｕｇｕｓｔ ２３：６５９−６７４）により、運動神経細胞特異的な発現を示すマウスＨｂ９遺伝子のプロモーターが単離されている。このプロモーターは、トランスジェニックマウスにおいて体性運動神経細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ）に特異的にレポーター遺伝子の発現を誘導することが知られている。しかし、Ｈｂ９遺伝子の運動神経細胞での発現は一過性のものであり、成熟した細胞にはレポーター遺伝子の発現を誘導することは困難であると考えられる。さらに、この系では内臓運動神経（ｖｉｓｃｅｒａｌ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ）にはレポーター遺伝子の発現を誘導しない。また、このプロモーターは、Ｈｂ９遺伝子の転写開始点から上流約９ｋｂｐを含んでおり、組み換え体作製などの作業において取扱いの煩雑さを伴うことが予想される。また、マウス由来のプロモーターであることから、仮に治療で用いられることがあるとすると、倫理的な問題も生じかねない。
一方、エンハンサーとは、ＲＮＡポリメラーゼによる転写効率を高める特定の塩基配列である。エンハンサーは、特定の遺伝子の上流或いは下流に存在し、遺伝子発現制御能を有する制御タンパク質等が結合することによって、特定の遺伝子の転写を促進することができる。
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に、遺伝子の発現効率を高めることができるエンハンサーを提供することを目的とする。また、本発明は、当該エンハンサーを有するベクター、トラスジェニック動物、遺伝子発現調節方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、当該エンハンサーを用いた多能性幹細胞の分化判別方法及び運動神経・感覚神経の再生方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
上述した目的を達成した本発明は、以下を包含する。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（２）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（３）上記運動神経細胞は、背側に軸索を進展する運動神経細胞であることを特徴とする（１）又は（２）記載のエンハンサー。
（４）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（５）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（６）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサーを有するベクター。
（７）プロモーターと、コード領域を含む遺伝子とを更に有することを特徴とする（６）記載のベクター。
（８）（６）又は（７）記載のベクターを有する遺伝子導入細胞。
（９）（６）又は（７）記載のベクターを有するトランスジェニック動物。
（１０）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサーの制御下で、所定の遺伝子の発現効率を向上させることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
（１１）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー及び上記所定の遺伝子とを有する核酸構築物を細胞に導入する工程を有し、
運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、上記所定の遺伝子の発現効率を高めることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
（１２）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程とを有し、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別することを特徴とする多能性幹細胞の分化判別方法。
（１３）（１）〜（５）いずれか１記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程と、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別し、運動神経細胞又は感覚神経細胞を選択する工程と、
選択された運動神経細胞又は感覚神経細胞を移植する工程とを有する
運動神経・感覚神経の再生方法。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００２−２５４８２９号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ゼブラフィッシュゲノムにおけるＩｓｌｅｔ−１遺伝子近傍のＥｃｏＲＩ制限酵素地図を示す図である。
図２は、ＩＣＰ−ＧＦＰプラスミドの一部を示す模式図である。
図３は、ＣＭ領域の部分断片を有するプラスミドの設計を示す図である。
図４は、ｈｓｐ−ＧＦＰプラスミドの一部を示す模式図である。
図５は、ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図６は、ＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図７は、ＳＳ領域の部分断片を有するプラスミドの設計を示す図である。
図８は、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図９は、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１０は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図１１は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１２は、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図１３は、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１４は、ｚＣＭ、ｈｕＣＭ、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭ間での相同性を調べた結果をアライメントして示す図である。
図１５は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ或いはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける頭部を背側面から撮像した写真である。
図１６は、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ或いはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを注入したゼブラフィッシュにおける脊髄を側面から撮像した写真である。
図１７は、ｚＳＳ及びｈｕＳＳ間での相同性を調べた結果をアライメントして示す図である。
図１８は、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュにおける頭部及び脊髄を側面から撮像した写真である。
図１９は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図２０は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を全面から撮像した写真である。
図２１は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける肋骨を側面から撮像した写真である。
図２２は、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける肋骨を内側から撮像した写真である。
図２３は、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおける頭部を側面から撮像した写真である。
図２４は、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュ及び、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ並びにｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの写真である。
図２５は、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュ及びｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号１の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号１の塩基配列は、ゼブラフィッシュゲノムにおいて、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在する領域（以下、ＣＭ領域と呼ぶ）に含まれている。配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、運動神経細胞核において特異的に遺伝子発現効率を高める作用を有するエンハンサーである。なお、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子は、分化した運動神経細胞の早期マーカーの一つであり、ゼブラフィッシュ２４時間胚においては、運動神経細胞ならびに感覚神経細胞に強く発現する。
また、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号２、３又は４に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号２、３又は４の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号２、３又は４の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号１の塩基配列に基づいて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）で公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって配列番号２の塩基配列を同定することができる。また、配列番号１の塩基配列に基づいて、ＮＣＢＩで公開されているマウスゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、配列番号３の塩基配列を同定することができる。また、配列番号１の塩基配列に基づいて、ＮＣＢＩで公開されているフグゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって、配列番号４の塩基配列を同定することができる。
すなわち、配列番号１の塩基配列はゼブラフィッシュゲノム由来のエンハンサーであり、配列番号２の塩基配列はヒトゲノム由来のエンハンサーであり、配列番号３の塩基配列はマウス由来のエンハンサーであり、配列番号４の塩基配列はフグゲノム由来のエンハンサーである。
なお、以下の説明において、（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡからなるエンハンサー、（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサー及び（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサーをまとめてＣＭエンハンサーと呼ぶ。
一方、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号５に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号５の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、感覚神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号５の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、感覚神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。
配列番号５の塩基配列は、ゼブラフィッシュゲノムにおいて、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在する領域（以下、ＳＳ領域と呼ぶ）に含まれている。配列番号５の塩基配列からなるＤＮＡ断片は、感覚神経細胞核及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞において特異的に遺伝子発現効率を高める作用を有するエンハンサーである。
また、配列番号５の塩基配列に基づいて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において公開されているヒトゲノムデータベースに対して相同性検索を行うことによって配列番号６の塩基配列を同定することができる。したがって、本発明に係るエンハンサーは、（ａ）配列番号６に示す塩基配列からなる、（ｂ）配列番号６の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換又は付加してなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる、或いは、（ｃ）配列番号６の塩基配列と相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有する塩基配列からなる。なお、配列番号６の塩基配列からなるエンハンサーは、感覚神経細胞においては活性を示さない。
なお、以下の説明において、（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡからなるエンハンサー、（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサー及び（ｃ）配列番号５又は６に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡからなるエンハンサーをまとめてＳＳエンハンサーと呼ぶ。
ここで、配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列とは、例えば、１〜３０塩基、好ましくは１〜２０塩基、より好ましくは１〜１０塩基が欠失、置換又は付加した塩基配列を意味する。特に、欠失、置換又は付加する領域としては、配列番号１における２３５〜５６０番目以外の領域、配列番号２における２０４〜５２８番目以外の領域、配列番号３における２０６〜５３０番目以外の領域、配列番号４における２１１〜５５５番目以外の領域、配列番号５における３７８〜５５３番目以外の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目以外の領域が好ましい。
配列番号１における２３５〜５６０番目の領域、配列番号２における２０４〜５２８番目の領域、配列番号３における２０６〜５３０番目の領域、及び配列番号４における２１１〜５５５番目の領域は、互いに高い相同性を示す領域であり、生物種間において高度に保存されている。このため、配列番号１乃至４におけるこれらの領域は、運動神経細胞において遺伝子発現効率を高めるといったエンハンサーの機能に寄与する領域であると示唆される。また、配列番号５における３７８〜５５３番目の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目の領域は、互いに高い相同性を示す領域であり、生物種間において高度に保存されている。このため、配列番号５及び６におけるこれらの領域は、感覚神経細胞及び／又は腹側に軸索を進展する運動神経細胞において遺伝子発現効率を高めるといったエンハンサーの機能に寄与する領域であると示唆される。
配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列に１以上の塩基を欠失、置換又は付加する際には、従来公知の手法を特に限定することなく、適宜使用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発方法を使用して、所定の塩基を置換することができる。部位特異的突然変異誘発方法としては、例えばＴ．クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）の部位特異的変異導入法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２，４８８−４９２（１９８５））、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等が挙げられる。また、通常のクンケル法で使用する１〜２本の改変用オリゴヌクレオチドを、最高１６本のオリゴヌクレオチドを同時に用いて多部位での効率よい置換を行う改良法なども採用することができる。本発明では、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（宝酒造社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（宝酒造社製））などを用いて、あるいは、宝酒造社製のＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異を導入することもできる。
また、配列番号１乃至６のいずれかに表される塩基配列の相補的な塩基配列にしてストリンジェントな条件下でハイブリダイズするとは、ストリンジェントな条件下において、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されないことを意味する。例えば、相同性が高い核酸同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合はハイブリダイズしないことを意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１５〜９００ｍＭであり、温度が３７〜７０℃、好ましくは６８℃での条件においてハイブリダイズすることを意味する。
ここで、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能とは、特に、任意の遺伝子の転写効率を高める機能が運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に出現することを意味する。任意の塩基配列を有するＤＮＡ断片が当該機能を有するか否かは、任意のプロモーター及びレポーター遺伝子を有する発現ベクターに当該ＤＮＡ断片を組み込んで組換えベクターを作製し、組換えベクターを用いて作製したトランスジェニック動物の運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が増大しているか否かを検討する。トラスジェニック動物の運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が増大している場合、当該ＤＮＡ断片は上記機能を有する。
特に、ＣＭエンハンサーは、運動神経細胞のなかでも背側に軸索を進展する運動神経細胞においてエンハンサー活性を示すとともに、全ての運動神経細胞において一過的なエンハンサー活性を示す。また、ＳＳエンハンサーは、運動神経のなかでも腹側に軸索を進展する運動神経細胞において特異的なエンハンサー活性を示す。なお、ゼブラフィッシュ由来のＳＳエンハンサーは、感覚神経細胞においてもエンハンサー活性を示すが、ヒト由来のＳＳエンハンサーは感覚神経細胞においてエンハンサー活性を示さない。
ここで、作製するトランスジェニック動物としては、特に限定されないが、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現が容易に判別可能なトランスジェニック動物を作製することが好ましい。例えば、トランスジェニック動物としては、トランスジェニックゼブラフィッシュやトランスジェニックマウス等を用いることができる。
また、ゼブラフィッシュ１細胞卵に顕微鏡注入等の手法によって上述した組換えベクターを注入し、２４時間後、胚におけるレポーター遺伝子の発現を確認することで、任意のＤＮＡ断片について、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において遺伝子発現効率を高める機能を有するか否かを確認できる。
ここで、レポーター遺伝子としては、蛍光緑色タンパク質をコードするＧＦＰ遺伝子（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子）やアルカリフォスファターゼ遺伝子、βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子等を使用することができる。
また、プロモーターとしては、ゼブラフィッシュ由来のＩｓｌｅｔ−１遺伝子上流約４ｋｂｐに存在するＩｓｌｅｔ−１プロモーター（Ｉｓｌｅｔ−１ Ｃｏｒｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、以下、ＩＣＰと呼ぶ）や、ゼブラフィッシュ由来熱ショック７０プロモーターや、ヒト由来のプロモーター、具体的にはβグロビンプロモーター等を用いることができる 一方、上述した本発明に係るエンハンサーを用いて、所望の遺伝子を運動神経細胞或いは感覚神経細胞において特異的に発現量を増大できる発現ベクターを構築することができる。プロモーターとしては、上述した各種プロモーターを用いることができる。特に、ヒトに対する遺伝子治療用発現ベクターの場合には、プロモーターとして、ヒト由来のプロモーター、具体的には、βグロビンプロモーターを用いることが好ましい。
また、運動神経細胞或いは感覚神経細胞において特異的に発現量を増大させる遺伝子としては、何ら限定されないが、例えば、家族性ＡＬＳ（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）のうちＳＯＤ１遺伝子に変異を持つ群に対して、過剰発現することにより生命予後を改善することが知られている原癌遺伝子Ｂｃｌ−２（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，Ｊｕｌｙ ２５：２７７，５５９−５６２）挙げることができる。本発明に係るエンハンサー、プロモーター及び原癌遺伝子Ｂｃｌ−２を有する発現ベクターを用いて遺伝子治療を行う場合には、Ｂｃｌ−２を運動神経細胞において特異的に発現させることができる。これにより、家族性ＡＬＳに罹患した患者の生命予後を改善する効果を期待することができる。
さらに、例えば、感覚神経細胞に特異的に発現を増大させる遺伝子としては、プレプロエンケファリン遺伝子があげられる。プレプロエンケファリンは内因性麻薬様物質の一つであるエンケファリンの前駆物質であり、これを感覚神経細胞に過剰に発現誘導することにより例えば慢性関節リウマチなどの慢性疼痛を緩和することが可能であると期待することができる。（Ｂｒａｚ Ｊ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００１ Ｏｃｔ １５；２１（２０）：７８８１−８）。
また、上述した本発明に係るエンハンサーは、多能性幹細胞の分化判別方法に用いることができる。この場合、先ず、上記エンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を有する核酸構築物を作製する。ここで核酸構築物とは、上述したような、上記エンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を有する発現ベクターであってもよい。多能性幹細胞とは、発生初期に存在する個体を構成する全ての組織細胞に分化する能力、すなわち多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）をもつ幹細胞を意味する。多能性幹細胞としては、発生初期に存在する多能性を有する幹細胞を選別し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できるように株化した胚性幹細胞（ＥＳ細胞；ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）を挙げることができる。
多能性幹細胞に対して核酸構築物を導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、顕微鏡を用いた注入方法、エレクトロポレーション等を挙げることができる。
次に、核酸構築物を導入した多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化すべく、当該多能性幹細胞に対して分化誘導を行う。分化誘導方法としては、例えば、レチノイン酸を含む培養液を用いて培養するなどの方法を挙げることができる。
次に、分化した多能性幹細胞におけるレポーター遺伝子の発現を検定する。すなわち、レポーター遺伝子の発現量が対照と比較して有意に増加している細胞を、運動神経細胞に分化したものであると判断することができる。そして、レポーター遺伝子の発現量が有意に増加した細胞を選択することによって、多能性幹細胞から分化した運動神経細胞を容易に且つ精度よく選別することができる。
さらに、選別した運動神経細胞は、いわゆる再生医療に用いることができる。具体的には、選別した運動神経細胞を更に培養した後、対照となる動物、例えばヒトに移植することによって、運動神経を欠損した患者に対して有効な治療方法を提供することができる。
一方、上述した本発明に係るエンハンサーは、いわゆる遺伝子治療に用いることができる。具体的には、上述したエンハンサーが制御しうる形で導入対象の遺伝子を有する核酸構築物を作製する。核酸構築物としては、遺伝子治療に用いることができるものであれば特に限定されないが、上記エンハンサー、プロモーター及び導入対象の遺伝子を有するアデノウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター及びレトロウィルスベクター等を用いることができる。
導入対象の遺伝子は、特に限定されないが、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において特異的に発現させることによって、所定の疾患に対する治療・改善効果を奏することが知られている遺伝子を挙げることができる。例えば、導入対象の遺伝子としては、上述したような、原癌遺伝子Ｂｃｌ−２（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，Ｊｕｌｙ ２５：２７７，５５９−５６２）、プレプロエンケファリン遺伝子等を挙げることができる。
次に、核酸構築物を用いて治療対象である患者に対して定法に従って遺伝子治療を行う。
以上のように遺伝子治療を行うことによって、当該遺伝子治療が施された患者では、運動神経細胞又は感覚神経細胞において導入対象の遺伝子を特異的に発現させることができる。本発明に係るエンハンサーを用いた遺伝子治療によれば、運動神経細胞又は感覚神経細胞において、特異的に導入対象の遺伝子を発現させることができるため、より効果的な治療・改善効果を期待することができる。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕エンハンサー領域の同定
先ず、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在するＣＭ領域及び約５５ｋｂｐ下流に存在するＳＳ領域に含まれるエンハンサー機能を示す領域を、以下のように特定した。
ｉ）Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子プロモーターの同定
ゼブラフィッシュゲノムライブラリーを、Ｉｓｌｅｔ−１ ｃＤＮＡをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子全長並びにその上流のゲノム配列約４．１Ｋｂｐを含む陽性クローンを単離した。この陽性クローンを鋳型として標準的なＰＣＲ法を用いてＩＣＰを単離した（図１参照）。
なお、具体的にゼブラフィッシュゲノムライブラリーは、定法に従いファージベクターとしてλ ＤＡＳＨ ＩＩを用いて調製した。上記ＰＣＲ法には、プライマーとして、ファージベクター由来の配列（ＩＣＰ５ｐｒｉｍｅ）と３’端に制限酵素Ｋｐｎ１認識配列を付加したＩｓｌｅｔ１遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列（ＩＣＰ３ｐｒｉｍｅ）を用いた。プライマーの配列を以下に示す。
上記ＰＣＲによって増幅した領域がプロモーターとしての機能を有するか否かを以下のように確認した。すなわち、先ず、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ断片のすぐ下流に、ＳＶ４０ウイルス由来のイントロン／ポリＡ付加シグナルを連結したＧｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）をレポーター遺伝子として連結したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を構築した（図２参照）。構築したプラスミドをＩＣＰ−ＧＦＰと命名した。
ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入した。具体的には、顕微注入には、プラスチック製注射筒を繋いだホルダーにガラス製マイクロピペットを用いた。ガラス製マイクロピペットに約２５ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒの濃度に調整したＤＮＡ溶液を入れ、実体顕微鏡（ＺＥＩＳＳ社製）下に、細胞質の径約１／３程度に溶液が拡散するくらいの量を注入した。顕微注入後、通常の飼育条件下に飼育し、ＧＦＰの発現を２４時間胚について蛍光実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）下で検定した。
その結果、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子のプロモーターを同定するとともに、単離することができた。
ｉｉ）ＣＭ領域及びＳＳ領域の同定
ゼブラフィッシュＢＡＣライブラリーから、Ｉｓｌｅｔ−１ｃＤＮＡを鋳型としてＩｓｌｅｔ−１遺伝子を含む約１００Ｋｂｐのクローンを単離した。
単離したＩｓｌｅｔ−１遺伝子を含む約１００Ｋｂｐのクローンを、制限酵素ＥｃｏＲ１を用いて完全消化し、得られた断片をそれぞれＩＣＰ−ＧＦＰのＩＣＰ上流に挿入した。ＢＡＣクローンのＥｃｏＲ１処理断片を含むＩＣＰ−ＧＦＰを、それぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＧＦＰによる蛍光の発現を一過性発現系において検定した。
その結果、脳神経運動核に特異的にＧＦＰを発現誘導するゲノム断片（約１５Ｋｂｐ）を同定した。このゲノム断片はＩｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約１０ｋｂｐ下流に存在した。なお、このゲノム断片をＣＭ領域と命名した（図１）。
また、感覚神経に特異的にＧＦＰを発現誘導するゲノム断片（約４．５Ｋｂｐ）を同定した。このゲノム断片はＩｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在した。なお、このゲノム断片をＳＳ領域と命名した（図１）。
ｉｉｉ）ＣＭ領域及びＳＳ領域に含まれるエンハンサーの解析
上記ｉｉ）で同定したＣＭ領域及びＳＳ領域に関して、エンハンサー機能を示す最小領域を解析した。
ＣＭ領域については、図３に示すように、ＣＭ領域中に存在するＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＸＩ認識部位を用いてＣＭ領域の部分断片を設計した。これら部分断片のエンハンサー機能を解析するために、図４に示したプラスミドｈｓｐ−ＧＦＰを用い、ＧＦＰの発現を検定した。なお、ｈｓｐ−ＧＦＰは、ゼブラフィッシュ熱ショックタンパク（ｈｓｐ）７０プロモーターをｅｎｈａｎｃｅｄ ＧＦＰ（図４においてＥＧＦＰと表す）の上流に挿入したものである。
ＣＭ領域の部分断片については、ＰＣＲで増幅したＣＭ領域を所定の制限酵素（ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ及びＢｓｔＸＩ）で処理することによって調製した。ＣＭ領域の部分断片それぞれを、ｈｓｐ−ＧＦＰにおけるｈｓｐの直上に挿入し、８種類のプラスミド、ＣＭＥＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＸＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ１−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ４−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＢ２−ｈｓｐ−ＧＦＰを構築した（図３）。
次に、これら８種類のプラスミドを、それぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＥＧＦＰによる蛍光の発現を検定した。
その結果、ＣＭＸ−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＣＭＰ−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入した場合には、蛍光を観察することができ、ＥＧＦＰの発現が認められた。ＣＭＢ３−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間後の写真を図５に示す。また、比較のため、ＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＰＣの直上にＣＭ領域全体を挿入したＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを、ゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間後の写真を図６に示す。なお、図５及び６中、「ｎ．ＩＩＩ」は脳神経である動眼神経を示し、「ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「ｎ．Ｘ」は迷走神経を示している。図５及び６から判るように、脳神経である動眼神経、滑車神経、三叉神経、顔面神経と迷走神経の細胞体並びに軸索にＧＦＰが発現している様子が観察できた。
以上の結果より、ＣＭ領域における約８００ｋｂｐの領域を、エンハンサー機能を示す最小領域とした。この約８００ｋｂｐの領域の塩基配列を決定することによって（配列番号１）、運動神経細胞において所定の遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを同定することができた。なお、このエンハンサーが存在する領域は、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約２０ｋｂｐ下流に存在する領域であった。
一方、ＳＳ領域に関しては、適当な制限酵素認識部位がないことからｋｉｌｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラ社製）を使用し、図７に示すように、所定の領域を欠失した部分断片を有する５種類のプラスミド、ＳＳｄ２５−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ３０ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＳＳｄ２５ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰを構築した。
次に、これら５種類のプラスミドと、ＳＳ領域全体を有するプラスミドＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰと、ＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＰＣの直上にＳＳ領域全体を挿入したＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰとを、それぞれそれぞれゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入し、ＥＧＦＰによる蛍光の発現を検定した。
その結果、ＳＳｄ２５−ｈｓｐ−ＧＦＰ、ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰ及びＳＳｄ３０ｒｅｖ−ｈｓｐ−ＧＦＰを注入した場合には、蛍光を観察することができ、ＥＧＦＰの発現が認められた。ＳＳｄ２５／３０−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図８及び９に示す。また、比較のため、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図１０及び１１に示す。さらに、比較のため、ＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから３２時間経過後、側面からの写真を図１２及び１３に示す。なお、図８〜１３中、「Ｔ．Ｇ」は三叉神経細胞を示し、「Ｒ．Ｂ」はＲｏｈｏｎ−Ｂｅａｒｄ（ローハン・ベアード）細胞を示し、「ｅｙｅ」は目を示し、「ｙｏｌｋ」は卵黄を示している。
図８、１０及び１２から、三叉神経節細胞にＧＦＰが発現している様子が確認できた。一方、図９、１１及び１３から、脊髄内に存在する一次感覚神経細胞であるローハン・ベアード細胞にＧＦＰが発現している様子が確認できた。
以上の結果より、ＳＳ領域における約６００ｋｂｐの領域を、エンハンサー機能を示す最小領域とした。この約６００ｋｂｐの領域の塩基配列を決定することによって（配列番号５）、感覚神経細胞において所定の遺伝子の発現効率を高める機能を有するエンハンサーを同定することができた。なお、このエンハンサーが存在する領域は、Ｉｓｌｅｔ−１遺伝子の転写開始点から約５５ｋｂｐ下流に存在する領域であった。
〔実施例２〕他生物由来エンハンサーの同定
運動神経細胞におけるエンハンサーの塩基配列（以下、ｚＣＭと呼ぶ。配列番号１）に基づいて、ＮＣＢＩのデータベースを用いて相同性検索を行った。相同性検索はＢＬＡＳＴを使用した。その結果、ヒトゲノムデータベースから、配列番号１の塩基配列と約２３０ｂｐにわたり高度に相同性（８１％）を持つ配列が得られた（以下、ｈｕＣＭと呼ぶ。配列番号２）。また、マウスゲノムデータベース及びフグゲノムデータベースからも、配列番号１の塩基配列と高い相同性を持つ配列が得られた（以下、それぞれ以下、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭと呼ぶ。それぞれ配列番号３及び４）。これらｚＣＭ、ｈｕＣＭ、ｍＣＭ及びｆｕｇｕＣＭ間での相同性を調べた結果を図１４に示す。図１４に示した相同性の結果を検討したところ、相同性の高低に基づいて３つの領域に分類することができた。すなわち、最も相同性が高く、生物種を超えて高度に保存されている領域２、領域２に次いで相同性が高い領域３、及び領域３に次いで相同性が高い領域１に分類することができた。なお、ｚＣＭとｈｕＣＭとの間では、領域２における相同性が８１％であり、領域３における相同性が６３％であり、領域１における相同性が５３％であった。
ｚＣＭにおける領域２は配列番号１における２３５〜５６０番目に相当し、ｈｕＣＭにおける領域２は配列番号２における２０４〜５２８番目に相当し、ｍＣＭにおける領域２は配列番号３における２０６〜５３０番目に相当し、ｆｕｇｕＣＭにおける領域２は配列番号４における２１１〜５５５番目に相当する。領域２は、生物種を超えて高度に保存された領域であるため、エンハンサー機能にとって最も重要な領域であると示唆される。
次に、ｈｕＣＭ及びｍＣＭそれぞれについて、周辺の配列を含むようにプライマーを設計し、ＰＣＲ法で各ゲノムＤＮＡより増幅を行い、単離した。具体的には、ｈｕＣＭをヒトゲノムより増幅する目的でプライマー（ｈｕＣＭｆｏｒｗａｒｄ，ｈｕＣＭｒｅｖｅｒｓｅ）を設計した。以下にその配列を示す。
なお、これらプライマーには、後のプラスミドコンストラクト構築のために制限酵素ＥｃｏＲ１認識配列をそれぞれ両端に付加した。
同様に、ｍＣＭをマウスゲノムより増幅する目的でプライマー（ｍＣＭｆｏｒｗａｒｄ，ｍＣＭｒｅｖｅｒｓｅ）を設計した。配列を以下に示す。
これらのプライマーを用いて、ヒト及びマウス各ゲノムから標準的なＰＣＲ法を用いてそれぞれゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を増幅し、ＴＡクローニング法によりｐＧＥＭＴ ｅａｓｙベクター（ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、単離した。単離されたゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を含むプラスミドを、アルカリＳＤＳ法を用いて大量調整し、制限酵素ＥｃｏＲ１で消化し、目的とするゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）をアガロースゲルによる電気泳動で回収した。回収したゲノム断片（ｈｕＣＭ及びｍＣＭ）を、制限酵素ＥｃｏＲ１で消化したＩＣＰ−ＧＦＰにおけるＩＣＰの上流にサブクローニングし、プラスミドｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを構築した。
次に、得られたプラスミドｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞卵に顕微注入し、ＧＦＰの発現を検定した。その結果を図１５及び図１６に示す。なお、図１５中、ＡはｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真であり、ＢはｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真であり、ＣはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰをゼブラフィッシュ１細胞胚に顕微注入してから６０時間経過後、頭部を背面から撮像した写真である。また、図１５中、「ｎ．ＩＩＩ」は動眼神経を示し、「ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「ｎ．Ｘ」は迷走神経を示している。
図１６中、ＡはｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合の脊髄を側面から撮像した写真であり、ＢはｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合の脊髄を側面から撮像した写真である。図１６中、「ＣａＰ」はＣａｕｄａｌ ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ＭｉＰ」はＭｉｄｄｌｅ Ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ＲｏＰ」はＲｏｓｔｒａｌ ｐｒｉｍａｒｙと呼ばれる一次運動神経細胞を示し、「ｓｍｎ」は二次運動神経細胞を示している。これらＲｏＰ、ＭｉＰ及びＣａＰは、ゼブラフィッシュ胚の各体節ごとに３つづつ存在する一次運動神経細胞であり、それぞれ体幹の中隔部、背側部及び腹側部に軸索を伸ばすことが知られている。その役割は詳細には分かっていないが、体節の筋肉を最終的に支配する二次運動神経細胞の軸索進展のガイダンスの役割を担っていると考えられている。
図１５から判るように、ｈｕＣＭ及びｍＣＭを用いた場合には、ｚＣＭを用いた場合と同様に、脳神経である動眼神経、滑車神経、三叉神経、顔面神経と迷走神経の細胞体並びに軸索にＧＦＰが発現している様子が観察できた。このことから、ｈｕＣＭ及びｍＣＭについても、運動神経細胞において遺伝子の発現効率を高めるエンハンサー機能を示すことが実証された。
また、図１６からは、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いた場合とは異なり、ｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｈｕＣＭ−ＴＣＰ−ＧＦＰを用いた場合においてのみ、脊髄運動神経細胞にＧＦＰの発現が見られた。このことから、ｈｕＣＭ及びｍＣＭを用いた場合には、運動神経細胞のなかでも脊髄運動神経細胞において遺伝子の発現効率を高めるエンハンサー機能を示すことが明らかとなった。
一方、感覚神経細胞におけるエンハンサーの塩基配列（以下、ｚＳＳと呼ぶ。配列番号５）に基づいて、ＮＣＢＩのデータベースを用いて相同性検索を行った。相同性検索はＢＬＡＳＴを使用した。その結果、ヒトゲノムデータベースから、配列番号５の塩基配列と約１２０ｂｐにわたり高度に相同性（８０％）を持つ配列が得られた（以下、ｈｕＳＳと呼ぶ。配列番号６）。これらｚＳＳ及びｈｕＳＳ間での相同性を調べた結果を図１７に示す。
図１７に示した相同性の結果を検討したところ、１）おおまかに解析されたヒトゲノムの全配列と比較してもｈｕＳＳが明らかな繰り返し配列を持たないこと、２）ｈｕＳＳとｚＳＳが比較的長い配列において高度に相同性を示すこと（配列番号５における３７８〜５５３番目の領域、配列番号６における１７８〜３５３番目の領域は）、３）ｈｕＳＳがヒトＩｓｌｅｔ−１遺伝子の比較的近傍に存在することなどから、その感覚神経細胞におけるエンハンサー活性も有しているものと考えられる。
〔実施例３〕トラスジェニック動物の作製１
１）トラスジェニックゼブラフィッシュ
先ず、実施例２で作製したプラスミドのうちｚＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｍＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰ、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰ及びｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰを、ＮｏｔＩで処理してエンハンサー領域の上流で切断し、直鎖状のプラスミドとした。次に、直鎖状プラスミドをゼブラフィッシュ１細胞胚にそれぞれ顕微注入した。このとき、直鎖状プラスミドを、ＤＮＡの濃度が５０ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒとなるように調製した。
その後、２４時間胚においてＧＦＰが強く発現している個体のみを選別し成魚（Ｆ０世代）へと育成した。得られた成魚をかけ合わせ、Ｆ１世代を蛍光実体顕微鏡下にスクリーニングした。得られたトラスジェニックゼブラフィッシュのうち、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュの共焦点画像（ＺＥＩＳＳ社製ＬＳＭ５１０）を図１８に示す。なお、図１８中、Ａは三叉神経細胞を示し、Ｂは脊髄内のローハン・ベアード細胞を示している。図１８から判るように、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＧＦＰトランスジェニックゼブラフィッシュにおいては、感覚神経細胞である三叉神経節細胞と脊髄内のローハン・ベアード細胞とにＧＦＰの発現が見られた。
２）トランスジェニックマウス
トランスジェニックマウス作製にあたりレポーター遺伝子をＧＦＰからヒト胎盤由来アルカリフォスファターゼ（ＰＬＡＰ）に変更した。ＰＬＡＰはＧＰＩリンカー型のタンパク質で、神経細胞に発現させた際に膜への移行が非常に良く、神経軸索を良好に染色できる。また、マウスの内在性アルカリフォスファターゼは熱に弱いのに対して、ＰＬＡＰは熱耐性であることから、熱処理を行うことによりＰＬＡＰの活性のみを検出することが可能となる。以上のことから、トランスジェニックマウスを作製する際には、レポーター遺伝子としてＰＬＡＰを用いることとした。
先ず、ＩＣＰの下流にＰＬＡＰ遺伝子を配置した基本ベクター（ＩＣＰ−ＰＬＡＰ）を作製した。具体的には、先ず、ＰＬＡＰ遺伝子はＺ／ＡＰベクター（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ ＆ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｅｎｔｅｒのＣｏｒｒｉｎｎｅ Ｇ．Ｌｏｂｅ博士から分与）から標準的なＰＣＲ法を用いて増幅、単離した。このＰＣＲで使用するプライマー（ＰＬＡＰ５ｐｒｉｍｅ，ＰＬＡＰ３ｐｒｉｍｅ）は、５’側に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を、３’側にＢｇｌＩＩ認識配列を加えて設計した。配列は以下に示す通りである。
次に、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片をｐＧＥＭＴ ｅａｓｙベクターへサブクローニングし、このベクターを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化することによってＰＬＡＰ遺伝子をベクターから切断し、アガロースゲルによる電気泳動を用いてＰＬＡＰ遺伝子を回収した。回収したＰＬＡＰ遺伝子を、ＳＶ４０ウイルス由来のイントロン／ポリＡ付加シグナルをＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ制限酵素認識部位に組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩベクターのＫｐｎＩ，ＢａｍＨＩ制限酵素認識部位に組み込んだ。このＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを組み込んだプラスミドをアルカリＳＤＳ法で大量調整した。大量調整したプラスミドから制限酵素ＫｐｎＩ，ＸｂａＩを用いてベクターからＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを切断し、アガロースゲルによる電気泳動を用いて回収した。回収したＰＬＡＰ遺伝子及びＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルを、同様に制限酵素Ｋｐｎ１，Ｘｂａ１で消化したＩＣＰプラスミドのＩＣＰ下流に挿入した。なお、ＳＶ４０ウイルス由来イントロン／ポリＡ付加シグナルはｐｃＤＮＡ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に由来する。次に、ｚＣＭ及びｚＳＳを、ＩＣＰ−ＧＦＰプラスミド構築の時と同様に、それぞれＩＣＰ−ＰＬＡＰにおけるＩＣＰ（プロモーター）の上流に挿入した。
ｚＣＭをＩＣＰ−ＰＬＡＰに挿入したプラスミドをｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰと命名し、ｚＳＳをＩＣＰ−ＰＬＡＰに挿入したプラスミドをｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰと命名した。
次に、作製したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰをアルカリＳＤＳ法により大量に調製した。次に、大量調整したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを制限酵素ＮｏｔＩ並びにＸｂａＩを用いて消化することによりベクターからｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを切り出した。そして、切り出したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを、最終濃度が３０ｎｇ／ｍｉｃｒｏｌｉｔｔｅｒとなるように調整した。回収したｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰをＢ６マウス受精卵に顕微注入し、注入された受精卵を偽妊娠マウスの卵管内に移植した。離乳した産仔の尾からゲノムＤＮＡを採取し、ＰＣＲ法によりトランスジーン陽性個体を選別した。
選別したトランスジーン陽性個体（Ｆ０世代産仔（Ｐ０））のうち死産したものを用いてアルカリフォスファターゼ染色を行った。具体的には、当該個体をリン酸バッファーに浸漬し、その後、断頭しマイクロピンセットを用いて脳を摘出した。体幹は内臓を除去し、筋骨格が露出するように剥皮した。摘出した脳及び体幹部を、４％パラフォルムアルデヒドを用いて室温で３時間固定し、そののちリン酸バッファーで漱いだ。十分漱いだ後、内在性のアルカリフォスファターゼを失活させる目的で、熱処理（７２度、４５分）を行った。その後、発色バッファー（１００ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ＝９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、ＢＭ ｐｕｒｐｌｅ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて発色を行った。
ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体（死産）について各部位を撮像した結果を図１９〜２２に示す。図１９は側面から頭部を撮像した写真であり、図２０は全面から頭部を撮像した写真であり、図２１は側面から肋骨を撮像した写真であり、図２２は内側から肋骨を撮像した写真である。図１９〜２２中、「Ｎ．ＩＩＩ」は動眼神経を示し、「Ｎ．ＩＶ」は滑車神経を示し、「Ｎ．Ｖ」は三叉神経を示し、「Ｎ．ＶＩ」は動眼神経を示し、「Ｎ．ＶＩＩ」は顔面神経を示し、「Ｎ．ＩＸ」は舌下神経を示し、「Ｎ．Ｘ」は迷走神経を示し、「Ｎ．ＸＩ」は副神経を示し、「ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ｎｅｒｖｅ」は交感神経を示している。図１９〜２２に示した写真から、ｚＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体では、脳神経の神経軸索が染色されている様子と、体幹部での肋間神経と交感神経幹が染色されている様子を確認できた。
また、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体（死産）について各部位を撮像した結果を図２３に示す。図２３は側面から頭部を撮像した写真である。図２３中、「Ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ ｓｅｎｓｏｒｙ」として矢印を付した箇所が三叉神経感覚枝の軸索である。図２３に示した写真から、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジーン陽性個体では三叉神経感覚枝の軸索が染色されている様子を確認できた。
〔実施例４〕トラスジェニック動物の作製２
本例では、ＣＭ領域のエンハンサー活性及びＳＳ領域のエンハンサー活性の局在性をさらに詳細に検討した。先ず、ＳＳ領域のエンハンサー活性の局所性を検討するため、実施例２で作製したＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰ（ｈｓｐ−ＧＦＰにおけるｈｓｐの直上にＳＳ領域全体を挿入したベクター）を用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックゼブラフィッシュを作製するとともに、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰ及びｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックマウスを作製した。
ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュの各部位を撮像した結果を図２４中ａ、ｂ及びｃに示す。図２４中、ａは三叉神経細胞を示し、ｂは胸ビレの外転筋を示し、ｃは体幹の腹側を示している。図２４ｂ及びｃ、中矢印は軸索の進展方向を示している。
ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの各部位を撮像した結果を図２４中ｄ、ｆ及びｇに示す。図２４中、ｄはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の側面から全体を撮像した写真であり、ｆはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の頚髄を撮像した写真であり、ｇはトランスジェニックマウス（Ｅ１４．５）の頚髄を撮像した写真である。また、ｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の頚髄を撮像した写真を図２４中ｅに示す。図２４ｄ及びｅ中、矢印は三叉神経細胞を示している。図２４中「ＤＲＧ」は後根神経節細胞を意味している。
図２４ａ〜ｂに示すように、ＳＳ−ｈｓｐ−ＧＦＰを用いて作製したトランスジェニックゼブラフィッシュでは、三叉神経細胞及び腹側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＧＦＰ）を発現していることが判った。また、図２４ｄ、ｆ及びｇに示すように、ｚＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスでは、三叉神経細胞（図２４ｄ）、腋芽の腹側の体幹筋に軸索を進展する運動神経細胞（図２４ｆ）及び後根神経節細胞（図２４ｇ）においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。
これに対して、図２４ｅに示すように、ｈｕＳＳ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスでは、三叉神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現しておらず、腹側に軸索を進展する神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。
以上の結果から、ｚＳＳ領域に基づくエンハンサー活性及びｈｕＳＳ領域に基づくエンハンサー活性は、腹側に軸索を進展する運動神経細胞において共通して認められることが明らかとなった。また、感覚神経細胞では、ｚＳＳ領域に基づくエンハンサー活性しか認められず、ｈｕＳＳ領域に基づくエンハンサー活性は認められなかった。
次に、ＣＭ領域のエンハンサー活性の局所性を検討するため、実施例２で作製したｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＧＦＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックゼブラフィッシュを作製するとともに、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて実施例３と同様にしてトランスジェニックマウスを作製した。
ｚＣＭを含むさらに大きなゼブラフィッシュのゲノム断片を用いて作製した７２時間のトランスジェニック胚の脊髄を撮像した結果を図２５ａに示す。ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスの各部位を撮像した結果を図２５中ｂ、ｃ及びｄに示す。図２５ｂはトランスジェニックマウス（Ｅ１２．５）の凍結切片における胸髄を抗Ｉｓｌｅｔ−１抗体（緑色）と抗ＰＬＡＰ抗体（赤色）を用いて二重染色した写真であり、図２５ｃはトランスジェニックマウス（Ｅ１０．５）全体を側面から撮像した写真であり、図２５ｄはトランスジェニックマウス（Ｅ１１．５）の凍結切片における胸髄を抗Ｉｓｌｅｔ−１抗体（緑色）と抗ＰＬＡＰ抗体（赤色）を用いて二重染色した写真である。
図２５ａに示すように、トランスジェニックゼブラフィッシュでは、脊髄二次運動神経細胞のうち背側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＧＦＰ）を発現していることが判った。また、図２５ｂに示すように、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいても、背側に軸索を進展する運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を発現していることが判った。また、図２５ｃ及びｄに示すように、ｈｕＣＭ−ＩＣＰ−ＰＬＡＰを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいては、全ての脳神経運動核並びに脊髄運動神経細胞及びＩｓｌｅｔ−１陽性運動神経細胞においてリポーター遺伝子（ＰＬＡＰ）を一過的に発現していることが判った。
以上の結果から、ｈｕＣＭ領域に基づくエンハンサー活性は、全ての運動神経細胞において一過的に認められるとともに、背側に軸索を進展する運動神経細胞に特異的に認められることが明らかとなった。
本例で示したように、ＳＳ領域及びＣＭ領域は、それぞれ異なる種類の運動神経細胞において特異的にエンハンサー活性を示すことが明らかとなった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
以上詳細に説明したように、本発明によれば、運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、任意の遺伝子の発現効率を高める新規なエンハンサーを提供することができる。また、本発明によれば、当該エンハンサーを有するベクター、遺伝子導入細胞、トランスジェニック動物、遺伝子発現調節方法、多能性幹細胞の分化判別方法及び運動神経・感覚神経の再生方法を提供することができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１７】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項３】
上記運動神経細胞は、背側に軸索を進展する運動神経細胞であることを特徴とする請求の範囲１又は２記載のエンハンサー。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項６】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサーを有するベクター。
【請求項７】
プロモーターと、コード領域を含む遺伝子とを更に有することを特徴とする請求の範囲６記載のベクター。
【請求項８】
請求の範囲６又は７記載のベクターを有する遺伝子導入細胞。
【請求項９】
請求の範囲６又は７記載のベクターを有するトランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサーの制御下で、所定の遺伝子の発現効率を向上させることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
【請求項１１】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー及び上記所定の遺伝子とを有する核酸構築物を細胞に導入する工程を有し、
運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、上記所定の遺伝子の発現効率を高めることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
【請求項１２】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程とを有し、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別することを特徴とする多能性幹細胞の分化判別方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程と、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別し、運動神経細胞又は感覚神経細胞を選択する工程と、
選択された運動神経細胞又は感覚神経細胞を移植する工程とを有する
運動神経・感覚神経の再生方法。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１〜４いずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号１における２３５〜５６０番目の塩基配列、配列番号２における２０４〜５２８番目の塩基配列、配列番号３における２０６〜５３０番目の塩基配列又は配列番号４における２１１〜５５５番目の塩基配列のいずれか１に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項３】
上記運動神経細胞は、背側に軸索を進展する運動神経細胞であることを特徴とする請求の範囲１又は２記載のエンハンサー。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、感覚神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡからなるエンハンサー。
（ａ）配列番号５又は６に表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５又は６に表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号５に表される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる塩基配列からなり、腹側に軸索を進展する運動神経細胞で遺伝子の発現効率を高める機能を有するＤＮＡ
【請求項６】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサーを有するベクター。
【請求項７】
プロモーターと、コード領域を含む遺伝子とを更に有することを特徴とする請求の範囲６記載のベクター。
【請求項８】
請求の範囲６又は７記載のベクターを有する遺伝子導入細胞。
【請求項９】
請求の範囲６又は７記載のベクターを有するトランスジェニック動物。
【請求項１０】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサーの制御下で、所定の遺伝子の発現効率を向上させることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
【請求項１１】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー及び上記所定の遺伝子とを有する核酸構築物を細胞に導入する工程を有し、
運動神経細胞及び／又は感覚神経細胞において、上記所定の遺伝子の発現効率を高めることを特徴とする遺伝子発現調節方法。
【請求項１２】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程とを有し、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別することを特徴とする多能性幹細胞の分化判別方法。
【請求項１３】
請求の範囲１〜５いずれか１項記載のエンハンサー、プロモーター及びレポーター遺伝子を含む核酸構築物を多能性幹細胞に導入する工程と、
上記多能性幹細胞に対して分化誘導する工程と、
レポーター遺伝子の発現を検定することによって、上記多能性幹細胞が運動神経細胞又は感覚神経細胞に分化したか否かを判別し、運動神経細胞又は感覚神経細胞を選択する工程と、
選択された運動神経細胞又は感覚神経細胞を移植する工程とを有する
運動神経・感覚神経の再生方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４９１１
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３５８８６（Ｐ２００４−５３５８８６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１０７６
【国際出願日】平成１５年８月２９日（２００３．８．２９）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月５日（２００６．１．５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１０７６
【国際出願日】平成１５年８月２９日（２００３．８．２９）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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