遺伝子導入ジカンバ−分解生物体を製造及び使用するための方法及び材料発明の分野
【課題】除草剤ジカンバ−分解酵素およびそれをコードする遺伝子等を提供する。
【解決手段】除草剤ジカンバ−分解酵素であるシュードモナス・マルトフィリア由来のジカンバ−オキシゲナーゼ、フェレドキシンと、レダクターゼ、および該酵素をコードするＤＮＡ分子、該遺伝子導入宿主細胞、さらに該遺伝子導入ジカンバ−耐性植物。これらの利用により、ジカンバ−耐性植物を含む畑での雑草の抑制、またジカンバーを含む物質の除染が可能となる。
【解決手段】除草剤ジカンバ−分解酵素であるシュードモナス・マルトフィリア由来のジカンバ−オキシゲナーゼ、フェレドキシンと、レダクターゼ、および該酵素をコードするＤＮＡ分子、該遺伝子導入宿主細胞、さらに該遺伝子導入ジカンバ−耐性植物。これらの利用により、ジカンバ−耐性植物を含む畑での雑草の抑制、またジカンバーを含む物質の除染が可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ジカンバ（dicamba）耐性を有するようにした遺伝子導入植物を含む、除
草剤であるジカンバを分解することができる遺伝子導入生物体に関する。この発明はまたジカンバ−分解酵素、及びジカンバ分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ分子及びＤＮＡ構成に関する。この発明はさらに、ジカンバー耐性遺伝子導入植物の畑における雑草の制御方法及びジカンバで汚染された材料からジカンバを除去する方法（生物治療）に関する。最後に、この発明はジカンバ耐性を基に、あるいはジカンバが分解した結果生成する３，６−ジクロロサリチル酸の蛍光の検出を基に、形質転換株を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
除草剤は農業生産において日常的に使用される。除草剤の効果はしばしば、作物畑での雑草の成長を止める能力及び換金作物の除草剤に対する耐性により決定される。換金作物がその除草剤に対し耐性を有しなければ、除草剤は換金作物の生産性を減少させ、あるいは換金作物を共に枯らしてしまうこととなる。逆に、除草剤の強さが十分でなければ、作物畑で雑草が成長しすぎ、これにより換金作物の生産性が減少してしまう。このため、除草剤に対し耐性のある、経済的に重要な植物を生産することが望ましい。農業用土地の水質及び環境的な質を守るため、除草剤の不測の流出が起きた場合あるいは容認できない高レベルの土壌あるいは水質汚染が起きた場合に除草剤を分解する技術を開発することも望ましい。
【０００３】
除草剤及び他のゼノフォビック化合物を不活性化する酵素を符号化する遺伝子が、様々な原核生物及び真核生物から以前単離された。場合によっては、これらの遺伝子は植物における発現が成功するように遺伝子的に工作されている。このアプローチを介して、除草剤、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸ストレバー（Streber）及びウィルミッツァ（Willmitzer）１９８９バイオ／テクノロジー ７：８１１−８１６；２、４−Ｄ、ブロモキシニルストーカー（Stalker）ら、（１９８８）サイエンス２４２：４１９−４２３；商標名
バクトリル(Buctril))、グリフォセート（コマイ（Comai）ら、（１９８５）ネイチャー
３１７：７４１−７４４；商標名ラウンドアップ(Round-up)）及びホスフィノトリシン（デブロック（De Block）ら、（１９９７）エンボジャーナル６：２５１３−２５１８；商標名バスタ(Basta)）に耐性を持つ植物が開発されている。
【０００４】
ジカンバ（商標名バンベル(Banvel)）は、とうもろこし、もろこし類、小穀粒、牧草地、干草、放牧地、さとうきび、アスパラガス、芝、イネ科種子作物における一年生及び多年生広葉雑草及び幾つかのイネ科雑草を抑制するための出芽前散布除草剤及び出芽後散布除草剤として使用される。クロッププロテクションレファレンスの１８０３−１８２１ページ参照のことケミカル＆ファーマソイティカルプレス社、ニューヨーク、ＮＹ、１１版、１９９５年。不幸なことに、ジカンバは多くの商業用の作物豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ひまわり、トマト、タバコ及び果樹を含む、観賞植物及び樹木、及び他の広葉植物と触れると、それらに損害を与える。同上のジカンバは化学的に安定であり、環境において分解されにくい場合もある。
【０００５】
ジカンバは安息香酸除草剤のクラスである。ジカンバを含む安息香酸除草剤に対し耐性を持つ植物は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）シンターゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣオキシダーゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣ脱アミノ酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを植物内に組み入れることにより産出することができることが示唆されている。カナダ特許出願第２，１６５，０３６号（１９９６年６月１６日に公表
）を参照のこと。しかしながら、この出願では、このような耐性について立証をする実験的なデータは示されていない。
【０００６】
ジカンバを代謝する細菌が知られている。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガー（Krueger）らの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コ
ーク（Cork）及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリル（Khalil）の先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの細菌によるジカンバ代謝の原因となる特定の遺伝子を単離し、ジカンバー耐性植物及び他の生物体を産出するのに使用することができることが示唆されている。同上及びヤング（Yang）らの分析生物化学、２１９、３７−４２（１９９４）を参照のこと。しかしながら、この発明以前では、そのような遺伝子は同定も単離もされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明は単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解オキシゲナーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解フェレドキシン、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解レダクターゼを提供するものである。これらは全て以下において規定、説明する。
【０００９】
この発明はまた、ジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子及びジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子を提供するものである。この発明はさらに、発現制御配列と機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成及び発現制御配列と機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成を提供するものである。
【００１０】
この発明はさらに、発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む遺伝子導入宿主細胞、及び発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む遺伝子導入宿主細胞を提供するものである。遺伝子導入宿主細胞はジカンバ−分解オキシゲナーゼ及びジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含んでもよい。これらはどちらも発現制御配列に機能可能に結合している。遺伝子導入宿主細胞は植物細胞でも、原核あるいは真核微生物でもよい。
【００１１】
さらに、この発明は発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む１つ以上の細胞を有する遺伝子導入植物あるいは植物部分を提供するものである。植物あるいは植物部分の１以上の細胞はさらに、発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含んでもよい。遺伝子導入植物または植物部分はジカンバに対し耐性があり、そのジカンバに対する耐性はジカンバ−分解オキシゲナーゼの発現あるいはジカンバ−分解オキシゲナーゼとフェレドキシンの発現により増加する。
【００１２】
この発明はまた、本発明にかかる遺伝子導入ジカンバー耐性植物を含む畑において雑草を抑制する方法を提供するものである。この方法は雑草を抑制するのに有効なある量のジカンバを畑に適用する工程を含む。
【００１３】
この発明はさらに、ジカンバを含む物質の除染を行う方法を提供する。１つの実施の形態では、この方法は有効量の本発明にかかる遺伝子導入ジカンバ−分解微生物をその物質
に適用する工程を含む。他の実施の形態では、この方法は有効量のジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼまたは有効量のジカンバ−分解オキシゲナーゼと、ジカンバ−分解フェレドキシンとジカンバ−分解レダクターゼの組み合わせをその物質に適用する工程を含む。
【００１４】
この発明はまた、選択標識としてジカンバ耐性を使用した形質転換植物細胞及び形質転換植物の選択方法も提供する。１つの実施の形態では、この方法は、発明にかかるＤＮＡ構成を用いて一群の植物細胞中の少なくともいくつかの植物細胞の形質転換を行い、得られた植物細胞群を、形質転換植物細胞は増殖するが形質転換されていない植物細胞は増殖しないように選択された濃度のジカンバを含む培地で増殖させる工程を含む。他の実施の形態では、この方法は、ジカンバの分解を起こす発明にかかるＤＮＡ構成を含むと思われる一群の植物にジカンバを適用する工程を含み、このジカンバは形質転換された植物は成長するが、形質転換されていない植物の成長は阻害されるように選択された量で適用される。
【００１５】
最後に、この発明は、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分に対する選択方法あるいはスクリーニング方法を提供する。この方法は、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を含むと考えられる一群の宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分を提供する工程と、３，６−ジクロロサリチル酸による蛍光の存在またはレベルを確認する工程とを含む。３，６−ジクロロサリチル酸は形質転換宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分において、ジカンバの分解の結果生成し、形質転換されていない宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分では生成されない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ジカンバＯ−デメチラーゼに対する電子伝達スキームを示した図である。ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼDICからフェレドキシンDICまで、そしてオキシゲナーゼDICまで逐次伝達される。酸素と基質であるジカンバとから３，６−ジクロロサリチル酸が形成する反応はオキシゲナーゼDICにより触媒される。ここで、ｏｘは酸化状態、ｒｅｄは還元状態である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の現在のところ好ましい実施の形態の詳細な説明 以前の研究（コークとクルー
ガー、先進応用微生物学、３６：１−５６及びヤングら１９９４、分析生物化学、２１９：３７−４２）では、土壌細菌、シュードモナス・マルトフィリア、ＤＩ−６株は一段反応でジカンバの除草活性を消失させることができることが示されている。この一段反応では、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）は３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ）に転化される。３，６−ＤＣＳＡは除草活性を有しておらず、植物に対しいかなる有害な影響を与えないことが示されている。さらに、３，６−ＤＣＳＡは土壌中に存在する通常の細菌叢により容易に分解される。
【００１８】
この中で説明している実験により、シュードモナス・マルトフィリア株ＤＩ−６によりジカンバが３，６−ＤＣＳＡに転化されるのはＯ−デメチラーゼが原因であるというヤングらの仮説（同書物参照のこと）が確認され、Ｏ−デメチラーゼはレダクターゼと、フェレドキシンと、オキシゲナーゼとからなる三成分酵素系であることが確立される。シュードモナス・マルトフィリアＯ−デメチラーゼ及びその三成分の単離、精製、キャラクタリゼーションについて詳細に説明している実施例１を参照のこと。ジカンバＯ−デメチラーゼの三成分により触媒される反応に対する反応スキームを図１に示す。図１に示されるように、ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼとフェレドキシンからなる短い電子連鎖を介して末端のオキシゲナーゼまで往復し、このオキシゲナーゼがジカンバの酸化を触媒し、３，６−ＤＣＳＡが生成される。
【００１９】
第１の実施の形態では、この発明により、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ−分解酵素が提供される。この中で使用されている「単離された」という用語は、酵素が産出細胞から少なくとも取り出された（すなわち、酵素は細胞溶解物中に含まれる）ことを意味する。この中で使用されている「少なくとも部分的に精製された」とは、酵素が細胞溶解物の他の成分から少なくとも部分的に単離されていることを意味する。好ましくは、酵素は十分に精製され、酵素の試料は少なくとも７０％は均一である。
【００２０】
特に、この発明は単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼを提供する。「ジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ」はこの中では、ジカンバ−分解オキシゲナーゼ、ジカンバ−分解フェレドキシン及びジカンバ−分解レダクターゼの組み合わせを意味するものと規定される。これらは全て以下に規定する通りである。
【００２１】
この発明はまた単離した、少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解オキシゲナーゼを提供する。「ジカンバ−分解オキシゲナーゼ」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製したオキシゲナーゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるオキシゲナーゼを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解オキシゲナーゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼのアミノ酸配列を有する突然変異オキシゲナーゼが含まれる。ジカンバ−分解オキシゲナーゼの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２２】
この発明はさらに、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバー分解フェレドキシンを提供する。「ジカンバ−分解フェレドキシン」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製されたフェレドキシン、及びシュードモナス・マルトフィリアフェレドキシンのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるフェレドキシンを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解フェレドキシン」には、シュードモナス・マルトフィリアフェレドキシン配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアフェレドキシンのアミノ酸配列を有する突然変異フェレドキシンが含まれる。ジカンバ−分解フェレドキシンの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２３】
最後に、この発明は単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバー分解レダクターゼを提供する。「ジカンバ−分解レダクターゼ」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製されたレダクターゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアレダクターゼのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるレダクターゼを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解レダクターゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアレダクターゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアレダクターゼのアミノ酸配列を有する突然変異レダクターゼが含まれる。ジカンバ−分解レダクターゼの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２４】
アミノ酸配列の相同性の程度を決定する方法は当業者には周知である。例えば、遺伝学的コンピューティンググループ（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラム（ウィスコンシン大学、マディソン、ＷＩ）を使用して、スイスタンパク質データベースなどの様々なタンパク質データベースにおける配列を比較することができる。
【００２５】
この発明のジカンバ−分解酵素は、実施例で説明しているように、シュードモナス・マルトフィリア及び他の生物体から単離、精製することができる。適した他の生物体としては、ジカンバを分解するシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株以外の細菌が挙げられる。そのような細菌の幾つかの株が周知である。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガーらの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コーク及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリルの先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。他のジカンバ−分解細菌株は、当業者に周知の方法により単離することができる。
【００２６】
しかしながら、好ましくは、この発明のジカンバ−分解酵素は組み換えＤＮＡ技術（以下を参照）を用いて調製される。特に、シュードモナス・マルトフィリア配列のアミノ酸において１つ以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリア酵素のアミノ酸配列を有する突然変異酵素は、この様に、例えば、オリゴヌクレオチド−定方向突然変異誘発、リンカー−スキャニング変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた変異誘発、などを用いて調製される。オースベル（Ausubel）ら編集の分子生
物学における最近のプロトコルワイリーインターサイエンス（Wiley Interscience）１９９０、及びマクファーソン（McPherson）編集、定方向突然変異誘発：実際のアプローチ
（ＩＲＬプレス１９９１）を参照のこと。
【００２７】
第２の実施の形態では、この発明は、この発明のジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定する単離したＤＮＡ分子を提供する。「単離された」はこの中で、ＤＮＡ分子がその自然環境から取り出されていること、あるいは自然発生ＤＮＡ分子ではないことを意味するために使用される。これらのＤＮＡ分子の調製方法は当業者に周知である。例えば、マニアチス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８２、サムブルック（Sambrook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹを参照のこと。
【００２８】
例えば、この発明のＤＮＡ分子は単離したｃＤＮＡまたはゲノミッククローンでもよい。シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株のジカンバ−分解オキシゲナーゼ及びフェレドキシンの遺伝暗号を指定するクローンの同定及び単離は実施例２及び実施例３で説明されている。ジカンバ−分解レダクターゼの遺伝暗号を指定するクローンを含む、ジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するその他のクローンは同様に得ることができる。単離したクローン、あるいはそれらの一部をプローブとして使用して、最初にクローンを単離した生物体以外の生物体から追加のクローンを同定、単離することができる。適した生物体としては、ジカンバを分解する細菌が挙げられる。上述したように、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株以外に、幾つかの細菌株がジカンバを分解することが知られている。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガーらの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コーク及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリルの先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。
【００２９】
この発明のＤＮＡ分子はまた単離したクローンの配列を用いて化学的に合成することもできる。そのような技術は当業者に周知である。例えば、ＤＮＡ配列は自動ＤＮＡ合成器内でホスホアミダイト化学により合成してもよい。化学合成には多数の利点がある。特に、ＤＮＡ配列が発現する宿主が選択したコドンを使用して発現を最適化してもよいため、化学合成は望ましい。発現を改良するためにコドンの全てを変える必要はないが、好ましくは、少なくとも宿主においてほとんど使用されないコドンは宿主選択コドンに変更される。約５０％を超える、最も好ましくは少なくとも約８０％のコドンを宿主選択コドンに変更することにより、高レベルの発現を得ることができる。多くの宿主細胞のコドン選択性は周知である。例えば、遺伝子発現の最大化、２２５−８５ページレズニコフ（Reznik
off）及びドールド、編集、１９８６、ＰＣＴ ＷＯ ９７／３１１１１５、ＰＣＴ ＷＯ９７／１１０８６、ＥＰ ６４６６４３、ＥＰ ５５３４９４、及び米国特許第５，６８９，０５２号、第５，５６７，８６２号、第５，５６７，６００号、第５，５５２，２９９号、第５，０１７，６９２号を参照のこと。
【００３０】
他の宿主細胞のコドン選択性は当業者に周知の方法により導き出すことができる。また、化学合成を用いて、ＤＮＡ分子の配列あるいはそれにより遺伝暗号が指定されたタンパク質を容易に変更し、例えば発現を最適化すること例えば、転写または翻訳を阻害するｍＲＮＡ２次構造を除去すること、好都合な点で独特な制限部位を付加すること、プロテアーゼ開裂部位を削除すること、などができる。
【００３１】
第３の実施の形態では、この発明は発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡを含むＤＮＡ構成を提供する。「ＤＮＡ構成」はこの中では、ＤＮＡを宿主細胞中に導入するために有効な構築した（非−自然的に生じた）ＤＮＡ分子と定義される。この用語はキメラ遺伝子、発現カセット、及びベクターを含む。
この中で使用されている「機能可能に結合された」とは、遺伝暗号が指定されたタンパク質が発現されるようなＤＮＡ配列の結合（配列順序、配列の配向、及び様々な配列の相対的な距離を含む）を言う。遺伝暗号を指定する配列に表現制御配列を機能可能に結合する方法は当業者に周知である。例えば、アニアティス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）及びサムブルック（Sam brook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、
ＮＹ（１９８９）を参照のこと。
【００３２】
「発現制御配列」は、原核生物及び真核生物における転写または翻訳の規制に何らかの関わりのあるＤＮＡ配列である。適した発現制御配列及びそれらの作成方法及び使用方法は当業者に周知である。
【００３３】
発現制御配列にはプロモータが含まれなければならない。プロモータは選択された宿主細胞または生物体において転写活性を示すＤＮＡ配列であればどのようなものでもよい。プロモータは誘導性あるいは構成性であってもよい。自然発生したものでもよく、様々な自然発生プロモータの部分から構成されてもよく、部分的にあるいは全体的に合成されたものでもよい。プロモータの設計のガイダンスが、ハーレイ（Harley）及びレイノルド(Relnolds)、核酸リサーチ、１５、２３４３−６１（１９８７）などのプロモータ構造の研究により提供されている。また、転写開始に関するプロモータの位置は最適化してもよい。例えば、ロバートらのプロシーヂャー、国立アカデミー、サイエンス、ＵＳＡ、７６、７６０−４（１９７９）を参照のこと。原核生物及び真核生物において使用するための多くの適したプロモータが当業者に周知である。例えば、植物において使用するための適した構成性プロモータとしては、植物ウィルスからのプロモータオデール（Odell）ら、ネ
イチャー３１３：８１０−８１２１９８５))、クロレラウィルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータ米国特許第５，５６３，３２８号、ゴマノハグサモザイクウィルスからの全長転写プロモータ米国特許第５，３７８，６１９号、及びコメアクチンマクエローリー（McElory）ら、植物細胞２：１６３−１７１１９９０))、ユビキチンクリステン
セン（Christensen）ら、植物分子生物学１２：６１９−６３２（１９８９）及びクリス
テンセンら、植物分子生物学１８：６７５−６８９、ｐＥＭＵラスト（Last）ら、理論応用遺伝子学８１：５８１−５８８１９９１))、ＭＡＳベルテン（Velten）ら、ＥＭＢＯジャーナル３：２７２３−２７３０１９８４))、トウモロコシＨ３ヒストンレペチット（Lepetit）ら、分子遺伝子遺伝学２３１：２７６−２８５（１９９２）及びアタナッソバ（Atanassova）ら、植物ジャーナル２３：２９１−３００１９９２))、アブラナ属ナプスＡ
ＬＳ３（ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４１２２８）などの遺伝子からのプロモータ、及び様々
なアグロバクテリウム属遺伝子のプロモータ（米国特許第４，７７１，００２号、第５，
１０２，７９６号、第５，１８２，２００号、第５，４２８，１４７号）が挙げられる。
【００３４】
植物において使用するのに適した誘導性プロモータとしては、銅に応答するＡＣＥ１系からのプロモータメット（Mett）ら、ＰＮＡＳ９０：４５６７−４５７１１９９３))、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答するトウモロコシＩｎＺ遺伝子のプロモータハーシェイ（Hershey）ら、分子遺伝子遺伝学２２７：２２９−２３７（１９９１）及
びガッツ（Gatz）ら、分子遺伝子遺伝学２４３：３２−３８１９９４))、及びＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサのプロモータ（ガッツら、分子遺伝子遺伝学２２７：２２９−２３７１９９１）が挙げられる。植物に使用するのに特に好ましい誘導性プロモータは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するものである。この型の誘導性プロモータの例としては、転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されるステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモータが挙げられる（スケナ（Schena）ら、プロシーヂャー、国立アカデミー、サイエンス、ＵＳＡ８８：１０４２１１９９１。植物に使用するための他の誘導性プロモータはＥＰ ３３２１０４、ＰＣＴ ＷＯ ９３／２１３３４、ＰＣＴ ＷＯ
９７／０６２６９において説明されている。
【００３５】
細菌において使用するのに適したプロモータとしては、バシラスステアロサーモフィラスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモータ、バシラスリケニホルミスアルファーアミラーゼ遺伝子、バシラスアミロリケファシエンスＢＡＮアミラーゼ遺伝子、枯草菌アルカリプロテアーゼ遺伝子、バシラスプミラスキシロシダーゼ遺伝子、ファージラムダＰｐ及びＰｌプロモータ、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００３６】
酵母宿主細胞において使用するのに適したプロモータとしては、酵母解糖遺伝子からのプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、及びＡＤＨ２−４ｃプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００３７】
糸状菌類において使用するのに適したプロモータとしては、ＡＤＨ３プロモータ、ｔｐｉＡプロモータ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギンタンパク質分解酵素、アスペルギルス・ニガー中性α-アミラーゼ、アス
ペルギルス・ニガー酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギ
ルス・アワモリグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスパルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼの遺伝暗号を指定する遺伝子のプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００３８】
哺乳類細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ＳＶ４０プロモータ、金属チオネイン遺伝子プロモータ、ネズミの乳房腫瘍ウィルスプロモータ、ラウス肉腫ウィルスプロモータ、及びアデノウィルス２主働遅発プロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００３９】
昆虫細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリフォルニカ多角体病ウィルス塩基性タンパク質プロモータ、バクロウィルス初期遺伝子１プロモータ及びバクロウィルス３９Ｋ遅発−早発遺伝子プロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００４０】
最後に、他のプロモータの一部からなるプロモータ及び部分的あるいは全体的に合成した合成プロモータも使用することができる。例えば植物において使用するためのそのようなプロモータについて説明している、ニ（Ni）らの植物ジャーナル７：６６１−６７６（
１９９５）及びＰＣＴ ＷＯ ９５／１４０９８を参照のこと。
【００４１】
プロモータは１以上のエンハンサー要素を含んでもよく、あるいは１以上のエンハンサー要素を含むように修飾されてもよい。好ましくは、プロモータは複数のエンハンサー要素を含む。エンハンサー要素を含むプロモータは、エンハンサー要素を含まないプロモータに比べて高いレベルの転写を提供する。植物において使用するのに適したエンハンサーとしてはカリフラワーモザイクウィルスからの３５Ｓエンハンサー（米国特許第５，１０６，７３９号及び第５，１６４，３１６号を参照のこと）及びゴマノハグサモザイクウィルスからのエンハンサー要素（マイティ（Maiti）ら、遺伝子導入リサーチ６：１４３−
１５６（１９９７）が挙げられる。他の細胞において使用するのに適した他のエンハンサーは周知である。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びエンハンサーと真核生物の発現（コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８３）を参照のこと。
【００４２】
有効な発現のために、暗号配列もまた３’未翻訳配列に機能可能に結合されていることが好ましい。３’未翻訳配列は転写及び／または翻訳終止配列を含む。３’未翻訳領域は細菌、植物あるいは他の真核生物細胞からの遺伝子の側面領域から得ることができる。原核生物において使用するためには、３’未翻訳配列は転写終止配列を含む。植物及び他の真核生物において使用するためには、３’未翻訳領域は転写終止配列及びポリアデニル化配列を含む。植物において使用するのに適した３’未翻訳配列はカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子、ファセオリン種子貯蔵タンパク質遺伝子、エンドウのリブロースビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットＥ９遺伝子、大豆７５貯蔵タンパク質遺伝子、オクトピンシンターゼ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’未翻訳配列を含む。
【００４３】
植物及び他の真核生物においては、５’未翻訳配列も用いられる。５’未翻訳配列は、５’ＣＡＰ部位から翻訳開始コドンまで延在しているｍＲＮＡの部分である。このｍＲＮＡの領域は真核生物では翻訳の開始のために必要であり、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。植物において使用するのに適した５’未翻訳配列としては、アルファルファモザイクウィルス、キュウリモザイクウィルス外皮タンパク質遺伝子、タバコモザイクウィルスの５’未翻訳配列が挙げられる。
【００４４】
上述したように、ＤＮＡ構成はベクターでもよい。ベクターは１以上の複製システムを含んでもよく、これによりベクターが宿主細胞において複製する。自己複製ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターが挙げられる。その代わりに、ベクターは組み込みベクターでもよく、これにより、この発明のジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定する配列の宿主細胞染色体中への組込みが可能となる。ベクターはまた、ＤＮＡ配列の挿入のためのユニークな制限部位を有することが望ましい。ベクターがユニークな制限部位を有していない場合、ベクターを修飾して制限部位を導入または除去しその後の操作により適したものとしてもよい。
【００４５】
発明にかかるＤＮＡ構成を使用して様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる下記参照のこと。形質転換宿主細胞を選択するためには、遺伝標識を使用しなければならない「選択標識」。選択標識により典型的には、形質転換された細胞は、負の選択によりすなわち、選択標識を含まない細胞の成長を阻害することにより、あるいは選択標識により遺伝暗号が指定された産出物をスクリーニングすることにより、回収することができる。植物の形質転換のための選択可能な標識遺伝子として最も普通に使用されるのは、Ｔｎ５から単離されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これを植物調節シグナルの制御下に置くと、カナマイシンに対する耐性が付与される。フラリー（Fraley）ら、プロシージャー国立アカデミーサイエンスＵＳＡ、ＢＯ：４８０３
１９８３。他の普通に使用される選択可能な標識遺伝子は、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、この遺伝子は構成物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する。バンデンエルゼン（Vanden Elzen）ら、植物分子生物学５：２９９１９８５。
【００４６】
抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源のその他の選択可能な標識遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、及びブレオマイシン耐性決定基が挙げられる。ヘイフォード（Hayford）ら、植物生理学８６：１２１６１９８８
、ジョーンズ（Jones）ら、分子遺伝子遺伝学２１０：８６１９８７、スバブ（Svab）ら
、植物分子生物学１４：１９７１９９０、ヒル（Hille）ら、植物分子生物学７：１７１
１９８６。他の選択可能な標識遺伝子は、グリフォセート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する耐性を付与する。コマイ（Comai）ら、ネイチャー３１７
：７４１−７４４１９８５、ゴルドン−カム（Gordon-Kamm）ら、植物細胞２：６０３−
６１８（１９９０）及びストーカー（Stalker）ら、サイエンス２４２：４１９−４２３
１９８８。
【００４７】
植物の形質転換のために選択可能な他の標識遺伝子は細菌起源のものではない。これらの遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロフォレートレダクターゼ、植物エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ及び植物アセトラクテートシンターゼが挙げられる。エイコルツ（Eichholtz）ら、体細胞分子遺伝学１３：６７１９８７、サー（Shah）ら、サイエンス２３３：４７８１９８６、チャレスト（Charest）ら、植物細胞リポート８：６４３１９９０。
【００４８】
形質転換細胞と仮定される細胞のスクリーニングを行うために普通用いられる遺伝子としては、β−グルクロニダーゼＧＵＳ、β−ガタクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。ジェファーソン(Jefferson)、Ｒ．Ａ、植物分子生物学リポート５：３８７１９８７、ティーリ（Teeri）ら、ＥＭＢＯジャーナル８：３４３１９８９、コンクツ（Koncz）ら、プロシーヂャー国立アカデ
ミーサイエンスＵＳＡ８４：１３１１９８７、デブロック（De Block）ら、ＥＭＢＯジャーナル３：１６８１１９８４、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）チャルフィー（Chalfie）
ら、サイエンス２６３：８０２１９９４、ハセロッフ（Haseloff）ら、ＴＩＧ１１：３２８−３２９（１９９５）及びＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４１２２８。比較的まれな形質転換
事象の同定へのアプローチは、トウモロコシのアントシアニン色素沈着経路の優性抗生性調節体の遺伝暗号を指定する遺伝子を使用するものである。ルードウィグ（Ludwig）ら、サイエンス２４７：４４９１９９０。
【００４９】
植物以外の原核生物及び真核生物において使用するのに適した選択標識も周知である。例えば、ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。例えば、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、テトラシリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンまたはヒグロマイシン）に対する耐性を選択標識として使用してもよい。
【００５０】
本発明の別の観点によれば、植物及び植物細胞のための選択標識として、ジカンバに対する耐性を使用することができる。「耐性」は、形質転換された植物細胞が、形質転換されていない細胞の成長を妨害するレベルのジカンバを含む培地に置いた場合に成長する（生き残り、再生して植物になる）ことができることを意味する。「耐性」はまた、形質転換植物が、形質転換されていない植物の成長を阻害する量のジカンバを適用した後も成長することができることを意味する。
【００５１】
形質転換植物細胞の選択方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、一群の植物細
胞（例えば、外植体または胚懸濁培養）において少なくとも幾つかの植物細胞について、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を用いて形質転換を行う。得られた植物細胞群を、形質転換された植物細胞は増殖するが、形質転換されていない植物細胞は増殖しないように選択された濃度のジカンバを含む培地に置く。適したジカンバ濃度は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００５２】
形質転換された植物を選択する方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を含むと思われる一群の植物にジカンバを適用する。ジカンバの量は、形質転換された植物は成長するが、形質転換されていない植物の成長は阻害されるように選択される。阻害レベルは、形質転換された植物とそうでない植物とが容易に識別できる（すなわち、阻害は統計学上、有意なものでなければならない）ように十分なものでなければならない。そのような量は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００５３】
さらに、ジカンバの分解の結果生成する３，６−ＤＣＳＡを使用して選択、スクリーニングすることができる。３，６−ＤＣＳＡの生成はこの化合物の蛍光を観測することにより簡単に確認することができ、このため、形質転換された宿主細胞、完全の生物体、生物体の一部（例えば、微生物、植物、植物の部分、及び植物細胞）の選択、スクリーニングすることができる。この点に関しては、この発明により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する場合と同様に、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分の選択及びスクリーニングが可能である。米国特許第５，１６２，２２７号、第５，４９１，０８４号、及びＰＣＴ出願ＷＯ ９６／２７６７５、ＷＯ ９７／１１０９４、ＷＯ ９７
／４１２２８、ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。これらは全てこの中で引用され参
照される。特に、３，６−ＤＣＳＡは、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分において、従来の分光測光法を用いて検出することができる。例えば、顕微鏡は、蛍光励起及び検出用の適当なフィルタを組み合わせて適合させることができる。ベンチでの調査または現地調査では手持ちランプを使用してもよい実施例１を参照のこと。蛍光-活性化細胞分類も使用することができる。３，６−ＤＣＳＡは３１２−３１３ｎｍの
波長で励起され、極大発光波長は４２４ｎｍである。
【００５４】
生物体の「部分」は器官、組織、あるいはその他の全ての部分を含む。「植物の部分」は種子、花粉、胚芽、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを含む。
ジカンバ耐性植物またはジカンバ−分解微生物を産出するには、ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択を使用することができる。この場合、他の選択標識の使用は必要ない。ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択はまた、他の興味のある遺伝子が発現する遺伝子導入細胞または生物体の産出に使用することができる。多くのそのような遺伝子は周知であり、そのような遺伝子としては、経済価値のあるタンパク質の遺伝暗号を指定する遺伝子、植物に改良された農業経済学的特性を付与する遺伝子が挙げられる例えば、ＰＣＴ ＷＯ９７／４１２２８を参照のこと。この開示内容は全てこの中で引用
され参照される。
【００５５】
本発明のＤＮＡ構成を使用して、原核生物や真核生物を含む様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる。別個の選択標識を使用する場合、ジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列及び選択標識は、同じあるいは異なるＤＮＡ構成上にあってもよい。好ましくは、それらは転写単位としての単一のＤＮＡ構成上に配列され、遺伝暗号を指定する配列の全てが共に発現される。また、関心のある遺伝子及びジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列は、ジカンバー耐性またはジカンバ−分解を選択標識として使用する場合、同じまたは異なるＤＮＡ構成上にあってもよい。そのような構成は以上で説明したのと同様に調製することができる。
【００５６】
適した宿主細胞としては、原核微生物及び真核微生物例えば、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス及び大腸菌を含む、酵母（サッカロミセス・セレビシエを含む）及び他の真菌アスペルギルス種を含む))、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は通常ジカンバを分解しないものである。しかしながら、この発明はまた、通常ジカンバを分解する宿主細胞におけるジカンバ分解レベルを増加させるために使用することができる。
【００５７】
このように、本発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解しない細胞及び生物体が含まれるが、これらの細胞及び生物体はこの発明により形質転換され、この除草剤を分解することができるようになる。この発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解する細胞及び生物体も含まれ、これらの細胞及び生物体はこの発明により形質転換され、この除草剤をより多く分解することができる、あるいはより効果的に分解することができるようになる。
【００５８】
原核生物及び真核生物の宿主細胞の形質転換方法は当業者に周知である。例えば、マニアチス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８２、サムブルック（Sambrook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８９、ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８、ＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００５９】
例えば、生物学的及び物理学的形質転換プロトコルを含む、多くの植物形質転換方法が開発されている。例えば、ミキらの植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法における「異種ＤＮＡを植物に導入するための手順」、グリック(Glick)、Ｂ．Ｒ．及び
トンプソン(Thompson)、Ｊ．Ｅ．編集（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．ボカ ラトン(Boca Raton)、１９９３）６７−８８ページを参照のこと。さらに、植物細胞または組織の形質転換
及び植物の再生のためのベクター及び生体外培養法が有効である。例えば、グルバー（Gruber）らの植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法おける「植物形質転換のためのベクター」、グリック、Ｂ．Ｒ．及びトンプソン、Ｊ．Ｅ．編集（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．ボカ ラトン(Boca Raton)、１９９３）８９−１１９ページを参照のこと。発現
ベクターを植物に導入するための最も広く使用されている方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換システムに基づくものである。例えば、ホルシュ（Horsh）ら、サイエンス
２２７：１２２９（１９８５）を参照のこと。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスは、遺伝学的に植物細胞の形質転換を行う植物の病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を運ぶ。例えば、カド(Kado)、Ｃ．Ｉ、評論レビュー、植物サイエンス１０：１（１９９１）を参照のこと。アグロバクテリウムのベクターシステムの説明及びアグロバクテリウム−媒介遺伝子伝達の方法は多くの参考文献において示されている。例えば、グルバー（Gruber）ら前述、ミキら前述、モロニー（Moloney）らの植物細胞リポート８：２３８
１９８９、及び米国特許第４，９４０，８３８号及び第５，４６４，７６３号などである。
【００６０】
一般に適用できる植物の形質転換方法は、ＤＮＡが微小噴射体の表面上で運ばれる微小噴射体−媒介形質転換である。発現ベクターは、微小噴射体を加速して植物細胞壁及び細胞膜を通過するのに十分な速度とするバイオリスティック装置を用いて植物組織内に導入される。サンフォード（Sanford）ら、特別サイエンステクノロジー５：２７１９８７、
サンフォード、Ｊ．Ｃ．トレンドバイオテクノロジー６：２９９１９８８、サンフォード、Ｊ．Ｃ，生理学植物７９：２０６１９９０、クレイン（Klein）ら、バイオテクノロジ
ー１０：２６８１９９２。
【００６１】
ＤＮＡを物理的に植物まで運ぶための別の方法は目標細胞の音波処理である。ツァング（Zhang）ら、バイオ／テクノロジー９：９９６１９９１。その代わりに、リポソームま
たはスフェロプラストを使用して発現ベクターが植物内に導入されている。デシャエス（Deshayes）ら、ＥＭＢＯジャーナル４：２７３１１９８５、クリストウ(Christou)、プロシージャー国立アカデミーサイエンス ＵＳＡ８４：３９６２１９８７。ＣａＣｌ2沈澱、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを用いたＤＮＡのプロトプラストへの直接摂取もまた報告されている。ヘイン（Hain）ら、分子遺伝子遺伝学１９９：１６１（１９８５）及びドラパー（Draper）ら、植物細胞生理学２３：４５１１９８２。プロトプラスト及び、全細胞及び組織のエレクトロポレーションについても説明されている。ドン（Donn）ら、植物細胞及び組織培養に関する第７回国際会議ＩＡＰＴＣの要約において、Ａ２−３８、５３ページ１９９０；ドハルイン（D'Halluin）ら、植物細胞４：１４９５
−１５０５（１９９２）及びスペンサー（Spencer）ら、植物分子生物学２４：５１−６
１１９９４。
【００６２】
本発明によれば、どの型の遺伝子導入ジカンバー耐性植物も産出することができる。特に、現在のところジカンバの被害を受けていることが知られている広葉植物（インゲン豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、タバコ、果樹及び観葉植物及び観葉樹木を含む）の形質転換を行い、それらの植物が除草剤に対し耐性を有するようにすることができる。現在ジカンバに対し耐性があると考えられている他の植物（例えば、トウモロコシ、モロコシ類、小穀粒、サトウキビ、アスパラガス及び草）も形質転換し、除草剤に対する耐性を増加させることができる。「耐性がある」とは、形質転換された植物が、形質転換されていない植物の成長を阻害する量のジカンバの存在下で成長することができることを意味する。
【００６３】
本発明のジカンバ−分解オキシゲナーゼは、ジカンバを分解する遺伝子導入宿主細胞及び生物体において見出された内因性のレダクターゼとフェレドキシンと共に機能することができると考えられる。植物葉緑体は特にレダクターゼ及びフェレドキシンが豊富である。従って、遺伝子導入ジカンバー耐性植物を産出するための好ましい実施の形態では、ジカンバ−分解オキシゲナーゼを葉緑体内に導くペプチドの遺伝暗号を指定する配列（「葉緑体標的配列」）を使用する。葉緑体標的配列の遺伝暗号を指定するＤＮＡは、好ましくはジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定する配列の上流（５’）に位置するが、暗号づけ配列の下流（３’）に位置してもよく、あるいは暗号づけ配列の上流、下流両方に位置してもよい。葉緑体標的配列の例としては、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列ベッカー（Becker）ら、植物分子生物学２０：４９（１９９２）及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４１２２８を参照のこと、及びエンドウグルタチオンレダクターゼシグナル配列（クライセン（Cre issen）ら、植物ジャーナル２：１２９１９９１及びＰＣＴ ＷＯ ９７／
４１２２８を参照のこと）が挙げられる。
【００６４】
代わりの好ましい実施の形態では、葉緑体内で機能するプロモータを含む構成を用いて葉緑体の直接形質転換が行われ、葉緑体内でオキシゲナーゼの発現が得られる。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ ＷＯ ９５／２４４９２及び米国特許第５，５４５，８１８号を参照のこと。
【００６５】
更に別の実施の形態では、この発明は、遺伝子導入ジカンバー耐性植物が成長する畑での雑草の制御方法を提供する。この方法は、有効量のジカンバを畑に適用して雑草を制御する工程を含む。ジカンバの適用方法及び様々な型の雑草を制御するのに有効なジカンバの量は周知である。作物保護基準、１８０３−１８２１ページ（ケミカル＆ファーマソイティカルプレス社、ニューヨーク、ＮＹ、１１版、１９９５）を参照のこと。
【００６６】
他の実施の形態では、この発明は土壌、水、あるいはジカンバ製造設備の老廃物などの
物質中に存在するジカンバを分解する方法を提供する。そのような分解は、この発明のジカンバ−分解酵素を用いて達成することができる。酵素は、酵素を自然に発現させる微生物から精製することができ実施例１を参照のこと、あるいは酵素を産出する形質転換宿主細胞から精製することができる。酵素をそのような方法に用いる場合、適当な補助因子も提供しなければならない実施例１を参照のこと。有効量は当業者に周知なように経験的に決定することができる実施例１を参照のこと。その代わりに、遺伝子導入原核微生物及び真核微生物を使用して、そのような物質中のジカンバを分解することもできる。遺伝子導入原核微生物及び真核微生物は以上で説明したように産出することができ、有効量は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００６７】
ジカンバは大量に、連続的に環境に導入される。ジカンバの除去は大部分が、地球の土壌及び水中に存在する微生物中で見出された酵素系の作用に依存している。ジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ及びその３つの成分を含むこれらの酵素系を理解することが、汚染された土壌、水及び他の物質の生物治療及び回復のために自然のまたは遺伝的に修飾した微生物を開発しようとする場合、重要である。このように、本発明のジカンバ−分解酵素、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ構成、などはジカンバ分解及び生物治療の研究のための調査ツールとして使用することができる。
【００６８】
最後に、この発明のジカンバ−分解酵素はジカンバの分析に使用することができる。ジカンバを含むと考えられるサンプルをジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ、またはジカンバ−分解オキシゲナーゼと、ジカンバ−分解フェレドキシンと、ジカンバ−分解レダクターゼとの組み合わせと共に混合する。適した分析が実施例１で説明されている。特に、３，６−ＤＣＳＡの生成による蛍光の検出または定量は好都合な分析に役立つ。
実施例
実施例１． シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼの成
分の精製とキャラクタリゼーション方法と材料細菌と成長条件
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株（クルーガーら、（１９８９）農芸食物化学ジャーナル３７：５３４−５３８）を、ジカンバに持続的に汚染された土壌から単離した。細菌はイリノイののテクノロジー会社（シカゴ、ＩＬ）のダクラス コーク（DouglasCork）博士により提供され、還元塩化物培地で維持しクルーガー、Ｊ．Ｐ、１９８９、Ｐｈ．Ｄ．論文、イリノイテクノロジ-研究所、シカゴ、ＩＬ、ジカンバ（２ｍｇ／ｍｌ）
またはグルコース（２ｍｇ／ｍｌ）とカザミノ酸（２ｍｇ／ｍｌ）の混合物のいずれかを追加した。炭素源を細菌濾過器で殺菌し、培地を加圧蒸気滅菌した後、その培地に添加した。固体培地は１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゲルライト（スコット研究所、ウエストウォリック、Ｒ．Ｉ）を添加することにより調製した。
薬品及び試薬
ジカンバ、３，６−ＤＣＳＡ、［１４Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−１４Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、放射化学的純度は９８％を超える）はサンドツ アグロ（Sandoz Agro）社（デスプレイネス、ＩＬ）から供給された。溶解性を増加させるため、ジカンバ及び３、６−ＤＣＳＡ保存液を、ＫＯＨを用い滴定してｐＨ７．０に調製した。特に記載が無ければ、薬品は全てシグマ ケミカル(Sigma Chemical)社（セントルイス、ＭＯ）から購
入した。ＦＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用のスーパーロース（Superose）１２、Ｍｏｎｏ Ｑ，Ｑ−セファロース（ファーストフロー）およびフェニル−セ七ファロー
ス（ＣＬ−４Ｂ）カラム充填物はファーマシア（Pharmacia）ミルウォーキー、ＷＩから
得た。両性電解質ｐＨ４−６と両性電解質ｐＨ４−９はセルバ（Serva）ハイデルベルグ
、ＦＲＧから購入した。アクリルアミド、β−メルカプトエタノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び過硫酸アンモニウムはバイオ−ラッド（Bio-Rad）研究所（ヘルクレス、ＣＡ）から購入した。薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）プレートはＵＶ２５４指示薬を含むシリカゲル（厚さ２５０μｍ）であり、Ｊ．Ｔ．ベイカーケミカル（Baker Chemical）社（フィリプスバーグ、ＮＪ）から購入した。
酵素分析 ジカンバＯ−デメチラーゼ活性は［14Ｃ］ジカンバからの［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡの形成を測定することにより分析した。簡単に説明すると、酵素成分の混合物中での活性は３０℃において、２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＨ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元
型）と、０．５ｍＭの硫酸鉄（ＩＩ）と、５０μＭの冷ジカンバと、２．５μＭの［14Ｃ］ジカンバ（放射性ジカンバの最終比活性は１．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌであった）と、異なる量の細胞溶解物または部分的に精製した酵素とを含む標準３００μｌ反応混合物中で測定した。最終精製工程中の全ての酵素分析はリン酸緩衝液中で行った。ジカンバＯ−デメチラーゼ活性に対する最適ｐＨはリン酸緩衝液の中央範囲であることが見出され、ｐＨ７．０のトリス−ＨＣｌ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド］に比ベリン酸緩衝液を用いるとより高い酵素活性が観察されたからである。反応は基質であるジカンバを添加することにより開始した。特定の時間で、５０μｌの５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＨ2ＳＯ4を添加して反応を止めた。その後、ジカンバ及びジカンバ代謝物を１体積のエーテルで２度抽出し、抽出物を蒸発させ乾燥させた。抽出手順の回収効率（平均±標準偏差）はジカンバで８７％±２％、３，６−ＤＣＳＡで８５％±３％であったヤングら、分析生物化学２１８：３７−４２１９９４))。
【００６９】
［14Ｃ］ジカンバ及び［14Ｃ］−標識代謝物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した。エーテル−抽出ジカンバ及びその代謝物を５０μｌのエーテルに再溶解させ、ＴＬＣプレート上にスポットとしてつけた。ＴＬＣで移動する溶剤系はクロロホルム−エタノール−一酢酸とした。分離した反応生成物は、ＴＬＣプレートを蛍光体スクリーンに２４時間曝し、その後そのスクリーンを蛍光体イメージ器（モレキュラーダイナミクス、サニーベール、ＣＡ）において走査することにより可視化し、定量した。ＴＬＣプレート上の特別のスポット中の放射能の量は、周知の量の［14Ｃ］ジカンバを含む同じプレート上の１つのスポットに対し、そのスポット内の総画素数を比較することにより決定した。活性の１つの単位は、３０℃で、１分につき、ジカンバから１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡの形成を触媒する酵素の量として規定した。比活性は分析混合物の総タンパク質濃度を基本とした。
【００７０】
ジカンバジメチラーゼのレダクターゼ成分の活性は、日立のＵ−２０００分光光度計を用いて２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＩＰ）の還元を測定することにより分析した。反応は、総体積１ｍｌ中に、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２ｍＭのＦＡＤフラビンアデニンジヌクレオチド、５０μＭのＤＣＩＰ、２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０、１０−１００μｌの酵素サンプルを含んだ。時間経過に伴う６００ｎｍでの吸光度の変化を室温で測定した。比活性は還元ＤＣＩＰに対し、２１．０ｍ・Ｍ-1・ｃｍ-1の６００ｎｍでの吸光率を用いて計算した。比活性は還元ＤＣＩＰｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇで表した。
【００７１】
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕＤＣＩＰ分析を使用して、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上で
分離したタンパク質試料中のレダクターゼ活性を検出し、位置を確認した。ＩＥＦゲル上でのタンパク質の電気泳動後、ゲルから切り取ったレーンを２０ｍｌの冷ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。低融点アガロースを１０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０中で加熱することにより溶解し、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）とした。アガロースを室温付近の温度まで冷却すると、０．２ｍＭのＦＡＤと、５０μＭのＤＣＩと、０．５ｍＭのＮＡＤＨとを追加した。分析混合物をガラスプレート上に注ぎ、固化させた。ゲル片を固化させた反応混合物上に置き、室温で１０分間静置した。ゲル薄片がレダクターゼ活性を有するタンパク質を含んでいると、還元ＤＣＩＰの無色バンドがＤＣＩＰの青色バックグラウンド中に生成した。
細胞溶解物
細胞は、回転振とう培養機（３０℃で２５０ｒｐｍ）で、グルコースとカザミノ酸の混
合物を含む液体還元塩化物培地中で、５５０ｎｍで１．３から１．５の光学密度が得られるまで増殖させた。細胞は遠心分離により採取し、冷１００ｍＭ ＭｇＣｌ2で２度洗浄し、再び遠心分離にかけた。細胞ペーストは液体窒素中で直ちに冷凍して使用するか、あるいは−８０℃で保存した。酵素精製時に、２５ｇの冷凍細胞を解凍して、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＥＤＴＡとを含む５
０ｍｌの単離緩衝液中に再懸濁させた。フェニルメチルスルホニルフルオリド及びジチオスレイトールを、それぞれ最終濃度が０．５ｍＭ及び１ｍＭとなるまで添加した。１０ｍｇのリソチームと１ｍｇのＤＮアーゼを添加した後、細胞を１０分間氷上で撹拌し、氷上で、２０秒の群発と４０秒の静止間隔を１２回行う中間セッティング（セッティング５）で、音波処理（モデルＸＬ２０２０音波計；ヒートシステムズ）することにより粉砕した。得られた細胞溶解物は単離緩衝液を用いて９０ｍｌとなるまで希釈し、４℃、７６，０００ｘｇで１時間、遠心分離にかけた。上清を用いて清んだ細胞溶解物源とした。
酵素の精製
特に記載がなければ、全ての手順は４℃で行った。常に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムを９０ｍｌ体積の清んだ細胞溶解物にゆっくりと添加し、４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）飽和とした。１５分の撹拌後、混合物を１５，４００ｘｇで１５分間遠心分離にかけ、沈澱を廃棄した。さらに、上清を常に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムを添加し７０％（ｗｔ／ｖｏｌ）飽和とした。１５分の撹拌の後、混合物を前記条件下で遠心分離にかけた。上清を廃棄し、沈澱を最小体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス[ｐＨ８．０]、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５）ｍＭのＥＤＴＡ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール、
１ｍＭのジチオスレイトール）中に再懸濁させた。
【００７２】
その後、４０−７０％の硫酸アンモニウム切片を、ＦＰＬＣ装置（ファーマシア）に接続されたフェニル−セファロースカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）上に負荷し、１０％（ｗ／ｖ）から０％（ｗ／ｖ）までの（ＮＨ4）2ＳＯ4の線形減少勾配を用いて溶離した。
カラムは１０％（ｗｔ／ｖoｌ）硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａを用いて予め平衡させ
た。流速は１ｍｌ／分とした。カラム溶離中にＡ280でタンパク質濃度を連続的にモニタ
した。基線Ａ280示数が得られるまで、カラムを１２０ｍｌの１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫
酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで洗浄した。結合タンパク質は緩衝液Ａ中の減少勾配の（ＮＨ4）2ＳＯ4［総体積２１０ｍｌ中１０から０％（ｗｔ／ｖｏｌ）までの（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4］を用いて溶離した。２ｍｌの画分を収集した。非放射性ジカンバを基質として使用
した場合を除き、１０μｌのアリコットを各画分から取りだし、標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析混合物（前述部を参照のこと）に添加した。ジカンバＯ−デメチラーゼ活性は、暗室で手持ちのＵＶランプ（３１２ｎｍ、フォトダイン）を用いてジカンバの高蛍光反応性生物３，６−ＤＣＳＡへの転化をモニタすることにより検出した。
【００７３】
この手順により、ジカンバＯ−デメチラーゼを別個の成分（成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩとする）を含む３つのプールに分離することができた。各成分はジカンバＯ−デメチラーゼ活性に対し本質的なものである以下を参照のこと。単一成分を分析する場合、他の２つの成分は過剰に供給した。単一型の活性を含む画分をプールした成分Ｉ、画分１２８−１４５；成分ＩＩ、非結合画分１２−３３；成分ＩＩＩ、画分６２−９２。
【００７４】
（ｉ）成分Ｉの精製 成分Ｉ活性を含む画分（０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4でフェニル−セファロースカラムから溶離、画分１２８−１４５）をプールし、総体積３４ｍｌとした。このプールサンプルをセントリプレプ（Centriprep）−１０装置（アミコン(Amicon)）により１０ｍｌまで濃縮し、その後、緩衝液Ａで平衡され８０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄されたＱ−セファロース（ファーストフロー）ＦＰＬＣカラム（ファーマシア）２．５ｃｍ×６ｃｍに適用した。カラムに結合したタンパク質を緩衝液Ａ中の０から０．６Ｍの線形勾配ＫＣｌ、１００ｍｌを用いて溶離した。画分を１．５分間隔で収集した。成分Ｉ活性を示すそれらの画分（画分２９−３７）をプールし、４℃で一晩中緩衝液に対し透析し、緩衝液
Ａ中のＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５ＦＰＬＣアニオン交換カラムに適用した。増加勾配濃度（０から０．５Ｍ）のＫＣｌ ５０ｍｌを用いて１ｍｌ／分でタンパク質を溶離した。成分
Ｉ活性を示す画分（画分１９から２５まで）をプールし、セントリコン−１０装置で遠心分離により０．４ｍｌまで濃縮した。濃縮サンプルはその後、スーパーロース１２ＦＰＬＣカラム（１．６×５．０ｃｍ）上で、流速０．２ｍｌ／分、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａを用い、クロマトグラフィーにより分離した。成分Ｉ活性を示す画分７−１０をプールし、セントリコン−１０装置における遠心分離により濃縮した。
【００７５】
部分的に精製した成分Ｉを冷１％（ｗ／ｖ）グリシンで希釈し、セントリコン−１０装置における遠心分離により３倍に濃縮し、脱塩しＩＥＦ電気泳動の準備をした。脱塩、濃縮サンプルをその後、６％（ｗ／ｖ）ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲルに適用し、４℃で１時間電気泳動を行った下記参照。電気泳動の後、ゲルを２５ｍＭの冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間洗浄し、ゲルレーンの各薄片を小片（６ｍｍ×４ｍｍ）に切断した。タンパク質を切断ゲル画分から、その切断ゲル核分を１０μｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の存在下ピペット先端を用いてすりつぶすことにより、溶離した。各セグメントからのタンパク質を過剰の成分ＩＩと成分ＩＩＩと混合し、ジカンバＯ−ジメチラーゼ活性の分析を行った。成分Ｉ活性を示したゲルセグメント（これもまた赤茶色であった）を１２・５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上に負荷し、サンプル純度を確認した。
【００７６】
（ｉｉ）成分ＩＩの精製
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩは４℃で一晩中緩衝液Ａに対し透析し、ＦＰＬＣ Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に適
用した。サンプル溶離条件は、溶離勾配を緩衝液Ａ中０から１ＭＫＣｌとしたことを除き、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩ活性を示す画分（画分３０−３７）をプールし、緩衝液Ａに対し透析し、０．４ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣスーパーロース１２カラム（１．６×５０ｃｍ）に適用した。サンプル適用及び溶離手順は成分Ｉについて以上で説明したものと同一であった。成分ＩＩ活性を示す画分（画分３−６）をプールし、同量の緩衝液Ａで希釈し、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ カラムに適用した。成分Ｉの
場合と同じＫＣｌ勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離した。画分２０−２５は成分ＩＩ活性を示した。部分的に精製した成分ＩＩをさらに、成分Ｉについて説明したのと同じ条件を用いてＩＥＦ（ｐＨ４−６）電気泳動により精製した。成分ＩＩ活性を示すゲルセグメントを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷し、さらに分析した。
（ｉｉｉ）成分ＩＩＩの精製
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩＩは４℃で一晩中緩衝液Ａに対し透析し、ＦＰＬＣ Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に
適用した。条件は、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩＩ活性を示す画分（画分２６−３８）を緩衝液Ｂ［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール］に対
し透析し、５ｍｌに濃縮した。青色染料親和性マトリクス［シバルコンブルー（Cibarcon
Blue）３ＧＡ型３０００シグマ］をＦＰＬＣカラム（１×５ｃｍ）に充填し、２０ｍｌ
の緩衝液Ｂを用いて平衡させた。濃縮成分ＩＩＩを青色染料カラム上に負荷し、カラム廃液のＡ280が基線レベルに到達するまで、流速０．２ｍｌ／分で２０ｍｌの緩衝液Ｂで洗
浄した。その後、結合タンパク質を緩衝液Ｂ中の５ｍＭのＮＡＤＨを用いて溶離した。レダクターゼ活性を含む画分を、過剰の成分Ｉ及び成分ＩＩの存在下でのジカンバＯ−デメチラーゼ活性分析により、ＮＡＤＨの存在下での各画分のＤＣＩＰ還元能力により検出した。両方の分析において強いレダクターゼ活性を有する画分をプールし、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａに対し透析し、０．２ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣスーパーロース１２カラムに適用した。スーパーロースカラムの移動には、成分Ｉについて説明したのを同一の条件を使用した。ＤＣＩＰ還元を触媒したタンパク質を含む画分をプールし、緩衝液Ａに
対し透析し、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ カラムに適用した。成分Ｉに対するのと同じ条件を
用いてタンパク質を溶離した。部分的に精製した成分ＩＩＩをさらに、ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲル電気泳動により精製した。ＩＥＦゲル内のタンパク質のレダクターゼ活性を、以上で説明したように、アガロースゲル被膜内のＤＣＩＰ還元分析により検出した。成分ＩＩ活性を示したゲルセグメントを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷しさらに分析した。
ＮＨ2−末端アミノ酸配列の決定
成分Ｉ、成分ＩＩ、または成分ＩＩＩを有するとＩＥＦゲル上で同定されたタンパク質バンドを摘出し、１２．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲルのへこみに載せた。電気泳動後、精製したタンパク質を含むゲル薄片をトランス−ブロッドセル（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）中のＰＶＤＦ（ポリビニリデンジスルフィド）膜（ミリポア）上に、２５Ｖで１６時間、密着印画した。ブロッティング緩衝液は１０ｍＭのＣＡＰＳ［３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸を含む、ｐＨ１０．０の２０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液とした。配列決定は、応用バイオシステム社の４２０ＩＩ機器を用いて、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解（エドマン及びヘンシェン（Henschen）１９７５２３２−２７９ページ、Ｓ．Ｂ．ニードルマン（Needleman）編集、タンパク質
配列決定、第２版、スプリンガー−ベルラージ(Springer-Verlarge)、ニューヨーク）に
より実行した。
タンパク質濃度の定量
タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準に用い、ブラッドフォード（Bradford）の方法１９７６、分析生物化学７２：２４８−２５４、により決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
レムリ（Laemmli）の改良方法（レムリ（１９７０）ネイチャー２２７：６８０−６８
５）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。８５×６５×０．７５ｎｍの１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳゲルを以下の様に作製した。泳動ゲルは２．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス溶液３７：５：１、１ｍｌの泳動緩衝溶液[３Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ８．８、０．８％（ｗ／ｖ
）ＳＤＳ]、４．５ｍｌのＨ2Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、４０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。スタッキングゲルは、０．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス、０．５ｍｌのスタッキング緩衝溶液[１Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ６．８、０．８％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ]、３ｍｌのＨ2Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、１２．５μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。泳動緩衝液の組成は２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、０．２Ｍのグリシン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳとした。サンプル緩衝液は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に、０．２５ｍｌのスタッキング緩衝液、０．６ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２ｍｌのβ−メルカプトエタノール、及び０．９５ｍｌの０．１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）を含んだ。電気泳動は、バイオ−ラッド ミニゲル（Bio-Rad Mini Gel）装置で８０Ｖで、先導色素がゲルの陽極端から０．５ｃｍの所に移動するまで、実
行した。タンパク質は、３：６：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のイソプロパノールと水と酢酸との混合物中の０．１％（ｗ／ｖ）のクーマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）Ｒ−２５０により染色した。脱色は７：８３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のメタノールと水と酢酸との混合物中で行った。標準タンパク質（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ）はミオ
シン２１４．２ｋＤａ、ホスホリラーゼＢ１１１．４ｋＤａ、ウシ血清アルブミン７４．２５ｋＤａ、卵白アルブミン４５．５ｋＤａ、炭酸脱水素酵素２９．
５ｋＤａ、β−ラクトグロブリン１８．３ｋＤａ、及びリソチーム（１５．４ｋＤａ
）を含んだ。
分子量の決定
変性条件下でのペプチドの分子量（Ｍr）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて評価した。
本来の成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分子量を、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａ中、０．２ｍｌ／分の流速で、スーパーロース１２ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（ファーマシア）を介したゲル濾過により評価した。基準タンパク質はバイオ−ラッドからのゲル濾過標準とした。基準タンパク質は、ウシチログロビン６７０ｋＤａ、ウシガンマグロビン１５８
ｋＤａ、ニワトリ卵白アルブミン４４ｋＤａ、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ−１２（１３５ｋＤａ）とした。スーパーロース１２カラムの空隙容量はブルーデキストラン（Blue Dextran、Ｍrは２，０００，０００、シグマ）を用いて計算した。
ＩＥＦ
Ｃ．Ｂ．Ｓサイエンティフィック社（デル マー、ＣＡ）からの垂直ミニ−ゲル装置（
モデルＨＭＧＶ−１００）等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動を行った。６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドを含むＩＥＦゲル（７０×９０×１ｍｍ）は、以下のものを混合することにより作製した：１．６ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス（３７：５：１）と、０．８ｇのグリセロールと、０．３２ｍｌの両性電解質ｐＨ４−６（サーバ：Serva
）と、０．０８ｍｌの両性電解質ｐＨ４−９（サーバ）と、５．２ｍｌのＨ2Ｏ、１０μ
ｌのＴＥＭＥＤと、８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ。陰極緩衝液は１００ｍＭのβ−アラニン、陽極緩衝液は１００ｍＭの酢酸とした。約１から１０μｌの１％（ｗ／ｖ）グリシン中のタンパク質サンプルは等量のサンプル緩衝液［５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１．６％（ｖ／ｖ）の両性電解質ｐＨ４−９、２．４％（ｖ／ｖ）の両性電解質４−６］と混合した。サンプルはゲルの陰極端に負荷し、２００Ｖで１．５時間、４００Ｖで更に１．５時間、移動させた。タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに対し以上で説明した手順を用い、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。ＩＥＦ標識（シグマ）は、アミログルコソダーゼ、ｐＩ３．６；グルコースオキシダーゼ、ｐＩ４．２；トリプシン阻害因子、ｐＩ４．６；β−ラクトグロブリンＡ、ｐＩ５．１；炭酸脱水素酵素ＩＩ、ｐＩ５．４；炭酸脱水素酵素ＩＩ，ｐＩ５．９および炭酸脱水素酵素Ｉ、ｐＩ６．６とした。
速度論的分析
ジカンバＯ−デメチラーゼにより触媒される脱メチル反応の速度論について、一定濃度の酵素の存在下、基質であるジカンバの濃度を増加させ、反応の初期速度を分析することにより研究した。反応混合物は２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ4と、２５μｇの部分的に精製したＯ−デメチラーゼ酵素［清んだ細胞溶解物からの４０％−７０％（ｗ／ｖ）ＮＨ42ＳＯ4画分］と、様々な濃度（０．５から５０μＭ）のジカンバと、様々な濃度
（０．０２５から２．５μＭ）の［14Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−14Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏ１）とを、総体積３００μｌ中に含んだ。０．５μＭと１μＭのジカンバ濃度を用いて分析するために、反応体積を９００μｌまで増加させ、十分な放射性ジカンバとその代謝物を存在させ検出可能なようにした。これらの反応では、反応内の他の全ての成分量は３倍にした。各ジカンバ濃度において異なる時間の時点で、ホスファーイメージャーＳＦを用いてＴＬＣプレートに２４時間曝された蛍光体スクリーン上の放射能を走査することにより、［14Ｃ］ジカンバの[14Ｃ]３，６−ＤＣＳＡへの転化の定量を行った。活性の１単位は、３０℃における１分あたり１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡを形成する酵素量と規定した。各反応の初速度は、各基質濃度において反応速度対時間をプロットすることにより決定した。データはミカエリス−メンテン速度論をモデルとし、Ｋm及びＶmaxの値は、シグマプロット（登録商標、SigmaPlot）ジャンデルサイエンティフィック(Jandel
Scientific)、コルトマデラ、ＣＡを用いて、ラインウィーバー−バークプロットにフィッティングさせることにより決定した。
酸素の必要性
クラーク酸素電極を用いた予備実験により、基質にジカンバを用いた標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析中に酸素が消費されることが示唆された。ジカンバＯ−デメチラーゼによるジカンバのＯ−脱メチルにおける酸素の必要性を証明するために、反応は１ｐｐｍ未満の酸素を含む嫌気性チャンバ内で行った。反応混合物から酸素を排除する手順は４℃で行った。酵素を含まない反応混合物をバイアル中に入れ、ゴム栓で密閉した。酸素を排除するために、バイアルは２度真空により排気し、その都度窒素でフラッシングした。３度目の排気後、バイアルを９０％の窒素と１０％の水素を用いてフラッシングした。同様に、酵素溶液から酸素を除去した酵素溶液に気泡が入らないように注意して。反応混合物及
び酵素溶液の両方を嫌気性チャンバ内（９５％のＮ2−５％のＨ2雰囲気）に移した。２４０ｍｌの清んだ細胞溶解物を微量注射器を用いてゴム栓を介して注入し、９６０μｌの酸素を含まない反応混合物と静かに混合した。反応は３０℃で行った。
【００７７】
ＴＬＣプレート上の反応生成物を調べると、嫌気性［14Ｃ］ジカンバからの［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡ生成速度は、同量の酵素を用いて好気性条件下で得られた反応速度を大きく下回った。嫌気性条件下では、１時間以内では、ジカンバから３，６−ＤＣＳＡへの転化は実質的には起こらなかった。しかしながら、平行反応混合物を３０分後に嫌気性チャンバから取りだし空気で培養すると、かなりの量のＯ−デメチラーゼ酵素錯体の成分の１つはオキシゲナーゼであった。
【００７８】
［14Ｃ］ジカンバから［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡへの生体外転化は以前に証明された生体内転化経路（コーク及びクルーガー、先進応用微生物学３６：１−６６１９９１；ヤングら、分析生物化学２１９：３７−４２１９９４）によく似ていることに注意すべきである。これらの研究では、ＴＬＣ及びキャピラリー電気泳動の両方によりＤＣＳＡが反応生成物であると同定された。生体内及び生体外の両方でジカンバ分解の第１主生成物がＤＣＳＡであるという厳格な同定は、ガスクロマトグラフィー−質量分析により得られている。
成分と補助因子の必要性
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーによるジカンバＯ−デメチラーゼの３成分の初期分離後、部分的に精製した試料を個々に、Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）上での１回の追加精製により取り出した。サンプルを緩衝液Ａ中、Ｑ−セファロース（ファーストフロー）高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム（ファーマシア）に適用し、１００ｍｌの０から０．６ＭまでのＫＣｌ線形勾配（オキシゲナーゼ成分に対し）を用い、あるいは０から１．０ＭまでのＫＣｌ（フェレドキシン及びレダクターゼ成分に対し）を用いて、１．５ｍｌの画分中で溶離した。オキシゲナーゼ精製に対する分離カラムから適当にプールした画分画分２９から３７まで、フェレドキシン精製に対する画分画分３０から３７まで、あるいはレダクターゼ精製に対する画分（画分２６から３８まで）を使用して、成分及び補助因子の必要性の決定を行った。
【００７９】
３成分は様々な組み合わせでＯ−デメチラーゼ活性の分析を行い、成分の必要性を決定した。
補助因子の必要性を決定するために、３成分と［14Ｃ］ジカンバとの混合物を用いて、３０℃で３０分間、Ｏ−デメチラーゼ活性の分析を行った。反応混合物中の、（最適比率の）部分的に精製されたタンパク質の量は、８５μｇのオキシゲナーゼと、５５μｇのフェレドキシンと、５０μｇのレダクターゼであった。反応混合物中で使用した補助因子の濃度は０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．２ｍＭのＦＡＤと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ3と、１
０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨと、０．２ｍＭのＦＭＮであった。
結果
成分Ｉ
フェニル−セファロースカラムに最も強く結合したジカンバＯ−デメチラーゼの成分（最初成分Ｉと称し、後にオキシゲナーゼであることが同定された）は明確な赤茶色を示した。これにより、鉄−硫黄クラスターまたはヘム基を含むタンパク質の存在の可能性が示唆された。フェニル−セファロースカラムからの成分Ｉ活性を有する画分について、Ｑ−セファロース（ファーストフロー）及びＭｏｎｏ Ｑクロマトグラフィーにより更に精製
し、スーパーロース１２サイズ排除カラム上で分離した。その後更にＩＥＦゲル上で成分Ｉタンパク質を精製した。
【００８０】
ＩＥＦゲル上の主要バンド（見かけのｐＩが約４．６である）からタンパク質を摘出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより残りの微量不純物から単離した。ＩＥＦにより精製した後に得
られた主成分Ｉタンパク質の純度は、クーマシーブルーで染色したこのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃度分析から判断すると、９０％を超えた。
【００８１】
見かけの分子量が約４０，０００ダルトンの優性タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の結果から、Ｎ−末端領域の最初の２９のアミノ酸が以下の配列で存在していることが示唆された括弧内の残基が最も良い推測である：
Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp またはThr) (Pro) ［配列番号１］
様々なデータベース中のアミノ酸配列と比較すると、他のモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼについて報告されているＮＨ2−末端配列とほとんどあるいは全く相同性
が見られないことが示唆された。
成分ＩＩ
フェニル−セファロースカラムに結合しなかったタンパク質核分は成分ＩＩと称した。この黄色がかった画分は、分析を成分Ｉと成分ＩＩＩと組み合わせて実行すると、クロストリジウム・パストリアヌムからのフェレドキシンと置換することができた（しかし、反応速度は遅くなる）ので、仮にフェレドキシン−含有画分と称した。クロストリジウムフェレドキシンは明らかに成分ＩＩの代わりに機能したが、これらの実験で使用した成分ＩＩの不純性が高いとすると、クロストリジウム酵素の効率は、ＤＩ−６株からの推定フェレドキシンの効率よりもかなり低い。特に、５５μｇの部分的に精製した成分ＩＩを過剰の成分Ｉ及び成分ＩＩＩと共に混合したものでは、ジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの転化が触媒され、約５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の速度が得られたが、１００μｇのクロストリジウムからの高精製フェレドキシンではその活性は０．６ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1にすぎなかった。
【００８２】
Ｑ−セファロース（ファーストフロー）クロマトグラフィー、スーパーロース１２ゲル濾過及びＭｏｎｏ Ｑ クロマトグラフィーを含む精製工程により、最初の２５ｇの細胞ペーストから約１ｍｇの精製タンパク質が得られた。この画分をオキシゲナーゼ成分と同様に、ＩＥＦゲル上で電気泳動を行い、その後活性ＩＥＦ画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより精製した。
【００８３】
ＩＥＦゲルのセグメントから溶離したタンパク質における成分ＩＩ活性の分析により、約３．０のｐＩを有する画分は成分ＩＩ中に活性タンパク質を含んでいることが示唆された。このゲル薄片からのタンパク質を溶離しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをクーマシブルーで染色すると、分子量のより低いタンパク質のしみに加えてタンパク質の１つの顕著なバンドが現れた。見かけの分子量が約２８，０００ダルトンの顕著なタンパク質をＰＶＤＦ膜上に密着印画した。
【００８４】
アミノ酸配列決定から以下の２０のアミノ酸のＮ−末端配列が明らかになった。
Thr Tyr Val Val Thr Asp Ala Xaa Ile Lys Xaa Lys Tyr Met Asp Xaa Val Glu Val Xaa ［配列番号２］
成分ＩＩＩ
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩは高濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4中のフェニル−セ
ファロースカラム上に保持され、約４％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離された。こ
の明るい黄色の画分は、酸化チトクロームｃ及びＤＣＩＰをＮＡＤＨの存在下で還元する能力から、及び成分Ｉと成分ＩＩを用いた分析でブタの心臓からのチトクロームｃレダクターゼ（タイプＩ、シグマ）により置換することができるため、レダクターゼ含有画分であると仮に同定された。この組の反応では、５０μｇの部分的に精製した成分ＩＩＩを使用し、過剰の成分Ｉ及びＩＩと混合すると、約５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の反応速度が得られた。高精製チトクロームｃレダクターゼは反応において約２．５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の比活性を示した。この活性は、これらの分析で使用した粗成分ＩＩＩの不純性を考
えると、成分ＩＩＩにより得られる活性よりもかなり低い。さらに、成分ＩＩＩは、ＮＡＤＨの存在下、チトクロームｃまたは２，６−ジクロロフェニル−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）と共に培養するとレダクターゼ活性を示した。成分Ｉ及び成分ＩＩのどちらも、これら２つのレダクターゼ分析のいずれにおいても、活性を示さなかった。
【００８５】
Ｑ−セファロースファーストフロー、青色染料親和性マトリクス、スーパーロース１２、及びＭｏｎｏ Ｑ充填材を含むカラム上でのクロマトグラフィーにより、この画分をさ
らに精製すると、レダクターゼ活性を有する画分中の少量のタンパク質が得られた。成分ＩＩＩタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離及びクーマシーブルーによる染色後の活性タンパク質画分の濃度分析により判断すると、約７０％であった。
【００８６】
さらに成分ＩＩＩの精製を激化するために、Ｍｏｎｏ Ｑカラム段階からの２つの異な
るタンパク質画分は、フェレドキシン成分とオキシゲナーゼ成分とを用いて分析すると、レダクターゼ活性を含むことを見出した。ＩＥＦゲル上での電気泳動によりこれらの２つの画分をさらに精製すると、２つの画分のレダクターゼ活性は明確に異なる等電点を有することが明らかになった。これは、２つのレダクターゼ画分のそれぞれを含むレーンをＩＥＦゲルから摘出し、この薄片をＤＣＩＰ反応混合物を含む低融点アガロースのパッド上に置くことにより証明した。どちらのゲル薄片におけるレダクターゼ活性も、ＤＣＩＰのその無色の還元型へのＮＡＤＨ−依存還元により同定した。画分３５中のレダクターゼの見かけのｐＩは約５．６であったが、画分２７のレダクターゼの見かけのｐＩは約４．８であった。
【００８７】
ＩＥＦゲル薄片から単離したレダクターゼ活性はどちらも不安定で、その量は少なかった。実際、Ｍｏｎｏ Ｑカラム分別による画分３５からのレダクターゼのみが十分なタン
パク質濃度と活性を有し、更に精製及びキャラクタリゼーションが可能であった。このレダクターゼ活性を含むＩＥＦゲルからの薄片を溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより不純タンパク質から分離した。このゲル中の優先タンパク質は分子量が約４５，０００のタンパク質であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、成分ＩＩＩの分子量は、自然状態で約５０，０００ダルトンであることが示唆された。
【００８８】
ジカンバＯ−デメチラーゼの生物化学特性
ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を、温度が２０℃から５０℃、ｐＨ値が約６から９の生体外培養中に、測定した。活性のピークは３０℃で鋭く、６．５から７．５のｐＨでブロードに現れた。酵素活性は用いたｐＨ緩衝液の型に依存した。ｐＨ７では、例えば、活性はリン酸含有緩衝液の場合に比べトリス含有緩衝液の場合の方が約４０％低かった。
【００８９】
ジカンバＯ−デメチラーゼに対するＫm及びＶmaxの値は、２度の実験からのデータのミカエリス−メンテン及びラインウィーバー−バークプロットから最もフィッティングの良い曲線を生成するシグマプロット（登録商標）を用いて評価した。ジカンバのＫmは約９
．９±３．９μＭであり、反応のＶmaxは約１０８±１２ｎｍｏｌ／分／ｍｇであると判
断した。
【００９０】
３成分について、様々な組み合わせで、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性の分析を行った。どの成分も単一で分析すると酵素活性を示さなかった。実際、３成分全てを組み合わせた場合にのみ、有意の量のＯ−デメチラーゼ活性を検出することができた。成分Ｉと成分ＩＩの混合物は少量の触媒活性を示した。おそらく、微量の成分ＩＩＩが成分Ｉ画分に混入していたためであろう。
【００９１】
ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨは酵素活性を補助した。ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨよりも著しく効果的であった。酵素活性にはＭｇ2+が必要であった。Ｆｅ2+、フラビンアデニンジヌクレオ
チドＦＡＤ、及びフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの実験における部分的に精製したタンパク質試料を用いた酵素活性をほとんどあるいは全く刺激しない。最も高い活性はＮＡＤＨ、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+及びＦＡＤの組み合わせを用いた場合に得られた。考察 シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株からのジカンバＯ−デメチラーゼは、除草剤であるジカンバ（２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）を３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ：２−ヒドロキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）へ転化する能力を持つ、３成分オキシゲナーゼ（ワング(Wang)、Ｘ−Ｚ１９９６、Ｐｈ．Ｄ．論文、ネブラスカ−リンカン大学、リンカン、ＮＥ）である。３成分のそれぞれを均一状態または均一に近い状態で単離することができる精製スキームを発明した。
【００９２】
３成分の最初の分離はフェニル−セファロースカラム上でのクロマトグラフィーにより達成した。部分的に精製した成分の酵素活性及び他の特性により、その成分がレダクターゼ、フェレドキシン及びオキシゲナーゼー多くの他の以前に研究したヘム含有及びノンヘム含有多成分オキシゲナーゼと同様の組成（バチー（Ba tie）ら（１９９２）５４３−５６５ページ、Ｆ．ミラー編集、フラボ酵素、ｖｏｌ．ＩＩＩ、ＣＲＣプレス、ボカ ラト
ン；ハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１；メイソンとカマック（Mason,Cammack）１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：２７７−３
０５；ロシュ（Rosche）ら１９９５、生物化学、生物物理学、アクタ１２５２：１７７−１７９）−であることが仮に同定できた。フェニル−セファロースカラムから単離した成分ＩＩＩはチトクロームｃと染料ＤＣＩＰの両方のＮＡＤＨ−依存還元を触媒した。さらに、成分Ｉ及び成分ＩＩと組み合わせるとジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの転化を助けることができる能力は、チトクロームｃレダクターゼと部分的に置きかえることができた。成分ＩＩは、成分Ｉと成分ＩＩＩを含む反応に対し、クロストリジウム・パストリアヌムからのフェレドキシンを添加することにより置きかえることができた。Ｏ−脱メチル反応を補助するには分子状酸素が絶対に必要であることから、残りの成分はオキシゲナーゼであることが示唆された。
オキシゲナーゼDIC
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分Ｉ（オキシゲナーゼDICと称す）を精製して均一とし
、Ｎ−末端アミノ酸配列決定を行った。得られた２９のアミノ酸残基の配列では、様々なデータバンク中の他のタンパク質配列との有意の相同性は見られなかった。しかしながら、このアミノ酸配列のから得られた情報により、縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となり、このプローブは成分Ｉ遺伝子を検出しクローン化するのに使用することができた実施例２参照。さらに、このクローンのヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列を、データベース中のタンパク質配列のアミノ酸配列と比較すると、他のオキシゲナーゼに対する強い相同性が見られた実施例２参照。
【００９３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の移動から評価したオキシゲナーゼDICの見かけの
分子量は約４０，０００ダルトンである。オキシゲナーゼの精製試料はクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で唯一の主バンドを示し、そのバンドに含まれていたタンパク質のエドマン分解により唯一のＮ−末端種の存在が示唆された。サイズ排除カラム上での天然オキシゲナーゼDICの挙動から導かれる評価により、分子サイズ
は約９０，０００ダルトンであることが示唆される。これらの結果から、天然オキシゲナーゼはホモダイマーとして存在することが示唆される。
【００９４】
多くの多成分系のオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼ成分は（αβ）n−型サブユニッ
ト配列から成り、このサブユニット配列では、より大きなαサブユニットのサイズは約５０，０００ダルトン、より小さなβサブユニットの分子量は約２０、０００ダルトンであったハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１。これとは対照的に、ジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼ成分は分子量が約４０ｋＤａの単一サブユニットを有し、これらが自然状態でダイマーとして存在すると考えられる。この
（α）n−型サブユニット配列は、他の良くキャラクタリゼーションの行われているオキ
シゲナーゼ、例えばシュードモナス・ＳＰ．ＣＢＣ株からの４−クロロフェニルアセテート３，４−ジオキシゲナーゼマーカス（Markus）ら１９８６、ジャーナル生物化学２６１：１２８８３−１２８８８、シュードモナス・セパシアからのフタレートジオキシゲナーゼバチー（Batie）ら１９９１、生物化学ジャーナル２７４：８３３−８４２、シュード
モナス・プチダ８６からの２−オキソ−１、２−ジヒドロキノリン ８−モノオキシゲナ
ーゼロシェ（Roche）ら（１９９５）生物化学・生物物理学・アクタ１２５２：１７７−
１７９、シュードモナス・シュードアルカリゲンスからの４−カルボキシジフェニルエーテルジオキシゲナーゼデーメル（Dehmel）ら（１９９５）構築微生物学１６３：３５−４１、及びシュードモナス・プチダからの３−クロロ安息香酸３，４−ジオキシゲナーゼナカツら１９９５、微生物学（読物）１４１：４８５−４９５、において見出されたものと同様である。フェレドキシンDIC ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩ（フェレドキシンDICと称す）を、カラムクロマトグラフィーとＩＥＦの複数の工程により、均一に近い
状態まで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる最終精製により１つのタンパク質（Ｍr＝２
８，０００）の主バンドとわずかに小さなタンパク質のしみが生成した。これらは精製フェレドキシンの部分分解生成物を示しているかもしれない。
【００９５】
主タンパク質バンドから得られた２０のアミノ酸残基のＮ−末端配列を、遺伝学コンピューティンググループ（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ＷＩ）を用いて、様々なタンパク質データバンクの他のアミノ酸配列と比較すると、多くのジクラスター細菌フェレドキシンに対する強い相同性が明らかになった。例えば、シュードモナス・スツツェリ、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・キャプシュラス及びアゾトバクター・ビネランジルからのフェレドキシンの最初の２０のアミノ酸の整合及び比較により、これらのフェレドキシンのシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株からのタンパク質のＮ−末端配列との同一性はそれぞれ、６５％、６５％、６５％、６０％であることが示された。推定フェレドキシン配列中のＸａａと指定された４つの残基の同一性は不確定であった。エドマン分解生成物のクロマトグラフ上の余分のピークの位置から、これらのＸａａ残基は実際には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のシステイン残基のアクリルアミドによるアルキル化により形成したプロピオニル−システイン残基であると考えられるブルネ（Brune）１９９２分析生物化学２０７：２８５−１９０。４つのＸａａ残基
が全てシステイン残基であるとすると、細菌フェレドキシン配列の、シュードモナス・マルトフィリアからのフェレドキシンとの同一性はそれぞれ、８５％、８５％、８５％及び０％となる。
【００９６】
フェレドキシンDICに対し強い相同性を示す４つのジクラスターフェレドキシンは、タ
ンパク質のＮ−末端で、［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスター及びこれに続く［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを有していた。これにより、フェレドキシンDICは、通常ノン−ヘム多成分オキ
シゲナーゼと関連する［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するフェレドキシン成分とは明確に異なることが示唆されるハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１；メイソンとカマック１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：２７７−３０５；ロシェら（１９９５）生物化学、生物物理学、アクタ１２５２：１７７−１７９。実際、ＥＰＲ（電子常磁性共鳴）スペクトル［他の場所で詳細に報告されている、キアノ(Qiano)、Ｆ、Ｘ−Ｚ．ワング、Ｐ．Ｌ、Ｄ．Ｐ．ウィークス(Weeks)、及びＪ．Ｈ．ゴルベック出版するために提出されている］の分析を行うと、フェレドキシンDICのＮ−末
端の［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスターは電子伝達において活性な酸化還元中心であることが示唆される。
【００９７】
フェレドキシンDICは、等電点が低いという点で、他の細菌フェレドキシンの典型であ
るすなわち、ｐＩは３またはわずかに３以上である。ｐＩが低いと、しばしば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で及びサイズ排除クロマトグラフィー中に、これらのタンパク
質の異常な移動をもたらすオキーフェ（O'Keefe）ら（１９９１）生物化学３０：４４７
−４５５。フェレドキシンDICの場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質の移動から、そ
の分子量は約２８，０００であると評価された。同様に、サイズ排除クロマトグラフィーにより、天然フェレドキシンDICのみかけの分子量は約２８，０００であることが示唆さ
れた。この分子量は細菌からの多成分オキシゲナーゼ中で見出される他のフェレドキシンの分子量［すなわち、８−１３ｋＤａ］バチーら（１９９２）５４３−５６５ページ、Ｆ．ミュラーにおいて編集、フラボ酵素の化学及び生物化学、ｖｏｌ．ＩＩＩ、ＣＲＣプレス、ボカ ラトン；ハラヤマら（１９９２）アニュアルレヴュー微生物学４６：５６５−
６０１よりかなり高い。
レダクターゼDIC
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩ（レダクターゼDICと称す）は、３成分中最も
精製が困難な成分であった。これは一部には、この成分の見かけの不安定さ及びＤＩ−６株の溶解物中における量が少ないことによる。にもかかわらず、十分なタンパク質が単離され、その分子量は４５，０００と仮定された。これはサイズ排除クロマトグラフィーから得られた、約５０，０００ダルトンの分子量と同様であり、レダクターゼDICは自然状
態ではモノマーとして存在することが示唆される。レダクターゼ成分の精製は、ＭｏｎｏＱカラム上でのクロマトグラフィー及びＩＥＦにより精製レダクターゼ試料が明らかに異なるｐＩ値を有する２つの活性に分割されるという事実により、さらに複雑となる。Ｍｏｎｏ Ｑカラムからの両方の画分は、精製フェレドキシンDIC及びオキシゲナーゼDICとの
組み合わせにおいて機能し、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を生成する。スフィンゴモナスｓｐ．ＲＷ１株において、３成分ジベンゾフラン４，４ａ−ジオキシゲナーゼ中でレダクターゼ成分として同様によく機能する２つの同様のフラボタンパク質の存在が、最近、ビンツ及びクック（Bu ntz、Cook）により報告されているビンツ及びクック１９９３、細菌ジャーナル１７５：６４６７−６４７５。興味深いことに、どちらのレダクターゼもその分子量は４４，０００ダルトンであり、４５，０００ダルトンレダクターゼＤＩＣの分子量と非常に良く類似している。レグヘモグロビンレダクターゼの複数の成分もまた、等電点電気泳動技術を用いると、ルピナスの根の小結節において観察されているトプノブ（Topunov）ら（１９８２）バイオキミヤ（Biokymiya）英語版１６２：３７８−３７９。この場合、ＩＥＦにより、ＮＡＤＨ−依存レダクターゼ活性を有する４つの別個の成分が明らかになった。ＤＩ−６株においては、唯一のレダクターゼDICが２つの形態で存在する
のか、それとも２つの別個のレダクターゼが存在するのかについての質問への回答は、より大量のタンパク質を単離するための改良方法の開発、及び／または、関係する遺伝子のクローン化と配列決定にかかっている。
ジカンバＯ−デメチラーゼ特性
以上で述べた個々の成分の物理的及び生物化学的特性の他に、酵素活性の分析により、Ｏ−デメチラーゼ系はその基質に対し強い親和性を有しＫm＝−１０μＭ、Ｖmaxは約１００−１１０ｎｍｏｌ／分／ｍｇであることが示された。
【００９８】
温帯気候帯で収集した上壌細菌で予測したように、最大酵素活性は３０℃付近の温度で観察された。酵素系の最適ｐＨはｐＨ６．５からｐＨ７．５までであったが、酵素の一定の試料を用いた活性は使用したｐＨ緩衝系の型に強く依存した。トリス緩衝液の存在下での活性は、同じｐＨでは、リン酸緩衝液を用いた場合に比べ少なくとも４０％低かった。ジカンバＯ−デメチラーゼの３成分により触媒される反応に対する反応スキームを図１に示す。ＮＡＤＨからの電子は、レダクターゼとフェレドキシンからなる短い電子連鎖を介して、末端のジカンバの酸化を触媒するオキシゲナーゼのところまで往復する。ジカンバＯ−デメチラーゼと幾つかの多成分ジオキシゲナーゼ間の類似性から、ジカンバＯ−デメチラーゼが、隠れたジオキシゲナーゼ活性を有する可能性が示唆される。しかしながら、この酵素は、Ｏ2を分割し、酸素の１つの原子を主要基質内に組込み、他の１つをα−ケ
トグルタル酸塩などの小さな有機基質に組み込むジオキシゲナーゼのクラスのものではないことは、明らかであるフクモリ及びハウシンガー（Hukumori、Hausinger）１９９３、
生物・化学ジャーナル２６８：２４３１１−２４３１７。実際、高精製レダクターゼDIC
、フェレドキシンDIC及びオキシゲナーゼDICが活性を示すのに必要とするのはＯ2、ＮＡ
ＤＨ、Ｍｇ2+及びジカンバのみである。
実施例２
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するクローンの同定と配列決定 実施例１で述べたように、オキシゲ
ナーゼDICのＮ−末端アミノ酸配列の最初の２９のアミノ酸は以下のように決定されてい
る括弧内の残基は最も良い推測である：Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp またはThr) (Pro) ［配列番号１］
この配列により、オペロン、アラミダ、ＣＡにより合成された縮重オリゴヌ クレオチ
ドプローブの設計が可能となった。特に、それぞれが１７ヌクレオチ ドの長さを持ち、
以上でとりわけ強調したアミノ酸配列の遺伝暗号を指定する ことができる可能なヌクレ
オチド配列の全てを含む３２プローブの混合物を使 用した。オリゴヌクレオチドプロー
ブは、ボエーリンガー マンハイム (Boehringer Mannheim)、インディアナポリス、ＩＮ
により提供された指示に 従い、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いて３’−端標識した。
【００９９】
まず、ＤＩＧ−標識プローブは、制限酵素の様々な組み合わせで切断され、１％のアガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルタに密着印画されていたシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させた。これらの結果を基に、サイズ−分別ゲノムライブラリーをｐブルースクリプト（Bluescript）ＩＩ Ｋｓ＋ベクター内
で構成し、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に変換した。ゲノムライブラリーは１−２ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を含んでいた。ＤＩＧ−標識オリゴヌクレオチドプ
ローブは、ナイロンフィルタ上の縞状の細菌コロニー列とハイブリッド形成させた。プラスミドＤＮＡを陽性コロニーから単離しサブクローン化した。各サブクローンの両方のストランドの配列決定を、ネブラスカ−リンカンの大学でＤＮＡ配列決定設備を用いて行った。ＤＩＧ−標識プローブのハイブッド形成及び検出は、ボアリンガーマンハイムが提示したプロトコルに従って行った。
【０１００】
オキシゲナーゼDICの遺伝暗号を指定するゲノムＤＮＡクローンを同定した。ヌクレオ
チド配列及び導き出した全オキシゲナーゼDICのアミノ酸配列を以下の配列表にそれぞれ
、配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示す。
【０１０１】
このクローンのヌクレオチド配列から導き出したアミノ酸配列と、スイスタンパク質データベースのタンパク質配列のアミノ酸配列との比較から、他のオキシゲナーゼに対する相同性が見られた。相同性はＧＣＧソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを用いて決定した。最も強い相同性は（シュードモナス・ｓｐ．ＡＴＣＣ株１９１５１からの）バニレートデメチラーゼのオキシゲナーゼ成分との間にあり、３３．８％の同一性を示した。
実施例３
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼのフェレドキシンの遺伝暗号を指定するクローンの同定と配列
実施例１で述べたように、フェレドキシンDICのＮ−末端アミノ酸配列の最初の２０ア
ミノ酸は以下のように決定された：
Thr Tyr Val Val Thr Asp Ala Xaa Ile Lys Xaa Lys Tyr Met Asp Xaa Val Glu Val Xaa ［配列番号２］ この配列により縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となった。特に、それぞれが１７ヌクレオチドの長さを持ち、以上でとりわけ強調した（ＸａａをＣｙｓとする）アミノ酸配列の遺伝暗号を指定することができる可能なヌクレオチド配列の全てを含む１６プローブの混合物を使用した。
【０１０２】
ＤＩＧ−標識プローブを使用して、ゲノムライブラリーが２−３ Ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｅ
ｃｏ ＲＩ断片を含むこと以外は実施例２で説明した様に、ゲノムライブラリーのスクリ
ーニングを行った。フェレドキシンDICクローンのヌクレオチド配列及び導き出した全フ
ェレドキシンDICのアミノ酸配列を以下の配列表にそれぞれ、配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５及び配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示す。
【０１０３】
このクローンのヌクレオチド配列から導き出したアミノ酸配列と、スイスタンパク質データベースのタンパク質配列のアミノ酸配列との比較を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った。この比較により、シュードモナス・スツツェリ、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・キャプシュラツス、アゾトバクター・ビネランジイ及ロドスピルム・ルブルムからのフェレドキシンを含む他のフェレドキシンに対する強い相同性が見られた上記実施例１における考察を参照のこと。
【技術分野】
【０００１】
この発明は、ジカンバ（dicamba）耐性を有するようにした遺伝子導入植物を含む、除
草剤であるジカンバを分解することができる遺伝子導入生物体に関する。この発明はまたジカンバ−分解酵素、及びジカンバ分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ分子及びＤＮＡ構成に関する。この発明はさらに、ジカンバー耐性遺伝子導入植物の畑における雑草の制御方法及びジカンバで汚染された材料からジカンバを除去する方法（生物治療）に関する。最後に、この発明はジカンバ耐性を基に、あるいはジカンバが分解した結果生成する３，６−ジクロロサリチル酸の蛍光の検出を基に、形質転換株を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
除草剤は農業生産において日常的に使用される。除草剤の効果はしばしば、作物畑での雑草の成長を止める能力及び換金作物の除草剤に対する耐性により決定される。換金作物がその除草剤に対し耐性を有しなければ、除草剤は換金作物の生産性を減少させ、あるいは換金作物を共に枯らしてしまうこととなる。逆に、除草剤の強さが十分でなければ、作物畑で雑草が成長しすぎ、これにより換金作物の生産性が減少してしまう。このため、除草剤に対し耐性のある、経済的に重要な植物を生産することが望ましい。農業用土地の水質及び環境的な質を守るため、除草剤の不測の流出が起きた場合あるいは容認できない高レベルの土壌あるいは水質汚染が起きた場合に除草剤を分解する技術を開発することも望ましい。
【０００３】
除草剤及び他のゼノフォビック化合物を不活性化する酵素を符号化する遺伝子が、様々な原核生物及び真核生物から以前単離された。場合によっては、これらの遺伝子は植物における発現が成功するように遺伝子的に工作されている。このアプローチを介して、除草剤、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸ストレバー（Streber）及びウィルミッツァ（Willmitzer）１９８９バイオ／テクノロジー ７：８１１−８１６；２、４−Ｄ、ブロモキシニルストーカー（Stalker）ら、（１９８８）サイエンス２４２：４１９−４２３；商標名
バクトリル(Buctril))、グリフォセート（コマイ（Comai）ら、（１９８５）ネイチャー
３１７：７４１−７４４；商標名ラウンドアップ(Round-up)）及びホスフィノトリシン（デブロック（De Block）ら、（１９９７）エンボジャーナル６：２５１３−２５１８；商標名バスタ(Basta)）に耐性を持つ植物が開発されている。
【０００４】
ジカンバ（商標名バンベル(Banvel)）は、とうもろこし、もろこし類、小穀粒、牧草地、干草、放牧地、さとうきび、アスパラガス、芝、イネ科種子作物における一年生及び多年生広葉雑草及び幾つかのイネ科雑草を抑制するための出芽前散布除草剤及び出芽後散布除草剤として使用される。クロッププロテクションレファレンスの１８０３−１８２１ページ参照のことケミカル＆ファーマソイティカルプレス社、ニューヨーク、ＮＹ、１１版、１９９５年。不幸なことに、ジカンバは多くの商業用の作物豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ひまわり、トマト、タバコ及び果樹を含む、観賞植物及び樹木、及び他の広葉植物と触れると、それらに損害を与える。同上のジカンバは化学的に安定であり、環境において分解されにくい場合もある。
【０００５】
ジカンバは安息香酸除草剤のクラスである。ジカンバを含む安息香酸除草剤に対し耐性を持つ植物は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）シンターゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣオキシダーゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣ脱アミノ酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを植物内に組み入れることにより産出することができることが示唆されている。カナダ特許出願第２，１６５，０３６号（１９９６年６月１６日に公表
）を参照のこと。しかしながら、この出願では、このような耐性について立証をする実験的なデータは示されていない。
【０００６】
ジカンバを代謝する細菌が知られている。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガー（Krueger）らの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コ
ーク（Cork）及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリル（Khalil）の先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの細菌によるジカンバ代謝の原因となる特定の遺伝子を単離し、ジカンバー耐性植物及び他の生物体を産出するのに使用することができることが示唆されている。同上及びヤング（Yang）らの分析生物化学、２１９、３７−４２（１９９４）を参照のこと。しかしながら、この発明以前では、そのような遺伝子は同定も単離もされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この発明は単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解オキシゲナーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解フェレドキシン、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解レダクターゼを提供するものである。これらは全て以下において規定、説明する。
【０００９】
この発明はまた、ジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子及びジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子を提供するものである。この発明はさらに、発現制御配列と機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成及び発現制御配列と機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成を提供するものである。
【００１０】
この発明はさらに、発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む遺伝子導入宿主細胞、及び発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む遺伝子導入宿主細胞を提供するものである。遺伝子導入宿主細胞はジカンバ−分解オキシゲナーゼ及びジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含んでもよい。これらはどちらも発現制御配列に機能可能に結合している。遺伝子導入宿主細胞は植物細胞でも、原核あるいは真核微生物でもよい。
【００１１】
さらに、この発明は発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含む１つ以上の細胞を有する遺伝子導入植物あるいは植物部分を提供するものである。植物あるいは植物部分の１以上の細胞はさらに、発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解フェレドキシンの遺伝暗号を指定するＤＮＡを含んでもよい。遺伝子導入植物または植物部分はジカンバに対し耐性があり、そのジカンバに対する耐性はジカンバ−分解オキシゲナーゼの発現あるいはジカンバ−分解オキシゲナーゼとフェレドキシンの発現により増加する。
【００１２】
この発明はまた、本発明にかかる遺伝子導入ジカンバー耐性植物を含む畑において雑草を抑制する方法を提供するものである。この方法は雑草を抑制するのに有効なある量のジカンバを畑に適用する工程を含む。
【００１３】
この発明はさらに、ジカンバを含む物質の除染を行う方法を提供する。１つの実施の形態では、この方法は有効量の本発明にかかる遺伝子導入ジカンバ−分解微生物をその物質
に適用する工程を含む。他の実施の形態では、この方法は有効量のジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼまたは有効量のジカンバ−分解オキシゲナーゼと、ジカンバ−分解フェレドキシンとジカンバ−分解レダクターゼの組み合わせをその物質に適用する工程を含む。
【００１４】
この発明はまた、選択標識としてジカンバ耐性を使用した形質転換植物細胞及び形質転換植物の選択方法も提供する。１つの実施の形態では、この方法は、発明にかかるＤＮＡ構成を用いて一群の植物細胞中の少なくともいくつかの植物細胞の形質転換を行い、得られた植物細胞群を、形質転換植物細胞は増殖するが形質転換されていない植物細胞は増殖しないように選択された濃度のジカンバを含む培地で増殖させる工程を含む。他の実施の形態では、この方法は、ジカンバの分解を起こす発明にかかるＤＮＡ構成を含むと思われる一群の植物にジカンバを適用する工程を含み、このジカンバは形質転換された植物は成長するが、形質転換されていない植物の成長は阻害されるように選択された量で適用される。
【００１５】
最後に、この発明は、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分に対する選択方法あるいはスクリーニング方法を提供する。この方法は、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を含むと考えられる一群の宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分を提供する工程と、３，６−ジクロロサリチル酸による蛍光の存在またはレベルを確認する工程とを含む。３，６−ジクロロサリチル酸は形質転換宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分において、ジカンバの分解の結果生成し、形質転換されていない宿主細胞、完全な生物体、あるいは生物体の部分では生成されない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ジカンバＯ−デメチラーゼに対する電子伝達スキームを示した図である。ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼDICからフェレドキシンDICまで、そしてオキシゲナーゼDICまで逐次伝達される。酸素と基質であるジカンバとから３，６−ジクロロサリチル酸が形成する反応はオキシゲナーゼDICにより触媒される。ここで、ｏｘは酸化状態、ｒｅｄは還元状態である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の現在のところ好ましい実施の形態の詳細な説明 以前の研究（コークとクルー
ガー、先進応用微生物学、３６：１−５６及びヤングら１９９４、分析生物化学、２１９：３７−４２）では、土壌細菌、シュードモナス・マルトフィリア、ＤＩ−６株は一段反応でジカンバの除草活性を消失させることができることが示されている。この一段反応では、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）は３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ）に転化される。３，６−ＤＣＳＡは除草活性を有しておらず、植物に対しいかなる有害な影響を与えないことが示されている。さらに、３，６−ＤＣＳＡは土壌中に存在する通常の細菌叢により容易に分解される。
【００１８】
この中で説明している実験により、シュードモナス・マルトフィリア株ＤＩ−６によりジカンバが３，６−ＤＣＳＡに転化されるのはＯ−デメチラーゼが原因であるというヤングらの仮説（同書物参照のこと）が確認され、Ｏ−デメチラーゼはレダクターゼと、フェレドキシンと、オキシゲナーゼとからなる三成分酵素系であることが確立される。シュードモナス・マルトフィリアＯ−デメチラーゼ及びその三成分の単離、精製、キャラクタリゼーションについて詳細に説明している実施例１を参照のこと。ジカンバＯ−デメチラーゼの三成分により触媒される反応に対する反応スキームを図１に示す。図１に示されるように、ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼとフェレドキシンからなる短い電子連鎖を介して末端のオキシゲナーゼまで往復し、このオキシゲナーゼがジカンバの酸化を触媒し、３，６−ＤＣＳＡが生成される。
【００１９】
第１の実施の形態では、この発明により、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ−分解酵素が提供される。この中で使用されている「単離された」という用語は、酵素が産出細胞から少なくとも取り出された（すなわち、酵素は細胞溶解物中に含まれる）ことを意味する。この中で使用されている「少なくとも部分的に精製された」とは、酵素が細胞溶解物の他の成分から少なくとも部分的に単離されていることを意味する。好ましくは、酵素は十分に精製され、酵素の試料は少なくとも７０％は均一である。
【００２０】
特に、この発明は単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼを提供する。「ジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ」はこの中では、ジカンバ−分解オキシゲナーゼ、ジカンバ−分解フェレドキシン及びジカンバ−分解レダクターゼの組み合わせを意味するものと規定される。これらは全て以下に規定する通りである。
【００２１】
この発明はまた単離した、少なくとも部分的に精製したジカンバ−分解オキシゲナーゼを提供する。「ジカンバ−分解オキシゲナーゼ」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製したオキシゲナーゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるオキシゲナーゼを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解オキシゲナーゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアオキシゲナーゼのアミノ酸配列を有する突然変異オキシゲナーゼが含まれる。ジカンバ−分解オキシゲナーゼの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２２】
この発明はさらに、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバー分解フェレドキシンを提供する。「ジカンバ−分解フェレドキシン」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製されたフェレドキシン、及びシュードモナス・マルトフィリアフェレドキシンのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるフェレドキシンを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解フェレドキシン」には、シュードモナス・マルトフィリアフェレドキシン配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアフェレドキシンのアミノ酸配列を有する突然変異フェレドキシンが含まれる。ジカンバ−分解フェレドキシンの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２３】
最後に、この発明は単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバー分解レダクターゼを提供する。「ジカンバ−分解レダクターゼ」はこの中では、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株から精製されたレダクターゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアレダクターゼのアミノ酸配列に対し少なくとも６５％、好ましくは少なくとも約８５％が相同なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わるレダクターゼを意味するものと規定される。「ジカンバ−分解レダクターゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアレダクターゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアレダクターゼのアミノ酸配列を有する突然変異レダクターゼが含まれる。ジカンバ−分解レダクターゼの活性は実施例１で説明しているように決定することができる。
【００２４】
アミノ酸配列の相同性の程度を決定する方法は当業者には周知である。例えば、遺伝学的コンピューティンググループ（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラム（ウィスコンシン大学、マディソン、ＷＩ）を使用して、スイスタンパク質データベースなどの様々なタンパク質データベースにおける配列を比較することができる。
【００２５】
この発明のジカンバ−分解酵素は、実施例で説明しているように、シュードモナス・マルトフィリア及び他の生物体から単離、精製することができる。適した他の生物体としては、ジカンバを分解するシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株以外の細菌が挙げられる。そのような細菌の幾つかの株が周知である。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガーらの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コーク及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリルの先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。他のジカンバ−分解細菌株は、当業者に周知の方法により単離することができる。
【００２６】
しかしながら、好ましくは、この発明のジカンバ−分解酵素は組み換えＤＮＡ技術（以下を参照）を用いて調製される。特に、シュードモナス・マルトフィリア配列のアミノ酸において１つ以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリア酵素のアミノ酸配列を有する突然変異酵素は、この様に、例えば、オリゴヌクレオチド−定方向突然変異誘発、リンカー−スキャニング変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた変異誘発、などを用いて調製される。オースベル（Ausubel）ら編集の分子生
物学における最近のプロトコルワイリーインターサイエンス（Wiley Interscience）１９９０、及びマクファーソン（McPherson）編集、定方向突然変異誘発：実際のアプローチ
（ＩＲＬプレス１９９１）を参照のこと。
【００２７】
第２の実施の形態では、この発明は、この発明のジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定する単離したＤＮＡ分子を提供する。「単離された」はこの中で、ＤＮＡ分子がその自然環境から取り出されていること、あるいは自然発生ＤＮＡ分子ではないことを意味するために使用される。これらのＤＮＡ分子の調製方法は当業者に周知である。例えば、マニアチス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８２、サムブルック（Sambrook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹを参照のこと。
【００２８】
例えば、この発明のＤＮＡ分子は単離したｃＤＮＡまたはゲノミッククローンでもよい。シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株のジカンバ−分解オキシゲナーゼ及びフェレドキシンの遺伝暗号を指定するクローンの同定及び単離は実施例２及び実施例３で説明されている。ジカンバ−分解レダクターゼの遺伝暗号を指定するクローンを含む、ジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するその他のクローンは同様に得ることができる。単離したクローン、あるいはそれらの一部をプローブとして使用して、最初にクローンを単離した生物体以外の生物体から追加のクローンを同定、単離することができる。適した生物体としては、ジカンバを分解する細菌が挙げられる。上述したように、シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株以外に、幾つかの細菌株がジカンバを分解することが知られている。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガーらの農芸化学・食物化学ジャーナル、３７、５３４−５３８１９８９；コーク及びクルーガーの先進応用微生物、３８、１−６６１９９１；コーク及びカリルの先進応用微生物、４０、２８９−３２０（１９９５）を参照のこと。
【００２９】
この発明のＤＮＡ分子はまた単離したクローンの配列を用いて化学的に合成することもできる。そのような技術は当業者に周知である。例えば、ＤＮＡ配列は自動ＤＮＡ合成器内でホスホアミダイト化学により合成してもよい。化学合成には多数の利点がある。特に、ＤＮＡ配列が発現する宿主が選択したコドンを使用して発現を最適化してもよいため、化学合成は望ましい。発現を改良するためにコドンの全てを変える必要はないが、好ましくは、少なくとも宿主においてほとんど使用されないコドンは宿主選択コドンに変更される。約５０％を超える、最も好ましくは少なくとも約８０％のコドンを宿主選択コドンに変更することにより、高レベルの発現を得ることができる。多くの宿主細胞のコドン選択性は周知である。例えば、遺伝子発現の最大化、２２５−８５ページレズニコフ（Reznik
off）及びドールド、編集、１９８６、ＰＣＴ ＷＯ ９７／３１１１１５、ＰＣＴ ＷＯ９７／１１０８６、ＥＰ ６４６６４３、ＥＰ ５５３４９４、及び米国特許第５，６８９，０５２号、第５，５６７，８６２号、第５，５６７，６００号、第５，５５２，２９９号、第５，０１７，６９２号を参照のこと。
【００３０】
他の宿主細胞のコドン選択性は当業者に周知の方法により導き出すことができる。また、化学合成を用いて、ＤＮＡ分子の配列あるいはそれにより遺伝暗号が指定されたタンパク質を容易に変更し、例えば発現を最適化すること例えば、転写または翻訳を阻害するｍＲＮＡ２次構造を除去すること、好都合な点で独特な制限部位を付加すること、プロテアーゼ開裂部位を削除すること、などができる。
【００３１】
第３の実施の形態では、この発明は発現制御配列に機能可能に結合したジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡを含むＤＮＡ構成を提供する。「ＤＮＡ構成」はこの中では、ＤＮＡを宿主細胞中に導入するために有効な構築した（非−自然的に生じた）ＤＮＡ分子と定義される。この用語はキメラ遺伝子、発現カセット、及びベクターを含む。
この中で使用されている「機能可能に結合された」とは、遺伝暗号が指定されたタンパク質が発現されるようなＤＮＡ配列の結合（配列順序、配列の配向、及び様々な配列の相対的な距離を含む）を言う。遺伝暗号を指定する配列に表現制御配列を機能可能に結合する方法は当業者に周知である。例えば、アニアティス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８２）及びサムブルック（Sam brook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、
ＮＹ（１９８９）を参照のこと。
【００３２】
「発現制御配列」は、原核生物及び真核生物における転写または翻訳の規制に何らかの関わりのあるＤＮＡ配列である。適した発現制御配列及びそれらの作成方法及び使用方法は当業者に周知である。
【００３３】
発現制御配列にはプロモータが含まれなければならない。プロモータは選択された宿主細胞または生物体において転写活性を示すＤＮＡ配列であればどのようなものでもよい。プロモータは誘導性あるいは構成性であってもよい。自然発生したものでもよく、様々な自然発生プロモータの部分から構成されてもよく、部分的にあるいは全体的に合成されたものでもよい。プロモータの設計のガイダンスが、ハーレイ（Harley）及びレイノルド(Relnolds)、核酸リサーチ、１５、２３４３−６１（１９８７）などのプロモータ構造の研究により提供されている。また、転写開始に関するプロモータの位置は最適化してもよい。例えば、ロバートらのプロシーヂャー、国立アカデミー、サイエンス、ＵＳＡ、７６、７６０−４（１９７９）を参照のこと。原核生物及び真核生物において使用するための多くの適したプロモータが当業者に周知である。例えば、植物において使用するための適した構成性プロモータとしては、植物ウィルスからのプロモータオデール（Odell）ら、ネ
イチャー３１３：８１０−８１２１９８５))、クロレラウィルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータ米国特許第５，５６３，３２８号、ゴマノハグサモザイクウィルスからの全長転写プロモータ米国特許第５，３７８，６１９号、及びコメアクチンマクエローリー（McElory）ら、植物細胞２：１６３−１７１１９９０))、ユビキチンクリステン
セン（Christensen）ら、植物分子生物学１２：６１９−６３２（１９８９）及びクリス
テンセンら、植物分子生物学１８：６７５−６８９、ｐＥＭＵラスト（Last）ら、理論応用遺伝子学８１：５８１−５８８１９９１))、ＭＡＳベルテン（Velten）ら、ＥＭＢＯジャーナル３：２７２３−２７３０１９８４))、トウモロコシＨ３ヒストンレペチット（Lepetit）ら、分子遺伝子遺伝学２３１：２７６−２８５（１９９２）及びアタナッソバ（Atanassova）ら、植物ジャーナル２３：２９１−３００１９９２))、アブラナ属ナプスＡ
ＬＳ３（ＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４１２２８）などの遺伝子からのプロモータ、及び様々
なアグロバクテリウム属遺伝子のプロモータ（米国特許第４，７７１，００２号、第５，
１０２，７９６号、第５，１８２，２００号、第５，４２８，１４７号）が挙げられる。
【００３４】
植物において使用するのに適した誘導性プロモータとしては、銅に応答するＡＣＥ１系からのプロモータメット（Mett）ら、ＰＮＡＳ９０：４５６７−４５７１１９９３))、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答するトウモロコシＩｎＺ遺伝子のプロモータハーシェイ（Hershey）ら、分子遺伝子遺伝学２２７：２２９−２３７（１９９１）及
びガッツ（Gatz）ら、分子遺伝子遺伝学２４３：３２−３８１９９４))、及びＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサのプロモータ（ガッツら、分子遺伝子遺伝学２２７：２２９−２３７１９９１）が挙げられる。植物に使用するのに特に好ましい誘導性プロモータは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するものである。この型の誘導性プロモータの例としては、転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されるステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモータが挙げられる（スケナ（Schena）ら、プロシーヂャー、国立アカデミー、サイエンス、ＵＳＡ８８：１０４２１１９９１。植物に使用するための他の誘導性プロモータはＥＰ ３３２１０４、ＰＣＴ ＷＯ ９３／２１３３４、ＰＣＴ ＷＯ
９７／０６２６９において説明されている。
【００３５】
細菌において使用するのに適したプロモータとしては、バシラスステアロサーモフィラスマルトジェニックアミラーゼ遺伝子のプロモータ、バシラスリケニホルミスアルファーアミラーゼ遺伝子、バシラスアミロリケファシエンスＢＡＮアミラーゼ遺伝子、枯草菌アルカリプロテアーゼ遺伝子、バシラスプミラスキシロシダーゼ遺伝子、ファージラムダＰｐ及びＰｌプロモータ、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００３６】
酵母宿主細胞において使用するのに適したプロモータとしては、酵母解糖遺伝子からのプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子からのプロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、及びＡＤＨ２−４ｃプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００３７】
糸状菌類において使用するのに適したプロモータとしては、ＡＤＨ３プロモータ、ｔｐｉＡプロモータ、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギンタンパク質分解酵素、アスペルギルス・ニガー中性α-アミラーゼ、アス
ペルギルス・ニガー酸安定性α-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギ
ルス・アワモリグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、アスパルギルス・オリザエアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエトリオースホスフェートイソメラーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼの遺伝暗号を指定する遺伝子のプロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００３８】
哺乳類細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ＳＶ４０プロモータ、金属チオネイン遺伝子プロモータ、ネズミの乳房腫瘍ウィルスプロモータ、ラウス肉腫ウィルスプロモータ、及びアデノウィルス２主働遅発プロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００３９】
昆虫細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリフォルニカ多角体病ウィルス塩基性タンパク質プロモータ、バクロウィルス初期遺伝子１プロモータ及びバクロウィルス３９Ｋ遅発−早発遺伝子プロモータが挙げられる。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８を参照のこと。
【００４０】
最後に、他のプロモータの一部からなるプロモータ及び部分的あるいは全体的に合成した合成プロモータも使用することができる。例えば植物において使用するためのそのようなプロモータについて説明している、ニ（Ni）らの植物ジャーナル７：６６１−６７６（
１９９５）及びＰＣＴ ＷＯ ９５／１４０９８を参照のこと。
【００４１】
プロモータは１以上のエンハンサー要素を含んでもよく、あるいは１以上のエンハンサー要素を含むように修飾されてもよい。好ましくは、プロモータは複数のエンハンサー要素を含む。エンハンサー要素を含むプロモータは、エンハンサー要素を含まないプロモータに比べて高いレベルの転写を提供する。植物において使用するのに適したエンハンサーとしてはカリフラワーモザイクウィルスからの３５Ｓエンハンサー（米国特許第５，１０６，７３９号及び第５，１６４，３１６号を参照のこと）及びゴマノハグサモザイクウィルスからのエンハンサー要素（マイティ（Maiti）ら、遺伝子導入リサーチ６：１４３−
１５６（１９９７）が挙げられる。他の細胞において使用するのに適した他のエンハンサーは周知である。ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びエンハンサーと真核生物の発現（コールドスプリングハーバープレス、コールドスプリングハーバー、ＮＹ、１９８３）を参照のこと。
【００４２】
有効な発現のために、暗号配列もまた３’未翻訳配列に機能可能に結合されていることが好ましい。３’未翻訳配列は転写及び／または翻訳終止配列を含む。３’未翻訳領域は細菌、植物あるいは他の真核生物細胞からの遺伝子の側面領域から得ることができる。原核生物において使用するためには、３’未翻訳配列は転写終止配列を含む。植物及び他の真核生物において使用するためには、３’未翻訳領域は転写終止配列及びポリアデニル化配列を含む。植物において使用するのに適した３’未翻訳配列はカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子、ファセオリン種子貯蔵タンパク質遺伝子、エンドウのリブロースビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットＥ９遺伝子、大豆７５貯蔵タンパク質遺伝子、オクトピンシンターゼ遺伝子、ノパリンシンターゼ遺伝子の３’未翻訳配列を含む。
【００４３】
植物及び他の真核生物においては、５’未翻訳配列も用いられる。５’未翻訳配列は、５’ＣＡＰ部位から翻訳開始コドンまで延在しているｍＲＮＡの部分である。このｍＲＮＡの領域は真核生物では翻訳の開始のために必要であり、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。植物において使用するのに適した５’未翻訳配列としては、アルファルファモザイクウィルス、キュウリモザイクウィルス外皮タンパク質遺伝子、タバコモザイクウィルスの５’未翻訳配列が挙げられる。
【００４４】
上述したように、ＤＮＡ構成はベクターでもよい。ベクターは１以上の複製システムを含んでもよく、これによりベクターが宿主細胞において複製する。自己複製ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターが挙げられる。その代わりに、ベクターは組み込みベクターでもよく、これにより、この発明のジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定する配列の宿主細胞染色体中への組込みが可能となる。ベクターはまた、ＤＮＡ配列の挿入のためのユニークな制限部位を有することが望ましい。ベクターがユニークな制限部位を有していない場合、ベクターを修飾して制限部位を導入または除去しその後の操作により適したものとしてもよい。
【００４５】
発明にかかるＤＮＡ構成を使用して様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる下記参照のこと。形質転換宿主細胞を選択するためには、遺伝標識を使用しなければならない「選択標識」。選択標識により典型的には、形質転換された細胞は、負の選択によりすなわち、選択標識を含まない細胞の成長を阻害することにより、あるいは選択標識により遺伝暗号が指定された産出物をスクリーニングすることにより、回収することができる。植物の形質転換のための選択可能な標識遺伝子として最も普通に使用されるのは、Ｔｎ５から単離されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これを植物調節シグナルの制御下に置くと、カナマイシンに対する耐性が付与される。フラリー（Fraley）ら、プロシージャー国立アカデミーサイエンスＵＳＡ、ＢＯ：４８０３
１９８３。他の普通に使用される選択可能な標識遺伝子は、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、この遺伝子は構成物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与する。バンデンエルゼン（Vanden Elzen）ら、植物分子生物学５：２９９１９８５。
【００４６】
抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源のその他の選択可能な標識遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、及びブレオマイシン耐性決定基が挙げられる。ヘイフォード（Hayford）ら、植物生理学８６：１２１６１９８８
、ジョーンズ（Jones）ら、分子遺伝子遺伝学２１０：８６１９８７、スバブ（Svab）ら
、植物分子生物学１４：１９７１９９０、ヒル（Hille）ら、植物分子生物学７：１７１
１９８６。他の選択可能な標識遺伝子は、グリフォセート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する耐性を付与する。コマイ（Comai）ら、ネイチャー３１７
：７４１−７４４１９８５、ゴルドン−カム（Gordon-Kamm）ら、植物細胞２：６０３−
６１８（１９９０）及びストーカー（Stalker）ら、サイエンス２４２：４１９−４２３
１９８８。
【００４７】
植物の形質転換のために選択可能な他の標識遺伝子は細菌起源のものではない。これらの遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロフォレートレダクターゼ、植物エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ及び植物アセトラクテートシンターゼが挙げられる。エイコルツ（Eichholtz）ら、体細胞分子遺伝学１３：６７１９８７、サー（Shah）ら、サイエンス２３３：４７８１９８６、チャレスト（Charest）ら、植物細胞リポート８：６４３１９９０。
【００４８】
形質転換細胞と仮定される細胞のスクリーニングを行うために普通用いられる遺伝子としては、β−グルクロニダーゼＧＵＳ、β−ガタクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。ジェファーソン(Jefferson)、Ｒ．Ａ、植物分子生物学リポート５：３８７１９８７、ティーリ（Teeri）ら、ＥＭＢＯジャーナル８：３４３１９８９、コンクツ（Koncz）ら、プロシーヂャー国立アカデ
ミーサイエンスＵＳＡ８４：１３１１９８７、デブロック（De Block）ら、ＥＭＢＯジャーナル３：１６８１１９８４、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）チャルフィー（Chalfie）
ら、サイエンス２６３：８０２１９９４、ハセロッフ（Haseloff）ら、ＴＩＧ１１：３２８−３２９（１９９５）及びＰＣＴ出願ＷＯ ９７／４１２２８。比較的まれな形質転換
事象の同定へのアプローチは、トウモロコシのアントシアニン色素沈着経路の優性抗生性調節体の遺伝暗号を指定する遺伝子を使用するものである。ルードウィグ（Ludwig）ら、サイエンス２４７：４４９１９９０。
【００４９】
植物以外の原核生物及び真核生物において使用するのに適した選択標識も周知である。例えば、ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。例えば、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、テトラシリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンまたはヒグロマイシン）に対する耐性を選択標識として使用してもよい。
【００５０】
本発明の別の観点によれば、植物及び植物細胞のための選択標識として、ジカンバに対する耐性を使用することができる。「耐性」は、形質転換された植物細胞が、形質転換されていない細胞の成長を妨害するレベルのジカンバを含む培地に置いた場合に成長する（生き残り、再生して植物になる）ことができることを意味する。「耐性」はまた、形質転換植物が、形質転換されていない植物の成長を阻害する量のジカンバを適用した後も成長することができることを意味する。
【００５１】
形質転換植物細胞の選択方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、一群の植物細
胞（例えば、外植体または胚懸濁培養）において少なくとも幾つかの植物細胞について、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を用いて形質転換を行う。得られた植物細胞群を、形質転換された植物細胞は増殖するが、形質転換されていない植物細胞は増殖しないように選択された濃度のジカンバを含む培地に置く。適したジカンバ濃度は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００５２】
形質転換された植物を選択する方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、ジカンバ分解を提供する本発明にかかるＤＮＡ構成を含むと思われる一群の植物にジカンバを適用する。ジカンバの量は、形質転換された植物は成長するが、形質転換されていない植物の成長は阻害されるように選択される。阻害レベルは、形質転換された植物とそうでない植物とが容易に識別できる（すなわち、阻害は統計学上、有意なものでなければならない）ように十分なものでなければならない。そのような量は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００５３】
さらに、ジカンバの分解の結果生成する３，６−ＤＣＳＡを使用して選択、スクリーニングすることができる。３，６−ＤＣＳＡの生成はこの化合物の蛍光を観測することにより簡単に確認することができ、このため、形質転換された宿主細胞、完全の生物体、生物体の一部（例えば、微生物、植物、植物の部分、及び植物細胞）の選択、スクリーニングすることができる。この点に関しては、この発明により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に対する場合と同様に、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分の選択及びスクリーニングが可能である。米国特許第５，１６２，２２７号、第５，４９１，０８４号、及びＰＣＴ出願ＷＯ ９６／２７６７５、ＷＯ ９７／１１０９４、ＷＯ ９７
／４１２２８、ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。これらは全てこの中で引用され参
照される。特に、３，６−ＤＣＳＡは、形質転換された宿主細胞、完全な生物体、及び生物体の部分において、従来の分光測光法を用いて検出することができる。例えば、顕微鏡は、蛍光励起及び検出用の適当なフィルタを組み合わせて適合させることができる。ベンチでの調査または現地調査では手持ちランプを使用してもよい実施例１を参照のこと。蛍光-活性化細胞分類も使用することができる。３，６−ＤＣＳＡは３１２−３１３ｎｍの
波長で励起され、極大発光波長は４２４ｎｍである。
【００５４】
生物体の「部分」は器官、組織、あるいはその他の全ての部分を含む。「植物の部分」は種子、花粉、胚芽、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを含む。
ジカンバ耐性植物またはジカンバ−分解微生物を産出するには、ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択を使用することができる。この場合、他の選択標識の使用は必要ない。ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択はまた、他の興味のある遺伝子が発現する遺伝子導入細胞または生物体の産出に使用することができる。多くのそのような遺伝子は周知であり、そのような遺伝子としては、経済価値のあるタンパク質の遺伝暗号を指定する遺伝子、植物に改良された農業経済学的特性を付与する遺伝子が挙げられる例えば、ＰＣＴ ＷＯ９７／４１２２８を参照のこと。この開示内容は全てこの中で引用
され参照される。
【００５５】
本発明のＤＮＡ構成を使用して、原核生物や真核生物を含む様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる。別個の選択標識を使用する場合、ジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列及び選択標識は、同じあるいは異なるＤＮＡ構成上にあってもよい。好ましくは、それらは転写単位としての単一のＤＮＡ構成上に配列され、遺伝暗号を指定する配列の全てが共に発現される。また、関心のある遺伝子及びジカンバ−分解酵素の遺伝暗号を指定するＤＮＡ配列は、ジカンバー耐性またはジカンバ−分解を選択標識として使用する場合、同じまたは異なるＤＮＡ構成上にあってもよい。そのような構成は以上で説明したのと同様に調製することができる。
【００５６】
適した宿主細胞としては、原核微生物及び真核微生物例えば、細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス及び大腸菌を含む、酵母（サッカロミセス・セレビシエを含む）及び他の真菌アスペルギルス種を含む))、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞が挙げられる。好ましくは、宿主細胞は通常ジカンバを分解しないものである。しかしながら、この発明はまた、通常ジカンバを分解する宿主細胞におけるジカンバ分解レベルを増加させるために使用することができる。
【００５７】
このように、本発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解しない細胞及び生物体が含まれるが、これらの細胞及び生物体はこの発明により形質転換され、この除草剤を分解することができるようになる。この発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解する細胞及び生物体も含まれ、これらの細胞及び生物体はこの発明により形質転換され、この除草剤をより多く分解することができる、あるいはより効果的に分解することができるようになる。
【００５８】
原核生物及び真核生物の宿主細胞の形質転換方法は当業者に周知である。例えば、マニアチス（Maniatis）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８２、サムブルック（Sambrook）らの分子クローニング：研究室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ＮＹ１９８９、ＰＣＴ ＷＯ ９６／２３８９８、ＰＣＴ ＷＯ ９７／４２３２０を参照のこと。
【００５９】
例えば、生物学的及び物理学的形質転換プロトコルを含む、多くの植物形質転換方法が開発されている。例えば、ミキらの植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法における「異種ＤＮＡを植物に導入するための手順」、グリック(Glick)、Ｂ．Ｒ．及び
トンプソン(Thompson)、Ｊ．Ｅ．編集（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．ボカ ラトン(Boca Raton)、１９９３）６７−８８ページを参照のこと。さらに、植物細胞または組織の形質転換
及び植物の再生のためのベクター及び生体外培養法が有効である。例えば、グルバー（Gruber）らの植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法おける「植物形質転換のためのベクター」、グリック、Ｂ．Ｒ．及びトンプソン、Ｊ．Ｅ．編集（ＣＲＣプレス、Ｉｎｃ．ボカ ラトン(Boca Raton)、１９９３）８９−１１９ページを参照のこと。発現
ベクターを植物に導入するための最も広く使用されている方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換システムに基づくものである。例えば、ホルシュ（Horsh）ら、サイエンス
２２７：１２２９（１９８５）を参照のこと。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスは、遺伝学的に植物細胞の形質転換を行う植物の病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を運ぶ。例えば、カド(Kado)、Ｃ．Ｉ、評論レビュー、植物サイエンス１０：１（１９９１）を参照のこと。アグロバクテリウムのベクターシステムの説明及びアグロバクテリウム−媒介遺伝子伝達の方法は多くの参考文献において示されている。例えば、グルバー（Gruber）ら前述、ミキら前述、モロニー（Moloney）らの植物細胞リポート８：２３８
１９８９、及び米国特許第４，９４０，８３８号及び第５，４６４，７６３号などである。
【００６０】
一般に適用できる植物の形質転換方法は、ＤＮＡが微小噴射体の表面上で運ばれる微小噴射体−媒介形質転換である。発現ベクターは、微小噴射体を加速して植物細胞壁及び細胞膜を通過するのに十分な速度とするバイオリスティック装置を用いて植物組織内に導入される。サンフォード（Sanford）ら、特別サイエンステクノロジー５：２７１９８７、
サンフォード、Ｊ．Ｃ．トレンドバイオテクノロジー６：２９９１９８８、サンフォード、Ｊ．Ｃ，生理学植物７９：２０６１９９０、クレイン（Klein）ら、バイオテクノロジ
ー１０：２６８１９９２。
【００６１】
ＤＮＡを物理的に植物まで運ぶための別の方法は目標細胞の音波処理である。ツァング（Zhang）ら、バイオ／テクノロジー９：９９６１９９１。その代わりに、リポソームま
たはスフェロプラストを使用して発現ベクターが植物内に導入されている。デシャエス（Deshayes）ら、ＥＭＢＯジャーナル４：２７３１１９８５、クリストウ(Christou)、プロシージャー国立アカデミーサイエンス ＵＳＡ８４：３９６２１９８７。ＣａＣｌ2沈澱、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを用いたＤＮＡのプロトプラストへの直接摂取もまた報告されている。ヘイン（Hain）ら、分子遺伝子遺伝学１９９：１６１（１９８５）及びドラパー（Draper）ら、植物細胞生理学２３：４５１１９８２。プロトプラスト及び、全細胞及び組織のエレクトロポレーションについても説明されている。ドン（Donn）ら、植物細胞及び組織培養に関する第７回国際会議ＩＡＰＴＣの要約において、Ａ２−３８、５３ページ１９９０；ドハルイン（D'Halluin）ら、植物細胞４：１４９５
−１５０５（１９９２）及びスペンサー（Spencer）ら、植物分子生物学２４：５１−６
１１９９４。
【００６２】
本発明によれば、どの型の遺伝子導入ジカンバー耐性植物も産出することができる。特に、現在のところジカンバの被害を受けていることが知られている広葉植物（インゲン豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、タバコ、果樹及び観葉植物及び観葉樹木を含む）の形質転換を行い、それらの植物が除草剤に対し耐性を有するようにすることができる。現在ジカンバに対し耐性があると考えられている他の植物（例えば、トウモロコシ、モロコシ類、小穀粒、サトウキビ、アスパラガス及び草）も形質転換し、除草剤に対する耐性を増加させることができる。「耐性がある」とは、形質転換された植物が、形質転換されていない植物の成長を阻害する量のジカンバの存在下で成長することができることを意味する。
【００６３】
本発明のジカンバ−分解オキシゲナーゼは、ジカンバを分解する遺伝子導入宿主細胞及び生物体において見出された内因性のレダクターゼとフェレドキシンと共に機能することができると考えられる。植物葉緑体は特にレダクターゼ及びフェレドキシンが豊富である。従って、遺伝子導入ジカンバー耐性植物を産出するための好ましい実施の形態では、ジカンバ−分解オキシゲナーゼを葉緑体内に導くペプチドの遺伝暗号を指定する配列（「葉緑体標的配列」）を使用する。葉緑体標的配列の遺伝暗号を指定するＤＮＡは、好ましくはジカンバ−分解オキシゲナーゼの遺伝暗号を指定する配列の上流（５’）に位置するが、暗号づけ配列の下流（３’）に位置してもよく、あるいは暗号づけ配列の上流、下流両方に位置してもよい。葉緑体標的配列の例としては、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列ベッカー（Becker）ら、植物分子生物学２０：４９（１９９２）及びＰＣＴ ＷＯ ９７／４１２２８を参照のこと、及びエンドウグルタチオンレダクターゼシグナル配列（クライセン（Cre issen）ら、植物ジャーナル２：１２９１９９１及びＰＣＴ ＷＯ ９７／
４１２２８を参照のこと）が挙げられる。
【００６４】
代わりの好ましい実施の形態では、葉緑体内で機能するプロモータを含む構成を用いて葉緑体の直接形質転換が行われ、葉緑体内でオキシゲナーゼの発現が得られる。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ ＷＯ ９５／２４４９２及び米国特許第５，５４５，８１８号を参照のこと。
【００６５】
更に別の実施の形態では、この発明は、遺伝子導入ジカンバー耐性植物が成長する畑での雑草の制御方法を提供する。この方法は、有効量のジカンバを畑に適用して雑草を制御する工程を含む。ジカンバの適用方法及び様々な型の雑草を制御するのに有効なジカンバの量は周知である。作物保護基準、１８０３−１８２１ページ（ケミカル＆ファーマソイティカルプレス社、ニューヨーク、ＮＹ、１１版、１９９５）を参照のこと。
【００６６】
他の実施の形態では、この発明は土壌、水、あるいはジカンバ製造設備の老廃物などの
物質中に存在するジカンバを分解する方法を提供する。そのような分解は、この発明のジカンバ−分解酵素を用いて達成することができる。酵素は、酵素を自然に発現させる微生物から精製することができ実施例１を参照のこと、あるいは酵素を産出する形質転換宿主細胞から精製することができる。酵素をそのような方法に用いる場合、適当な補助因子も提供しなければならない実施例１を参照のこと。有効量は当業者に周知なように経験的に決定することができる実施例１を参照のこと。その代わりに、遺伝子導入原核微生物及び真核微生物を使用して、そのような物質中のジカンバを分解することもできる。遺伝子導入原核微生物及び真核微生物は以上で説明したように産出することができ、有効量は当業者に周知なように経験的に決定することができる。
【００６７】
ジカンバは大量に、連続的に環境に導入される。ジカンバの除去は大部分が、地球の土壌及び水中に存在する微生物中で見出された酵素系の作用に依存している。ジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ及びその３つの成分を含むこれらの酵素系を理解することが、汚染された土壌、水及び他の物質の生物治療及び回復のために自然のまたは遺伝的に修飾した微生物を開発しようとする場合、重要である。このように、本発明のジカンバ−分解酵素、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ構成、などはジカンバ分解及び生物治療の研究のための調査ツールとして使用することができる。
【００６８】
最後に、この発明のジカンバ−分解酵素はジカンバの分析に使用することができる。ジカンバを含むと考えられるサンプルをジカンバ−分解Ｏ−デメチラーゼ、またはジカンバ−分解オキシゲナーゼと、ジカンバ−分解フェレドキシンと、ジカンバ−分解レダクターゼとの組み合わせと共に混合する。適した分析が実施例１で説明されている。特に、３，６−ＤＣＳＡの生成による蛍光の検出または定量は好都合な分析に役立つ。
実施例
実施例１． シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼの成
分の精製とキャラクタリゼーション方法と材料細菌と成長条件
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株（クルーガーら、（１９８９）農芸食物化学ジャーナル３７：５３４−５３８）を、ジカンバに持続的に汚染された土壌から単離した。細菌はイリノイののテクノロジー会社（シカゴ、ＩＬ）のダクラス コーク（DouglasCork）博士により提供され、還元塩化物培地で維持しクルーガー、Ｊ．Ｐ、１９８９、Ｐｈ．Ｄ．論文、イリノイテクノロジ-研究所、シカゴ、ＩＬ、ジカンバ（２ｍｇ／ｍｌ）
またはグルコース（２ｍｇ／ｍｌ）とカザミノ酸（２ｍｇ／ｍｌ）の混合物のいずれかを追加した。炭素源を細菌濾過器で殺菌し、培地を加圧蒸気滅菌した後、その培地に添加した。固体培地は１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のゲルライト（スコット研究所、ウエストウォリック、Ｒ．Ｉ）を添加することにより調製した。
薬品及び試薬
ジカンバ、３，６−ＤＣＳＡ、［１４Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−１４Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、放射化学的純度は９８％を超える）はサンドツ アグロ（Sandoz Agro）社（デスプレイネス、ＩＬ）から供給された。溶解性を増加させるため、ジカンバ及び３、６−ＤＣＳＡ保存液を、ＫＯＨを用い滴定してｐＨ７．０に調製した。特に記載が無ければ、薬品は全てシグマ ケミカル(Sigma Chemical)社（セントルイス、ＭＯ）から購
入した。ＦＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）用のスーパーロース（Superose）１２、Ｍｏｎｏ Ｑ，Ｑ−セファロース（ファーストフロー）およびフェニル−セ七ファロー
ス（ＣＬ−４Ｂ）カラム充填物はファーマシア（Pharmacia）ミルウォーキー、ＷＩから
得た。両性電解質ｐＨ４−６と両性電解質ｐＨ４−９はセルバ（Serva）ハイデルベルグ
、ＦＲＧから購入した。アクリルアミド、β−メルカプトエタノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び過硫酸アンモニウムはバイオ−ラッド（Bio-Rad）研究所（ヘルクレス、ＣＡ）から購入した。薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）プレートはＵＶ２５４指示薬を含むシリカゲル（厚さ２５０μｍ）であり、Ｊ．Ｔ．ベイカーケミカル（Baker Chemical）社（フィリプスバーグ、ＮＪ）から購入した。
酵素分析 ジカンバＯ−デメチラーゼ活性は［14Ｃ］ジカンバからの［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡの形成を測定することにより分析した。簡単に説明すると、酵素成分の混合物中での活性は３０℃において、２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＨ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元
型）と、０．５ｍＭの硫酸鉄（ＩＩ）と、５０μＭの冷ジカンバと、２．５μＭの［14Ｃ］ジカンバ（放射性ジカンバの最終比活性は１．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌであった）と、異なる量の細胞溶解物または部分的に精製した酵素とを含む標準３００μｌ反応混合物中で測定した。最終精製工程中の全ての酵素分析はリン酸緩衝液中で行った。ジカンバＯ−デメチラーゼ活性に対する最適ｐＨはリン酸緩衝液の中央範囲であることが見出され、ｐＨ７．０のトリス−ＨＣｌ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド］に比ベリン酸緩衝液を用いるとより高い酵素活性が観察されたからである。反応は基質であるジカンバを添加することにより開始した。特定の時間で、５０μｌの５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＨ2ＳＯ4を添加して反応を止めた。その後、ジカンバ及びジカンバ代謝物を１体積のエーテルで２度抽出し、抽出物を蒸発させ乾燥させた。抽出手順の回収効率（平均±標準偏差）はジカンバで８７％±２％、３，６−ＤＣＳＡで８５％±３％であったヤングら、分析生物化学２１８：３７−４２１９９４))。
【００６９】
［14Ｃ］ジカンバ及び［14Ｃ］−標識代謝物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した。エーテル−抽出ジカンバ及びその代謝物を５０μｌのエーテルに再溶解させ、ＴＬＣプレート上にスポットとしてつけた。ＴＬＣで移動する溶剤系はクロロホルム−エタノール−一酢酸とした。分離した反応生成物は、ＴＬＣプレートを蛍光体スクリーンに２４時間曝し、その後そのスクリーンを蛍光体イメージ器（モレキュラーダイナミクス、サニーベール、ＣＡ）において走査することにより可視化し、定量した。ＴＬＣプレート上の特別のスポット中の放射能の量は、周知の量の［14Ｃ］ジカンバを含む同じプレート上の１つのスポットに対し、そのスポット内の総画素数を比較することにより決定した。活性の１つの単位は、３０℃で、１分につき、ジカンバから１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡの形成を触媒する酵素の量として規定した。比活性は分析混合物の総タンパク質濃度を基本とした。
【００７０】
ジカンバジメチラーゼのレダクターゼ成分の活性は、日立のＵ−２０００分光光度計を用いて２，６−ジクロロフェノリンドフェノール（ＤＣＩＰ）の還元を測定することにより分析した。反応は、総体積１ｍｌ中に、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２ｍＭのＦＡＤフラビンアデニンジヌクレオチド、５０μＭのＤＣＩＰ、２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０、１０−１００μｌの酵素サンプルを含んだ。時間経過に伴う６００ｎｍでの吸光度の変化を室温で測定した。比活性は還元ＤＣＩＰに対し、２１．０ｍ・Ｍ-1・ｃｍ-1の６００ｎｍでの吸光率を用いて計算した。比活性は還元ＤＣＩＰｎｍｏｌ／タンパク質ｍｇで表した。
【００７１】
さらに、ｉｎ ｓｉｔｕＤＣＩＰ分析を使用して、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上で
分離したタンパク質試料中のレダクターゼ活性を検出し、位置を確認した。ＩＥＦゲル上でのタンパク質の電気泳動後、ゲルから切り取ったレーンを２０ｍｌの冷ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。低融点アガロースを１０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０中で加熱することにより溶解し、最終濃度１．５％（ｗ／ｖ）とした。アガロースを室温付近の温度まで冷却すると、０．２ｍＭのＦＡＤと、５０μＭのＤＣＩと、０．５ｍＭのＮＡＤＨとを追加した。分析混合物をガラスプレート上に注ぎ、固化させた。ゲル片を固化させた反応混合物上に置き、室温で１０分間静置した。ゲル薄片がレダクターゼ活性を有するタンパク質を含んでいると、還元ＤＣＩＰの無色バンドがＤＣＩＰの青色バックグラウンド中に生成した。
細胞溶解物
細胞は、回転振とう培養機（３０℃で２５０ｒｐｍ）で、グルコースとカザミノ酸の混
合物を含む液体還元塩化物培地中で、５５０ｎｍで１．３から１．５の光学密度が得られるまで増殖させた。細胞は遠心分離により採取し、冷１００ｍＭ ＭｇＣｌ2で２度洗浄し、再び遠心分離にかけた。細胞ペーストは液体窒素中で直ちに冷凍して使用するか、あるいは−８０℃で保存した。酵素精製時に、２５ｇの冷凍細胞を解凍して、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＥＤＴＡとを含む５
０ｍｌの単離緩衝液中に再懸濁させた。フェニルメチルスルホニルフルオリド及びジチオスレイトールを、それぞれ最終濃度が０．５ｍＭ及び１ｍＭとなるまで添加した。１０ｍｇのリソチームと１ｍｇのＤＮアーゼを添加した後、細胞を１０分間氷上で撹拌し、氷上で、２０秒の群発と４０秒の静止間隔を１２回行う中間セッティング（セッティング５）で、音波処理（モデルＸＬ２０２０音波計；ヒートシステムズ）することにより粉砕した。得られた細胞溶解物は単離緩衝液を用いて９０ｍｌとなるまで希釈し、４℃、７６，０００ｘｇで１時間、遠心分離にかけた。上清を用いて清んだ細胞溶解物源とした。
酵素の精製
特に記載がなければ、全ての手順は４℃で行った。常に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムを９０ｍｌ体積の清んだ細胞溶解物にゆっくりと添加し、４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）飽和とした。１５分の撹拌後、混合物を１５，４００ｘｇで１５分間遠心分離にかけ、沈澱を廃棄した。さらに、上清を常に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムを添加し７０％（ｗｔ／ｖｏｌ）飽和とした。１５分の撹拌の後、混合物を前記条件下で遠心分離にかけた。上清を廃棄し、沈澱を最小体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス[ｐＨ８．０]、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５）ｍＭのＥＤＴＡ、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のグリセロール、
１ｍＭのジチオスレイトール）中に再懸濁させた。
【００７２】
その後、４０−７０％の硫酸アンモニウム切片を、ＦＰＬＣ装置（ファーマシア）に接続されたフェニル−セファロースカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）上に負荷し、１０％（ｗ／ｖ）から０％（ｗ／ｖ）までの（ＮＨ4）2ＳＯ4の線形減少勾配を用いて溶離した。
カラムは１０％（ｗｔ／ｖoｌ）硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａを用いて予め平衡させ
た。流速は１ｍｌ／分とした。カラム溶離中にＡ280でタンパク質濃度を連続的にモニタ
した。基線Ａ280示数が得られるまで、カラムを１２０ｍｌの１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫
酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで洗浄した。結合タンパク質は緩衝液Ａ中の減少勾配の（ＮＨ4）2ＳＯ4［総体積２１０ｍｌ中１０から０％（ｗｔ／ｖｏｌ）までの（ＮＨ4）2Ｓ
Ｏ4］を用いて溶離した。２ｍｌの画分を収集した。非放射性ジカンバを基質として使用
した場合を除き、１０μｌのアリコットを各画分から取りだし、標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析混合物（前述部を参照のこと）に添加した。ジカンバＯ−デメチラーゼ活性は、暗室で手持ちのＵＶランプ（３１２ｎｍ、フォトダイン）を用いてジカンバの高蛍光反応性生物３，６−ＤＣＳＡへの転化をモニタすることにより検出した。
【００７３】
この手順により、ジカンバＯ−デメチラーゼを別個の成分（成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩとする）を含む３つのプールに分離することができた。各成分はジカンバＯ−デメチラーゼ活性に対し本質的なものである以下を参照のこと。単一成分を分析する場合、他の２つの成分は過剰に供給した。単一型の活性を含む画分をプールした成分Ｉ、画分１２８−１４５；成分ＩＩ、非結合画分１２−３３；成分ＩＩＩ、画分６２−９２。
【００７４】
（ｉ）成分Ｉの精製 成分Ｉ活性を含む画分（０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4でフェニル−セファロースカラムから溶離、画分１２８−１４５）をプールし、総体積３４ｍｌとした。このプールサンプルをセントリプレプ（Centriprep）−１０装置（アミコン(Amicon)）により１０ｍｌまで濃縮し、その後、緩衝液Ａで平衡され８０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄されたＱ−セファロース（ファーストフロー）ＦＰＬＣカラム（ファーマシア）２．５ｃｍ×６ｃｍに適用した。カラムに結合したタンパク質を緩衝液Ａ中の０から０．６Ｍの線形勾配ＫＣｌ、１００ｍｌを用いて溶離した。画分を１．５分間隔で収集した。成分Ｉ活性を示すそれらの画分（画分２９−３７）をプールし、４℃で一晩中緩衝液に対し透析し、緩衝液
Ａ中のＭｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５ＦＰＬＣアニオン交換カラムに適用した。増加勾配濃度（０から０．５Ｍ）のＫＣｌ ５０ｍｌを用いて１ｍｌ／分でタンパク質を溶離した。成分
Ｉ活性を示す画分（画分１９から２５まで）をプールし、セントリコン−１０装置で遠心分離により０．４ｍｌまで濃縮した。濃縮サンプルはその後、スーパーロース１２ＦＰＬＣカラム（１．６×５．０ｃｍ）上で、流速０．２ｍｌ／分、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａを用い、クロマトグラフィーにより分離した。成分Ｉ活性を示す画分７−１０をプールし、セントリコン−１０装置における遠心分離により濃縮した。
【００７５】
部分的に精製した成分Ｉを冷１％（ｗ／ｖ）グリシンで希釈し、セントリコン−１０装置における遠心分離により３倍に濃縮し、脱塩しＩＥＦ電気泳動の準備をした。脱塩、濃縮サンプルをその後、６％（ｗ／ｖ）ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲルに適用し、４℃で１時間電気泳動を行った下記参照。電気泳動の後、ゲルを２５ｍＭの冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間洗浄し、ゲルレーンの各薄片を小片（６ｍｍ×４ｍｍ）に切断した。タンパク質を切断ゲル画分から、その切断ゲル核分を１０μｌの２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の存在下ピペット先端を用いてすりつぶすことにより、溶離した。各セグメントからのタンパク質を過剰の成分ＩＩと成分ＩＩＩと混合し、ジカンバＯ−ジメチラーゼ活性の分析を行った。成分Ｉ活性を示したゲルセグメント（これもまた赤茶色であった）を１２・５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上に負荷し、サンプル純度を確認した。
【００７６】
（ｉｉ）成分ＩＩの精製
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩは４℃で一晩中緩衝液Ａに対し透析し、ＦＰＬＣ Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に適
用した。サンプル溶離条件は、溶離勾配を緩衝液Ａ中０から１ＭＫＣｌとしたことを除き、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩ活性を示す画分（画分３０−３７）をプールし、緩衝液Ａに対し透析し、０．４ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣスーパーロース１２カラム（１．６×５０ｃｍ）に適用した。サンプル適用及び溶離手順は成分Ｉについて以上で説明したものと同一であった。成分ＩＩ活性を示す画分（画分３−６）をプールし、同量の緩衝液Ａで希釈し、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ カラムに適用した。成分Ｉの
場合と同じＫＣｌ勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離した。画分２０−２５は成分ＩＩ活性を示した。部分的に精製した成分ＩＩをさらに、成分Ｉについて説明したのと同じ条件を用いてＩＥＦ（ｐＨ４−６）電気泳動により精製した。成分ＩＩ活性を示すゲルセグメントを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷し、さらに分析した。
（ｉｉｉ）成分ＩＩＩの精製
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩＩは４℃で一晩中緩衝液Ａに対し透析し、ＦＰＬＣ Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に
適用した。条件は、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩＩ活性を示す画分（画分２６−３８）を緩衝液Ｂ［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール］に対
し透析し、５ｍｌに濃縮した。青色染料親和性マトリクス［シバルコンブルー（Cibarcon
Blue）３ＧＡ型３０００シグマ］をＦＰＬＣカラム（１×５ｃｍ）に充填し、２０ｍｌ
の緩衝液Ｂを用いて平衡させた。濃縮成分ＩＩＩを青色染料カラム上に負荷し、カラム廃液のＡ280が基線レベルに到達するまで、流速０．２ｍｌ／分で２０ｍｌの緩衝液Ｂで洗
浄した。その後、結合タンパク質を緩衝液Ｂ中の５ｍＭのＮＡＤＨを用いて溶離した。レダクターゼ活性を含む画分を、過剰の成分Ｉ及び成分ＩＩの存在下でのジカンバＯ−デメチラーゼ活性分析により、ＮＡＤＨの存在下での各画分のＤＣＩＰ還元能力により検出した。両方の分析において強いレダクターゼ活性を有する画分をプールし、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａに対し透析し、０．２ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣスーパーロース１２カラムに適用した。スーパーロースカラムの移動には、成分Ｉについて説明したのを同一の条件を使用した。ＤＣＩＰ還元を触媒したタンパク質を含む画分をプールし、緩衝液Ａに
対し透析し、ＦＰＬＣ Ｍｏｎｏ Ｑ カラムに適用した。成分Ｉに対するのと同じ条件を
用いてタンパク質を溶離した。部分的に精製した成分ＩＩＩをさらに、ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲル電気泳動により精製した。ＩＥＦゲル内のタンパク質のレダクターゼ活性を、以上で説明したように、アガロースゲル被膜内のＤＣＩＰ還元分析により検出した。成分ＩＩ活性を示したゲルセグメントを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷しさらに分析した。
ＮＨ2−末端アミノ酸配列の決定
成分Ｉ、成分ＩＩ、または成分ＩＩＩを有するとＩＥＦゲル上で同定されたタンパク質バンドを摘出し、１２．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳポリアクリルアミドゲルのへこみに載せた。電気泳動後、精製したタンパク質を含むゲル薄片をトランス−ブロッドセル（バイオ−ラッド、リッチモンド、ＣＡ）中のＰＶＤＦ（ポリビニリデンジスルフィド）膜（ミリポア）上に、２５Ｖで１６時間、密着印画した。ブロッティング緩衝液は１０ｍＭのＣＡＰＳ［３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸を含む、ｐＨ１０．０の２０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液とした。配列決定は、応用バイオシステム社の４２０ＩＩ機器を用いて、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解（エドマン及びヘンシェン（Henschen）１９７５２３２−２７９ページ、Ｓ．Ｂ．ニードルマン（Needleman）編集、タンパク質
配列決定、第２版、スプリンガー−ベルラージ(Springer-Verlarge)、ニューヨーク）に
より実行した。
タンパク質濃度の定量
タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準に用い、ブラッドフォード（Bradford）の方法１９７６、分析生物化学７２：２４８−２５４、により決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
レムリ（Laemmli）の改良方法（レムリ（１９７０）ネイチャー２２７：６８０−６８
５）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。８５×６５×０．７５ｎｍの１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳゲルを以下の様に作製した。泳動ゲルは２．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス溶液３７：５：１、１ｍｌの泳動緩衝溶液[３Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ８．８、０．８％（ｗ／ｖ
）ＳＤＳ]、４．５ｍｌのＨ2Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、４０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。スタッキングゲルは、０．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス、０．５ｍｌのスタッキング緩衝溶液[１Ｍのトリス−ＨＣｌｐＨ６．８、０．８％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳ]、３ｍｌのＨ2Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、１２．５μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。泳動緩衝液の組成は２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３、０．２Ｍのグリシン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳとした。サンプル緩衝液は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に、０．２５ｍｌのスタッキング緩衝液、０．６ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２ｍｌのβ−メルカプトエタノール、及び０．９５ｍｌの０．１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）を含んだ。電気泳動は、バイオ−ラッド ミニゲル（Bio-Rad Mini Gel）装置で８０Ｖで、先導色素がゲルの陽極端から０．５ｃｍの所に移動するまで、実
行した。タンパク質は、３：６：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のイソプロパノールと水と酢酸との混合物中の０．１％（ｗ／ｖ）のクーマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）Ｒ−２５０により染色した。脱色は７：８３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のメタノールと水と酢酸との混合物中で行った。標準タンパク質（ギブコ（Gibco）ＢＲＬ）はミオ
シン２１４．２ｋＤａ、ホスホリラーゼＢ１１１．４ｋＤａ、ウシ血清アルブミン７４．２５ｋＤａ、卵白アルブミン４５．５ｋＤａ、炭酸脱水素酵素２９．
５ｋＤａ、β−ラクトグロブリン１８．３ｋＤａ、及びリソチーム（１５．４ｋＤａ
）を含んだ。
分子量の決定
変性条件下でのペプチドの分子量（Ｍr）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて評価した。
本来の成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分子量を、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａ中、０．２ｍｌ／分の流速で、スーパーロース１２ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（ファーマシア）を介したゲル濾過により評価した。基準タンパク質はバイオ−ラッドからのゲル濾過標準とした。基準タンパク質は、ウシチログロビン６７０ｋＤａ、ウシガンマグロビン１５８
ｋＤａ、ニワトリ卵白アルブミン４４ｋＤａ、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ−１２（１３５ｋＤａ）とした。スーパーロース１２カラムの空隙容量はブルーデキストラン（Blue Dextran、Ｍrは２，０００，０００、シグマ）を用いて計算した。
ＩＥＦ
Ｃ．Ｂ．Ｓサイエンティフィック社（デル マー、ＣＡ）からの垂直ミニ−ゲル装置（
モデルＨＭＧＶ−１００）等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動を行った。６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドを含むＩＥＦゲル（７０×９０×１ｍｍ）は、以下のものを混合することにより作製した：１．６ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス（３７：５：１）と、０．８ｇのグリセロールと、０．３２ｍｌの両性電解質ｐＨ４−６（サーバ：Serva
）と、０．０８ｍｌの両性電解質ｐＨ４−９（サーバ）と、５．２ｍｌのＨ2Ｏ、１０μ
ｌのＴＥＭＥＤと、８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ。陰極緩衝液は１００ｍＭのβ−アラニン、陽極緩衝液は１００ｍＭの酢酸とした。約１から１０μｌの１％（ｗ／ｖ）グリシン中のタンパク質サンプルは等量のサンプル緩衝液［５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１．６％（ｖ／ｖ）の両性電解質ｐＨ４−９、２．４％（ｖ／ｖ）の両性電解質４−６］と混合した。サンプルはゲルの陰極端に負荷し、２００Ｖで１．５時間、４００Ｖで更に１．５時間、移動させた。タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに対し以上で説明した手順を用い、クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。ＩＥＦ標識（シグマ）は、アミログルコソダーゼ、ｐＩ３．６；グルコースオキシダーゼ、ｐＩ４．２；トリプシン阻害因子、ｐＩ４．６；β−ラクトグロブリンＡ、ｐＩ５．１；炭酸脱水素酵素ＩＩ、ｐＩ５．４；炭酸脱水素酵素ＩＩ，ｐＩ５．９および炭酸脱水素酵素Ｉ、ｐＩ６．６とした。
速度論的分析
ジカンバＯ−デメチラーゼにより触媒される脱メチル反応の速度論について、一定濃度の酵素の存在下、基質であるジカンバの濃度を増加させ、反応の初期速度を分析することにより研究した。反応混合物は２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ4と、２５μｇの部分的に精製したＯ−デメチラーゼ酵素［清んだ細胞溶解物からの４０％−７０％（ｗ／ｖ）ＮＨ42ＳＯ4画分］と、様々な濃度（０．５から５０μＭ）のジカンバと、様々な濃度
（０．０２５から２．５μＭ）の［14Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−14Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏ１）とを、総体積３００μｌ中に含んだ。０．５μＭと１μＭのジカンバ濃度を用いて分析するために、反応体積を９００μｌまで増加させ、十分な放射性ジカンバとその代謝物を存在させ検出可能なようにした。これらの反応では、反応内の他の全ての成分量は３倍にした。各ジカンバ濃度において異なる時間の時点で、ホスファーイメージャーＳＦを用いてＴＬＣプレートに２４時間曝された蛍光体スクリーン上の放射能を走査することにより、［14Ｃ］ジカンバの[14Ｃ]３，６−ＤＣＳＡへの転化の定量を行った。活性の１単位は、３０℃における１分あたり１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡを形成する酵素量と規定した。各反応の初速度は、各基質濃度において反応速度対時間をプロットすることにより決定した。データはミカエリス−メンテン速度論をモデルとし、Ｋm及びＶmaxの値は、シグマプロット（登録商標、SigmaPlot）ジャンデルサイエンティフィック(Jandel
Scientific)、コルトマデラ、ＣＡを用いて、ラインウィーバー−バークプロットにフィッティングさせることにより決定した。
酸素の必要性
クラーク酸素電極を用いた予備実験により、基質にジカンバを用いた標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析中に酸素が消費されることが示唆された。ジカンバＯ−デメチラーゼによるジカンバのＯ−脱メチルにおける酸素の必要性を証明するために、反応は１ｐｐｍ未満の酸素を含む嫌気性チャンバ内で行った。反応混合物から酸素を排除する手順は４℃で行った。酵素を含まない反応混合物をバイアル中に入れ、ゴム栓で密閉した。酸素を排除するために、バイアルは２度真空により排気し、その都度窒素でフラッシングした。３度目の排気後、バイアルを９０％の窒素と１０％の水素を用いてフラッシングした。同様に、酵素溶液から酸素を除去した酵素溶液に気泡が入らないように注意して。反応混合物及
び酵素溶液の両方を嫌気性チャンバ内（９５％のＮ2−５％のＨ2雰囲気）に移した。２４０ｍｌの清んだ細胞溶解物を微量注射器を用いてゴム栓を介して注入し、９６０μｌの酸素を含まない反応混合物と静かに混合した。反応は３０℃で行った。
【００７７】
ＴＬＣプレート上の反応生成物を調べると、嫌気性［14Ｃ］ジカンバからの［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡ生成速度は、同量の酵素を用いて好気性条件下で得られた反応速度を大きく下回った。嫌気性条件下では、１時間以内では、ジカンバから３，６−ＤＣＳＡへの転化は実質的には起こらなかった。しかしながら、平行反応混合物を３０分後に嫌気性チャンバから取りだし空気で培養すると、かなりの量のＯ−デメチラーゼ酵素錯体の成分の１つはオキシゲナーゼであった。
【００７８】
［14Ｃ］ジカンバから［14Ｃ］３，６−ＤＣＳＡへの生体外転化は以前に証明された生体内転化経路（コーク及びクルーガー、先進応用微生物学３６：１−６６１９９１；ヤングら、分析生物化学２１９：３７−４２１９９４）によく似ていることに注意すべきである。これらの研究では、ＴＬＣ及びキャピラリー電気泳動の両方によりＤＣＳＡが反応生成物であると同定された。生体内及び生体外の両方でジカンバ分解の第１主生成物がＤＣＳＡであるという厳格な同定は、ガスクロマトグラフィー−質量分析により得られている。
成分と補助因子の必要性
フェニル−セファロースカラムクロマトグラフィーによるジカンバＯ−デメチラーゼの３成分の初期分離後、部分的に精製した試料を個々に、Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）上での１回の追加精製により取り出した。サンプルを緩衝液Ａ中、Ｑ−セファロース（ファーストフロー）高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム（ファーマシア）に適用し、１００ｍｌの０から０．６ＭまでのＫＣｌ線形勾配（オキシゲナーゼ成分に対し）を用い、あるいは０から１．０ＭまでのＫＣｌ（フェレドキシン及びレダクターゼ成分に対し）を用いて、１．５ｍｌの画分中で溶離した。オキシゲナーゼ精製に対する分離カラムから適当にプールした画分画分２９から３７まで、フェレドキシン精製に対する画分画分３０から３７まで、あるいはレダクターゼ精製に対する画分（画分２６から３８まで）を使用して、成分及び補助因子の必要性の決定を行った。
【００７９】
３成分は様々な組み合わせでＯ−デメチラーゼ活性の分析を行い、成分の必要性を決定した。
補助因子の必要性を決定するために、３成分と［14Ｃ］ジカンバとの混合物を用いて、３０℃で３０分間、Ｏ−デメチラーゼ活性の分析を行った。反応混合物中の、（最適比率の）部分的に精製されたタンパク質の量は、８５μｇのオキシゲナーゼと、５５μｇのフェレドキシンと、５０μｇのレダクターゼであった。反応混合物中で使用した補助因子の濃度は０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．２ｍＭのＦＡＤと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ3と、１
０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨと、０．２ｍＭのＦＭＮであった。
結果
成分Ｉ
フェニル−セファロースカラムに最も強く結合したジカンバＯ−デメチラーゼの成分（最初成分Ｉと称し、後にオキシゲナーゼであることが同定された）は明確な赤茶色を示した。これにより、鉄−硫黄クラスターまたはヘム基を含むタンパク質の存在の可能性が示唆された。フェニル−セファロースカラムからの成分Ｉ活性を有する画分について、Ｑ−セファロース（ファーストフロー）及びＭｏｎｏ Ｑクロマトグラフィーにより更に精製
し、スーパーロース１２サイズ排除カラム上で分離した。その後更にＩＥＦゲル上で成分Ｉタンパク質を精製した。
【００８０】
ＩＥＦゲル上の主要バンド（見かけのｐＩが約４．６である）からタンパク質を摘出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより残りの微量不純物から単離した。ＩＥＦにより精製した後に得
られた主成分Ｉタンパク質の純度は、クーマシーブルーで染色したこのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃度分析から判断すると、９０％を超えた。
【００８１】
見かけの分子量が約４０，０００ダルトンの優性タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列の結果から、Ｎ−末端領域の最初の２９のアミノ酸が以下の配列で存在していることが示唆された括弧内の残基が最も良い推測である：
Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp またはThr) (Pro) ［配列番号１］
様々なデータベース中のアミノ酸配列と比較すると、他のモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼについて報告されているＮＨ2−末端配列とほとんどあるいは全く相同性
が見られないことが示唆された。
成分ＩＩ
フェニル−セファロースカラムに結合しなかったタンパク質核分は成分ＩＩと称した。この黄色がかった画分は、分析を成分Ｉと成分ＩＩＩと組み合わせて実行すると、クロストリジウム・パストリアヌムからのフェレドキシンと置換することができた（しかし、反応速度は遅くなる）ので、仮にフェレドキシン−含有画分と称した。クロストリジウムフェレドキシンは明らかに成分ＩＩの代わりに機能したが、これらの実験で使用した成分ＩＩの不純性が高いとすると、クロストリジウム酵素の効率は、ＤＩ−６株からの推定フェレドキシンの効率よりもかなり低い。特に、５５μｇの部分的に精製した成分ＩＩを過剰の成分Ｉ及び成分ＩＩＩと共に混合したものでは、ジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの転化が触媒され、約５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の速度が得られたが、１００μｇのクロストリジウムからの高精製フェレドキシンではその活性は０．６ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1にすぎなかった。
【００８２】
Ｑ−セファロース（ファーストフロー）クロマトグラフィー、スーパーロース１２ゲル濾過及びＭｏｎｏ Ｑ クロマトグラフィーを含む精製工程により、最初の２５ｇの細胞ペーストから約１ｍｇの精製タンパク質が得られた。この画分をオキシゲナーゼ成分と同様に、ＩＥＦゲル上で電気泳動を行い、その後活性ＩＥＦ画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することにより精製した。
【００８３】
ＩＥＦゲルのセグメントから溶離したタンパク質における成分ＩＩ活性の分析により、約３．０のｐＩを有する画分は成分ＩＩ中に活性タンパク質を含んでいることが示唆された。このゲル薄片からのタンパク質を溶離しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをクーマシブルーで染色すると、分子量のより低いタンパク質のしみに加えてタンパク質の１つの顕著なバンドが現れた。見かけの分子量が約２８，０００ダルトンの顕著なタンパク質をＰＶＤＦ膜上に密着印画した。
【００８４】
アミノ酸配列決定から以下の２０のアミノ酸のＮ−末端配列が明らかになった。
Thr Tyr Val Val Thr Asp Ala Xaa Ile Lys Xaa Lys Tyr Met Asp Xaa Val Glu Val Xaa ［配列番号２］
成分ＩＩＩ
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩは高濃度の（ＮＨ4）2ＳＯ4中のフェニル−セ
ファロースカラム上に保持され、約４％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ4）2ＳＯ4で溶離された。こ
の明るい黄色の画分は、酸化チトクロームｃ及びＤＣＩＰをＮＡＤＨの存在下で還元する能力から、及び成分Ｉと成分ＩＩを用いた分析でブタの心臓からのチトクロームｃレダクターゼ（タイプＩ、シグマ）により置換することができるため、レダクターゼ含有画分であると仮に同定された。この組の反応では、５０μｇの部分的に精製した成分ＩＩＩを使用し、過剰の成分Ｉ及びＩＩと混合すると、約５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の反応速度が得られた。高精製チトクロームｃレダクターゼは反応において約２．５ｎｍｏｌｍｉｎ-1ｍｇ-1の比活性を示した。この活性は、これらの分析で使用した粗成分ＩＩＩの不純性を考
えると、成分ＩＩＩにより得られる活性よりもかなり低い。さらに、成分ＩＩＩは、ＮＡＤＨの存在下、チトクロームｃまたは２，６−ジクロロフェニル−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）と共に培養するとレダクターゼ活性を示した。成分Ｉ及び成分ＩＩのどちらも、これら２つのレダクターゼ分析のいずれにおいても、活性を示さなかった。
【００８５】
Ｑ−セファロースファーストフロー、青色染料親和性マトリクス、スーパーロース１２、及びＭｏｎｏ Ｑ充填材を含むカラム上でのクロマトグラフィーにより、この画分をさ
らに精製すると、レダクターゼ活性を有する画分中の少量のタンパク質が得られた。成分ＩＩＩタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離及びクーマシーブルーによる染色後の活性タンパク質画分の濃度分析により判断すると、約７０％であった。
【００８６】
さらに成分ＩＩＩの精製を激化するために、Ｍｏｎｏ Ｑカラム段階からの２つの異な
るタンパク質画分は、フェレドキシン成分とオキシゲナーゼ成分とを用いて分析すると、レダクターゼ活性を含むことを見出した。ＩＥＦゲル上での電気泳動によりこれらの２つの画分をさらに精製すると、２つの画分のレダクターゼ活性は明確に異なる等電点を有することが明らかになった。これは、２つのレダクターゼ画分のそれぞれを含むレーンをＩＥＦゲルから摘出し、この薄片をＤＣＩＰ反応混合物を含む低融点アガロースのパッド上に置くことにより証明した。どちらのゲル薄片におけるレダクターゼ活性も、ＤＣＩＰのその無色の還元型へのＮＡＤＨ−依存還元により同定した。画分３５中のレダクターゼの見かけのｐＩは約５．６であったが、画分２７のレダクターゼの見かけのｐＩは約４．８であった。
【００８７】
ＩＥＦゲル薄片から単離したレダクターゼ活性はどちらも不安定で、その量は少なかった。実際、Ｍｏｎｏ Ｑカラム分別による画分３５からのレダクターゼのみが十分なタン
パク質濃度と活性を有し、更に精製及びキャラクタリゼーションが可能であった。このレダクターゼ活性を含むＩＥＦゲルからの薄片を溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより不純タンパク質から分離した。このゲル中の優先タンパク質は分子量が約４５，０００のタンパク質であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、成分ＩＩＩの分子量は、自然状態で約５０，０００ダルトンであることが示唆された。
【００８８】
ジカンバＯ−デメチラーゼの生物化学特性
ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を、温度が２０℃から５０℃、ｐＨ値が約６から９の生体外培養中に、測定した。活性のピークは３０℃で鋭く、６．５から７．５のｐＨでブロードに現れた。酵素活性は用いたｐＨ緩衝液の型に依存した。ｐＨ７では、例えば、活性はリン酸含有緩衝液の場合に比べトリス含有緩衝液の場合の方が約４０％低かった。
【００８９】
ジカンバＯ−デメチラーゼに対するＫm及びＶmaxの値は、２度の実験からのデータのミカエリス−メンテン及びラインウィーバー−バークプロットから最もフィッティングの良い曲線を生成するシグマプロット（登録商標）を用いて評価した。ジカンバのＫmは約９
．９±３．９μＭであり、反応のＶmaxは約１０８±１２ｎｍｏｌ／分／ｍｇであると判
断した。
【００９０】
３成分について、様々な組み合わせで、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性の分析を行った。どの成分も単一で分析すると酵素活性を示さなかった。実際、３成分全てを組み合わせた場合にのみ、有意の量のＯ−デメチラーゼ活性を検出することができた。成分Ｉと成分ＩＩの混合物は少量の触媒活性を示した。おそらく、微量の成分ＩＩＩが成分Ｉ画分に混入していたためであろう。
【００９１】
ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨは酵素活性を補助した。ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨよりも著しく効果的であった。酵素活性にはＭｇ2+が必要であった。Ｆｅ2+、フラビンアデニンジヌクレオ
チドＦＡＤ、及びフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの実験における部分的に精製したタンパク質試料を用いた酵素活性をほとんどあるいは全く刺激しない。最も高い活性はＮＡＤＨ、Ｆｅ2+、Ｍｇ2+及びＦＡＤの組み合わせを用いた場合に得られた。考察 シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株からのジカンバＯ−デメチラーゼは、除草剤であるジカンバ（２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）を３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ：２−ヒドロキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）へ転化する能力を持つ、３成分オキシゲナーゼ（ワング(Wang)、Ｘ−Ｚ１９９６、Ｐｈ．Ｄ．論文、ネブラスカ−リンカン大学、リンカン、ＮＥ）である。３成分のそれぞれを均一状態または均一に近い状態で単離することができる精製スキームを発明した。
【００９２】
３成分の最初の分離はフェニル−セファロースカラム上でのクロマトグラフィーにより達成した。部分的に精製した成分の酵素活性及び他の特性により、その成分がレダクターゼ、フェレドキシン及びオキシゲナーゼー多くの他の以前に研究したヘム含有及びノンヘム含有多成分オキシゲナーゼと同様の組成（バチー（Ba tie）ら（１９９２）５４３−５６５ページ、Ｆ．ミラー編集、フラボ酵素、ｖｏｌ．ＩＩＩ、ＣＲＣプレス、ボカ ラト
ン；ハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１；メイソンとカマック（Mason,Cammack）１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：２７７−３
０５；ロシュ（Rosche）ら１９９５、生物化学、生物物理学、アクタ１２５２：１７７−１７９）−であることが仮に同定できた。フェニル−セファロースカラムから単離した成分ＩＩＩはチトクロームｃと染料ＤＣＩＰの両方のＮＡＤＨ−依存還元を触媒した。さらに、成分Ｉ及び成分ＩＩと組み合わせるとジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの転化を助けることができる能力は、チトクロームｃレダクターゼと部分的に置きかえることができた。成分ＩＩは、成分Ｉと成分ＩＩＩを含む反応に対し、クロストリジウム・パストリアヌムからのフェレドキシンを添加することにより置きかえることができた。Ｏ−脱メチル反応を補助するには分子状酸素が絶対に必要であることから、残りの成分はオキシゲナーゼであることが示唆された。
オキシゲナーゼDIC
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分Ｉ（オキシゲナーゼDICと称す）を精製して均一とし
、Ｎ−末端アミノ酸配列決定を行った。得られた２９のアミノ酸残基の配列では、様々なデータバンク中の他のタンパク質配列との有意の相同性は見られなかった。しかしながら、このアミノ酸配列のから得られた情報により、縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となり、このプローブは成分Ｉ遺伝子を検出しクローン化するのに使用することができた実施例２参照。さらに、このクローンのヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列を、データベース中のタンパク質配列のアミノ酸配列と比較すると、他のオキシゲナーゼに対する強い相同性が見られた実施例２参照。
【００９３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の移動から評価したオキシゲナーゼDICの見かけの
分子量は約４０，０００ダルトンである。オキシゲナーゼの精製試料はクーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で唯一の主バンドを示し、そのバンドに含まれていたタンパク質のエドマン分解により唯一のＮ−末端種の存在が示唆された。サイズ排除カラム上での天然オキシゲナーゼDICの挙動から導かれる評価により、分子サイズ
は約９０，０００ダルトンであることが示唆される。これらの結果から、天然オキシゲナーゼはホモダイマーとして存在することが示唆される。
【００９４】
多くの多成分系のオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼ成分は（αβ）n−型サブユニッ
ト配列から成り、このサブユニット配列では、より大きなαサブユニットのサイズは約５０，０００ダルトン、より小さなβサブユニットの分子量は約２０、０００ダルトンであったハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１。これとは対照的に、ジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼ成分は分子量が約４０ｋＤａの単一サブユニットを有し、これらが自然状態でダイマーとして存在すると考えられる。この
（α）n−型サブユニット配列は、他の良くキャラクタリゼーションの行われているオキ
シゲナーゼ、例えばシュードモナス・ＳＰ．ＣＢＣ株からの４−クロロフェニルアセテート３，４−ジオキシゲナーゼマーカス（Markus）ら１９８６、ジャーナル生物化学２６１：１２８８３−１２８８８、シュードモナス・セパシアからのフタレートジオキシゲナーゼバチー（Batie）ら１９９１、生物化学ジャーナル２７４：８３３−８４２、シュード
モナス・プチダ８６からの２−オキソ−１、２−ジヒドロキノリン ８−モノオキシゲナ
ーゼロシェ（Roche）ら（１９９５）生物化学・生物物理学・アクタ１２５２：１７７−
１７９、シュードモナス・シュードアルカリゲンスからの４−カルボキシジフェニルエーテルジオキシゲナーゼデーメル（Dehmel）ら（１９９５）構築微生物学１６３：３５−４１、及びシュードモナス・プチダからの３−クロロ安息香酸３，４−ジオキシゲナーゼナカツら１９９５、微生物学（読物）１４１：４８５−４９５、において見出されたものと同様である。フェレドキシンDIC ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩ（フェレドキシンDICと称す）を、カラムクロマトグラフィーとＩＥＦの複数の工程により、均一に近い
状態まで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる最終精製により１つのタンパク質（Ｍr＝２
８，０００）の主バンドとわずかに小さなタンパク質のしみが生成した。これらは精製フェレドキシンの部分分解生成物を示しているかもしれない。
【００９５】
主タンパク質バンドから得られた２０のアミノ酸残基のＮ−末端配列を、遺伝学コンピューティンググループ（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ＷＩ）を用いて、様々なタンパク質データバンクの他のアミノ酸配列と比較すると、多くのジクラスター細菌フェレドキシンに対する強い相同性が明らかになった。例えば、シュードモナス・スツツェリ、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・キャプシュラス及びアゾトバクター・ビネランジルからのフェレドキシンの最初の２０のアミノ酸の整合及び比較により、これらのフェレドキシンのシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株からのタンパク質のＮ−末端配列との同一性はそれぞれ、６５％、６５％、６５％、６０％であることが示された。推定フェレドキシン配列中のＸａａと指定された４つの残基の同一性は不確定であった。エドマン分解生成物のクロマトグラフ上の余分のピークの位置から、これらのＸａａ残基は実際には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のシステイン残基のアクリルアミドによるアルキル化により形成したプロピオニル−システイン残基であると考えられるブルネ（Brune）１９９２分析生物化学２０７：２８５−１９０。４つのＸａａ残基
が全てシステイン残基であるとすると、細菌フェレドキシン配列の、シュードモナス・マルトフィリアからのフェレドキシンとの同一性はそれぞれ、８５％、８５％、８５％及び０％となる。
【００９６】
フェレドキシンDICに対し強い相同性を示す４つのジクラスターフェレドキシンは、タ
ンパク質のＮ−末端で、［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスター及びこれに続く［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを有していた。これにより、フェレドキシンDICは、通常ノン−ヘム多成分オキ
シゲナーゼと関連する［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するフェレドキシン成分とは明確に異なることが示唆されるハラヤマら１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：５６５−６０１；メイソンとカマック１９９２、アニュアルレビュー微生物学４６：２７７−３０５；ロシェら（１９９５）生物化学、生物物理学、アクタ１２５２：１７７−１７９。実際、ＥＰＲ（電子常磁性共鳴）スペクトル［他の場所で詳細に報告されている、キアノ(Qiano)、Ｆ、Ｘ−Ｚ．ワング、Ｐ．Ｌ、Ｄ．Ｐ．ウィークス(Weeks)、及びＪ．Ｈ．ゴルベック出版するために提出されている］の分析を行うと、フェレドキシンDICのＮ−末
端の［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスターは電子伝達において活性な酸化還元中心であることが示唆される。
【００９７】
フェレドキシンDICは、等電点が低いという点で、他の細菌フェレドキシンの典型であ
るすなわち、ｐＩは３またはわずかに３以上である。ｐＩが低いと、しばしば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で及びサイズ排除クロマトグラフィー中に、これらのタンパク
質の異常な移動をもたらすオキーフェ（O'Keefe）ら（１９９１）生物化学３０：４４７
−４５５。フェレドキシンDICの場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質の移動から、そ
の分子量は約２８，０００であると評価された。同様に、サイズ排除クロマトグラフィーにより、天然フェレドキシンDICのみかけの分子量は約２８，０００であることが示唆さ
れた。この分子量は細菌からの多成分オキシゲナーゼ中で見出される他のフェレドキシンの分子量［すなわち、８−１３ｋＤａ］バチーら（１９９２）５４３−５６５ページ、Ｆ．ミュラーにおいて編集、フラボ酵素の化学及び生物化学、ｖｏｌ．ＩＩＩ、ＣＲＣプレス、ボカ ラトン；ハラヤマら（１９９２）アニュアルレヴュー微生物学４６：５６５−
６０１よりかなり高い。
レダクターゼDIC
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩ（レダクターゼDICと称す）は、３成分中最も
精製が困難な成分であった。これは一部には、この成分の見かけの不安定さ及びＤＩ−６株の溶解物中における量が少ないことによる。にもかかわらず、十分なタンパク質が単離され、その分子量は４５，０００と仮定された。これはサイズ排除クロマトグラフィーから得られた、約５０，０００ダルトンの分子量と同様であり、レダクターゼDICは自然状
態ではモノマーとして存在することが示唆される。レダクターゼ成分の精製は、ＭｏｎｏＱカラム上でのクロマトグラフィー及びＩＥＦにより精製レダクターゼ試料が明らかに異なるｐＩ値を有する２つの活性に分割されるという事実により、さらに複雑となる。Ｍｏｎｏ Ｑカラムからの両方の画分は、精製フェレドキシンDIC及びオキシゲナーゼDICとの
組み合わせにおいて機能し、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を生成する。スフィンゴモナスｓｐ．ＲＷ１株において、３成分ジベンゾフラン４，４ａ−ジオキシゲナーゼ中でレダクターゼ成分として同様によく機能する２つの同様のフラボタンパク質の存在が、最近、ビンツ及びクック（Bu ntz、Cook）により報告されているビンツ及びクック１９９３、細菌ジャーナル１７５：６４６７−６４７５。興味深いことに、どちらのレダクターゼもその分子量は４４，０００ダルトンであり、４５，０００ダルトンレダクターゼＤＩＣの分子量と非常に良く類似している。レグヘモグロビンレダクターゼの複数の成分もまた、等電点電気泳動技術を用いると、ルピナスの根の小結節において観察されているトプノブ（Topunov）ら（１９８２）バイオキミヤ（Biokymiya）英語版１６２：３７８−３７９。この場合、ＩＥＦにより、ＮＡＤＨ−依存レダクターゼ活性を有する４つの別個の成分が明らかになった。ＤＩ−６株においては、唯一のレダクターゼDICが２つの形態で存在する
のか、それとも２つの別個のレダクターゼが存在するのかについての質問への回答は、より大量のタンパク質を単離するための改良方法の開発、及び／または、関係する遺伝子のクローン化と配列決定にかかっている。
ジカンバＯ−デメチラーゼ特性
以上で述べた個々の成分の物理的及び生物化学的特性の他に、酵素活性の分析により、Ｏ−デメチラーゼ系はその基質に対し強い親和性を有しＫm＝−１０μＭ、Ｖmaxは約１００−１１０ｎｍｏｌ／分／ｍｇであることが示された。
【００９８】
温帯気候帯で収集した上壌細菌で予測したように、最大酵素活性は３０℃付近の温度で観察された。酵素系の最適ｐＨはｐＨ６．５からｐＨ７．５までであったが、酵素の一定の試料を用いた活性は使用したｐＨ緩衝系の型に強く依存した。トリス緩衝液の存在下での活性は、同じｐＨでは、リン酸緩衝液を用いた場合に比べ少なくとも４０％低かった。ジカンバＯ−デメチラーゼの３成分により触媒される反応に対する反応スキームを図１に示す。ＮＡＤＨからの電子は、レダクターゼとフェレドキシンからなる短い電子連鎖を介して、末端のジカンバの酸化を触媒するオキシゲナーゼのところまで往復する。ジカンバＯ−デメチラーゼと幾つかの多成分ジオキシゲナーゼ間の類似性から、ジカンバＯ−デメチラーゼが、隠れたジオキシゲナーゼ活性を有する可能性が示唆される。しかしながら、この酵素は、Ｏ2を分割し、酸素の１つの原子を主要基質内に組込み、他の１つをα−ケ
トグルタル酸塩などの小さな有機基質に組み込むジオキシゲナーゼのクラスのものではないことは、明らかであるフクモリ及びハウシンガー（Hukumori、Hausinger）１９９３、
生物・化学ジャーナル２６８：２４３１１−２４３１７。実際、高精製レダクターゼDIC
、フェレドキシンDIC及びオキシゲナーゼDICが活性を示すのに必要とするのはＯ2、ＮＡ
ＤＨ、Ｍｇ2+及びジカンバのみである。
実施例２
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼの遺伝暗号を指定するクローンの同定と配列決定 実施例１で述べたように、オキシゲ
ナーゼDICのＮ−末端アミノ酸配列の最初の２９のアミノ酸は以下のように決定されてい
る括弧内の残基は最も良い推測である：Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp (Asp またはThr) (Pro) ［配列番号１］
この配列により、オペロン、アラミダ、ＣＡにより合成された縮重オリゴヌ クレオチ
ドプローブの設計が可能となった。特に、それぞれが１７ヌクレオチ ドの長さを持ち、
以上でとりわけ強調したアミノ酸配列の遺伝暗号を指定する ことができる可能なヌクレ
オチド配列の全てを含む３２プローブの混合物を使 用した。オリゴヌクレオチドプロー
ブは、ボエーリンガー マンハイム (Boehringer Mannheim)、インディアナポリス、ＩＮ
により提供された指示に 従い、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いて３’−端標識した。
【００９９】
まず、ＤＩＧ−標識プローブは、制限酵素の様々な組み合わせで切断され、１％のアガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルタに密着印画されていたシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成させた。これらの結果を基に、サイズ−分別ゲノムライブラリーをｐブルースクリプト（Bluescript）ＩＩ Ｋｓ＋ベクター内
で構成し、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に変換した。ゲノムライブラリーは１−２ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を含んでいた。ＤＩＧ−標識オリゴヌクレオチドプ
ローブは、ナイロンフィルタ上の縞状の細菌コロニー列とハイブリッド形成させた。プラスミドＤＮＡを陽性コロニーから単離しサブクローン化した。各サブクローンの両方のストランドの配列決定を、ネブラスカ−リンカンの大学でＤＮＡ配列決定設備を用いて行った。ＤＩＧ−標識プローブのハイブッド形成及び検出は、ボアリンガーマンハイムが提示したプロトコルに従って行った。
【０１００】
オキシゲナーゼDICの遺伝暗号を指定するゲノムＤＮＡクローンを同定した。ヌクレオ
チド配列及び導き出した全オキシゲナーゼDICのアミノ酸配列を以下の配列表にそれぞれ
、配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４として示す。
【０１０１】
このクローンのヌクレオチド配列から導き出したアミノ酸配列と、スイスタンパク質データベースのタンパク質配列のアミノ酸配列との比較から、他のオキシゲナーゼに対する相同性が見られた。相同性はＧＣＧソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを用いて決定した。最も強い相同性は（シュードモナス・ｓｐ．ＡＴＣＣ株１９１５１からの）バニレートデメチラーゼのオキシゲナーゼ成分との間にあり、３３．８％の同一性を示した。
実施例３
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼのフェレドキシンの遺伝暗号を指定するクローンの同定と配列
実施例１で述べたように、フェレドキシンDICのＮ−末端アミノ酸配列の最初の２０ア
ミノ酸は以下のように決定された：
Thr Tyr Val Val Thr Asp Ala Xaa Ile Lys Xaa Lys Tyr Met Asp Xaa Val Glu Val Xaa ［配列番号２］ この配列により縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となった。特に、それぞれが１７ヌクレオチドの長さを持ち、以上でとりわけ強調した（ＸａａをＣｙｓとする）アミノ酸配列の遺伝暗号を指定することができる可能なヌクレオチド配列の全てを含む１６プローブの混合物を使用した。
【０１０２】
ＤＩＧ−標識プローブを使用して、ゲノムライブラリーが２−３ Ｋｂ Ｘｈｏ Ｉ／Ｅ
ｃｏ ＲＩ断片を含むこと以外は実施例２で説明した様に、ゲノムライブラリーのスクリ
ーニングを行った。フェレドキシンDICクローンのヌクレオチド配列及び導き出した全フ
ェレドキシンDICのアミノ酸配列を以下の配列表にそれぞれ、配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
：５及び配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６として示す。
【０１０３】
このクローンのヌクレオチド配列から導き出したアミノ酸配列と、スイスタンパク質データベースのタンパク質配列のアミノ酸配列との比較を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを用いて行った。この比較により、シュードモナス・スツツェリ、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・キャプシュラツス、アゾトバクター・ビネランジイ及ロドスピルム・ルブルムからのフェレドキシンを含む他のフェレドキシンに対する強い相同性が見られた上記実施例１における考察を参照のこと。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカンバ−分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であって、
前記ジカンバ−分解オキシゲナーゼは、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するジカンバ−分解オキシゲナーゼ、および
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するオキシゲナーゼ内の１つまたは２つのアミノ酸が付加、削除、または置換されたジカンバ−分解オキシゲナーゼと、
からなる群より選択される、ＤＮＡ分子。
【請求項１】
ジカンバ−分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子であって、
前記ジカンバ−分解オキシゲナーゼは、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を有するジカンバ−分解オキシゲナーゼ、および
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するオキシゲナーゼ内の１つまたは２つのアミノ酸が付加、削除、または置換されたジカンバ−分解オキシゲナーゼと、
からなる群より選択される、ＤＮＡ分子。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１８７６７３（Ｐ２０１０−１８７６７３Ａ）
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３８５７２（Ｐ２０１０−３８５７２）
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【分割の表示】特願２００８−２１１７０２（Ｐ２００８−２１１７０２）の分割
【原出願日】平成１０年４月３日（１９９８．４．３）
【出願人】（５０８２２１２２４）ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２４日（２０１０．２．２４）
【分割の表示】特願２００８−２１１７０２（Ｐ２００８−２１１７０２）の分割
【原出願日】平成１０年４月３日（１９９８．４．３）
【出願人】（５０８２２１２２４）ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ネブラスカ (10)
【Ｆターム（参考）】
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