遺伝子導入材料及び培養容器
【課題】核酸の担持量が多く、優れた遺伝子導入活性を示し、かつ培養容器の表面に付着させることができる遺伝子導入材料、及びこの遺伝子導入材料を容器の内面に付着させた培養容器を提供する。
【解決手段】核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【解決手段】核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸とを含んでなる遺伝子導入材料、及びこの遺伝子導入材料を付着させた培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。本出願人らは、前述の合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核として分岐鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。
【０００４】
本出願人らはまた、前記特許文献１に記載の遺伝子導入剤が、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であるという性質を利用し、この遺伝子導入剤を容器の内面に付着させた培養容器を提案した（特許文献２）。この特許文献２では、遺伝子導入剤の疎水性を利用して容器内面に遺伝子導入剤を長期に亘り付着させることが可能であるが、この遺伝子導入剤は、分岐鎖の電気的な親和力により核酸を凝集するのではなく、遺伝子導入剤の疎水性により核酸を凝集するため、担持できる核酸の量が十分ではない。
【０００５】
本出願人らは、より多くの核酸を担持することができる遺伝子導入剤として、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対して、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合してなる遺伝子導入剤について特許出願した（特許文献３）。
【０００６】
この特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が、僅かながらカチオン性を備えるため、このカチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位が、核酸との結合に寄与し、核酸担持量を多くすることができる。また、分岐鎖が感温性を有していることから、温度を調整することにより、遺伝子導入剤を疎水性に変化させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１９５６８１号公報
【特許文献２】特開２００８−１９４００３号公報
【特許文献３】特願２００９−２２７４０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献３に記載の遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が有するカチオン性により、核酸を十分に担持することができ、良好な遺伝子導入活性を示すと共に、分岐鎖の感温性により遺伝子導入剤を疎水性に変化させることができるため、培養容器に付着させることも可能であるが、培養容器への付着量が十分ではない。
【０００９】
即ち、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体は、常温の水溶液中において容易に加水分解される。従って、この遺伝子導入剤を疎水性に変化させ培養容器の表面に付着させても、分岐鎖が加水分解されることにより、分子全体が親水性に変化してしまうため、遺伝子導入剤が培養容器の表面から剥がれて培養液中に溶解してしまう。
【００１０】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、核酸の担持量が多く、優れた遺伝子導入活性を示し、かつ培養容器の表面に付着させることができる遺伝子導入材料、及びこの遺伝子導入材料を容器の内面に付着させた培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位の加水分解を抑える方法について検討を重ねた結果、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを構成単位とする遺伝子導入剤と、核酸とを所定の割合で混合することにより、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位の加水分解を制御することが可能であることを見出した。
【００１２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１３】
本発明（請求項１）の遺伝子導入材料は、核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項２の遺伝子導入材料は、請求項１において、前記分岐鎖１本当りの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項３の遺伝子導入材料は、請求項１又は２において、前記分岐鎖は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項４の遺伝子導入材料は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分を含む水溶液であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項５の遺伝子導入材料は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項６の遺伝子導入材料は、請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項７の遺伝子導入材料は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料の分子量は、５，０００〜５００，０００であることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項８の遺伝子導入材料は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項９の遺伝子導入材料は、請求項８において、前記所定温度（Ｔ）は、２５〜３７℃の間の温度であることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明（請求項１０）の培養容器は、培養液が接する容器内面に、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入材料を付着させたものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明においては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又は誘導体を、単に、「ＤＭＡＥＭ」と略記する場合がある。）を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体からなるポリマー材料と、核酸とのカチオン／アニオン比を１／０．７〜１／１．２とすることにより、分岐鎖中のＤＭＡＥＭ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＥＭ単位」と称す場合がある。）の加水分解を抑制することができ、若干のカチオン性を有するＤＭＡＥＭを構成単位とし、核酸の担持効率に優れたポリマー材料を遺伝子導入材料に適用することが可能となる。
【００２４】
なお、所定の比で混合した場合には、分岐鎖のＤＭＡＥＭ単位と核酸との電気的な親和力により、ＤＭＡＥＭ単位の近傍に核酸が存在するようになり、この核酸が水分子の接近を阻害し、結果として、加水分解が生じにくくなることが考えられる。
【００２５】
本発明において、前記分岐鎖１本当りのＤＭＡＥＭ単位の分子量は、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることが好ましく（請求項２）、特に、前記分岐鎖が、ＤＭＡＥＭ単位のみからなることが好ましい（請求項３）。分岐鎖に含まれるＤＭＡＥＭ単位の量が多いほど、分岐鎖のカチオン性が高くなるため、アニオン性である核酸との親和性が向上し、ポリマー材料の核酸担持量が増加する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入材料は、ポリマー材料と核酸との複合体である遺伝子導入成分を水に溶解させた水溶液とすることができ（請求項４）、このような遺伝子導入材料であれば、有機溶媒を不使用として細胞に与える影響を低減させることができる。
【００２７】
本発明で用いるポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくともＤＭＡＥＭを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましく（請求項５）、このＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項６）。
【００２８】
また、本発明で用いるポリマー材料の分子量は５，０００〜５００，０００であることが好ましい（請求項７）。ポリマー材料の分子量がこの範囲内であれば、核酸の担持量を十分なものとすると共に、遺伝子導入材料の培養容器などに対する付着性を高めることができる。
【００２９】
本発明に係る遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることが好ましく（請求項８）、この所定温度（Ｔ）としては、２５〜３７℃の間の温度であることが好ましい（請求項９）。
【００３０】
本発明（請求項１０）の培養容器は、本発明の遺伝子導入材料がコーティングされた培養容器であり、遺伝子導入材料の付着性、長期安定性に優れるため、優れた遺伝子導入活性を長期間に亘って持続することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】６分岐型重合体溶液の温度と光透過率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入材料］
本発明の遺伝子導入材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（ＤＭＡＥＭ）を重合主成分とする分岐鎖を複数本有するポリマー材料と、核酸とを含むものであって、該ポリマー材料と核酸とのカチオン／アニオン比（以下、この比を単にＣ／Ａ比という場合がある。）が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とするものである。
【００３４】
本発明によれば、前述の通り、ＤＭＡＥＭに由来する構成単位の加水分解を抑制することができ、これにより、遺伝子導入材料が疎水性を示すようになるため、培養容器の表面に長期に亘り安定に付着させることが可能となる。また、カチオン性のＤＭＡＥＭ単位により、十分量の核酸を安定に担持することができる。
【００３５】
＜遺伝子導入成分＞
本発明に係る遺伝子導入成分を構成するポリマー材料と核酸とのカチオン／アニオン比は、１／０．７〜１／１．２、特に１／０．８〜１／１．１程度が好ましい。この比が上記範囲外である場合には、ポリマー材料中のＤＭＡＥＭ単位の加水分解を十分に抑制することができない。また、核酸の配合量が少ない場合には、細胞に対して十分に遺伝子を導入することができず、核酸の配合量が多すぎると製造コストが上昇する。ポリマー材料と核酸とのＣ／Ａ比を上記範囲内とすることにより、ＤＭＡＥＭ単位の加水分解を抑制した上で、十分な遺伝子導入活性を得ることが可能である。
なお、本発明において、Ｃ／Ａ比とは、６分岐型重合体のカチオン（ＤＭＡＭＥ単位）のモル数と、核酸のアニオン（リン酸残基）のモル数との比を意味する。
【００３６】
本発明において、遺伝子導入材料中のポリマー材料の濃度は、０．００１〜１．０重量％、特に０．０１〜０．１重量％程度が好ましい。遺伝子導入材料中のポリマー材料の濃度が上記下限よりも低い場合には、培養容器などに対して均一に塗布することができず、上記上限よりも濃度が高い場合には、ポリマー材料と核酸とを前述の重量比で混合しても、ＤＭＡＥＭ単位の加水分解を抑制することができない。
【００３７】
前記遺伝子導入成分を調製するには、ポリマー材料の低温の水溶液に対して核酸を添加して混合し、ポリマー材料に核酸を担持させればよい。
【００３８】
ここで、遺伝子導入成分の調製に用いる水溶液、或いは、本発明の遺伝子導入材料が遺伝子導入成分を含む水溶液である場合の該水溶液の種類としては、生理食塩水、水（ミリＱ水などの超純水など）、りん酸緩衝溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、グッドバッファーなど当業者に周知のものが使用可能であるが、生理食塩水やりん酸緩衝溶液が好適であり、緩衝溶液のうち、りん酸緩衝溶液のうち、トリス緩衝溶液を使用する際は低濃度（例えば１０ｍＭ以下、具体的には１〜５ｍＭ）で使用することが好ましい。
【００３９】
前記所定濃度でポリマー材料と核酸とを混合させてなる遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低温では親水性となり、所定温度（Ｔ）よりも高温では疎水性を示すようになる。この所定温度（Ｔ）としては、２５〜３７℃、特に３０〜３５℃が好ましい。
【００４０】
前記所定温度が３０℃である場合には、３０℃よりも低い温度、例えば１０〜２５℃程度の遺伝子導入材料の水溶液を培養容器などに塗布などにより付着させ、３０℃よりも高い温度に昇温させ、必要に応じ乾燥させることにより、水不溶性の、核酸を担持したコーティングが形成される。
【００４１】
≪ポリマー材料≫
本発明において用いるポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＭＡＥＭを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００４２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００４３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００４４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００４５】
イニファターと上記ＤＭＡＥＭとを反応させるには、イニファター、及びＤＭＡＥＭを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭが結合した反応生成物を生成させる。
【００４６】
該原料溶液中のＤＭＡＥＭの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４７】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えば蛍光灯、ショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。市販の蛍光灯を用いて光照射を行う場合には、１〜１００時間程度光照射を行うことが好ましい。
【００４８】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＭＡＥＭ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００４９】
このポリマー材料の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、１００〜６０，０００程度、特に２００〜３０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００５０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５１】
ポリマー材料の分岐鎖は、前述のＤＭＡＥＭをモノマーとする１種のモノマーのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭとは異なる１種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００５２】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５３】
イニファターとＤＭＡＭＥとＤＭＡＥＭとは異なるモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＭＡＥＭとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＭＡＥＭ、及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００５４】
また、上記イニファターに対し、まず、ＤＭＡＥＭをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＤＭＡＥＭのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。
いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００５５】
前記のように、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭ以外のモノマーとを反応させた場合には、分岐鎖１本当りのＤＭＡＥＭ単位の分子量が、当該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上、特に９５〜１００％となるようにするのが好ましい。ＤＭＡＥＭ単位はカチオン性であるため、分岐鎖に含まれるＤＭＡＥＭ単位が多いほど、ポリマー材料とアニオン性である核酸との親和性が高くなり、核酸担持量を高めることができ、遺伝子導入材料の遺伝子導入活性が向上する。
【００５６】
また、本発明において、ポリマー材料は核酸の担体として機能すると共に、培養容器等への付着のためのアンカーとして機能することから、ポリマー材料の分岐型重合体の分岐鎖は多い方が好ましく、分岐鎖は４本以上、特に６本であることが好ましい。
【００５７】
また、ポリマー材料の分子量としては、上記機能を有効に得る上で５，０００〜５００，０００程度、特に２５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
【００５８】
≪核酸≫
核酸としては、各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイや単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が利用できる。また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が利用できる。
【００５９】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６０】
［培養容器］
培養容器としては、シャーレ、フラスコ、培養プレート（マルチウェルプレート）などが例示される。その材質は、合成樹脂、ガラス、金属などのいずれでもよい。本発明の遺伝子導入材料を培養容器などに適用する場合、培養容器の表面に本発明の遺伝子導入材料を０．７ｎｇ／ｍｍ２〜７０μｇ／ｍｍ２程度の密度で付着させるのが好ましい。
【００６１】
培養容器などに遺伝子導入材料を付着させる方法としては、後述の実施例に記載の方法を挙げることができるが、培養容器に遺伝子導入材料をピペッティングした後、培養容器を温和に上下左右に転倒させて容器内面全体に流延させることにより付着させ、次いで３０〜４０℃で１０〜１００分程度インキュベートする方法でもよい。この方法を採用する場合、前述のインキュベートを行った後に無菌雰囲気下で乾燥させても良く、インキュベートを省略して無菌雰囲気下で乾燥させても良い。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
（１） イニファターの合成（６分岐型）
イニファターとしての１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６４】
１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇとをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬに溶解させた後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。この結晶を高速液体クロマトグラフィーで分析し、結晶中に原料が含まれていないこと、及び結晶が単一物質であることを確認した。
【００６５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，３６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）であった。
【００６６】
【化１】
【００６７】
（２） ６分岐型重合体の合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、１，２，３，４，５，６−ヘキサキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）メチル］ベンゼンの合成を行った。
【００６８】
上記（１）により合成した１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４６．０ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムに溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。１ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード、流量：２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後、丸管形ブラック蛍光灯（Ｏ字形）（東芝製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の環の内側に前記ガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの側面の全周方向から蛍光灯の光を９６時間照射した。光照射後の溶液の色は薄い黄色であった。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、ｎ−ヘキサンをデカンテーションした後、沈殿物をクロロホルムに溶解した。溶媒をエバポレーター留去し、フラスコの内壁面にフィルムを形成した。ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（ｖ／ｖ：１／１）の混合溶液で前記フィルムを洗浄することにより精製し、目的とする６分岐型重合体を得た。ＧＰＣにより、この重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、２６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０）であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量を求めたところ、４１５９であった。
【００６９】
【化２】
【００７０】
（３） 曇点の評価
上記（２）で合成した６分岐型重合体２０ｍｇを水に溶解させ、溶解させた直後（実験例１）、溶解から１時間後（実験例２）、３時間後（実験例３）、５時間後（実験例４）、及び２４時間後（実験例５）の溶液の３０〜４０℃における光透過率を測定することにより前記重合体の曇点（ＬＣＳＴ）を求めた。結果を図１に示す。
【００７１】
全ての実験例において、温度の上昇により溶液が白濁したことから、前記重合体が温度感応性を備えていることが分かる。また、溶解させてから測定までの保持時間に比例して曇点が上昇したこと、及び時間の経過と共に溶液中に揮発性の低分子量アミン化合物が生成していたことから、経時的に６分岐型重合体中の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位が、水溶液中で加水分解され、脱溶媒和の性質が徐々に失われることが分かる。
【００７２】
（４） 核酸複合体（遺伝子導入成分）の調製
上記（２）で合成した６分岐型重合体と、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ（プロメガ社：ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ）とを水溶液中で混合して複合体の形成を行った。６分岐型重合体の溶液として、濃度が１．６μｇ／１００μＬである水溶液を調製した。また、核酸（ＤＮＡ）溶液として、濃度が１．５〜１５．０μｇ／１００μＬである水溶液をそれぞれ調製した。前記６分岐型重合体水溶液と、各ＤＮＡ水溶液とを混合し（実験例６〜１１）、混合直後から２４時間後まで経時的に３０〜４５℃における光透過率を測定し、曇点を求めた。
【００７３】
各混合液の６分岐型重合体の濃度、ＤＮＡ濃度、Ｃ／Ａ比及び混合から５時間後及び２４時間後の曇点を表１に示す。なお、６分岐型重合体溶液中のカチオンのモル数は、溶液に含まれる６分岐型重合体のモル数に下記６分岐型重合体１モル当りのカチオンの数を掛けることにより求めることができ、また、ＤＮＡ溶液中のアニオンのモル数は、溶液中のＤＮＡの重量をその分子量で除して求めることができる。なお、ＤＮＡの分子量は、遺伝子マップの情報から得られる塩基対の数と塩基対の平均分子量（６６０）より求めることができる。つまり以下の通りである。
＜６分岐型重合体１モル当りのカチオン（ＤＭＡＥＭ単位）の数＞
６分岐型重合体の数平均分子量 ： ２６，０００
イニファターの分子量 ： １０４６
ＤＭＡＥＭ単位（１分子当り）の分子量 ： １５７
（２６，０００−１０４６）／１５７＝１５９（カチオン（ＤＭＡＥＭ単位）の数）
＜ＤＮＡ（ｐＧＬ３）の分子量＞
ｐＧＬ３の塩基対 ： ５２５６ｂｐ
塩基対の平均分子量 ： ６６０
５，２５６×６６０≒３，４７０，０００
【００７４】
【表１】
【００７５】
実験例６では、曇点が調製直後から徐々に上昇し、５時間後には３５℃、２４時間後には４２℃まで上昇した。
実験例７では、混合後に非常に緩やかに曇点が上昇した。５時間後の曇点は３３．５℃、２４時間後の曇点は３５．５℃であり、一般的な培養温度である３７℃まで上昇しなかった。
実験例８では、調製直後から２４時間後までの間で曇点の変化がほとんどなく、３３．０℃付近で一定であった。
実験例９では、曇点にほとんど変化がなく、２４時間後の曇点は３２．３℃であった。
実験例１０では、混合直後から曇点が上昇し、５時間後の曇点が４０．０℃、２４時間後の曇点が４２．０℃であった。これは、前述の加水分解によるものではなく、調製液中のＤＮＡの比率が高くなり、ＤＮＡのアニオン性電荷の効果により、６分岐型重合体自体の性質が発現しにくくなったためであると考えられる。
実験例１１では、６分岐型重合体の温度感応性の性質が確認できず、４２℃以上でも安定して水に分散していた。
【００７６】
以上より、６分岐型重合体の濃度が１．６μ／１００μＬの場合、ＤＮＡの濃度が２．５〜４．５μｇ／１００μＬの範囲、即ち、Ｃ／Ａ比が１／０．７〜１／１．２であると、混合から２４時間後でも曇点に大きな変化がない。これは、ＤＮＡが、６分岐型重合体の分岐鎖の近傍に存在し、水分子の接近による加水分解を抑制するためであると考えられる。
【００７７】
（５） 核酸複合体の調製と培養皿へのコーティング、及び遺伝子導入活性の評価
上記（２）で合成した６分岐型重合体１．６μｇを生理食塩水へ溶解し、全量を６０μＬとした。一方、前記ＤＮＡ（ｐＧＬ３）３．０μｇを希薄（１．０ｍＭ程度）なＴＥ緩衝溶液へ溶解し、全量を９０μＬとした後、この溶液を速やかに前記重合体溶液に滴下することにより６分岐型重合体とＤＮＡとを複合させた。この混合溶液を２４Ｗｅｌｌ培養皿へ２５μＬずつ分注し、転倒混和してＷｅｌｌ表面になじませ、３７℃で３分間インキュベートし、３７℃のＰＢＳで１回リンスした。
【００７８】
この培養皿の各ＷｅｌｌにＣＯＳ−１細胞の浮遊液（６×１０４個／ｍＬ）を１ｍＬずつ播種し、４８時間培養した。培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え、４℃で３０分間放置し、超遠心処理で不溶物を沈殿させて上澄を遺伝子導入活性評価用の試料とした。遺伝子導入活性の評価はルシフェラーゼアッセイで行った。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のルシフェラーゼアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行い（実施例１）、後述の比較例１と比較した。
【００７９】
（６） イニファターの合成（４分岐型）
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥し、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。この結晶を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、結晶中に原料が含まれていないこと、及び結晶が単一物質であることを確認した。
【００８１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００８２】
【化３】
【００８３】
（７） ４分岐型重合体の合成
（７−１） 下記手順に従い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）メチル］ベンゼン（１次ポリマー）の合成を行った。
【００８４】
上記（６）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を２０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に真空乾燥することにより、目的とする４分岐型重合体の１次ポリマーを得た。ＧＰＣにより、この重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）であった。また、分岐鎖１本当たりの分子量を計算により求めたとこと、８，５００であった。
【００８５】
【化４】
【００８６】
（７−２） 下記の手順に従い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）メチル］ベンゼンの合成を行った。
【００８７】
上記（７−１）で合成した１次ポリマー１．０ｇ及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７．９ｇを約３０ｍｌのメタノールへ溶解させた。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後に、前記（７−１）と同じ装置を用いて４０分間光照射を行った。重合体をクロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返し、エーテルを蒸散させた後、少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて目的とする４分岐型重合体（２次ポリマー）を得た（重合率２８％）。ＧＰＣによりこの重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、８３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．６）であった。また、計算により、分岐鎖１本当たりの分子量は、２０，５００であることが分かった。
【００８８】
以上の手順により、ベンゼンを中心核として放射状にＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量３５，０００）と３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量４８，０００）とが導入された４分岐型重合体を合成した。
【００８９】
【化５】
【００９０】
（８） ４分岐型重合体と核酸との核酸複合体の調製と培養皿へのコーティング、及び遺伝子導入活性の評価
前記（７）で合成した４分岐型重合体を１０℃の水へ溶解し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した後、濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調整した。この重合体溶液を２４Ｗｅｌｌ培養皿の各Ｗｅｌｌへ２００μＬずつ加えて軽く転倒振盪し、底面の全面に溶液を流延した。これを３７℃、５％炭酸ガス濃度の培養器へ移し、５分間インキュベートし、３７℃のＰＢＳで軽くリンスして廃液した。ここに３７℃に温調したＤＮＡ溶液（０．５μＬ／ｍＬ）を各Ｗｅｌｌへ１ｍＬずつ加えて３７℃で３分間インキュベートした。ここへＣＯＳ−１細胞を６×１０４個／ｍＬに調整して播種し、４８時間培養した。ＤＮＡは実施例１と同じものを用いた。
【００９１】
培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え４℃で３０分間放置し、遺伝子導入活性評価用の試料とした。遺伝子導入活性の評価は、実施例１と同様の評価方法で行った（比較例１）。
【００９２】
（９） 評価結果及び考察
実施例１における遺伝子導入活性は、比較例１の遺伝子導入活性の１０倍以上であった。比較例１においては、４分岐型重合体の分岐鎖中に、ＤＮＡの担持に寄与しないポリマーブロックが存在していたことから、基材表面がミクロ的には不均質になり、ＤＮＡの供給に寄与することができないスポットが存在したためであると考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤と核酸とを含んでなる遺伝子導入材料、及びこの遺伝子導入材料を付着させた培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。本出願人らは、前述の合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核として分岐鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（特許文献１）。
【０００４】
本出願人らはまた、前記特許文献１に記載の遺伝子導入剤が、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であるという性質を利用し、この遺伝子導入剤を容器の内面に付着させた培養容器を提案した（特許文献２）。この特許文献２では、遺伝子導入剤の疎水性を利用して容器内面に遺伝子導入剤を長期に亘り付着させることが可能であるが、この遺伝子導入剤は、分岐鎖の電気的な親和力により核酸を凝集するのではなく、遺伝子導入剤の疎水性により核酸を凝集するため、担持できる核酸の量が十分ではない。
【０００５】
本出願人らは、より多くの核酸を担持することができる遺伝子導入剤として、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに対して、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合してなる遺伝子導入剤について特許出願した（特許文献３）。
【０００６】
この特許文献３に記載される遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が、僅かながらカチオン性を備えるため、このカチオン性の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位が、核酸との結合に寄与し、核酸担持量を多くすることができる。また、分岐鎖が感温性を有していることから、温度を調整することにより、遺伝子導入剤を疎水性に変化させることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−１９５６８１号公報
【特許文献２】特開２００８−１９４００３号公報
【特許文献３】特願２００９−２２７４０５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献３に記載の遺伝子導入剤は、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体が有するカチオン性により、核酸を十分に担持することができ、良好な遺伝子導入活性を示すと共に、分岐鎖の感温性により遺伝子導入剤を疎水性に変化させることができるため、培養容器に付着させることも可能であるが、培養容器への付着量が十分ではない。
【０００９】
即ち、分岐鎖を構成する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体は、常温の水溶液中において容易に加水分解される。従って、この遺伝子導入剤を疎水性に変化させ培養容器の表面に付着させても、分岐鎖が加水分解されることにより、分子全体が親水性に変化してしまうため、遺伝子導入剤が培養容器の表面から剥がれて培養液中に溶解してしまう。
【００１０】
本発明は上記従来の課題に鑑みてなされたものであり、核酸の担持量が多く、優れた遺伝子導入活性を示し、かつ培養容器の表面に付着させることができる遺伝子導入材料、及びこの遺伝子導入材料を容器の内面に付着させた培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位の加水分解を抑える方法について検討を重ねた結果、この２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートを構成単位とする遺伝子導入剤と、核酸とを所定の割合で混合することにより、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位の加水分解を制御することが可能であることを見出した。
【００１２】
本発明はこのような知見に基いて達成されたものであり、以下を要旨とする。
【００１３】
本発明（請求項１）の遺伝子導入材料は、核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項２の遺伝子導入材料は、請求項１において、前記分岐鎖１本当りの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項３の遺伝子導入材料は、請求項１又は２において、前記分岐鎖は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項４の遺伝子導入材料は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分を含む水溶液であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項５の遺伝子導入材料は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項６の遺伝子導入材料は、請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項７の遺伝子導入材料は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料の分子量は、５，０００〜５００，０００であることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項８の遺伝子導入材料は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項９の遺伝子導入材料は、請求項８において、前記所定温度（Ｔ）は、２５〜３７℃の間の温度であることを特徴とするものである。
【００２２】
本発明（請求項１０）の培養容器は、培養液が接する容器内面に、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入材料を付着させたものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明においては、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（以下、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又は誘導体を、単に、「ＤＭＡＥＭ」と略記する場合がある。）を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体からなるポリマー材料と、核酸とのカチオン／アニオン比を１／０．７〜１／１．２とすることにより、分岐鎖中のＤＭＡＥＭ由来の構成単位（以下、「ＤＭＡＥＭ単位」と称す場合がある。）の加水分解を抑制することができ、若干のカチオン性を有するＤＭＡＥＭを構成単位とし、核酸の担持効率に優れたポリマー材料を遺伝子導入材料に適用することが可能となる。
【００２４】
なお、所定の比で混合した場合には、分岐鎖のＤＭＡＥＭ単位と核酸との電気的な親和力により、ＤＭＡＥＭ単位の近傍に核酸が存在するようになり、この核酸が水分子の接近を阻害し、結果として、加水分解が生じにくくなることが考えられる。
【００２５】
本発明において、前記分岐鎖１本当りのＤＭＡＥＭ単位の分子量は、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることが好ましく（請求項２）、特に、前記分岐鎖が、ＤＭＡＥＭ単位のみからなることが好ましい（請求項３）。分岐鎖に含まれるＤＭＡＥＭ単位の量が多いほど、分岐鎖のカチオン性が高くなるため、アニオン性である核酸との親和性が向上し、ポリマー材料の核酸担持量が増加する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入材料は、ポリマー材料と核酸との複合体である遺伝子導入成分を水に溶解させた水溶液とすることができ（請求項４）、このような遺伝子導入材料であれば、有機溶媒を不使用として細胞に与える影響を低減させることができる。
【００２７】
本発明で用いるポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくともＤＭＡＥＭを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましく（請求項５）、このＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項６）。
【００２８】
また、本発明で用いるポリマー材料の分子量は５，０００〜５００，０００であることが好ましい（請求項７）。ポリマー材料の分子量がこの範囲内であれば、核酸の担持量を十分なものとすると共に、遺伝子導入材料の培養容器などに対する付着性を高めることができる。
【００２９】
本発明に係る遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることが好ましく（請求項８）、この所定温度（Ｔ）としては、２５〜３７℃の間の温度であることが好ましい（請求項９）。
【００３０】
本発明（請求項１０）の培養容器は、本発明の遺伝子導入材料がコーティングされた培養容器であり、遺伝子導入材料の付着性、長期安定性に優れるため、優れた遺伝子導入活性を長期間に亘って持続することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】６分岐型重合体溶液の温度と光透過率との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入材料］
本発明の遺伝子導入材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体（ＤＭＡＥＭ）を重合主成分とする分岐鎖を複数本有するポリマー材料と、核酸とを含むものであって、該ポリマー材料と核酸とのカチオン／アニオン比（以下、この比を単にＣ／Ａ比という場合がある。）が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とするものである。
【００３４】
本発明によれば、前述の通り、ＤＭＡＥＭに由来する構成単位の加水分解を抑制することができ、これにより、遺伝子導入材料が疎水性を示すようになるため、培養容器の表面に長期に亘り安定に付着させることが可能となる。また、カチオン性のＤＭＡＥＭ単位により、十分量の核酸を安定に担持することができる。
【００３５】
＜遺伝子導入成分＞
本発明に係る遺伝子導入成分を構成するポリマー材料と核酸とのカチオン／アニオン比は、１／０．７〜１／１．２、特に１／０．８〜１／１．１程度が好ましい。この比が上記範囲外である場合には、ポリマー材料中のＤＭＡＥＭ単位の加水分解を十分に抑制することができない。また、核酸の配合量が少ない場合には、細胞に対して十分に遺伝子を導入することができず、核酸の配合量が多すぎると製造コストが上昇する。ポリマー材料と核酸とのＣ／Ａ比を上記範囲内とすることにより、ＤＭＡＥＭ単位の加水分解を抑制した上で、十分な遺伝子導入活性を得ることが可能である。
なお、本発明において、Ｃ／Ａ比とは、６分岐型重合体のカチオン（ＤＭＡＭＥ単位）のモル数と、核酸のアニオン（リン酸残基）のモル数との比を意味する。
【００３６】
本発明において、遺伝子導入材料中のポリマー材料の濃度は、０．００１〜１．０重量％、特に０．０１〜０．１重量％程度が好ましい。遺伝子導入材料中のポリマー材料の濃度が上記下限よりも低い場合には、培養容器などに対して均一に塗布することができず、上記上限よりも濃度が高い場合には、ポリマー材料と核酸とを前述の重量比で混合しても、ＤＭＡＥＭ単位の加水分解を抑制することができない。
【００３７】
前記遺伝子導入成分を調製するには、ポリマー材料の低温の水溶液に対して核酸を添加して混合し、ポリマー材料に核酸を担持させればよい。
【００３８】
ここで、遺伝子導入成分の調製に用いる水溶液、或いは、本発明の遺伝子導入材料が遺伝子導入成分を含む水溶液である場合の該水溶液の種類としては、生理食塩水、水（ミリＱ水などの超純水など）、りん酸緩衝溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、グッドバッファーなど当業者に周知のものが使用可能であるが、生理食塩水やりん酸緩衝溶液が好適であり、緩衝溶液のうち、りん酸緩衝溶液のうち、トリス緩衝溶液を使用する際は低濃度（例えば１０ｍＭ以下、具体的には１〜５ｍＭ）で使用することが好ましい。
【００３９】
前記所定濃度でポリマー材料と核酸とを混合させてなる遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低温では親水性となり、所定温度（Ｔ）よりも高温では疎水性を示すようになる。この所定温度（Ｔ）としては、２５〜３７℃、特に３０〜３５℃が好ましい。
【００４０】
前記所定温度が３０℃である場合には、３０℃よりも低い温度、例えば１０〜２５℃程度の遺伝子導入材料の水溶液を培養容器などに塗布などにより付着させ、３０℃よりも高い温度に昇温させ、必要に応じ乾燥させることにより、水不溶性の、核酸を担持したコーティングが形成される。
【００４１】
≪ポリマー材料≫
本発明において用いるポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターに少なくともＤＭＡＥＭを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００４２】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００４３】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００４４】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００４５】
イニファターと上記ＤＭＡＥＭとを反応させるには、イニファター、及びＤＭＡＥＭを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭが結合した反応生成物を生成させる。
【００４６】
該原料溶液中のＤＭＡＥＭの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４７】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えば蛍光灯、ショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。市販の蛍光灯を用いて光照射を行う場合には、１〜１００時間程度光照射を行うことが好ましい。
【００４８】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分にＤＭＡＥＭ単位よりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００４９】
このポリマー材料の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、１００〜６０，０００程度、特に２００〜３０，０００程度が好ましい。この分子量は、光照射の時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、重合反応を進行させて分子量の大きい分岐型重合体を得ることができる。
【００５０】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５１】
ポリマー材料の分岐鎖は、前述のＤＭＡＥＭをモノマーとする１種のモノマーのみからなるホモポリマーであることが好ましいが、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭとは異なる１種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。
【００５２】
この場合の他のモノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のビニル系モノマーが挙げられ、特に、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００５３】
イニファターとＤＭＡＭＥとＤＭＡＥＭとは異なるモノマーとを反応させるには、前述のイニファターとＤＭＡＥＭとを反応させる場合と同様に、イニファター、ＤＭＡＥＭ、及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対し、ＤＭＡＥＭ及びＤＭＡＥＭ以外のモノマーが結合したランダムコポリマーを得る。
【００５４】
また、上記イニファターに対し、まず、ＤＭＡＥＭをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＤＭＡＥＭのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。
いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００５５】
前記のように、ＤＭＡＥＭとＤＭＡＥＭ以外のモノマーとを反応させた場合には、分岐鎖１本当りのＤＭＡＥＭ単位の分子量が、当該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上、特に９５〜１００％となるようにするのが好ましい。ＤＭＡＥＭ単位はカチオン性であるため、分岐鎖に含まれるＤＭＡＥＭ単位が多いほど、ポリマー材料とアニオン性である核酸との親和性が高くなり、核酸担持量を高めることができ、遺伝子導入材料の遺伝子導入活性が向上する。
【００５６】
また、本発明において、ポリマー材料は核酸の担体として機能すると共に、培養容器等への付着のためのアンカーとして機能することから、ポリマー材料の分岐型重合体の分岐鎖は多い方が好ましく、分岐鎖は４本以上、特に６本であることが好ましい。
【００５７】
また、ポリマー材料の分子量としては、上記機能を有効に得る上で５，０００〜５００，０００程度、特に２５，０００〜１５０，０００程度が好ましい。
【００５８】
≪核酸≫
核酸としては、各種ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイや単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が利用できる。また、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が利用できる。
【００５９】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６０】
［培養容器］
培養容器としては、シャーレ、フラスコ、培養プレート（マルチウェルプレート）などが例示される。その材質は、合成樹脂、ガラス、金属などのいずれでもよい。本発明の遺伝子導入材料を培養容器などに適用する場合、培養容器の表面に本発明の遺伝子導入材料を０．７ｎｇ／ｍｍ２〜７０μｇ／ｍｍ２程度の密度で付着させるのが好ましい。
【００６１】
培養容器などに遺伝子導入材料を付着させる方法としては、後述の実施例に記載の方法を挙げることができるが、培養容器に遺伝子導入材料をピペッティングした後、培養容器を温和に上下左右に転倒させて容器内面全体に流延させることにより付着させ、次いで３０〜４０℃で１０〜１００分程度インキュベートする方法でもよい。この方法を採用する場合、前述のインキュベートを行った後に無菌雰囲気下で乾燥させても良く、インキュベートを省略して無菌雰囲気下で乾燥させても良い。
【実施例】
【００６２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
（１） イニファターの合成（６分岐型）
イニファターとしての１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６４】
１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇとをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をクロロホルム２００ｍＬに溶解させた後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。この結晶を高速液体クロマトグラフィーで分析し、結晶中に原料が含まれていないこと、及び結晶が単一物質であることを確認した。
【００６５】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，３６Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，１２Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，１２Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２）であった。
【００６６】
【化１】
【００６７】
（２） ６分岐型重合体の合成
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレートをモノマーとして用い、１，２，３，４，５，６−ヘキサキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）メチル］ベンゼンの合成を行った。
【００６８】
上記（１）により合成した１，２，３，４，５，６−ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４６．０ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムに溶解し、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート８．０ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。１ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード、流量：２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後、丸管形ブラック蛍光灯（Ｏ字形）（東芝製：ＦＣＬ３０ＢＬ）の環の内側に前記ガラスセルとマグネットスターラーを配置し、ガラスセルの側面の全周方向から蛍光灯の光を９６時間照射した。光照射後の溶液の色は薄い黄色であった。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ｎ−ヘキサンで重合物を再沈殿させ、ｎ−ヘキサンをデカンテーションした後、沈殿物をクロロホルムに溶解した。溶媒をエバポレーター留去し、フラスコの内壁面にフィルムを形成した。ジエチルエーテル／ｎ−ヘキサン（ｖ／ｖ：１／１）の混合溶液で前記フィルムを洗浄することにより精製し、目的とする６分岐型重合体を得た。ＧＰＣにより、この重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、２６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．０）であった。また、計算により分岐鎖１本当たりの分子量を求めたところ、４１５９であった。
【００６９】
【化２】
【００７０】
（３） 曇点の評価
上記（２）で合成した６分岐型重合体２０ｍｇを水に溶解させ、溶解させた直後（実験例１）、溶解から１時間後（実験例２）、３時間後（実験例３）、５時間後（実験例４）、及び２４時間後（実験例５）の溶液の３０〜４０℃における光透過率を測定することにより前記重合体の曇点（ＬＣＳＴ）を求めた。結果を図１に示す。
【００７１】
全ての実験例において、温度の上昇により溶液が白濁したことから、前記重合体が温度感応性を備えていることが分かる。また、溶解させてから測定までの保持時間に比例して曇点が上昇したこと、及び時間の経過と共に溶液中に揮発性の低分子量アミン化合物が生成していたことから、経時的に６分岐型重合体中の２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート単位が、水溶液中で加水分解され、脱溶媒和の性質が徐々に失われることが分かる。
【００７２】
（４） 核酸複合体（遺伝子導入成分）の調製
上記（２）で合成した６分岐型重合体と、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ（プロメガ社：ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ）とを水溶液中で混合して複合体の形成を行った。６分岐型重合体の溶液として、濃度が１．６μｇ／１００μＬである水溶液を調製した。また、核酸（ＤＮＡ）溶液として、濃度が１．５〜１５．０μｇ／１００μＬである水溶液をそれぞれ調製した。前記６分岐型重合体水溶液と、各ＤＮＡ水溶液とを混合し（実験例６〜１１）、混合直後から２４時間後まで経時的に３０〜４５℃における光透過率を測定し、曇点を求めた。
【００７３】
各混合液の６分岐型重合体の濃度、ＤＮＡ濃度、Ｃ／Ａ比及び混合から５時間後及び２４時間後の曇点を表１に示す。なお、６分岐型重合体溶液中のカチオンのモル数は、溶液に含まれる６分岐型重合体のモル数に下記６分岐型重合体１モル当りのカチオンの数を掛けることにより求めることができ、また、ＤＮＡ溶液中のアニオンのモル数は、溶液中のＤＮＡの重量をその分子量で除して求めることができる。なお、ＤＮＡの分子量は、遺伝子マップの情報から得られる塩基対の数と塩基対の平均分子量（６６０）より求めることができる。つまり以下の通りである。
＜６分岐型重合体１モル当りのカチオン（ＤＭＡＥＭ単位）の数＞
６分岐型重合体の数平均分子量 ： ２６，０００
イニファターの分子量 ： １０４６
ＤＭＡＥＭ単位（１分子当り）の分子量 ： １５７
（２６，０００−１０４６）／１５７＝１５９（カチオン（ＤＭＡＥＭ単位）の数）
＜ＤＮＡ（ｐＧＬ３）の分子量＞
ｐＧＬ３の塩基対 ： ５２５６ｂｐ
塩基対の平均分子量 ： ６６０
５，２５６×６６０≒３，４７０，０００
【００７４】
【表１】
【００７５】
実験例６では、曇点が調製直後から徐々に上昇し、５時間後には３５℃、２４時間後には４２℃まで上昇した。
実験例７では、混合後に非常に緩やかに曇点が上昇した。５時間後の曇点は３３．５℃、２４時間後の曇点は３５．５℃であり、一般的な培養温度である３７℃まで上昇しなかった。
実験例８では、調製直後から２４時間後までの間で曇点の変化がほとんどなく、３３．０℃付近で一定であった。
実験例９では、曇点にほとんど変化がなく、２４時間後の曇点は３２．３℃であった。
実験例１０では、混合直後から曇点が上昇し、５時間後の曇点が４０．０℃、２４時間後の曇点が４２．０℃であった。これは、前述の加水分解によるものではなく、調製液中のＤＮＡの比率が高くなり、ＤＮＡのアニオン性電荷の効果により、６分岐型重合体自体の性質が発現しにくくなったためであると考えられる。
実験例１１では、６分岐型重合体の温度感応性の性質が確認できず、４２℃以上でも安定して水に分散していた。
【００７６】
以上より、６分岐型重合体の濃度が１．６μ／１００μＬの場合、ＤＮＡの濃度が２．５〜４．５μｇ／１００μＬの範囲、即ち、Ｃ／Ａ比が１／０．７〜１／１．２であると、混合から２４時間後でも曇点に大きな変化がない。これは、ＤＮＡが、６分岐型重合体の分岐鎖の近傍に存在し、水分子の接近による加水分解を抑制するためであると考えられる。
【００７７】
（５） 核酸複合体の調製と培養皿へのコーティング、及び遺伝子導入活性の評価
上記（２）で合成した６分岐型重合体１．６μｇを生理食塩水へ溶解し、全量を６０μＬとした。一方、前記ＤＮＡ（ｐＧＬ３）３．０μｇを希薄（１．０ｍＭ程度）なＴＥ緩衝溶液へ溶解し、全量を９０μＬとした後、この溶液を速やかに前記重合体溶液に滴下することにより６分岐型重合体とＤＮＡとを複合させた。この混合溶液を２４Ｗｅｌｌ培養皿へ２５μＬずつ分注し、転倒混和してＷｅｌｌ表面になじませ、３７℃で３分間インキュベートし、３７℃のＰＢＳで１回リンスした。
【００７８】
この培養皿の各ＷｅｌｌにＣＯＳ−１細胞の浮遊液（６×１０４個／ｍＬ）を１ｍＬずつ播種し、４８時間培養した。培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え、４℃で３０分間放置し、超遠心処理で不溶物を沈殿させて上澄を遺伝子導入活性評価用の試料とした。遺伝子導入活性の評価はルシフェラーゼアッセイで行った。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のルシフェラーゼアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行い（実施例１）、後述の比較例１と比較した。
【００７９】
（６） イニファターの合成（４分岐型）
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下室温で４日間撹拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノール中に投入して３０分間撹拌した後、濾過した。この操作を繰り返し合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、熱濾過後、冷蔵庫内で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥し、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。この結晶を高速液体クロマトグラフィーにより分析し、結晶中に原料が含まれていないこと、及び結晶が単一物質であることを確認した。
【００８１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果は、δ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）であった。
【００８２】
【化３】
【００８３】
（７） ４分岐型重合体の合成
（７−１） 下記手順に従い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）メチル］ベンゼン（１次ポリマー）の合成を行った。
【００８４】
上記（６）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を２０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に真空乾燥することにより、目的とする４分岐型重合体の１次ポリマーを得た。ＧＰＣにより、この重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）であった。また、分岐鎖１本当たりの分子量を計算により求めたとこと、８，５００であった。
【００８５】
【化４】
【００８６】
（７−２） 下記の手順に従い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）メチル］ベンゼンの合成を行った。
【００８７】
上記（７−１）で合成した１次ポリマー１．０ｇ及び３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド７．９ｇを約３０ｍｌのメタノールへ溶解させた。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく撹拌しながら高純度窒素ガス（Ｇ１グレード，流量２Ｌ／ｍｉｎ）で１０分間パージした後に、前記（７−１）と同じ装置を用いて４０分間光照射を行った。重合体をクロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返し、エーテルを蒸散させた後、少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて目的とする４分岐型重合体（２次ポリマー）を得た（重合率２８％）。ＧＰＣによりこの重合体のポリエチレングリコールを標準物質とした数平均分子量を測定したところ、８３，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．６）であった。また、計算により、分岐鎖１本当たりの分子量は、２０，５００であることが分かった。
【００８８】
以上の手順により、ベンゼンを中心核として放射状にＮ−イソプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量３５，０００）と３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック（分子量４８，０００）とが導入された４分岐型重合体を合成した。
【００８９】
【化５】
【００９０】
（８） ４分岐型重合体と核酸との核酸複合体の調製と培養皿へのコーティング、及び遺伝子導入活性の評価
前記（７）で合成した４分岐型重合体を１０℃の水へ溶解し、０．２μｍシリンジフィルターで濾過した後、濃度を０．１ｍｇ／ｍＬに調整した。この重合体溶液を２４Ｗｅｌｌ培養皿の各Ｗｅｌｌへ２００μＬずつ加えて軽く転倒振盪し、底面の全面に溶液を流延した。これを３７℃、５％炭酸ガス濃度の培養器へ移し、５分間インキュベートし、３７℃のＰＢＳで軽くリンスして廃液した。ここに３７℃に温調したＤＮＡ溶液（０．５μＬ／ｍＬ）を各Ｗｅｌｌへ１ｍＬずつ加えて３７℃で３分間インキュベートした。ここへＣＯＳ−１細胞を６×１０４個／ｍＬに調整して播種し、４８時間培養した。ＤＮＡは実施例１と同じものを用いた。
【００９１】
培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え４℃で３０分間放置し、遺伝子導入活性評価用の試料とした。遺伝子導入活性の評価は、実施例１と同様の評価方法で行った（比較例１）。
【００９２】
（９） 評価結果及び考察
実施例１における遺伝子導入活性は、比較例１の遺伝子導入活性の１０倍以上であった。比較例１においては、４分岐型重合体の分岐鎖中に、ＤＮＡの担持に寄与しないポリマーブロックが存在していたことから、基材表面がミクロ的には不均質になり、ＤＮＡの供給に寄与することができないスポットが存在したためであると考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、
該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、
該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐鎖１本当りの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記分岐鎖は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分を含む水溶液であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項６】
請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料の分子量は、５，０００〜５００，０００であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項９】
請求項８において、前記所定温度（Ｔ）は、２５〜３７℃の間の温度であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項１０】
培養液が接する容器内面に、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入材料を付着させた培養容器。
【請求項１】
核酸と、ポリマー材料とからなる遺伝子導入成分を含む遺伝子導入材料において、
該ポリマー材料は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を重合主成分とする分岐鎖を複数本有する分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であり、
該ポリマー材料と該核酸とのカチオン／アニオン比が１／０．７〜１／１．２であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐鎖１本当りの２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位の分子量が、該分岐鎖１本当りの分子量の９０％以上であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記分岐鎖は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体単位のみからなることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分を含む水溶液であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体を光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項６】
請求項５において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記ポリマー材料の分子量は、５，０００〜５００，０００であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記遺伝子導入成分は、所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項９】
請求項８において、前記所定温度（Ｔ）は、２５〜３７℃の間の温度であることを特徴とする遺伝子導入材料。
【請求項１０】
培養液が接する容器内面に、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入材料を付着させた培養容器。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−４４９８６（Ｐ２０１２−４４９８６Ａ）
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１６２２６９（Ｐ２０１１−１６２２６９）
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月８日（２０１２．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月２５日（２０１１．７．２５）
【出願人】（５１００９４７２４）独立行政法人国立循環器病研究センター (52)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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