遺伝子発現抑制のための方法及び組成物
【課題】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法及び該方法のための組成物を用いて、有効性の高いがんの治療方法を提供することにある。
【解決手段】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ、前記２本鎖ＲＮＡを転写反応により生成することができる核酸、該核酸が挿入されたベクター、前記２本鎖ＲＮＡ、核酸、ベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物、ならびに当該組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法。
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法及び該方法のための組成物を用いて、有効性の高いがんの治療方法を提供することにある。
【解決手段】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ、前記２本鎖ＲＮＡを転写反応により生成することができる核酸、該核酸が挿入されたベクター、前記２本鎖ＲＮＡ、核酸、ベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物、ならびに当該組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学、薬学、畜産学の分野において、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ； ＧｎＴ−Ｖ）の発現を抑制する方法並びに当該方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧｎＴ−Ｖは糖タンパク質Ｎ−結合型糖鎖のトリマンノシルコアの、α−１，６結合により分岐したマンノース残基にβ−１，６結合によりＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を転移する酵素である。ラット、ヒト及びマウスのＧｎＴ−Ｖ遺伝子がすでにクローニングされている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【０００３】
糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の構造は様々な生物機能に関連することが報告されている。例えば、がん細胞において糖鎖の高分岐化が見られること（例えば、非特許文献４参照）、β１−６結合により分岐した細胞表面糖鎖の量とがん細胞の転移能が正の相関関係にあり、この分岐構造はＧｎＴ−Ｖにより形成されること（例えば、非特許文献５参照）が挙げられる。また、ＧｎＴ−Ｖが発現している直腸がんは発現していないものよりも転移しやすく、予後が悪いこと（例えば、非特許文献６参照）、正常組織においてＧｎＴ−Ｖが発現している肺においては、ＧｎＴ−Ｖ発現レベルの低い癌細胞の方が悪性度は高いこと（例えば、非特許文献７参照）等が報告されている。ＧｎＴ−Ｖタンパク質は糖転移酵素活性に加えて血管新生促進活性を有しており、糖タンパク質糖鎖のβ１−６分岐の増加による転移能の上昇とあいまってがんを悪性化させる原因になると考えられている（例えば、非特許文献８参照）。
１９９８年に報告された線虫におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的なｍＲＮＡ分解が生じることによる遺伝子発現の抑制現象として注目されている（例えば、非特許文献９参照）。前記ＲＮＡ干渉は、長鎖２本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩタイプリボヌクレアーゼの活性によりｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡに分解され、続いて、該ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるリボ核酸タンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡにＡＴＰ依存的に結合し、標的ＲＮＡを分解するというメカニズムにより起こると考えられている（例えば、非特許文献１０、１１参照）。哺乳動物細胞内に３０ｂｐ以上の長鎖２本鎖ＲＮＡが存在すると、インターフェロン応答が起きて細胞死に至ることが知られている。その後、２０ｂｐ前後の短い２本鎖ＲＮＡ又は２０ｂｐ前後の２本鎖を含有するＲＮＡの細胞への導入又は発現により、哺乳動物細胞でもＲＮＡ干渉を応用して遺伝子発現を抑制することが可能であることが報告されている（例えば、非特許文献１２、１３参照）。
糖転移酵素遺伝子の発現をＲＮＡ干渉により抑制した例としては、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（例えば、非特許文献１４参照）、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（例えば、非特許文献１５参照）、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、非特許文献１６、１７参照）等が報告されている。しかしながら、ＲＮＡ干渉法を用いてＧｎＴ−Ｖの遺伝子発現を抑制することについて報告はない。
【０００４】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入する方法（例えば、非特許文献１８参照）、ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加する方法（例えば、非特許文献１９参照）等が報告されているが、効果や特異性の点で十分とは言いがたいという問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２１），１５３８１−１５３８５（１９９３）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８（１），３１８−３２７（１９９４）
【非特許文献３】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２（７），３８９−３９４（２００２）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４（９），３７３０−５（１９８４）
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６（４８０１），５８２−５８５（１９８７）
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６（５），１７７２−１７７７（２０００）
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（５），１７７３−１７７９（２００４）
【非特許文献８】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（１９），１７００２−１７００８（２００２）
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、第８０６〜８１１頁（１９９８）
【非特許文献１０】Ｃｅｌｌ、第１０１巻、第１号、２５〜３３頁（２０００）
【非特許文献１１】Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１５巻、第２号、１８８〜２００頁（２００１）
【非特許文献１２】Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、第６８３６号、第４９４〜４９８頁（２００１）
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第２２２−２２６（２００５）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８８（７），９０１−９０８（２００４）
【非特許文献１５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（１３），１２５０３−１２５１６（２００５）
【非特許文献１６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７９（３），２８９−２９６（２００５）
【非特許文献１７】ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４（４），２３５−２４３（２００５）
【非特許文献１８】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２６４（２），５０９−５１７（１９９９）
【非特許文献１９】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４９５（３），２９７−３０７（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、より有効性の高いがんの治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、鋭意研究を行った結果、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列を標的配列とすることによりＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を効率よく抑制できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡに関する。
本発明の第１の発明において、該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡであってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造であってもよい。
【０００９】
本発明の第２の発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸に関する。
本発明の第２の発明において、上記核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸であってもよい。また塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。
また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造をとるものが好適である。
【００１０】
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の核酸が挿入されたベクターに関する。
【００１１】
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の２本鎖ＲＮＡ、第２の発明の核酸、第３の発明のベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物に関する。
【００１２】
本発明の第５の発明は、本発明の第４の発明の組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、がん細胞の転移能を減少させ及び／又は増殖能を減少させることを可能にする組成物が提供される。前記の組成物は、がんの治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクター
本発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子（例えば、ヒトＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４１０）の発現を制御できるものが好ましく、２本鎖ＲＮＡ、転写反応後に当該２本鎖ＲＮＡが生成するように構築された核酸、あるいはベクターである。本発明のＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現を制御するための２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクターに特に限定はなく、上記標的配列を標的としてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸、好ましくはＲＮＡ干渉によりＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸であればよい。
上記２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクターが有する塩基配列は、特に限定はされないが例えばヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子の部分配列である配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列で示される領域の少なくとも一つが好適に使用できる。また、当該選択される領域は、複数を組み合わせてもよい。
【００１５】
上記選択される領域を標的配列としてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制するメカニズムに特に限定はないが、２０〜３０塩基前後の短鎖２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉法が特に好ましい。すなわち、ＲＮＡ干渉法はアンチセンスＲＮＡを用いる方法に比べて効率よく遺伝子発現を抑制されていること、及び長鎖２本鎖ＲＮＡを哺乳類細胞に導入し、又は発現させると、インターフェロン応答が起きて細胞死を誘発すること等による。
【００１６】
本明細書において、２本鎖ＲＮＡとは、標的配列の相補鎖の一部又は全部を含むアンチセンス鎖ＲＮＡと、標的配列に対応する部分においてアンチセンス鎖とハイブリダイズしうるセンス鎖ＲＮＡがハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡを意味する。
本発明の２本鎖ＲＮＡの一つの形態としてｓｉＲＮＡが挙げられる。当該ｓｉＲＮＡの２本鎖部分は、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１５〜３５塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜３０塩基対の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、２０〜３０塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列がＲＮＡ干渉を起こしうるかぎり、標的配列のすべての塩基配列を含んでいてもよく、標的配列の一部を含んでいてもよく、標的配列以外の配列を含んでいてもよい。さらに、本発明の２本鎖ＲＮＡには、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側にデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが２〜４塩基突出した２本鎖ＲＮＡの形状のもの、さらに好ましくは３’末端側に２塩基突出した２本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。２〜４塩基としてはＴＴ配列〜ＴＴＴＴ配列又はＵＵ配列〜ＵＵＵＵ配列が例示される。なお、突出部分の塩基がデオキシリボヌクレオチドである場合、当該核酸を構成するオリゴヌクレオチドはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであるが、本明細書ではこれも２本鎖ＲＮＡと呼ぶ。また、前記２本鎖ＲＮＡが生理的条件下、細胞内において２本鎖構造をとりうる範囲内で、センス鎖に塩基の置換、挿入又は欠失を導入してもよい。この場合、ｓｉＲＮＡはミスマッチ又はバルジを有する。さらに、センス鎖とアンチセンス鎖の間にループ構造を有するようにデザインされた核酸配列を含むものであってもよい。
【００１７】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる配列の観点から、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列に対応するｓｉＲＮＡである。
言い換えれば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡが好ましい。また、該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡであってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であってもよい。
【００１８】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、特に限定されないが、２’−ＡＣＥ（２’−ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）又は２’−ＴＢＤＭＳ（２’−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙｌ）等の保護基を用いた化学合成法又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを使用する酵素合成法により合成することができる。
化学合成法又は酵素合成法により合成された２本鎖ＲＮＡは、特に限定は無いが、安定化や標識化のために、化学修飾基により修飾してもよい。本発明に使用できる修飾には特に限定は無いが、例えば、６−フルオレセイン付加、ビオチン付加、２’−Ｏ−メチル化、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）化、アミノ化、等が挙げられる。当該修飾基は、ＲＮＡ干渉作用を阻害しない限り、５’末端、３’末端あるいは内部塩基のいずれに付加してもよい。
【００１９】
本発明の別の形態としては、転写反応後に上記２本鎖ＲＮＡを生成するように構築された核酸が例示される。例えば、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列を、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を哺乳動物細胞内において発現しうる核酸が例示される。言い換えれば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸である。また、当該核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸であってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造をとるものであってもよい。
【００２０】
当該核酸により生成する２本鎖ＲＮＡは、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御しうる核酸の形態としては特に限定はされないが例えば、上記ｓｉＲＮＡ及びｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖が、ＲＮＡからなるループにより連結された部分的２本鎖構造を有する。当該ｓｈＲＮＡにおいてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる限り、ループの鎖長及び塩基配列に限定はない。また、ベクターにより発現するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのセンス鎖は、化学合成法又は酵素合成法により合成した２本鎖ＲＮＡと同様に、塩基の置換、挿入又は欠失が導入されていてもよい。
【００２１】
本発明の核酸は、直鎖状核酸の形態で目的の細胞内に導入し、細胞内で発現させて２本鎖ＲＮＡを生成させることができる。特に限定はされないが、例えば転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生じる塩基配列を有する核酸をＰＣＲ法等で作製し、プロモーター、好ましくはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、の下流に挿入して作製することができる。あるいは、下記ベクター形態であってもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の形態として、転写反応後に上記２本鎖ＲＮＡが生成される核酸を含有するベクターであっても良い。
本発明のベクターは、哺乳動物細胞内でＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を発現させるためのベクターであり、当該細胞内で効率良く発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、特に限定はないが、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡ並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐＢＡｓｉシリーズベクター（商品名、タカラバイオ社製）、ｐｉＧＥＮＥ ｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣ Ｈｙｇｒｏ Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ａｍｂｉｏｎ社製）等が好適に使用できる。
さらに前記直鎖状２本鎖ＤＮＡベクターであっても良く、特に限定はされないが、ｓｉＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ ベクターシステム（商品名、Ｍｉｒｕｓ社製）等が好適に使用できる。また、前記アデノウイルスベクターとしては、ＢＤ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）が挙げられる。さらに、レトロウイルスベクターとしては、ｐＳＩＮｓｉベクターシリーズ（商品名、タカラバイオ社製）及びｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等が挙げられる。
【００２３】
当該ベクターの構築は、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡ干渉の場合（Ａ）異なる２つのプロモーター制御下に、前記核酸に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置して、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプとして、（Ｂ）１つのプロモーター制御下に本発明のＲＮＡ干渉剤に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをループをコードする核酸を挟んで配置して、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがそれぞれループで連結されたステムループタイプ（又はヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプとして、（Ｃ）ベクターのセンス鎖にて機能するプロモーター制御下に一方のＲＮＡをコードする核酸を、アンチセンス鎖にて機能するプロモーター制御下に該ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を配置して、それぞれ別個のプロモーター制御下でそれぞれのＲＮＡを転写する対向タイプとして、あるいは、（Ｄ）センス鎖を発現するベクターとアンチセンス鎖を発現するベクターを別々に作製したのち同一の細胞に導入するセパレートタイプとして、構築することにより行われうる。本発明の組成物に含有されるＲＮＡ干渉ベクターの形態においては、特に限定されないが、好ましくは、反応条件、例えば、ベクターの種類、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセンス配列の種類等に応じ、タンデムタイプ、ステムループタイプ、対向タイプ、セパレートタイプを使い分けることが望ましい。さらに複数の標的配列を同時に発現させるものであっても良い。
【００２４】
なお、前記ベクターにより発現する、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸は、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列であって、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列であれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、以下の２つの条件：
（ｉ）転写開始点は、プリン残基〔グアニル酸残基（Ｇ）又はアデニル酸残基（Ａ）〕とすること；及び
（ｉｉ）転写されるＲＮＡの３’末端に連続した４個のウラシル残基が付加されるため、転写されるＲＮＡの５'末端の２塩基はＡＡとすること；
を満たすことが望ましい。
【００２５】
また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、
（ｉ）ステムループタイプにすること；及び
（ｉｉ）短いポリ（Ａ）配列を付加すること；
が望ましい。
【００２６】
以下にＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を発現するベクターの作製方法について事例を挙げて説明する。
すなわち、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列を選択し、これに対応するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが転写されるようにベクターを構築する。あるいは、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡの転写反応を異なるベクターで行うように構築してもよい。
ここで、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの転写に用いる発現ベクターは転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生じる塩基配列を有する核酸をＰＣＲ法等で作製し、プロモーター、好ましくはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、の下流に挿入して、発現カセットを作製し、該カセットを適切な骨格となるベクター、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター等に連結することにより作成されたベクターも好適に使用できる。あるいは、転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生成するための塩基配列を有する核酸を化学合成し、必要に応じて制限酵素の認識配列のタグを付加し、得られた核酸を、ベクターに挿入することにより調製することができる。細胞へのトランスフェクション効率を改善する観点からは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターが骨格となるベクターとして好適に使用できる。
【００２７】
本発明に用いるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーター等が挙げられる。前記プロモーターは、野生型及び／又は変異体型のいずれであってもよい。また、組織特異的プロモーターを用いることにより、所望の部位、臓器等においてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸の発現が可能となる。特に限定はされないが、例えば、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーター等が挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーター等が挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密に発現を制御することもできる。
【００２８】
（２）本発明の組成物
さらに本発明の組成物は、上記（１）の２本鎖ＲＮＡ、当該２本鎖ＲＮＡを生成する核酸あるいはベクターを有効成分とする組成物である。また、本発明の組成物において、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる２本鎖ＲＮＡ又は当該２本鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞内において発現しうる核酸あるいはベクター以外に安定化剤、ｐＨ調整剤等の細胞内への導入を促進するような有効成分が含まれていてもよい。当該有効成分としては、特に限定はされないが例えばＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を導入する場合および上記ベクターがプラスミドベクターである場合には、ＴｒａｎｓＩＴシリーズのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ社製）、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のトランスフェクション試薬が例示される。また、上記ベクターがレトロウイルスベクターである場合には、フィブロネクチンまたはその断片、たとえば組換えヒトフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６が例示される。
【００２９】
医薬品として本発明の組成物を使用する場合には、特に限定はされないが例えば、前記有効成分を薬学的に許容される公知の担体と組み合わせた組成物を調製することができ、また、その使用目的に応じて製剤化することもできる。例えば、注射剤、点滴用剤のような医薬組成物としてもよい。前記の医薬組成物は、例えば制ガン剤として有用である。なお、医薬組成物としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び投与される患者の年齢、体重、症状に応じて適宜設定されるのは当然のことである。
【００３０】
（３）本発明のＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現抑制方法
本発明の方法は、上記（２）記載の組成物を用いることを特徴とするＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現抑制方法である。対象となる遺伝子は、ヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子に特に限定されない。すなわち、本発明の方法は、ヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子の部分配列である配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列で示される領域の少なくとも一つを発現抑制の標的配列とする。また、当該標的配列は、複数を組み合わせてもよい。
特に限定はされないが例えば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ、あるいはＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドである２本鎖ＲＮＡ、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡ、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖である２本鎖ＲＮＡ、さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造を有する２本鎖ＲＮＡを用いることができる。
【００３１】
あるいは、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸、当該核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸、転写反応後に塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする核酸、また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造をとることができる前記核酸のいずれもが好適に使用できる。また、前記核酸が挿入されたベクターも好適に使用できる。
【００３２】
さらに、上記（２）の組成物の形態で使用してもよい。
【００３３】
本発明の方法において、当該組成物をマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、カチオン脂質法を用いて目的の組織あるいは細胞内に導入することができる。
【００３４】
また、医薬組成物の場合では、遺伝子導入効率の観点からは、ウイルスベクター、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いてｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにより投与することが好ましい。また、組成物調製の容易さ、増殖性ウイルスの出現等のウイルスベクター特有の危険を避けるという観点からは、ｓｉＲＮＡ含有組成物、プラスミドベクター含有組成物または直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター含有組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにより投与することが好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に示すが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１ ｓｉＲＮＡの導入
（１）Ｈｕｈ６細胞へのｓｉＲＮＡの導入
ヒトＧｎＴ−Ｖ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４１０） ｃＤＮＡ配列をもとに配列表の配列番号１〜１０に記載の塩基配列を有するｓｉＲＮＡ構築領域を選択した。これらの塩基配列をもとに配列表の配列番号１１〜３０記載の塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチド（Ａ１〜Ａ２０）を合成した。当該キメラオリゴヌクレオチドは、その３'末端に２塩基のデオキシリボヌクレオチドが配置されている。前記Ａ１〜２０のキメラオリゴヌクレオチドは、表１に示す組み合わせで常法によりリボヌクレオチド部分をアニールさせたあと、２０μＭとなるように滅菌水に溶解し、ｓｉＲＮＡ溶液として用いた。また、配列表の配列番号３１及び３２で表されるキメラオリゴヌクレオチド（Ｃ２１、２２）を、緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２６５４）をもとに合成し、同様の方法でアニールさせて陰性対照とした。
【００３７】
【表１】
【００３８】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１１０巻、第８３７−８４１頁（１９８３）記載のＨｕｈ６細胞を８×１０４個／ｍｌとなるように１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、この細胞懸濁液２．５ｍｌを６穴プレートの各ウェルに加えた。
次ぎに１５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）と６０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を混合して室温で１０分間放置した後、２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地と１５μｌのｓｉＲＮＡ溶液を混合しておいたチューブに添加した。これを室温にて２０分間放置した後、更に１６０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を加えて５００μｌにしたものをＨｕｈ６細胞の入ったプレートの各ウェルに加えた。これを３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ中で４８時間培養した。
【００３９】
（２）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
上記（１）で培養した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを鋳型とし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡの定量を行った。
逆転写時の反応液組成は次のとおりである：２μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ用５×添付緩衝液〔２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２〕（タカラバイオ社製）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１００μＭ Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｐｄ（Ｎ）６（タカラバイオ社製）、０．２５μｌの４０Ｕ／μｌ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ヒト胎盤由来、タカラバイオ社製）、０．２５μｌの２００Ｕ／μｌ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）、５μｌの４ｎｇ／μｌ 鋳型ＲＮＡ、１．５μｌの蒸留水で反応容量を１０μｌとした。なお、鋳型ＲＮＡとして５μｌの４０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、０．４ｎｇ／μｌ、０．０４ｎｇ／μｌ、０．００４ｎｇ／μｌまたは０．０００４ｎｇ／μｌ 陰性対照由来ＲＮＡを使用して同様の反応液を調製し、検量線作成用とした。これらの反応液を４２℃で１０分間インキュベートした後、９５℃で２分間加熱した。
【００４０】
ＰＣＲ時の反応液組成は次のとおりである：２．５μｌの１０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社製）、０．３μｌの２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２５μｌの５Ｕ／μｌ ＥｘＴａｑ（タカラバイ社製）、０．５μｌの各１０μＭプライマー混合物（配列表の配列番号３３と３４記載の塩基配列を有する）、２．５μｌの３０００倍希釈ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）、１．２５μｌのジメチルスルホキシド、２．５μｌの５Ｍベタイン、５μｌの逆転写反応液、５μｌのｃＤＮＡ ｂｕｆｅｒ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ〕、４．４５μｌの蒸留水で反応容量を２５μｌとした。なお、配列表の配列番号３５と３６記載の塩基配列を有するヒトβ−アクチン特異的プライマーを用いて同様の反応液を調製した。これらの反応液をＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍにセットし、９５℃で５秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１５秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲを行った。
検量線作成用の反応により、陰性対照由来ＲＮＡ量とＣｔ値との関係を示す検量線を作成し、これを用いて各試料に含まれるＧｎＴ−Ｖおよびヒトβ−アクチンのｍＲＮＡ量を算出した。各試料のＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量をヒトβ−アクチンｍＲＮＡ量で除することにより補正し、ＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値とした。各試料におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値を、陰性対照におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値に対する相対値として算出した。
【００４１】
その結果を図１に示す。すなわち、図１は各ｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現量を示す図であり、縦軸はＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値（相対値）を示す。図中、「ｎｅｇａ」は、陰性対照を示す。
図１に示したように、ｓｉ−１、ｓｉ−５、ｓｉ−１１、ｓｉ−１４、ｓｉ−１８、ｓｉ−２４、ｓｉ−２６およびｓｉ−７１はいずれも顕著なＲＮＡｉ効果を示した。一方、ｓｉ−１５およびｓｉ−４３はわずかなＲＮＡｉ効果しか示さなかった。
【００４２】
（３）ＧｎＴ−Ｖ酵素活性の測定
上記（１）で調製した１０５−１０６個の細胞を遠心分離により回収し、１００μｌのＣｅｌＬｙｔｉＴＭＭ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を加えた後、室温で１５分間振盪して懸濁した。前記懸濁液を１５，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により上清を回収してＧｎＴ−Ｖ粗酵素液とし、活性測定を行った。活性測定は、以下の手順で行った。
すなわち、３μｌのＧｎＴ−Ｖ粗酵素液、５μｌの２×緩衝液（２５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２５）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、１μｌの０．４Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製）、１μｌの３８５ｐｍｏｌ／μｌ ＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖（タカラバイオ社製、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０１２）を混合し、３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、９８℃で５分間加熱して酵素を失活させ、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して上清を得た。その上清１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。カラムはＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｒ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、タカラバイオ社製、ＣＡ８０００）、溶離液は０．５％１−ブタノール含有１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ４．０）を使用し、カラム温度は４０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。検出には蛍光検出器（ＲＦ−５３５、島津製作所社製）を使用し、励起波長を３２０ｎｍ、検出波長を４００ｎｍに設定した。この条件でＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖は約９．６分に、ＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖にＧｎＴ−Ｖが作用することにより生成するＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ，Ｇｎ−ｔｒｉ'糖鎖は約６．７分に溶出された。
その結果を図２に示す。すなわち、図２は各ｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ活性を示す図であり、縦軸はＧｖＴ−Ｖ活性（ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質／ｈ）を示す。図中、「ｎｅｇａ」は、陰性対照を示す。
【００４３】
図２に示したように、ｓｉ−１、ｓｉ−５、ｓｉ−１１、ｓｉ−１４、ｓｉ−１８、ｓｉ−２４、ｓｉ−２６およびｓｉ−７１はいずれも顕著なＲＮＡｉ効果を示した。一方、ｓｉ−１５およびｓｉ−４３はわずかなＲＮＡｉ効果しか示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量を示す図である。
【図２】本発明のｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ活性を示す図である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。また、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制用組成物が提供される。さらに、本発明の組成物は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の過剰発現を伴う疾患、たとえばがんの治療薬として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
SEQ ID NO:11;A synthetic chimera oligonucleotide A1. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:12;A synthetic chimera oligonucleotide A2. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:13;A synthetic chimera oligonucleotide A3. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:14;A synthetic chimera oligonucleotide A4. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:15;A synthetic chimera oligonucleotide A5. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:16;A synthetic chimera oligonucleotide A6. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:17;A synthetic chimera oligonucleotide A7. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:18;A synthetic chimera oligonucleotide A8. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:19;A synthetic chimera oligonucleotide A9. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:20;A synthetic chimera oligonucleotide A10. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:21;A synthetic chimera oligonucleotide A11. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:22;A synthetic chimera oligonucleotide A12. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:23;A synthetic chimera oligonucleotide A13. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:24;A synthetic chimera oligonucleotide A14. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:25;A synthetic chimera oligonucleotide A15. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:26;A synthetic chimera oligonucleotide A16. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:27;A synthetic chimera oligonucleotide A17. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:28;A synthetic chimera oligonucleotide A18. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:29;A synthetic chimera oligonucleotide A19. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:30;A synthetic chimera oligonucleotide A20. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:31;A synthetic chimera oligonucleotide C21. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:32;A synthetic chimera oligonucleotide C22. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:33;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human Gnt-V gene
SEQ ID NO:34;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human Gnt-V gene
SEQ ID NO:35;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human beta-actin gene
SEQ ID NO:36;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human beta-actin gene
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学、薬学、畜産学の分野において、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ； ＧｎＴ−Ｖ）の発現を抑制する方法並びに当該方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧｎＴ−Ｖは糖タンパク質Ｎ−結合型糖鎖のトリマンノシルコアの、α−１，６結合により分岐したマンノース残基にβ−１，６結合によりＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を転移する酵素である。ラット、ヒト及びマウスのＧｎＴ−Ｖ遺伝子がすでにクローニングされている（例えば、非特許文献１〜３参照）。
【０００３】
糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖の構造は様々な生物機能に関連することが報告されている。例えば、がん細胞において糖鎖の高分岐化が見られること（例えば、非特許文献４参照）、β１−６結合により分岐した細胞表面糖鎖の量とがん細胞の転移能が正の相関関係にあり、この分岐構造はＧｎＴ−Ｖにより形成されること（例えば、非特許文献５参照）が挙げられる。また、ＧｎＴ−Ｖが発現している直腸がんは発現していないものよりも転移しやすく、予後が悪いこと（例えば、非特許文献６参照）、正常組織においてＧｎＴ−Ｖが発現している肺においては、ＧｎＴ−Ｖ発現レベルの低い癌細胞の方が悪性度は高いこと（例えば、非特許文献７参照）等が報告されている。ＧｎＴ−Ｖタンパク質は糖転移酵素活性に加えて血管新生促進活性を有しており、糖タンパク質糖鎖のβ１−６分岐の増加による転移能の上昇とあいまってがんを悪性化させる原因になると考えられている（例えば、非特許文献８参照）。
１９９８年に報告された線虫におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡによって配列特異的なｍＲＮＡ分解が生じることによる遺伝子発現の抑制現象として注目されている（例えば、非特許文献９参照）。前記ＲＮＡ干渉は、長鎖２本鎖ＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩタイプリボヌクレアーゼの活性によりｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）と呼ばれる２１〜２５ヌクレオチドの短鎖ＲＮＡに分解され、続いて、該ｓｉＲＮＡが、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるリボ核酸タンパク質複合体に組み込まれ、標的ＲＮＡにＡＴＰ依存的に結合し、標的ＲＮＡを分解するというメカニズムにより起こると考えられている（例えば、非特許文献１０、１１参照）。哺乳動物細胞内に３０ｂｐ以上の長鎖２本鎖ＲＮＡが存在すると、インターフェロン応答が起きて細胞死に至ることが知られている。その後、２０ｂｐ前後の短い２本鎖ＲＮＡ又は２０ｂｐ前後の２本鎖を含有するＲＮＡの細胞への導入又は発現により、哺乳動物細胞でもＲＮＡ干渉を応用して遺伝子発現を抑制することが可能であることが報告されている（例えば、非特許文献１２、１３参照）。
糖転移酵素遺伝子の発現をＲＮＡ干渉により抑制した例としては、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（例えば、非特許文献１４参照）、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ（例えば、非特許文献１５参照）、α−１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、非特許文献１６、１７参照）等が報告されている。しかしながら、ＲＮＡ干渉法を用いてＧｎＴ−Ｖの遺伝子発現を抑制することについて報告はない。
【０００４】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターを細胞に導入する方法（例えば、非特許文献１８参照）、ａｌｌ ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄを添加する方法（例えば、非特許文献１９参照）等が報告されているが、効果や特異性の点で十分とは言いがたいという問題があった。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２１），１５３８１−１５３８５（１９９３）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８（１），３１８−３２７（１９９４）
【非特許文献３】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２（７），３８９−３９４（２００２）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４４（９），３７３０−５（１９８４）
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６（４８０１），５８２−５８５（１９８７）
【非特許文献６】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６（５），１７７２−１７７７（２０００）
【非特許文献７】Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０（５），１７７３−１７７９（２００４）
【非特許文献８】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（１９），１７００２−１７００８（２００２）
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、第８０６〜８１１頁（１９９８）
【非特許文献１０】Ｃｅｌｌ、第１０１巻、第１号、２５〜３３頁（２０００）
【非特許文献１１】Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、第１５巻、第２号、１８８〜２００頁（２００１）
【非特許文献１２】Ｎａｔｕｒｅ、第４１１巻、第６８３６号、第４９４〜４９８頁（２００１）
【非特許文献１３】Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第２２２−２２６（２００５）
【非特許文献１４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．８８（７），９０１−９０８（２００４）
【非特許文献１５】Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８０（１３），１２５０３−１２５１６（２００５）
【非特許文献１６】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．７９（３），２８９−２９６（２００５）
【非特許文献１７】ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２４（４），２３５−２４３（２００５）
【非特許文献１８】Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２６４（２），５０９−５１７（１９９９）
【非特許文献１９】Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１４９５（３），２９７−３０７（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記従来技術に鑑みて行われたものであり、より有効性の高いがんの治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、鋭意研究を行った結果、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列を標的配列とすることによりＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を効率よく抑制できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡに関する。
本発明の第１の発明において、該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡであってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造であってもよい。
【０００９】
本発明の第２の発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸に関する。
本発明の第２の発明において、上記核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸であってもよい。また塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。
また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造をとるものが好適である。
【００１０】
本発明の第３の発明は、本発明の第２の発明の核酸が挿入されたベクターに関する。
【００１１】
本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の２本鎖ＲＮＡ、第２の発明の核酸、第３の発明のベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物に関する。
【００１２】
本発明の第５の発明は、本発明の第４の発明の組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、がん細胞の転移能を減少させ及び／又は増殖能を減少させることを可能にする組成物が提供される。前記の組成物は、がんの治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明について詳細に説明する。
（１）本発明の２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクター
本発明は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子（例えば、ヒトＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４１０）の発現を制御できるものが好ましく、２本鎖ＲＮＡ、転写反応後に当該２本鎖ＲＮＡが生成するように構築された核酸、あるいはベクターである。本発明のＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現を制御するための２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクターに特に限定はなく、上記標的配列を標的としてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸、好ましくはＲＮＡ干渉によりＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸であればよい。
上記２本鎖ＲＮＡ、核酸及びベクターが有する塩基配列は、特に限定はされないが例えばヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子の部分配列である配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列で示される領域の少なくとも一つが好適に使用できる。また、当該選択される領域は、複数を組み合わせてもよい。
【００１５】
上記選択される領域を標的配列としてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制するメカニズムに特に限定はないが、２０〜３０塩基前後の短鎖２本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉法が特に好ましい。すなわち、ＲＮＡ干渉法はアンチセンスＲＮＡを用いる方法に比べて効率よく遺伝子発現を抑制されていること、及び長鎖２本鎖ＲＮＡを哺乳類細胞に導入し、又は発現させると、インターフェロン応答が起きて細胞死を誘発すること等による。
【００１６】
本明細書において、２本鎖ＲＮＡとは、標的配列の相補鎖の一部又は全部を含むアンチセンス鎖ＲＮＡと、標的配列に対応する部分においてアンチセンス鎖とハイブリダイズしうるセンス鎖ＲＮＡがハイブリダイズした２本鎖ＲＮＡを意味する。
本発明の２本鎖ＲＮＡの一つの形態としてｓｉＲＮＡが挙げられる。当該ｓｉＲＮＡの２本鎖部分は、哺乳動物細胞におけるインターフェロン応答抑制の観点から、例えば１５〜３５塩基の鎖長を有するもの、好ましくは１５〜３０塩基対の鎖長を有するもの、さらに好ましくは、２０〜３０塩基対の鎖長を有するものが例示される。また、前記鎖長の塩基配列がＲＮＡ干渉を起こしうるかぎり、標的配列のすべての塩基配列を含んでいてもよく、標的配列の一部を含んでいてもよく、標的配列以外の配列を含んでいてもよい。さらに、本発明の２本鎖ＲＮＡには、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉の有効性の観点から、例えば、３’末端側にデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドが２〜４塩基突出した２本鎖ＲＮＡの形状のもの、さらに好ましくは３’末端側に２塩基突出した２本鎖ＲＮＡの形状のものであっても良い。２〜４塩基としてはＴＴ配列〜ＴＴＴＴ配列又はＵＵ配列〜ＵＵＵＵ配列が例示される。なお、突出部分の塩基がデオキシリボヌクレオチドである場合、当該核酸を構成するオリゴヌクレオチドはＤＮＡ−ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドであるが、本明細書ではこれも２本鎖ＲＮＡと呼ぶ。また、前記２本鎖ＲＮＡが生理的条件下、細胞内において２本鎖構造をとりうる範囲内で、センス鎖に塩基の置換、挿入又は欠失を導入してもよい。この場合、ｓｉＲＮＡはミスマッチ又はバルジを有する。さらに、センス鎖とアンチセンス鎖の間にループ構造を有するようにデザインされた核酸配列を含むものであってもよい。
【００１７】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、哺乳動物細胞においてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる配列の観点から、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列に対応するｓｉＲＮＡである。
言い換えれば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡが好ましい。また、該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであってもよく、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡであってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であってもよい。
【００１８】
本発明の２本鎖ＲＮＡは、特に限定されないが、２’−ＡＣＥ（２’−ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）又は２’−ＴＢＤＭＳ（２’−ｔ−ｂｕｔｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｌｙｌ）等の保護基を用いた化学合成法又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼを使用する酵素合成法により合成することができる。
化学合成法又は酵素合成法により合成された２本鎖ＲＮＡは、特に限定は無いが、安定化や標識化のために、化学修飾基により修飾してもよい。本発明に使用できる修飾には特に限定は無いが、例えば、６−フルオレセイン付加、ビオチン付加、２’−Ｏ−メチル化、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）化、アミノ化、等が挙げられる。当該修飾基は、ＲＮＡ干渉作用を阻害しない限り、５’末端、３’末端あるいは内部塩基のいずれに付加してもよい。
【００１９】
本発明の別の形態としては、転写反応後に上記２本鎖ＲＮＡを生成するように構築された核酸が例示される。例えば、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列を、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を哺乳動物細胞内において発現しうる核酸が例示される。言い換えれば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸である。また、当該核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸であってもよい。また、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であってもよい。また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造をとるものであってもよい。
【００２０】
当該核酸により生成する２本鎖ＲＮＡは、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御しうる核酸の形態としては特に限定はされないが例えば、上記ｓｉＲＮＡ及びｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ｓｈＲＮＡはｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖が、ＲＮＡからなるループにより連結された部分的２本鎖構造を有する。当該ｓｈＲＮＡにおいてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる限り、ループの鎖長及び塩基配列に限定はない。また、ベクターにより発現するｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡのセンス鎖は、化学合成法又は酵素合成法により合成した２本鎖ＲＮＡと同様に、塩基の置換、挿入又は欠失が導入されていてもよい。
【００２１】
本発明の核酸は、直鎖状核酸の形態で目的の細胞内に導入し、細胞内で発現させて２本鎖ＲＮＡを生成させることができる。特に限定はされないが、例えば転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生じる塩基配列を有する核酸をＰＣＲ法等で作製し、プロモーター、好ましくはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、の下流に挿入して作製することができる。あるいは、下記ベクター形態であってもよい。
【００２２】
本発明のさらに別の形態として、転写反応後に上記２本鎖ＲＮＡが生成される核酸を含有するベクターであっても良い。
本発明のベクターは、哺乳動物細胞内でＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を発現させるためのベクターであり、当該細胞内で効率良く発現できるものであれば、骨格となるベクターは、特に限定されるものではない。前記骨格となるベクターとしては、特に限定はないが、例えば、プラスミドベクター、直鎖状２本鎖ＤＮＡ並びに、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクターが挙げられる。前記プラスミドベクターとしては、特に限定されないが、例えばＲＮＡ干渉用の核酸を発現させるｐＢＡｓｉシリーズベクター（商品名、タカラバイオ社製）、ｐｉＧＥＮＥ ｔＲＮＡプラスミド（商品名、ｉＧＥＮＥ社製）、ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ（商品名、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＳＥＣ Ｈｙｇｒｏ Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ａｍｂｉｏｎ社製）等が好適に使用できる。
さらに前記直鎖状２本鎖ＤＮＡベクターであっても良く、特に限定はされないが、ｓｉＸｐｒｅｓｓ ＰＣＲ ベクターシステム（商品名、Ｍｉｒｕｓ社製）等が好適に使用できる。また、前記アデノウイルスベクターとしては、ＢＤ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ＲＮＡｉ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）が挙げられる。さらに、レトロウイルスベクターとしては、ｐＳＩＮｓｉベクターシリーズ（商品名、タカラバイオ社製）及びｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）等が挙げられる。
【００２３】
当該ベクターの構築は、特に限定されないが、例えば、ＲＮＡ干渉の場合（Ａ）異なる２つのプロモーター制御下に、前記核酸に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをそれぞれ順方向に配置して、別個にセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとを転写するタンデムタイプとして、（Ｂ）１つのプロモーター制御下に本発明のＲＮＡ干渉剤に関するセンスＲＮＡをコードする核酸とアンチセンスＲＮＡをコードする核酸とをループをコードする核酸を挟んで配置して、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがそれぞれループで連結されたステムループタイプ（又はヘアピンタイプ）のＲＮＡを転写するタイプとして、（Ｃ）ベクターのセンス鎖にて機能するプロモーター制御下に一方のＲＮＡをコードする核酸を、アンチセンス鎖にて機能するプロモーター制御下に該ＲＮＡに相補的なＲＮＡをコードする核酸を配置して、それぞれ別個のプロモーター制御下でそれぞれのＲＮＡを転写する対向タイプとして、あるいは、（Ｄ）センス鎖を発現するベクターとアンチセンス鎖を発現するベクターを別々に作製したのち同一の細胞に導入するセパレートタイプとして、構築することにより行われうる。本発明の組成物に含有されるＲＮＡ干渉ベクターの形態においては、特に限定されないが、好ましくは、反応条件、例えば、ベクターの種類、哺乳動物細胞の種類、センス配列とアンチセンス配列の種類等に応じ、タンデムタイプ、ステムループタイプ、対向タイプ、セパレートタイプを使い分けることが望ましい。さらに複数の標的配列を同時に発現させるものであっても良い。
【００２４】
なお、前記ベクターにより発現する、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸は、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列であって、ＲＮＡ干渉作用を示す塩基配列であれば特に限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、以下の２つの条件：
（ｉ）転写開始点は、プリン残基〔グアニル酸残基（Ｇ）又はアデニル酸残基（Ａ）〕とすること；及び
（ｉｉ）転写されるＲＮＡの３’末端に連続した４個のウラシル残基が付加されるため、転写されるＲＮＡの５'末端の２塩基はＡＡとすること；
を満たすことが望ましい。
【００２５】
また、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを用いる場合、好ましくは、
（ｉ）ステムループタイプにすること；及び
（ｉｉ）短いポリ（Ａ）配列を付加すること；
が望ましい。
【００２６】
以下にＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を発現するベクターの作製方法について事例を挙げて説明する。
すなわち、配列表の配列番号１〜８に示される塩基配列を有する領域からなる群より選ばれた少なくとも１種の標的配列を選択し、これに対応するｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが転写されるようにベクターを構築する。あるいは、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡの転写反応を異なるベクターで行うように構築してもよい。
ここで、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの転写に用いる発現ベクターは転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生じる塩基配列を有する核酸をＰＣＲ法等で作製し、プロモーター、好ましくはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、の下流に挿入して、発現カセットを作製し、該カセットを適切な骨格となるベクター、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター等に連結することにより作成されたベクターも好適に使用できる。あるいは、転写によりｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを生成するための塩基配列を有する核酸を化学合成し、必要に応じて制限酵素の認識配列のタグを付加し、得られた核酸を、ベクターに挿入することにより調製することができる。細胞へのトランスフェクション効率を改善する観点からは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等のウイルスベクターが骨格となるベクターとして好適に使用できる。
【００２７】
本発明に用いるプロモーターとしては、哺乳動物細胞内で機能しうるものであれば特に限定はなく、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、テトラサイクリンで調節可能なプロモーター等が挙げられる。前記プロモーターは、野生型及び／又は変異体型のいずれであってもよい。また、組織特異的プロモーターを用いることにより、所望の部位、臓器等においてＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸の発現が可能となる。特に限定はされないが、例えば、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター等が挙げられる。また、前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとしては、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒストンＨ１プロモーター等が挙げられる。前記テトラサイクリンで調節可能なプロモーターとしては、テトラサイクリン調節型Ｕ６プロモーター、ＴＲプロモーター等が挙げられる。また、上記プロモーターをＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムと組み合わせることにより、より厳密に発現を制御することもできる。
【００２８】
（２）本発明の組成物
さらに本発明の組成物は、上記（１）の２本鎖ＲＮＡ、当該２本鎖ＲＮＡを生成する核酸あるいはベクターを有効成分とする組成物である。また、本発明の組成物において、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる２本鎖ＲＮＡ又は当該２本鎖ＲＮＡを哺乳動物細胞内において発現しうる核酸あるいはベクター以外に安定化剤、ｐＨ調整剤等の細胞内への導入を促進するような有効成分が含まれていてもよい。当該有効成分としては、特に限定はされないが例えばＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制しうる核酸を導入する場合および上記ベクターがプラスミドベクターである場合には、ＴｒａｎｓＩＴシリーズのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ社製）、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等のトランスフェクション試薬が例示される。また、上記ベクターがレトロウイルスベクターである場合には、フィブロネクチンまたはその断片、たとえば組換えヒトフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６が例示される。
【００２９】
医薬品として本発明の組成物を使用する場合には、特に限定はされないが例えば、前記有効成分を薬学的に許容される公知の担体と組み合わせた組成物を調製することができ、また、その使用目的に応じて製剤化することもできる。例えば、注射剤、点滴用剤のような医薬組成物としてもよい。前記の医薬組成物は、例えば制ガン剤として有用である。なお、医薬組成物としての投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び投与される患者の年齢、体重、症状に応じて適宜設定されるのは当然のことである。
【００３０】
（３）本発明のＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現抑制方法
本発明の方法は、上記（２）記載の組成物を用いることを特徴とするＧｎＴ−Ｖ遺伝子発現抑制方法である。対象となる遺伝子は、ヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子に特に限定されない。すなわち、本発明の方法は、ヒトＧｎＴ−Ｖ遺伝子の部分配列である配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列で示される領域の少なくとも一つを発現抑制の標的配列とする。また、当該標的配列は、複数を組み合わせてもよい。
特に限定はされないが例えば、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ、あるいはＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドである２本鎖ＲＮＡ、また該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる２本鎖ＲＮＡ、塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖である２本鎖ＲＮＡ、さらに、該２本鎖ＲＮＡが、１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造を有する２本鎖ＲＮＡを用いることができる。
【００３１】
あるいは、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸、当該核酸を用いた転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができる核酸、転写反応後に塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする核酸、また、転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ヘアピン構造をとることができる前記核酸のいずれもが好適に使用できる。また、前記核酸が挿入されたベクターも好適に使用できる。
【００３２】
さらに、上記（２）の組成物の形態で使用してもよい。
【００３３】
本発明の方法において、当該組成物をマイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、カチオン脂質法を用いて目的の組織あるいは細胞内に導入することができる。
【００３４】
また、医薬組成物の場合では、遺伝子導入効率の観点からは、ウイルスベクター、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を用いてｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにより投与することが好ましい。また、組成物調製の容易さ、増殖性ウイルスの出現等のウイルスベクター特有の危険を避けるという観点からは、ｓｉＲＮＡ含有組成物、プラスミドベクター含有組成物または直鎖状２本鎖ＤＮＡベクター含有組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにより投与することが好ましい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に示すが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１ ｓｉＲＮＡの導入
（１）Ｈｕｈ６細胞へのｓｉＲＮＡの導入
ヒトＧｎＴ−Ｖ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００２４１０） ｃＤＮＡ配列をもとに配列表の配列番号１〜１０に記載の塩基配列を有するｓｉＲＮＡ構築領域を選択した。これらの塩基配列をもとに配列表の配列番号１１〜３０記載の塩基配列を有するキメラオリゴヌクレオチド（Ａ１〜Ａ２０）を合成した。当該キメラオリゴヌクレオチドは、その３'末端に２塩基のデオキシリボヌクレオチドが配置されている。前記Ａ１〜２０のキメラオリゴヌクレオチドは、表１に示す組み合わせで常法によりリボヌクレオチド部分をアニールさせたあと、２０μＭとなるように滅菌水に溶解し、ｓｉＲＮＡ溶液として用いた。また、配列表の配列番号３１及び３２で表されるキメラオリゴヌクレオチド（Ｃ２１、２２）を、緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ６２６５４）をもとに合成し、同様の方法でアニールさせて陰性対照とした。
【００３７】
【表１】
【００３８】
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１１０巻、第８３７−８４１頁（１９８３）記載のＨｕｈ６細胞を８×１０４個／ｍｌとなるように１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、この細胞懸濁液２．５ｍｌを６穴プレートの各ウェルに加えた。
次ぎに１５μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（インビトロジェン社製）と６０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を混合して室温で１０分間放置した後、２５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地と１５μｌのｓｉＲＮＡ溶液を混合しておいたチューブに添加した。これを室温にて２０分間放置した後、更に１６０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地を加えて５００μｌにしたものをＨｕｈ６細胞の入ったプレートの各ウェルに加えた。これを３７℃の５％ＣＯ２インキュベータ中で４８時間培養した。
【００３９】
（２）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
上記（１）で培養した細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを鋳型とし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡの定量を行った。
逆転写時の反応液組成は次のとおりである：２μｌのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ用５×添付緩衝液〔２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、５０ｍＭ ＤＴＴ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２〕（タカラバイオ社製）、０．５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌの１００μＭ Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ ｐｄ（Ｎ）６（タカラバイオ社製）、０．２５μｌの４０Ｕ／μｌ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ヒト胎盤由来、タカラバイオ社製）、０．２５μｌの２００Ｕ／μｌ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ（タカラバイオ社製）、５μｌの４ｎｇ／μｌ 鋳型ＲＮＡ、１．５μｌの蒸留水で反応容量を１０μｌとした。なお、鋳型ＲＮＡとして５μｌの４０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、０．４ｎｇ／μｌ、０．０４ｎｇ／μｌ、０．００４ｎｇ／μｌまたは０．０００４ｎｇ／μｌ 陰性対照由来ＲＮＡを使用して同様の反応液を調製し、検量線作成用とした。これらの反応液を４２℃で１０分間インキュベートした後、９５℃で２分間加熱した。
【００４０】
ＰＣＲ時の反応液組成は次のとおりである：２．５μｌの１０×ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｍｇ２＋ ｆｒｅｅ）（タカラバイオ社製）、０．３μｌの２５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．７５μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、０．２５μｌの５Ｕ／μｌ ＥｘＴａｑ（タカラバイ社製）、０．５μｌの各１０μＭプライマー混合物（配列表の配列番号３３と３４記載の塩基配列を有する）、２．５μｌの３０００倍希釈ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｃａｍｂｒｅｘ社製）、１．２５μｌのジメチルスルホキシド、２．５μｌの５Ｍベタイン、５μｌの逆転写反応液、５μｌのｃＤＮＡ ｂｕｆｅｒ〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ〕、４．４５μｌの蒸留水で反応容量を２５μｌとした。なお、配列表の配列番号３５と３６記載の塩基配列を有するヒトβ−アクチン特異的プライマーを用いて同様の反応液を調製した。これらの反応液をＳｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍにセットし、９５℃で５秒間、５５℃で２０秒間、７２℃で１５秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲを行った。
検量線作成用の反応により、陰性対照由来ＲＮＡ量とＣｔ値との関係を示す検量線を作成し、これを用いて各試料に含まれるＧｎＴ−Ｖおよびヒトβ−アクチンのｍＲＮＡ量を算出した。各試料のＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量をヒトβ−アクチンｍＲＮＡ量で除することにより補正し、ＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値とした。各試料におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値を、陰性対照におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値に対する相対値として算出した。
【００４１】
その結果を図１に示す。すなわち、図１は各ｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現量を示す図であり、縦軸はＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量補正値（相対値）を示す。図中、「ｎｅｇａ」は、陰性対照を示す。
図１に示したように、ｓｉ−１、ｓｉ−５、ｓｉ−１１、ｓｉ−１４、ｓｉ−１８、ｓｉ−２４、ｓｉ−２６およびｓｉ−７１はいずれも顕著なＲＮＡｉ効果を示した。一方、ｓｉ−１５およびｓｉ−４３はわずかなＲＮＡｉ効果しか示さなかった。
【００４２】
（３）ＧｎＴ−Ｖ酵素活性の測定
上記（１）で調製した１０５−１０６個の細胞を遠心分離により回収し、１００μｌのＣｅｌＬｙｔｉＴＭＭ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を加えた後、室温で１５分間振盪して懸濁した。前記懸濁液を１５，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により上清を回収してＧｎＴ−Ｖ粗酵素液とし、活性測定を行った。活性測定は、以下の手順で行った。
すなわち、３μｌのＧｎＴ−Ｖ粗酵素液、５μｌの２×緩衝液（２５０ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．２５）、２００ｍＭ ＥＤＴＡ、４００ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、１μｌの０．４Ｍ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（シグマ社製）、１μｌの３８５ｐｍｏｌ／μｌ ＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖（タカラバイオ社製、ＰＡ−Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ ０１２）を混合し、３７℃で１６時間反応させた。反応終了後、９８℃で５分間加熱して酵素を失活させ、１５，０００ｒｐｍ、３分間遠心分離して上清を得た。その上清１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。カラムはＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐｅ Ｒ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、タカラバイオ社製、ＣＡ８０００）、溶離液は０．５％１−ブタノール含有１００ｍＭ 酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ４．０）を使用し、カラム温度は４０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。検出には蛍光検出器（ＲＦ−５３５、島津製作所社製）を使用し、励起波長を３２０ｎｍ、検出波長を４００ｎｍに設定した。この条件でＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖は約９．６分に、ＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ糖鎖にＧｎＴ−Ｖが作用することにより生成するＰＡ−Ｇｎ，Ｇｎ，Ｇｎ−ｔｒｉ'糖鎖は約６．７分に溶出された。
その結果を図２に示す。すなわち、図２は各ｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ活性を示す図であり、縦軸はＧｖＴ−Ｖ活性（ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質／ｈ）を示す。図中、「ｎｅｇａ」は、陰性対照を示す。
【００４３】
図２に示したように、ｓｉ−１、ｓｉ−５、ｓｉ−１１、ｓｉ−１４、ｓｉ−１８、ｓｉ−２４、ｓｉ−２６およびｓｉ−７１はいずれも顕著なＲＮＡｉ効果を示した。一方、ｓｉ−１５およびｓｉ−４３はわずかなＲＮＡｉ効果しか示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ ｍＲＮＡ量を示す図である。
【図２】本発明のｓｉＲＮＡを添加したときのＨｕｈ６細胞におけるＧｎＴ−Ｖ活性を示す図である。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。また、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制用組成物が提供される。さらに、本発明の組成物は、ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の過剰発現を伴う疾患、たとえばがんの治療薬として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
SEQ ID NO:11;A synthetic chimera oligonucleotide A1. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:12;A synthetic chimera oligonucleotide A2. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:13;A synthetic chimera oligonucleotide A3. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:14;A synthetic chimera oligonucleotide A4. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:15;A synthetic chimera oligonucleotide A5. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:16;A synthetic chimera oligonucleotide A6. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:17;A synthetic chimera oligonucleotide A7. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:18;A synthetic chimera oligonucleotide A8. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:19;A synthetic chimera oligonucleotide A9. "nucleotide 20 and 21 are
deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:20;A synthetic chimera oligonucleotide A10. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:21;A synthetic chimera oligonucleotide A11. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:22;A synthetic chimera oligonucleotide A12. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:23;A synthetic chimera oligonucleotide A13. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:24;A synthetic chimera oligonucleotide A14. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:25;A synthetic chimera oligonucleotide A15. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:26;A synthetic chimera oligonucleotide A16. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:27;A synthetic chimera oligonucleotide A17. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:28;A synthetic chimera oligonucleotide A18. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:29;A synthetic chimera oligonucleotide A19. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:30;A synthetic chimera oligonucleotide A20. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:31;A synthetic chimera oligonucleotide C21. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:32;A synthetic chimera oligonucleotide C22. "nucleotide 20 and 21
are deoxyribonucleotide-other nucleotides are ribonucleotides"
SEQ ID NO:33;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human Gnt-V gene
SEQ ID NO:34;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human Gnt-V gene
SEQ ID NO:35;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human beta-actin gene
SEQ ID NO:36;A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying
a human beta-actin gene
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができることを特徴とする請求項１又は２記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする請求項３記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
該２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸。
【請求項７】
転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができることを特徴とする請求項６記載の核酸。
【請求項８】
塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする請求項７記載の核酸。
【請求項９】
転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸が挿入されたベクター。
【請求項１１】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の２本鎖ＲＮＡ、請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸、あるいは請求項１０記載のベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法。
【請求項１】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための２本鎖ＲＮＡであって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応するＲＮＡを含有する２本鎖ＲＮＡ。
【請求項２】
該２本鎖ＲＮＡが、ＤＮＡから成る３’突出構造をさらに含有する、２本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項３】
該２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができることを特徴とする請求項１又は２記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項４】
塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする請求項３記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項５】
該２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の２本鎖ＲＮＡ。
【請求項６】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を制御するための核酸であって、プロモーターの下流に配置された配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列の核酸とを含有し、かつ前記プロモーターにより開始される転写反応によって、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列と当該配列に相補的な塩基配列のそれぞれに対応する２本鎖ＲＮＡを生成することができる核酸。
【請求項７】
転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、少なくとも一方のＲＮＡ鎖において塩基の置換、挿入もしくは欠失を含有し、かつ細胞内で２本鎖ＲＮＡの構造を取ることができることを特徴とする請求項６記載の核酸。
【請求項８】
塩基の置換、挿入、付加もしくは欠失を含有するＲＮＡ鎖が、配列表の配列番号１〜８記載の塩基配列に対応するＲＮＡ鎖であることを特徴とする請求項７記載の核酸。
【請求項９】
転写反応後の２本鎖ＲＮＡが、さらに１本鎖ＲＮＡ部分を有する、ループ構造であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸が挿入されたベクター。
【請求項１１】
ＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の２本鎖ＲＮＡ、請求項６〜９のいずれか１項に記載の核酸、あるいは請求項１０記載のベクターから選択される有効成分を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物を用いたＧｎＴ−Ｖ遺伝子の発現抑制方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−４９９０１（Ｐ２００７−４９９０１Ａ）
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２３５０４４（Ｐ２００５−２３５０４４）
【出願日】平成１７年８月１２日（２００５．８．１２）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１２日（２００５．８．１２）
【出願人】（３０２０１９２４５）タカラバイオ株式会社 (115)
【Ｆターム（参考）】
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