還元酵素遺伝子の取得方法、及び、還元酵素遺伝子
【課題】還元酵素をコードする遺伝子を取得する方法を提供する。
【解決手段】下記（１）〜（４）に記載する４工程：（１）特定の塩基配列からなる核酸断片、及び、該核酸断片；からなるプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程、（２）前記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程、（３）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程、及び（４）前記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程、を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
【解決手段】下記（１）〜（４）に記載する４工程：（１）特定の塩基配列からなる核酸断片、及び、該核酸断片；からなるプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程、（２）前記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程、（３）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程、及び（４）前記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程、を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子を取得する方法、還元酵素遺伝子等に関する。本発明は、特に、環境サンプル由来の環境ＤＮＡから還元酵素をコードする遺伝子を取得する方法、還元酵素遺伝子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医農薬等の各種用途の化合物の製造中間体として有用性な光学活性なアルコールの製造方法としては、種々の方法が知られており、特許文献１には、ライフソニア エスピー（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ．）Ｓ−７４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）から還元酵素遺伝子をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２６１０４２号公報
【非特許文献１】Ｊｉｚｈｏｎｇ Ｚｈｏｕら、Ａｐｐｌｉｅｄ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６２（２）：３１６，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のスクリーニング方法によって微生物から目的の還元酵素を見出すには、純粋培養が可能な微生物を培養し、標的とする特定の基質を分解又は変換する微生物をスクリーニングする必要があった。純粋培養可能な微生物は土壌等の環境中に存在する全微生物の１％足らずであると言われていることから、従来のスクリーニング法であると還元酵素のスクリーニング源は環境中の微生物の約１％しかないことになる。また、従来の微生物の１次スクリーニング法では何千、何万もの多検体についてアッセイし、また、微生物の増殖等に長時間要する場合がある。さらに、還元酵素遺伝子を単離する場合には、かなりの労力と時間を要する問題があった。
【０００５】
本願発明は、土壌等の環境中に存在する微生物由来のＤＮＡから還元酵素をコードする遺伝子を効率的に取得し、有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得るための方法等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］ （１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセット。
［２］ （１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセット。
［３］ 上記［２］記載のプライマーセットが、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセット。
［４］ 下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）上記［１］〜［３］いずれかに記載のプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）上記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
［５］ 上記ＤＮＡライブラリーが、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである、上記［４］に記載の方法。
［６］ 配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸。
［７］ 配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸。
［８］ 配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
［９］ 上記［６］又は［７］に記載の核酸を含有する組換えベクター。
［１０］ 上記組換えベクターが、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１からなる群より選ばれる、上記［９］に記載の組換えベクター。
［１１］ 上記［９］又は［１０］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１２］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［６］又は［７］に記載の核酸の使用。
［１３］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［８］に記載のタンパク質の使用。
［１４］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［９］又は［１０］に記載の組換えベクターの使用。
［１５］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［１１］に記載の形質転換体の使用。
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の核酸断片、プライマー、プライマーセット、還元酵素遺伝子の取得方法を用いることにより、不斉還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得でき、取得した遺伝子を用いて還元酵素を生産することによって、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。また、本発明は、かかる還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
（核酸断片、プライマーセット）
本発明の核酸断片及びプライマーセットについて説明する。
本発明の核酸断片は、配列番号１〜４からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸断片である。
配列番号１：５’−ＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号２：５’−ＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号３：５’−ＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号４：５’−ＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００１０】
本発明の核酸断片は、配列番号１〜４のいずれか１つに記載された塩基配列から選ばれる２つ以上の塩基配列からなる２つ以上の核酸断片であってもよく、また、配列番号１〜４のいずれか１つに記載された塩基配列の全ての組み合わせからなる核酸断片（ミックス核酸断片、縮重核酸断片）であることが好ましい。
【００１１】
別の実施形態においては、本発明の核酸断片は、上記核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片であることが好ましい。制限酵素サイト（制限酵素認識配列）は、当業者にとって公知のものを適宜、選択することができる。また、制限酵素サイトの５’末端側にさらに数個の塩基を含むことが好ましい。制限酵素サイトのさらに５’末端側に付加する核酸の塩基数について、一般的には、３塩基以上あれば、酵素で効率よく切断することができるが、適宜、所望の制限酵素が制限酵素サイトを効率的に切断できる塩基数を選択することができる。
【００１２】
本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセットである。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセットである。
【００１４】
また、特定の実施形態においては、本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセットである。
配列番号５：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＴＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００１５】
本発明の核酸断片及びプライマーセットは、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなる核酸断片、又は、制限酵素による切断配列を含むように、これらの核酸断片に付加等の操作を施したものとすることができる。すなわち、本発明の核酸断片は、その配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸断片であり、本発明のプライマーセットは、その配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸断片のペアである。なお、制限酵素による切断配列を含むように、核酸断片に付加等の操作を施したものを用いる場合には、還元酵素遺伝子に特異的であり、他の酵素遺伝子と相同性の少ない部分を選択することが望ましい。また、プライマーセットの各プライマーが互いにハイブリダイゼーションを起こさないように、還元酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を保持する範囲内で、末端配列の付加等の操作を施したものとすることができる。また、本発明のプライマーセットは、ミックスプライマー、縮重プライマーとして用いることができる。
【００１６】
本発明の核酸断片及びプライマーセットによれば、新規の還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得できる。特に、環境中に存在する微生物であり、単離培養の困難なものに由来する新規の還元酵素遺伝子を効率的に取得できる。また、本発明の核酸断片及びプライマーセットの各核酸断片の５’末端側に制限酵素サイトを含む核酸断片が付加されることにより、取得した還元酵素遺伝子のクローニング、還元酵素遺伝子を含む組み換えベクターの構築等をより効率的に行うことができる。
【００１７】
（還元酵素遺伝子を取得する方法）
次に、本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法について説明する。
本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法は、下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）上記プライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）上記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える。
【００１８】
（１）の工程は、上記プライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程である。上記ＤＮＡライブラリーは、環境サンプル由来の環境ＤＮＡであることが好ましい。
【００１９】
本発明において「環境」とは土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫、動物、植物の固体の組織内部及び表面、並びに、排泄物等の微生物の生育環境を意味する。「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルであり、中でも、土壌、湖沼等から採取したサンプルであることが好ましい。また、「環境ＤＮＡ」とは環境サンプルから得たＤＮＡを意味する。環境ＤＮＡの抽出方法としては、例えば、５ｇの土壌サンプルを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）を含む抽出溶液１３．５ｍｌと１００μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液に懸濁し、３７℃で３０分間振とう後、２０％ＳＤＳ水溶液を１．５ｍｌ添加し、６５℃、２時間で抽出後、クロロホルム／イソアミルアルコールでその上清液から抽出する方法（非特許文献１）や、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン社製）のマニュアルにしたがって調製する等、環境サンプル中に存在する微生物中のＤＮＡを抽出することができればいかなる手段を用いてもよい。
【００２０】
核酸増幅反応としては、当業者にとって公知の方法を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であることが好ましい。特定の実施形態においては、環境ＤＮＡを鋳型として、配列番号１と２、又は、配列番号３と４の２種類のプライマーセットを用いて増幅させた増幅産物を得る。ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２００μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々８０ｐｍｏｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．５分間）−６９℃（１分間）−７２℃（１分間）のサイクルを４０回行い、さらに７２℃で１０分間保持する条件が挙げられる。なお、ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素サイト等を付加していてもよい。増幅産物が得られたことを確認する方法としては、アガロースゲル電気泳動法等が挙げられる。
【００２１】
上記（１）の工程で得られる増幅産物には、所望の還元酵素遺伝子が含まれることが期待できる。増幅産物に含まれる遺伝子断片がコードするポリペプチドの中から、還元活性を有するものを本発明還元酵素と呼ぶことがある。また、本発明還元酵素をコードする拡散を、本発明還元酵素遺伝子と呼ぶこともある。そのような本願還元酵素遺伝子の単離及び同定は、以下のようにして行うことができる。まず、上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する（工程（２））、次いで、組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する（工程（３））、そして、形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する（工程（４））。その活性を指標に、所望の特性を備える形質転換体、組換えベクター、還元酵素、還元酵素遺伝子を得ることができる。
【００２２】
以下に、工程（２）〜（４）について説明する。（２）の工程は、上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程である。（３）の工程は、上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程である。
【００２３】
上記（１）の工程で調製された本発明還元酵素遺伝子を含む増幅産物を、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして発現ベクターを得ることができる。ベクターとしては、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を挙げることができる。
【００２４】
本発明のプライマーセットの各核酸断片が、その５’末端側に互いに異なる制限酵素サイトを有する場合、又は、制限酵素サイトに方向性がある場合、増幅産物のベクターへの挿入方向をコントロールすることができる。また、発現量を向上させるために、ＳＤ配列と開始コドンの距離や、プロモーターと開始コドンの距離を工夫することもできる。例えば、ＳＤ配列と開始コドンの距離を５ヌクレオチド以上１３ヌクレオチド以下にする等が挙げられる。
【００２５】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明還元酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
本発明還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクターを導入する宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物等が挙げられる。上記宿主細胞としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。大腸菌としては、Ｋ−１２由来株が好ましく、具体的にはＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株、ＤＨ１株、ＭＶ１１８４株、ＪＭ１０５株、ＭＣ１０６１株、Ｃ６００株等が例示される。
【００２７】
本発明還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクターを宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−X等に記載される塩化カルシウム法や、「ＭＥＴＨＯＤＳ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００２８】
本還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
【００２９】
形質転換体が還元酵素遺伝子を保有していることは、形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程（工程（４））によって、確認することができる。また、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション等を行うことによっても、確認することができる。
【００３０】
形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、スクロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３２】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３３】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３４】
さらに、アロラクトースで誘導されるタイプのｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等と本還元酵素遺伝子とが機能可能な形で接続された組み換えベクターが導入された形質転換体の場合には、還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００３５】
本発明還元酵素遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養、及び、固体培養が挙げられる。
【００３６】
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００３７】
活性を検出するために用いる形質転換体又はその処理物としては、例えば、形質転換体の培養物、生形質転換体、破砕物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質、及び、これらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００３８】
カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性は、以下の方法により検出することができる。上記の形質転換体又はその処理物を、基質及びＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、消費されるＮＡＤＨ量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。基質としては、アセトフェノン、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、４’−クロロアセトフェノン、３−メチル−２−オキソ酪酸エチルエステル、２−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンゾイルギ酸エチル、プロピオンアルデヒド、１−フェニル−２−ブタノン、ｎ−ブチルアルデヒド、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アセトフェノンを還元して１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜することができる。
【００３９】
また、本発明還元酵素遺伝子の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｒ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７） ７４：５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００４０】
本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法を用いることにより、不斉還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得でき、取得した遺伝子を用いて還元酵素を生産することによって、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。また、本発明は、かかる還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を提供することができる。
【００４１】
（還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、形質転換体）
本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体について説明する。本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体は、上記還元酵素遺伝子を取得する方法により単離同定したものである。
【００４２】
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸である。また、本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸である。また、本発明の還元酵素遺伝子は、その遺伝子がコードするタンパク質の還元活性を損なわない限り、１〜数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００４３】
本発明の還元酵素は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、本発明の還元酵素は、その還元活性を損なわない限り、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００４４】
本発明の組換えベクターは、上記還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターである。特定の実施形態においては、本発明の組換えベクターは、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１（それぞれプラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６）である。また、本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４５】
以下に、プラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６の各々の組換えベクターに関して、還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体を説明する。
【００４６】
（Ａ）プラスミドＬＳ−１
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１１に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１１に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４７】
（Ｂ）プラスミドＬＳ−７
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１３に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１３に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−７と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−７と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４８】
（Ｃ）プラスミドＬＳ−１０
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１５に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１５に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１０と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１０と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４９】
（Ｄ）プラスミドＬＳ−１１
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１７に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１７に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１１と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１１と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５０】
（Ｅ）プラスミドＬＳ−１７
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１９に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１９に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１７と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１７と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５１】
（Ｆ）プラスミドＬＳ−２０
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２１に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２１に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２０と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２０と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５２】
（Ｇ）プラスミドＬＳ−２２
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２３に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２３に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２２と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２２と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５３】
（Ｈ）プラスミドＬＳ−２４
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２５に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２５に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２４と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２４と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５４】
（Ｉ）プラスミドＬＳ−２６
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２７に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２７に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２６と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２６と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５５】
本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を用いることにより、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。
【００５６】
（アルコールの製造方法）
本発明の光学活性なアルコールの製造方法について説明する。本発明の光学活性なアルコールの製造方法は、上記の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、又は、形質転換体を用いることを特徴とするものである。また、上記製造方法は、上記の還元酵素遺伝子を取得する方法により単離同定した還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、又は、形質転換体を用いるものであってもよい。本発明の光学活性なアルコールの製造方法は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物に、還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００５７】
形質転換体の培養方法、形質転換体の処理物の調製方法等は、上述の還元酵素遺伝子を取得する方法の工程（４）において説明した方法を用いることができる。また、形質転換体の培養物から還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００５８】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、還元酵素を精製することができる。
【００５９】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００６０】
なお、還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、アセトフェノンを還元して１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００６１】
次に、本発明の光学活性なアルコールの製造方法に用いる基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物について説明する。
【００６２】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、ピルビン酸エチル、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、Ｄ−（＋）-グルコース、４−クロロ-３-オキソ酪酸エチル、３−メチル-２-オキソ酪酸エチル、４−ヒドロキシ-２-ブタノン、ベンゾイルギ酸エチル、１−フェニル-２-ブタノン、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられる。
【００６３】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００６４】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類；トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類、及び、これらの混合物が挙げられる。
【００６５】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、還元酵素又はそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００６６】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。また、窒素や空気等を吹き込みながら、反応を行なってもよい。通気量は通常０．１〜５Ｌ／分の範囲である。
【００６７】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００６８】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００６９】
形質転換体又はその処理物としては、上述のものを用いることができるが、本発明の形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が、製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００７０】
また、本発明還元酵素を用いたアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す）に変換される。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する還元酵素は、変換により生じたＮＡＤ＋を、例えば、２−プロパノールの酸化反応に伴って、還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換を可能にする基質として、２−プロパノール等を共存させることもできる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００７２】
（実施例１：環境ＤＮＡの取得）
環境サンプルとして、４℃保存した以下の環境サンプル（Ａ）〜（Ｃ）を用いて、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン社製）のマニュアルにしたがって、環境ＤＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）をそれぞれ抽出した。ＤＮＡの抽出確認は１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した。
（Ａ）滋賀県琵琶湖周辺の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
（Ｂ）富山県砺波市の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
（Ｃ）富山県魚津市付近の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
【００７３】
（実施例２：人工オリゴヌクレオチドプライマーの調製）
以下の4種類の縮重プライマーを人工合成した。
プライマー１：５’−ＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’(配列番号１)
プライマー２：５’−ＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’(配列番号２)
プライマー３：５’−ＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’(配列番号３)
プライマー４：５’−ＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’(配列番号４)
プライマー１と２、プライマー３と４のペアで遺伝子増幅反応を行った。なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００７４】
（実施例３：ｐＨＡＲ１ｓベクターの構築）
以下の手順により、特開２００７−０６１０６５に記載のプラスミドｐＨＡＲ１を改変し、ＥｃｏＴ１４Ｉ制限酵素サイトを含まないｐＨＡＲ１ｓベクターを構築した。
まず、プラスミドｐＨＡＲ１を含む以下の組成液１を調製し、３７℃で３時間処理した。
［組成液１］
ｐＨＡＲ１溶液（１００μｇ/ｍｌ） １μｌ
ＥｃｏＴ１４Ｉ（宝酒造社製） １μｌ
１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）２μｌ
滅菌水 １６μｌ
【００７５】
反応終了後、６０℃で１５分間処理し、反応を止めた。得られた反応液に以下の組成液２を添加した。
［組成液２］
０．１％ ＢＳＡ ２μｌ
ｄＮＴＰｓ（各１．７ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
１０×Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製） ２μｌ
滅菌水 ２μｌ
【００７６】
７０℃で１５分間処理後、３７℃にし、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を２μｌ加えて３０分間保温した。保温後、エタノール沈殿処理し、乾燥後、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを１０μｌの滅菌水で溶解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いて１６℃、３０分間反応させた。反応液から、エタノール沈殿にて乾燥ＤＮＡを得た。得られた乾燥ＤＮＡを５μｌの滅菌水で溶解し、エレクトロポレーション法で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に、得られた形質転換体を接種し培養した。培養菌体からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミド（以下、プラスミドｐＨＡＲ１ｓと記すこともある。）を取り出した。
【００７７】
（実施例４：本発明還元酵素遺伝子の増幅、発現プラスミド及び形質転換体調製）
（４−１）還元酵素遺伝子の増幅
配列番号１で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＳｆｉＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５）、配列番号２で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｄｅＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６）を用いて、環境サンプル（Ａ）由来の環境ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７８】
また、配列番号３で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＳｆｉＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７）、配列番号４で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｄｅＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８）を用いて、環境サンプル（Ｂ）又は（Ｃ）由来の環境ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７９】
［プライマー配列］
配列番号５：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＴＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
［反応液組成］
環境ＤＮＡ液 ２μl
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（１００μＭ） 各０．８μｌ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＢｌｅｎｄＴａｑ ２μｌ
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製） ０．２μｌ
ＤＭＳＯ ２μｌ
滅菌水 １０．２μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．５分間）→６９℃（１分間）→７２℃（１分間）のサイクルを４０回行い、さらに７２℃で１０分間保持した。増幅産物はＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。
【００８０】
（４−２）還元酵素遺伝子を含む組み換えベクターを用いた形質転換体の構築
精製後の溶液に２種類の制限酵素（ＮｄｅＩ及びＳｆｉＩ）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化し、方向性がある制限酵素切断末端を有するＤＮＡ断片を調製した。一方、プラスミドｐＨＡＲ１ｓを２種類の制限酵素（ＮｄｅＩ及びＳｆｉＩ）により２重消化した。ＤＮＡ断片の酵素消化確認は１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した。１．５％アガロースゲル電気泳動後、ゲルから酵素消化ＤＮＡ断片を切り出し、それぞれＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。得られた精製液をエタノール沈殿後、乾燥させた後、それぞれの酵素消化ＤＮＡ断片に滅菌水を５μｌ添加した。それぞれの酵素消化ＤＮＡ断片水溶液を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を１０μｌ添加した。１６℃にて一晩放置し、エタノール沈殿後、乾燥させた。５μｌの滅菌水を添加後、エレクトロポレーション法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００８１】
滋賀県琵琶湖周辺から採取した環境ＤＮＡ（Ａ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約１２００コロニー認められた。また、富山県砺波市付近から採取した環境ＤＮＡ（Ｂ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約１２００コロニー認められた。また、富山県魚津市付近から採取した環境ＤＮＡ（Ｃ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約４００コロニー認められた。それら大腸菌組換え体から、２４０個のコロニーをランダムに選択し、コロニーＰＣＲを行なった。
【００８２】
[反応液組成]
コロニー １白金耳
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） １．６μｌ
Ｍ１３−４７プライマー（１００μＭ） １．０μｌ
ＰＡＲＳＱＲ０プライマー（１００μＭ） １．０μｌ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＢｌｅｎｄＴａｑ ２μｌ
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）） ０．２μｌ
滅菌水 １４．２μｌ
［プライマー］
Ｍ１３−４７ ：５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号９）
ＰＡＲＳＱＲ０：５’−ＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣ−３’（配列番号１０）
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９５℃（０．５分間）→５０℃（０．５分間）→７２℃（１．５分間）のサイクルを３０回行い、さらに７２℃で１０分間保持した。
ＰＣＲ増幅断片を１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した結果、３４個のコロニーに遺伝子の挿入を確認した。
【００８３】
（実施例５：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体のアセトフェノン還元活性測定）
（５−１）粗酵素液の調製
得られた３４種類の形質転換体、プラスミドｐＨＡＲ１ｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体、又は、プラスミドｐＫＥＬＡ（特許文献：特開２００８−０１７７７３）にてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ一Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び、０．４ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地４ｍｌ中で培養（３７℃、２２時間、振盪培養）した。その後、培養液２ｍｌを２ｍｌ容の遠心チューブに入れ、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）することにより、沈殿として湿菌体を得た。培養上清液を除いた湿菌体に、５００ｍｇのビーズ（Φ０．１ｍｍ）と、５０ｍＭのＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）を０．５ｍｌを加え、Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器械社製）で破砕した（２５００ｒｐｍ、１５０秒、ＯＮ（３０秒×３）、ＯＦＦ（３０秒×２））。破砕液を短時間遠心分離した後、破砕液の入ったチューブの底に穴をあけ、チューブを１．５ｍｌ容の新しい遠心チューブに押し込んだ。遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）後、２ｍｌ容の遠心チューブを抜き、１．５ｍｌ容の遠心チューブのサンプルをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、得られた遠心上清液を粗酵素液とした。なお、プラスミドｐＫＥＬＡは、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードする還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００８４】
（５−２）還元活性測定
５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）、０．２７ｍＭ ＮＡＤＨ、３ｍＭ アセトフェノンを含む反応液９９０μｌを２５℃で１．５分保温し、粗酵素液を１０μｌ添加後、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸収の減少を測定した。なお、プラスミドｐＨＡＲ１ｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体から得られた粗酵素液で測定した結果をブランクとした。また、酵素活性はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａＵ）とし、下記の計算式を用いて算出した。結果を表１に示した。
酵素活性（ａＵ）＝（３４０ｎｍでの減少量（ΔＡ）／測定時間（1分））
【００８５】
【表１】
【００８６】
酵素活性０．００３（ａＵ）以上の酵素を還元活性ありと判断すると、３４個の酵素中２８個の酵素（ＬＳ−１〜２８）で還元活性を確認できた。
【００８７】
還元活性の確認できた上記２８種類の形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、各種ＰＣＲ増幅断片を含む組み換えベクター（以下、プラスミドＬＳ−１〜ＬＳ−２８と記すこともある。）を取り出した。
【００８８】
（実施例６：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体の基質特異性検討（その１））
基質として、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、又は、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルを用いた以外は実施例５に記載の方法で還元活性を測定した。なお、実施例５で活性の確認できた２８種類について、各形質転換体から調製した粗酵素液を用いて基質特異性を検討した。結果を表２に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
（実施例７：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体の基質特異性検討（その２））
基質としてアセトフェノン、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルエステル、４’−クロロアセトフェノン、３−メチル−２−オキソ酪酸エチルエステル、２−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンゾイルギ酸エチル、プロピオンアルデヒド、１−フェニル−２−ブタノン、ｎ−ブチルアルデヒド、又は、３−オキソ酪酸エチルを用いた以外は実施例５に記載の方法で還元活性を測定した。結果を表３〜６に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】
（実施例８：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体を用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元反応）
（８−１）湿菌体調製
増幅された還元酵素遺伝子を含む３４種類の形質転換体の中から２０種類（ＬＳ−１、２、３、５、６、７、８、１１、１３、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７）の形質転換体、又は、プラスミドｐＫＥＬＡ（特開２００８−０１７７７３）にてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び、０．４ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地４ｍｌ中で培養（３７℃、２２時間、振盪培養）した。その後、培養液２ｍｌを２ｍｌ容の遠心チューブに入れ、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）することにより、沈殿として湿菌体を得た。
【００９６】
（８−２）還元反応
湿菌体に、５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１０％（ｗ／ｖ）２−プロパノールを含む反応液０．５ｍｌを加え、バイオシェーカーで振とうした（１２００ｒｐｍ、２２時間、３０℃）。その後、１−ブタノールを１ｍｌ添加して振とうした（１２００ｒｐｍ、３０分、３０℃）。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、３０℃）し、有機層を得た。この有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥後、ガスクロマトグラフィーによる含量分析を行った。
【００９７】
（８−３）１−フェニルトリフルオロエタノールの含量分析、及び、光学純度分析
以下の条件で、ガスクロマトグラフィーによる１−フェニルトリフルオロエタノールの含量分析を行い、溶出時間の違いにより、得られた還元体の光学純度を調べた。その結果を表７に示す。
＜含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件）＞
カラム：ＣＰ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−β−２３６−Ｎ１９(０．２５ｍｍ×２５Ｍ)
カラム温度：１３０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ温度：２５０℃
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：０．５ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：（Ｓ）−（＋）−１−フェニルトリフルオロエタノール（８．３分）、（Ｒ）−（−）−１−フェニルトリフルオロエタノール（８．５分）
【００９８】
【表７】
【００９９】
（実施例９：本発明還元酵素遺伝子の塩基配列決定）
実施例４でアセトフェノン還元活性を示した２８株（ＬＳ−１〜２８）のプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の中から、ＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、ＬＳ−２６について塩基配列を解析した。塩基配列の解析は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。得られた塩基配列を配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４に示した。
【０１００】
プラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００８年１０月２１日に寄託されており、寄託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１である（表８参照）。
【０１０１】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本願発明の方法によれば、カルボニル化合物から光学活性アルコール化合物を効率よく得ることができる還元酵素が環境サンプル由来のＤＮＡから得ることができることから、産業に有用な還元酵素を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元酵素をコードする遺伝子を取得する方法、還元酵素遺伝子等に関する。本発明は、特に、環境サンプル由来の環境ＤＮＡから還元酵素をコードする遺伝子を取得する方法、還元酵素遺伝子等に関する。
【背景技術】
【０００２】
医農薬等の各種用途の化合物の製造中間体として有用性な光学活性なアルコールの製造方法としては、種々の方法が知られており、特許文献１には、ライフソニア エスピー（Ｌｅｉｆｓｏｎｉａ ｓｐ．）Ｓ−７４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２９１）から還元酵素遺伝子をクローニングし、当該還元酵素を発現する形質転換体を用いて光学活性アルコールを製造する方法が開示されている。
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−２６１０４２号公報
【非特許文献１】Ｊｉｚｈｏｎｇ Ｚｈｏｕら、Ａｐｐｌｉｅｄ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６２（２）：３１６，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来のスクリーニング方法によって微生物から目的の還元酵素を見出すには、純粋培養が可能な微生物を培養し、標的とする特定の基質を分解又は変換する微生物をスクリーニングする必要があった。純粋培養可能な微生物は土壌等の環境中に存在する全微生物の１％足らずであると言われていることから、従来のスクリーニング法であると還元酵素のスクリーニング源は環境中の微生物の約１％しかないことになる。また、従来の微生物の１次スクリーニング法では何千、何万もの多検体についてアッセイし、また、微生物の増殖等に長時間要する場合がある。さらに、還元酵素遺伝子を単離する場合には、かなりの労力と時間を要する問題があった。
【０００５】
本願発明は、土壌等の環境中に存在する微生物由来のＤＮＡから還元酵素をコードする遺伝子を効率的に取得し、有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得るための方法等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は、
［１］ （１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセット。
［２］ （１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセット。
［３］ 上記［２］記載のプライマーセットが、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセット。
［４］ 下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）上記［１］〜［３］いずれかに記載のプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）上記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
［５］ 上記ＤＮＡライブラリーが、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである、上記［４］に記載の方法。
［６］ 配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸。
［７］ 配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸。
［８］ 配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
［９］ 上記［６］又は［７］に記載の核酸を含有する組換えベクター。
［１０］ 上記組換えベクターが、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１からなる群より選ばれる、上記［９］に記載の組換えベクター。
［１１］ 上記［９］又は［１０］に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
［１２］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［６］又は［７］に記載の核酸の使用。
［１３］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［８］に記載のタンパク質の使用。
［１４］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［９］又は［１０］に記載の組換えベクターの使用。
［１５］ 光学活性なアルコールの製造における、上記［１１］に記載の形質転換体の使用。
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の核酸断片、プライマー、プライマーセット、還元酵素遺伝子の取得方法を用いることにより、不斉還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得でき、取得した遺伝子を用いて還元酵素を生産することによって、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。また、本発明は、かかる還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【０００９】
（核酸断片、プライマーセット）
本発明の核酸断片及びプライマーセットについて説明する。
本発明の核酸断片は、配列番号１〜４からなる群より選ばれる塩基配列からなる核酸断片である。
配列番号１：５’−ＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号２：５’−ＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号３：５’−ＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号４：５’−ＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００１０】
本発明の核酸断片は、配列番号１〜４のいずれか１つに記載された塩基配列から選ばれる２つ以上の塩基配列からなる２つ以上の核酸断片であってもよく、また、配列番号１〜４のいずれか１つに記載された塩基配列の全ての組み合わせからなる核酸断片（ミックス核酸断片、縮重核酸断片）であることが好ましい。
【００１１】
別の実施形態においては、本発明の核酸断片は、上記核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片であることが好ましい。制限酵素サイト（制限酵素認識配列）は、当業者にとって公知のものを適宜、選択することができる。また、制限酵素サイトの５’末端側にさらに数個の塩基を含むことが好ましい。制限酵素サイトのさらに５’末端側に付加する核酸の塩基数について、一般的には、３塩基以上あれば、酵素で効率よく切断することができるが、適宜、所望の制限酵素が制限酵素サイトを効率的に切断できる塩基数を選択することができる。
【００１２】
本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセットである。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセットである。
【００１４】
また、特定の実施形態においては、本発明のプライマーセットは、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセットである。
配列番号５：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＴＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００１５】
本発明の核酸断片及びプライマーセットは、配列番号１〜４に記載の塩基配列からなる核酸断片、又は、制限酵素による切断配列を含むように、これらの核酸断片に付加等の操作を施したものとすることができる。すなわち、本発明の核酸断片は、その配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸断片であり、本発明のプライマーセットは、その配列の長さを１０〜５０塩基の長さとする一本鎖の核酸断片のペアである。なお、制限酵素による切断配列を含むように、核酸断片に付加等の操作を施したものを用いる場合には、還元酵素遺伝子に特異的であり、他の酵素遺伝子と相同性の少ない部分を選択することが望ましい。また、プライマーセットの各プライマーが互いにハイブリダイゼーションを起こさないように、還元酵素遺伝子に対するハイブリダイゼーション能を保持する範囲内で、末端配列の付加等の操作を施したものとすることができる。また、本発明のプライマーセットは、ミックスプライマー、縮重プライマーとして用いることができる。
【００１６】
本発明の核酸断片及びプライマーセットによれば、新規の還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得できる。特に、環境中に存在する微生物であり、単離培養の困難なものに由来する新規の還元酵素遺伝子を効率的に取得できる。また、本発明の核酸断片及びプライマーセットの各核酸断片の５’末端側に制限酵素サイトを含む核酸断片が付加されることにより、取得した還元酵素遺伝子のクローニング、還元酵素遺伝子を含む組み換えベクターの構築等をより効率的に行うことができる。
【００１７】
（還元酵素遺伝子を取得する方法）
次に、本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法について説明する。
本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法は、下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）上記プライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）上記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える。
【００１８】
（１）の工程は、上記プライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程である。上記ＤＮＡライブラリーは、環境サンプル由来の環境ＤＮＡであることが好ましい。
【００１９】
本発明において「環境」とは土壌、汚泥、下水、河川、湖沼、海水、海底、昆虫、動物、植物の固体の組織内部及び表面、並びに、排泄物等の微生物の生育環境を意味する。「環境サンプル」とは、環境から採取したサンプルであり、中でも、土壌、湖沼等から採取したサンプルであることが好ましい。また、「環境ＤＮＡ」とは環境サンプルから得たＤＮＡを意味する。環境ＤＮＡの抽出方法としては、例えば、５ｇの土壌サンプルを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）、１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＨ８）、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ｈｅｘａｄｅｃｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）を含む抽出溶液１３．５ｍｌと１００μｌのｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液に懸濁し、３７℃で３０分間振とう後、２０％ＳＤＳ水溶液を１．５ｍｌ添加し、６５℃、２時間で抽出後、クロロホルム／イソアミルアルコールでその上清液から抽出する方法（非特許文献１）や、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン社製）のマニュアルにしたがって調製する等、環境サンプル中に存在する微生物中のＤＮＡを抽出することができればいかなる手段を用いてもよい。
【００２０】
核酸増幅反応としては、当業者にとって公知の方法を用いることができるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であることが好ましい。特定の実施形態においては、環境ＤＮＡを鋳型として、配列番号１と２、又は、配列番号３と４の２種類のプライマーセットを用いて増幅させた増幅産物を得る。ＰＣＲの条件としては、例えば、４種類のｄＮＴＰを各々２００μＭ、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを各々８０ｐｍｏｌ、Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを０．５Ｕ及び鋳型となるＤＮＡライブラリーを混合した反応液を９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．５分間）−６９℃（１分間）−７２℃（１分間）のサイクルを４０回行い、さらに７２℃で１０分間保持する条件が挙げられる。なお、ＰＣＲに用いるプライマーの５’末端側には、制限酵素サイト等を付加していてもよい。増幅産物が得られたことを確認する方法としては、アガロースゲル電気泳動法等が挙げられる。
【００２１】
上記（１）の工程で得られる増幅産物には、所望の還元酵素遺伝子が含まれることが期待できる。増幅産物に含まれる遺伝子断片がコードするポリペプチドの中から、還元活性を有するものを本発明還元酵素と呼ぶことがある。また、本発明還元酵素をコードする拡散を、本発明還元酵素遺伝子と呼ぶこともある。そのような本願還元酵素遺伝子の単離及び同定は、以下のようにして行うことができる。まず、上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する（工程（２））、次いで、組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する（工程（３））、そして、形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する（工程（４））。その活性を指標に、所望の特性を備える形質転換体、組換えベクター、還元酵素、還元酵素遺伝子を得ることができる。
【００２２】
以下に、工程（２）〜（４）について説明する。（２）の工程は、上記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程である。（３）の工程は、上記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程である。
【００２３】
上記（１）の工程で調製された本発明還元酵素遺伝子を含む増幅産物を、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−X等に記載されている方法に準じてベクターにクローニングして発現ベクターを得ることができる。ベクターとしては、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社製）、ｐＴＶ１１８Ｎ（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＩＩ（東洋紡社製）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を挙げることができる。
【００２４】
本発明のプライマーセットの各核酸断片が、その５’末端側に互いに異なる制限酵素サイトを有する場合、又は、制限酵素サイトに方向性がある場合、増幅産物のベクターへの挿入方向をコントロールすることができる。また、発現量を向上させるために、ＳＤ配列と開始コドンの距離や、プロモーターと開始コドンの距離を工夫することもできる。例えば、ＳＤ配列と開始コドンの距離を５ヌクレオチド以上１３ヌクレオチド以下にする等が挙げられる。
【００２５】
ここで、「機能可能な形で」とは、該遺伝子を宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させた際に、本発明還元酵素遺伝子が、プロモーターの制御下に発現するようにプロモーターと結合された状態にあることを意味する。プロモーターとしては、例えば、ｌａｃプロモーターやｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等を挙げることができる。
【００２６】
本発明還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクターを導入する宿主細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物等が挙げられる。上記宿主細胞としては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。大腸菌としては、Ｋ−１２由来株が好ましく、具体的にはＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株、ＸＬ１ Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株、ＤＨ５α、ＨＢ１０１株、ＤＨ１株、ＭＶ１１８４株、ＪＭ１０５株、ＭＣ１０６１株、Ｃ６００株等が例示される。
【００２７】
本発明還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクターを宿主細胞へ導入する方法は、用いられる宿主細胞に応じて通常使われる導入方法であればよく、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９８７）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮＯ−４７１−５０３３８−X等に記載される塩化カルシウム法や、「ＭＥＴＨＯＤＳ ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｕｌｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ」 Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（１９９３）等に記載されるエレクトロポレーション法等を挙げることができる。
【００２８】
本還元酵素遺伝子が挿入された組み換えベクター等が導入された形質転換体を選抜するには、例えば、前述のようなベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の表現型を指標にして選抜すればよい。
【００２９】
形質転換体が還元酵素遺伝子を保有していることは、形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程（工程（４））によって、確認することができる。また、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９）, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等に記載される通常の方法に準じて、塩基配列の解析、サザンハイブリダイゼーション等を行うことによっても、確認することができる。
【００３０】
形質転換体を培養するための培地としては、例えば、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される炭素源や窒素源、有機塩や無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、スクロース等の糖類、グリセロール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸、動物油、植物油及び糖蜜が挙げられる。これらの炭素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３２】
窒素源としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーン・スティープ・リカー（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｌｉｑｕｏｒ）、綿実粉、乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、アミノ酸類、硝酸ナトリウム等の無機酸のアンモニウム塩、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩及び尿素が挙げられる。これらのうち有機酸のアンモニウム塩、天然有機窒素源、アミノ酸類等は多くの場合には炭素源としても使用することができる。これらの窒素源の培地への添加量は培養液に対して通常０．１〜３０％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３３】
有機塩や無機塩としては、例えば、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の塩化物、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩及びリン酸塩を挙げることができる。具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素一カリウム及びリン酸水素二カリウムが挙げられる。これらの有機塩及び／又は無機塩の培地への添加量は培養液に対して通常０．０００１〜５％（ｗ／ｖ）程度である。
【００３４】
さらに、アロラクトースで誘導されるタイプのｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター等と本還元酵素遺伝子とが機能可能な形で接続された組み換えベクターが導入された形質転換体の場合には、還元酵素の生産を誘導するための誘導剤として、例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を培地中に少量加えることもできる。
【００３５】
本発明還元酵素遺伝子を保有する形質転換体の培養は、微生物等の宿主細胞の培養に通常使用される方法に準じて行うことができ、例えば、試験管振盪式培養、往復式振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養、タンク培養等の液体培養、及び、固体培養が挙げられる。
【００３６】
培養温度は、該形質転換体が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃である。培地のｐＨは約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約１日〜約５日が好ましい。
【００３７】
活性を検出するために用いる形質転換体又はその処理物としては、例えば、形質転換体の培養物、生形質転換体、破砕物、無細胞抽出液、粗精製タンパク質、精製タンパク質、及び、これらの固定化物が挙げられる。ここで、形質転換体の処理物としては、例えば、凍結乾燥形質転換体、有機溶媒処理形質転換体、乾燥形質転換体、形質転換体摩砕物、形質転換体の自己消化物、形質転換体の超音波処理物、形質転換体抽出物、形質転換体のアルカリ処理物が挙げられる。また、固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に還元酵素等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に還元酵素等を閉じ込める方法）が挙げられる。
【００３８】
カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性は、以下の方法により検出することができる。上記の形質転換体又はその処理物を、基質及びＮＡＤＨと混合して３０℃で保温し、消費されるＮＡＤＨ量を反応液の３４０ｎｍにおける吸光度を指標に定量することにより測定することができる。基質としては、アセトフェノン、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチル、４’−クロロアセトフェノン、３−メチル−２−オキソ酪酸エチルエステル、２−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンゾイルギ酸エチル、プロピオンアルデヒド、１−フェニル−２−ブタノン、ｎ−ブチルアルデヒド、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、アセトフェノンを還元して１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜することができる。
【００３９】
また、本発明還元酵素遺伝子の塩基配列は、Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ ｅｒ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７） ７４：５４６３−５４６７頁等に記載されているダイデオキシターミネーター法等により解析することができる。塩基配列分析用の試料調製には、例えば、パーキンエルマー社のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ等の市販の試薬を用いてもよい。
【００４０】
本発明の還元酵素遺伝子を取得する方法を用いることにより、不斉還元酵素をコードする遺伝子をより効率的に取得でき、取得した遺伝子を用いて還元酵素を生産することによって、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。また、本発明は、かかる還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を提供することができる。
【００４１】
（還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、形質転換体）
本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体について説明する。本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体は、上記還元酵素遺伝子を取得する方法により単離同定したものである。
【００４２】
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸である。また、本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸である。また、本発明の還元酵素遺伝子は、その遺伝子がコードするタンパク質の還元活性を損なわない限り、１〜数個の塩基の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有する塩基配列を有する核酸であってもよい。
【００４３】
本発明の還元酵素は、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質である。また、本発明の還元酵素は、その還元活性を損なわない限り、１〜数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００４４】
本発明の組換えベクターは、上記還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターである。特定の実施形態においては、本発明の組換えベクターは、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１（それぞれプラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６）である。また、本発明の形質転換体は、上記組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４５】
以下に、プラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６の各々の組換えベクターに関して、還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、及び、形質転換体を説明する。
【００４６】
（Ａ）プラスミドＬＳ−１
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１１に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１１に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４７】
（Ｂ）プラスミドＬＳ−７
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１３に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１３に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−７と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−７と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４８】
（Ｃ）プラスミドＬＳ−１０
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１５に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１５に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１０と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１０と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００４９】
（Ｄ）プラスミドＬＳ−１１
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１７に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１７に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１１と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１１と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５０】
（Ｅ）プラスミドＬＳ−１７
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号１９に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２０に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号１９に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−１７と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−１７と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５１】
（Ｆ）プラスミドＬＳ−２０
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２１に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２１に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２０と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２０と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５２】
（Ｇ）プラスミドＬＳ−２２
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２３に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２４に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２３に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２２と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２２と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５３】
（Ｈ）プラスミドＬＳ−２４
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２５に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２６に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２５に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２４と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２４と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５４】
（Ｉ）プラスミドＬＳ−２６
本発明の還元酵素遺伝子は、配列番号２７に記載の塩基配列を有する核酸である。また、配列番号２８に記載のアミノ酸配列をコードする核酸である。本発明の還元酵素は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質である。本発明の組換えベクターは、配列番号２７に記載の塩基配列を有する核酸を含有する組換えベクターである。本発明の組換えベクターは、プラスミドＬＳ−２６と命名された受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１である。本発明の形質転換体は、プラスミドＬＳ−２６と命名された組換えベクターを含有する形質転換体である。
【００５５】
本発明の還元酵素遺伝子、還元酵素、還元酵素遺伝子を含む組換えベクター、及び、その形質転換体を用いることにより、ケトン化合物又はアルデヒド化合物から有用な光学活性アルコールを工業的に有利に得ることができる。
【００５６】
（アルコールの製造方法）
本発明の光学活性なアルコールの製造方法について説明する。本発明の光学活性なアルコールの製造方法は、上記の還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、又は、形質転換体を用いることを特徴とするものである。また、上記製造方法は、上記の還元酵素遺伝子を取得する方法により単離同定した還元酵素遺伝子、還元酵素、組換えベクター、又は、形質転換体を用いるものであってもよい。本発明の光学活性なアルコールの製造方法は、基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物に、還元酵素、それを産生する形質転換体又はその処理物を作用させることを特徴とする。
【００５７】
形質転換体の培養方法、形質転換体の処理物の調製方法等は、上述の還元酵素遺伝子を取得する方法の工程（４）において説明した方法を用いることができる。また、形質転換体の培養物から還元酵素を精製する方法としては、通常のタンパク質の精製において使用される方法を適用することができ、例えば、次のような方法を挙げることができる。
【００５８】
まず、形質転換体の培養物から遠心分離等により細胞を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕法又は界面活性剤若しくはリゾチーム等の溶菌酵素を用いる化学的破砕法等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルター濾過等により不純物を除去することにより無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって、還元酵素を精製することができる。
【００５９】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、フェニル基若しくはブチル基を導入したセルロース、デキストリン又はアガロース等の不溶性高分子担体が挙げられる。市販の担体充填済カラムを用いることもでき、かかる市販の担体充填済カラムとしては、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００６０】
なお、還元酵素を含む画分を選抜するには、例えば、アセトフェノンを還元して１−フェニルエタノールを生産する能力を指標にして選抜すればよい。
【００６１】
次に、本発明の光学活性なアルコールの製造方法に用いる基質であるケトン化合物又はアルデヒド化合物について説明する。
【００６２】
ケトン化合物又はアルデヒド化合物は、例えば、プロピオンアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、ｎ−ヘキシルアルデヒド、ｎ−ペプチルアルデヒド、ｎ−デシルアルデヒド、２−オキソプロピオンアルデヒド、トランス−シンナムアルデヒド、４−ブロモベンズアルデヒド、２−ニトロベンズアルデヒド、３−ニトロベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、４−クロロベンズアルデヒド、２−ペンタノン、２−ヘキサノン、２−ヘプタノン、２−オクタノン、２−ノナノン、３−ペンタノン、３−クロロ−２−ブタノン、ｔｅｒｔ−ブチルアセトアセテート、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、クロロアセトン、ジヒドロキシアセトン、１，１−ジクロロアセトン、ピルビン酸エチル、メチル ３−オキソブタノエート、エチル ３−オキサブタノネート、エチル ４−クロロアセトアセテート、メチル ４−ブロモー３−オキサブタノエート、エチル ４−ブロモ−３−オキサブタノエート、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−ピロリジノン、イソプロピル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、エチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ４−シアノ−３−オキソブタノエート、メチル ３−オキソペンタノエート、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、アセトフェノン、２’−ブロモアセトフェノン、３’−ブロモアセトフェノン、４’−ブロモアセトフェノン、２−クロロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、４’−クロロアセトフェノン、ベンジルアセトン、１−フェニル−２−ブタノン、ｍ−メトキシアセトフェノン、３，４−ジメトキシアセトフェノン、４’−メトキシアセトフェノン、２，３’−ジクロロアセトフェノン、３，４−ジメトキシフェニルアセトン、シクロペンタノン、４−アセチル安息香酸、Ｄ−（＋）-グルコース、４−クロロ-３-オキソ酪酸エチル、３−メチル-２-オキソ酪酸エチル、４−ヒドロキシ-２-ブタノン、ベンゾイルギ酸エチル、１−フェニル-２-ブタノン、３−オキソ酪酸エチル等が挙げられる。
【００６３】
上記方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行うとよい。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。該緩衝水溶液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩及びこれらの混合物が挙げられる。
【００６４】
上記方法においては、水に加えて有機溶媒を共存させることもできる。共存させることができる有機溶媒としては、例えば、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロプルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類；ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類；トルエン、ヘキサン、シクロへヘキサン、ヘプタン、イソオクタン等の炭化水素類；メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等の有機硫黄化合物；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類、及び、これらの混合物が挙げられる。
【００６５】
上記方法における反応は、例えば、水、ＮＡＤＨ、及びケトン化合物又はアルデヒド化合物を、還元酵素又はそれを産生する形質転換体又はその処理物とともに、必要によりさらに有機溶媒等を含有した状態で、攪拌、振盪等により混合することにより行われる。
【００６６】
上記方法における反応時のｐＨは適宜選択することができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲である。また反応温度は適宜選択することができるが、原料及び生成物の安定性、反応速度の点から通常０〜６０℃の範囲である。また、窒素や空気等を吹き込みながら、反応を行なってもよい。通気量は通常０．１〜５Ｌ／分の範囲である。
【００６７】
反応の終点は、例えば、反応液中のケトン化合物又はアルデヒド化合物の量を液体クロマトグラフィー等により追跡することにより決めることができる。反応時間は適宜選択することができるが、通常０．５時間から１０日間の範囲である。
【００６８】
反応液からのアルコールの回収は、一般に知られている任意の方法で行えばよい。例えば、反応液の有機溶媒抽出操作、濃縮操作等の後処理を、必要によりカラムクロマトグラフィー、蒸留等を組み合わせて、行うことにより精製する方法が挙げられる。
【００６９】
形質転換体又はその処理物としては、上述のものを用いることができるが、本発明の形質転換体を用いた工業的な生産を考慮すれば、生形質転換体を用いるよりも形質転換体を死滅化させた処理物を用いる方法が、製造設備の制限が少ないという点では好ましい。そのための死菌化処理方法としては、例えば、物理的殺菌法（加熱、乾燥、冷凍、光線、超音波、濾過、通電）や、化学薬品を用いる殺菌法（アルカリ、酸、ハロゲン、酸化剤、硫黄、ホウ素、砒素、金属、アルコール、フェノール、アミン、サルファイド、エーテル、アルデヒド、ケトン、シアン及び抗生物質）が挙げられる。一般的には、これらの殺菌法のうちできるだけ還元酵素の酵素活性を失活させず、かつ反応系への残留、汚染等の影響が少ない処理方法を選択することが望ましい。
【００７０】
また、本発明還元酵素を用いたアルコールの製造方法はＮＡＤＨの存在下に行われ、ケトン化合物又はアルデヒド化合物の還元反応の進行に伴い、ＮＡＤＨは酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ＋と記す）に変換される。配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する還元酵素は、変換により生じたＮＡＤ＋を、例えば、２−プロパノールの酸化反応に伴って、還元型（ＮＡＤＨ）に変換する能力を有するので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換を可能にする基質として、２−プロパノール等を共存させることもできる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００７２】
（実施例１：環境ＤＮＡの取得）
環境サンプルとして、４℃保存した以下の環境サンプル（Ａ）〜（Ｃ）を用いて、ＩＳＯＩＬ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ Ｂｅａｔｉｎｇ（ニッポンジーン社製）のマニュアルにしたがって、環境ＤＮＡ（Ａ）〜（Ｃ）をそれぞれ抽出した。ＤＮＡの抽出確認は１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した。
（Ａ）滋賀県琵琶湖周辺の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
（Ｂ）富山県砺波市の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
（Ｃ）富山県魚津市付近の土壌（表層土から下に１０ｃｍ程度下にある黒色土）
【００７３】
（実施例２：人工オリゴヌクレオチドプライマーの調製）
以下の4種類の縮重プライマーを人工合成した。
プライマー１：５’−ＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’(配列番号１)
プライマー２：５’−ＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’(配列番号２)
プライマー３：５’−ＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’(配列番号３)
プライマー４：５’−ＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’(配列番号４)
プライマー１と２、プライマー３と４のペアで遺伝子増幅反応を行った。なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
【００７４】
（実施例３：ｐＨＡＲ１ｓベクターの構築）
以下の手順により、特開２００７−０６１０６５に記載のプラスミドｐＨＡＲ１を改変し、ＥｃｏＴ１４Ｉ制限酵素サイトを含まないｐＨＡＲ１ｓベクターを構築した。
まず、プラスミドｐＨＡＲ１を含む以下の組成液１を調製し、３７℃で３時間処理した。
［組成液１］
ｐＨＡＲ１溶液（１００μｇ/ｍｌ） １μｌ
ＥｃｏＴ１４Ｉ（宝酒造社製） １μｌ
１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）２μｌ
滅菌水 １６μｌ
【００７５】
反応終了後、６０℃で１５分間処理し、反応を止めた。得られた反応液に以下の組成液２を添加した。
［組成液２］
０．１％ ＢＳＡ ２μｌ
ｄＮＴＰｓ（各１．７ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
１０×Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製） ２μｌ
滅菌水 ２μｌ
【００７６】
７０℃で１５分間処理後、３７℃にし、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を２μｌ加えて３０分間保温した。保温後、エタノール沈殿処理し、乾燥後、ＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを１０μｌの滅菌水で溶解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）を用いて１６℃、３０分間反応させた。反応液から、エタノール沈殿にて乾燥ＤＮＡを得た。得られた乾燥ＤＮＡを５μｌの滅菌水で溶解し、エレクトロポレーション法で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ（１％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム）培地に、得られた形質転換体を接種し培養した。培養菌体からＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミド（以下、プラスミドｐＨＡＲ１ｓと記すこともある。）を取り出した。
【００７７】
（実施例４：本発明還元酵素遺伝子の増幅、発現プラスミド及び形質転換体調製）
（４−１）還元酵素遺伝子の増幅
配列番号１で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＳｆｉＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５）、配列番号２で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｄｅＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６）を用いて、環境サンプル（Ａ）由来の環境ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７８】
また、配列番号３で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＳｆｉＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７）、配列番号４で示される塩基配列の５’末端側に制限酵素サイト（ＮｄｅＩ）を付加したオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８）を用いて、環境サンプル（Ｂ）又は（Ｃ）由来の環境ＤＮＡを鋳型にして、下記反応液組成、反応条件でＰＣＲを行った。
【００７９】
［プライマー配列］
配列番号５：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＹＴＧＣＡＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＹＧＡＡＣＧ−３’
配列番号６：５’−ＣＡＴＡＴＧＲＧＣＡＡＹＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＲＡＣＣＧＣＭＲＴＣＧ−３’
配列番号７：５’−ＧＧＣＣＧＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＧＡＷＳＧＣＲＧＴＳＲＣＳＣＣＲＣＣＲＴＣＳＡＣＣＧＣＣＡＧＹＧＭＡＴＧＧＣＣＧＧ−３’
配列番号８：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＹＣＡＧＧＴＲＧＣＣ−３’
なお、ＲはＡ又はＧの塩基、ＹはＣ又はＴの塩基、ＭはＡ又はＣの塩基、ＫはＧ又はＴの塩基、ＳはＣ又はＧの塩基、ＷはＡ又はＴの塩基を示す。
［反応液組成］
環境ＤＮＡ液 ２μl
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） ２μｌ
プライマー（１００μＭ） 各０．８μｌ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＢｌｅｎｄＴａｑ ２μｌ
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製） ０．２μｌ
ＤＭＳＯ ２μｌ
滅菌水 １０．２μｌ
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９４℃（０．５分間）→６９℃（１分間）→７２℃（１分間）のサイクルを４０回行い、さらに７２℃で１０分間保持した。増幅産物はＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。
【００８０】
（４−２）還元酵素遺伝子を含む組み換えベクターを用いた形質転換体の構築
精製後の溶液に２種類の制限酵素（ＮｄｅＩ及びＳｆｉＩ）を加え、ＤＮＡ断片を２重消化し、方向性がある制限酵素切断末端を有するＤＮＡ断片を調製した。一方、プラスミドｐＨＡＲ１ｓを２種類の制限酵素（ＮｄｅＩ及びＳｆｉＩ）により２重消化した。ＤＮＡ断片の酵素消化確認は１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した。１．５％アガロースゲル電気泳動後、ゲルから酵素消化ＤＮＡ断片を切り出し、それぞれＷｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて精製した。得られた精製液をエタノール沈殿後、乾燥させた後、それぞれの酵素消化ＤＮＡ断片に滅菌水を５μｌ添加した。それぞれの酵素消化ＤＮＡ断片水溶液を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を１０μｌ添加した。１６℃にて一晩放置し、エタノール沈殿後、乾燥させた。５μｌの滅菌水を添加後、エレクトロポレーション法によりＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した。
【００８１】
滋賀県琵琶湖周辺から採取した環境ＤＮＡ（Ａ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約１２００コロニー認められた。また、富山県砺波市付近から採取した環境ＤＮＡ（Ｂ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約１２００コロニー認められた。また、富山県魚津市付近から採取した環境ＤＮＡ（Ｃ）から増幅させたＤＮＡ断片を含む大腸菌組換え体は約４００コロニー認められた。それら大腸菌組換え体から、２４０個のコロニーをランダムに選択し、コロニーＰＣＲを行なった。
【００８２】
[反応液組成]
コロニー １白金耳
ｄＮＴＰｓ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） １．６μｌ
Ｍ１３−４７プライマー（１００μＭ） １．０μｌ
ＰＡＲＳＱＲ０プライマー（１００μＭ） １．０μｌ
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＢｌｅｎｄＴａｑ ２μｌ
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）） ０．２μｌ
滅菌水 １４．２μｌ
［プライマー］
Ｍ１３−４７ ：５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号９）
ＰＡＲＳＱＲ０：５’−ＧＡＡＡＧＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣ−３’（配列番号１０）
［反応条件］
上記組成の反応液が入った容器をＢｉｏ−ＲＡＤ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅにセットし、９４℃（２分間）に加熱した後、９５℃（０．５分間）→５０℃（０．５分間）→７２℃（１．５分間）のサイクルを３０回行い、さらに７２℃で１０分間保持した。
ＰＣＲ増幅断片を１．５％アガロースゲル電気泳動を行って確認した結果、３４個のコロニーに遺伝子の挿入を確認した。
【００８３】
（実施例５：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体のアセトフェノン還元活性測定）
（５−１）粗酵素液の調製
得られた３４種類の形質転換体、プラスミドｐＨＡＲ１ｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体、又は、プラスミドｐＫＥＬＡ（特許文献：特開２００８−０１７７７３）にてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ一Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び、０．４ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地４ｍｌ中で培養（３７℃、２２時間、振盪培養）した。その後、培養液２ｍｌを２ｍｌ容の遠心チューブに入れ、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）することにより、沈殿として湿菌体を得た。培養上清液を除いた湿菌体に、５００ｍｇのビーズ（Φ０．１ｍｍ）と、５０ｍＭのＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）を０．５ｍｌを加え、Ｍｕｌｔｉ−Ｂｅａｄｓ Ｓｈｏｃｋｅｒ（安井器械社製）で破砕した（２５００ｒｐｍ、１５０秒、ＯＮ（３０秒×３）、ＯＦＦ（３０秒×２））。破砕液を短時間遠心分離した後、破砕液の入ったチューブの底に穴をあけ、チューブを１．５ｍｌ容の新しい遠心チューブに押し込んだ。遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）後、２ｍｌ容の遠心チューブを抜き、１．５ｍｌ容の遠心チューブのサンプルをさらに遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、得られた遠心上清液を粗酵素液とした。なお、プラスミドｐＫＥＬＡは、２，２，２−トリフルオロアセトフェノンを２，２，２−トリフルオロ−１−フェニルエタノールに還元する能力を有するポリペプチドをコードする還元酵素遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００８４】
（５−２）還元活性測定
５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）、０．２７ｍＭ ＮＡＤＨ、３ｍＭ アセトフェノンを含む反応液９９０μｌを２５℃で１．５分保温し、粗酵素液を１０μｌ添加後、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸収の減少を測定した。なお、プラスミドｐＨＡＲ１ｓにてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を形質転換した形質転換体から得られた粗酵素液で測定した結果をブランクとした。また、酵素活性はａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ（ａＵ）とし、下記の計算式を用いて算出した。結果を表１に示した。
酵素活性（ａＵ）＝（３４０ｎｍでの減少量（ΔＡ）／測定時間（1分））
【００８５】
【表１】
【００８６】
酵素活性０．００３（ａＵ）以上の酵素を還元活性ありと判断すると、３４個の酵素中２８個の酵素（ＬＳ−１〜２８）で還元活性を確認できた。
【００８７】
還元活性の確認できた上記２８種類の形質転換体からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用い、各種ＰＣＲ増幅断片を含む組み換えベクター（以下、プラスミドＬＳ−１〜ＬＳ−２８と記すこともある。）を取り出した。
【００８８】
（実施例６：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体の基質特異性検討（その１））
基質として、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、又は、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルを用いた以外は実施例５に記載の方法で還元活性を測定した。なお、実施例５で活性の確認できた２８種類について、各形質転換体から調製した粗酵素液を用いて基質特異性を検討した。結果を表２に示す。
【００８９】
【表２】
【００９０】
（実施例７：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体の基質特異性検討（その２））
基質としてアセトフェノン、２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、３’−クロロアセトフェノン、ｎ−バレルアルデヒド、４−クロロ−３−オキソ酪酸エチルエステル、４’−クロロアセトフェノン、３−メチル−２−オキソ酪酸エチルエステル、２−ヘプタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、ｎ−ヘプチルアルデヒド、ベンゾイルギ酸エチル、プロピオンアルデヒド、１−フェニル−２−ブタノン、ｎ−ブチルアルデヒド、又は、３−オキソ酪酸エチルを用いた以外は実施例５に記載の方法で還元活性を測定した。結果を表３〜６に示す。
【００９１】
【表３】
【００９２】
【表４】
【００９３】
【表５】
【００９４】
【表６】
【００９５】
（実施例８：本発明還元酵素遺伝子を有する形質転換体を用いた２，２，２−トリフルオロアセトフェノン還元反応）
（８−１）湿菌体調製
増幅された還元酵素遺伝子を含む３４種類の形質転換体の中から２０種類（ＬＳ−１、２、３、５、６、７、８、１１、１３、１５、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７）の形質転換体、又は、プラスミドｐＫＥＬＡ（特開２００８−０１７７７３）にてＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株を形質転換した形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び、０．４ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地４ｍｌ中で培養（３７℃、２２時間、振盪培養）した。その後、培養液２ｍｌを２ｍｌ容の遠心チューブに入れ、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０秒、４℃）することにより、沈殿として湿菌体を得た。
【００９６】
（８−２）還元反応
湿菌体に、５０ｍＭ ＭＯＰＳ−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ２，２，２−トリフルオロアセトフェノン、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１０％（ｗ／ｖ）２−プロパノールを含む反応液０．５ｍｌを加え、バイオシェーカーで振とうした（１２００ｒｐｍ、２２時間、３０℃）。その後、１−ブタノールを１ｍｌ添加して振とうした（１２００ｒｐｍ、３０分、３０℃）。遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分、３０℃）し、有機層を得た。この有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて乾燥後、ガスクロマトグラフィーによる含量分析を行った。
【００９７】
（８−３）１−フェニルトリフルオロエタノールの含量分析、及び、光学純度分析
以下の条件で、ガスクロマトグラフィーによる１−フェニルトリフルオロエタノールの含量分析を行い、溶出時間の違いにより、得られた還元体の光学純度を調べた。その結果を表７に示す。
＜含量分析条件（ガスクロマトグラフィー条件）＞
カラム：ＣＰ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−β−２３６−Ｎ１９(０．２５ｍｍ×２５Ｍ)
カラム温度：１３０℃
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ温度：２５０℃
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ温度：２５０℃
キャリアーガス：ヘリウム（流量：０．５ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
溶出時間：（Ｓ）−（＋）−１−フェニルトリフルオロエタノール（８．３分）、（Ｒ）−（−）−１−フェニルトリフルオロエタノール（８．５分）
【００９８】
【表７】
【００９９】
（実施例９：本発明還元酵素遺伝子の塩基配列決定）
実施例４でアセトフェノン還元活性を示した２８株（ＬＳ−１〜２８）のプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の中から、ＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、ＬＳ−２６について塩基配列を解析した。塩基配列の解析は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（パーキンエルマー製）を用いて各プラスミドを鋳型としてシークエンス反応を行い、得られたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（パーキンエルマー製）で解析することにより行った。得られた塩基配列を配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４に示した。
【０１００】
プラスミドＬＳ−１、ＬＳ−７、ＬＳ−１０、ＬＳ−１１、ＬＳ−１７、ＬＳ−２０、ＬＳ−２２、ＬＳ−２４、及び、ＬＳ−２６は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ つくばセンター 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に２００８年１０月２１日に寄託されており、寄託番号は、それぞれ、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１である（表８参照）。
【０１０１】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本願発明の方法によれば、カルボニル化合物から光学活性アルコール化合物を効率よく得ることができる還元酵素が環境サンプル由来のＤＮＡから得ることができることから、産業に有用な還元酵素を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセット。
【請求項２】
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセット。
【請求項３】
請求項２記載のプライマーセットが、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセット。
【請求項４】
下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）請求項１〜３いずれか一項に記載のプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）前記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）前記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡライブラリーが、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸。
【請求項７】
配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
前記組換えベクターが、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１からなる群より選ばれる、請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１２】
光学活性なアルコールの製造における、請求項６又は７に記載の核酸の使用。
【請求項１３】
光学活性なアルコールの製造における、請求項８に記載のタンパク質の使用。
【請求項１４】
光学活性なアルコールの製造における、請求項９又は１０に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１５】
光学活性なアルコールの製造における、請求項１１に記載の形質転換体の使用。
【請求項１】
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片；
からなるプライマーセット。
【請求項２】
（１）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；又は
（２）配列番号３に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片、及び、配列番号４に記載の塩基配列からなる核酸断片の５’末端側に、制限酵素サイトを含む核酸断片が付加された核酸断片；
からなるプライマーセット。
【請求項３】
請求項２記載のプライマーセットが、
（１）配列番号５に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号６に記載の塩基配列からなる核酸断片；又は
（２）配列番号７に記載の塩基配列からなる核酸断片、及び、配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸断片；
である、プライマーセット。
【請求項４】
下記（１）〜（４）に記載する４工程：
（１）請求項１〜３いずれか一項に記載のプライマーセットを用い、ＤＮＡライブラリーを鋳型として、核酸増幅反応を行い、増幅産物を得る工程；
（２）前記増幅産物を、宿主細胞内において機能可能なプロモーターと機能可能な形で接続し得るベクターに挿入して、組換えベクターを構築する工程；
（３）前記組換えベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する工程；及び
（４）前記形質転換体又はその処理物を用いて、カルボニル化合物を光学活性なアルコールに不斉還元する活性を有することを検出する工程；
を備える、還元酵素遺伝子を取得する方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡライブラリーが、環境サンプル由来の環境ＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７からなる群より選ばれる塩基配列を有する核酸。
【請求項７】
配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
前記組換えベクターが、受託番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４３、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４４、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４５、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４６、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４７、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４８、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０４９、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５０、及び、ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１１０５１からなる群より選ばれる、請求項９に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
【請求項１２】
光学活性なアルコールの製造における、請求項６又は７に記載の核酸の使用。
【請求項１３】
光学活性なアルコールの製造における、請求項８に記載のタンパク質の使用。
【請求項１４】
光学活性なアルコールの製造における、請求項９又は１０に記載の組換えベクターの使用。
【請求項１５】
光学活性なアルコールの製造における、請求項１１に記載の形質転換体の使用。
【公開番号】特開２０１０−１１５１６３（Ｐ２０１０−１１５１６３Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２９１４０７（Ｐ２００８−２９１４０７）
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（５０３０８１２１０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１３日（２００８．１１．１３）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【出願人】（５０３０８１２１０）
【Ｆターム（参考）】
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