酵素糖化用原料の製造方法、並びに糖の製造方法、及びエタノールの製造方法
【課題】糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる有用な酵素糖化用原料の製造方法、並びに、糖の製造方法、及びエタノールの製造方法の提供。
【解決手段】リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、前記処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、を含み、前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と、水の質量（Ｂ）とが、下記式（１）の関係を満たし、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０・・・（１）かつ、前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行う酵素糖化用原料の製造方法である。エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００・・・（２）
【解決手段】リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、前記処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、を含み、前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と、水の質量（Ｂ）とが、下記式（１）の関係を満たし、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０・・・（１）かつ、前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行う酵素糖化用原料の製造方法である。エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００・・・（２）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス原料を利用した、糖の製造に用いられる、酵素糖化用原料の製造方法、並びに該酵素糖化用原料の製造方法により製造された酵素糖化用原料を用いた糖の製造方法、及び該糖の製造方法により製造された糖を用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策の一環として、木質バイオマスや草本バイオマス等のセルロースを含む原料からエタノールを製造し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている。バイオマス原料からのエタノールの製造は、例えば、収集したバイオマス原料を、糖化工程において糖に分解した後、発酵工程において酵母等の微生物を用いてエタノールに変換することにより行うことができる。
【０００３】
一方、環境負荷低減の観点から、生分解性ポリマーの利用が増加しており、その原料のひとつとして乳酸が使用されている。この乳酸も、前記のバイオマス原料を糖化し、さらにこれを発酵することにより得ることができる。
【０００４】
前記糖化は、従来より、濃硫酸を用いて行われることが多かったが、環境負荷低減の観点から、硫酸の使用量を少なくすることが望まれている。そこで、近年は、濃硫酸による糖化に代わる手段として、酵素を用いたバイオマス原料の糖化が広く研究されている。酵素による糖化は、環境に対する影響の観点から望ましい手段であるが、この酵素糖化のためには、酵素を作用させ易くする目的から、予めバイオマス原料に対して前処理を施して、バイオマス原料を構成するリグノセルロース（リグニン、セルロース、ヘミセルロースからなる複合体）中のセルロースとリグニンとを分離することが必要となる。このバイオマス原料の前処理方法として様々な方法が知られているが、中でも、希硫酸、加圧熱水等による蒸煮処理などが一般的である（例えば、下記特許文献１〜４参照。）。しかしながら、前記したように硫酸の使用が好ましくないこと、及びバイオマス原料にこれらの前処理を行い、得られた処理物を酵素糖化に供する場合では、所望の程度の酵素糖化率を得るためには該前処理を多段で行う必要があったり、２００℃以上の高温にしなければならない等の問題がある。
また、前記蒸煮処理において生成する分解生成物は、酵素糖化後の発酵工程において、酵母等の微生物による発酵に対する阻害作用を及ぼすという問題もある。
そして、前記蒸煮処理では、バイオマス原料の粒子を流動化させるために水分量を多くする必要があり、そのために、酵素糖化後の糖液中における糖濃度が低くなり、その後の発酵工程における効率が低下するという問題もある。
【０００５】
また、バイオマス原料を物理的手段により微細に粉砕することにより、化学的、生物化学的反応性が向上することが知られているが、粉砕のみにより充分な酵素糖化率を得ようとすると、粉砕工程に多大なエネルギーを要し、経済合理性を失うおそれがある。
【０００６】
また、バイオマス原料を加圧熱水により蒸煮処理した後、水等の存在下に湿式で機械的粉砕を行うことにより、バイオマスの酵素糖化率が向上することが開示されている（例えば、下記特許文献５参照。）。この場合も、酵素糖化率の向上はあるものの、前記蒸煮処理における問題点、すなわち発酵に対する阻害物質の生成、酵素糖化工程により得られる糖液中の糖濃度が低いとの問題は依然として解消しない。
【０００７】
また、バイオマス原料をアンモニアを用いて前処理することにより、その化学的、生物化学的反応性が向上することが知られている（例えば、下記特許文献６、非特許文献１参照。）。中でも、バイオマス原料中のリグニンをセルロースから分離するだけでなく、アンモニア処理により、バイオマス原料中のセルロースＩ型結晶を、セルロースＩ型結晶の結晶密度よりも低い結晶密度を有するセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることによって、高い酵素糖化率を得ることができることが知られている（例えば、特許文献７参照）。
また、バイオマス原料を水とアンモニアが共存する条件下に前処理する場合におけるセルロースＩ型結晶からセルロースＩＩＩ型結晶への転移は、アンモニアに対する相対的な水の量が少ないほど進行することが知られている（例えば、非特許文献４参照）。
しかしながら、この提案の技術でも十分な酵素糖化率が得られていないのが現状であり、更なる改良が求められている。
【０００８】
一方、アンモニア処理により生成し、高い酵素糖化率が期待できるセルロースＩＩＩ型結晶の少なくとも一部は、水との接触により酵素糖化を受けにくいセルロースＩ型結晶に戻ることが知られている（例えば、非特許文献２、及び３参照）。
そのため、乾燥されて水分を含まない、あるいは水分含有量の低いバイオマス原料を、水分を含まない、あるいは水分含有量の低いアンモニアを用いて前処理を行うことにより、より効率的にセルロースＩ型結晶をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることができる。そして、アンモニア処理により生成したセルロースＩＩＩ型結晶を保持するとの観点からは、アンモニア処理されたバイオマスを、酵素糖化工程の前に多量の水と接触させることは、酵素糖化率の観点からは好ましくないと考えられていた。
【０００９】
また、バイオマス原料を、アンモニア水で処理した後に、更に湿式で粉砕することによって、バイオマス原料の酵素糖化率を向上できることが知られている（例えば、特許文献８参照）。通常、アンモニア水のアンモニア濃度は３５％程度が上限のため、前記アンモニア水による処理は多量の水が共存する状態で行われることとなる。そのため、アンモニア水による処理は、前記蒸煮処理に似た効果が得られることが知られている。
したがって、前記蒸煮処理の場合と同様に、分解生成物による発酵阻害の問題や、酵素糖化により得られる糖液の糖濃度が低くなる等の問題がある。
また、多量の水の共存下に処理を行うため、セルロースの結晶形態がＩＩＩ型には転移せず、十分な酵素糖化率が得られないという問題がある。
【００１０】
また、バイオマス原料を気相のアンモニアで処理した場合には、セルロースの結晶形態がＩＩＩ型には転移しないため、液相のアンモニアで処理した場合と比較して酵素糖化率が大幅に低いという問題がある。
したがって、より酵素糖化率を高めることのできる酵素糖化技術の開発、及び、前記酵素糖化に適したバイオマス原料の前処理技術の速やかな開発が、強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−０７５００７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０５５号公報
【特許文献３】特表２００２−５４１３５５号公報
【特許文献４】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献５】特開２００６−１３６２６３号公報
【特許文献６】欧州特許公開第７７２８７号公報
【特許文献７】特開２００８−１６１１２５号公報
【特許文献８】特開２０１０−１１５１６２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｅｎｄｉｃｈ Ｅ．， Ｌａｓｅｒ Ｍ．， Ｋｉｍ Ｓ．， Ａｌｉｚａｄｅｈ Ｈ．， Ｌａｕｒｅａｎｏ−Ｐｅｒｅｚ Ｌ．， Ｄａｌｅ Ｂ． ａｎｄ Ｌｙｎｄ Ｌ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｆｉｂｅｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ （ＡＦＥＸ） ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｅｌｌｉｎｇ ｐｒｉｃｅ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９９，８４２９−８４３５（２００８）
【非特許文献２】ＲＡＪＡＩ Ｈ． ＡＴＡＬＬＡ ＡＮＤ ＤＡＶＩＤ Ｌ． ＶＡＮＤＥＲＨＡＲＴ， ＩＰＣ ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＰＡＰＥＲ ＳＥＲＩＥＳ ＮＵＭＢＥＲ ３０６（１９８８）
【非特許文献３】杉山ら，木材学会誌，５４（２），ｐ．４９−５７（２００８）
【非特許文献４】Ｂｒｙａｎ Ｂａｌｓ， Ｃｈａｄ Ｒｏｇｅｒｓ， Ｍｉｎｇｊｉｅ Ｊｉｎ， Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ Ｂａｌａｎ， Ｂｒｕｃｅ Ｄａｌｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ， ３（１） ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる有用な酵素糖化用原料の製造方法、並びに、糖の製造方法、及びエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、高い酵素糖化率を得ることができるセルロースＩＩＩ型結晶に転移させたバイオマスを湿式で粉砕することは、通常、酵素糖化率向上には寄与せず、むしろ酵素糖化率が低下すると予想されるところ、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を水分量の少ない条件下でアンモニア処理して、前記バイオマス原料中のエステル結合を特定の割合で切断し、且つセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させて得られたバイオマスを、敢えて湿式で粉砕することにより、セルロースＩＩＩ型結晶の一部がセルロースＩ型結晶に戻るにもかかわらず、予想外にも格段に向上した酵素糖化率が得られることを知見した。また、従来、気相のアンモニアで処理したバイオマス原料はセルロースＩＩＩ型に転移しないため、実用に供することができる程度に酵素糖化率を向上させることが困難であったが、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を水分量の少ない条件下で気相のアンモニアで処理して、前記バイオマス原料中のエステル結合を特定の割合で切断して得られたバイオマスを、湿式で粉砕することにより、湿式の粉砕を行わなかった場合と比較して大幅に酵素糖化率が向上すること、また、気相のアンモニアで処理して得られたバイオマスの湿式の粉砕の有無による酵素糖化率の向上幅（湿式粉砕有りの酵素糖化用原料の酵素糖化率と、湿式粉砕無しの酵素糖化用原料の酵素糖化率との差）が、液相のアンモニアで処理して得られたバイオマスの湿式の粉砕の有無による酵素糖化率の向上幅よりも予想外に大きいことを知見した。
【００１５】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで処理し、前記バイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、を含み、前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とが下記式（１）の関係を満たし、
｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０ ・・・ （１）
かつ、
前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行うことを特徴とする酵素糖化用原料の製造方法である。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
＜２＞ 前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含む前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
＜３＞ 前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水を加える工程を含む前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
＜４＞ 前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）とが、下記式（３）の関係を満たす前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７ ・・・ （３）
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化して糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
＜６＞ 前記＜５＞に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる有用な酵素糖化用原料の製造方法、並びに、糖の製造方法、及びエタノールの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、アンモニア処理されたバイオマス、アンモニア処理されたバイオマスを湿式粉砕したバイオマス、及びアンモニア処理されたバイオマスを乾式粉砕したバイオマスのＸ線回折パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（酵素糖化用原料の製造方法）
本発明の酵素糖化用原料の製造方法は、アンモニア処理工程と、湿式粉砕工程と、を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明の酵素糖化用原料の製造方法について説明する。
【００１９】
＜アンモニア処理工程＞
前記アンモニア処理工程は、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断する工程である。
前記アンモニア処理工程では、アンモニアによりヘミセルロースとリグニンとの間のエステル結合を切断する（即ち、当該エステル結合のアミド化開裂を行う）ことにより、後述する酵素糖化工程において、酵素によるセルロースの加水分解を効率的に行うことができる。
【００２０】
−リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料−
前記リグニン、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマス原料としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、農業や林業等の生産活動に伴う残渣として得られる「廃棄物バイオマス」や、エネルギー等を得る目的で意図的に栽培して得られる「資源作物バイオマス」などを使用することができる。前記「廃棄物バイオマス」としては、例えば、廃建材、間伐材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガスなどが挙げられ、また、前記「資源作物バイオマス」としては、例えば、セルロース類の利用を目的として栽培されるシラカバ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ヤナギ、スギ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ミスカンサス、ススキ、リードカナリーグラスなどが挙げられる。また、前記バイオマスは、木に由来する「木質バイオマス」、草に由来する「草本バイオマス」などにも分類される。本発明においては、木質バイオマス及び草本バイオマス共に使用することができる。前記リグニン、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマス原料は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
上記バイオマス原料に含まれるセルロースは、基本的にセルロースＩ型結晶から構成される。
【００２１】
前記バイオマス原料のアンモニア処理において、前記バイオマス原料としては、収集されたものをそのまま使用してもよいが、裁断、粉砕等によりある程度以下の大きさの粒子としてから使用することが、取り扱いの容易さ及びアンモニア処理の効率の観点から望ましい。前記バイオマス原料の粒子の大きさとしては特に制限はなく、粒子としての取り扱いやすさなどに応じて適宜選択することができるが、例えば、通過するメッシュの目開きとして、５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以下がより好ましい。前記メッシュの目開きの大きさが５ｍｍを超えると、後述するアンモニア処理の効率が低下することがある。一方、単位操作としての粉砕はエネルギー効率が極めて低いため、例えば、粉砕に供するエネルギー投入量は乾燥バイオマス１ｋｇ当たり１ＭＪ以下が好ましい。なお、以下、前記の収集したバイオマス原料を裁断、粉砕する工程を「粗粉砕」ということがある。
【００２２】
前記粗粉砕を予め行うことにより、後述するアンモニア処理を効率的に進行させることができる。前記粗粉砕に用いる粉砕機としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィレーミル、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等を用いることができる。
【００２３】
前記バイオマス原料は、アンモニア処理を行う前に乾燥を行うことが好ましいが、この乾燥による水分量の調整についての詳細は後述する。
【００２４】
−アンモニア処理−
前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を、アンモニア処理する場合、その方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料と、アンモニアとを、通常は圧力容器内に導入し、前記圧力容器内を所望の圧力及び温度に設定して、所望の時間処理することにより行うことができる。
前記圧力としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０ＭＰａ〜１２．５ＭＰａ（ゲージ圧）とすることができる。
前記温度としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、−３５℃〜１８０℃とすることができる。
【００２５】
前記アンモニアは液相であっても、気相であっても、また超臨界状態であってもよい。
前記アンモニアは、糖化率の観点からは、液相、又は超臨界状態のアンモニアが好ましく、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアを除去して回収する際に要するエネルギー、湿式粉砕の有無による糖化率の向上幅（湿式粉砕有りの酵素糖化用原料の酵素糖化率と、湿式粉砕無しの酵素糖化用原料の酵素糖化率との差）の観点からは、気相のアンモニアが好ましい。前記気相のアンモニアを用いた場合の湿式粉砕の有無による向上幅が著しく優れていることは、後述する実施例５、比較例５参照からもわかる。
【００２６】
前記アンモニア処理の時間としては特に制限はなく、用いる前記バイオマス原料の量や、前記した処理圧力、処理温度等に応じ、所望の程度のエステル結合の切断が進行する範囲内で適宜選択することができるが、１０分〜１０時間が好ましく、３０分〜８時間が更に好ましく、３０分〜５時間が特に好ましい。前記処理時間が、１０分未満であると、所望の程度のエステル結合の切断が進行しないことがあり、１０時間を超えると、それ以上エステル結合の切断が進行せず、全体として非効率となることがある。一方、前記処理時間が、前記更に好ましい範囲内であると、効率よく、エステル結合の切断を進行させることができ、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上する点で有利である。
【００２７】
前記アンモニア処理工程を実施する装置としては特に限定されず、回分式装置、半連続式装置、連続式装置などが適宜選択され、処理を行う効率を高めるとの観点から、半連続式装置又は連続式装置を採用することが好ましい。
【００２８】
前記アンモニア処理時の、アンモニアの使用量としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料１ｇに対して、１０ｍｇ〜３００ｇが好ましく、１００ｍｇ〜１５０ｇがより好ましく、１ｇ〜５０ｇが特に好ましい。前記アンモニアの使用量が、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料１ｇに対して、１０ｍｇ未満であると、処理が不十分となることがあり、３００ｇを超えると、処理の効率が悪くなることがある。一方、その使用量が、前記特に好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用する処理剤の量を少なくできる等の点で、有利である。
【００２９】
なお、アンモニア処理時には、前記バイオマス原料のエステル結合の少なくとも一部を切断することができれば、更にその他の化合物を組み合わせて使用してもよく、前記その他の化合物としては、例えば、二酸化炭素、窒素、エチレン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、フェノール、ジオキサン、キシレン、アセトン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。また、エチレンジアン、モノメチルアミン、モノエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等のアミン類を組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
−バイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）−
前記アンモニア処理工程においては、前記バイオマス原料とアンモニアの他に、水（水分）が共存することがある。この水は前記バイオマス原料が包含している水、あるいは使用するアンモニアに含有される水などである。そして、得られる酵素糖化用原料の糖化率の向上の観点から、アンモニア処理工程に共存する水の量については、前記バイオマス原料の量との関係においてコントロールされることが好ましい。
アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とは、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０（式（１））の関係を満たすことが好ましい。また、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００（以下、「水分含有率」という場合もある。）は１５以下であることがより好ましい。なお、ここで「水」とはアンモニア処理工程において処理を行う系内に存在する全ての水を意味し、該系内においてバイオマス中に包含されている水も含むものとする。
前記水分含有率が３０より大きい場合、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いた処理の際に、前記バイオマス原料に含まれるセルロースを構成するセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることが困難となり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が十分に向上しないことがある。また、アンモニア処理されたバイオマスからアンモニアを分離・回収して再使用するに際して、効率的に前記分離・回収及び再使用を行うことが困難となる場合がある。すなわち、アンモニアは水に対する溶解度が高く、使用する前記バイオマス原料が多くの水を包含する場合には、アンモニア処理されたバイオマス中にも多くの水が包含されることが多く、この水にアンモニアが溶解するため、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアを除去して回収するためには、加熱等の大きなエネルギーを要する工程が必要となる。また、回収されたアンモニア中の水分の含有量が大きくなり、回収されたアンモニアから水分を除去する工程（例えば蒸留等）が必要となり、大きなエネルギーが必要となる。
一方、前記水分含有率が３０以下であると、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いた処理の際に、前記バイオマス原料に含まれるセルロースを構成するセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることができ、更に前記水分含有率が１５以下であると、更に容易に前記結晶の転移が進行し、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が更に向上するとの点で有利である。また、アンモニア処理後に、更に効率的にアンモニアを分離・回収して再使用することが可能との点でも有利である。
前記アンモニア処理において、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いて処理されたバイオマスは、少なくともセルロースＩＩＩ型結晶を有していることが好ましい。
【００３１】
前記式（１）を満たすためには、前記バイオマス原料を予め乾燥して、バイオマス原料が包含する水分由来の水の量が前記式（１）を満たすように調整しておくことが好ましい。
前記バイオマスの乾燥方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、大気下に高温で乾燥すると、バイオマスの組織が破壊されたり酸化されたりするため、例えば、天日乾燥、自然乾燥、１００℃以下での通風による乾燥、減圧乾燥、ジメチルエーテルを用いた乾燥などが好ましい。
なお、前述した、アンモニア処理後のアンモニアの分離・回収及び再使用を効率的に行うとの観点からは、前記バイオマス原料を予め十分に乾燥して、その水分含有量を極力低減することが好ましい。一方、バイオマス原料中に残存する水分の含有量を低減するに伴い、乾燥に要するエネルギーは増大する。したがって、乾燥後のバイオマス原料中の水分含有量の設定は、前記アンモニア処理工程における水分含有率が前記式（１）を満たす範囲において、バイオマス原料の乾燥に使用する設備、消費エネルギー、アンモニア処理後に分離・回収されて再使用されるにアンモニアの水分含有量の設定等の因子を勘案して決定することが好ましい。
【００３２】
−エステル結合残存率−
前記エステル結合残存率は、下記式（２）により求められる。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
なお、前記吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積は、前記のアンモニア処理工程の前後で変化しない。
また、エステル結合のアミド化開裂の進行は、フーリエ変換赤外分光分析における１６６２ｃｍ−１付近のアミド結合のＣ＝Ｏ（リグニン共役カルボニル）伸縮振動に帰属される吸収ピークの増大によっても確認することができる。
なお、前記エステル結合は、前記バイオマス原料中のヘミセルロースとリグニンとの間の結合であり、ヘミセルロースはセルロースと水素結合による強い相互作用を有している。したがって、リグニンはヘミセルロースを介してセルロースと強い相互作用を有し、これがリグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含むバイオマス原料が容易に酵素糖化を受けない理由である。アンモニア処理により前記エステル結合が切断されると、リグニンはヘミセルロースから分離され、その結果、セルロースとの相互作用も弱まることとなり、酵素糖化が促進される大きな要因となる。
【００３３】
前記エステル結合残存率としては、９０％以下であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記エステル結合の残存率が９０％を超えると、セルロースとリグニンとを分離するとのアンモニア処理の効果が不十分となり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が十分に向上しないことがある。
一方、前記エステル結合残存率が前記範囲内であると、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上する。
なお、前述の作用機構から、一般的に、前記エステル結合の切断の進行（前記エステル結合残存率の低下）に伴い、セルロースの酵素糖化率は向上することとなる。
【００３４】
前記アンモニア処理工程においてアンモニア処理されたバイオマスは、アンモニア処理を行うための装置（通常は高圧容器）から排出される。前記排出と同時あるいは前記排出の前に、通常は加圧されていたアンモニアが大気圧に脱圧される。前記脱圧により、アンモニア処理されたバイオマスとアンモニアとが固気分離される。
【００３５】
前記アンモニアから分離されたアンモニア処理されたバイオマスの内部には、一部のアンモニアが残留しているので、この残留アンモニアを除去する工程を設けることが好ましい。残留アンモニアの除去を行う方法の例としては、アンモニア処理されたバイオマスを必要により加熱下に、窒素ガス等の不活性ガス気流に接触させる方法、スチーム流に接触させる方法、必要により加熱下に減圧とする方法などが挙げられる。
なお、前述のように、アンモニア処理されたバイオマス中に水が包含される場合には、この水にアンモニアが溶解することから、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアの含有量が増大する傾向にある。また、バイオマス中に包含される水に溶解したアンモニアを除去するためには、この水もバイオマスから除去する必要があることから、アンモニアの除去に要するエネルギーが増大する傾向にある。
【００３６】
前記アンモニア処理工程において使用され、アンモニア処理されたバイオマスと固気分離により分離されたアンモニアは、回収されてアンモニア処理工程にリサイクルされて再使用されることが好ましい。アンモニア処理工程において水が共存し、回収されたアンモニアが所定の含有量を超える水分を含有する場合には、当該回収されたアンモニアを再使用してアンモニア処理を行うと、前記式（１）に規定されるアンモニア処理工程におけるバイオマス原料の乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）との関係を満足すことができないことがある。そのような場合には、回収されたアンモニアから水を除去する工程を設けることが好ましい。回収されたアンモニアから水を除去する方法の例としては、回収されたアンモニアを圧縮及び／又は冷却して液化し、蒸留を行う方法などが挙げられる。
【００３７】
＜湿式粉砕工程＞
前記湿式粉砕工程は、前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する工程である。ここで、「湿式」とは水及び／又は有機溶剤の共存下であることを意味する。
【００３８】
前記湿式粉砕工程では、水及び／又は有機溶剤の共存下に、前記アンモニア処理されたバイオマスを粉砕する。
前記有機溶剤としては、例えば、脂肪族、脂環族又は芳香族の１価、２価、又は多価アルコールのような各種アルコール、より具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオールなどのアルコール類又はそのアルキルエーテルなどの誘導体が挙げられる。
前記湿式粉砕工程において有機溶剤を使用する場合は、酵素糖化における阻害防止、発酵における阻害防止等の観点から、湿式粉砕後に、前記湿式粉砕工程から得られる、粉砕されたバイオマス及び前記有機溶剤又は前記有機溶剤を含む水を含む粉砕物から、前記有機溶剤あるいは場合によりその反応物を除去することが好ましい。前記有機溶剤の除去を実施することは、装置コスト及びエネルギーコストの上昇を招くことから、有機溶剤は使用せず、水を用いて湿式粉砕することが好ましい。
【００３９】
−アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量と水及び／又は有機溶剤の質量−
前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）との関係としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７（式（３））が好ましく、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦３０がより好ましく、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦１５が特に好ましい。
前記｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００（以下、「固形分率」という場合もある。）が６７を超えると、水及び／又は有機溶剤の質量が相対的に少なくなり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上しないことがある。一方、前記固形分率が５未満であると、水及び／又は有機溶剤の質量が相対的に多くなり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率は向上するものの、該酵素糖化用原料を糖化処理して得られる糖液中の糖濃度が低くなり、その後の発酵工程における効率が低下することがある。一方、前記固形分率が前記好ましい範囲内であると、酵素糖化率の向上、及び発酵工程における効率などの点で有利である。
なお、前記固形分率が１５未満である場合には、前記湿式粉砕工程から、必要により有機溶媒を除去する工程を経て得られる水を含む粉砕物を酵素糖化用原料として、そのままスラリーとして酵素糖化工程に供することが可能である。すなわち、前記水を含む粉砕物はスラリーとして流動性を有しており、均一に酵素糖化を行うことができる。
【００４０】
前記湿式粉砕工程の湿式粉砕に用いる粉砕機としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ボールミル、ビーズミル、振動ミル、ジェットミル、ディスクミル等が挙げられる。
【００４１】
−アンモニア処理されたバイオマスに水及び／又は有機溶剤を加える工程−
本実施形態では、前記アンモニア処理工程と、前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含むことが好ましい。
前記アンモニア処理されたバイオマスに水及び／又は有機溶剤を加える工程により、前記湿式粉砕工程において必要なアンモニア処理されたバイオマスと水及び／又は有機溶剤とを含む混合物が提供される。また、当該工程により、アンモニア処理されたバイオマスの質量と水及び／又は有機溶剤の質量との比率を調整し易くなる。
【００４２】
前記湿式粉砕工程により得られた水及び／又は有機溶剤を含む粉砕物は、酵素糖化用原料として、そのまま後述する糖の製造方法（酵素糖化工程）に供してもよいし、適宜その他の工程を経た後、後述する糖の製造方法に供してもよい。
【００４３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アンモニア処理されたバイオマスの量と水の量との比率を調整する工程、ｐＨを調整する工程、などが挙げられる。
前記アンモニア処理されたバイオマスの量と水の量との比率を調整する工程においては、前記粉砕物に水を添加して酵素糖化に適したバイオマスの量と水の量との比率とする方法などが挙げられる。
前記ｐＨを調整する工程は、前記湿式粉砕工程から得られた水を含む粉砕物を、後述する糖の製造方法の酵素糖化工程における酵素糖化に適切となるようなｐＨに調整する工程である。
以上のようにして本発明に係る酵素糖化用原料が得られる。
【００４４】
（糖の製造方法）
本発明の糖の製造方法は、前記本発明の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化する酵素糖化工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明の糖の製造方法について詳細に説明する。
【００４５】
＜酵素糖化工程＞
本実施形態の糖の製造方法に係る酵素糖化工程は、前記酵素糖化用原料と酵素とを接触させることにより、前記酵素糖化用原料中に含まれる、アンモニア処理され、湿式粉砕されたバイオマスを構成するセルロース、及びヘミセルロースを加水分解して単糖類を得る工程である。
【００４６】
前記酵素糖化工程に用いられる酵素糖化の方法としては、酵素を用いる限りにおいて特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。硫酸等を用いる化学的な糖化方法を用いた場合には、過分解により単糖の収率が低下する傾向にあること、糖化に続く工程である発酵工程において阻害作用をもつ物質が生成し易い傾向にあること、及び硫酸等の環境負荷物質の排出が生じるなどの問題があるのに対して、酵素を用いる糖化方法においては、温和な条件を選択することが可能であり、前記の問題を生じ難い傾向にある。
前記酵素糖化工程において使用する酵素としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルラーゼ、セロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）などが挙げられる。また、これら酵素を適当な担体又はマトリックスに固定化した固定化酵素を使用することもできる。
【００４７】
前記酵素糖化工程における酵素の使用量としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましく、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇがより好ましく、０．１ｍｇ〜１ｍｇが更に好ましい。前記酵素の使用量が、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ未満であると、酵素糖化が不十分となることがあり、１００ｍｇを超えると、糖化阻害が起こることがある。一方、前記酵素の使用量が前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４８】
前記酵素糖化工程における温度としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜７０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましく、３０℃〜５０℃が更に好ましい。前記温度が、１０℃より低い温度であると、酵素糖化が十分に進行しないことがあり、７０℃を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記温度が、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４９】
前記酵素糖化工程におけるｐＨとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、３．０〜８．０が好ましく、３．５〜７．０がより好ましく、４．０〜６．０が更に好ましい。前記ｐＨが、３．０未満、又は８．０を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００５０】
前記酵素糖化工程により、単糖としては、前記酵素糖化用原料に含まれるセルロースからはグルコースが得られる。また、前記酵素糖化用原料に含まれるヘミセルロースからはグルコース、ガラクトース、マンノースといった六炭糖及びキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成する。
【００５１】
上記の酵素糖化工程により得られる単糖を含む糖液は、そのまま後述する発酵工程に供してもよいが、例えば、糖液のｐＨを調整する工程、糖の濃度を調整する工程などを施すことにより、発酵により適した糖液としてもよい。
【００５２】
本実施形態の糖の製造方法により得られる糖は、後述するエタノールの製造方法、乳酸の製造方法に用いるだけでなく、その他の物質の製造の原料として用いることもできる。
【００５３】
（エタノールの製造方法）
本発明のエタノールの製造方法は、前記本発明の糖の製造方法により得られた糖を発酵する発酵工程（エタノール発酵工程）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明のエタノールの製造方法について詳細に説明する。
【００５４】
＜発酵工程＞
本実施形態のエタノールの製造方法に係る発酵工程は、前記糖液にエタノール発酵微生物を添加し、エタノール発酵を行う工程である。
【００５５】
前記エタノール発酵微生物としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、酵母、ザイモモナス・モビリス等のザイモモナス属の細菌等が好ましく、酵母がより好ましい。
【００５６】
前記酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、サッカロマイセス・セルビシエ等のサッカロマイセス属の酵母が好ましい。ただし前述のように、前記バイオマス原料を構成するヘミセルロースからは、酵素糖化によりキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成するが、サッカロマイセス属の天然酵母は五炭糖を資化してエタノールを生成する能力をもたない。このため、六炭糖だけでなくヘミセルロース由来の五炭糖も有効に利用してエタノールに変換するためには、五炭糖を資化してエタノールを生成する能力を有する酵母（ペントース資化酵母）を使用することも好ましく行われる。前記ペントース資化酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ピキア・スティピティス、カンジダ・シハタエ等が好ましい。六炭糖及び五炭糖を効率的にエタノールに変換するためには、サッカロマイセス属の酵母と、前述のペントース資化酵母とを組み合わせて使用する方法も好ましく採用される。この場合、サッカロマイセス属の酵母と前述のペントース資化酵母を共存させて発酵を行なってもよいし、まずサッカロマイセス属の酵母により糖液中のグルコースを資化させ、その後前述のペントース資化酵母により五炭糖を資化させてもよい。
【００５７】
前記発酵工程に用いる酵母は、天然の酵母であってもよいし、遺伝子組換え酵母であってもよい。特に、六炭糖と五炭糖の両方の資化能を有する遺伝子組換え酵母を用いることにより、効率的にセルロース及びヘミセルロース由来の六炭糖及び五炭糖の両方をエタノールに変換することができる。
【００５８】
前記発酵工程における前記酵母の使用量、糖以外の添加物、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等の条件としては特に制限はなく、公知の条件を適宜選択して用いることができるが、ｐＨは４〜７、発酵温度は２０℃〜３７℃程度が好ましい。
【００５９】
また、耐熱性の酵母を用いて、通常よりも高い温度で発酵を行なうことで、冷却のための設備を必要とせず、また雑菌の繁殖を抑制して効率的に発酵を行なうこともできる。前記耐熱性の酵母としては例えば、クロイベロマイセス・マルキシアナス等のクロイベロマイセス属に属する耐熱性酵母が挙げられる。これらの耐熱性酵母を使用する場合は、発酵の温度は３７℃以上５０℃以下程度とすることができる。
【００６０】
前記酵素糖化工程と発酵工程とを同時に行う、所謂並行複発酵法を採用してもよい。この並行複発酵法を採用することにより、前記酵素糖化工程と発酵工程とを単一の工程として実施することができ、簡略化された工程によってエタノールを製造することが可能となる。
前記並行複発酵としては、前記本実施形態の酵素糖化用原料の製造方法によって得られた酵素糖化用原料に、酵素糖化のための酵素、及び、酵素糖化により生成する糖をそのまま反応系内でエタノール発酵させるための微生物を添加し、酵素糖化及びエタノール発酵を行う。
【００６１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製工程を含むことが好ましい。
【００６２】
−精製工程−
前記精製工程は、前記発酵工程において得られたエタノールを含む培地からエタノールを分離・精製する工程である。前記精製工程により、エタノールは発酵培地中に含まれる種々の物質から分離・精製され、また濃縮される。
前記分離・精製の方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、まず発酵培地を、菌体等の固形分を遠心分離及び／又はろ過などにより固液分離し、エタノールを含む水溶液を回収し、その後、該水溶液を蒸留、膜分離などの方法によりエタノールを濃縮、精製する方法が好ましい。
【００６３】
本実施形態のエタノールの製造方法によれば、前記酵素糖化用原料を用いて得られた糖を用いることで、効率的にエタノールを製造することができる。前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。
【００６４】
（乳酸の製造方法）
前記本発明の糖の製造方法により得られた糖を用いて、乳酸を製造することができる。この場合の乳酸の製造方法においては、前記糖を乳酸発酵する発酵工程（乳酸発酵工程）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６５】
＜乳酸発酵工程＞
前記乳酸発酵工程は、前記糖液に乳酸菌等を添加し、乳酸発酵を行う工程である。
前記乳酸菌としては特に制限はなく、公知の乳酸菌を適宜選択して用いることができ、例えば、ラクトバチルス・マニホティヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などが挙げられる。なお、前記乳酸菌は、天然の乳酸菌であってもよいし、遺伝子組換え乳酸菌であってもよい。
前記発酵工程における前記乳酸菌の使用量、糖以外の添加物、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等の条件としては特に制限はなく、公知の条件を適宜選択して用いることができる。
【００６６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳酸の精製工程を含むことが好ましい。
【００６７】
本発明の乳酸の製造方法によれば、前記酵素糖化用原料を用いて得られた糖を用いることで、効率的に乳酸を製造することができる。このようにして得られた乳酸は、例えばポリ乳酸等の生分解性高分子の原料として利用することができる。
【００６８】
また、本発明の糖の製造方法により得られる糖を、前記乳酸菌に代えて、それぞれ目的とする有機酸を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、乳酸以外の有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸等を製造することもできる。
【００６９】
以上、本発明の酵素糖化用原料の製造方法、並びに前記酵素糖化用原料の製造方法により製造された酵素糖化用原料を用いた糖の製造方法、及び、前記糖の製造方法により製造された糖を用いたエタノールの製造方法、乳酸の製造方法について、好ましい実施形態に沿って説明したが、本発明はその趣旨を逸脱しない範囲において、上記実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７１】
（製造例）
＜バイオマス原料＞
リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含むバイオマス原料として、エリアンサスを用いた。
【００７２】
＜粗粉砕＞
収穫したエリアンサスを目開き４ｍｍのスクリーンで粒度を制御しながらカッターミルを用いて粉砕し、バイオマス原料の粗粉砕品を得た。前記バイオマス原料の粗粉砕品の粒径はレーザー回折法（装置：レーザー回折粒子径測定装置ＬＭＳ−２０００ｅ（セイシン企業社製））で測定したメジアン径（ｄ５０）として９７５μｍであった。
【００７３】
＜乾燥＞
前記バイオマス原料の粗粉砕品の含水率は２９質量％であり、これをバイオマス１とし、後述する実施例１及び比較例１で使用した。
前記バイオマスの粗粉砕品を４０℃、５ｋＰａ（絶対圧）の減圧下に一昼夜乾燥し、バイオマスの含水率（水分を含むバイオマスの質量を基準とした水分質量の比率）を０．５質量％とし、バイオマス２を得た。前記バイオマス２は後述する実施例３−１、実施例３−２、比較例３−１、比較例３−２、比較例４−１、比較例４−２、実施例５、及び比較例５で使用した。
前記バイオマス２を湿度を調節した容器内で吸湿させて、バイオマスの含水率を１５質量％に調整し、バイオマス３を得た。前記バイオマス３は、後述する実施例２及び比較例２で使用した。
また、前記バイオマス２をポリプロピレン樹脂製容器に所定量取り、該容器を回転させながら、ここへ、バイオマスの含水率が４０質量％となる量の水を滴下し、更に該容器を５時間回転させて、バイオマスの含水率が４０質量％であり、均一に水が吸収されたバイオマス４を得た。前記バイオマス４は、後述する比較例６−１及び比較例６−２で使用した。
【００７４】
（実施例１、比較例１：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
内容積約５Ｌの、撹拌装置を備えたステンレス鋼製オートクレーブに前記バイオマス１を２００ｇ充填し、窒素ガスによる加圧、脱圧を数回繰り返して、オートクレーブ内の空気を除去した後、減圧により窒素ガスを除去した。そして、オートクレーブ内をアンモニア処理温度（８０℃）近くまで昇温した。別途、ステンレス鋼製オートクレーブを用いて、処理温度（８０℃）より高い温度（１００℃）まで乾燥したアンモニアを予め昇温した。前記２つのオートクレーブを導通し、バイオマスが充填されたオートクレーブに、アンモニアを８０℃において処理圧力３．９ＭＰａＧで導入し、その後前記条件にて撹拌下に０．５時間（処理時間）アンモニア処理を行った。その後、脱圧し、更にオートクレーブに窒素ガスを流通させ、バイオマス内に残留したアンモニアを除去し、アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）を得た。
【００７５】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス１のエステル結合残存率を以下のように測定した。
フーリエ変換赤外分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ社製ＮＩＣＯＬＥＴ３８０を用い、吸光波数４００ｃｍ−１〜４０００ｃｍ−１の範囲を反射法で、アンモニア処理されたバイオマス１の赤外分光分析を行った。同様にして、アンモニア処理前のバイオマス１の赤外分光分析を行った。アンモニア処理前のバイオマス１についての、吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、アンモニア処理前後で変化しない吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のリグニンのベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値に対して、アンモニア処理されたバイオマス１の前記値の百分率を求め、得られた値をエステル結合残存率（％）（下記式（２））とした。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
その結果、エステル結合残存率は８５％であった。
【００７６】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物１の調製−
実施例１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１の乾燥質量１５部に対して８５部の水（既にバイオマスが含有している水を含む、即ち、含水分を除いた質量分の水を加えて８５部となるように調整。）を加えて均一に混合し、マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス１と水との混合物（固形分率１５質量％）である被粉砕物１を得た。
【００７７】
−ディスクミル粉砕−
実施例１においては、ディスクミル型粉砕機グローエンジニアリング社製ＲＤ１−１５を用い、前記被粉砕物１の湿式粉砕を行った。前記粉砕機の上下に炭化ケイ素製砥石を装着し、前記砥石間の間隙を１５０μｍとした。片側の砥石を９００ｒｐｍの速度で回転させ、中心部に前記被粉砕物１（マッド状のバイオマスと水の混合物）を投入して、粉砕による発熱を除去するための冷却水を流通させて、室温（２５℃〜３０℃）にて粉砕し、酵素糖化用原料１（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００７８】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１、固形物）、及び前記酵素糖化用原料１（実施例１、マッド状の水を含む混合物）のそれぞれを用い、以下の操作により、酵素糖化反応を行った。
内容積１．５ｍＬのマイクロチューブに、乾燥固形分として１０ｍｇとなるように精秤した試料を取り、試料濃度１％（乾燥質量／体積）、酵素としてＣｅｌｌｕｃｌａｓｔ＠１．５Ｌ及びＮｏｖｏｚｙｍｅ＠１８８（共に商品名、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を各酵素濃度０．０１％（質量／体積）、計０．０２％（質量／体積）の酵素濃度、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）となるように酵素糖化反応液を調製した。これを３７℃の恒温室にて、回転振とう機（１５回転／分）を用いて２４時間転倒振とうして酵素糖化反応を行った。反応後、遠心分離によって得られた上澄み液中のグルコース濃度を、グルコースＣＩＩテストワコー（商品名、和光純薬社製）を用いて測定し、酵素糖化率の尺度としてグルコース収率を算出した。その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）のグルコース収率は３１％であり、前記酵素糖化用原料１（実施例１）のグルコース収率は６２％であった。
なお、グルコース収率は下記式（４）で定義される。
グルコース収率（％）＝［酵素糖化反応液中のグルコース量／（酵素糖化原料の乾燥質量×全グルコース化率／１００）］×１００ ・・・（４）
全グルコース化率（％）：（バイオマス原料を別途化学的に完全に加水分解したときに得られるグルコースの量／バイオマス原料の乾燥質量）×１００（バイオマス原料基準のグルコースの理論収率に相当）
【００７９】
（実施例２、比較例２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
バイオマス原料として使用した前記バイオマス１を前記バイオマス３に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）を得た。
【００８０】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス３のエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【００８１】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物３の調製−
実施例２においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス３に代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（固体濃度１５質量％）である被粉砕物３を得た。
【００８２】
−ディスクミル粉砕−
実施例２においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物３に代えた以外は、前記実施例１と同様にしてディスクミルによる湿式粉砕を行い、酵素糖化用原料３（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８３】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）及び前記酵素糖化用原料３（実施例２）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、それぞれ酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）のグルコース収率は５１％であり、前記酵素糖化用原料３（実施例２）のグルコース収率は６８％であった。
【００８４】
（実施例３−１、３−２、比較例３−１、３−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
バイオマス原料として使用した前記バイオマス１を前記バイオマス２に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）を得た。
【００８５】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【００８６】
＜湿式粉砕工程Ａ＞
−被粉砕物２Ａの調製−
実施例３−１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス２Ａと水との混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ａを得た。
【００８７】
−ディスクミル粉砕−
実施例３−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ａに代えた以外は、前記実施例１と同様にしてディスクミルによる湿式粉砕を行い、酵素糖化用原料２Ａ−１（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８８】
＜湿式粉砕工程Ｂ＞
−ボールミル粉砕−
実施例３−２においては、ボールミル型粉砕機レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ３００）を用い、前記被粉砕物２Ａの湿式粉砕を行った。前記被粉砕物２Ａ（マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス２と水の混合物）２．２ｇを粉砕ジャー（５０ｍＬ容器）に投入して密閉後、振とう速度２０回／秒で５分間、粉砕による発熱を除去するための冷却水を流通させて、室温（２５℃〜３０℃）にて粉砕し、酵素糖化用原料２Ａ−２（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８９】
＜乾式粉砕工程＞
比較例３−２においては、前記被粉砕物１の湿式粉砕に代えて、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａの乾式粉砕を行った以外は、実施例１と同様に粉砕を行った。すなわち、実施例１と同一の粉砕機を用いて、同様の運転条件で、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａに水を添加することなく粉砕した。これにより酵素糖化用原料２Ａ−３（固形物）を得た。
【００９０】
−Ｘ線回折分析−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａを湿式粉砕して得られた前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）に含まれるバイオマス、及び前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａを乾式粉砕して得られた前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）のそれぞれについて、以下の操作により、Ｘ線回折分析を行った。
前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）の少量を乾燥して水分を除去し、これに含まれるバイオマスの固形分試料を得た。この試料、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−３のそれぞれの試料１００ｍｇを、２０ＭＰａＧの圧力にて加圧成型してＸ線回折分析に供した。Ｘ線回折分析は管球型Ｘ線発生装置ＲＩＮＴ２２００（商品名、リガク社製）を用い、ディフラクトメトリー法によって行った。電圧３８ｋＶ、電流５０ｍＡ、モノクロメーターで単色化したＣｕＫα線（波長０．１５４１８ｎｍ）を用い、操作範囲２θ＝５〜３０°、ステップ幅０．１°、積算時間２０秒の条件にてステップスキャン法で測定した。前記３種の試料のＸ線回折パターンを図１に示す。
【００９１】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）に、前記酵素糖化用原料１（実施例１）を前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−２（実施例３−２）に、それぞれ代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、それぞれ酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）のグルコース収率は５０％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）は７０％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−２（実施例３−２）のグルコース収率は７１％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）のグルコース収率は５２％であった。
【００９２】
（比較例４−１、４−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
アンモニア処理時間を０．５時間から０．１７時間に変えた以外は、実施例３−１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）を得た。
【００９３】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は９５％だった。
【００９４】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物２Ｂの調製−
比較例４−１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ｂを得た。
【００９５】
−ディスクミル粉砕−
比較例４−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ｂに代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料２Ｂ（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００９６】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）及び前記酵素糖化用原料２Ｂ（比較例４−１）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）のグルコース収率は１５％であり、前記酵素糖化用原料２Ｂ（比較例４−１）のグルコース収率は１９％であった。
【００９７】
（実施例５、比較例５：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
処理温度を８０℃から１５０℃に、処理圧力を３．９ＭＰａＧから１．０ＭＰａＧに、及び処理時間を０．５時間から２．５時間に変えた以外は、前記実施例３−１及び比較例３−１と同様にして、アンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）を得た。
【００９８】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は９０％だった。
【００９９】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物２Ｃの調製−
実施例５においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ｃを得た。
【０１００】
−ディスクミル粉砕−
実施例５においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ｃに代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料２Ｃ（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【０１０１】
＜酵素糖化工程＞
前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）及び前記酵素糖化用原料２Ｃ（実施例５）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）のグルコース収率は２９％であり、前記酵素糖化用原料２Ｃ（実施例５）は６２％であった。
【０１０２】
（比較例６−１、比較例６−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
前記バイオマス１を前記バイオマス４に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にして、アンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−１）を得た。
【０１０３】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス４のエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【０１０４】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物４の調製−
前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス４に代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物４を得た。
【０１０５】
−ディスクミル粉砕−
比較例６−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物４に代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料４（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【０１０６】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）を、前記アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−２）、及び前記酵素糖化用原料４（比較例６−１）のそれぞれに代えた以外は、前記比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−２）のグルコース収率は１９％であり、前記酵素糖化用原料４のグルコース収率は４１％であった。
【０１０７】
前記実施例、及び比較例の構成及び結果を下記表１に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
表１の結果から、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を、水分の含有量が前記式（１）を満たす条件下に、前記式（２）により求められるエステル結合残存率が９０％以下となるようにアンモニア処理を行い、更にアンモニア処理されたバイオマスを湿式粉砕する実施例においては、前記構成の少なくとも一部を満たさない比較例と比べて、グルコース収率、すなわち酵素糖化率が格段に向上することがわかった。
また、図１に示すＸ線回折パターンの結果から、所定の要件を満たしてアンモニア処理されたバイオマスにおいて、生成したセルロースＩＩＩ型結晶は、湿式粉砕することにより、その一部がセルロースＩ型結晶へと戻っていることがわかる。一方、同一のアンモニア処理されたバイオマスを乾式粉砕した場合には、Ｘ線回折パターンは粉砕前と大きな変化はなく、セルロースＩＩＩ型結晶のセルロースＩ型結晶への転移は見られない。表１が示すように、より酵素糖化を受けやすいセルロースＩＩＩ型結晶を多く有する乾式粉砕を受けたバイオマス（比較例３−２）よりも、湿式粉砕を受け、セルロースＩＩＩ型結晶が減少したバイオマス（実施例３−１）の方が高いグルコース収率を与えた。これは、酵素糖化率の向上に対して、セルロースＩＩＩ型結晶と同Ｉ型結晶間の転移よりも大きな影響を与えるセルロースの構造変化（非晶化と推定）が、アンモニア処理されたバイオマスの湿式粉砕によってより進行することに起因するものと推定される。この変化による酵素糖化率の向上効果は、アンモニア処理における含水率及びアンモニア処理されたバイオマス中のエステル残存率が所定の条件を満たす場合に、顕著に発現される。
【０１１０】
（実施例６、エタノールの製造）
＜酵素糖化工程＞
実施例３−１で得た酵素糖化用原料２Ａ−１について、実施例３−１で実施したマイクロチューブ内での酵素糖化を、内容積１００ｍＬの三角フラスコに規模を拡大して実施した。
＜エタノール発酵工程＞
得られた酵素糖化後の懸濁液は、遠心分離及びろ過により固液分離し、得られた溶液をロータリーエバポレーターによりグルコース濃度が１０％になるように濃縮して糖化液を得た。内容積１００ｍＬの三角フラスコ中にて前記糖化液にサッカロマイセス・セルビシエを植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振盪しながら発酵した。２４時間後にエタノール濃度４．３ｗｔ％の発酵液を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の酵素糖化用原料の製造方法によれば、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる、有用な酵素糖化用原料を効率的に得ることができる。
また、本発明の糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法によれば、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を格段に向上させることができる。
したがって、本発明の酵素糖化用原料の製造方法、並びに本発明の糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法は、例えば、近年注目されている、環境に優しい燃料を産出することを目的としたバイオマス原料からのエタノール製造、また、環境に優しい生分解性プラスチックの製造等に、好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス原料を利用した、糖の製造に用いられる、酵素糖化用原料の製造方法、並びに該酵素糖化用原料の製造方法により製造された酵素糖化用原料を用いた糖の製造方法、及び該糖の製造方法により製造された糖を用いたエタノールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、地球温暖化対策の一環として、木質バイオマスや草本バイオマス等のセルロースを含む原料からエタノールを製造し、各種燃料や化学原料として利用しようとする試みが広く行われている。バイオマス原料からのエタノールの製造は、例えば、収集したバイオマス原料を、糖化工程において糖に分解した後、発酵工程において酵母等の微生物を用いてエタノールに変換することにより行うことができる。
【０００３】
一方、環境負荷低減の観点から、生分解性ポリマーの利用が増加しており、その原料のひとつとして乳酸が使用されている。この乳酸も、前記のバイオマス原料を糖化し、さらにこれを発酵することにより得ることができる。
【０００４】
前記糖化は、従来より、濃硫酸を用いて行われることが多かったが、環境負荷低減の観点から、硫酸の使用量を少なくすることが望まれている。そこで、近年は、濃硫酸による糖化に代わる手段として、酵素を用いたバイオマス原料の糖化が広く研究されている。酵素による糖化は、環境に対する影響の観点から望ましい手段であるが、この酵素糖化のためには、酵素を作用させ易くする目的から、予めバイオマス原料に対して前処理を施して、バイオマス原料を構成するリグノセルロース（リグニン、セルロース、ヘミセルロースからなる複合体）中のセルロースとリグニンとを分離することが必要となる。このバイオマス原料の前処理方法として様々な方法が知られているが、中でも、希硫酸、加圧熱水等による蒸煮処理などが一般的である（例えば、下記特許文献１〜４参照。）。しかしながら、前記したように硫酸の使用が好ましくないこと、及びバイオマス原料にこれらの前処理を行い、得られた処理物を酵素糖化に供する場合では、所望の程度の酵素糖化率を得るためには該前処理を多段で行う必要があったり、２００℃以上の高温にしなければならない等の問題がある。
また、前記蒸煮処理において生成する分解生成物は、酵素糖化後の発酵工程において、酵母等の微生物による発酵に対する阻害作用を及ぼすという問題もある。
そして、前記蒸煮処理では、バイオマス原料の粒子を流動化させるために水分量を多くする必要があり、そのために、酵素糖化後の糖液中における糖濃度が低くなり、その後の発酵工程における効率が低下するという問題もある。
【０００５】
また、バイオマス原料を物理的手段により微細に粉砕することにより、化学的、生物化学的反応性が向上することが知られているが、粉砕のみにより充分な酵素糖化率を得ようとすると、粉砕工程に多大なエネルギーを要し、経済合理性を失うおそれがある。
【０００６】
また、バイオマス原料を加圧熱水により蒸煮処理した後、水等の存在下に湿式で機械的粉砕を行うことにより、バイオマスの酵素糖化率が向上することが開示されている（例えば、下記特許文献５参照。）。この場合も、酵素糖化率の向上はあるものの、前記蒸煮処理における問題点、すなわち発酵に対する阻害物質の生成、酵素糖化工程により得られる糖液中の糖濃度が低いとの問題は依然として解消しない。
【０００７】
また、バイオマス原料をアンモニアを用いて前処理することにより、その化学的、生物化学的反応性が向上することが知られている（例えば、下記特許文献６、非特許文献１参照。）。中でも、バイオマス原料中のリグニンをセルロースから分離するだけでなく、アンモニア処理により、バイオマス原料中のセルロースＩ型結晶を、セルロースＩ型結晶の結晶密度よりも低い結晶密度を有するセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることによって、高い酵素糖化率を得ることができることが知られている（例えば、特許文献７参照）。
また、バイオマス原料を水とアンモニアが共存する条件下に前処理する場合におけるセルロースＩ型結晶からセルロースＩＩＩ型結晶への転移は、アンモニアに対する相対的な水の量が少ないほど進行することが知られている（例えば、非特許文献４参照）。
しかしながら、この提案の技術でも十分な酵素糖化率が得られていないのが現状であり、更なる改良が求められている。
【０００８】
一方、アンモニア処理により生成し、高い酵素糖化率が期待できるセルロースＩＩＩ型結晶の少なくとも一部は、水との接触により酵素糖化を受けにくいセルロースＩ型結晶に戻ることが知られている（例えば、非特許文献２、及び３参照）。
そのため、乾燥されて水分を含まない、あるいは水分含有量の低いバイオマス原料を、水分を含まない、あるいは水分含有量の低いアンモニアを用いて前処理を行うことにより、より効率的にセルロースＩ型結晶をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることができる。そして、アンモニア処理により生成したセルロースＩＩＩ型結晶を保持するとの観点からは、アンモニア処理されたバイオマスを、酵素糖化工程の前に多量の水と接触させることは、酵素糖化率の観点からは好ましくないと考えられていた。
【０００９】
また、バイオマス原料を、アンモニア水で処理した後に、更に湿式で粉砕することによって、バイオマス原料の酵素糖化率を向上できることが知られている（例えば、特許文献８参照）。通常、アンモニア水のアンモニア濃度は３５％程度が上限のため、前記アンモニア水による処理は多量の水が共存する状態で行われることとなる。そのため、アンモニア水による処理は、前記蒸煮処理に似た効果が得られることが知られている。
したがって、前記蒸煮処理の場合と同様に、分解生成物による発酵阻害の問題や、酵素糖化により得られる糖液の糖濃度が低くなる等の問題がある。
また、多量の水の共存下に処理を行うため、セルロースの結晶形態がＩＩＩ型には転移せず、十分な酵素糖化率が得られないという問題がある。
【００１０】
また、バイオマス原料を気相のアンモニアで処理した場合には、セルロースの結晶形態がＩＩＩ型には転移しないため、液相のアンモニアで処理した場合と比較して酵素糖化率が大幅に低いという問題がある。
したがって、より酵素糖化率を高めることのできる酵素糖化技術の開発、及び、前記酵素糖化に適したバイオマス原料の前処理技術の速やかな開発が、強く望まれているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００６−０７５００７号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０５５号公報
【特許文献３】特表２００２−５４１３５５号公報
【特許文献４】特開２００２−１５９９５４号公報
【特許文献５】特開２００６−１３６２６３号公報
【特許文献６】欧州特許公開第７７２８７号公報
【特許文献７】特開２００８−１６１１２５号公報
【特許文献８】特開２０１０−１１５１６２号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｅｎｄｉｃｈ Ｅ．， Ｌａｓｅｒ Ｍ．， Ｋｉｍ Ｓ．， Ａｌｉｚａｄｅｈ Ｈ．， Ｌａｕｒｅａｎｏ−Ｐｅｒｅｚ Ｌ．， Ｄａｌｅ Ｂ． ａｎｄ Ｌｙｎｄ Ｌ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｍｍｏｎｉａ ｆｉｂｅｒ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ （ＡＦＥＸ） ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｔｈａｎｏｌ ｓｅｌｌｉｎｇ ｐｒｉｃｅ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９９，８４２９−８４３５（２００８）
【非特許文献２】ＲＡＪＡＩ Ｈ． ＡＴＡＬＬＡ ＡＮＤ ＤＡＶＩＤ Ｌ． ＶＡＮＤＥＲＨＡＲＴ， ＩＰＣ ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ ＰＡＰＥＲ ＳＥＲＩＥＳ ＮＵＭＢＥＲ ３０６（１９８８）
【非特許文献３】杉山ら，木材学会誌，５４（２），ｐ．４９−５７（２００８）
【非特許文献４】Ｂｒｙａｎ Ｂａｌｓ， Ｃｈａｄ Ｒｏｇｅｒｓ， Ｍｉｎｇｊｉｅ Ｊｉｎ， Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ Ｂａｌａｎ， Ｂｒｕｃｅ Ｄａｌｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｆｕｅｌｓ， ３（１） ２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる有用な酵素糖化用原料の製造方法、並びに、糖の製造方法、及びエタノールの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記課題を解決するため本発明者らが鋭意検討を重ねた結果、高い酵素糖化率を得ることができるセルロースＩＩＩ型結晶に転移させたバイオマスを湿式で粉砕することは、通常、酵素糖化率向上には寄与せず、むしろ酵素糖化率が低下すると予想されるところ、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を水分量の少ない条件下でアンモニア処理して、前記バイオマス原料中のエステル結合を特定の割合で切断し、且つセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させて得られたバイオマスを、敢えて湿式で粉砕することにより、セルロースＩＩＩ型結晶の一部がセルロースＩ型結晶に戻るにもかかわらず、予想外にも格段に向上した酵素糖化率が得られることを知見した。また、従来、気相のアンモニアで処理したバイオマス原料はセルロースＩＩＩ型に転移しないため、実用に供することができる程度に酵素糖化率を向上させることが困難であったが、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を水分量の少ない条件下で気相のアンモニアで処理して、前記バイオマス原料中のエステル結合を特定の割合で切断して得られたバイオマスを、湿式で粉砕することにより、湿式の粉砕を行わなかった場合と比較して大幅に酵素糖化率が向上すること、また、気相のアンモニアで処理して得られたバイオマスの湿式の粉砕の有無による酵素糖化率の向上幅（湿式粉砕有りの酵素糖化用原料の酵素糖化率と、湿式粉砕無しの酵素糖化用原料の酵素糖化率との差）が、液相のアンモニアで処理して得られたバイオマスの湿式の粉砕の有無による酵素糖化率の向上幅よりも予想外に大きいことを知見した。
【００１５】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで処理し、前記バイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、を含み、前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とが下記式（１）の関係を満たし、
｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０ ・・・ （１）
かつ、
前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行うことを特徴とする酵素糖化用原料の製造方法である。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
＜２＞ 前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含む前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
＜３＞ 前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水を加える工程を含む前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
＜４＞ 前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）とが、下記式（３）の関係を満たす前記＜１＞に記載の酵素糖化用原料の製造方法である。
５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７ ・・・ （３）
＜５＞ 前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化して糖を得ることを特徴とする糖の製造方法である。
＜６＞ 前記＜５＞に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる有用な酵素糖化用原料の製造方法、並びに、糖の製造方法、及びエタノールの製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、アンモニア処理されたバイオマス、アンモニア処理されたバイオマスを湿式粉砕したバイオマス、及びアンモニア処理されたバイオマスを乾式粉砕したバイオマスのＸ線回折パターンを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（酵素糖化用原料の製造方法）
本発明の酵素糖化用原料の製造方法は、アンモニア処理工程と、湿式粉砕工程と、を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明の酵素糖化用原料の製造方法について説明する。
【００１９】
＜アンモニア処理工程＞
前記アンモニア処理工程は、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断する工程である。
前記アンモニア処理工程では、アンモニアによりヘミセルロースとリグニンとの間のエステル結合を切断する（即ち、当該エステル結合のアミド化開裂を行う）ことにより、後述する酵素糖化工程において、酵素によるセルロースの加水分解を効率的に行うことができる。
【００２０】
−リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料−
前記リグニン、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマス原料としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、農業や林業等の生産活動に伴う残渣として得られる「廃棄物バイオマス」や、エネルギー等を得る目的で意図的に栽培して得られる「資源作物バイオマス」などを使用することができる。前記「廃棄物バイオマス」としては、例えば、廃建材、間伐材、稲わら、麦わら、もみ殻、バガスなどが挙げられ、また、前記「資源作物バイオマス」としては、例えば、セルロース類の利用を目的として栽培されるシラカバ、ユーカリ、ポプラ、アカシア、ヤナギ、スギ、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、ミスカンサス、ススキ、リードカナリーグラスなどが挙げられる。また、前記バイオマスは、木に由来する「木質バイオマス」、草に由来する「草本バイオマス」などにも分類される。本発明においては、木質バイオマス及び草本バイオマス共に使用することができる。前記リグニン、セルロース及びヘミセルロースを含むバイオマス原料は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
上記バイオマス原料に含まれるセルロースは、基本的にセルロースＩ型結晶から構成される。
【００２１】
前記バイオマス原料のアンモニア処理において、前記バイオマス原料としては、収集されたものをそのまま使用してもよいが、裁断、粉砕等によりある程度以下の大きさの粒子としてから使用することが、取り扱いの容易さ及びアンモニア処理の効率の観点から望ましい。前記バイオマス原料の粒子の大きさとしては特に制限はなく、粒子としての取り扱いやすさなどに応じて適宜選択することができるが、例えば、通過するメッシュの目開きとして、５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以下がより好ましい。前記メッシュの目開きの大きさが５ｍｍを超えると、後述するアンモニア処理の効率が低下することがある。一方、単位操作としての粉砕はエネルギー効率が極めて低いため、例えば、粉砕に供するエネルギー投入量は乾燥バイオマス１ｋｇ当たり１ＭＪ以下が好ましい。なお、以下、前記の収集したバイオマス原料を裁断、粉砕する工程を「粗粉砕」ということがある。
【００２２】
前記粗粉砕を予め行うことにより、後述するアンモニア処理を効率的に進行させることができる。前記粗粉砕に用いる粉砕機としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ウィレーミル、カッターミル、ハンマーミル、ピンミル等を用いることができる。
【００２３】
前記バイオマス原料は、アンモニア処理を行う前に乾燥を行うことが好ましいが、この乾燥による水分量の調整についての詳細は後述する。
【００２４】
−アンモニア処理−
前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を、アンモニア処理する場合、その方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料と、アンモニアとを、通常は圧力容器内に導入し、前記圧力容器内を所望の圧力及び温度に設定して、所望の時間処理することにより行うことができる。
前記圧力としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０ＭＰａ〜１２．５ＭＰａ（ゲージ圧）とすることができる。
前記温度としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、−３５℃〜１８０℃とすることができる。
【００２５】
前記アンモニアは液相であっても、気相であっても、また超臨界状態であってもよい。
前記アンモニアは、糖化率の観点からは、液相、又は超臨界状態のアンモニアが好ましく、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアを除去して回収する際に要するエネルギー、湿式粉砕の有無による糖化率の向上幅（湿式粉砕有りの酵素糖化用原料の酵素糖化率と、湿式粉砕無しの酵素糖化用原料の酵素糖化率との差）の観点からは、気相のアンモニアが好ましい。前記気相のアンモニアを用いた場合の湿式粉砕の有無による向上幅が著しく優れていることは、後述する実施例５、比較例５参照からもわかる。
【００２６】
前記アンモニア処理の時間としては特に制限はなく、用いる前記バイオマス原料の量や、前記した処理圧力、処理温度等に応じ、所望の程度のエステル結合の切断が進行する範囲内で適宜選択することができるが、１０分〜１０時間が好ましく、３０分〜８時間が更に好ましく、３０分〜５時間が特に好ましい。前記処理時間が、１０分未満であると、所望の程度のエステル結合の切断が進行しないことがあり、１０時間を超えると、それ以上エステル結合の切断が進行せず、全体として非効率となることがある。一方、前記処理時間が、前記更に好ましい範囲内であると、効率よく、エステル結合の切断を進行させることができ、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上する点で有利である。
【００２７】
前記アンモニア処理工程を実施する装置としては特に限定されず、回分式装置、半連続式装置、連続式装置などが適宜選択され、処理を行う効率を高めるとの観点から、半連続式装置又は連続式装置を採用することが好ましい。
【００２８】
前記アンモニア処理時の、アンモニアの使用量としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料１ｇに対して、１０ｍｇ〜３００ｇが好ましく、１００ｍｇ〜１５０ｇがより好ましく、１ｇ〜５０ｇが特に好ましい。前記アンモニアの使用量が、前記リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料１ｇに対して、１０ｍｇ未満であると、処理が不十分となることがあり、３００ｇを超えると、処理の効率が悪くなることがある。一方、その使用量が、前記特に好ましい範囲内であると、処理時間が短縮できる、使用する処理剤の量を少なくできる等の点で、有利である。
【００２９】
なお、アンモニア処理時には、前記バイオマス原料のエステル結合の少なくとも一部を切断することができれば、更にその他の化合物を組み合わせて使用してもよく、前記その他の化合物としては、例えば、二酸化炭素、窒素、エチレン、メタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、フェノール、ジオキサン、キシレン、アセトン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。また、エチレンジアン、モノメチルアミン、モノエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等のアミン類を組み合わせて使用してもよい。
【００３０】
−バイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）−
前記アンモニア処理工程においては、前記バイオマス原料とアンモニアの他に、水（水分）が共存することがある。この水は前記バイオマス原料が包含している水、あるいは使用するアンモニアに含有される水などである。そして、得られる酵素糖化用原料の糖化率の向上の観点から、アンモニア処理工程に共存する水の量については、前記バイオマス原料の量との関係においてコントロールされることが好ましい。
アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とは、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０（式（１））の関係を満たすことが好ましい。また、｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００（以下、「水分含有率」という場合もある。）は１５以下であることがより好ましい。なお、ここで「水」とはアンモニア処理工程において処理を行う系内に存在する全ての水を意味し、該系内においてバイオマス中に包含されている水も含むものとする。
前記水分含有率が３０より大きい場合、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いた処理の際に、前記バイオマス原料に含まれるセルロースを構成するセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることが困難となり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が十分に向上しないことがある。また、アンモニア処理されたバイオマスからアンモニアを分離・回収して再使用するに際して、効率的に前記分離・回収及び再使用を行うことが困難となる場合がある。すなわち、アンモニアは水に対する溶解度が高く、使用する前記バイオマス原料が多くの水を包含する場合には、アンモニア処理されたバイオマス中にも多くの水が包含されることが多く、この水にアンモニアが溶解するため、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアを除去して回収するためには、加熱等の大きなエネルギーを要する工程が必要となる。また、回収されたアンモニア中の水分の含有量が大きくなり、回収されたアンモニアから水分を除去する工程（例えば蒸留等）が必要となり、大きなエネルギーが必要となる。
一方、前記水分含有率が３０以下であると、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いた処理の際に、前記バイオマス原料に含まれるセルロースを構成するセルロースＩ型結晶の少なくとも一部をセルロースＩＩＩ型結晶に転移させることができ、更に前記水分含有率が１５以下であると、更に容易に前記結晶の転移が進行し、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が更に向上するとの点で有利である。また、アンモニア処理後に、更に効率的にアンモニアを分離・回収して再使用することが可能との点でも有利である。
前記アンモニア処理において、液相のアンモニア、又は超臨界状態のアンモニアを用いて処理されたバイオマスは、少なくともセルロースＩＩＩ型結晶を有していることが好ましい。
【００３１】
前記式（１）を満たすためには、前記バイオマス原料を予め乾燥して、バイオマス原料が包含する水分由来の水の量が前記式（１）を満たすように調整しておくことが好ましい。
前記バイオマスの乾燥方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、大気下に高温で乾燥すると、バイオマスの組織が破壊されたり酸化されたりするため、例えば、天日乾燥、自然乾燥、１００℃以下での通風による乾燥、減圧乾燥、ジメチルエーテルを用いた乾燥などが好ましい。
なお、前述した、アンモニア処理後のアンモニアの分離・回収及び再使用を効率的に行うとの観点からは、前記バイオマス原料を予め十分に乾燥して、その水分含有量を極力低減することが好ましい。一方、バイオマス原料中に残存する水分の含有量を低減するに伴い、乾燥に要するエネルギーは増大する。したがって、乾燥後のバイオマス原料中の水分含有量の設定は、前記アンモニア処理工程における水分含有率が前記式（１）を満たす範囲において、バイオマス原料の乾燥に使用する設備、消費エネルギー、アンモニア処理後に分離・回収されて再使用されるにアンモニアの水分含有量の設定等の因子を勘案して決定することが好ましい。
【００３２】
−エステル結合残存率−
前記エステル結合残存率は、下記式（２）により求められる。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
なお、前記吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積は、前記のアンモニア処理工程の前後で変化しない。
また、エステル結合のアミド化開裂の進行は、フーリエ変換赤外分光分析における１６６２ｃｍ−１付近のアミド結合のＣ＝Ｏ（リグニン共役カルボニル）伸縮振動に帰属される吸収ピークの増大によっても確認することができる。
なお、前記エステル結合は、前記バイオマス原料中のヘミセルロースとリグニンとの間の結合であり、ヘミセルロースはセルロースと水素結合による強い相互作用を有している。したがって、リグニンはヘミセルロースを介してセルロースと強い相互作用を有し、これがリグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含むバイオマス原料が容易に酵素糖化を受けない理由である。アンモニア処理により前記エステル結合が切断されると、リグニンはヘミセルロースから分離され、その結果、セルロースとの相互作用も弱まることとなり、酵素糖化が促進される大きな要因となる。
【００３３】
前記エステル結合残存率としては、９０％以下であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記エステル結合の残存率が９０％を超えると、セルロースとリグニンとを分離するとのアンモニア処理の効果が不十分となり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が十分に向上しないことがある。
一方、前記エステル結合残存率が前記範囲内であると、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上する。
なお、前述の作用機構から、一般的に、前記エステル結合の切断の進行（前記エステル結合残存率の低下）に伴い、セルロースの酵素糖化率は向上することとなる。
【００３４】
前記アンモニア処理工程においてアンモニア処理されたバイオマスは、アンモニア処理を行うための装置（通常は高圧容器）から排出される。前記排出と同時あるいは前記排出の前に、通常は加圧されていたアンモニアが大気圧に脱圧される。前記脱圧により、アンモニア処理されたバイオマスとアンモニアとが固気分離される。
【００３５】
前記アンモニアから分離されたアンモニア処理されたバイオマスの内部には、一部のアンモニアが残留しているので、この残留アンモニアを除去する工程を設けることが好ましい。残留アンモニアの除去を行う方法の例としては、アンモニア処理されたバイオマスを必要により加熱下に、窒素ガス等の不活性ガス気流に接触させる方法、スチーム流に接触させる方法、必要により加熱下に減圧とする方法などが挙げられる。
なお、前述のように、アンモニア処理されたバイオマス中に水が包含される場合には、この水にアンモニアが溶解することから、アンモニア処理されたバイオマス中に残留するアンモニアの含有量が増大する傾向にある。また、バイオマス中に包含される水に溶解したアンモニアを除去するためには、この水もバイオマスから除去する必要があることから、アンモニアの除去に要するエネルギーが増大する傾向にある。
【００３６】
前記アンモニア処理工程において使用され、アンモニア処理されたバイオマスと固気分離により分離されたアンモニアは、回収されてアンモニア処理工程にリサイクルされて再使用されることが好ましい。アンモニア処理工程において水が共存し、回収されたアンモニアが所定の含有量を超える水分を含有する場合には、当該回収されたアンモニアを再使用してアンモニア処理を行うと、前記式（１）に規定されるアンモニア処理工程におけるバイオマス原料の乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）との関係を満足すことができないことがある。そのような場合には、回収されたアンモニアから水を除去する工程を設けることが好ましい。回収されたアンモニアから水を除去する方法の例としては、回収されたアンモニアを圧縮及び／又は冷却して液化し、蒸留を行う方法などが挙げられる。
【００３７】
＜湿式粉砕工程＞
前記湿式粉砕工程は、前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する工程である。ここで、「湿式」とは水及び／又は有機溶剤の共存下であることを意味する。
【００３８】
前記湿式粉砕工程では、水及び／又は有機溶剤の共存下に、前記アンモニア処理されたバイオマスを粉砕する。
前記有機溶剤としては、例えば、脂肪族、脂環族又は芳香族の１価、２価、又は多価アルコールのような各種アルコール、より具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ヘキサノール、オクタノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオールなどのアルコール類又はそのアルキルエーテルなどの誘導体が挙げられる。
前記湿式粉砕工程において有機溶剤を使用する場合は、酵素糖化における阻害防止、発酵における阻害防止等の観点から、湿式粉砕後に、前記湿式粉砕工程から得られる、粉砕されたバイオマス及び前記有機溶剤又は前記有機溶剤を含む水を含む粉砕物から、前記有機溶剤あるいは場合によりその反応物を除去することが好ましい。前記有機溶剤の除去を実施することは、装置コスト及びエネルギーコストの上昇を招くことから、有機溶剤は使用せず、水を用いて湿式粉砕することが好ましい。
【００３９】
−アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量と水及び／又は有機溶剤の質量−
前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）との関係としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７（式（３））が好ましく、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦３０がより好ましく、５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦１５が特に好ましい。
前記｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００（以下、「固形分率」という場合もある。）が６７を超えると、水及び／又は有機溶剤の質量が相対的に少なくなり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率が向上しないことがある。一方、前記固形分率が５未満であると、水及び／又は有機溶剤の質量が相対的に多くなり、得られる酵素糖化用原料の酵素糖化率は向上するものの、該酵素糖化用原料を糖化処理して得られる糖液中の糖濃度が低くなり、その後の発酵工程における効率が低下することがある。一方、前記固形分率が前記好ましい範囲内であると、酵素糖化率の向上、及び発酵工程における効率などの点で有利である。
なお、前記固形分率が１５未満である場合には、前記湿式粉砕工程から、必要により有機溶媒を除去する工程を経て得られる水を含む粉砕物を酵素糖化用原料として、そのままスラリーとして酵素糖化工程に供することが可能である。すなわち、前記水を含む粉砕物はスラリーとして流動性を有しており、均一に酵素糖化を行うことができる。
【００４０】
前記湿式粉砕工程の湿式粉砕に用いる粉砕機としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ボールミル、ビーズミル、振動ミル、ジェットミル、ディスクミル等が挙げられる。
【００４１】
−アンモニア処理されたバイオマスに水及び／又は有機溶剤を加える工程−
本実施形態では、前記アンモニア処理工程と、前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含むことが好ましい。
前記アンモニア処理されたバイオマスに水及び／又は有機溶剤を加える工程により、前記湿式粉砕工程において必要なアンモニア処理されたバイオマスと水及び／又は有機溶剤とを含む混合物が提供される。また、当該工程により、アンモニア処理されたバイオマスの質量と水及び／又は有機溶剤の質量との比率を調整し易くなる。
【００４２】
前記湿式粉砕工程により得られた水及び／又は有機溶剤を含む粉砕物は、酵素糖化用原料として、そのまま後述する糖の製造方法（酵素糖化工程）に供してもよいし、適宜その他の工程を経た後、後述する糖の製造方法に供してもよい。
【００４３】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アンモニア処理されたバイオマスの量と水の量との比率を調整する工程、ｐＨを調整する工程、などが挙げられる。
前記アンモニア処理されたバイオマスの量と水の量との比率を調整する工程においては、前記粉砕物に水を添加して酵素糖化に適したバイオマスの量と水の量との比率とする方法などが挙げられる。
前記ｐＨを調整する工程は、前記湿式粉砕工程から得られた水を含む粉砕物を、後述する糖の製造方法の酵素糖化工程における酵素糖化に適切となるようなｐＨに調整する工程である。
以上のようにして本発明に係る酵素糖化用原料が得られる。
【００４４】
（糖の製造方法）
本発明の糖の製造方法は、前記本発明の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化する酵素糖化工程を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明の糖の製造方法について詳細に説明する。
【００４５】
＜酵素糖化工程＞
本実施形態の糖の製造方法に係る酵素糖化工程は、前記酵素糖化用原料と酵素とを接触させることにより、前記酵素糖化用原料中に含まれる、アンモニア処理され、湿式粉砕されたバイオマスを構成するセルロース、及びヘミセルロースを加水分解して単糖類を得る工程である。
【００４６】
前記酵素糖化工程に用いられる酵素糖化の方法としては、酵素を用いる限りにおいて特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。硫酸等を用いる化学的な糖化方法を用いた場合には、過分解により単糖の収率が低下する傾向にあること、糖化に続く工程である発酵工程において阻害作用をもつ物質が生成し易い傾向にあること、及び硫酸等の環境負荷物質の排出が生じるなどの問題があるのに対して、酵素を用いる糖化方法においては、温和な条件を選択することが可能であり、前記の問題を生じ難い傾向にある。
前記酵素糖化工程において使用する酵素としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルラーゼ、セロビアーゼ（β−グルコシダーゼ）などが挙げられる。また、これら酵素を適当な担体又はマトリックスに固定化した固定化酵素を使用することもできる。
【００４７】
前記酵素糖化工程における酵素の使用量としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましく、０．０１ｍｇ〜１０ｍｇがより好ましく、０．１ｍｇ〜１ｍｇが更に好ましい。前記酵素の使用量が、前記酵素糖化用原料中の固形分乾燥質量１ｇに対して、０．００１ｍｇ未満であると、酵素糖化が不十分となることがあり、１００ｍｇを超えると、糖化阻害が起こることがある。一方、前記酵素の使用量が前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４８】
前記酵素糖化工程における温度としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０℃〜７０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましく、３０℃〜５０℃が更に好ましい。前記温度が、１０℃より低い温度であると、酵素糖化が十分に進行しないことがあり、７０℃を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記温度が、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００４９】
前記酵素糖化工程におけるｐＨとしては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、３．０〜８．０が好ましく、３．５〜７．０がより好ましく、４．０〜６．０が更に好ましい。前記ｐＨが、３．０未満、又は８．０を超えると、酵素が失活することがある。一方、前記ｐＨが、前記更に好ましい範囲内であると、酵素の使用量に対して得られる糖の量が多い点で有利である。
【００５０】
前記酵素糖化工程により、単糖としては、前記酵素糖化用原料に含まれるセルロースからはグルコースが得られる。また、前記酵素糖化用原料に含まれるヘミセルロースからはグルコース、ガラクトース、マンノースといった六炭糖及びキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成する。
【００５１】
上記の酵素糖化工程により得られる単糖を含む糖液は、そのまま後述する発酵工程に供してもよいが、例えば、糖液のｐＨを調整する工程、糖の濃度を調整する工程などを施すことにより、発酵により適した糖液としてもよい。
【００５２】
本実施形態の糖の製造方法により得られる糖は、後述するエタノールの製造方法、乳酸の製造方法に用いるだけでなく、その他の物質の製造の原料として用いることもできる。
【００５３】
（エタノールの製造方法）
本発明のエタノールの製造方法は、前記本発明の糖の製造方法により得られた糖を発酵する発酵工程（エタノール発酵工程）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
以下、好ましい実施形態に沿って、本発明のエタノールの製造方法について詳細に説明する。
【００５４】
＜発酵工程＞
本実施形態のエタノールの製造方法に係る発酵工程は、前記糖液にエタノール発酵微生物を添加し、エタノール発酵を行う工程である。
【００５５】
前記エタノール発酵微生物としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、酵母、ザイモモナス・モビリス等のザイモモナス属の細菌等が好ましく、酵母がより好ましい。
【００５６】
前記酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、サッカロマイセス・セルビシエ等のサッカロマイセス属の酵母が好ましい。ただし前述のように、前記バイオマス原料を構成するヘミセルロースからは、酵素糖化によりキシロース、アラビノースといった五炭糖が生成するが、サッカロマイセス属の天然酵母は五炭糖を資化してエタノールを生成する能力をもたない。このため、六炭糖だけでなくヘミセルロース由来の五炭糖も有効に利用してエタノールに変換するためには、五炭糖を資化してエタノールを生成する能力を有する酵母（ペントース資化酵母）を使用することも好ましく行われる。前記ペントース資化酵母としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ピキア・スティピティス、カンジダ・シハタエ等が好ましい。六炭糖及び五炭糖を効率的にエタノールに変換するためには、サッカロマイセス属の酵母と、前述のペントース資化酵母とを組み合わせて使用する方法も好ましく採用される。この場合、サッカロマイセス属の酵母と前述のペントース資化酵母を共存させて発酵を行なってもよいし、まずサッカロマイセス属の酵母により糖液中のグルコースを資化させ、その後前述のペントース資化酵母により五炭糖を資化させてもよい。
【００５７】
前記発酵工程に用いる酵母は、天然の酵母であってもよいし、遺伝子組換え酵母であってもよい。特に、六炭糖と五炭糖の両方の資化能を有する遺伝子組換え酵母を用いることにより、効率的にセルロース及びヘミセルロース由来の六炭糖及び五炭糖の両方をエタノールに変換することができる。
【００５８】
前記発酵工程における前記酵母の使用量、糖以外の添加物、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等の条件としては特に制限はなく、公知の条件を適宜選択して用いることができるが、ｐＨは４〜７、発酵温度は２０℃〜３７℃程度が好ましい。
【００５９】
また、耐熱性の酵母を用いて、通常よりも高い温度で発酵を行なうことで、冷却のための設備を必要とせず、また雑菌の繁殖を抑制して効率的に発酵を行なうこともできる。前記耐熱性の酵母としては例えば、クロイベロマイセス・マルキシアナス等のクロイベロマイセス属に属する耐熱性酵母が挙げられる。これらの耐熱性酵母を使用する場合は、発酵の温度は３７℃以上５０℃以下程度とすることができる。
【００６０】
前記酵素糖化工程と発酵工程とを同時に行う、所謂並行複発酵法を採用してもよい。この並行複発酵法を採用することにより、前記酵素糖化工程と発酵工程とを単一の工程として実施することができ、簡略化された工程によってエタノールを製造することが可能となる。
前記並行複発酵としては、前記本実施形態の酵素糖化用原料の製造方法によって得られた酵素糖化用原料に、酵素糖化のための酵素、及び、酵素糖化により生成する糖をそのまま反応系内でエタノール発酵させるための微生物を添加し、酵素糖化及びエタノール発酵を行う。
【００６１】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、精製工程を含むことが好ましい。
【００６２】
−精製工程−
前記精製工程は、前記発酵工程において得られたエタノールを含む培地からエタノールを分離・精製する工程である。前記精製工程により、エタノールは発酵培地中に含まれる種々の物質から分離・精製され、また濃縮される。
前記分離・精製の方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、まず発酵培地を、菌体等の固形分を遠心分離及び／又はろ過などにより固液分離し、エタノールを含む水溶液を回収し、その後、該水溶液を蒸留、膜分離などの方法によりエタノールを濃縮、精製する方法が好ましい。
【００６３】
本実施形態のエタノールの製造方法によれば、前記酵素糖化用原料を用いて得られた糖を用いることで、効率的にエタノールを製造することができる。前記エタノールの製造方法により得られたエタノールは、例えば、燃料用エタノール、工業用エタノールなどとして好適に利用可能である。
【００６４】
（乳酸の製造方法）
前記本発明の糖の製造方法により得られた糖を用いて、乳酸を製造することができる。この場合の乳酸の製造方法においては、前記糖を乳酸発酵する発酵工程（乳酸発酵工程）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００６５】
＜乳酸発酵工程＞
前記乳酸発酵工程は、前記糖液に乳酸菌等を添加し、乳酸発酵を行う工程である。
前記乳酸菌としては特に制限はなく、公知の乳酸菌を適宜選択して用いることができ、例えば、ラクトバチルス・マニホティヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）などが挙げられる。なお、前記乳酸菌は、天然の乳酸菌であってもよいし、遺伝子組換え乳酸菌であってもよい。
前記発酵工程における前記乳酸菌の使用量、糖以外の添加物、発酵温度、ｐＨ、発酵時間等の条件としては特に制限はなく、公知の条件を適宜選択して用いることができる。
【００６６】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、乳酸の精製工程を含むことが好ましい。
【００６７】
本発明の乳酸の製造方法によれば、前記酵素糖化用原料を用いて得られた糖を用いることで、効率的に乳酸を製造することができる。このようにして得られた乳酸は、例えばポリ乳酸等の生分解性高分子の原料として利用することができる。
【００６８】
また、本発明の糖の製造方法により得られる糖を、前記乳酸菌に代えて、それぞれ目的とする有機酸を産生する微生物を使用して発酵せしめることにより、乳酸以外の有機酸、例えば、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、シュウ酸等を製造することもできる。
【００６９】
以上、本発明の酵素糖化用原料の製造方法、並びに前記酵素糖化用原料の製造方法により製造された酵素糖化用原料を用いた糖の製造方法、及び、前記糖の製造方法により製造された糖を用いたエタノールの製造方法、乳酸の製造方法について、好ましい実施形態に沿って説明したが、本発明はその趣旨を逸脱しない範囲において、上記実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７１】
（製造例）
＜バイオマス原料＞
リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含むバイオマス原料として、エリアンサスを用いた。
【００７２】
＜粗粉砕＞
収穫したエリアンサスを目開き４ｍｍのスクリーンで粒度を制御しながらカッターミルを用いて粉砕し、バイオマス原料の粗粉砕品を得た。前記バイオマス原料の粗粉砕品の粒径はレーザー回折法（装置：レーザー回折粒子径測定装置ＬＭＳ−２０００ｅ（セイシン企業社製））で測定したメジアン径（ｄ５０）として９７５μｍであった。
【００７３】
＜乾燥＞
前記バイオマス原料の粗粉砕品の含水率は２９質量％であり、これをバイオマス１とし、後述する実施例１及び比較例１で使用した。
前記バイオマスの粗粉砕品を４０℃、５ｋＰａ（絶対圧）の減圧下に一昼夜乾燥し、バイオマスの含水率（水分を含むバイオマスの質量を基準とした水分質量の比率）を０．５質量％とし、バイオマス２を得た。前記バイオマス２は後述する実施例３−１、実施例３−２、比較例３−１、比較例３−２、比較例４−１、比較例４−２、実施例５、及び比較例５で使用した。
前記バイオマス２を湿度を調節した容器内で吸湿させて、バイオマスの含水率を１５質量％に調整し、バイオマス３を得た。前記バイオマス３は、後述する実施例２及び比較例２で使用した。
また、前記バイオマス２をポリプロピレン樹脂製容器に所定量取り、該容器を回転させながら、ここへ、バイオマスの含水率が４０質量％となる量の水を滴下し、更に該容器を５時間回転させて、バイオマスの含水率が４０質量％であり、均一に水が吸収されたバイオマス４を得た。前記バイオマス４は、後述する比較例６−１及び比較例６−２で使用した。
【００７４】
（実施例１、比較例１：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
内容積約５Ｌの、撹拌装置を備えたステンレス鋼製オートクレーブに前記バイオマス１を２００ｇ充填し、窒素ガスによる加圧、脱圧を数回繰り返して、オートクレーブ内の空気を除去した後、減圧により窒素ガスを除去した。そして、オートクレーブ内をアンモニア処理温度（８０℃）近くまで昇温した。別途、ステンレス鋼製オートクレーブを用いて、処理温度（８０℃）より高い温度（１００℃）まで乾燥したアンモニアを予め昇温した。前記２つのオートクレーブを導通し、バイオマスが充填されたオートクレーブに、アンモニアを８０℃において処理圧力３．９ＭＰａＧで導入し、その後前記条件にて撹拌下に０．５時間（処理時間）アンモニア処理を行った。その後、脱圧し、更にオートクレーブに窒素ガスを流通させ、バイオマス内に残留したアンモニアを除去し、アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）を得た。
【００７５】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス１のエステル結合残存率を以下のように測定した。
フーリエ変換赤外分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ社製ＮＩＣＯＬＥＴ３８０を用い、吸光波数４００ｃｍ−１〜４０００ｃｍ−１の範囲を反射法で、アンモニア処理されたバイオマス１の赤外分光分析を行った。同様にして、アンモニア処理前のバイオマス１の赤外分光分析を行った。アンモニア処理前のバイオマス１についての、吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、アンモニア処理前後で変化しない吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のリグニンのベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値に対して、アンモニア処理されたバイオマス１の前記値の百分率を求め、得られた値をエステル結合残存率（％）（下記式（２））とした。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・（２）
その結果、エステル結合残存率は８５％であった。
【００７６】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物１の調製−
実施例１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１の乾燥質量１５部に対して８５部の水（既にバイオマスが含有している水を含む、即ち、含水分を除いた質量分の水を加えて８５部となるように調整。）を加えて均一に混合し、マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス１と水との混合物（固形分率１５質量％）である被粉砕物１を得た。
【００７７】
−ディスクミル粉砕−
実施例１においては、ディスクミル型粉砕機グローエンジニアリング社製ＲＤ１−１５を用い、前記被粉砕物１の湿式粉砕を行った。前記粉砕機の上下に炭化ケイ素製砥石を装着し、前記砥石間の間隙を１５０μｍとした。片側の砥石を９００ｒｐｍの速度で回転させ、中心部に前記被粉砕物１（マッド状のバイオマスと水の混合物）を投入して、粉砕による発熱を除去するための冷却水を流通させて、室温（２５℃〜３０℃）にて粉砕し、酵素糖化用原料１（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００７８】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１、固形物）、及び前記酵素糖化用原料１（実施例１、マッド状の水を含む混合物）のそれぞれを用い、以下の操作により、酵素糖化反応を行った。
内容積１．５ｍＬのマイクロチューブに、乾燥固形分として１０ｍｇとなるように精秤した試料を取り、試料濃度１％（乾燥質量／体積）、酵素としてＣｅｌｌｕｃｌａｓｔ＠１．５Ｌ及びＮｏｖｏｚｙｍｅ＠１８８（共に商品名、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を各酵素濃度０．０１％（質量／体積）、計０．０２％（質量／体積）の酵素濃度、ｐＨ４．５（酢酸緩衝液）となるように酵素糖化反応液を調製した。これを３７℃の恒温室にて、回転振とう機（１５回転／分）を用いて２４時間転倒振とうして酵素糖化反応を行った。反応後、遠心分離によって得られた上澄み液中のグルコース濃度を、グルコースＣＩＩテストワコー（商品名、和光純薬社製）を用いて測定し、酵素糖化率の尺度としてグルコース収率を算出した。その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）のグルコース収率は３１％であり、前記酵素糖化用原料１（実施例１）のグルコース収率は６２％であった。
なお、グルコース収率は下記式（４）で定義される。
グルコース収率（％）＝［酵素糖化反応液中のグルコース量／（酵素糖化原料の乾燥質量×全グルコース化率／１００）］×１００ ・・・（４）
全グルコース化率（％）：（バイオマス原料を別途化学的に完全に加水分解したときに得られるグルコースの量／バイオマス原料の乾燥質量）×１００（バイオマス原料基準のグルコースの理論収率に相当）
【００７９】
（実施例２、比較例２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
バイオマス原料として使用した前記バイオマス１を前記バイオマス３に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）を得た。
【００８０】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス３のエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【００８１】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物３の調製−
実施例２においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス３に代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（固体濃度１５質量％）である被粉砕物３を得た。
【００８２】
−ディスクミル粉砕−
実施例２においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物３に代えた以外は、前記実施例１と同様にしてディスクミルによる湿式粉砕を行い、酵素糖化用原料３（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８３】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）及び前記酵素糖化用原料３（実施例２）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、それぞれ酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス３（比較例２）のグルコース収率は５１％であり、前記酵素糖化用原料３（実施例２）のグルコース収率は６８％であった。
【００８４】
（実施例３−１、３−２、比較例３−１、３−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
バイオマス原料として使用した前記バイオマス１を前記バイオマス２に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）を得た。
【００８５】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【００８６】
＜湿式粉砕工程Ａ＞
−被粉砕物２Ａの調製−
実施例３−１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス２Ａと水との混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ａを得た。
【００８７】
−ディスクミル粉砕−
実施例３−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ａに代えた以外は、前記実施例１と同様にしてディスクミルによる湿式粉砕を行い、酵素糖化用原料２Ａ−１（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８８】
＜湿式粉砕工程Ｂ＞
−ボールミル粉砕−
実施例３−２においては、ボールミル型粉砕機レッチェ社製ミキサーミル（ＭＭ３００）を用い、前記被粉砕物２Ａの湿式粉砕を行った。前記被粉砕物２Ａ（マッド状の、アンモニア処理されたバイオマス２と水の混合物）２．２ｇを粉砕ジャー（５０ｍＬ容器）に投入して密閉後、振とう速度２０回／秒で５分間、粉砕による発熱を除去するための冷却水を流通させて、室温（２５℃〜３０℃）にて粉砕し、酵素糖化用原料２Ａ−２（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００８９】
＜乾式粉砕工程＞
比較例３−２においては、前記被粉砕物１の湿式粉砕に代えて、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａの乾式粉砕を行った以外は、実施例１と同様に粉砕を行った。すなわち、実施例１と同一の粉砕機を用いて、同様の運転条件で、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａに水を添加することなく粉砕した。これにより酵素糖化用原料２Ａ−３（固形物）を得た。
【００９０】
−Ｘ線回折分析−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａを湿式粉砕して得られた前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）に含まれるバイオマス、及び前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａを乾式粉砕して得られた前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）のそれぞれについて、以下の操作により、Ｘ線回折分析を行った。
前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）の少量を乾燥して水分を除去し、これに含まれるバイオマスの固形分試料を得た。この試料、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−３のそれぞれの試料１００ｍｇを、２０ＭＰａＧの圧力にて加圧成型してＸ線回折分析に供した。Ｘ線回折分析は管球型Ｘ線発生装置ＲＩＮＴ２２００（商品名、リガク社製）を用い、ディフラクトメトリー法によって行った。電圧３８ｋＶ、電流５０ｍＡ、モノクロメーターで単色化したＣｕＫα線（波長０．１５４１８ｎｍ）を用い、操作範囲２θ＝５〜３０°、ステップ幅０．１°、積算時間２０秒の条件にてステップスキャン法で測定した。前記３種の試料のＸ線回折パターンを図１に示す。
【００９１】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）に、前記酵素糖化用原料１（実施例１）を前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）、及び前記酵素糖化用原料２Ａ−２（実施例３−２）に、それぞれ代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、それぞれ酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ａ（比較例３−１）のグルコース収率は５０％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−１（実施例３−１）は７０％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−２（実施例３−２）のグルコース収率は７１％であり、前記酵素糖化用原料２Ａ−３（比較例３−２）のグルコース収率は５２％であった。
【００９２】
（比較例４−１、４−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
アンモニア処理時間を０．５時間から０．１７時間に変えた以外は、実施例３−１と同様にしてアンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）を得た。
【００９３】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は９５％だった。
【００９４】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物２Ｂの調製−
比較例４−１においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ｂを得た。
【００９５】
−ディスクミル粉砕−
比較例４−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ｂに代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料２Ｂ（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【００９６】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）及び前記酵素糖化用原料２Ｂ（比較例４−１）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｂ（比較例４−２）のグルコース収率は１５％であり、前記酵素糖化用原料２Ｂ（比較例４−１）のグルコース収率は１９％であった。
【００９７】
（実施例５、比較例５：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
処理温度を８０℃から１５０℃に、処理圧力を３．９ＭＰａＧから１．０ＭＰａＧに、及び処理時間を０．５時間から２．５時間に変えた以外は、前記実施例３−１及び比較例３−１と同様にして、アンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）を得た。
【００９８】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃのエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は９０％だった。
【００９９】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物２Ｃの調製−
実施例５においては、前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃに代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物２Ｃを得た。
【０１００】
−ディスクミル粉砕−
実施例５においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物２Ｃに代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料２Ｃ（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【０１０１】
＜酵素糖化工程＞
前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）のそれぞれを、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）及び前記酵素糖化用原料２Ｃ（実施例５）のそれぞれに代えた以外は、比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス２Ｃ（比較例５）のグルコース収率は２９％であり、前記酵素糖化用原料２Ｃ（実施例５）は６２％であった。
【０１０２】
（比較例６−１、比較例６−２：酵素糖化用原料、及び糖の製造）
＜アンモニア処理工程＞
前記バイオマス１を前記バイオマス４に代えた以外は、前記実施例１及び比較例１と同様にして、アンモニア処理を行い、アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−１）を得た。
【０１０３】
−エステル結合残存率−
前記アンモニア処理されたバイオマス４のエステル結合残存率を、前記実施例１及び比較例１と同様にして測定した結果、エステル結合残存率は８５％だった。
【０１０４】
＜湿式粉砕工程＞
−被粉砕物４の調製−
前記アンモニア処理されたバイオマス１を前記アンモニア処理されたバイオマス４に代えた以外は、前記実施例１と同様にして、マッド状のバイオマスと水の混合物（乾燥固形分率１５質量％）である被粉砕物４を得た。
【０１０５】
−ディスクミル粉砕−
比較例６−１においては、前記被粉砕物１を前記被粉砕物４に代えた以外は、前記実施例１と同様にして湿式粉砕し、酵素糖化用原料４（乾燥固形分率１５質量％）を得た。
【０１０６】
＜酵素糖化工程＞
酵素糖化用原料として、前記アンモニア処理されたバイオマス１（比較例１）及び前記酵素糖化用原料１（実施例１）を、前記アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−２）、及び前記酵素糖化用原料４（比較例６−１）のそれぞれに代えた以外は、前記比較例１及び実施例１と同様にして、酵素糖化反応を行った。
その結果、前記アンモニア処理されたバイオマス４（比較例６−２）のグルコース収率は１９％であり、前記酵素糖化用原料４のグルコース収率は４１％であった。
【０１０７】
前記実施例、及び比較例の構成及び結果を下記表１に示す。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】
表１の結果から、リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料を、水分の含有量が前記式（１）を満たす条件下に、前記式（２）により求められるエステル結合残存率が９０％以下となるようにアンモニア処理を行い、更にアンモニア処理されたバイオマスを湿式粉砕する実施例においては、前記構成の少なくとも一部を満たさない比較例と比べて、グルコース収率、すなわち酵素糖化率が格段に向上することがわかった。
また、図１に示すＸ線回折パターンの結果から、所定の要件を満たしてアンモニア処理されたバイオマスにおいて、生成したセルロースＩＩＩ型結晶は、湿式粉砕することにより、その一部がセルロースＩ型結晶へと戻っていることがわかる。一方、同一のアンモニア処理されたバイオマスを乾式粉砕した場合には、Ｘ線回折パターンは粉砕前と大きな変化はなく、セルロースＩＩＩ型結晶のセルロースＩ型結晶への転移は見られない。表１が示すように、より酵素糖化を受けやすいセルロースＩＩＩ型結晶を多く有する乾式粉砕を受けたバイオマス（比較例３−２）よりも、湿式粉砕を受け、セルロースＩＩＩ型結晶が減少したバイオマス（実施例３−１）の方が高いグルコース収率を与えた。これは、酵素糖化率の向上に対して、セルロースＩＩＩ型結晶と同Ｉ型結晶間の転移よりも大きな影響を与えるセルロースの構造変化（非晶化と推定）が、アンモニア処理されたバイオマスの湿式粉砕によってより進行することに起因するものと推定される。この変化による酵素糖化率の向上効果は、アンモニア処理における含水率及びアンモニア処理されたバイオマス中のエステル残存率が所定の条件を満たす場合に、顕著に発現される。
【０１１０】
（実施例６、エタノールの製造）
＜酵素糖化工程＞
実施例３−１で得た酵素糖化用原料２Ａ−１について、実施例３−１で実施したマイクロチューブ内での酵素糖化を、内容積１００ｍＬの三角フラスコに規模を拡大して実施した。
＜エタノール発酵工程＞
得られた酵素糖化後の懸濁液は、遠心分離及びろ過により固液分離し、得られた溶液をロータリーエバポレーターによりグルコース濃度が１０％になるように濃縮して糖化液を得た。内容積１００ｍＬの三角フラスコ中にて前記糖化液にサッカロマイセス・セルビシエを植菌し、２８℃、８０ｒｐｍで振盪しながら発酵した。２４時間後にエタノール濃度４．３ｗｔ％の発酵液を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明の酵素糖化用原料の製造方法によれば、酵素糖化を効率的に行うことができ、そのため、糖の生産効率を向上させることが可能な、糖の製造方法に用いられる、有用な酵素糖化用原料を効率的に得ることができる。
また、本発明の糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法によれば、糖の生産効率、エタノールの生産効率、及び乳酸の生産効率を格段に向上させることができる。
したがって、本発明の酵素糖化用原料の製造方法、並びに本発明の糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法は、例えば、近年注目されている、環境に優しい燃料を産出することを目的としたバイオマス原料からのエタノール製造、また、環境に優しい生分解性プラスチックの製造等に、好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで処理し、前記バイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、
前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、
を含み、
前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とが下記式（１）の関係を満たし、
｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０ ・・・ （１）
かつ、
前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行うことを特徴とする酵素糖化用原料の製造方法。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・ （２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
【請求項２】
前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含む請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
【請求項３】
前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水を加える工程を含む請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
【請求項４】
前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）とが、下記式（３）の関係を満たす請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７ ・・・ （３）
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化して糖を得ることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項１】
リグニン、セルロース、及びヘミセルロースを含有するバイオマス原料をアンモニアで処理し、前記バイオマス原料中のエステル結合の少なくとも一部を切断するアンモニア処理工程と、
前記アンモニア処理されたバイオマスを湿式で粉砕する湿式粉砕工程と、
を含み、
前記アンモニア処理工程におけるバイオマスの乾燥質量（Ａ）と水の質量（Ｂ）とが下記式（１）の関係を満たし、
｛Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｝×１００≦３０ ・・・ （１）
かつ、
前記エステル結合の切断は、下記式（２）で求められるエステル結合残存率が９０％以下となるまで行うことを特徴とする酵素糖化用原料の製造方法。
エステル結合残存率（％）＝（アンモニア処理されたバイオマスのエステル結合ピーク／バイオマス原料のエステル結合ピーク）×１００ ・・・ （２）
ただし、前記式（２）中、「エステル結合ピーク」は、フーリエ変換赤外分光光度計で測定された吸光波数１７３０ｃｍ−１付近の、脂肪酸と脂肪族アルコールとの縮合により生成するエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に帰属される吸収ピークの面積を、吸光波数１５１５ｃｍ−１付近のベンゼン核骨核振動（Ｃ＝Ｃ）に帰属される吸収ピークの面積で除した値を表す。
【請求項２】
前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水及び／又は有機溶剤を加える工程を含む請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
【請求項３】
前記アンモニア処理工程と前記湿式粉砕工程との間に、アンモニア処理されたバイオマスに、前記湿式粉砕工程において使用する水を加える工程を含む請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
【請求項４】
前記湿式粉砕工程における、アンモニア処理されたバイオマスの乾燥質量（Ｃ）と水及び／又は有機溶剤の質量（Ｄ）とが、下記式（３）の関係を満たす請求項１に記載の酵素糖化用原料の製造方法。
５≦｛Ｃ／（Ｃ＋Ｄ）｝×１００≦６７ ・・・ （３）
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の酵素糖化用原料の製造方法により得られた酵素糖化用原料を酵素糖化して糖を得ることを特徴とする糖の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の糖の製造方法により得られた糖を発酵させてエタノールを得ることを特徴とするエタノールの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−７０７２５（Ｐ２０１２−７０７２５Ａ）
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−７２３５４（Ｐ２０１１−７２３５４）
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、セルロース系エタノール革新的生産システム開発事業委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００４４４４）ＪＸ日鉱日石エネルギー株式会社 (1,898)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月１２日（２０１２．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２９日（２０１１．３．２９）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２２年度 独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構、セルロース系エタノール革新的生産システム開発事業委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００４４４４）ＪＸ日鉱日石エネルギー株式会社 (1,898)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]