酸化的損傷グアニン化合物とこれの濃度補正物質の同時分析方法及びこの分析方法に用いる分析装置
本発明は、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを効率よく分析することができる方法、及びこの方法を実施するための分析装置を提供することを目的とする。 本発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を精製する工程と、前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質をＵＶ検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする分析方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質との同時分析方法、特に８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、適宜「８−ＯＨ−ｄＧ」という。）と、７−メチルグアニン（以下、適宜「７−ＭＧ」という）又はクレアチニン（以下、適宜「Ｃｒｅ」という。）との同時分析方法、及びこれを実施するための分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内での活性酸素の作用について多くの研究がなされている。通常、活性酸素は生体内に異物が侵入した際、防御システムとして働いている。しかしながら、食品添加物（発ガン性物質）、大気汚染、喫煙、ストレス等によって過剰に活性酸素が発生すると、それらはＤＮＡの損傷を引き起こし、酸化的ＤＮＡ損傷産物の一種である８−ＯＨ−ｄＧを生成する。この８−ＯＨ−ｄＧは突然変異を誘発し、発癌過程で重要な役割を演じていると考えられている。また、活性酸素は、発癌だけでなく様々な疾患や老化の原因として注目されている。
そのため、生体内における活性酸素量を知ることにより、個人個人の発癌リスク評価や、活性酸素関連の様々な疾患の予測・診断、老化度、あるいは一般健康の評価を行うことができる。
しかしながら、生体内における活性酸素は不安定であり、それらを直接検出するのは困難である。そのため、活性酸素の指標として活性酸素によって生成される８−ＯＨ−ｄＧを測定することが提案されている。８−ＯＨ−ｄＧの分析方法としては、（１）８−ＯＨ−ｄＧに対する抗体を結合させたアフィニティ−カラムで精製した分画をＨＰＬＣ−ＥＣＤで分析する方法、（２）２本の逆相カラムの間にカーボンカラムを接続してカラムスイッチング法により、最終的に８−ＯＨ−ｄＧをＨＰＬＣ−ＥＣＤにより検出する方法（非特許文献１）、（３）サンプリングインジェクター（一定分画を分取し、攪拌後、一定量をカラムに注入する装置）を介してマルチファンクションカラム（逆相カラム、陽イオン交換カラムの機能を併せ持つゲル濾過カラム）と、逆相カラムを接続しＥＣＤにより検出する方法（非特許文献２）等が報告されている。
【非特許文献１】ボグダノフら（Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｍ．，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．）、フリー・ラジカル・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、１９９９年、第２７巻、ｐ．６４７−６６６
【非特許文献２】カサイら（Ｋａｓａｉ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．）ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２００１年、第９２巻、ｐ．９−１５
【非特許文献３】トップら（Ｔｏｐｐ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８７年、第１６１巻、ｐ．４９−５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生体中の８−ＯＨ−ｄＧの値は、多くの場合、時間により変化する。そこで、８−ＯＨ−ｄＧを正確に定量する場合、２４時間分の試料を用意するか、８−ＯＨ−ｄＧに対する濃度補正物質を用いて８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正をすることが必要になる。
上述の方法においては、濃度補正物質を用いて濃度補正をすることにより８−ＯＨ−ｄＧを定量する場合、試料を最低２本の容器にとり、１本を８−ＯＨ−ｄＧ自体の分析に用い、もう１本を濃度補正物質（例えば、クレアチニン（Ｃｒｅ））の分析に用い、両物質の測定値から算出される値（例えば、（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ））を酸化的ＤＮＡ損傷の指標としていた。そのため、試料の採取・保存・分析・データの解析において煩雑な手続きが必要であった。
【０００４】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを効率よく分析することができる方法、及びこの方法を実施するための分析装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような事情に鑑みて、本発明者は鋭意検討の結果、８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正物質である７−メチルグアニン、クレアチニンを８−ＯＨ−ｄＧと同時に分析する方法、及びこれに用いる装置により、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。
７−ＭＧは、代謝率（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒａｔｅ，ＭＲ）と関係するＲＮＡ分解物であり、ＲＮＡの分解産物であるプソイドウリジンと一定の比率で尿中に排せつされることが知られており（非特許文献３）、また、クレアチニンの濃度と７−ＭＧの濃度には強い相関があることも分かっている。したがって、７−ＭＧによって８−ＯＨ−ｄＧの値を補正した（８−ＯＨ−ｄＧ／７−ＭＧ）値は、クレアチニンによって８−ＯＨ−ｄＧの値を補正した（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ）値と同等の信頼度を持つ酸化的ＤＮＡ損傷の指標となる。
【０００６】
同様に、他のＲＮＡ分解物であるプソイドウリジン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、Ｎ６−スレオニノカルボニルアデノシン等によっても補正は可能と考えられる。
【０００７】
即ち、本発明の第１の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
このような構成をとることにより、前記酸化的損傷グアニン化合物を、簡便に分析できるので、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることが可能となる。
また、本発明は、多量の溶離液や洗浄液を必要とせず、有毒の廃液の発生も少ないので、環境面でも優れている。
【０００８】
本発明の第２の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）である第１の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【０００９】
本発明の第３の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１０】
この方法によれば、前記酸化的損傷グアニン化合物と、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、同時に分析できるので、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることが可能となる。
【００１１】
本発明の第４の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）である第３の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１２】
本発明の第５の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位置を感知し、適宜、前記試料中に含まれる前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１３】
この方法によれば、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）等の物質を、８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えているので、酸化的損傷グアニン化合物の、カラムからの溶出位置（時間）、溶出液の分取範囲をより正確に規定することが可能になり、その結果、８−ＯＨ−ｄＧを高精度で、且つ再現性よく測定できる。
【００１４】
本発明の第６の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）であり、前記マーカが、８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）である第５の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１５】
本発明の第７、８、及び９の発明は、前記試料が尿であることを特徴とする、それぞれ第１、第３、又は第５の発明に記載の分析方法である。
【００１６】
本発明の第１０、１１、及び１２の発明は、前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する、それぞれ第７、第８、又は第９の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
このような構成をとることにより、どこにいても試料を採取することができ、郵送等により分析機関に大量の試料を効率よく集めることが可能になる。
【００１７】
本発明の第１３の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程において、カルボン酸型のカラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる第１乃至１２のいずれか一つの発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。この方法によりＨＰＬＣ−１における８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａの溶出位置を重ねることができ両者の同時分析が可能となる。
【００１８】
本発明の第１４の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により精製された前記酸化的損傷グアニン化合物を含む分画を、更に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）により精製する工程；及びＨＰＬＣ−２により精製された精製酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程；を更に有する第１乃至１２の何れか一つの発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
この場合、ＨＰＬＣ−１で精製した酸化的損傷グアニン化合物（８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）等）の測定は、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）適宜、８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、の順序で行い、ついで、逆相カラムへ注入して行うことができる。
本発明の分析装置は、大掛かりな機構を必要とせず、安価で経済性にも優れている。
【００１９】
本発明の第１５の発明は、１）試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）；２）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製して得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を、更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）；及び３）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）で精製して得られた精製酸化的損傷グアニン化合物を測定する検出器；を備えたことを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析装置である。
【００２０】
本発明の第１６の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器が、光路の短いセルを備えた検出器である、第１５の発明に記載の分析装置である。
【００２１】
本発明の第１７の発明は、予め試料中に加えておいたマーカのピークシグナルを検出器より受け、一定時間後の酸化的損傷グアニン化合物の溶出時にバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、次いで、得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から溶出する前記酸化的損傷グアニン化合物を精製・回収する処理を行わせるための酸化的損傷グアニン化合物の分析機構（制御プログラムを含む）である。
この分析機構（制御プログラムを含む）は、本発明の分析装置において利用することにより、酸化的損傷グアニン化合物の効率的且つ正確な分析を自動化することが可能になる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の分析方法を用いれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチドの損傷の過程で生成される酸化的損傷グアニン化合物を分析する方法において、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、（同時に）分析することができる。そのため、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることができ、より効率的な酸化的損傷グアニン化合物の分析が可能となる。
また、本発明の分析方法は、高精度で再現性が良く、分析時間も短く、連続運転を行うことにより、大量処理が可能である。
本発明の分析装置は、上記の効果を奏する分析方法を提供することができ、また、安価で経済性に優れている。
尚、本願においては、「酸化的損傷グアニン化合物」には、「酸化的損傷グアニンヌクレオシド」及び「酸化的損傷グアニン」の双方が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】８−ＯＨ−ｄＧ（８−ＯＨ−Ｇｕａ）と７−ＭＧ又はＣｒｅとを一時に分析するための装置の一例を示す模式図である。
【図２】８−ＯＨ−ｄＧ（８−ＯＨ−Ｇｕａ）と７−ＭＧ又はＣｒｅとを一時に分析するための装置のもう一つの例を示す模式図である。
【図３】マーカである８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピークに基づく８−ＯＨ−ｄＧの分取と７−ＭＧ又はＣｒｅの測定の例を示す図である（ＨＰＬＣ−１）。
【図４】本発明の実施に係る８−ＯＨ−ｄＧの測定の例を示す図である（ＨＰＬＣ−２）。
【図５】Ｃｒｅ、７−ＭＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａ、８−ＯＨ−ｄＧを一時に分析した例を示す図である。
【符号の説明】
【００２４】
１１‥陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）、１２‥逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）、１３‥電気化学検出器、１４‥ＵＶ検出器、１５‥スイッチングバルブ、１６‥スイッチングバルブ、１７‥オートサンプラー、２７‥サンプリングインジェクター
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物）
８−ＯＨ−ｄＧをはじめＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物とは、生体内の活性酸素（酸素ラジカル）等によってＤＮＡやＲＮＡ又はヌクレオチドが損傷を受けた結果生じるものであり、活性酸素の指標として用いられる。８−ＯＨ−ｄＧ以外の酸化的損傷化合物としては、２−ヒドロキシデオキシアデノシン（２−ＯＨ−ｄＡ）、５−ヒドロキシデオキシシチジン（５−ＯＨ−ｄＣ）、５−ホルミルデオキシウリジン（５−ＣＨＯ−ｄＵ）、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）等が挙げられる。これら酸化的損傷化合物は、不要物として尿により生体外へ排出される。また、これらのうち８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物は負の電荷を帯びているため、後段で説明する陰イオン交換カラムにより容易に精製、回収することができる。これらの中でも活性酸素の指標として、特に８−ＯＨ−ｄＧを用いることが好ましい。なお、本出願（請求項、明細書、等）における酸化的損傷グアニン化合物とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが活性酸素によって損傷を受けた結果生じる８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等であり、酸化的損傷とはヒドロキシル化されることを示す。
【００２６】
（試料）
本発明の酸化的損傷グアニン化合物（８−ＯＨ−ｄＧを含む）と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、（一時に）分析する分析方法に使用される試料としては、尿、血清、髄液、唾液、細胞培養後の培地等、全ての生体試料を挙げることができる。これらの中でも、尿は採取し易く、また尿中で酸化的損傷グアニン化合物は安定であるため、特に尿が好ましい。
【００２７】
本発明の分析方法、及びこれを実施するための分析装置について説明する。本発明の分析方法は、酸化的損傷グアニン化合物（例えば、８−ＯＨ−ｄＧ）を精製する工程と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質（例えば、７−ＭＧ又はＣｒｅ）を測定する工程と、この酸化的損傷グアニン化合物を測定する工程から構成される。また、本発明の分析装置は、上記の精製及び測定を行うための部材からなる。
以下、酸化的損傷グアニン化合物として８−ＯＨ−ｄＧを、またこの酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質として、７−ＭＧ及びＣｒｅを例にとって説明する。
【００２８】
（分析装置）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと、適宜７−ＭＧ及び／又はＣｒｅとを分析するための装置は、１）８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）と、２）８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置の指標となる８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカを感知し、７−ＭＧ又はＣｒｅを測定するＵＶ検出器等の検出器と、３）陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）と、４）逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する検出器を具備する。
【００２９】
本発明の分析装置の一例の模式図を図１に示す。図中符号１１は陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）であり、これはＵＶ検出器１４、及びカラムスイッチングバルブ１６を介して、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２と接続している。また、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１の上流には、試料を注入するオートサンプラー１７が接続されたカラムスイッチングバルブ１５が接続している。
また、カラムに吸着した分子を溶出するための溶離液（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１に用いられる溶離液をＡ液、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に用いられる溶離液をＢ液とする）、上記カラムスイッチングバルブ１５に接続されたガードカラム（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１と同一の陰イオン交換樹脂を充填）を洗浄するための洗浄液（Ｃ液）を各カラムに送り込むためのポンプ２１、２２、２３が設けられ、ポンプ２１はオートサンプラー１７、ポンプ２２はカラムスイッチングバルブ１６、ポンプ２３はカラムスイッチングバルブ１５に各々接続されている。
なお、この例において、オートサンプラー１７の代わりに、８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク感知により、カラムスイッチングバルブ１６を自動的に作動させる機能を持つサンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）等を用いることができる。
【００３０】
本発明の方法の実施において、ＨＰＬＣ−１及びＨＰＬＣ−２の二つのカラムをカラムスイッチング法により用いる場合には、通常、ＨＰＬＣ−１における酸化的損傷グアニン化合物（例えば８−ＯＨ−ｄＧ）の標準液を予めＨＰＬＣ−１に注入し、分取開始時間と、終了時間とを決定しておき、その条件を使用してＨＰＬＣ−２へ、ＨＰＬＣ−１で精製済みの酸化的損傷グアニン化合物を注入することが必要である。
一方、本発明の方法を実施にあたっては上記のような方法に代えて、２３１ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行うこともできる。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものであり（図３を参照）、予め、８−ＯＨ−ｄＧ等の酸化的損傷グアニン化合物の分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。より詳しくは、以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３１ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３１ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、バルブへ接点信号を出力し、ループ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、バルブへ接点信号を出力し、分取を終了させると同時にループ内の分画をＨＰＬＣ−２に注入する。
後段でも説明するが、サンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）に使用することにより、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。
【００３１】
上記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１は、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着するので回収率が非常に高く、且つほとんどの夾雑物を取り除くことができるため、不純物の少ない画分を得ることができる。また、上述したように、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１によれば、負の電荷を帯びている８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物においても、容易に精製、回収することができる。陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１としては、陰イオン交換樹脂を充填剤としたものであれば、特に制限はない。具体的な充填剤としては、スチレンジビニルベンゼン系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの、ポリヒドロキシメタクリレート系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの等が挙げられる。また、市販品の充填剤としては、アミネックスＨＰＸ−７２Ｓ（ＢｉｏＲａｄ製）、Ｓｈｏｄｅｘカラム充填剤（昭和電工（株）製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡＯ８Ｆ（三菱化成（株）製、ハミルトンＲＣＸ−１０）等を挙げることができる。
また、陰イオン交換樹脂の粒子径としては、現在７μｍのものにより良好な結果が得られているが、更に小粒子径（３〜５μｍ）の陰イオン交換樹脂をカラムに用いることにより、より分離能が高くなり、その結果、カラム長を短くできて、分析時間を短縮することも可能である。
【００３２】
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの内径は、特に制限はないが、約１ｍｍ〜１．５ｍｍ程度であることが好ましい。また、カラムの内径が２．０〜４．６ｍｍの場合は、図２に示すように、カラムスイッチングバルブ１６に接続したサンプリングインジェクター２７（「２３３ＸＬ」、ギルソン製等）を用いて、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識により、８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に注入することが好ましい。なお、この方法を実施するために、２３３ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、（５）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものであるが、より詳しくは以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３３ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３３ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、２３３ＸＬバイアルチューブ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、分取を終了させる。
（７）得られた分画を吸引、吐出により撹拌する。
（８）分画の一部をＨＰＬＣ−２に注入する。
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの長さは、特に制限はないが、陰イオン交換樹脂の粒子径、交換容量等によって、カラムを短くすることが可能であり、分析時間を短縮することができる。
【００３３】
上記光路の短いセルを具備したＵＶ検出器１４は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から溶出される画分をモニターし、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置を感知する。このように、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置を当該ＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させることにより、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
これと同時に、光路の短いセルを具備した当該ＵＶ検出器１４は、検出器のＵＶ波長を調整することにより、試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅを測定することができる。
【００３４】
上記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製するものであり、逆相カラムの性質を有するものであれば、特に制限はない。市販品としては、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（（株）資生堂製）等が挙げられる。
【００３５】
上記検出器１３は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定するものであり、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２の下流に設けられている。上記検出器１３としては、電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。また、上記電気化学検出器（ＥＣＤ）に関しては、２種類の設定電圧を選ぶことにより、８−ＯＨ−ｄＧのピークは固有の比率で表れるため（図４）、そのピークが８−ＯＨ−ｄＧであることを確認できる。
【００３６】
また、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと７−ＭＧ又はＣｒｅを同時に分析するための分析装置は、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することが可能である。その場合、ガードカラム３５の洗い洗浄液（Ｃ液）は、０．５Ｍ硫酸アンモニウム：アセトニトリル＝７：３程度の組成であることが好ましい。
【００３７】
以上説明したように、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと７−ＭＧ又はＣｒｅを同時に分析するための分析装置によれば、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１が試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着し、試料中に含まれる夾雑物の大半を一度に取り除くことができる。
また、ＵＶ検出器１４によって、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカの溶出位置に基づき、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取する方法は、回収率、再現性に優れているといえる。この光路の短いＵＶ検出器１４は、検出器のＵＶ波長を調整することにより、同時に８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正物質である７−ＭＧ又はＣｒｅをも測定することができる。このため、本実施形態の分析装置は、８−ＯＨ−ｄＧと、７−ＭＧ又はＣｒｅとを同時に分析することも可能である。
また、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することができる。また、上述した分析装置は比較的安価なため経済性にも優れている。
【００３８】
（分析方法）
以下、図１に示す分析装置を用いて８−ＯＨ−ｄＧと、７−ＭＧ又はＣｒｅとの分析方法について説明する。（分取範囲（時間）の決定）８−ＯＨ−ｄＧと８−ＯＨ−ｒＧｕｏと尿との混合物を図１示す分析装置に注入し、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲を決定しておく。
分取範囲を予め決定しておくことにより、８−ＯＨ−ｄＧの正確な溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させるように設定することで、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。なお、上述したように、図１において、オートサンプラー１７の代わりに、サンプリングインジェクター（２３１ＸＬ）を用いた場合は、ピーク感知により８−ＯＨ−ｒＧｕｏとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、分取範囲（時間）の設定をしておく必要がない。
【００３９】
（精製方法）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする。また、上述したように、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の負の電荷を有する酸化的損傷グアニン化合物においても、陰イオン交換クロマトグラフィーによって容易に精製、回収することができる。
第１の精製工程における溶出条件としては、カラム温度は５０〜６５℃、内径１ｍｍのカラムの場合、流速が１７〜２５μｌ／ｍｉｎとすることが好ましい。また、８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａの同時分析のためには、第１の精製工程における溶出液としては、カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸（又はそれらの塩）を含むものを挙げることができる。中でも酢酸を含むものが好ましい。
【００４０】
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えて、精製を行うことが可能である。８−ＯＨ−ｒＧｕｏを試料中に予め添加しておくと、８−ＯＨ−ｒＧｕｏが溶出された後、一定時間後に８−ＯＨ−ｄＧが溶出されるため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置をＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置（時間）が把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
【００４１】
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる第１の精製工程を行い、第１の精製工程で得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製すること（第２の精製工程）が好ましい。
上記第２の精製工程としては、逆相クロマトグラフィーにより精製することが好ましい。逆相クロマトグラフィーに用いられる溶出液（Ｂ液）、温度条件等は、使用する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２によって異なるため、それらは適宜決定される。例えば、逆相カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）を用いてヒト尿を分析する場合は、カラム温度が約４０℃、流速が０．９ｍｌ／ｍｉｎ程度とすることが好ましい。
【００４２】
（測定方法）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの測定方法は、上述した精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧの量を測定する測定工程を有し、上述した電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いて精製８−ＯＨ−ｄＧ量を測定できる。なお、上記測定方法は、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ（マーカとして加えない場合）、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物の測定にも適用できる。
また、連続運転を行う場合、図１に示すようなオートサンプラー１７を具備した装置においても、図２に示すようなサンプリングインジェクター２７を具備した装置においても、定期的に８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置をチェックすることが好ましい。
【００４３】
本発明の実施形態に係る７−ＭＧ又はＣｒｅの測定は、注入した試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅをＵＶ検出器１４によって測定する。
試料がマウスやラットの尿である場合は、７−ＭＧ測定のためのＵＶ検出器の波長は２５４ｎｍとしてよい。試料がヒトの尿である場合は、夾雑物と７−ＭＧを区別するため、ＵＶ検出器の波長は２５４ｎｍよりも長波長として、好ましくは、３００〜３１０ｎｍとする。Ｃｒｅ測定のためには、波長を２３５〜２６０ｎｍ、好ましくは２４５ｎｍとし、光路の短い（好ましくは０．２ｍｍ程度）セルを用いる。光路の短いセルの光路の長さとしては、０．１〜１ｍｍ程度の範囲とすることができる。
【００４４】
本発明の実施形態に係る分析方法においては、試料として尿を用いる場合、次の様な利点がある。
即ち、尿をろ紙片などに滴下し、尿を乾燥させる。ついで、この乾燥したろ紙片から尿を再抽出し、尿を分析する。
このようにすれば、尿はいずれの場所においても採取でき、乾燥したろ紙片を分析機関に郵送などの方法で送ることにより、大量の試料を効率よく分析することができる。
【００４５】
以上説明したように、本発明の実施形態に係る分析方法によれば、ＵＶ検出器１４のＵＶ波長を調整することにより、試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅを測定することができ、これにより、８−ＯＨ−ｄＧと、この濃度補正物質である７−ＭＧ又はＣｒｅとを同時に分析することができる。
本発明の分析方法では、８−ＯＨ−ｄＧを回収率良く得られる。更に、第１の精製工程における陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）の流速が微量であるため、溶離液（Ａ液）、洗浄液（Ｃ液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法によれば、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取でき、８−ＯＨ−ｄＧのピーク付近において夾雑物がほとんどない画分を得ることができる。また、連続運転を行っても、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピークを感知させる方法を用いれば、サンプル毎の分取範囲のズレに対応して、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧ又は８−ＯＨ−Ｇｕａ等の精製酸化的損傷グアニン化合物を測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。また、連続運転を行うことにより大量処理が可能である。
【００４６】
なお、本発明の分析方法では、７−ＭＧを定量的に測定することができる。７−ＭＧは、タバコ煙中の発癌物質によりＤＮＡ中に生じるとされ、本分析方法は発癌リスク評価の方法としても応用できる可能性がある。本発明の分析方法においては、７−ＭＧを濃度補正に用いる場合、正確には喫煙による７−ＭＧの増加分を差し引くことが好ましい。
【００４７】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。例えば、溶離液（Ａ液、Ｂ液）、洗浄液（Ｃ液）の組成等は、使用するカラム（充填剤）により適宜変更可能である。
本発明の酸化的損傷グアニン化合物の測定方法は、例えば、個人個人の発癌リスクの評価、活性酸素関連の様々な疾患（糖尿病等）の予測・診断、老化度、あるいは一般的健康の評価に用いることができる。
上記測定方法により得られた結果の評価方法として、例えば８−ＯＨ−ｄＧの場合、８−ＯＨ−ｄＧ標準溶液を随時、尿試料の他に分析装置に注入し、そのピーク面積との比較により算出された試料中の８−ＯＨ−ｄＧ濃度を、ＵＶ検出器によって同時に測定された７−ＭＧ又はＣｒｅの濃度で割った値として算出する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（尿試料の調製）
ヒトの尿を１ｍｌずつ２本のエッペンドルフチューブに取り、−２０℃で凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その１００μｌを取り、微酸性溶液（組成；０．６ｍＭ硫酸を９６ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で２倍に希釈し、８−ＯＨ−ｒＧｕｏを１２μｇ加えた。更に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を６．７μｌ加え、ｐＨを７以下にした。これをよく攪拌し、５℃で２〜３時間冷却後、１５０００回転、５分間遠心分離を行い、その上清を尿試料とした。なお、遠心した尿を直接２３１ＸＬ等のサンプリングインジェクターにセットし、希釈、ミクシング、注入を自動化することも可能である。
【００４９】
（８−ＯＨ−ｄＧの精製・分画と７−ＭＧ又はＣｒｅの測定）
この尿試料２０μｌを陰イオン交換カラム（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡ０８Ｆ、粒径７μｍ、ｓｕｌｆａｔｅ型）内径１．５ｍｍ、ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）によって精製した。カラムの温度は６５度とし、流速は５０μｌ／分とし、溶出液は０．３ｍＭの硫酸（２％アセトニトリルを含む）を用いた。
この分離により、ＵＶ検出器（「ＵＶ／ＶＩＳ−１５５」、ギルソン製）（吸光波長３０５ｎｍ及び２４５ｎｍ）を用いて、それぞれ７−ＭＧとＣｒｅを検出した。この分析における８−ＯＨ−ｒＧｕｏピーク認識は、３０５ｎｍにより行った。検出の結果を図３に示す。
【００５０】
図３に示すように、７−ＭＧとＣｒｅのピークが検出され、本実施例により、７−ＭＧとＣｒｅが測定できることが分かった。また、８−ＯＨ−ｄＧは、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出から一定の時間差を置いて溶出された。そのため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出をモニターすることにより、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置を把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを有する画分を得ることが可能であることが分かった。
【００５１】
（８−ＯＨ−ｄＧの精製と測定）
上記の、陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相クロマトグラフィーに注入した。なお、逆相カラムとして、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（２５０ｘ４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、５％メタノール（ＭｅＯＨ）溶離液（Ｂ液）を用い、カラム温度は４０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎとした。その分離パターンを図４に示す。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ＥＳＡ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ」、ＥＳＡ社）（電圧：ガードセル３５０ｍＶ；チャンネル１、１７０ｍＶ；チャンネル２、３００ｍＶ）を用いて検出した。
【００５２】
図４に示すように、８−ＯＨ−ｄＧのピークが検出され、本実施例により、８−ＯＨ−ｄＧが測定できることが分かった。
上記図３により得られた７−ＭＧ又はＣｒｅのピークの面積と、図４より得られた８−ＯＨ−ｄＧのピークの面積から、（８−ＯＨ−ｄＧ／７−ＭＧ）又は（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ）の値を算出し、これをもって、酸化的ＤＮＡ損傷の指標とすることができる。
【００５３】
（８−ＯＨ−ｄＧ及び８−ＯＨ−Ｇｕａの同時分析）
遠心したヒト尿をサンプリングインジェクター２３１ＸＬにセットし８−ＯＨ−ｒＧｕｏ（１２０ｍｇ／ｍｌ）を含む微酸性希釈液（組成；１２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）溶液９９ｍｌ；アセトニトリル１ｍｌ）で自動的に希釈（１：１）、ミクシング、ＨＰＬＣ−１への注入（２０μｌ）を行った。カラムは陰イオン交換カラム（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡ０８Ｆ、粒径７μｍ、ａｃｅｔａｔｅ型；内径１．５ｍｍ、ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）を用い、カラム温度は５５℃とし、流速は５０μｌ／分とし、溶離液は０．５％アセトニトリルを含む５ｍＭ酢酸を用いた。８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識により分取された８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａ分画は自動的にＨＰＬＣ−２に注入された。カラムはＩｎｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、粒径３μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用い、カラム温度は３０℃とし、流速は０．７ｍｌ／分とし、溶離液はＥＤＴＡ・３Ｎａ塩・３水和物（５０ｍｇ／ｌ）および８％メタノールを含む１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液を用いた。なおこの分析例においてはＥＣＤはエイコム社（京都）製ＥＣＤ−３００を用いた（設定電圧、５５０ｍＶ）。
結果を図５に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の分析方法は、尿等の生体物質の分析業界において用いることができる。本発明の分析装置は、分析機器の業界において用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質との同時分析方法、特に８−ヒドロキシデオキシグアノシン（以下、適宜「８−ＯＨ−ｄＧ」という。）と、７−メチルグアニン（以下、適宜「７−ＭＧ」という）又はクレアチニン（以下、適宜「Ｃｒｅ」という。）との同時分析方法、及びこれを実施するための分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内での活性酸素の作用について多くの研究がなされている。通常、活性酸素は生体内に異物が侵入した際、防御システムとして働いている。しかしながら、食品添加物（発ガン性物質）、大気汚染、喫煙、ストレス等によって過剰に活性酸素が発生すると、それらはＤＮＡの損傷を引き起こし、酸化的ＤＮＡ損傷産物の一種である８−ＯＨ−ｄＧを生成する。この８−ＯＨ−ｄＧは突然変異を誘発し、発癌過程で重要な役割を演じていると考えられている。また、活性酸素は、発癌だけでなく様々な疾患や老化の原因として注目されている。
そのため、生体内における活性酸素量を知ることにより、個人個人の発癌リスク評価や、活性酸素関連の様々な疾患の予測・診断、老化度、あるいは一般健康の評価を行うことができる。
しかしながら、生体内における活性酸素は不安定であり、それらを直接検出するのは困難である。そのため、活性酸素の指標として活性酸素によって生成される８−ＯＨ−ｄＧを測定することが提案されている。８−ＯＨ−ｄＧの分析方法としては、（１）８−ＯＨ−ｄＧに対する抗体を結合させたアフィニティ−カラムで精製した分画をＨＰＬＣ−ＥＣＤで分析する方法、（２）２本の逆相カラムの間にカーボンカラムを接続してカラムスイッチング法により、最終的に８−ＯＨ−ｄＧをＨＰＬＣ−ＥＣＤにより検出する方法（非特許文献１）、（３）サンプリングインジェクター（一定分画を分取し、攪拌後、一定量をカラムに注入する装置）を介してマルチファンクションカラム（逆相カラム、陽イオン交換カラムの機能を併せ持つゲル濾過カラム）と、逆相カラムを接続しＥＣＤにより検出する方法（非特許文献２）等が報告されている。
【非特許文献１】ボグダノフら（Ｂｏｇｄａｎｏｖ，Ｍ．，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．）、フリー・ラジカル・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｆｒｅｅ Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．）、１９９９年、第２７巻、ｐ．６４７−６６６
【非特許文献２】カサイら（Ｋａｓａｉ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．）ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・キャンサー・リサーチ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、２００１年、第９２巻、ｐ．９−１５
【非特許文献３】トップら（Ｔｏｐｐ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．）、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９８７年、第１６１巻、ｐ．４９−５６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生体中の８−ＯＨ−ｄＧの値は、多くの場合、時間により変化する。そこで、８−ＯＨ−ｄＧを正確に定量する場合、２４時間分の試料を用意するか、８−ＯＨ−ｄＧに対する濃度補正物質を用いて８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正をすることが必要になる。
上述の方法においては、濃度補正物質を用いて濃度補正をすることにより８−ＯＨ−ｄＧを定量する場合、試料を最低２本の容器にとり、１本を８−ＯＨ−ｄＧ自体の分析に用い、もう１本を濃度補正物質（例えば、クレアチニン（Ｃｒｅ））の分析に用い、両物質の測定値から算出される値（例えば、（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ））を酸化的ＤＮＡ損傷の指標としていた。そのため、試料の採取・保存・分析・データの解析において煩雑な手続きが必要であった。
【０００４】
本発明は、かかる状況に鑑みてなされたものであり、酸化的損傷グアニン化合物と、この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを効率よく分析することができる方法、及びこの方法を実施するための分析装置を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような事情に鑑みて、本発明者は鋭意検討の結果、８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正物質である７−メチルグアニン、クレアチニンを８−ＯＨ−ｄＧと同時に分析する方法、及びこれに用いる装置により、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成した。
７−ＭＧは、代謝率（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｒａｔｅ，ＭＲ）と関係するＲＮＡ分解物であり、ＲＮＡの分解産物であるプソイドウリジンと一定の比率で尿中に排せつされることが知られており（非特許文献３）、また、クレアチニンの濃度と７−ＭＧの濃度には強い相関があることも分かっている。したがって、７−ＭＧによって８−ＯＨ−ｄＧの値を補正した（８−ＯＨ−ｄＧ／７−ＭＧ）値は、クレアチニンによって８−ＯＨ−ｄＧの値を補正した（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ）値と同等の信頼度を持つ酸化的ＤＮＡ損傷の指標となる。
【０００６】
同様に、他のＲＮＡ分解物であるプソイドウリジン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、Ｎ６−スレオニノカルボニルアデノシン等によっても補正は可能と考えられる。
【０００７】
即ち、本発明の第１の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
このような構成をとることにより、前記酸化的損傷グアニン化合物を、簡便に分析できるので、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることが可能となる。
また、本発明は、多量の溶離液や洗浄液を必要とせず、有毒の廃液の発生も少ないので、環境面でも優れている。
【０００８】
本発明の第２の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）である第１の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【０００９】
本発明の第３の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１０】
この方法によれば、前記酸化的損傷グアニン化合物と、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、同時に分析できるので、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることが可能となる。
【００１１】
本発明の第４の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）である第３の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１２】
本発明の第５の発明は、試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位置を感知し、適宜、前記試料中に含まれる前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１３】
この方法によれば、予め、試料に８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）等の物質を、８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えているので、酸化的損傷グアニン化合物の、カラムからの溶出位置（時間）、溶出液の分取範囲をより正確に規定することが可能になり、その結果、８−ＯＨ−ｄＧを高精度で、且つ再現性よく測定できる。
【００１４】
本発明の第６の発明は、前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）であり、前記マーカが、８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）である第５の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
【００１５】
本発明の第７、８、及び９の発明は、前記試料が尿であることを特徴とする、それぞれ第１、第３、又は第５の発明に記載の分析方法である。
【００１６】
本発明の第１０、１１、及び１２の発明は、前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する、それぞれ第７、第８、又は第９の発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
このような構成をとることにより、どこにいても試料を採取することができ、郵送等により分析機関に大量の試料を効率よく集めることが可能になる。
【００１７】
本発明の第１３の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程において、カルボン酸型のカラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる第１乃至１２のいずれか一つの発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。この方法によりＨＰＬＣ−１における８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａの溶出位置を重ねることができ両者の同時分析が可能となる。
【００１８】
本発明の第１４の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により精製された前記酸化的損傷グアニン化合物を含む分画を、更に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）により精製する工程；及びＨＰＬＣ−２により精製された精製酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程；を更に有する第１乃至１２の何れか一つの発明に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法である。
この場合、ＨＰＬＣ−１で精製した酸化的損傷グアニン化合物（８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）等）の測定は、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）適宜、８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、の順序で行い、ついで、逆相カラムへ注入して行うことができる。
本発明の分析装置は、大掛かりな機構を必要とせず、安価で経済性にも優れている。
【００１９】
本発明の第１５の発明は、１）試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）；２）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製して得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を、更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）；及び３）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）で精製して得られた精製酸化的損傷グアニン化合物を測定する検出器；を備えたことを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析装置である。
【００２０】
本発明の第１６の発明は、前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器が、光路の短いセルを備えた検出器である、第１５の発明に記載の分析装置である。
【００２１】
本発明の第１７の発明は、予め試料中に加えておいたマーカのピークシグナルを検出器より受け、一定時間後の酸化的損傷グアニン化合物の溶出時にバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、次いで、得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から溶出する前記酸化的損傷グアニン化合物を精製・回収する処理を行わせるための酸化的損傷グアニン化合物の分析機構（制御プログラムを含む）である。
この分析機構（制御プログラムを含む）は、本発明の分析装置において利用することにより、酸化的損傷グアニン化合物の効率的且つ正確な分析を自動化することが可能になる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の分析方法を用いれば、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチドの損傷の過程で生成される酸化的損傷グアニン化合物を分析する方法において、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、（同時に）分析することができる。そのため、試料の採取・保存・分析・データの解析において労力・時間をほぼ半減させることができ、より効率的な酸化的損傷グアニン化合物の分析が可能となる。
また、本発明の分析方法は、高精度で再現性が良く、分析時間も短く、連続運転を行うことにより、大量処理が可能である。
本発明の分析装置は、上記の効果を奏する分析方法を提供することができ、また、安価で経済性に優れている。
尚、本願においては、「酸化的損傷グアニン化合物」には、「酸化的損傷グアニンヌクレオシド」及び「酸化的損傷グアニン」の双方が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】８−ＯＨ−ｄＧ（８−ＯＨ−Ｇｕａ）と７−ＭＧ又はＣｒｅとを一時に分析するための装置の一例を示す模式図である。
【図２】８−ＯＨ−ｄＧ（８−ＯＨ−Ｇｕａ）と７−ＭＧ又はＣｒｅとを一時に分析するための装置のもう一つの例を示す模式図である。
【図３】マーカである８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピークに基づく８−ＯＨ−ｄＧの分取と７−ＭＧ又はＣｒｅの測定の例を示す図である（ＨＰＬＣ−１）。
【図４】本発明の実施に係る８−ＯＨ−ｄＧの測定の例を示す図である（ＨＰＬＣ−２）。
【図５】Ｃｒｅ、７−ＭＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａ、８−ＯＨ−ｄＧを一時に分析した例を示す図である。
【符号の説明】
【００２４】
１１‥陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）、１２‥逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）、１３‥電気化学検出器、１４‥ＵＶ検出器、１５‥スイッチングバルブ、１６‥スイッチングバルブ、１７‥オートサンプラー、２７‥サンプリングインジェクター
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（ＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物）
８−ＯＨ−ｄＧをはじめＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドの酸化的損傷化合物とは、生体内の活性酸素（酸素ラジカル）等によってＤＮＡやＲＮＡ又はヌクレオチドが損傷を受けた結果生じるものであり、活性酸素の指標として用いられる。８−ＯＨ−ｄＧ以外の酸化的損傷化合物としては、２−ヒドロキシデオキシアデノシン（２−ＯＨ−ｄＡ）、５−ヒドロキシデオキシシチジン（５−ＯＨ−ｄＣ）、５−ホルミルデオキシウリジン（５−ＣＨＯ−ｄＵ）、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）等が挙げられる。これら酸化的損傷化合物は、不要物として尿により生体外へ排出される。また、これらのうち８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物は負の電荷を帯びているため、後段で説明する陰イオン交換カラムにより容易に精製、回収することができる。これらの中でも活性酸素の指標として、特に８−ＯＨ−ｄＧを用いることが好ましい。なお、本出願（請求項、明細書、等）における酸化的損傷グアニン化合物とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが活性酸素によって損傷を受けた結果生じる８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等であり、酸化的損傷とはヒドロキシル化されることを示す。
【００２６】
（試料）
本発明の酸化的損傷グアニン化合物（８−ＯＨ−ｄＧを含む）と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質とを、（一時に）分析する分析方法に使用される試料としては、尿、血清、髄液、唾液、細胞培養後の培地等、全ての生体試料を挙げることができる。これらの中でも、尿は採取し易く、また尿中で酸化的損傷グアニン化合物は安定であるため、特に尿が好ましい。
【００２７】
本発明の分析方法、及びこれを実施するための分析装置について説明する。本発明の分析方法は、酸化的損傷グアニン化合物（例えば、８−ＯＨ−ｄＧ）を精製する工程と、適宜この酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質（例えば、７−ＭＧ又はＣｒｅ）を測定する工程と、この酸化的損傷グアニン化合物を測定する工程から構成される。また、本発明の分析装置は、上記の精製及び測定を行うための部材からなる。
以下、酸化的損傷グアニン化合物として８−ＯＨ−ｄＧを、またこの酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質として、７−ＭＧ及びＣｒｅを例にとって説明する。
【００２８】
（分析装置）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと、適宜７−ＭＧ及び／又はＣｒｅとを分析するための装置は、１）８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）と、２）８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置の指標となる８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカを感知し、７−ＭＧ又はＣｒｅを測定するＵＶ検出器等の検出器と、３）陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）と、４）逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定する検出器を具備する。
【００２９】
本発明の分析装置の一例の模式図を図１に示す。図中符号１１は陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）であり、これはＵＶ検出器１４、及びカラムスイッチングバルブ１６を介して、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２と接続している。また、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１の上流には、試料を注入するオートサンプラー１７が接続されたカラムスイッチングバルブ１５が接続している。
また、カラムに吸着した分子を溶出するための溶離液（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１に用いられる溶離液をＡ液、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に用いられる溶離液をＢ液とする）、上記カラムスイッチングバルブ１５に接続されたガードカラム（陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１と同一の陰イオン交換樹脂を充填）を洗浄するための洗浄液（Ｃ液）を各カラムに送り込むためのポンプ２１、２２、２３が設けられ、ポンプ２１はオートサンプラー１７、ポンプ２２はカラムスイッチングバルブ１６、ポンプ２３はカラムスイッチングバルブ１５に各々接続されている。
なお、この例において、オートサンプラー１７の代わりに、８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク感知により、カラムスイッチングバルブ１６を自動的に作動させる機能を持つサンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）等を用いることができる。
【００３０】
本発明の方法の実施において、ＨＰＬＣ−１及びＨＰＬＣ−２の二つのカラムをカラムスイッチング法により用いる場合には、通常、ＨＰＬＣ−１における酸化的損傷グアニン化合物（例えば８−ＯＨ−ｄＧ）の標準液を予めＨＰＬＣ−１に注入し、分取開始時間と、終了時間とを決定しておき、その条件を使用してＨＰＬＣ−２へ、ＨＰＬＣ−１で精製済みの酸化的損傷グアニン化合物を注入することが必要である。
一方、本発明の方法を実施にあたっては上記のような方法に代えて、２３１ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行うこともできる。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものであり（図３を参照）、予め、８−ＯＨ−ｄＧ等の酸化的損傷グアニン化合物の分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。より詳しくは、以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３１ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３１ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、バルブへ接点信号を出力し、ループ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、バルブへ接点信号を出力し、分取を終了させると同時にループ内の分画をＨＰＬＣ−２に注入する。
後段でも説明するが、サンプリングインジェクター（「２３１ＸＬ」、ギルソン製）に使用することにより、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。
【００３１】
上記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１は、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着するので回収率が非常に高く、且つほとんどの夾雑物を取り除くことができるため、不純物の少ない画分を得ることができる。また、上述したように、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１によれば、負の電荷を帯びている８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物においても、容易に精製、回収することができる。陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１としては、陰イオン交換樹脂を充填剤としたものであれば、特に制限はない。具体的な充填剤としては、スチレンジビニルベンゼン系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの、ポリヒドロキシメタクリレート系ポリマーに４級アンモニウム基が結合したもの等が挙げられる。また、市販品の充填剤としては、アミネックスＨＰＸ−７２Ｓ（ＢｉｏＲａｄ製）、Ｓｈｏｄｅｘカラム充填剤（昭和電工（株）製）、ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡＯ８Ｆ（三菱化成（株）製、ハミルトンＲＣＸ−１０）等を挙げることができる。
また、陰イオン交換樹脂の粒子径としては、現在７μｍのものにより良好な結果が得られているが、更に小粒子径（３〜５μｍ）の陰イオン交換樹脂をカラムに用いることにより、より分離能が高くなり、その結果、カラム長を短くできて、分析時間を短縮することも可能である。
【００３２】
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの内径は、特に制限はないが、約１ｍｍ〜１．５ｍｍ程度であることが好ましい。また、カラムの内径が２．０〜４．６ｍｍの場合は、図２に示すように、カラムスイッチングバルブ１６に接続したサンプリングインジェクター２７（「２３３ＸＬ」、ギルソン製等）を用いて、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識により、８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２に注入することが好ましい。なお、この方法を実施するために、２３３ＸＬに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、（１）リボヌクレオシド８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピーク認識、（２）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取開始、（３）一定時間後の８−ＯＨ−ｄＧ分取終了、（４）８−ＯＨ−ｄＧ分画のミキシング、（５）ＨＰＬＣ−２への注入を行うものであるが、より詳しくは以下のフローにより機能を実現している。
（１）２３３ＸＬにより試料をＨＰＬＣ−１に注入する。
（２）設定時間（Ｔ１）だけシステムを待機させる。
（３）２３３ＸＬがＵＶ検出器シグナルのモニターを開始する。
（４）設定ＵＶレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。
（５）ピーク感知後、設定時間（Ｔ２）だけシステムを待機させた後、２３３ＸＬバイアルチューブ内に分取を開始する。
（６）設定時間（Ｔ３）後、分取を終了させる。
（７）得られた分画を吸引、吐出により撹拌する。
（８）分画の一部をＨＰＬＣ−２に注入する。
上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの長さは、特に制限はないが、陰イオン交換樹脂の粒子径、交換容量等によって、カラムを短くすることが可能であり、分析時間を短縮することができる。
【００３３】
上記光路の短いセルを具備したＵＶ検出器１４は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から溶出される画分をモニターし、試料中に含まれる８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置を感知する。このように、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置を当該ＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させることにより、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
これと同時に、光路の短いセルを具備した当該ＵＶ検出器１４は、検出器のＵＶ波長を調整することにより、試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅを測定することができる。
【００３４】
上記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２は、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１から得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製するものであり、逆相カラムの性質を有するものであれば、特に制限はない。市販品としては、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（（株）資生堂製）等が挙げられる。
【００３５】
上記検出器１３は、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から得られた精製８−ＯＨ−ｄＧを測定するものであり、逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２の下流に設けられている。上記検出器１３としては、電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いることができる。また、上記電気化学検出器（ＥＣＤ）に関しては、２種類の設定電圧を選ぶことにより、８−ＯＨ−ｄＧのピークは固有の比率で表れるため（図４）、そのピークが８−ＯＨ−ｄＧであることを確認できる。
【００３６】
また、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと７−ＭＧ又はＣｒｅを同時に分析するための分析装置は、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することが可能である。その場合、ガードカラム３５の洗い洗浄液（Ｃ液）は、０．５Ｍ硫酸アンモニウム：アセトニトリル＝７：３程度の組成であることが好ましい。
【００３７】
以上説明したように、本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧと７−ＭＧ又はＣｒｅを同時に分析するための分析装置によれば、陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）１１が試料中に含まれる８−ＯＨ−ｄＧを特異的に吸着し、試料中に含まれる夾雑物の大半を一度に取り除くことができる。
また、ＵＶ検出器１４によって、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカの溶出位置に基づき、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取する方法は、回収率、再現性に優れているといえる。この光路の短いＵＶ検出器１４は、検出器のＵＶ波長を調整することにより、同時に８−ＯＨ−ｄＧの濃度補正物質である７−ＭＧ又はＣｒｅをも測定することができる。このため、本実施形態の分析装置は、８−ＯＨ−ｄＧと、７−ＭＧ又はＣｒｅとを同時に分析することも可能である。
また、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することができる。また、上述した分析装置は比較的安価なため経済性にも優れている。
【００３８】
（分析方法）
以下、図１に示す分析装置を用いて８−ＯＨ−ｄＧと、７−ＭＧ又はＣｒｅとの分析方法について説明する。（分取範囲（時間）の決定）８−ＯＨ−ｄＧと８−ＯＨ−ｒＧｕｏと尿との混合物を図１示す分析装置に注入し、予め、８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲を決定しておく。
分取範囲を予め決定しておくことにより、８−ＯＨ−ｄＧの正確な溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ１６を作動させるように設定することで、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。なお、上述したように、図１において、オートサンプラー１７の代わりに、サンプリングインジェクター（２３１ＸＬ）を用いた場合は、ピーク感知により８−ＯＨ−ｒＧｕｏとの相対的位置により自動的に８−ＯＨ−ｄＧの分取範囲（時間）が決定されるため、分取範囲（時間）の設定をしておく必要がない。
【００３９】
（精製方法）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第１の精製工程を有することを特徴とする。また、上述したように、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の負の電荷を有する酸化的損傷グアニン化合物においても、陰イオン交換クロマトグラフィーによって容易に精製、回収することができる。
第１の精製工程における溶出条件としては、カラム温度は５０〜６５℃、内径１ｍｍのカラムの場合、流速が１７〜２５μｌ／ｍｉｎとすることが好ましい。また、８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａの同時分析のためには、第１の精製工程における溶出液としては、カルボン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸（又はそれらの塩）を含むものを挙げることができる。中でも酢酸を含むものが好ましい。
【００４０】
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えて、精製を行うことが可能である。８−ＯＨ−ｒＧｕｏを試料中に予め添加しておくと、８−ＯＨ−ｒＧｕｏが溶出された後、一定時間後に８−ＯＨ−ｄＧが溶出されるため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出位置をＵＶ検出器１４でモニターすることによって、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置（時間）が把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。
【００４１】
また、本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法は、予め、試料に８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等を８−ＯＨ−ｄＧの内部標準マーカとして加えて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる第１の精製工程を行い、第１の精製工程で得られた８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を更に精製すること（第２の精製工程）が好ましい。
上記第２の精製工程としては、逆相クロマトグラフィーにより精製することが好ましい。逆相クロマトグラフィーに用いられる溶出液（Ｂ液）、温度条件等は、使用する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）１２によって異なるため、それらは適宜決定される。例えば、逆相カラムとして、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（Ｓ−５μｍ）（ＹＭＣ社）を用いてヒト尿を分析する場合は、カラム温度が約４０℃、流速が０．９ｍｌ／ｍｉｎ程度とすることが好ましい。
【００４２】
（測定方法）
本発明の実施形態に係る８−ＯＨ−ｄＧの測定方法は、上述した精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧの量を測定する測定工程を有し、上述した電気化学検出器（ＥＣＤ）、液体クロマトグラフィー質量分析装置（ＬＣＭＳ）等を用いて精製８−ＯＨ−ｄＧ量を測定できる。なお、上記測定方法は、８−ＯＨ−ｄＧのみならず、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ（マーカとして加えない場合）、８−ＯＨ−Ｇｕａ等の酸化的損傷グアニン化合物の測定にも適用できる。
また、連続運転を行う場合、図１に示すようなオートサンプラー１７を具備した装置においても、図２に示すようなサンプリングインジェクター２７を具備した装置においても、定期的に８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置をチェックすることが好ましい。
【００４３】
本発明の実施形態に係る７−ＭＧ又はＣｒｅの測定は、注入した試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅをＵＶ検出器１４によって測定する。
試料がマウスやラットの尿である場合は、７−ＭＧ測定のためのＵＶ検出器の波長は２５４ｎｍとしてよい。試料がヒトの尿である場合は、夾雑物と７−ＭＧを区別するため、ＵＶ検出器の波長は２５４ｎｍよりも長波長として、好ましくは、３００〜３１０ｎｍとする。Ｃｒｅ測定のためには、波長を２３５〜２６０ｎｍ、好ましくは２４５ｎｍとし、光路の短い（好ましくは０．２ｍｍ程度）セルを用いる。光路の短いセルの光路の長さとしては、０．１〜１ｍｍ程度の範囲とすることができる。
【００４４】
本発明の実施形態に係る分析方法においては、試料として尿を用いる場合、次の様な利点がある。
即ち、尿をろ紙片などに滴下し、尿を乾燥させる。ついで、この乾燥したろ紙片から尿を再抽出し、尿を分析する。
このようにすれば、尿はいずれの場所においても採取でき、乾燥したろ紙片を分析機関に郵送などの方法で送ることにより、大量の試料を効率よく分析することができる。
【００４５】
以上説明したように、本発明の実施形態に係る分析方法によれば、ＵＶ検出器１４のＵＶ波長を調整することにより、試料中の７−ＭＧ又はＣｒｅを測定することができ、これにより、８−ＯＨ−ｄＧと、この濃度補正物質である７−ＭＧ又はＣｒｅとを同時に分析することができる。
本発明の分析方法では、８−ＯＨ−ｄＧを回収率良く得られる。更に、第１の精製工程における陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）の流速が微量であるため、溶離液（Ａ液）、洗浄液（Ｃ液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。本発明の８−ＯＨ−ｄＧの精製方法によれば、確実に精製８−ＯＨ−ｄＧを分取でき、８−ＯＨ−ｄＧのピーク付近において夾雑物がほとんどない画分を得ることができる。また、連続運転を行っても、８−ＯＨ−ｒＧｕｏ等のマーカのピークを感知させる方法を用いれば、サンプル毎の分取範囲のズレに対応して、確実に８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を分取することができる。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製８−ＯＨ−ｄＧ又は８−ＯＨ−Ｇｕａ等の精製酸化的損傷グアニン化合物を測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。また、連続運転を行うことにより大量処理が可能である。
【００４６】
なお、本発明の分析方法では、７−ＭＧを定量的に測定することができる。７−ＭＧは、タバコ煙中の発癌物質によりＤＮＡ中に生じるとされ、本分析方法は発癌リスク評価の方法としても応用できる可能性がある。本発明の分析方法においては、７−ＭＧを濃度補正に用いる場合、正確には喫煙による７−ＭＧの増加分を差し引くことが好ましい。
【００４７】
なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。例えば、溶離液（Ａ液、Ｂ液）、洗浄液（Ｃ液）の組成等は、使用するカラム（充填剤）により適宜変更可能である。
本発明の酸化的損傷グアニン化合物の測定方法は、例えば、個人個人の発癌リスクの評価、活性酸素関連の様々な疾患（糖尿病等）の予測・診断、老化度、あるいは一般的健康の評価に用いることができる。
上記測定方法により得られた結果の評価方法として、例えば８−ＯＨ−ｄＧの場合、８−ＯＨ−ｄＧ標準溶液を随時、尿試料の他に分析装置に注入し、そのピーク面積との比較により算出された試料中の８−ＯＨ−ｄＧ濃度を、ＵＶ検出器によって同時に測定された７−ＭＧ又はＣｒｅの濃度で割った値として算出する。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（尿試料の調製）
ヒトの尿を１ｍｌずつ２本のエッペンドルフチューブに取り、−２０℃で凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その１００μｌを取り、微酸性溶液（組成；０．６ｍＭ硫酸を９６ｍｌ、アセトニトリル４ｍｌ）で２倍に希釈し、８−ＯＨ−ｒＧｕｏを１２μｇ加えた。更に２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）を６．７μｌ加え、ｐＨを７以下にした。これをよく攪拌し、５℃で２〜３時間冷却後、１５０００回転、５分間遠心分離を行い、その上清を尿試料とした。なお、遠心した尿を直接２３１ＸＬ等のサンプリングインジェクターにセットし、希釈、ミクシング、注入を自動化することも可能である。
【００４９】
（８−ＯＨ−ｄＧの精製・分画と７−ＭＧ又はＣｒｅの測定）
この尿試料２０μｌを陰イオン交換カラム（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡ０８Ｆ、粒径７μｍ、ｓｕｌｆａｔｅ型）内径１．５ｍｍ、ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）によって精製した。カラムの温度は６５度とし、流速は５０μｌ／分とし、溶出液は０．３ｍＭの硫酸（２％アセトニトリルを含む）を用いた。
この分離により、ＵＶ検出器（「ＵＶ／ＶＩＳ−１５５」、ギルソン製）（吸光波長３０５ｎｍ及び２４５ｎｍ）を用いて、それぞれ７−ＭＧとＣｒｅを検出した。この分析における８−ＯＨ−ｒＧｕｏピーク認識は、３０５ｎｍにより行った。検出の結果を図３に示す。
【００５０】
図３に示すように、７−ＭＧとＣｒｅのピークが検出され、本実施例により、７−ＭＧとＣｒｅが測定できることが分かった。また、８−ＯＨ−ｄＧは、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出から一定の時間差を置いて溶出された。そのため、８−ＯＨ−ｒＧｕｏの溶出をモニターすることにより、正確な８−ＯＨ−ｄＧの溶出位置を把握でき、確実に８−ＯＨ−ｄＧを有する画分を得ることが可能であることが分かった。
【００５１】
（８−ＯＨ−ｄＧの精製と測定）
上記の、陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た８−ＯＨ−ｄＧを含有する画分を自動的に逆相クロマトグラフィーに注入した。なお、逆相カラムとして、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ（Ｓ−５μｍ）（２５０ｘ４．６ｍｍ）を用い、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７；これは０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）を希釈して調製したものであり、ｐＨは多少異なる）、５％メタノール（ＭｅＯＨ）溶離液（Ｂ液）を用い、カラム温度は４０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎとした。その分離パターンを図４に示す。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ＥＳＡ Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ ＩＩ」、ＥＳＡ社）（電圧：ガードセル３５０ｍＶ；チャンネル１、１７０ｍＶ；チャンネル２、３００ｍＶ）を用いて検出した。
【００５２】
図４に示すように、８−ＯＨ−ｄＧのピークが検出され、本実施例により、８−ＯＨ−ｄＧが測定できることが分かった。
上記図３により得られた７−ＭＧ又はＣｒｅのピークの面積と、図４より得られた８−ＯＨ−ｄＧのピークの面積から、（８−ＯＨ−ｄＧ／７−ＭＧ）又は（８−ＯＨ−ｄＧ／Ｃｒｅ）の値を算出し、これをもって、酸化的ＤＮＡ損傷の指標とすることができる。
【００５３】
（８−ＯＨ−ｄＧ及び８−ＯＨ−Ｇｕａの同時分析）
遠心したヒト尿をサンプリングインジェクター２３１ＸＬにセットし８−ＯＨ−ｒＧｕｏ（１２０ｍｇ／ｍｌ）を含む微酸性希釈液（組成；１２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）溶液９９ｍｌ；アセトニトリル１ｍｌ）で自動的に希釈（１：１）、ミクシング、ＨＰＬＣ−１への注入（２０μｌ）を行った。カラムは陰イオン交換カラム（ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＡ０８Ｆ、粒径７μｍ、ａｃｅｔａｔｅ型；内径１．５ｍｍ、ガードカラムの長さ４ｃｍ、本カラムの長さ１２ｃｍ）を用い、カラム温度は５５℃とし、流速は５０μｌ／分とし、溶離液は０．５％アセトニトリルを含む５ｍＭ酢酸を用いた。８−ＯＨ−ｒＧｕｏのピーク認識により分取された８−ＯＨ−ｄＧ、８−ＯＨ−Ｇｕａ分画は自動的にＨＰＬＣ−２に注入された。カラムはＩｎｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３、粒径３μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ２５ｃｍ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）を用い、カラム温度は３０℃とし、流速は０．７ｍｌ／分とし、溶離液はＥＤＴＡ・３Ｎａ塩・３水和物（５０ｍｇ／ｌ）および８％メタノールを含む１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム溶液を用いた。なおこの分析例においてはＥＣＤはエイコム社（京都）製ＥＣＤ−３００を用いた（設定電圧、５５０ｍＶ）。
結果を図５に示した。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の分析方法は、尿等の生体物質の分析業界において用いることができる。本発明の分析装置は、分析機器の業界において用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項２】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）である請求項１記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項３】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、
前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項４】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、
前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）である請求項３に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項５】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位置を感知し、適宜、前記試料中に含まれる前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、
前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項６】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、
前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）であり、
前記マーカが、８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）である請求項５に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項７】
前記試料が尿である請求項１に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項８】
前記試料が尿である請求項３に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項９】
前記試料が尿である請求項５に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１０】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項７に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１１】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項８に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１２】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項９に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程において、カルボン酸型のカラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１４】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により精製された前記酸化的損傷グアニン化合物を含む分画を、更に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）により精製する工程；及び
ＨＰＬＣ−２により精製された精製酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程；
を更に有する請求項１乃至１２の何れか一項に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１５】
１）試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）；
２）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製して得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を、更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）；及び
３）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）で精製して得られた精製酸化的損傷グアニン化合物を測定する検出器；
を備えたことを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析装置。
【請求項１６】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器が、光路の短いセルを備えた検出器である、請求項１５記載の分析装置。
【請求項１７】
予め試料中に加えておいたマーカのピークシグナルを検出器より受け、一定時間後の酸化的損傷グアニン化合物の溶出時にバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、
更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、
次いで、得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から溶出する前記酸化的損傷グアニン化合物を精製・回収する処理を行わせるための酸化的損傷グアニン化合物の分析機構（制御プログラムを含む）。
【請求項１】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項２】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）である請求項１記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項３】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
前記試料中に含まれる、前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、
前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項４】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、
前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）である請求項３に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項５】
試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程と、
予め前記試料中に加えておいたマーカの溶出位置を感知し、適宜、前記試料中に含まれる前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質を検出器で測定する工程と、
前記酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程とを有し、
前記酸化的損傷グアニン化合物と前記濃度補正物質とを一時に分析することを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項６】
前記酸化的損傷グアニン化合物が、８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）及び／又は８−ヒドロキシグアニン（８−ＯＨ−Ｇｕａ）であり、
前記酸化的損傷グアニン化合物の濃度補正物質が、７−メチルグアニン（７−ＭＧ）及び／又はクレアチニン（Ｃｒｅ）であり、
前記マーカが、８−ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（８−ＯＨ−ｒＧｕｏ）である請求項５に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項７】
前記試料が尿である請求項１に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項８】
前記試料が尿である請求項３に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項９】
前記試料が尿である請求項５に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１０】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項７に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１１】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項８に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１２】
前記尿を紙片に滴下して乾燥させたものを再抽出することにより分析する請求項９に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１３】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製する工程において、カルボン酸型のカラムおよびカルボン酸又はその塩を含む溶出液を用いる請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１４】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により精製された前記酸化的損傷グアニン化合物を含む分画を、更に逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）により精製する工程；及び
ＨＰＬＣ−２により精製された精製酸化的損傷グアニン化合物を検出器で測定する工程；
を更に有する請求項１乃至１２の何れか一項に記載の酸化的損傷グアニン化合物の分析方法。
【請求項１５】
１）試料中に含まれる、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はヌクレオチド中のグアニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グアニン化合物を特異的に吸着する陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）；
２）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）で精製して得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を、更に精製する逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）；及び
３）前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器、及び前記逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）で精製して得られた精製酸化的損傷グアニン化合物を測定する検出器；
を備えたことを特徴とする酸化的損傷グアニン化合物の分析装置。
【請求項１６】
前記陰イオン交換カラム（ＨＰＬＣ−１）により酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を得るために用いる検出器が、光路の短いセルを備えた検出器である、請求項１５記載の分析装置。
【請求項１７】
予め試料中に加えておいたマーカのピークシグナルを検出器より受け、一定時間後の酸化的損傷グアニン化合物の溶出時にバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、
更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、
次いで、得られた酸化的損傷グアニン化合物を含有する分画を逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）へ注入するためのシグナルを出力し、該逆相カラム（ＨＰＬＣ−２）から溶出する前記酸化的損傷グアニン化合物を精製・回収する処理を行わせるための酸化的損傷グアニン化合物の分析機構（制御プログラムを含む）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５０１９１
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５５６６（Ｐ２００５−５１５５６６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５８２６
【国際出願日】平成１６年１０月２６日（２００４．１０．２６）
【出願人】（５０２０９３２３２）
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１５８２６
【国際出願日】平成１６年１０月２６日（２００４．１０．２６）
【出願人】（５０２０９３２３２）
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