重金属蓄積能を有する植物体及び土壌浄化方法
【課題】植物体の重金属蓄積能及び耐性を強化する。
【解決手段】鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入した植物体である。
【解決手段】鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入した植物体である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソバ由来の重金属（特に鉛）蓄積能を有する植物体及びこの植物体を用いた土壌浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、汚染土壌中の重金属を植物体に蓄積して除去する汚染土壌の浄化技術（ファイトレメディエーション）において、他の生物由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡを植物体に導入して当該植物体の重金属蓄積能及び耐性を強化する技術がある（特許文献１〜３参照）。この重金属輸送タンパク質は、植物体の地下部（根）が吸収した重金属を地上部（葉）へ輸送する重金属輸送活性を有する。このため、前記ＤＮＡを導入して形質転換した植物体は、この重金属輸送タンパク質の発現によって、土壌中の重金属を地下部から吸収して地上部に蓄積しつつ大きく生育する。この生育後の植物体を収穫することにより、効率良く汚染土壌から重金属を除去することができる。
【０００３】
ところで上述の汚染土壌は、一般に複数種類の重金属や有害物質（例えば、鉛、カドミウム、シアン、六価クロムなどの酸化クロム、砒素又は水銀）を含有する。特にバッテリ工場や射撃場跡地などの特殊な汚染土壌では、特定の重金属（例えば鉛）だけが許容値を超える高濃度で含有しており、他の重金属（例えばカドミウムや酸化クロム）が許容値以下で含有している場合もある。例えば射撃場跡地には土壌中に鉛弾が混入しているので、土壌中の鉛含有量が数千から数万ｍｇ／ｋｇになることもある。このように鉛だけを多く含有する汚染土壌では、鉛以外の重金属を除去することなく、高濃度の鉛だけを選択的に除去することが効率良く土壌を浄化する上で理想的である。
【特許文献１】特開２００３−２１００５７号
【特許文献２】特表２００３−５２７８６２号
【特許文献３】特表２００５−５０５３０２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、重金属輸送タンパク質の中でも、ファイトレメディエーションに有効なものとそうでないものがあり、重金属輸送タンパク質を導入して形質転換した植物体が必ずしも実用に耐え得る重金属蓄積能及び耐性を有するものではない。
さらには、複数の重金属に対して蓄積能を発揮する植物体の報告（特許文献３）はあるが、特定の重金属（例えば鉛）を選択的に蓄積する植物体の報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ソバ由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡをソバ以外の植物体に導入することで、当該植物体の重金属蓄積能及び耐性を強化できることを見出した。さらにソバ由来の重金属輸送タンパク質を導入した植物体が、特定の重金属を選択的に蓄積することを見出した。
すなわち上記課題を解決するための手段として、本発明の第１発明は、鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入して形質転換してなる植物体である。この植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強い重金属蓄積能及び耐性を発揮する。
【０００６】
また、本発明の第２発明の植物体は、第１発明に記載の植物体であって、前記ＤＮＡが、以下の（Ａ）又は（Ｂ）である。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡを導入した植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡに対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛を蓄積する一方で、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない）ことができる。
【０００７】
また、本発明の第３発明の土壌浄化方法では、第１発明又は第２発明に記載の植物体を、重金属で汚染状態の土壌にて生育したのち収穫することで、土壌から重金属を効率良く除去（特に鉛を選択的に除去）する。
【発明の効果】
【０００８】
第１発明によれば、重金属蓄積能及び耐性を強化した植物体を提供することができる。第２発明によれば、特定の重金属を選択的に除去する植物体を提供することができる。第３発明によれば、植物体により、汚染土壌から重金属を効率よく除去（特に鉛を選択的に除去）することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を実施するための最良の形態を説明する。
本実施の形態では、宿主植物体（ソバ以外の植物体）に、「鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を導入することで形質転換する。このように形質転換した宿主植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）重金属蓄積能及び耐性を発揮することとなる。
更に、後述の（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡを導入して形質転換した宿主植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛は効率良く蓄積するが、カドミウムや酸化クロムはほとんど蓄積しない）。
【００１０】
ここで、宿主植物体の種類は特に限定しないが、例えば、アブラナ科、アオイ科、マメ科、アカザ科、ナス科、キク科、ヒユ科又はイネ科の植物を宿主植物体として使用可能である。具体的には、ケナフ、ヒマワリ、ソルガム、ネピアグラス、タバコ、カラシナ、イネ、ポプラ、ナタネ、アブラナ、菜の花、シロイヌナズナ又はユリノキを宿主植物体として用いることができ、好ましくは、宿主植物体の生育が早い一年生植物または多年生植物であることが好ましい。
また宿主植物体は、ソバよりも大きく育つか、またはソバよりも環境に対する耐性が高いことが好ましく、例えば、ケナフ、ヒマワリ、ソルガム又はネピアグラスを宿主植物体として用いることが好ましい。
さらに宿主植物体は、アブラナ、ナタネ及び菜の花など油料系植物であることが好ましい。すなわち、油料系植物の生育によって汚染土壌の浄化を達成できると同時に、収穫した油料系植物を燃料原料として用いることもできる。
【００１１】
一方、ソバとは、普通ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ダッタンソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ）及びシャクチリソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍ）などの重金属（特に鉛）蓄積能又は耐性を有するタデ科ソバ属植物である。このようなソバの重金属（特に鉛）蓄積能又は耐性は後述の重金属輸送活性を有するタンパク質に由来する。
【００１２】
そして「重金属輸送活性を有するタンパク質」とは、ＡＴＰ駆動型のＡＢＣ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質に属するＡＢＣトランスポータである。具体的には、「重金属輸送活性を有するタンパク質」とは、例えば、多剤耐性関連タンパク質{Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）}、ＭＲＰのサブファミリーであるアニオントランスポータ{Ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅr（ｃＭＯＡＴ）}、多剤耐性関連ファクタ{Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ（ＭＤＲ）}、嚢胞性線維性膜貫通調節因子{Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏr（ＣＦＴＲ）}またはスルホニル尿素受容体{Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＳＵＲ）}のいずれかであって、且つ重金属輸送活性を有するタンパク質である。
そして、上述の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）は、それにより形質転換した宿主植物体に特定の重金属を選択的に除去する選択性を付与するため、「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質」として好ましい。
【００１３】
そして「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」は、上述の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）をコードするＤＮＡが好ましく、具体的には（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有することが好ましい。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有する。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列｛例えば、表１に表記の１）〜１８）のプライマを参照｝からなるＤＮＡあるいはその相補鎖（それらを総称してプローブと呼ぶ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。
（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡを導入した宿主植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛を蓄積する一方で、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない）ことができる。
【００１４】
ここで（Ｂ）に記載のプローブと「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」ＤＮＡ（ホモログ遺伝子）とは、０．７〜１．０ＭＮａＣｌ存在下又は５０％ホルムアミド存在下、３７℃〜４２℃又は４２℃〜６５℃でハイブリダイズするＤＮＡのことである。
なお、ハイブリダイズの手法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などの各種手法{例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅl ｅｔ ａｌ．，（１９８７）を参照}を用いることができる。
【００１５】
さらに「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ＤＮＡは、換言すると、配列番号１に記載の塩基配列と一定の相同性を有するＤＮＡである。一定の相同性を有するＤＮＡとは、例えば配列番号１に記載の塩基配列と５０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するものである。
【００１６】
ここで「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」を同定する手順について説明すると、例えば、ソバ由来の染色体ＤＮＡライブラリまたはソバ由来のｃＤＮＡライブラリを含むコロニーを固定化したフィルタを用意する。このフィルタに対して、０．７〜１．０ＭＮａＣｌ存在下６５℃で上記プローブ（蛍光標識又はＲＩ標識）をハイブリダイズする。そしてハイブリダイズ後のフィルタを、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（０．３ＭＮａＣｌを含む０．０３Ｍクエン酸ナトリウム水溶液）を用いて洗浄する。洗浄後のフィルタを蛍光又ＲＩ検出することにより、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」を同定することができる。
【００１７】
そして、上述の「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を宿主植物体に導入することにより、当該宿主植物体を形質転換する。
ここで「ソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を宿主植物体に導入してタンパク質を発現するための発現ベクターは、宿主植物体との組み合わせを考慮して適宜選択することができる。例えば発現ベクターとして、宿主植物体の染色体中に発現可能にＤＮＡを組み込み可能な染色体組込型ベクターや、宿主植物体の細胞内において自立複製可能なプラスミドを好適に使用可能である。
具体的には、植物細胞用の発現ベクターとして、アグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ（特開２００６−３２５４２８号公報参照, Ｊ． ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ｖｏｌ．１０４，ｐｐ３４−４１, ２００７）、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ，ｖｏｌ．１５， ｐｐ８０９８１４，１９９５）、ｐＢＩ１２１（ＥＭＢＯ Ｊ． ｖｏｌ．６， ｐｐ３９０１−３９０７，１９８７）、ｐＬＡＮ４１１またはｐＬＡＮ４２１（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ．１０， ｐｐ２８６−２９０，１９９１）を好適に使用可能である。
【００１８】
また発現ベクターのプロモータは、その下流に位置する「ソバ由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡ」を転写可能である限りどのようなプロモータを用いてもよい。例えば、発現ベクターのプロモータとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｖｏｌ．２２０， ｐｐ３８９−３９２，１９９０を参照）を使用可能であり、同プロモータによれば、宿主植物体中で上述のＤＮＡを恒常的に発現する（過剰に発現する）ため使用するプロモータとして好ましい。
【００１９】
そして、上記発現ベクターを宿主植物体に導入する方法は宿主植物体に合わせて適宜変更可能である。例えば、アグロバクテリウム法（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法）、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、ＰＥＧ法又は直接マイクロインジェクション法のいずれかの手法を用いて発現ベクターを宿主植物体に導入可能である。
【００２０】
そして、このようにして形質転換した宿主植物体を、重金属を含有の汚染土壌（地面を有する領域又は水性・半水性の領域のいずれも含む）にて生育したのち収穫する。
ここで宿主植物体を生育するとは、宿主植物体を重金属の蓄積が可能な状態で維持することであり、必ずしも宿主植物体が増殖することを要しない。このように形質転換した宿主植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）重金属蓄積能及び耐性を発揮することができる。
【００２１】
さらに本実施の形態の土壌浄化方法によれば、（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡにより形質転換した宿主植物体を生育及び収穫することで、汚染土壌から重金属を除去（特に鉛を選択的に除去）することができる。このため本実施の形態の土壌浄化方法は、バッテリ工場や射撃場跡地などの特殊な汚染土壌｛特定の重金属（例えば鉛）だけが許容値を超える高濃度で含有しており、他の重金属（例えばカドミウムや酸化クロム）が許容値以下で含有している土壌｝に好適に使用可能である。
【００２２】
［実施例］
以下、本実施の形態を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例に限定されない。
［ＭＲＰをコードするＤＮＡのクローニング］
ソバ由来多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）をコードするＤＮＡ（以下、ＦｅＭＲＰ３遺伝子と呼ぶ）のクローニング手法を（１）〜（３）の順に説明する。
（１）ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡの採取
パウダー状に磨り潰した普通ソバの葉５０ｍｇ〜１００ｍｇと、ＲＮＡ抽出用試薬１ｍｌ（商品名：ＩＳＯＧＥＮ、日本ジーン社製）を遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）に入れて撹拌した後、５０℃で１０分間保温したものをサンプルとした。このサンプル１ｍｌにクロロホルム２００μｌを加えて撹拌及び静置（室温）した後１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心分離（微量高速冷却遠心機 ＭＲＸ−１５０、トミー精工株式会社製）してサンプルの上澄み液を得た。この上澄み液に１０Ｍ塩化リチウム（ＬｉＣｌ）２００μｌを加えて撹拌、冷却及び静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)し、上澄み液と多糖類を除去したＲＮＡ沈殿物を得た。このＲＮＡ沈殿物を、ＤＥＰＣ水(ＤＥＰＣ処理した滅菌済み超純水)４００μｌに溶解した後、イソプロパノール４００μｌを加えて遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)し、その上澄み液を取り除いた後、更に７０％エタノール１８０μｌを加えて撹拌し、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)してリンスした。リンス後のＲＮＡ沈殿物を乾燥させた後、ＤＥＰＣ水４００μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）４０μｌ、１００％エタノール１ｍｌ（−２０℃）を加えて振盪し、−７０℃で１時間冷却して遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)して再度リンスした。
リンス後のＲＮＡ沈殿物に、７０％エタノール１８０μｌ（−２０℃）を加えて撹拌、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)して精製ＲＮＡ沈殿物を得た。この精製ＲＮＡ沈殿物からエタノールを取り除いて室温で５分間乾燥させた後、ＤＥＰＣ水１８μｌに溶解したものを「ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡ」溶液とした。
【００２３】
（２）ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートの作成
上述のｔｏｔａｌＲＮＡ溶液１８μｌを遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）へ入れ、オリゴｄＴアンカプライマ（表１を参照）２μｌを加えた。この溶液を、サーマルサイクラ（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ、ＴａＫａＲａ社製）にて６５℃で５分間保温し、氷上で冷却した後、逆転写用試薬｛５×ＲＴａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ Ｂｕｆｆｅｒ６μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ２μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１μｌおよびＲＴａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ１μｌ（商品名：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ社製）｝と４２℃で１時間反応させて「ソバ由来のｃＤＮＡテンプレート」を得た。
【００２４】
（３）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列（配列番号１）の決定
本実施例では、他種間で相同性の高いプライマ（表１）を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を解読し、さらにＲＡＣＥ法にてＦｅＭＲＰ３遺伝子の全塩基配列を解読した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（ａ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部解読
上記（２）で調整したｃＤＮＡテンプレートに対して、表１に記載のプライマＭＲＰ５’−１、プライマＭＲＰ３’−１及びＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑＴＭ、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子断片の増幅を行った。
なおＦｅＭＲＰ３遺伝子断片の増幅は、ＰＣＲ用プログラム温度制御装置（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＥＰＣ水１８．３μl、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）２．５μl、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（添付試薬）１μl、５’側ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１μｌ、３’側ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１μl、テンプレートＤＮＡ１μl、 ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑＴＭ（５ｕｎｉｔｓ／μl, ＴＡＫＡＲＡ）０．２μlであった。またＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→５５℃（１分）→７２℃（１分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
【００２７】
ここで、上述のプライマＭＲＰ５’−１及びプライマＭＲＰ３’−１は、他生物由来ＭＲＰのアミノ酸配列を比較し、各生物間で保存性の高い領域のアミノ酸配列を基に作成したものである。なお、他生物由来ＭＲＰとして、ヒトＭＲＰ（ＭＲＰ１， ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｐ３３５２７）、ラットＭＲＰ（ＲｔＣＭＯＡＴ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ４２０８７）、酵母ＭＲＰ（ＹＣＦ１ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｐ３９１０９）、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ６７３１９、ＡｔＭＲＰ３ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ４９７９１）の報告がある。
【００２８】
次に（３）(ａ)で増幅のＦｅＭＲＰ３遺伝子断片に対して、プライマＭＲＰ５’ＲＡＣＥ−１と、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２２９７と、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６０℃（１分）→７２℃（２分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
続いて、ＦｅＭＲＰ３遺伝子断片に対して、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２４３５とプライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ１５４５を用い、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６０℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。
ここで上述のプライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２２９７は、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１，３）の中流域で保存されているアミノ酸配列を基に作製し、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ１５４５は、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１，３）の上流域で保存されているアミノ酸配列を基に作製した。
このような手順によりＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を得てそれを解読した。
【００２９】
（ｂ）ＲＡＣＥ法を用いたＦｅＭＲＰ３遺伝子の全配列の解読
（ｉ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子３’末端の解読
ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を基に設計したプライマＭＲＰ５’と、オリゴｄ（Ｔ） ＳＸＸ−アンカプライマと、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６３℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。
【００３０】
（ｉｉ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子５’末端の解読
プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２４３５を使用して上記（１）のｔｏｔａｌＲＮＡを上記（２）の方法で逆転写（４２℃で１時間）し、ｃＤＮＡ溶液を得た。このｃＤＮＡ溶液を、カラム（商品名：ＱＩＡＥＸ(R)ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに附属のカラム、ＱＩＡＧＥＮ社製）に通してｄＮＴＰを除去した。ｄＮＴＰを除去した溶液中のｃＤＮＡ３’末端に、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてポリＣを付加した。この操作は、サーマルサイクラ（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ、ＴａＫａＲａ社製）にて行った。
そしてポリＣを付加のｃＤＮＡ溶液２４μｌを９４℃で３分間加熱し、すぐに氷上に移した。これにＴｄＴを１μl加えて３７℃で２０分間反応後、７０℃で１０分間処理しＴｄＴを失活させた。このｃＤＮＡ溶液を５’ＲＡＣＥ用テンプレートとして用いた。
そして５’ＲＡＣＥ用テンプレートと、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ ２４１５及びプライマＭＲＰ−Ｐ １５９３（５’側プライマ）と、オリゴｄ（Ｇ）アンカプライマ及びオリゴｄ（Ｇ） アンカ ＮＢＥプライマ（３’側プライマ）とを用いてＰＣＲ反応を２回行った。一回目のＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６５℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。二回目のＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６５℃（１分）→７２℃（２分）｝×２５サイクル→７２℃（５分）とした。
このような手順によりＦｅＭＲＰ３遺伝子の全塩基配列（配列番号１）を得てそれを解読した。そして、解読済のＦｅＭＲＰ３遺伝子をプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入して、ＦｅＭＲＰ３遺伝子のオープンリーディングフレーム全長を含む「プラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３」を得た。
【００３１】
［ＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入した酵母の重金属耐性試験］
（１）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の酵母用発現系プラスミド（ｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ）の構築
上述のプラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３と、プライマＭＲＰ−５'Ｋｐｎ１と、プライマＭＲＰ−３‘ＳａｌＩを用いてＰＣＲを行い、ＦｅＭＲＰ３遺伝子の５’末端にＫｐｎＩ配列を付加し、その３’末端にＳａｌＩ配列を付加した。そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩを用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子を切り出し、同様に酵母発現用シャトルベクターｐＫＴ１０−Ｇａｌ−ＨＡ−ＢＳ（Ｋ．Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５、以下単に「発現ベクターｐＫＴ１０」とも呼ぶ）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化した。そして制限酵素処理したＦｅＭＲＰ３遺伝子と酵母発現用シャトルベクターをアガロースゲルにて電気泳動の後、それぞれの分子量に対応のバンドを含むゲル断片より両者を各々抽出した。
ＦｅＭＲＰ３遺伝子と酵母発現用シャトルベクターのライゲーションは、市販のＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、ＴａＫａＲａ社製）を用いて行った。ライゲーション後の反応液によって大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｍｅｄｉｕｍ）にて生育の大腸菌ＤＨ５αコロニーをさらにＬＢ／Ａｍｐ液体培地にて培養し、培養後の菌体から「酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ」を得た。
【００３２】
（２）出芽酵母へのプラスミド導入（酢酸リチウム法）
ＹＰＤ液体培地（Ｙｅａｓｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）５ｍｌに出芽酵母デルタ（Δ）ＹＣＦ１（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社製）のシングルコロニーを懸濁し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で１５時間振盪培養を行い、出芽酵母デルタＹＣＦ１の前培養液を得た。この前培養液２．５ｍｌをＹＰＤ液体培地５０ｍｌに加え、６００ｎｍにおける吸光度が０．８となるまで培養した。この培養液を遠心チューブ（５０ｍｌ容）に移し、３０００ｒｐｍ、１５℃で遠心分離（マイクロ冷却遠心機 3700、株式会社久保田製作所）を５分間行った。培養液の上清を除いた後滅菌水５ｍｌを加え、よく懸濁して遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５℃、５分間）を行い、更に１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液１ｍｌを加え、１１０ｒｐｍ、３０℃で４５分振盪して細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液１００μｌに、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ１．０μｌを加えた。更に細胞懸濁液にサケ精子ＤＮＡ（１ｍｇ ｍｌ−１）５０μｌを加えて混合した後、ＰＥＧ／ＴＥ／酢酸リチウム溶液７００μｌを加えて３０℃で１時間保温し、酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを出芽酵母デルタＹＣＦ１に導入した。
【００３３】
（３）鉛耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例１の酵母として、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３-ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。すなわち、実施例１の酵母培養液{ＹＮＢ−Ｕｒａ−液体培地（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ−ｕｒｅａ ｍｅｄｉｕｍ）で振盪培養（３０℃、１５０ｒｐｍ）}の菌体濃度を、ＤＥＰＣ水でＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛{Ｐｂ（ＮＯ３）２}を添加したＹＰＤ寒天培地に各々スポットした。これら各培地を５日間培養して、形質転換酵母の生育阻害を観察した。試験は４連で行った。
なお上記出芽酵母において、ＭＲＰの発現を誘導する場合はガラクトース（Ｗａｋｏ社製）をＹＰＤ寒天培地に加え、ＭＲＰの誘導を抑制する場合はグルコース（Ｗａｋｏ社製）２０ｇＬ−１をＹＰＤ寒天培地に加えた。
また比較例１の酵母として、空の発現ベクターｐＫＴ１０（ＦｅＭＲＰ３遺伝子を未挿入）を導入した出芽酵母を用いて、実施例１と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３４】
（４）カドミウム耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例２の酵母として、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。実施例２の培養液の菌体濃度をＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜６０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を添加したＹＰＤ寒天培地に各々スポットした。これら各培地を３日間培養して、形質転換酵母の生育阻害を観察した。試験は４連で行い、他の条件は、上述の鉛耐性試験と同一とした。
また比較例２として、空の発現ベクターｐＫＴ１０を導入した出芽酵母を用いて、実施例２と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３５】
（５）酸化クロム耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例１２の酵母として、酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。形質転換酵母はウラシル要求性によって選抜し、ＹＮＢ−Ｕｒａ−培地で生育可能な株を使用した。
そしてＹＮＢ−Ｕｒａ−液体培地（３０℃、１５０ｒｐｍの条件）で培養した形質転換酵母の培養液を、滅菌超純水でＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜９００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム（ＶＩ） （ＣｒＯ３）を添加したＹＮＢ−Ｕｒａ−寒天培地(発現誘導用２０ｇＬ−１ｇａｌａｃｔｏｓｅ含有)に各々スポットした。これら各培地を、３日間（７２ｈｒ）、３０℃で培養したのち、形質転換酵母の生育阻害を観察した。
また比較例１２として、空の発現ベクターｐＫＴ１０を導入した出芽酵母を用いて、実施例１２と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３６】
［シロイヌナズナ（宿主植物体）の鉛刺激によるＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現量変化］
本実施例においては、アグロバクテリウム法を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子をシロイヌナズナに導入した。遺伝子導入ベクターとして、アグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ２（島根大学遺伝子実験施設より分譲）を用いた。ＴｉプラスミドへのＦｅＭＲＰ３遺伝子の導入は、ｐＥＮＴＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の方法に従い、（ｉ）エントリークローンの作成、（ｉｉ）エントリークローンを用いたＬＲ（ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）反応による相同組換えの２段階の反応を経て行った。
【００３７】
１）エントリークローンの構築
上述のプラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３と、５’末端側プライマ{ＭＲＰ Ｇａｔｅｗａｙ ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣ−３’（Ｆｏｒｗａｒｄ）}と、プライマＭＲＰ−３‘Ｓａｌｌを用いてＰＣＲを行い、ＦｅＭＲＰ３遺伝子を増幅した。この増幅操作にはＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ社製）を使用し、ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（０．５分）→６０℃（０．４分）→７２℃（４分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
そして増幅したＦｅＭＲＰ３遺伝子を、電気泳動の後、「Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて抽出した。この抽出液を用いて、「ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（ｐＥＮＴＥＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）を行いてプラスミドｐＥＮＴＥＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにＦｅＭＲＰ３遺伝子を連結した。ＦｅＭＲＰ３遺伝子を連結したプラスミドにて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、カナマイシン５０ｍｇＬ−１（Ｗａｋｏ社製）を含むＬＢ寒天培地で一晩培養し、「エントリークローン（ｐＥＮＴＥＲ−ＦｅＭＲＰ３による形質転換大腸菌）」を得た。
【００３８】
２）発現ベクター（ｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３）の構築
あらかじめ制限酵素ＸｈｏＩで消化した直鎖状のアグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ２と、上述のエントリークローンを用いてＬＲ反応による相同組換えを行い、エントリークローンの大腸菌を形質転換した。そして、カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１（Ｗａｋｏ社製）を含むＬＢ寒天培地上で一晩培養し形質転換した大腸菌より、「発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３」を得た。
【００３９】
３）発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３の導入（エレクトロポレーション法）
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１株の遺伝子導入用細胞（コンピテントセル）を調製した。
寒天培地のアグロバクテリウム一白金耳分をＬＢ液体培地５ｍｌに懸濁し、一晩振盪培養（３０℃、１５０ｒｐｍ）した。この培養液１ｍｌをＬＢ液体培地５０ｍｌに加え、３０℃でＯＤ６００=０．６になるまで振盪培養を行った。この振盪培養液を氷冷した遠心チューブ（５０ｍｌ容）に移し、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離（微量高速冷却遠心機 ＭＲＸ−１５０,トミー精工株式会社）を行った。振盪培養液の上清を除いた後、沈殿（アグロバクテリウム）を氷冷１０％グリセロール（ｗ／ｖ）２０ｍｌに懸濁し、遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）を行った。この操作を３回繰り返し、１０％グリセロール１２５μｌを加えて懸濁して「アグロバクテリウムＧＶ３１０１株のコンピテントセル」を得た。
【００４０】
そして上述のコンピテントセルに、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３のＤＮＡ液１μｌを加え、アグロバクテリウムの形質転換設定下でエレクトロポレーション（Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｌｓｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を行い、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３をコンピテントセルに導入した。形質転換後のサンプル全量をＬＢ培地１ｍｌへ移し、３０℃で１時間振盪培養を行った。この培養液１００μlをＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含有）に塗布し、３０℃（暗条件）で２日間培養した。得られた形質転換アグロバクテリウムをＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含む）５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間培養して「形質転換アグロバクテリウム」を得た。
なお、この形質転換アグロバクテリウムより抽出したプラスミドと、５’末端側プライマと、３’末端側プライマを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動することで、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３がコンピテントセルに導入したことを確認した。
【００４１】
４）シロイヌナズナの形質転換（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法）
上述の形質転換アグロバクテリウムは、ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含む）で前培養（５ｍｌ）を１日、本培養を１日、３０℃で行った。培養液５００ｍｌを集菌し、浸潤用懸濁培地で１回洗浄し、再び懸濁したものを形質転換アグロバクテリウムの懸濁液とした。
一方、シロイヌナズナは、播種して４週間生育して花茎の高さが１０ｃｍ程度になった摘心済のものを用いた。このシロイヌナズナ（結実している花や鞘を除去したもの）を逆さまにして形質転換アグロバクテリウムの懸濁液に２〜３秒ほど浸して感染させた。そして感染後のシロイヌナズナを、水飽和状態にして２２℃の暗所で２日間静置したのち、水を与えて長日条件下に戻して栽培した。この感染シロイヌナズナを「形質転換第０世代目（Ｔ０世代）」とした。
そしてＴ０世代より得た種子をエタノール７００ｍｌＬ−１で懸濁し、軽く遠心して種子を沈殿させた（以下の操作はクリーンベンチ内で実施）。この懸濁液の上清を取り除き、滅菌水を加えて遠心するという操作を３回繰り返して種子をリンスした。リンス後の種子を、１ｇＬ−１アガロース（Ｗａｋｏ社製）水溶液にて懸濁し、１／２×ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）寒天選択培地（ハイグロマイシンＢ ５０ｍｇＬ−１を含む）に播種し４℃で一晩低温処理した後、２２℃の長日条件下で栽培した。この選択培地において育つ形質転換シロイヌナズナ（Ｔ０世代より得た種子から育つ形質転換体）を「形質転換第１世代目（Ｔ１世代）」とした。
なお特に断りのないかぎり、Ｔ（ｎ）世代より得た種子から上記条件にて生育の形質転換シロイヌナズナをＴ（ｎ＋１）世代とする（ｎは正の整数）。
【００４２】
５）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験（ＲＴ−ＰＣＲ法）
上述のＴ１世代の葉からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認を行った。
本実施例３のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして本実施例３のシロイヌナズナの葉１枚(約１０ｍｇ)を、氷冷したスクリューキャップチューブ（２ｍｌ容）に入れ、これに滅菌したグラスビーズ（直径０．２５−０．５ｍｍ）を適量加え、グラスビーズ細胞破砕機（商品名：ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤ−８、ＢＩＯＳＰＥＣ−ＣＳＣ社製）を用いて葉の細胞を破砕した。なお破砕は細胞破砕機の最大速度で行い、３０秒間破砕の後、氷上で１分間冷却する事によって、細胞液の温度上昇を防いだ。この操作を５回繰り返した後、ＲＮＡ抽出用試薬１ｍｌ（商品名：ＩＳＯＧＥＮ、日本ジーン社製）を遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）に入れて撹拌した後、５０℃で１０分間保温したものをサンプルとした。以下、「（１）ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡの採取」と同様の操作を行い、Ｔ１世代のｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。このＴ１世代のｔｏｔａｌＲＮＡより、上述の「（２）ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートの作成」と同様の操作を行い、「Ｔ１世代のｃＤＮＡテンプレート」を作成した。このＴ１世代のｃＤＮＡテンプレートと、プライマＭＲＰ５’と、プライマＭＲＰ−３‘Ｓａｌｌを用いてＰＣＲを行った。このとき、シロイヌナズナのハウスキーピング遺伝子であるアクチン（Ａｃｔｉｎ）をコントロールとして同時に検出した。すなわち上述のプライマＭＲＰ５’及びプライマＭＲＰ−３’Ｓａｌｌと共にアクチン検出用のプライマａｃｔｉｎ５’及びプライマａｃｔｉｎ３’を混入して上記ＰＣＲを行い、実施例３のＰＣＲ溶液を得た。
また比較例３のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例３と同一条件でＲＴ−ＰＣＲを実施し、比較例３のＰＣＲ溶液を得た。
そして実施例３のＰＣＲ溶液と比較例３のＰＣＲ溶液を並べてアガロースゲルにアプライして電気泳動したのち、エチジウムブロマイドにて各バンドを染色し、紫外線下で撮影した。
【００４３】
［ＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入したシロイヌナズナの重金属耐性試験］
（Ａ）鉛耐性試験
（ａ）地上部の生鮮重量測定試験（Ｔ１世代）
実施例４のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例４のシロイヌナズナを、１,０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移して栽培した。そして、４週間栽培後における実施例４の地上部の生鮮重量を測定した。なお、試験は少なくとも３連で行い、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行い、統計的に有意な差の有無を判定した。
また比較例４のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例４と同一条件で栽培し、その生鮮重量を測定した。
【００４４】
（ｂ）地下部（根）の伸長測定試験
実施例５のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例５のシロイヌナズナを、１００、２５０、５００、７５０及び１，０００μｍｏｌＬ−１になるよう硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして同寒天培地を垂直に立て２２℃、長日条件下で生育し、１週間後及び２週間後における実施例５の根の伸長を測定した。なお試験は４連で行った。
また比較例５のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例５と同一条件で栽培し、その根の伸長を測定した。
【００４５】
（Ｂ）鉛集積試験（Ｔ１世代）
（ａ）地上部の鉛集積試験
実施例６のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例６のシロイヌナズナを、７５０μｍｏｌＬ−１になるよう硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移して２２℃長日条件下で４週間生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして１個体あたりの地上部全量を、７７℃で２日間乾燥したのち、硝酸過塩素酸分解により湿式分解を行い１個体分の地上部分解液を得た。そして、原子吸光分光光度計でこの地上部分解液の鉛濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。なお試験は少なくとも３連で行った。
また比較例６のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、上記と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、その地上部分解液の鉛含有濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
（ｂ）地下部の鉛集積試験
実施例７のシロイヌナズナとしてＴ１世代の形質転換シロイヌナズナを使用し、上記（Ｂ）（ａ）と同一条件で生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして地下部を回収して蒸留水で洗浄した後１個体あたりの地下部全量を乾燥及び分解し、地下部分解液の鉛含有濃度を測定して１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
また比較例７のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、上記と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、その地下部分解液の鉛含有濃度を測定し１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
【００４６】
（Ｃ）カドミウム耐性試験
（ａ）地上部の生鮮重量測定試験
実施例８のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例８のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した1/2×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして実施例８のシロイヌナズナを、寒天培地を垂直に立てた状態で２２℃、長日条件下生育し、２週間後の地上部生鮮重量を測定した。なお、試験は４連で行った。
また比較例８のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例８と同一条件で栽培し、２週間後の地上部生鮮重量を測定した。
【００４７】
（ｂ）地下部（根）の伸長測定試験
実施例９のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例９のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１になるよう塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして同寒天培地を垂直に立て２２℃、長日条件下で生育し、２週間後における実施例９の根の伸長を測定した。試験は４連で行った。
また比較例９のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例９と同一条件で栽培し、その根の伸長を測定した。
【００４８】
（Ｄ）カドミウム集積試験
実施例１０のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナの地上部を用いた。そして実施例１０のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１になるよう塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして各寒天培地の形質転換シロイヌナズナを、２２℃長日条件下で４週間生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして１個体あたりの地上部全量を７７℃で２日間乾燥させた後、硝酸過塩素酸分解により分解した。そして地上部分解液のカドミウム濃度を原子吸光分光光度計で測定し１個体あたりの地上部のカドミウム集積量を求めた。
また比較例１０のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１０と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、地上部分解液のカドミウム濃度を測定し１個体あたりの地上部のカドミウム集積量を求めた。
【００４９】
（Ｅ）グルタチオン依存性試験
実施例１１のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例１１のシロイヌナズナを、グルタチオン合成阻害剤であるブチオニンスルオキシミン{Ｌ−．ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ−［Ｓ，Ｒ］−ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｍｅ（ＢＳＯ）}２００μｍｏｌＬ−１と硝酸鉛７５０μｍｏｌＬ−１を加えた１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移し、４週間栽培して実施例１１におけるＢＳＯ存在下の鉛集積を調べた。
また比較例１１のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１１と同一条件で栽培し、ＢＳＯ存在下の鉛集積を調べた。
【００５０】
［Ｔ３世代のシロイヌナズナを用いた各種試験］
上記４）「シロイヌナズナの形質転換」の手法に従い、Ｔ３世代のシロイヌナズナ（実施例１３（Ｌ１６）、実施例１４（Ｌ４））を得た。
そして上記５）「ＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験」の手法に従い、これらＴ３世代のシロイヌナズナについてＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験を行った。
【００５１】
（Ｆ）地上部及び地下部の生鮮重量測定試験（Ｔ３世代）
実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナを、２５０、５００又は７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地に移した。そして実施例１３のシロイヌナズナを、寒天培地を垂直に立てた状態で２２℃、長日条件下で生育し、２週間後の地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。試験は少なくとも３連で行い、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行い、統計的に有意な差の有無を判定した。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、実施例１３と同一条件で栽培し、その地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。
そして比較例１３のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１３と同一条件で栽培し、その地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。
【００５２】
（Ｇ）鉛集積試験（Ｔ３世代）
（ａ）地上部の鉛集積試験
上述の生鮮重量測定試験後の実施例１３、実施例１４及び比較例１３を用いた。
すなわち実施例１３（Ｌ１６）に係るシロイヌナズナの一個体あたりの地上部全量を７７℃で２日間乾燥したのち、硝酸過塩素酸分解により湿式分解を行い１個体分の地上部分解液を得た。そして、原子吸光分光光度計でこの地上部分解液の鉛濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で乾燥及び分解したのち１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で乾燥及び分解したのち１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
【００５３】
（ｂ）地下部の鉛集積試験
同様に上述の生鮮重量測定試験後の実施例１３、実施例１４及び比較例１３を用いた。すなわち実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナの地下部を回収して蒸留水で洗浄した後１個体あたりの地下部全量を乾燥及び分解し、地下部分解液の鉛含有濃度を測定して１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で洗浄、乾燥及び分解したのち１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で洗浄、乾燥及び分解したのち１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
【００５４】
（Ｈ）「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」における鉛集積試験
実施例１５として、実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナの種子（Ｔ４世代）を用いた。このＴ４世代の種子を、１０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛及び１０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、２２℃にて１８日間、長日条件下で栽培した(種子９粒／１プラントボックス、３連)。そしてこの「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」の植物体全体を回収して、その生鮮重量を測定するとともに、その鉛集積量、鉛集積濃度及びカドミウム集積量を測定した。なお鉛集積濃度とは、植物体の乾燥重量あたりの鉛重量（μｇｇ−１ｄ．ｗ．）である。
また実施例１５の種子を、２５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、上記実施例１５の栽培条件にて栽培した。そしてこの「Ｐｂ含有培地」の植物体全体を回収して、その生鮮重量、鉛集積量、鉛集積濃度及びカドミウム集積量を測定した。
また比較例１５として、野生株のシロイヌナズナの種子を、１０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛及び１０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、上記実施例１５の栽培条件と同一条件にて栽培した。
【００５５】
［結果］
図１は、酵母による鉛耐性試験の結果を示す図である。
菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００＝１０−１の実施例１の酵母は、０〜４５μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加したＹＰＤ寒天培地でその生育が認められた。一方、比較例１の酵母は、０〜３０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加したＹＰＤ寒天培地でその生育が認められたが、３０μｍｏｌＬ−１以上の硝酸鉛濃度下ではほとんど生育が認められなかった。このことから実施例１の酵母はソバ由来の強力な鉛耐性を発揮することがわかった。
【００５６】
図２は、酵母によるカドミウム耐性試験の結果を示す図である。
実施例２の酵母と比較例２の酵母は、０〜６０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加したＹＰＤ寒天培地において生育度合に差がなかった。このことから、実施例２の酵母は、カドミウムに対する耐性が強化しておらず、またカドミウムを酵母内にほとんど蓄積しないことが示唆された。
そして、このカドミウム耐性試験の結果（図２）と上述の鉛耐性試験の結果（図１）を総合すると、実施例の酵母は、その生育過程においてＭＲＰを発現することにより、鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが示唆された。
【００５７】
図１２は、酵母による酸化クロム耐性試験の結果を示す図である。
実施例１２の酵母と比較例１２の酵母は、共に１００〜７００μｍｏｌＬ−１の酸化クロムを添加したＹＮＢ−Ｕｒａ−寒天培地において生育度合に差がなかった。そして実施例１２の酵母と比較例１２の酵母は、いずれも８００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム存在下で生育の遅延が認められるとともに、９００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム存在下で生育が阻害される結果となった。このことから実施例１２の酵母は、酸化クロムに対する耐性が強化しておらず、また酸化クロムを酵母内にほとんど蓄積しないことが示唆された。
【００５８】
そして上述の図１、図２及び図１２の結果を総合評価すると、本実施例の形質転換酵母は鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが示唆された。
このことからＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入した植物体も同様に、鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが強く示唆される。
【００５９】
図３は、シロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
実施例３のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できた。一方、比較例のシロイヌナズナ３ではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できなかった。このことから、実施例３のシロイヌナズナにはＦｅＭＲＰ３遺伝子が発現しており、恒常的に発現（過剰に発現）していると推察された。
なお、実施例３及び比較例３のシロイヌナズナいずれにおいても、アクチン遺伝子の発現を確認できたことから、ＲＴ−ＰＣＲの操作自体は成功したことがわかった。
【００６０】
［鉛耐性試験の結果］
図４は、地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
実施例４のシロイヌナズナの地上部は、比較例４と比較すると１,０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地で格段に大きく生育した。このことから実施例４のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛耐性を発揮することがわかった。
【００６１】
図５は、地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
実施例５及び比較例５のシロイヌナズナは、１００、２５０、５００、７５０及び１，０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地における根の生育度合に顕著な差がなかった。
そして、この地下部（根）の伸長測定試験（図５）の結果と、上述の地上部の生鮮重量測定試験（図４）を総合すると、実施例４のシロイヌナズナの鉛耐性は、発現したＭＲＰの機能（地下部から地上部に鉛を輸送する機能）に由来することがわかった。
【００６２】
図６は、地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図であり、図７は、地下部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
実施例６のシロイヌナズナの地上部には、比較例６と比較すると、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地から格段に高濃度の鉛を蓄積することが認められた。そして実施例７及び比較例７のシロイヌナズナの地下部には鉛蓄積に顕著な差がなかった。
このことから、実施例６のシロイヌナズナは、発現したＭＲＰでもって地上部に鉛を輸送することにより、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛蓄積能を発揮したことがわかった。
【００６３】
［カドミウム耐性試験の結果］
図８は、地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図であり、図９は、地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
実施例８のシロイヌナズナの地上部は、比較例８と比較すると、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地でほとんど生育しなかった。このことから実施例８のシロイヌナズナは、シロイヌナズナが本来的に有するカドミウム耐性を喪失しているか又は極めて弱いことがわかった。
また実施例９及び比較例９のシロイヌナズナは、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウム存在下における根の生育度合に顕著な差がなかった。このことから、実施例のシロイヌナズナでは、発現したＭＲＰが、シロイヌナズナ本来のカドミウム輸送能力を積極的に阻害していることが推察される（なお、この推察は本発明を何ら拘束しない）。
【００６４】
図１０は、地上部のカドミウム集積試験の結果を示す図である。
実施例１０のシロイヌナズナは、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地において、ほとんど生育しなかった。一方、比較例１０のシロイヌナズナは通常どおり生育した。このことから、実施例のシロイヌナズナは、シロイヌナズナが本来的に有するカドミウム蓄積能力を喪失しているか又はその能力が極めて弱いことがわかった。
【００６５】
上述の試験結果を総合的に評価すると、本実施例のシロイヌナズナは、［鉛耐性試験の結果］より、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛蓄積能及び耐性を発揮することがわかった。そして本実施例のシロイヌナズナは、［カドミウム耐性試験の結果］より、カドミウム蓄積能及び耐性を喪失しているか又は極めて弱いことがわかった。
すなわち本実施例のシロイヌナズナは、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、鉛は効率良く蓄積するがカドミウムはほとんど蓄積しない（特定の重金属を選択的に蓄積する）機能を発揮することがわかった。
【００６６】
［グルタチオン依存性試験の結果］
図１１は、グルタチオン依存性試験の結果を示す図である。
実施例１１のシロイヌナズナは、グルタチオン合成阻害剤ＢＳＯを加えた培地であっても強い鉛集積能及び耐性を示した。このことから、実施例１１のシロイヌナズナにおいて発現したＭＲＰは、グルタチオン非依存的に機能することがわかった。
このことより、実施例１１のシロイヌナズナにおいて発現したＭＲＰは、イオン化した鉛もしくはグルタチオン以外の物質によりキレート化された鉛を輸送しているものと考えられる。
【００６７】
［Ｔ３世代の形質転換シロイヌナズナ］
図１３は、Ｔ３世代のシロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できた。一方、比較例１３（野生株）のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できなかった。
なお実施例１３及び比較例１３のいずれにおいても、アクチン遺伝子の発現を確認できたことから、ＲＴ−ＰＣＲの操作自体は成功したことがわかった。
【００６８】
図１４（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の生鮮重量測定試験の結果を示す図であり（ｂ）は、地下部の生鮮重量測定試験の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナは、比較例１３（野生株）と比較して、２５０μｍｏｌＬ−１から７５０μｍｏｌＬ−１へ硝酸鉛濃度が増加しても生鮮重量が極端に低下することはなかった。
特に実施例１３のシロイヌナズナは、２５０μｍｏｌＬ−１〜７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛濃度範囲で十分に大きく生育した。すなわち実施例１３のシロイヌナズナは硝酸鉛濃度が７５０μｍｏｌＬ−１に増加しても、地上部の生鮮重量の低下は僅か７％であり（ほぼ横ばいであり）、地下部での生鮮重量の低下は認められなかった。
【００６９】
これとは反対に比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、硝酸鉛濃度の増加に伴いその生鮮重量が極端に減少した。すなわち比較例１３のシロイヌナズナは硝酸鉛濃度が７５０μｍｏｌＬ−１に増加することにより、地上部の生鮮重量が４３％低下し、地下部の生鮮重量が４９％低下した（地上部及び地下部の生鮮重量がほぼ半減した）。
以上のことからＴ３世代（実施例１３及び実施例１４）のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛耐性をＴ１世代及びＴ２世代より引き継いでいることがわかった。
【００７０】
図１５（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の鉛集積試験の結果を示す図である。図１５（ｂ）は、Ｔ３世代における地下部の鉛集積試験の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナは、硝酸鉛濃度の増加に伴い、より多くの鉛を蓄積する傾向があることがわかった。特に実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナは、比較例１３と比較して、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛存在下で極めて高い鉛蓄積能を発揮することがわかった。
これとは逆に比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、硝酸鉛の添加量とは関係なくその鉛蓄積能が低いことがわかった。そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛存在下でほとんど鉛を蓄積しなかった。
【００７１】
以上のことからＴ３世代（実施例１３及び実施例１４）のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な鉛蓄積能をＴ１世代及びＴ２世代より引き継いでいることがわかった。
そして図１３〜図１５の結果を総合的に考察して、本実施例によれば、組み換え植物としてのラインが確立する（実用に耐え得る）Ｔ３世代の組み換え植物種子を獲得できたことがわかった。
【００７２】
［鉛・カドミウム複合含有培地における各種試験の結果（Ｔ４世代）］
図１６は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における生鮮重量の測定結果を示す図である。
「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）の生鮮重量は、「Ｐｂ含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）と比較して極端に低下することはなかった。一方、比較例１５のシロイヌナズナは生育が不十分であり、分析に供する十分な植物体量（生鮮重量）が得られなかった。
【００７３】
また図１７（ａ）は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における鉛集積量の測定結果を示す図であり、（ｂ）は、鉛集積濃度の測定結果を示す図である。
「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）の鉛集積量及び鉛集積濃度は、「Ｐｂ含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）と比較して遜色のないものであった（見かけ上増加しているが、ｔ−検定では差は認められなかった）。
一方、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）からはカドミウムが検出されなかった。
このことから本実施例のシロイヌナズナは、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」（鉛・カドミウム複合汚染条件）においても十分な鉛除去能力を維持すること（特に鉛を選択的に蓄積する機能を発揮すること）が判明した。
【００７４】
本発明の植物体及び土壌浄化方法は、本実施の形態で説明した外観、構成、処理、表示例等に限定されず、本発明の要旨を変更しない範囲で種々の変更、追加、削除が可能である。
すなわち本実施例においては、塩基配列１のＤＮＡをＰＣＲにて獲得する例を説明した。これとは異なり、塩基配列１のＤＮＡを化学的に合成してもよい。化学的に合成する場合には、例えば、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することができる。
【００７５】
また、ソバ由来の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質（ホモログタンパク質）をコードするＤＮＡも本実施例のＤＮＡに含まれる。
なお、上記タンパク質のアミノ酸変異数は、ＭＲＰに求められる所望の重金属輸送活性が維持できる限り制限しないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ましくは２０％以内である。
そしてホモログタンパク質は、ＡＢＣトランスポータに特徴的なドメイン｛例えば、膜貫通領域ＡＢＣ ＴＭＦ１（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ―１ ｆｕｓｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）｝を有していることが好ましい。
【００７６】
また、本実施例においては宿主植物体としてシロイヌナズナを用いた例を説明したが、宿主植物体として各種の植物を使用可能であり、例えば、アブラナ、ナタネ又は菜の花などの油料系植物を宿主植物体として使用可能である。このようにすれば、油料系植物の生育によって汚染土壌の浄化を達成できると同時に、収穫した油料系植物を、ディーゼルエンジンなどのエンジン燃料（例えば菜種油）原料として用いることもできる。すなわち本実施例は、汚染土壌の浄化技術とエネルギー生産技術に併用して適用することができる。なお、収穫した油料系植物に含有の重金属イオンは親水性が高いので、油料系植物より得られる油脂成分への重金属混入はほとんどないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】酵母による鉛耐性試験の結果を示す図である。
【図２】酵母によるカドミウム耐性試験の結果を示す図である。
【図３】シロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
【図４】鉛存在下における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
【図５】鉛存在下における地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
【図６】地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図７】地下部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図８】カドミウム存在下における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
【図９】カドミウム存在下における地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
【図１０】地上部のカドミウム集積（Ｃｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図１１】グルタチオン依存性試験の結果を示す図である。
【図１２】酵母による酸化クロム耐性試験の結果を示す図である。
【図１３】Ｔ３世代におけるシロイヌナズナのＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
【図１４】（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図であり、（ｂ）は、地下部の生鮮重量測定試験の結果を示す図である。
【図１５】（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図であり、（ｂ）は、地下部の鉛集積試験の結果を示す図である。
【図１６】「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」における生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）及び「Ｐｂ含有培地」における生鮮重量の測定結果を示す図である。
【図１７】（ａ）は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における鉛集積量の測定結果を示す図であり、（ｂ）は、鉛集積濃度の測定結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ソバ由来の重金属（特に鉛）蓄積能を有する植物体及びこの植物体を用いた土壌浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、汚染土壌中の重金属を植物体に蓄積して除去する汚染土壌の浄化技術（ファイトレメディエーション）において、他の生物由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡを植物体に導入して当該植物体の重金属蓄積能及び耐性を強化する技術がある（特許文献１〜３参照）。この重金属輸送タンパク質は、植物体の地下部（根）が吸収した重金属を地上部（葉）へ輸送する重金属輸送活性を有する。このため、前記ＤＮＡを導入して形質転換した植物体は、この重金属輸送タンパク質の発現によって、土壌中の重金属を地下部から吸収して地上部に蓄積しつつ大きく生育する。この生育後の植物体を収穫することにより、効率良く汚染土壌から重金属を除去することができる。
【０００３】
ところで上述の汚染土壌は、一般に複数種類の重金属や有害物質（例えば、鉛、カドミウム、シアン、六価クロムなどの酸化クロム、砒素又は水銀）を含有する。特にバッテリ工場や射撃場跡地などの特殊な汚染土壌では、特定の重金属（例えば鉛）だけが許容値を超える高濃度で含有しており、他の重金属（例えばカドミウムや酸化クロム）が許容値以下で含有している場合もある。例えば射撃場跡地には土壌中に鉛弾が混入しているので、土壌中の鉛含有量が数千から数万ｍｇ／ｋｇになることもある。このように鉛だけを多く含有する汚染土壌では、鉛以外の重金属を除去することなく、高濃度の鉛だけを選択的に除去することが効率良く土壌を浄化する上で理想的である。
【特許文献１】特開２００３−２１００５７号
【特許文献２】特表２００３−５２７８６２号
【特許文献３】特表２００５−５０５３０２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、重金属輸送タンパク質の中でも、ファイトレメディエーションに有効なものとそうでないものがあり、重金属輸送タンパク質を導入して形質転換した植物体が必ずしも実用に耐え得る重金属蓄積能及び耐性を有するものではない。
さらには、複数の重金属に対して蓄積能を発揮する植物体の報告（特許文献３）はあるが、特定の重金属（例えば鉛）を選択的に蓄積する植物体の報告はない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ソバ由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡをソバ以外の植物体に導入することで、当該植物体の重金属蓄積能及び耐性を強化できることを見出した。さらにソバ由来の重金属輸送タンパク質を導入した植物体が、特定の重金属を選択的に蓄積することを見出した。
すなわち上記課題を解決するための手段として、本発明の第１発明は、鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入して形質転換してなる植物体である。この植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強い重金属蓄積能及び耐性を発揮する。
【０００６】
また、本発明の第２発明の植物体は、第１発明に記載の植物体であって、前記ＤＮＡが、以下の（Ａ）又は（Ｂ）である。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡを導入した植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡに対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛を蓄積する一方で、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない）ことができる。
【０００７】
また、本発明の第３発明の土壌浄化方法では、第１発明又は第２発明に記載の植物体を、重金属で汚染状態の土壌にて生育したのち収穫することで、土壌から重金属を効率良く除去（特に鉛を選択的に除去）する。
【発明の効果】
【０００８】
第１発明によれば、重金属蓄積能及び耐性を強化した植物体を提供することができる。第２発明によれば、特定の重金属を選択的に除去する植物体を提供することができる。第３発明によれば、植物体により、汚染土壌から重金属を効率よく除去（特に鉛を選択的に除去）することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に本発明を実施するための最良の形態を説明する。
本実施の形態では、宿主植物体（ソバ以外の植物体）に、「鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を導入することで形質転換する。このように形質転換した宿主植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）重金属蓄積能及び耐性を発揮することとなる。
更に、後述の（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡを導入して形質転換した宿主植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛は効率良く蓄積するが、カドミウムや酸化クロムはほとんど蓄積しない）。
【００１０】
ここで、宿主植物体の種類は特に限定しないが、例えば、アブラナ科、アオイ科、マメ科、アカザ科、ナス科、キク科、ヒユ科又はイネ科の植物を宿主植物体として使用可能である。具体的には、ケナフ、ヒマワリ、ソルガム、ネピアグラス、タバコ、カラシナ、イネ、ポプラ、ナタネ、アブラナ、菜の花、シロイヌナズナ又はユリノキを宿主植物体として用いることができ、好ましくは、宿主植物体の生育が早い一年生植物または多年生植物であることが好ましい。
また宿主植物体は、ソバよりも大きく育つか、またはソバよりも環境に対する耐性が高いことが好ましく、例えば、ケナフ、ヒマワリ、ソルガム又はネピアグラスを宿主植物体として用いることが好ましい。
さらに宿主植物体は、アブラナ、ナタネ及び菜の花など油料系植物であることが好ましい。すなわち、油料系植物の生育によって汚染土壌の浄化を達成できると同時に、収穫した油料系植物を燃料原料として用いることもできる。
【００１１】
一方、ソバとは、普通ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ダッタンソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｔａｔａｒｉｃｕｍ）及びシャクチリソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｃｙｍｏｓｕｍ）などの重金属（特に鉛）蓄積能又は耐性を有するタデ科ソバ属植物である。このようなソバの重金属（特に鉛）蓄積能又は耐性は後述の重金属輸送活性を有するタンパク質に由来する。
【００１２】
そして「重金属輸送活性を有するタンパク質」とは、ＡＴＰ駆動型のＡＢＣ（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ）タンパク質に属するＡＢＣトランスポータである。具体的には、「重金属輸送活性を有するタンパク質」とは、例えば、多剤耐性関連タンパク質{Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）}、ＭＲＰのサブファミリーであるアニオントランスポータ{Ｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎｉｏｎ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅr（ｃＭＯＡＴ）}、多剤耐性関連ファクタ{Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ（ＭＤＲ）}、嚢胞性線維性膜貫通調節因子{Ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏr（ＣＦＴＲ）}またはスルホニル尿素受容体{Ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＳＵＲ）}のいずれかであって、且つ重金属輸送活性を有するタンパク質である。
そして、上述の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）は、それにより形質転換した宿主植物体に特定の重金属を選択的に除去する選択性を付与するため、「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質」として好ましい。
【００１３】
そして「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」は、上述の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）をコードするＤＮＡが好ましく、具体的には（Ａ）または（Ｂ）の塩基配列を有することが好ましい。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有する。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列｛例えば、表１に表記の１）〜１８）のプライマを参照｝からなるＤＮＡあるいはその相補鎖（それらを総称してプローブと呼ぶ）とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する。
（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列を有するＤＮＡを導入した宿主植物体は、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、特定の重金属を選択的に蓄積する（例えば、鉛を蓄積する一方で、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない）ことができる。
【００１４】
ここで（Ｂ）に記載のプローブと「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」ＤＮＡ（ホモログ遺伝子）とは、０．７〜１．０ＭＮａＣｌ存在下又は５０％ホルムアミド存在下、３７℃〜４２℃又は４２℃〜６５℃でハイブリダイズするＤＮＡのことである。
なお、ハイブリダイズの手法としては、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンブロットハイブリダイゼーション法などの各種手法{例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｅｄｉｔ． Ａｕｓｕｂｅl ｅｔ ａｌ．，（１９８７）を参照}を用いることができる。
【００１５】
さらに「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ＤＮＡは、換言すると、配列番号１に記載の塩基配列と一定の相同性を有するＤＮＡである。一定の相同性を有するＤＮＡとは、例えば配列番号１に記載の塩基配列と５０％以上の相同性を有するＤＮＡであり、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するものである。
【００１６】
ここで「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」を同定する手順について説明すると、例えば、ソバ由来の染色体ＤＮＡライブラリまたはソバ由来のｃＤＮＡライブラリを含むコロニーを固定化したフィルタを用意する。このフィルタに対して、０．７〜１．０ＭＮａＣｌ存在下６５℃で上記プローブ（蛍光標識又はＲＩ標識）をハイブリダイズする。そしてハイブリダイズ後のフィルタを、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（０．３ＭＮａＣｌを含む０．０３Ｍクエン酸ナトリウム水溶液）を用いて洗浄する。洗浄後のフィルタを蛍光又ＲＩ検出することにより、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」を同定することができる。
【００１７】
そして、上述の「重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を宿主植物体に導入することにより、当該宿主植物体を形質転換する。
ここで「ソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡ」を宿主植物体に導入してタンパク質を発現するための発現ベクターは、宿主植物体との組み合わせを考慮して適宜選択することができる。例えば発現ベクターとして、宿主植物体の染色体中に発現可能にＤＮＡを組み込み可能な染色体組込型ベクターや、宿主植物体の細胞内において自立複製可能なプラスミドを好適に使用可能である。
具体的には、植物細胞用の発現ベクターとして、アグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ（特開２００６−３２５４２８号公報参照, Ｊ． ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇ． ｖｏｌ．１０４，ｐｐ３４−４１, ２００７）、ｐＩＧ１２１−Ｈｍ（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ，ｖｏｌ．１５， ｐｐ８０９８１４，１９９５）、ｐＢＩ１２１（ＥＭＢＯ Ｊ． ｖｏｌ．６， ｐｐ３９０１−３９０７，１９８７）、ｐＬＡＮ４１１またはｐＬＡＮ４２１（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｖｏｌ．１０， ｐｐ２８６−２９０，１９９１）を好適に使用可能である。
【００１８】
また発現ベクターのプロモータは、その下流に位置する「ソバ由来の重金属輸送タンパク質をコードするＤＮＡ」を転写可能である限りどのようなプロモータを用いてもよい。例えば、発現ベクターのプロモータとして、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｖｏｌ．２２０， ｐｐ３８９−３９２，１９９０を参照）を使用可能であり、同プロモータによれば、宿主植物体中で上述のＤＮＡを恒常的に発現する（過剰に発現する）ため使用するプロモータとして好ましい。
【００１９】
そして、上記発現ベクターを宿主植物体に導入する方法は宿主植物体に合わせて適宜変更可能である。例えば、アグロバクテリウム法（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法）、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム沈殿法、ＰＥＧ法又は直接マイクロインジェクション法のいずれかの手法を用いて発現ベクターを宿主植物体に導入可能である。
【００２０】
そして、このようにして形質転換した宿主植物体を、重金属を含有の汚染土壌（地面を有する領域又は水性・半水性の領域のいずれも含む）にて生育したのち収穫する。
ここで宿主植物体を生育するとは、宿主植物体を重金属の蓄積が可能な状態で維持することであり、必ずしも宿主植物体が増殖することを要しない。このように形質転換した宿主植物体は、その生育過程において重金属輸送活性を備えたタンパク質を発現し、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）重金属蓄積能及び耐性を発揮することができる。
【００２１】
さらに本実施の形態の土壌浄化方法によれば、（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡにより形質転換した宿主植物体を生育及び収穫することで、汚染土壌から重金属を除去（特に鉛を選択的に除去）することができる。このため本実施の形態の土壌浄化方法は、バッテリ工場や射撃場跡地などの特殊な汚染土壌｛特定の重金属（例えば鉛）だけが許容値を超える高濃度で含有しており、他の重金属（例えばカドミウムや酸化クロム）が許容値以下で含有している土壌｝に好適に使用可能である。
【００２２】
［実施例］
以下、本実施の形態を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例に限定されない。
［ＭＲＰをコードするＤＮＡのクローニング］
ソバ由来多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）をコードするＤＮＡ（以下、ＦｅＭＲＰ３遺伝子と呼ぶ）のクローニング手法を（１）〜（３）の順に説明する。
（１）ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡの採取
パウダー状に磨り潰した普通ソバの葉５０ｍｇ〜１００ｍｇと、ＲＮＡ抽出用試薬１ｍｌ（商品名：ＩＳＯＧＥＮ、日本ジーン社製）を遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）に入れて撹拌した後、５０℃で１０分間保温したものをサンプルとした。このサンプル１ｍｌにクロロホルム２００μｌを加えて撹拌及び静置（室温）した後１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間の条件で遠心分離（微量高速冷却遠心機 ＭＲＸ−１５０、トミー精工株式会社製）してサンプルの上澄み液を得た。この上澄み液に１０Ｍ塩化リチウム（ＬｉＣｌ）２００μｌを加えて撹拌、冷却及び静置した後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)し、上澄み液と多糖類を除去したＲＮＡ沈殿物を得た。このＲＮＡ沈殿物を、ＤＥＰＣ水(ＤＥＰＣ処理した滅菌済み超純水)４００μｌに溶解した後、イソプロパノール４００μｌを加えて遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)し、その上澄み液を取り除いた後、更に７０％エタノール１８０μｌを加えて撹拌し、遠心分離(１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)してリンスした。リンス後のＲＮＡ沈殿物を乾燥させた後、ＤＥＰＣ水４００μｌ、３Ｍ酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）４０μｌ、１００％エタノール１ｍｌ（−２０℃）を加えて振盪し、−７０℃で１時間冷却して遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)して再度リンスした。
リンス後のＲＮＡ沈殿物に、７０％エタノール１８０μｌ（−２０℃）を加えて撹拌、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、４℃、１５分間)して精製ＲＮＡ沈殿物を得た。この精製ＲＮＡ沈殿物からエタノールを取り除いて室温で５分間乾燥させた後、ＤＥＰＣ水１８μｌに溶解したものを「ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡ」溶液とした。
【００２３】
（２）ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートの作成
上述のｔｏｔａｌＲＮＡ溶液１８μｌを遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）へ入れ、オリゴｄＴアンカプライマ（表１を参照）２μｌを加えた。この溶液を、サーマルサイクラ（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ、ＴａＫａＲａ社製）にて６５℃で５分間保温し、氷上で冷却した後、逆転写用試薬｛５×ＲＴａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ Ｂｕｆｆｅｒ６μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ２μｌ、ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１μｌおよびＲＴａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ１μｌ（商品名：Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｍ−ＭＬＶ、ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ社製）｝と４２℃で１時間反応させて「ソバ由来のｃＤＮＡテンプレート」を得た。
【００２４】
（３）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列（配列番号１）の決定
本実施例では、他種間で相同性の高いプライマ（表１）を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を解読し、さらにＲＡＣＥ法にてＦｅＭＲＰ３遺伝子の全塩基配列を解読した。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（ａ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部解読
上記（２）で調整したｃＤＮＡテンプレートに対して、表１に記載のプライマＭＲＰ５’−１、プライマＭＲＰ３’−１及びＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑＴＭ、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子断片の増幅を行った。
なおＦｅＭＲＰ３遺伝子断片の増幅は、ＰＣＲ用プログラム温度制御装置（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＥＲＳＯＮＡＬ、ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いた。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＥＰＣ水１８．３μl、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）２．５μl、１０×Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（添付試薬）１μl、５’側ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１μｌ、３’側ｐｒｉｍｅｒ（２０μＭ）１μl、テンプレートＤＮＡ１μl、 ＴＡＫＡＲＡ ＥｘＴａｑＴＭ（５ｕｎｉｔｓ／μl, ＴＡＫＡＲＡ）０．２μlであった。またＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→５５℃（１分）→７２℃（１分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
【００２７】
ここで、上述のプライマＭＲＰ５’−１及びプライマＭＲＰ３’−１は、他生物由来ＭＲＰのアミノ酸配列を比較し、各生物間で保存性の高い領域のアミノ酸配列を基に作成したものである。なお、他生物由来ＭＲＰとして、ヒトＭＲＰ（ＭＲＰ１， ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｐ３３５２７）、ラットＭＲＰ（ＲｔＣＭＯＡＴ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ４２０８７）、酵母ＭＲＰ（ＹＣＦ１ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｐ３９１０９）、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ６７３１９、ＡｔＭＲＰ３ ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＡＣ４９７９１）の報告がある。
【００２８】
次に（３）(ａ)で増幅のＦｅＭＲＰ３遺伝子断片に対して、プライマＭＲＰ５’ＲＡＣＥ−１と、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２２９７と、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６０℃（１分）→７２℃（２分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
続いて、ＦｅＭＲＰ３遺伝子断片に対して、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２４３５とプライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ１５４５を用い、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６０℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。
ここで上述のプライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２２９７は、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１，３）の中流域で保存されているアミノ酸配列を基に作製し、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ１５４５は、シロイヌナズナＭＲＰ（ＡｔＭＲＰ１，３）の上流域で保存されているアミノ酸配列を基に作製した。
このような手順によりＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を得てそれを解読した。
【００２９】
（ｂ）ＲＡＣＥ法を用いたＦｅＭＲＰ３遺伝子の全配列の解読
（ｉ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子３’末端の解読
ＦｅＭＲＰ３遺伝子の塩基配列の一部を基に設計したプライマＭＲＰ５’と、オリゴｄ（Ｔ） ＳＸＸ−アンカプライマと、ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６３℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。
【００３０】
（ｉｉ）ＦｅＭＲＰ３遺伝子５’末端の解読
プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ２４３５を使用して上記（１）のｔｏｔａｌＲＮＡを上記（２）の方法で逆転写（４２℃で１時間）し、ｃＤＮＡ溶液を得た。このｃＤＮＡ溶液を、カラム（商品名：ＱＩＡＥＸ(R)ＩＩ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔに附属のカラム、ＱＩＡＧＥＮ社製）に通してｄＮＴＰを除去した。ｄＮＴＰを除去した溶液中のｃＤＮＡ３’末端に、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてポリＣを付加した。この操作は、サーマルサイクラ（商品名：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ、ＴａＫａＲａ社製）にて行った。
そしてポリＣを付加のｃＤＮＡ溶液２４μｌを９４℃で３分間加熱し、すぐに氷上に移した。これにＴｄＴを１μl加えて３７℃で２０分間反応後、７０℃で１０分間処理しＴｄＴを失活させた。このｃＤＮＡ溶液を５’ＲＡＣＥ用テンプレートとして用いた。
そして５’ＲＡＣＥ用テンプレートと、プライマＭＲＰ−ｐｏｉｎｔ ２４１５及びプライマＭＲＰ−Ｐ １５９３（５’側プライマ）と、オリゴｄ（Ｇ）アンカプライマ及びオリゴｄ（Ｇ） アンカ ＮＢＥプライマ（３’側プライマ）とを用いてＰＣＲ反応を２回行った。一回目のＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６５℃（１分）→７２℃（２分）｝×３５サイクル→７２℃（５分）とした。二回目のＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（１分）→６５℃（１分）→７２℃（２分）｝×２５サイクル→７２℃（５分）とした。
このような手順によりＦｅＭＲＰ３遺伝子の全塩基配列（配列番号１）を得てそれを解読した。そして、解読済のＦｅＭＲＰ３遺伝子をプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入して、ＦｅＭＲＰ３遺伝子のオープンリーディングフレーム全長を含む「プラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３」を得た。
【００３１】
［ＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入した酵母の重金属耐性試験］
（１）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の酵母用発現系プラスミド（ｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ）の構築
上述のプラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３と、プライマＭＲＰ−５'Ｋｐｎ１と、プライマＭＲＰ−３‘ＳａｌＩを用いてＰＣＲを行い、ＦｅＭＲＰ３遺伝子の５’末端にＫｐｎＩ配列を付加し、その３’末端にＳａｌＩ配列を付加した。そして制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩを用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子を切り出し、同様に酵母発現用シャトルベクターｐＫＴ１０−Ｇａｌ−ＨＡ−ＢＳ（Ｋ．Ｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５、以下単に「発現ベクターｐＫＴ１０」とも呼ぶ）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｌＩで消化した。そして制限酵素処理したＦｅＭＲＰ３遺伝子と酵母発現用シャトルベクターをアガロースゲルにて電気泳動の後、それぞれの分子量に対応のバンドを含むゲル断片より両者を各々抽出した。
ＦｅＭＲＰ３遺伝子と酵母発現用シャトルベクターのライゲーションは、市販のＤＮＡライゲーションキット（ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２、ＴａＫａＲａ社製）を用いて行った。ライゲーション後の反応液によって大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行った。ＬＢ／Ａｍｐ寒天培地（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ ｍｅｄｉｕｍ）にて生育の大腸菌ＤＨ５αコロニーをさらにＬＢ／Ａｍｐ液体培地にて培養し、培養後の菌体から「酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ」を得た。
【００３２】
（２）出芽酵母へのプラスミド導入（酢酸リチウム法）
ＹＰＤ液体培地（Ｙｅａｓｔ ｐｅｐｔｏｎｅ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｍｅｄｉｕｍ）５ｍｌに出芽酵母デルタ（Δ）ＹＣＦ１（Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ社製）のシングルコロニーを懸濁し、３０℃、１５０ｒｐｍの条件で１５時間振盪培養を行い、出芽酵母デルタＹＣＦ１の前培養液を得た。この前培養液２．５ｍｌをＹＰＤ液体培地５０ｍｌに加え、６００ｎｍにおける吸光度が０．８となるまで培養した。この培養液を遠心チューブ（５０ｍｌ容）に移し、３０００ｒｐｍ、１５℃で遠心分離（マイクロ冷却遠心機 3700、株式会社久保田製作所）を５分間行った。培養液の上清を除いた後滅菌水５ｍｌを加え、よく懸濁して遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５℃、５分間）を行い、更に１×ＴＥ／酢酸リチウム溶液１ｍｌを加え、１１０ｒｐｍ、３０℃で４５分振盪して細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液１００μｌに、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡ１．０μｌを加えた。更に細胞懸濁液にサケ精子ＤＮＡ（１ｍｇ ｍｌ−１）５０μｌを加えて混合した後、ＰＥＧ／ＴＥ／酢酸リチウム溶液７００μｌを加えて３０℃で１時間保温し、酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを出芽酵母デルタＹＣＦ１に導入した。
【００３３】
（３）鉛耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例１の酵母として、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３-ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。すなわち、実施例１の酵母培養液{ＹＮＢ−Ｕｒａ−液体培地（Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓｅ−ｕｒｅａ ｍｅｄｉｕｍ）で振盪培養（３０℃、１５０ｒｐｍ）}の菌体濃度を、ＤＥＰＣ水でＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛{Ｐｂ（ＮＯ３）２}を添加したＹＰＤ寒天培地に各々スポットした。これら各培地を５日間培養して、形質転換酵母の生育阻害を観察した。試験は４連で行った。
なお上記出芽酵母において、ＭＲＰの発現を誘導する場合はガラクトース（Ｗａｋｏ社製）をＹＰＤ寒天培地に加え、ＭＲＰの誘導を抑制する場合はグルコース（Ｗａｋｏ社製）２０ｇＬ−１をＹＰＤ寒天培地に加えた。
また比較例１の酵母として、空の発現ベクターｐＫＴ１０（ＦｅＭＲＰ３遺伝子を未挿入）を導入した出芽酵母を用いて、実施例１と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３４】
（４）カドミウム耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例２の酵母として、上述の酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。実施例２の培養液の菌体濃度をＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜６０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）を添加したＹＰＤ寒天培地に各々スポットした。これら各培地を３日間培養して、形質転換酵母の生育阻害を観察した。試験は４連で行い、他の条件は、上述の鉛耐性試験と同一とした。
また比較例２として、空の発現ベクターｐＫＴ１０を導入した出芽酵母を用いて、実施例２と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３５】
（５）酸化クロム耐性試験（形質転換酵母の増殖試験）
実施例１２の酵母として、酵母用発現系プラスミドｐＫＴ１０−ＦｅＭＲＰ３−ＨＡを導入した出芽酵母デルタＹＣＦ１を使用した。形質転換酵母はウラシル要求性によって選抜し、ＹＮＢ−Ｕｒａ−培地で生育可能な株を使用した。
そしてＹＮＢ−Ｕｒａ−液体培地（３０℃、１５０ｒｐｍの条件）で培養した形質転換酵母の培養液を、滅菌超純水でＯ．Ｄ．６００＝１０−１又は１０−２となるように希釈した。この希釈培養液５μｌを、０〜９００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム（ＶＩ） （ＣｒＯ３）を添加したＹＮＢ−Ｕｒａ−寒天培地(発現誘導用２０ｇＬ−１ｇａｌａｃｔｏｓｅ含有)に各々スポットした。これら各培地を、３日間（７２ｈｒ）、３０℃で培養したのち、形質転換酵母の生育阻害を観察した。
また比較例１２として、空の発現ベクターｐＫＴ１０を導入した出芽酵母を用いて、実施例１２と同一条件で培養して、その生育阻害を観察した。
【００３６】
［シロイヌナズナ（宿主植物体）の鉛刺激によるＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現量変化］
本実施例においては、アグロバクテリウム法を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子をシロイヌナズナに導入した。遺伝子導入ベクターとして、アグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ２（島根大学遺伝子実験施設より分譲）を用いた。ＴｉプラスミドへのＦｅＭＲＰ３遺伝子の導入は、ｐＥＮＴＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）の方法に従い、（ｉ）エントリークローンの作成、（ｉｉ）エントリークローンを用いたＬＲ（ＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）反応による相同組換えの２段階の反応を経て行った。
【００３７】
１）エントリークローンの構築
上述のプラスミドｐＣＲ２．１−ＦｅＭＲＰ３と、５’末端側プライマ{ＭＲＰ Ｇａｔｅｗａｙ ｆｏｒｗａｒｄ ５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣ−３’（Ｆｏｒｗａｒｄ）}と、プライマＭＲＰ−３‘Ｓａｌｌを用いてＰＣＲを行い、ＦｅＭＲＰ３遺伝子を増幅した。この増幅操作にはＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ社製）を使用し、ＰＣＲ反応条件は、９４℃（５分）→｛９４℃（０．５分）→６０℃（０．４分）→７２℃（４分）｝×３０サイクル→７２℃（５分）とした。
そして増幅したＦｅＭＲＰ３遺伝子を、電気泳動の後、「Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」（ＴａＫａＲａ社製）を用いて抽出した。この抽出液を用いて、「ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（ｐＥＮＴＥＲ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）を行いてプラスミドｐＥＮＴＥＲ／Ｄ−ＴＯＰＯにＦｅＭＲＰ３遺伝子を連結した。ＦｅＭＲＰ３遺伝子を連結したプラスミドにて大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、カナマイシン５０ｍｇＬ−１（Ｗａｋｏ社製）を含むＬＢ寒天培地で一晩培養し、「エントリークローン（ｐＥＮＴＥＲ−ＦｅＭＲＰ３による形質転換大腸菌）」を得た。
【００３８】
２）発現ベクター（ｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３）の構築
あらかじめ制限酵素ＸｈｏＩで消化した直鎖状のアグロバクテリウム感染用バイナリーベクターｐＧＷＢ２と、上述のエントリークローンを用いてＬＲ反応による相同組換えを行い、エントリークローンの大腸菌を形質転換した。そして、カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１（Ｗａｋｏ社製）を含むＬＢ寒天培地上で一晩培養し形質転換した大腸菌より、「発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３」を得た。
【００３９】
３）発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３の導入（エレクトロポレーション法）
土壌細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１株の遺伝子導入用細胞（コンピテントセル）を調製した。
寒天培地のアグロバクテリウム一白金耳分をＬＢ液体培地５ｍｌに懸濁し、一晩振盪培養（３０℃、１５０ｒｐｍ）した。この培養液１ｍｌをＬＢ液体培地５０ｍｌに加え、３０℃でＯＤ６００=０．６になるまで振盪培養を行った。この振盪培養液を氷冷した遠心チューブ（５０ｍｌ容）に移し、６，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離（微量高速冷却遠心機 ＭＲＸ−１５０,トミー精工株式会社）を行った。振盪培養液の上清を除いた後、沈殿（アグロバクテリウム）を氷冷１０％グリセロール（ｗ／ｖ）２０ｍｌに懸濁し、遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分、４℃）を行った。この操作を３回繰り返し、１０％グリセロール１２５μｌを加えて懸濁して「アグロバクテリウムＧＶ３１０１株のコンピテントセル」を得た。
【００４０】
そして上述のコンピテントセルに、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３のＤＮＡ液１μｌを加え、アグロバクテリウムの形質転換設定下でエレクトロポレーション（Ｍｉｃｒｏ Ｐｕｌｓｅｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を行い、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３をコンピテントセルに導入した。形質転換後のサンプル全量をＬＢ培地１ｍｌへ移し、３０℃で１時間振盪培養を行った。この培養液１００μlをＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含有）に塗布し、３０℃（暗条件）で２日間培養した。得られた形質転換アグロバクテリウムをＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含む）５ｍｌに植菌し、３０℃で２日間培養して「形質転換アグロバクテリウム」を得た。
なお、この形質転換アグロバクテリウムより抽出したプラスミドと、５’末端側プライマと、３’末端側プライマを用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動することで、発現ベクターｐＧＷＢ２−ＦｅＭＲＰ３がコンピテントセルに導入したことを確認した。
【００４１】
４）シロイヌナズナの形質転換（ｆｌｏｒａｌ ｄｉｐ法）
上述の形質転換アグロバクテリウムは、ＬＢ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇＬ−１及びハイグロマイシンＢ５０ｍｇＬ−１を含む）で前培養（５ｍｌ）を１日、本培養を１日、３０℃で行った。培養液５００ｍｌを集菌し、浸潤用懸濁培地で１回洗浄し、再び懸濁したものを形質転換アグロバクテリウムの懸濁液とした。
一方、シロイヌナズナは、播種して４週間生育して花茎の高さが１０ｃｍ程度になった摘心済のものを用いた。このシロイヌナズナ（結実している花や鞘を除去したもの）を逆さまにして形質転換アグロバクテリウムの懸濁液に２〜３秒ほど浸して感染させた。そして感染後のシロイヌナズナを、水飽和状態にして２２℃の暗所で２日間静置したのち、水を与えて長日条件下に戻して栽培した。この感染シロイヌナズナを「形質転換第０世代目（Ｔ０世代）」とした。
そしてＴ０世代より得た種子をエタノール７００ｍｌＬ−１で懸濁し、軽く遠心して種子を沈殿させた（以下の操作はクリーンベンチ内で実施）。この懸濁液の上清を取り除き、滅菌水を加えて遠心するという操作を３回繰り返して種子をリンスした。リンス後の種子を、１ｇＬ−１アガロース（Ｗａｋｏ社製）水溶液にて懸濁し、１／２×ＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）寒天選択培地（ハイグロマイシンＢ ５０ｍｇＬ−１を含む）に播種し４℃で一晩低温処理した後、２２℃の長日条件下で栽培した。この選択培地において育つ形質転換シロイヌナズナ（Ｔ０世代より得た種子から育つ形質転換体）を「形質転換第１世代目（Ｔ１世代）」とした。
なお特に断りのないかぎり、Ｔ（ｎ）世代より得た種子から上記条件にて生育の形質転換シロイヌナズナをＴ（ｎ＋１）世代とする（ｎは正の整数）。
【００４２】
５）ＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験（ＲＴ−ＰＣＲ法）
上述のＴ１世代の葉からｔｏｔａｌＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いてＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認を行った。
本実施例３のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして本実施例３のシロイヌナズナの葉１枚(約１０ｍｇ)を、氷冷したスクリューキャップチューブ（２ｍｌ容）に入れ、これに滅菌したグラスビーズ（直径０．２５−０．５ｍｍ）を適量加え、グラスビーズ細胞破砕機（商品名：ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤ−８、ＢＩＯＳＰＥＣ−ＣＳＣ社製）を用いて葉の細胞を破砕した。なお破砕は細胞破砕機の最大速度で行い、３０秒間破砕の後、氷上で１分間冷却する事によって、細胞液の温度上昇を防いだ。この操作を５回繰り返した後、ＲＮＡ抽出用試薬１ｍｌ（商品名：ＩＳＯＧＥＮ、日本ジーン社製）を遠心チューブ（ｌ．５ｍｌ容）に入れて撹拌した後、５０℃で１０分間保温したものをサンプルとした。以下、「（１）ソバ由来のｔｏｔａｌＲＮＡの採取」と同様の操作を行い、Ｔ１世代のｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。このＴ１世代のｔｏｔａｌＲＮＡより、上述の「（２）ソバ由来のｃＤＮＡテンプレートの作成」と同様の操作を行い、「Ｔ１世代のｃＤＮＡテンプレート」を作成した。このＴ１世代のｃＤＮＡテンプレートと、プライマＭＲＰ５’と、プライマＭＲＰ−３‘Ｓａｌｌを用いてＰＣＲを行った。このとき、シロイヌナズナのハウスキーピング遺伝子であるアクチン（Ａｃｔｉｎ）をコントロールとして同時に検出した。すなわち上述のプライマＭＲＰ５’及びプライマＭＲＰ−３’Ｓａｌｌと共にアクチン検出用のプライマａｃｔｉｎ５’及びプライマａｃｔｉｎ３’を混入して上記ＰＣＲを行い、実施例３のＰＣＲ溶液を得た。
また比較例３のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例３と同一条件でＲＴ−ＰＣＲを実施し、比較例３のＰＣＲ溶液を得た。
そして実施例３のＰＣＲ溶液と比較例３のＰＣＲ溶液を並べてアガロースゲルにアプライして電気泳動したのち、エチジウムブロマイドにて各バンドを染色し、紫外線下で撮影した。
【００４３】
［ＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入したシロイヌナズナの重金属耐性試験］
（Ａ）鉛耐性試験
（ａ）地上部の生鮮重量測定試験（Ｔ１世代）
実施例４のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例４のシロイヌナズナを、１,０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移して栽培した。そして、４週間栽培後における実施例４の地上部の生鮮重量を測定した。なお、試験は少なくとも３連で行い、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行い、統計的に有意な差の有無を判定した。
また比較例４のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例４と同一条件で栽培し、その生鮮重量を測定した。
【００４４】
（ｂ）地下部（根）の伸長測定試験
実施例５のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例５のシロイヌナズナを、１００、２５０、５００、７５０及び１，０００μｍｏｌＬ−１になるよう硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして同寒天培地を垂直に立て２２℃、長日条件下で生育し、１週間後及び２週間後における実施例５の根の伸長を測定した。なお試験は４連で行った。
また比較例５のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例５と同一条件で栽培し、その根の伸長を測定した。
【００４５】
（Ｂ）鉛集積試験（Ｔ１世代）
（ａ）地上部の鉛集積試験
実施例６のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例６のシロイヌナズナを、７５０μｍｏｌＬ−１になるよう硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移して２２℃長日条件下で４週間生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして１個体あたりの地上部全量を、７７℃で２日間乾燥したのち、硝酸過塩素酸分解により湿式分解を行い１個体分の地上部分解液を得た。そして、原子吸光分光光度計でこの地上部分解液の鉛濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。なお試験は少なくとも３連で行った。
また比較例６のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、上記と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、その地上部分解液の鉛含有濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
（ｂ）地下部の鉛集積試験
実施例７のシロイヌナズナとしてＴ１世代の形質転換シロイヌナズナを使用し、上記（Ｂ）（ａ）と同一条件で生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして地下部を回収して蒸留水で洗浄した後１個体あたりの地下部全量を乾燥及び分解し、地下部分解液の鉛含有濃度を測定して１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
また比較例７のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、上記と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、その地下部分解液の鉛含有濃度を測定し１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
【００４６】
（Ｃ）カドミウム耐性試験
（ａ）地上部の生鮮重量測定試験
実施例８のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例８のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した1/2×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして実施例８のシロイヌナズナを、寒天培地を垂直に立てた状態で２２℃、長日条件下生育し、２週間後の地上部生鮮重量を測定した。なお、試験は４連で行った。
また比較例８のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例８と同一条件で栽培し、２週間後の地上部生鮮重量を測定した。
【００４７】
（ｂ）地下部（根）の伸長測定試験
実施例９のシロイヌナズナとして、Ｔ２世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例９のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１になるよう塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、１５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして同寒天培地を垂直に立て２２℃、長日条件下で生育し、２週間後における実施例９の根の伸長を測定した。試験は４連で行った。
また比較例９のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例９と同一条件で栽培し、その根の伸長を測定した。
【００４８】
（Ｄ）カドミウム集積試験
実施例１０のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナの地上部を用いた。そして実施例１０のシロイヌナズナを、４０μｍｏｌＬ−１になるよう塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移した。そして各寒天培地の形質転換シロイヌナズナを、２２℃長日条件下で４週間生育したのち、地上部及び地下部に分割した。そして１個体あたりの地上部全量を７７℃で２日間乾燥させた後、硝酸過塩素酸分解により分解した。そして地上部分解液のカドミウム濃度を原子吸光分光光度計で測定し１個体あたりの地上部のカドミウム集積量を求めた。
また比較例１０のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１０と同一条件で栽培、分割、乾燥及び分解したのち、地上部分解液のカドミウム濃度を測定し１個体あたりの地上部のカドミウム集積量を求めた。
【００４９】
（Ｅ）グルタチオン依存性試験
実施例１１のシロイヌナズナとして、Ｔ１世代の形質転換シロイヌナズナを用いた。そして実施例１１のシロイヌナズナを、グルタチオン合成阻害剤であるブチオニンスルオキシミン{Ｌ−．ｂｕｔｈｉｏｎｉｎｅ−［Ｓ，Ｒ］−ｓｕｌｆｏｘｉｍｉｍｅ（ＢＳＯ）}２００μｍｏｌＬ−１と硝酸鉛７５０μｍｏｌＬ−１を加えた１／２×ＭＳ寒天培地（１５ｇＬ−１スクロース、５ｇＬ−１アガロース）に移し、４週間栽培して実施例１１におけるＢＳＯ存在下の鉛集積を調べた。
また比較例１１のシロイヌナズナとして、野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１１と同一条件で栽培し、ＢＳＯ存在下の鉛集積を調べた。
【００５０】
［Ｔ３世代のシロイヌナズナを用いた各種試験］
上記４）「シロイヌナズナの形質転換」の手法に従い、Ｔ３世代のシロイヌナズナ（実施例１３（Ｌ１６）、実施例１４（Ｌ４））を得た。
そして上記５）「ＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験」の手法に従い、これらＴ３世代のシロイヌナズナについてＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現確認試験を行った。
【００５１】
（Ｆ）地上部及び地下部の生鮮重量測定試験（Ｔ３世代）
実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナを、２５０、５００又は７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地に移した。そして実施例１３のシロイヌナズナを、寒天培地を垂直に立てた状態で２２℃、長日条件下で生育し、２週間後の地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。試験は少なくとも３連で行い、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定を行い、統計的に有意な差の有無を判定した。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、実施例１３と同一条件で栽培し、その地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。
そして比較例１３のシロイヌナズナとして野生株（形質転換していないシロイヌナズナ）を使用し、実施例１３と同一条件で栽培し、その地上部及び地下部の生鮮重量を測定した。
【００５２】
（Ｇ）鉛集積試験（Ｔ３世代）
（ａ）地上部の鉛集積試験
上述の生鮮重量測定試験後の実施例１３、実施例１４及び比較例１３を用いた。
すなわち実施例１３（Ｌ１６）に係るシロイヌナズナの一個体あたりの地上部全量を７７℃で２日間乾燥したのち、硝酸過塩素酸分解により湿式分解を行い１個体分の地上部分解液を得た。そして、原子吸光分光光度計でこの地上部分解液の鉛濃度を測定し１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で乾燥及び分解したのち１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で乾燥及び分解したのち１個体あたりの地上部の鉛集積量を求めた。
【００５３】
（ｂ）地下部の鉛集積試験
同様に上述の生鮮重量測定試験後の実施例１３、実施例１４及び比較例１３を用いた。すなわち実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナの地下部を回収して蒸留水で洗浄した後１個体あたりの地下部全量を乾燥及び分解し、地下部分解液の鉛含有濃度を測定して１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
また実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で洗浄、乾燥及び分解したのち１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナを、上記実施例１３と同一条件で洗浄、乾燥及び分解したのち１個体あたりの地下部の鉛集積量を求めた。
【００５４】
（Ｈ）「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」における鉛集積試験
実施例１５として、実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナの種子（Ｔ４世代）を用いた。このＴ４世代の種子を、１０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛及び１０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、２２℃にて１８日間、長日条件下で栽培した(種子９粒／１プラントボックス、３連)。そしてこの「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」の植物体全体を回収して、その生鮮重量を測定するとともに、その鉛集積量、鉛集積濃度及びカドミウム集積量を測定した。なお鉛集積濃度とは、植物体の乾燥重量あたりの鉛重量（μｇｇ−１ｄ．ｗ．）である。
また実施例１５の種子を、２５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、上記実施例１５の栽培条件にて栽培した。そしてこの「Ｐｂ含有培地」の植物体全体を回収して、その生鮮重量、鉛集積量、鉛集積濃度及びカドミウム集積量を測定した。
また比較例１５として、野生株のシロイヌナズナの種子を、１０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛及び１０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地（５ｇＬ−１アガロース）に播種して、上記実施例１５の栽培条件と同一条件にて栽培した。
【００５５】
［結果］
図１は、酵母による鉛耐性試験の結果を示す図である。
菌体濃度Ｏ．Ｄ．６００＝１０−１の実施例１の酵母は、０〜４５μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加したＹＰＤ寒天培地でその生育が認められた。一方、比較例１の酵母は、０〜３０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加したＹＰＤ寒天培地でその生育が認められたが、３０μｍｏｌＬ−１以上の硝酸鉛濃度下ではほとんど生育が認められなかった。このことから実施例１の酵母はソバ由来の強力な鉛耐性を発揮することがわかった。
【００５６】
図２は、酵母によるカドミウム耐性試験の結果を示す図である。
実施例２の酵母と比較例２の酵母は、０〜６０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加したＹＰＤ寒天培地において生育度合に差がなかった。このことから、実施例２の酵母は、カドミウムに対する耐性が強化しておらず、またカドミウムを酵母内にほとんど蓄積しないことが示唆された。
そして、このカドミウム耐性試験の結果（図２）と上述の鉛耐性試験の結果（図１）を総合すると、実施例の酵母は、その生育過程においてＭＲＰを発現することにより、鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが示唆された。
【００５７】
図１２は、酵母による酸化クロム耐性試験の結果を示す図である。
実施例１２の酵母と比較例１２の酵母は、共に１００〜７００μｍｏｌＬ−１の酸化クロムを添加したＹＮＢ−Ｕｒａ−寒天培地において生育度合に差がなかった。そして実施例１２の酵母と比較例１２の酵母は、いずれも８００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム存在下で生育の遅延が認められるとともに、９００μｍｏｌＬ−１の酸化クロム存在下で生育が阻害される結果となった。このことから実施例１２の酵母は、酸化クロムに対する耐性が強化しておらず、また酸化クロムを酵母内にほとんど蓄積しないことが示唆された。
【００５８】
そして上述の図１、図２及び図１２の結果を総合評価すると、本実施例の形質転換酵母は鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが示唆された。
このことからＦｅＭＲＰ３遺伝子を導入した植物体も同様に、鉛を効率良く蓄積する一方、カドミウムや酸化クロムをほとんど蓄積しない機能（鉛を選択的に蓄積する機能）を発揮することが強く示唆される。
【００５９】
図３は、シロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
実施例３のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できた。一方、比較例のシロイヌナズナ３ではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できなかった。このことから、実施例３のシロイヌナズナにはＦｅＭＲＰ３遺伝子が発現しており、恒常的に発現（過剰に発現）していると推察された。
なお、実施例３及び比較例３のシロイヌナズナいずれにおいても、アクチン遺伝子の発現を確認できたことから、ＲＴ−ＰＣＲの操作自体は成功したことがわかった。
【００６０】
［鉛耐性試験の結果］
図４は、地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
実施例４のシロイヌナズナの地上部は、比較例４と比較すると１,０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地で格段に大きく生育した。このことから実施例４のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛耐性を発揮することがわかった。
【００６１】
図５は、地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
実施例５及び比較例５のシロイヌナズナは、１００、２５０、５００、７５０及び１，０００μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地における根の生育度合に顕著な差がなかった。
そして、この地下部（根）の伸長測定試験（図５）の結果と、上述の地上部の生鮮重量測定試験（図４）を総合すると、実施例４のシロイヌナズナの鉛耐性は、発現したＭＲＰの機能（地下部から地上部に鉛を輸送する機能）に由来することがわかった。
【００６２】
図６は、地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図であり、図７は、地下部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
実施例６のシロイヌナズナの地上部には、比較例６と比較すると、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛を添加した１／２×ＭＳ寒天培地から格段に高濃度の鉛を蓄積することが認められた。そして実施例７及び比較例７のシロイヌナズナの地下部には鉛蓄積に顕著な差がなかった。
このことから、実施例６のシロイヌナズナは、発現したＭＲＰでもって地上部に鉛を輸送することにより、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛蓄積能を発揮したことがわかった。
【００６３】
［カドミウム耐性試験の結果］
図８は、地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図であり、図９は、地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
実施例８のシロイヌナズナの地上部は、比較例８と比較すると、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地でほとんど生育しなかった。このことから実施例８のシロイヌナズナは、シロイヌナズナが本来的に有するカドミウム耐性を喪失しているか又は極めて弱いことがわかった。
また実施例９及び比較例９のシロイヌナズナは、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウム存在下における根の生育度合に顕著な差がなかった。このことから、実施例のシロイヌナズナでは、発現したＭＲＰが、シロイヌナズナ本来のカドミウム輸送能力を積極的に阻害していることが推察される（なお、この推察は本発明を何ら拘束しない）。
【００６４】
図１０は、地上部のカドミウム集積試験の結果を示す図である。
実施例１０のシロイヌナズナは、４０μｍｏｌＬ−１の塩化カドミウムを添加した１／２×ＭＳ寒天培地において、ほとんど生育しなかった。一方、比較例１０のシロイヌナズナは通常どおり生育した。このことから、実施例のシロイヌナズナは、シロイヌナズナが本来的に有するカドミウム蓄積能力を喪失しているか又はその能力が極めて弱いことがわかった。
【００６５】
上述の試験結果を総合的に評価すると、本実施例のシロイヌナズナは、［鉛耐性試験の結果］より、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛蓄積能及び耐性を発揮することがわかった。そして本実施例のシロイヌナズナは、［カドミウム耐性試験の結果］より、カドミウム蓄積能及び耐性を喪失しているか又は極めて弱いことがわかった。
すなわち本実施例のシロイヌナズナは、その生育過程において塩基配列（Ａ）又は（Ｂ）に対応のタンパク質（ＭＲＰ）を発現し、鉛は効率良く蓄積するがカドミウムはほとんど蓄積しない（特定の重金属を選択的に蓄積する）機能を発揮することがわかった。
【００６６】
［グルタチオン依存性試験の結果］
図１１は、グルタチオン依存性試験の結果を示す図である。
実施例１１のシロイヌナズナは、グルタチオン合成阻害剤ＢＳＯを加えた培地であっても強い鉛集積能及び耐性を示した。このことから、実施例１１のシロイヌナズナにおいて発現したＭＲＰは、グルタチオン非依存的に機能することがわかった。
このことより、実施例１１のシロイヌナズナにおいて発現したＭＲＰは、イオン化した鉛もしくはグルタチオン以外の物質によりキレート化された鉛を輸送しているものと考えられる。
【００６７】
［Ｔ３世代の形質転換シロイヌナズナ］
図１３は、Ｔ３世代のシロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できた。一方、比較例１３（野生株）のシロイヌナズナではＦｅＭＲＰ３遺伝子の発現が確認できなかった。
なお実施例１３及び比較例１３のいずれにおいても、アクチン遺伝子の発現を確認できたことから、ＲＴ−ＰＣＲの操作自体は成功したことがわかった。
【００６８】
図１４（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の生鮮重量測定試験の結果を示す図であり（ｂ）は、地下部の生鮮重量測定試験の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナは、比較例１３（野生株）と比較して、２５０μｍｏｌＬ−１から７５０μｍｏｌＬ−１へ硝酸鉛濃度が増加しても生鮮重量が極端に低下することはなかった。
特に実施例１３のシロイヌナズナは、２５０μｍｏｌＬ−１〜７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛濃度範囲で十分に大きく生育した。すなわち実施例１３のシロイヌナズナは硝酸鉛濃度が７５０μｍｏｌＬ−１に増加しても、地上部の生鮮重量の低下は僅か７％であり（ほぼ横ばいであり）、地下部での生鮮重量の低下は認められなかった。
【００６９】
これとは反対に比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、硝酸鉛濃度の増加に伴いその生鮮重量が極端に減少した。すなわち比較例１３のシロイヌナズナは硝酸鉛濃度が７５０μｍｏｌＬ−１に増加することにより、地上部の生鮮重量が４３％低下し、地下部の生鮮重量が４９％低下した（地上部及び地下部の生鮮重量がほぼ半減した）。
以上のことからＴ３世代（実施例１３及び実施例１４）のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な（実用に耐え得る）鉛耐性をＴ１世代及びＴ２世代より引き継いでいることがわかった。
【００７０】
図１５（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の鉛集積試験の結果を示す図である。図１５（ｂ）は、Ｔ３世代における地下部の鉛集積試験の結果を示す図である。
実施例１３（Ｌ１６）及び実施例１４（Ｌ４）のシロイヌナズナは、硝酸鉛濃度の増加に伴い、より多くの鉛を蓄積する傾向があることがわかった。特に実施例１３（Ｌ１６）のシロイヌナズナは、比較例１３と比較して、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛存在下で極めて高い鉛蓄積能を発揮することがわかった。
これとは逆に比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、硝酸鉛の添加量とは関係なくその鉛蓄積能が低いことがわかった。そして比較例１３（野生株）のシロイヌナズナは、７５０μｍｏｌＬ−１の硝酸鉛存在下でほとんど鉛を蓄積しなかった。
【００７１】
以上のことからＴ３世代（実施例１３及び実施例１４）のシロイヌナズナは、ソバ由来の強力な鉛蓄積能をＴ１世代及びＴ２世代より引き継いでいることがわかった。
そして図１３〜図１５の結果を総合的に考察して、本実施例によれば、組み換え植物としてのラインが確立する（実用に耐え得る）Ｔ３世代の組み換え植物種子を獲得できたことがわかった。
【００７２】
［鉛・カドミウム複合含有培地における各種試験の結果（Ｔ４世代）］
図１６は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における生鮮重量の測定結果を示す図である。
「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）の生鮮重量は、「Ｐｂ含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）と比較して極端に低下することはなかった。一方、比較例１５のシロイヌナズナは生育が不十分であり、分析に供する十分な植物体量（生鮮重量）が得られなかった。
【００７３】
また図１７（ａ）は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における鉛集積量の測定結果を示す図であり、（ｂ）は、鉛集積濃度の測定結果を示す図である。
「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）の鉛集積量及び鉛集積濃度は、「Ｐｂ含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）と比較して遜色のないものであった（見かけ上増加しているが、ｔ−検定では差は認められなかった）。
一方、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」のシロイヌナズナ（実施例１５）からはカドミウムが検出されなかった。
このことから本実施例のシロイヌナズナは、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」（鉛・カドミウム複合汚染条件）においても十分な鉛除去能力を維持すること（特に鉛を選択的に蓄積する機能を発揮すること）が判明した。
【００７４】
本発明の植物体及び土壌浄化方法は、本実施の形態で説明した外観、構成、処理、表示例等に限定されず、本発明の要旨を変更しない範囲で種々の変更、追加、削除が可能である。
すなわち本実施例においては、塩基配列１のＤＮＡをＰＣＲにて獲得する例を説明した。これとは異なり、塩基配列１のＤＮＡを化学的に合成してもよい。化学的に合成する場合には、例えば、長鎖ＤＮＡの合成方法として知られている藤本らの手法（藤本英也、合成遺伝子の作製法、植物細胞工学シリーズ７植物のＰＣＲ実験プロトコール、１９９７、秀潤社、ｐ９５−１００）を採用することができる。
【００７５】
また、ソバ由来の多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質（ホモログタンパク質）をコードするＤＮＡも本実施例のＤＮＡに含まれる。
なお、上記タンパク質のアミノ酸変異数は、ＭＲＰに求められる所望の重金属輸送活性が維持できる限り制限しないが、全アミノ酸の７０％以内であることが好ましく、より好ましくは、３０％以内であり、さらに好ましくは２０％以内である。
そしてホモログタンパク質は、ＡＢＣトランスポータに特徴的なドメイン｛例えば、膜貫通領域ＡＢＣ ＴＭＦ１（ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｙｐｅ―１ ｆｕｓｅｄ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）｝を有していることが好ましい。
【００７６】
また、本実施例においては宿主植物体としてシロイヌナズナを用いた例を説明したが、宿主植物体として各種の植物を使用可能であり、例えば、アブラナ、ナタネ又は菜の花などの油料系植物を宿主植物体として使用可能である。このようにすれば、油料系植物の生育によって汚染土壌の浄化を達成できると同時に、収穫した油料系植物を、ディーゼルエンジンなどのエンジン燃料（例えば菜種油）原料として用いることもできる。すなわち本実施例は、汚染土壌の浄化技術とエネルギー生産技術に併用して適用することができる。なお、収穫した油料系植物に含有の重金属イオンは親水性が高いので、油料系植物より得られる油脂成分への重金属混入はほとんどないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】酵母による鉛耐性試験の結果を示す図である。
【図２】酵母によるカドミウム耐性試験の結果を示す図である。
【図３】シロイヌナズナにおけるＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
【図４】鉛存在下における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
【図５】鉛存在下における地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
【図６】地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図７】地下部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図８】カドミウム存在下における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図である。
【図９】カドミウム存在下における地下部（根）の伸長（Ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ）測定試験の結果を示す図である。
【図１０】地上部のカドミウム集積（Ｃｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図である。
【図１１】グルタチオン依存性試験の結果を示す図である。
【図１２】酵母による酸化クロム耐性試験の結果を示す図である。
【図１３】Ｔ３世代におけるシロイヌナズナのＦｅＭＲＰ３遺伝子発現の結果を示す図である。
【図１４】（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）測定試験の結果を示す図であり、（ｂ）は、地下部の生鮮重量測定試験の結果を示す図である。
【図１５】（ａ）は、Ｔ３世代における地上部の鉛集積（Ｐｂ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）試験の結果を示す図であり、（ｂ）は、地下部の鉛集積試験の結果を示す図である。
【図１６】「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」における生鮮重量（Ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ）及び「Ｐｂ含有培地」における生鮮重量の測定結果を示す図である。
【図１７】（ａ）は、「Ｐｂ・Ｃｄ複合含有培地」及び「Ｐｂ含有培地」における鉛集積量の測定結果を示す図であり、（ｂ）は、鉛集積濃度の測定結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入した植物体。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、以下の（Ａ）又は（Ｂ）である請求項１に記載の植物体。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の植物体を、重金属で汚染状態の土壌にて生育した後、収穫することを特徴とする土壌浄化方法。
【請求項１】
鉛などの重金属輸送活性を有するソバ由来タンパク質をコードするＤＮＡを導入した植物体。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、以下の（Ａ）又は（Ｂ）である請求項１に記載の植物体。
（Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｂ）配列番号１に記載の塩基配列の全体若しくは一部の配列からなるＤＮＡあるいはその相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、重金属輸送活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の植物体を、重金属で汚染状態の土壌にて生育した後、収穫することを特徴とする土壌浄化方法。
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１２】
【図１３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００８−２２０３６８（Ｐ２００８−２２０３６８Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３０６２（Ｐ２００８−３３０６２）
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（０００２１３２９７）中部電力株式会社 (811)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１４日（２００８．２．１４）
【出願人】（０００２１３２９７）中部電力株式会社 (811)
【出願人】（３０４０２６６９６）国立大学法人三重大学 (270)
【Ｆターム（参考）】
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