陰イオン交換を用いる核酸精製方法
本発明は、核酸分子を精製するための改良方法を提供する。本方法は、核酸を含む細胞溶解物を生成する段階、陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、溶解物を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、次いで溶離液からなる水性移動相を用いて陰イオン交換体から核酸を溶離する段階、及び下流用途に適するように溶離核酸を脱塩する段階を含んでなる。本方法の改良は、水性移動相のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３にするような組成物を溶離液中に添加することを含み、溶離液中における組成物の存在が組成物の不存在下での回収率に比べて核酸回収率の増加をもたらすことからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、タンパク質、脂質、可溶性膜成分などの汚染細胞成分からゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡのような核酸を分離する方法に関する。詳しくは、本発明は、溶離液のｐＨを高める組成物の添加によってバッチモード又は充填モードにおける陰イオン交換クロマトグラフィー媒質からの核酸回収率を向上させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の３０年間、生物学的供給源から核酸を単離及び精製するための改良法の開発に多大の努力が見られた。これは、主として医学及び生物学における核酸の用途が増加したことに原因する。血液、組織又は培養細胞から単離されたゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーション及びサザンブロッティングを含む様々な用途を有している。プラスミドＤＮＡは、配列決定、ＰＣＲ、ワクチン開発及び遺伝子療法において利用されてきた。単離ＲＮＡは、ブロットハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲを含む各種の下流用途を有している。
【０００３】
核酸の分析及びインビトロ操作の前には、通例、後続の処理手順を妨害することがある不要の夾雑物を核酸から除去するための核酸単離段階が実施される。研究用及び診断用の分子生物学におけるほとんどの方法については、最初の段階として抽出された核酸が要求される。典型的なＤＮＡ抽出プロトコルでは、研究対象となる核酸を含む細胞又はホモジナイズド組織試料を採取し、標準的な方法（例えば、プロテイナーゼＫ及びリゾチームのような酵素の使用、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ＨＣｌ００のような洗浄剤の使用、或いは水酸化ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジニウムなどの他の化学薬品の使用）を用いて溶解する。（例えば、Sambrook et al,Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd edition 9.14(New York:Cold Spring Harbor Laboratory 1989)を参照されたい。）細胞破片の除去後、粗溶解物をフェノール／クロロホルムのような有機溶媒で処理してタンパク質を抽出する。必要ならば、ＲＮアーゼのような酵素で処理することでＲＮＡを除去又は低減できる。しかし、塩類、フェノール、洗浄剤などの夾雑物の存在は、核酸に対して想定されている多くの下流操作を妨害することがある。
【０００４】
現在、ＤＮＡ（ゲノム及びプラスミド）及びＲＮＡのクロマトグラフィー精製のためには、例えばシリカベース膜精製、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、磁気ビーズベース精製又はイオン交換クロマトグラフィーの使用によるいくつかの方法が利用可能である。イオン交換クロマトグラフィーは最も普通に使用される分解及び精製方法の１つであり、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの精製のために使用されてきた。例えば、米国特許第６，４１０，２７４号（Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ），米国特許第６，３１０，１９９号（Ｓｍｉｔｈら）、米国特許第６，０９０，２８８号（Ｂｅｒｌｕｎｄら）、米国特許第５，９９０，３０１号（Ｃｏｌｐａｎら）、米国特許第５，８５６，１９２号、米国特許第５，８６６，４２８号（Ｂｌｏｃｈ）、米国特許第５，８０１，２３７号（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）、欧州特許第１１２５９４３号（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ）、欧州特許第９９２５８３号、欧州特許第６１６６３９号（Ｑｉａｇｅｎ）、米国特許第５，７０７，８１２号、米国特許第５，５６１，０６４号（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【０００５】
核酸精製のための陰イオン交換クロマトグラフィー方法を広範囲にわたって参照してきたが、現行のプロトコルの欠点の１つは溶離段階における核酸の回収率が悪いことである（Endres, H.N. et al, Biotechnol. Appl. Biochem., (2003), 37(3), 259-66; Prazeres, D.M. et al, J. Chromatog. A. (1998), 806(1), 31-45; Urthaler J. et al, Acta Biochim. Pol., (2005), 52(3), 703-11; Ferreira, G.N. et al, Bioseparation, (2000), 9(1), 1-6; Ferreira, G.N., et al, Biotechnol. Prog., (2000), 16(3), 416-24）。吸着及び脱離時にポリオール及びアルコールのような有機薬剤を添加することは、ＤＮＡの陰イオン交換精製に際して選択率及び回収率を向上させることが示された（Tseng, W.C. et al, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., (2003), 791(1-2), 263-72）。しかし、陰イオン交換樹脂からのＤＮＡ脱離に際してしばしば見られる回収率の問題とまともに取り組んだ報告は存在しないように思われる。この問題は陰イオン交換樹脂からの結合ＤＮＡの回収率を向上させることに関係するので、本発明はそれと取り組んでいる。特に、本発明はプロトコルのさらなる操作なしに固体担体からのＤＮＡ脱離の向上を可能にする。
【０００６】
プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは互いに類似した電荷特性を有しており、高い電荷密度を有するポリ陰イオンである。したがって、吸着すべき核酸の鎖長及びコンホメーションに応じ、最大０．７Ｍの塩化ナトリウムの存在下で正に帯電したイオン交換樹脂に結合することが可能である。核酸鎖長の増加並びに二本鎖コンホメーションは、核酸と陰イオン交換体との間の結合強度の増加をもたらす。しかし、この効果は約２キロベースまでの核酸鎖長に比例するにすぎない。核酸の負に帯電したリン酸エステル主鎖とイオン交換樹脂との間の非常に強い相互作用は、通常の方法を用いて核酸を溶離するのを妨げる。通常の方法では、塩溶離液のイオン強度を単に増加させるだけで７０〜１００％の結合物質を回収するのに十分である。しかし、長鎖核酸の場合には、最大３Ｍまで塩のイオン強度を増加しても２０〜５０％の結合核酸しか回収できない。残りの結合物質の回収は、高い塩濃度と水酸化ナトリウムを用いて高めたｐＨとの組合せで達成できる。しかし、水酸化ナトリウムは苛性を示すばかりでなく、核酸の不可逆的な変性及び経時的な分解を引き起こすことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２７４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９０，２８８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９９０，３０１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８５６，１９２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８６６，４２８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８０１，２３７号明細書
【特許文献８】欧州特許第１１２５９４３号明細書
【特許文献９】欧州特許第９９２５８３号明細書
【特許文献１０】欧州特許第６１６６３９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，７０７，８１２号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５６１，０６４号明細書
【特許文献１３】欧州特許第１２４３６４９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd edition 9.14 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1989)
【非特許文献２】Endres, H.N. et al, Biotechnol. Appl. Biochem., (2003), 37(3), 259-66
【非特許文献３】Prazeres, D.M. et al, J. Chromatog. A. (1998), 806(1), 31-45
【非特許文献４】Urthaler J. et al, Acta Biochim. Pol., (2005), 52(3), 703-11
【非特許文献５】Ferreira, G.N. et al, Bioseparation, (2000), 9(1), 1-6
【非特許文献６】Ferreira, G.N., et al, Biotechnol. Prog., (2000), 16(3), 416-24
【非特許文献７】Tseng, W.C. et al, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., (2003), 791(1-2), 263-72
【非特許文献８】Chen et al, Journal of Chromatography, 1118(1), 2006, 3-11
【非特許文献９】Thayer, J.R., et al, Analytical Biochemistry, 338(1), 2005, 39-47
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このたび意外にも、高い塩濃度及び溶離液中における溶離液のｐＨを高める添加剤の存在を含む条件下で核酸を陰イオン交換樹脂から効率的に溶離できると共に、溶離液のｐＨは好適には約ｐＨ９〜約ｐＨ１３の範囲内であり、さらに好ましくは約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２の範囲内であることが見出された。添加剤の一例はグアニジン又はグアニジン様誘導体である。別の例は炭酸カリウムである。溶離液にいずれかの添加剤を添加することは、陰イオン交換樹脂からの核酸回収率を２０〜５０％から７０〜９５％に向上させることが証明された。
【００１０】
かくして第１の態様では、本発明は、細胞から核酸を分離及び／又は精製する方法であって、
ａ）前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
ｂ）陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、及び
ｃ）核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体を溶離する段階
を含んでなる方法において、
前記溶離液が水性移動相のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３にするような添加剤を含み、溶離液中における添加剤の存在が添加剤の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことを特徴する方法を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、通常のイオン交換クロマトグラフィー操作に比べて核酸の安定性を損なうことなく陰イオン交換樹脂から高い回収率の核酸を得るため、溶離液への添加剤としての化合物の使用方法を提供する。核酸はホスホジエステル結合によって共有結合されたデオキシリボースリン酸エステルモノマーの鎖（又はペア鎖）からなり、各糖リン酸エステルは単一の芳香族複素環式塩基を担持している。かかる塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ、ＤＮＡ中にのみ見られる）及びウラシル（Ｕ、ＲＮＡ中にのみ見られる）である。ｐＨ＞２の水溶液中では、高可溶性の親水性糖リン酸エステルポリマー主鎖は、最大２つの負電荷を担持し得る末端ホスホモノエステルを除き、各ホスホジエステルに対して１つの負電荷を与える。このようにＤＮＡはポリ陰イオンであり、核酸分子の正味負電荷は鎖長と直接に関係している。したがって、核酸は陰イオン交換樹脂に対して強い結合親和性を示す結果、樹脂から核酸を効率的に除去するためには溶離液中に高い塩濃度が必要となる。
【００１２】
陰イオン交換樹脂からの核酸回収率に対するグアニジン及びグアニジン様化合物（特にアルギニン）の好ましい効果は、例えば約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のアルカリ性ｐＨ、さらに好ましくは約１０〜１２のｐＨ値において最も顕著である。約１０．５〜１１．６のｐＨ範囲が最適回収率を与えるように思われる。核酸の回収率は、溶離液にアルギニン又は炭酸グアニジンを添加した場合に最も高い。理論によって束縛されることはないが、グアニジニウム基の特異な性質の１つは、二重結合と窒素孤立電子対との間の共役に原因する非局在化正電荷特性である。グアニジニウム基は優先的にグアニン塩基と複数の水素結合を形成することができ、これは核酸構造の局部変形を引き起こすように作用することがある。このような核酸のコンホメーションの変化は脱離動態の変化の一因となり、かくして陰イオン交換クロマトグラフィーに際して核酸の高い回収率を有利に与える。高分子は複数の付着点を介して吸着表面に結合してクロマトグラフィー媒質表面上にミクロ環境を生み出すことが知られており、こうして生じる吸着は通常の脱離技法では不可逆に近くなることがある。従来の陰イオン交換クロマトグラフィーでは、競合する塩陰イオンを増加させることで正に帯電したリガンドから結合分子を溶離することができるが、核酸、特に（０．１キロベースを超える）高分子量（ＨＭＷ）核酸の溶離は塩陰イオンのみでは効率的でないことが認められている。また、対イオンとして使用される陽イオン並びに溶離のｐＨはＨＭＶ核酸の回収率に対して影響を及ぼすと共に、強アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）の使用は夾雑物の同時溶離及び生成物の安定性に対する有害効果のため回収率にとって有害であり得ることも認められている。
【００１３】
一実施形態では、添加剤は下記の式（Ｉ）を有する化合物（さらに詳しくは、その炭酸塩又は重炭酸塩）である。
【００１４】
【化１】
式中、ＲはＨ及び任意にはアミノで置換された低級アルキルから選択される。好適には、低級アルキルはＣ１〜Ｃ４アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル、好ましくはメチル又はエチルである。Ｒがアミノ置換低級アルキル基である場合、式（Ｉ）に係る化合物の例には、２−アミノエチル−グアニジン、３−アミノプロピル−グアニジン及び４−アミノブチル−グアニジン（アグマチン）がある。特に好ましい実施形態では、Ｒは水素であり、したがって化合物（Ｉ）は炭酸塩又は重炭酸塩としてのグアニジンである。
【００１５】
第２の実施形態では、添加剤は下記の式（Ｉ）を有する化合物である。
【００１６】
【化２】
式中、Ｒは次式の基である。
【００１７】
【化３】
式中、ｎは１、２又は３、好ましくは３である。この場合、添加剤はアルギニン、好適にはＬ−アルギニン、Ｄ−アルギニン又は両光学異性体の混合物である。
【００１８】
第３の実施形態では、添加剤は同様なｐＨを与える無機塩である。かかる塩の一例は炭酸カリウムである。別の例は炭酸ナトリウムである。
【００１９】
本発明の実施形態では、グアニジン又はグアニジン様化合物或いは炭酸カリウムは、０．１〜２Ｍ、好ましくは０．２５〜０．５Ｍの濃度で溶離液中に添加剤として存在することが好ましい。溶離液は、通例、好適には約０．７〜３Ｍの塩溶液に添加剤を添加したものからなる。好適には、水性移動相のｐＨは約ｐＨ９〜約ｐＨ１３であり、好ましいｐＨ範囲は約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２であり、さらに好ましくは約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である。
【００２０】
本明細書中で使用する「核酸」という用語は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、或いはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、或いはＤＮＡ及び／又はＲＮＡの混合物をいう。したがって、「核酸」という用語はゲノムＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、総ＲＮＡ及びｍＲＮＡを含むことが意図されている。本発明に係る方法は、種（例えば、ヒト、齧歯類、猿類）、組織源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）及び細胞タイプ（例えば、上皮細胞、内皮細胞、血液）に関して一般に認められている任意の供給源（正常細胞及び形質転換細胞を含む）からの細胞試料及び組織試料から導かれる複合成分混合物からのゲノムＤＮＡの調製及び／又は精製のために特に適している。
【００２１】
さらに、本発明の方法は、約０．１〜約２００キロベースのサイズを有するゲノムＤＮＡ或いはプラスミドＤＮＡ、コスミド、ＢＡＣ又はＹＡＣの調製及び／又は精製のために適している。本発明は、特にクローニング及び配列決定のような分子生物学研究における下流用途、遺伝子療法並びにインビボ及びインビトロでの診断用途のためにプラスミドＤＮＡ及びコスミドＤＮＡを精製するのに有用である。
【００２２】
本発明の方法で使用するのに適した陰イオン交換樹脂には、強陰イオン交換体及び弱陰イオン交換体の両方がある。この場合、陰イオン交換樹脂は好適には支持キャリヤーに帯電基又は帯電可能基を結合したものからなる。イオン交換樹脂はビーズ、膜又は表面の形態を有し得る。強陰イオン交換樹脂の例には、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱがある。弱イオン交換樹脂の例には、ＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂及びＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂がある（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
【００２３】
上記に開示した添加剤を水性移動相中に使用することで、溶離液中に添加剤が存在しないこと以外はすべて等しい条件下で同じ陰イオン交換体から核酸を回収する場合に比べて、陰イオン交換体からの核酸回収率を４０％以上、通例は約４０〜約４００％増加させることが可能である。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、細胞試料から核酸を分離及び／又は精製するためのキットであって、細胞試料から核酸含有水溶液を生成するための溶解液、核酸を結合するための、固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体、陰イオン交換体から核酸を溶離するための溶離液、及び任意には溶離核酸を脱塩するための脱塩手段を含んでなるキットを提供する。好適には、前記溶離液のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のｐＨにするような添加剤が溶離液中に存在する。
【００２５】
一実施形態では、添加剤はアルギニンである。別の実施形態では、添加剤は炭酸塩又は重炭酸塩として存在するグアニジンである。さらに別の実施形態では、添加剤は炭酸カリウムである。
【００２６】
好ましくは、陰イオン交換体はＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂である。別法として、陰イオン交換体はＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ又はＣａｐｔｏＱ樹脂（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）である。
【００２７】
本発明のその他の特徴及び利点は、好ましい実施形態に関する以下の説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る方法を用いてヒト血液試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図２】図２は、ヒト血液試料からの精製ゲノムＤＮＡのアガロースゲルイメージを示している。
【図３】図３は、ヒト血液試料から精製した制限酵素（ＥｃｏＲＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【図４】図４は、ヒト血液からのゲノムＤＮＡ試料について得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示しており、試料間において非常によく似た増幅プロファイルが認められる。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る方法を用いてラット肝臓試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図６】図６は、ラット肝臓試料からのゲノムＤＮＡ試料について得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示しており、試料間において非常によく似た増幅プロファイルが認められる。
【図７】図７は、ラット肝臓試料から精製した制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る方法を用いて培養ＭＲＣ５細胞試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図９】図９は、ＭＲＣ５細胞試料から精製した制限酵素（ＥｃｏＲＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の実施例は本発明の実施形態に係るＤＮＡ精製プロセスを例示するために役立つものであり、限定的なものではない。
【００３０】
（Ａ）実施例で使用するプロトコル
（ａ）血液からのゲノムＤＮＡの単離
血液からのゲノムＤＮＡ単離は２段階で行われる。第１の段階は細胞の溶解であり、第２の段階はイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるゲノムＤＮＡの精製である。
【００３１】
溶解：このプロセスは２つの段階を含んでいる。まず白血球を単離し、次いで溶解液を用いて単離した白血球を溶解する。白血球の単離及び白血球の溶解のために使用するプロトコルは下記の通りである。ここでは、一例として５ｍｌの血液を使用する。しかし、使用する血液の量に応じてプロトコルを調整することができる。
１．５ｍｌの全血を５０ｍｌの円錐形遠心管に加える。
２．５ｍｌの予冷した溶解１液及び１５ｍｌの冷水を試料に加える。管をラックに入れ、管を１０〜１５回転倒させることでよく混合する。
３．周囲温度で１０分間インキュベートする。
４．１５００×ｇで１０分間遠心する。
５．ペレットを乱すことなく、希釈漂白液を入れた廃棄物容器内に上澄みを廃棄する（又はＥＨＳによって推奨される適切な安全対策に従う）。
６．１ｍｌの溶解１液及び３ｍｌの水を遠心管に加え、短時間渦動させることでペレットを再懸濁する。
７．５０００×ｇで１０分間遠心する。
８．白血球ペレットを乱すことなしに上澄みを注意深く廃棄する。
９．最高速度で３０秒〜１分間渦動させることで白血球ペレットを５ｍｌの溶解２液中に再懸濁する。
１０．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）（ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え、短時間渦動させ、周囲温度で２０分間インキュベートする。
１１．５ｍｌのローディング液を遠心管に加え、管を渦動させることでよく混合し、この溶液を精製カラム上にロードする。
【００３２】
精製：精製プロセスは脱塩プロセス（段階１７〜２１）も含んでいる。
１２．イオン交換精製カラム（計器上での自動化プロセスを用いて充填された、プラスチック管内の約１．５ｍｌのイオン交換樹脂）の頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１３．上記の段階１１から得られた溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
１４．５ｍｌのローディング液をカラムに適用する。
１５．すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１６．２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
【００３３】
脱塩：
１７．脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
１８．２５ｍＬの１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を適用することでカラムを平衡化する。これは、ＬａｂＭａｔｅ ＰＤ−１０緩衝液溜め（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いることで一段階で達成できる。
１９．精製段階１６からの溶出液（２．５ｍｌ）を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
２０．溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
２１．３．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液を各カラムに加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用するできる。
【００３４】
（ｂ）組織試料からのゲノムＤＮＡの単離
下記の段階によって組織試料を調製する。精製プロセスから良好な収量のゲノムＤＮＡを得るためには、完全にホモジナイズした試料を使用することが極めて重要である。
１．微小片に切断することで約１００ｍｇの組織を秤取する。
２．組織を１×ＰＢＳ緩衝液で洗う。１ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液を加え、渦動させ、１０００ＲＰＭで１分間遠心する。洗液を捨て、管内に残った微量の緩衝液をピペットで除去する。
３．０．５ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液を加え、試料をハンドヘルドホモジナイザーでホモジナイズする。
【００３５】
こうして調製した組織試料に対し、ゲノムＤＮＡ単離のための下記の段階を施す。段階４〜７は試料溶解のためであり、段階８〜１２は精製のためであり、段階１３〜１７は脱塩のためである。
４．０．５ｍＬの溶解液をホモジナイズド試料に加え（ＰＢＳと溶解液との比＝１：１）、可能な最高速度で２０〜３０秒間渦動させる。
５．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）溶液を加え、短時間渦動させ、６０℃で１〜１．５時間インキュベートする。
６．インキュベーション期間後、反応管を氷浴中で３分間冷却する。２０μｌのＲＮアーゼＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
７．粗溶解物を４ｍｌの無ＤＮアーゼ水及び５ｍｌのローディング液で希釈し、５０００×ｇで１５分間遠心して粒子状物質をペレット化する。
【００３６】
精製
８．精製カラムの頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを５０ｍｌ遠心管内に配置する。
９．溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
１０．５ｍｌのローディング液をカラムに適用する。
１１．すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１２．２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
【００３７】
脱塩
１３．脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
１４．２５ｍＬの１×ＴＥ緩衝液を適用することでカラムを平衡化する。これはＬａｂＭａｔｅ ＰＤ−１０緩衝液溜めを用いることで達成できる。
１５．精製段階１２からの溶出液（２．５ｍｌ）を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
１６．溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１７．３．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液を各カラムに加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用できる。
【００３８】
（ｃ）細胞培養物からのゲノムＤＮＡの単離
下記のプロトコルに従って細胞培養細胞を集め、溶解する。精製及び脱塩は、上記のプロトコル（ｂ）（「組織試料からのゲノムＤＮＡの単離」）に記載したようにして行う。
１．１×１０７個〜２．０×１０７個までの細胞を１×ＰＢＳ緩衝液（２×５５ｍＬ）で洗う。細胞を５ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、２０００×ｇで１０分間遠心する。緩衝液をペレットから注意深くデカントし、プロセスをもう一度繰り返す。
２．３０秒〜１分間渦動させることで、細胞ペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液中に完全に再懸濁する。
３．４．５ｍｌの溶解液を加え、３０秒〜１分間渦動させる。
４．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、短時間（２秒間）渦動させる。
５．６０℃で１〜２時間インキュベートする。
６．管を氷浴中で２分間冷却し、２０μｌのＲＮアーゼＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加える。
７．３７℃で１５分間インキュベートする。
【００３９】
（ｄ）精製ゲノムＤＮＡ試料の定量化
精製ゲノムＤＮＡ試料の定量化は、ブランクとしての１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）及び光路長１ｃｍのキュベットを使用しながら、ＵＶ分光光度計によって行った。３つの試料の読みをＡ２６０、Ａ２８０及びＡ３２０で求めた。ＤＮＡの収量（μｇ）＝Ａ２６０×５０μｇ×溶出試料体積（３．５ｍｌ）。
【００４０】
（ｅ）プロトコルで使用した溶液の詳細組成
（ｉ）血液ｇＤＮＡプロトコル
溶解１液：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２％トリトンＸ１００及び０．６Ｍスクロース。
【００４１】
溶解２液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ。
【００４２】
ローディング液：７００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。
（ii）組織プロトコル
溶解液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１％ＳＤＳ。
【００４３】
ローディング液：７００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。
（iii）細胞培養物プロトコル
溶解液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１％ＳＤＳ。
【００４４】
（Ｂ）ゲノムＤＮＡ溶離に関する各種溶液の評価
ゲノムＤＮＡ精製のための最適溶離液を見付けようという努力の中で、血液陰イオン交換体からのゲノムＤＮＡ溶離に関して高イオン塩強度溶液を試験した。
【００４５】
一例として、ここではＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）樹脂を使用した。これらの樹脂は広いｐＨ範囲（３〜１３）にわたって非常に安定であり、９０μｍの平均粒度を有している（続いて、他の陰イオン交換樹脂を試験したが、これらも十分に役立つことが判明した）。適当な抗菌剤（例えば、エタノール又はケトン（ｋｅｔｈｏｎ））と共に、試料ローディング液と同様な強度を有する詳述溶液を用いてカラムを予備充填した。これにより、核酸結合のためにローディング液中の試料をロードするのに先立ってカラムを平衡化する必要性が排除される。
【００４６】
ここで使用した供給源細胞はヒト血液であり、上記の（Ａ）（ａ）に記載した血液プロトコルに準拠した。２〜３Ｍの塩濃度を使用した場合でも、それはイオン交換カラムからのゲノムＤＮＡの回収率を顕著に向上させないことが判明した。溶離後、ＮＡＰ−１０又はＮＡＰ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いてすべての試料を脱塩し、ＵＶ分光光度計を用いてＤＮＡを定量化した。良好な回収率を与え得る緩衝液又は溶液を同定するため、様々な塩類の組合せを評価した。
【００４７】
個別の実験により、ゲノムＤＮＡの溶離に関して下記の溶離用緩衝液／溶液の組合せを評価した。
１．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ。
２．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ炭酸ナトリウム。
３．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ過塩素酸ナトリウム。
４．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ重炭酸ナトリウム。
５．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ塩化マグネシウム。
６．２Ｍヨウ化ナトリウム。
７．２Ｍ過塩素酸ナトリウム。
８．３Ｍ酢酸アンモニウム。
９．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ重炭酸ナトリウム。
１０．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ炭酸ナトリウム。
１１．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ二ホウ酸ナトリウム。
１２．３Ｍ重炭酸アンモニウム。
１３．３Ｍ重炭酸ナトリウム（完全には溶解せず）。
１４．３Ｍ炭酸ナトリウム。
１５．３Ｍリン酸ナトリウム（完全には溶解せずに沈殿する）。
１６．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ水酸化ナトリウム。
１７．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ水酸化ナトリウム。
１８．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋７５ｍＭ水酸化ナトリウム。
１９．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋１００ｍＭ水酸化ナトリウム。
２０．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋７５ｍＭ水酸化リチウム。
２１．２Ｍ塩＋５００ｍＭ Ｌ−アルギニン。
２２．１Ｍ塩化ナトリウム＋１Ｍ炭酸ナトリウム。
【００４８】
代表的な結果を下記表１に示す。データから明らかな通り、２Ｍ塩溶液自体が溶離するゲノムＤＮＡは、塩と水酸化ナトリウムの組合せ又は塩とアルギニンの組合せを用いて溶離できるゲノムＤＮＡの１／２未満である。
【００４９】
【表１】
残りの結合物質の回収は、高い塩濃度と水酸化ナトリウムを用いて高めたｐＨとの組合せで達成できる。しかし、水酸化ナトリウムは苛性を示すばかりでなく、核酸の不可逆的な変性及び経時的な分解を引き起こすことがある。
【００５０】
また、対イオンとして使用される陽イオン並びに溶離のｐＨはＨＭＶ核酸の回収率に対して影響を及ぼすと共に、強アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）の使用は夾雑物の同時溶離及び生成物の安定性に対する有害効果のため回収率にとって有害であり得ることも認められた。
【００５１】
カルボン酸基と共にグアニジニウム基を有するアルギニンが溶離プロセスにおいて劇的な効果を示したので、回収率の向上に寄与するのはカルボン酸基又はグアニジニウム基のいずれであるかを確認するため、他のアミノ酸及びグアニジニウム塩を評価すると共に、アミノ酸とグアニジニウム塩との組合せも評価した。結果を表２にまとめて示す。
【００５２】
【表２】
ゲノムＤＮＡの回収率及び溶離を向上させる溶離液は、約１０．５〜１１．６の高いｐＨという共通の特徴を有することが注目された。グアニジンを用いた核酸溶離の向上は、溶離液中に炭酸塩（又は重炭酸塩）が存在することで促進されるように思われる。このような観察結果に基づき、高いｐＨの効果を試験するためにさらなる実験を実施した。炭酸ナトリウムを含む２Ｍ塩化ナトリウム或いはトリス塩基又はアルギニンを含む２Ｍ塩化ナトリウムを比較した。得られた結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
数種の溶液の評価結果に基づけば、塩強度に加えてｐＨがゲノムＤＮＡの回収に決定的な役割を果たすように思われる。溶離の向上のためには、１〜２Ｍ塩化ナトリウムと０．２５〜０．５Ｍアルギニン、０．５〜１Ｍ炭酸ナトリウム又は０．５〜１Ｍトリス塩基との組合せが使用できる。
【００５４】
高いｐＨがイオン交換樹脂からの多量のゲノムＤＮＡの回収を助ける因子であるように思われたので、塩とグアニジン誘導体とのさらにいくつかの組合せを溶離液として評価したが、これらはいずれも溶離液に高いｐＨを与えた。
１．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ Ｌ−アルギニン
２．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ 炭酸グアニジン
３．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ グリシン
４．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ 炭酸グアニジン＋０．５Ｍ Ｌ−グルタミン酸
５．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ プロピオン酸グアニジン
結果は、１Ｍ〜２Ｍ塩化ナトリウム溶液へのアルギニン、炭酸グアニジン又は他のグアニジン誘導体（例えば、プロピオン酸グアニジン）の添加がイオン交換樹脂からのゲノムＤＮＡの溶離に対して同様な効果を有することを明確に実証している（表４）。
【００５５】
【表４】
（Ｃ）溶離液中におけるＬ−アルギニン、炭酸グアニジン及び炭酸カリウムの比較
塩化ナトリウムと炭酸ナトリウムの組合せがある程度の回収率向上をもたらしたので、炭酸カリウムを塩化ナトリウムと組み合わせた溶液を炭酸グアニジン及びＬ−アルギニンと比較して評価する。塩化ナトリウム及び炭酸ナトリウムの溶液のｐＨは、イオン交換樹脂から核酸を完全に回収するためには最適でない。炭酸カリウムは一層高いｐＨの溶液を与えるので、イオン交換樹脂からの核酸の一層高い回収率を与えるものと予想される。実際、塩化ナトリウムと炭酸カリウムの組合せは高いｐＨを有する溶液を与え、溶離プロファイルは炭酸グアニジン又はアルギニンを含む溶液に十分匹敵していた。実験の詳細は上記セクション（Ｂ）の場合と同様である。この場合にも、ゲノムＤＮＡ供給源としてヒト血液を使用し、（Ａ）（ａ）に記載した血液プロトコルに準拠した。結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
表５中のデータから明らかな通り、炭酸カリウムを含む塩化ナトリウム溶液は、炭酸グアニジン又はＬ−アルギニンを含む溶液と比較した場合、イオン交換樹脂からのゲノムＤＮＡ溶離に関して等しく有効である。
【００５７】
各種添加剤の系統的な評価に基づけば、塩強度に加えてｐＨが核酸の回収に決定的な役割を果たすように思われる。溶離の向上のためには、１〜２Ｍ塩化ナトリウムと０．２５〜０．５Ｍアルギニン、０．５Ｍ炭酸カリウム又は０．５Ｍ炭酸グアニジンとの組合せが使用できる。０．５〜１Ｍ炭酸ナトリウム又は０．５〜１Ｍトリス塩基もまた、溶離を向上させるために使用できる。
【００５８】
（Ｄ）血液からのゲノムＤＮＡ精製
プロトコルセクションに記載した手順を用いて８ｍｌのヒト血液試料を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、さらに５ｍｌのローディング液をカラム上に加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液（１Ｍ塩化ナトリウム＋０．５Ｍ炭酸カリウム）を加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集管に捕集した。得られた生成物をＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動（図１）によって決定した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析（図２）によって評価した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、制限酵素消化（図３）、多重ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ（図４）のような下流用途においても評価した。
【００５９】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、血液からの精製ゲノムＤＮＡは大きいサイズを有することが明らかである（図１）。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた（図２）。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された。
【００６０】
精製ゲノムＤＮＡの品質をいくつかの方法で評価した。
【００６１】
ＤＮＡに対し、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図３、レーン２、４、６は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５は酵素で消化した試料である）。
【００６２】
ゲノムＤＮＡ試料の品質を、多重ＰＣＲ反応における効率によって間接的に測定した。この試験のためには、Ｐ４５０遺伝子に関するロングレンジ多重ＰＣＲを使用した（ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｐ４５０プロトコル、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５からの３つのアンプリコンを単一の反応で増幅した。アンプリコンのサイズは３３５〜２６００ｂｐの範囲内にある。ＰＣＲ生成物のサイズ及び収量はＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００及びＤＮＡ ７５００キットによって決定した。多重ＰＣＲ反応は、試験したすべての試料について十分に役立った（データは示さず）。
【００６３】
ゲノムＤＮＡ試料の品質はまた、リアルタイムＰＣＲアッセイによっても試験した。リアルタイムＰＣＲ実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。試験したすべての試料は非常によく似た増幅プロファイルを示している（図４）。
【００６４】
同じ精製プロセスは、他の動物からの血液試料にも成功裡に適用された。ラット、モルモット、ウマ、ニワトリ及びヒツジのような各種動物から高品質のゲノムＤＮＡが単離された。
【００６５】
（Ｅ）組織試料からのゲノムＤＮＡの単離
２００ミリグラムのラット肝臓組織をホモジナイズし、プロトコルセクションに記載したようにして溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、遠心して粒子状物質をペレット化した。透明な溶解物をイオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、５ｍｌのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液（１Ｍ塩化ナトリウム＋０．５Ｍ炭酸カリウム）をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムＤＮＡをＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析によって評価した。プロトコルの一貫性にアクセスするために複数の試料を処理した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動（図５）によって決定した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、リアルタイムＰＣＲ（図６）及び制限酵素消化（図７）のような下流用途においても評価した。
【００６６】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、ラット肝臓組織からの精製ゲノムＤＮＡ試料はいずれも大きいサイズを有することが明らかである（図５）。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された（データは示さず）。
【００６７】
精製ゲノムＤＮＡの品質をいくつかの方法で評価した。
【００６８】
ゲノムＤＮＡ試料の品質をリアルタイムＰＣＲアッセイによって試験した。リアルタイムＰＣＲ実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。試験したすべての試料は非常によく似た増幅プロファイルを示している（図６）。
【００６９】
ＤＮＡに対し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図７、レーン２、４、６、８は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５、７は酵素で消化した試料である）。
【００７０】
（Ｆ）細胞培養物からのゲノムＤＮＡの単離
プロトコルセクションに記載した手順を用いて約２×１０７個のＭＲＣ５細胞を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラムに移した。すべての溶液が樹脂を通過した後、５ｍｌのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムＤＮＡをＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析によって評価した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動によって決定した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、リアルタイムＰＣＲ及び制限酵素消化のような下流用途においても評価した。
【００７１】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、ＭＲＣ５細胞からの精製ゲノムＤＮＡ試料はいずれも大きいサイズ（１００Ｋｂ、図８）を有することが明らかである。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された（データは示さず）。
【００７２】
精製ゲノムＤＮＡの品質を制限酵素消化によって評価した。ＤＮＡに対し、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図９、レーン２、４、６、８、１０、１２は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５、７、９、１１は酵素で消化した試料である）。
【００７３】
本明細書中で言及された特許、特許出願公開及びその他の公表参考文献のすべては、各々が個別かつ詳細に引用されて本明細書中に組み込まれた場合と同じく、その全体が援用によって本明細書の内容の一部をなしている。以上、本発明の好ましい例示的な実施形態を説明してきたが、限定のためではなく例示を目的として示される記載の実施形態以外の実施形態によって本発明が実施できることは当業者にとって容易に理解されよう。本発明は、以下に示す特許請求の範囲のみによって限定される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、タンパク質、脂質、可溶性膜成分などの汚染細胞成分からゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ及びｍＲＮＡのような核酸を分離する方法に関する。詳しくは、本発明は、溶離液のｐＨを高める組成物の添加によってバッチモード又は充填モードにおける陰イオン交換クロマトグラフィー媒質からの核酸回収率を向上させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の３０年間、生物学的供給源から核酸を単離及び精製するための改良法の開発に多大の努力が見られた。これは、主として医学及び生物学における核酸の用途が増加したことに原因する。血液、組織又は培養細胞から単離されたゲノムＤＮＡは、ＰＣＲ、配列決定、遺伝子型決定、ハイブリダイゼーション及びサザンブロッティングを含む様々な用途を有している。プラスミドＤＮＡは、配列決定、ＰＣＲ、ワクチン開発及び遺伝子療法において利用されてきた。単離ＲＮＡは、ブロットハイブリダイゼーション、インビトロ翻訳、ｃＤＮＡ合成及びＲＴ−ＰＣＲを含む各種の下流用途を有している。
【０００３】
核酸の分析及びインビトロ操作の前には、通例、後続の処理手順を妨害することがある不要の夾雑物を核酸から除去するための核酸単離段階が実施される。研究用及び診断用の分子生物学におけるほとんどの方法については、最初の段階として抽出された核酸が要求される。典型的なＤＮＡ抽出プロトコルでは、研究対象となる核酸を含む細胞又はホモジナイズド組織試料を採取し、標準的な方法（例えば、プロテイナーゼＫ及びリゾチームのような酵素の使用、ＳＤＳ、Ｂｒｉｊ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）ＨＣｌ００のような洗浄剤の使用、或いは水酸化ナトリウム、イソチオシアン酸グアニジニウムなどの他の化学薬品の使用）を用いて溶解する。（例えば、Sambrook et al,Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd edition 9.14(New York:Cold Spring Harbor Laboratory 1989)を参照されたい。）細胞破片の除去後、粗溶解物をフェノール／クロロホルムのような有機溶媒で処理してタンパク質を抽出する。必要ならば、ＲＮアーゼのような酵素で処理することでＲＮＡを除去又は低減できる。しかし、塩類、フェノール、洗浄剤などの夾雑物の存在は、核酸に対して想定されている多くの下流操作を妨害することがある。
【０００４】
現在、ＤＮＡ（ゲノム及びプラスミド）及びＲＮＡのクロマトグラフィー精製のためには、例えばシリカベース膜精製、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、磁気ビーズベース精製又はイオン交換クロマトグラフィーの使用によるいくつかの方法が利用可能である。イオン交換クロマトグラフィーは最も普通に使用される分解及び精製方法の１つであり、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの精製のために使用されてきた。例えば、米国特許第６，４１０，２７４号（Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ），米国特許第６，３１０，１９９号（Ｓｍｉｔｈら）、米国特許第６，０９０，２８８号（Ｂｅｒｌｕｎｄら）、米国特許第５，９９０，３０１号（Ｃｏｌｐａｎら）、米国特許第５，８５６，１９２号、米国特許第５，８６６，４２８号（Ｂｌｏｃｈ）、米国特許第５，８０１，２３７号（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）、欧州特許第１１２５９４３号（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ）、欧州特許第９９２５８３号、欧州特許第６１６６３９号（Ｑｉａｇｅｎ）、米国特許第５，７０７，８１２号、米国特許第５，５６１，０６４号（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を参照されたい。
【０００５】
核酸精製のための陰イオン交換クロマトグラフィー方法を広範囲にわたって参照してきたが、現行のプロトコルの欠点の１つは溶離段階における核酸の回収率が悪いことである（Endres, H.N. et al, Biotechnol. Appl. Biochem., (2003), 37(3), 259-66; Prazeres, D.M. et al, J. Chromatog. A. (1998), 806(1), 31-45; Urthaler J. et al, Acta Biochim. Pol., (2005), 52(3), 703-11; Ferreira, G.N. et al, Bioseparation, (2000), 9(1), 1-6; Ferreira, G.N., et al, Biotechnol. Prog., (2000), 16(3), 416-24）。吸着及び脱離時にポリオール及びアルコールのような有機薬剤を添加することは、ＤＮＡの陰イオン交換精製に際して選択率及び回収率を向上させることが示された（Tseng, W.C. et al, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., (2003), 791(1-2), 263-72）。しかし、陰イオン交換樹脂からのＤＮＡ脱離に際してしばしば見られる回収率の問題とまともに取り組んだ報告は存在しないように思われる。この問題は陰イオン交換樹脂からの結合ＤＮＡの回収率を向上させることに関係するので、本発明はそれと取り組んでいる。特に、本発明はプロトコルのさらなる操作なしに固体担体からのＤＮＡ脱離の向上を可能にする。
【０００６】
プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びＲＮＡは互いに類似した電荷特性を有しており、高い電荷密度を有するポリ陰イオンである。したがって、吸着すべき核酸の鎖長及びコンホメーションに応じ、最大０．７Ｍの塩化ナトリウムの存在下で正に帯電したイオン交換樹脂に結合することが可能である。核酸鎖長の増加並びに二本鎖コンホメーションは、核酸と陰イオン交換体との間の結合強度の増加をもたらす。しかし、この効果は約２キロベースまでの核酸鎖長に比例するにすぎない。核酸の負に帯電したリン酸エステル主鎖とイオン交換樹脂との間の非常に強い相互作用は、通常の方法を用いて核酸を溶離するのを妨げる。通常の方法では、塩溶離液のイオン強度を単に増加させるだけで７０〜１００％の結合物質を回収するのに十分である。しかし、長鎖核酸の場合には、最大３Ｍまで塩のイオン強度を増加しても２０〜５０％の結合核酸しか回収できない。残りの結合物質の回収は、高い塩濃度と水酸化ナトリウムを用いて高めたｐＨとの組合せで達成できる。しかし、水酸化ナトリウムは苛性を示すばかりでなく、核酸の不可逆的な変性及び経時的な分解を引き起こすことがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２７４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，３１０，１９９号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９０，２８８号明細書
【特許文献４】米国特許第５，９９０，３０１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，８５６，１９２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８６６，４２８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８０１，２３７号明細書
【特許文献８】欧州特許第１１２５９４３号明細書
【特許文献９】欧州特許第９９２５８３号明細書
【特許文献１０】欧州特許第６１６６３９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，７０７，８１２号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，５６１，０６４号明細書
【特許文献１３】欧州特許第１２４３６４９号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sambrook et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual 2nd edition 9.14 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory 1989)
【非特許文献２】Endres, H.N. et al, Biotechnol. Appl. Biochem., (2003), 37(3), 259-66
【非特許文献３】Prazeres, D.M. et al, J. Chromatog. A. (1998), 806(1), 31-45
【非特許文献４】Urthaler J. et al, Acta Biochim. Pol., (2005), 52(3), 703-11
【非特許文献５】Ferreira, G.N. et al, Bioseparation, (2000), 9(1), 1-6
【非特許文献６】Ferreira, G.N., et al, Biotechnol. Prog., (2000), 16(3), 416-24
【非特許文献７】Tseng, W.C. et al, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., (2003), 791(1-2), 263-72
【非特許文献８】Chen et al, Journal of Chromatography, 1118(1), 2006, 3-11
【非特許文献９】Thayer, J.R., et al, Analytical Biochemistry, 338(1), 2005, 39-47
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このたび意外にも、高い塩濃度及び溶離液中における溶離液のｐＨを高める添加剤の存在を含む条件下で核酸を陰イオン交換樹脂から効率的に溶離できると共に、溶離液のｐＨは好適には約ｐＨ９〜約ｐＨ１３の範囲内であり、さらに好ましくは約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２の範囲内であることが見出された。添加剤の一例はグアニジン又はグアニジン様誘導体である。別の例は炭酸カリウムである。溶離液にいずれかの添加剤を添加することは、陰イオン交換樹脂からの核酸回収率を２０〜５０％から７０〜９５％に向上させることが証明された。
【００１０】
かくして第１の態様では、本発明は、細胞から核酸を分離及び／又は精製する方法であって、
ａ）前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
ｂ）陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、及び
ｃ）核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体を溶離する段階
を含んでなる方法において、
前記溶離液が水性移動相のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３にするような添加剤を含み、溶離液中における添加剤の存在が添加剤の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことを特徴する方法を提供する。
【００１１】
したがって本発明は、通常のイオン交換クロマトグラフィー操作に比べて核酸の安定性を損なうことなく陰イオン交換樹脂から高い回収率の核酸を得るため、溶離液への添加剤としての化合物の使用方法を提供する。核酸はホスホジエステル結合によって共有結合されたデオキシリボースリン酸エステルモノマーの鎖（又はペア鎖）からなり、各糖リン酸エステルは単一の芳香族複素環式塩基を担持している。かかる塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ、ＤＮＡ中にのみ見られる）及びウラシル（Ｕ、ＲＮＡ中にのみ見られる）である。ｐＨ＞２の水溶液中では、高可溶性の親水性糖リン酸エステルポリマー主鎖は、最大２つの負電荷を担持し得る末端ホスホモノエステルを除き、各ホスホジエステルに対して１つの負電荷を与える。このようにＤＮＡはポリ陰イオンであり、核酸分子の正味負電荷は鎖長と直接に関係している。したがって、核酸は陰イオン交換樹脂に対して強い結合親和性を示す結果、樹脂から核酸を効率的に除去するためには溶離液中に高い塩濃度が必要となる。
【００１２】
陰イオン交換樹脂からの核酸回収率に対するグアニジン及びグアニジン様化合物（特にアルギニン）の好ましい効果は、例えば約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のアルカリ性ｐＨ、さらに好ましくは約１０〜１２のｐＨ値において最も顕著である。約１０．５〜１１．６のｐＨ範囲が最適回収率を与えるように思われる。核酸の回収率は、溶離液にアルギニン又は炭酸グアニジンを添加した場合に最も高い。理論によって束縛されることはないが、グアニジニウム基の特異な性質の１つは、二重結合と窒素孤立電子対との間の共役に原因する非局在化正電荷特性である。グアニジニウム基は優先的にグアニン塩基と複数の水素結合を形成することができ、これは核酸構造の局部変形を引き起こすように作用することがある。このような核酸のコンホメーションの変化は脱離動態の変化の一因となり、かくして陰イオン交換クロマトグラフィーに際して核酸の高い回収率を有利に与える。高分子は複数の付着点を介して吸着表面に結合してクロマトグラフィー媒質表面上にミクロ環境を生み出すことが知られており、こうして生じる吸着は通常の脱離技法では不可逆に近くなることがある。従来の陰イオン交換クロマトグラフィーでは、競合する塩陰イオンを増加させることで正に帯電したリガンドから結合分子を溶離することができるが、核酸、特に（０．１キロベースを超える）高分子量（ＨＭＷ）核酸の溶離は塩陰イオンのみでは効率的でないことが認められている。また、対イオンとして使用される陽イオン並びに溶離のｐＨはＨＭＶ核酸の回収率に対して影響を及ぼすと共に、強アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）の使用は夾雑物の同時溶離及び生成物の安定性に対する有害効果のため回収率にとって有害であり得ることも認められている。
【００１３】
一実施形態では、添加剤は下記の式（Ｉ）を有する化合物（さらに詳しくは、その炭酸塩又は重炭酸塩）である。
【００１４】
【化１】
式中、ＲはＨ及び任意にはアミノで置換された低級アルキルから選択される。好適には、低級アルキルはＣ１〜Ｃ４アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル又はブチル、好ましくはメチル又はエチルである。Ｒがアミノ置換低級アルキル基である場合、式（Ｉ）に係る化合物の例には、２−アミノエチル−グアニジン、３−アミノプロピル−グアニジン及び４−アミノブチル−グアニジン（アグマチン）がある。特に好ましい実施形態では、Ｒは水素であり、したがって化合物（Ｉ）は炭酸塩又は重炭酸塩としてのグアニジンである。
【００１５】
第２の実施形態では、添加剤は下記の式（Ｉ）を有する化合物である。
【００１６】
【化２】
式中、Ｒは次式の基である。
【００１７】
【化３】
式中、ｎは１、２又は３、好ましくは３である。この場合、添加剤はアルギニン、好適にはＬ−アルギニン、Ｄ−アルギニン又は両光学異性体の混合物である。
【００１８】
第３の実施形態では、添加剤は同様なｐＨを与える無機塩である。かかる塩の一例は炭酸カリウムである。別の例は炭酸ナトリウムである。
【００１９】
本発明の実施形態では、グアニジン又はグアニジン様化合物或いは炭酸カリウムは、０．１〜２Ｍ、好ましくは０．２５〜０．５Ｍの濃度で溶離液中に添加剤として存在することが好ましい。溶離液は、通例、好適には約０．７〜３Ｍの塩溶液に添加剤を添加したものからなる。好適には、水性移動相のｐＨは約ｐＨ９〜約ｐＨ１３であり、好ましいｐＨ範囲は約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２であり、さらに好ましくは約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である。
【００２０】
本明細書中で使用する「核酸」という用語は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、或いはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、或いはＤＮＡ及び／又はＲＮＡの混合物をいう。したがって、「核酸」という用語はゲノムＤＮＡ又は染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、総ＲＮＡ及びｍＲＮＡを含むことが意図されている。本発明に係る方法は、種（例えば、ヒト、齧歯類、猿類）、組織源（例えば、脳、肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚、筋肉）及び細胞タイプ（例えば、上皮細胞、内皮細胞、血液）に関して一般に認められている任意の供給源（正常細胞及び形質転換細胞を含む）からの細胞試料及び組織試料から導かれる複合成分混合物からのゲノムＤＮＡの調製及び／又は精製のために特に適している。
【００２１】
さらに、本発明の方法は、約０．１〜約２００キロベースのサイズを有するゲノムＤＮＡ或いはプラスミドＤＮＡ、コスミド、ＢＡＣ又はＹＡＣの調製及び／又は精製のために適している。本発明は、特にクローニング及び配列決定のような分子生物学研究における下流用途、遺伝子療法並びにインビボ及びインビトロでの診断用途のためにプラスミドＤＮＡ及びコスミドＤＮＡを精製するのに有用である。
【００２２】
本発明の方法で使用するのに適した陰イオン交換樹脂には、強陰イオン交換体及び弱陰イオン交換体の両方がある。この場合、陰イオン交換樹脂は好適には支持キャリヤーに帯電基又は帯電可能基を結合したものからなる。イオン交換樹脂はビーズ、膜又は表面の形態を有し得る。強陰イオン交換樹脂の例には、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱがある。弱イオン交換樹脂の例には、ＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂及びＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂がある（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。
【００２３】
上記に開示した添加剤を水性移動相中に使用することで、溶離液中に添加剤が存在しないこと以外はすべて等しい条件下で同じ陰イオン交換体から核酸を回収する場合に比べて、陰イオン交換体からの核酸回収率を４０％以上、通例は約４０〜約４００％増加させることが可能である。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、細胞試料から核酸を分離及び／又は精製するためのキットであって、細胞試料から核酸含有水溶液を生成するための溶解液、核酸を結合するための、固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体、陰イオン交換体から核酸を溶離するための溶離液、及び任意には溶離核酸を脱塩するための脱塩手段を含んでなるキットを提供する。好適には、前記溶離液のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のｐＨにするような添加剤が溶離液中に存在する。
【００２５】
一実施形態では、添加剤はアルギニンである。別の実施形態では、添加剤は炭酸塩又は重炭酸塩として存在するグアニジンである。さらに別の実施形態では、添加剤は炭酸カリウムである。
【００２６】
好ましくは、陰イオン交換体はＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂である。別法として、陰イオン交換体はＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ又はＣａｐｔｏＱ樹脂（いずれもＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）である。
【００２７】
本発明のその他の特徴及び利点は、好ましい実施形態に関する以下の説明及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る方法を用いてヒト血液試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図２】図２は、ヒト血液試料からの精製ゲノムＤＮＡのアガロースゲルイメージを示している。
【図３】図３は、ヒト血液試料から精製した制限酵素（ＥｃｏＲＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【図４】図４は、ヒト血液からのゲノムＤＮＡ試料について得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示しており、試料間において非常によく似た増幅プロファイルが認められる。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る方法を用いてラット肝臓試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図６】図６は、ラット肝臓試料からのゲノムＤＮＡ試料について得られたリアルタイムＰＣＲ増幅結果を示しており、試料間において非常によく似た増幅プロファイルが認められる。
【図７】図７は、ラット肝臓試料から精製した制限酵素（ＨｉｎｄＩＩＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る方法を用いて培養ＭＲＣ５細胞試料から精製したゲノムＤＮＡのパルス電界ゲル電気泳動分析を示している。
【図９】図９は、ＭＲＣ５細胞試料から精製した制限酵素（ＥｃｏＲＩ）消化ゲノムＤＮＡ及び未消化ゲノムＤＮＡの比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の実施例は本発明の実施形態に係るＤＮＡ精製プロセスを例示するために役立つものであり、限定的なものではない。
【００３０】
（Ａ）実施例で使用するプロトコル
（ａ）血液からのゲノムＤＮＡの単離
血液からのゲノムＤＮＡ単離は２段階で行われる。第１の段階は細胞の溶解であり、第２の段階はイオン交換カラムクロマトグラフィーを用いるゲノムＤＮＡの精製である。
【００３１】
溶解：このプロセスは２つの段階を含んでいる。まず白血球を単離し、次いで溶解液を用いて単離した白血球を溶解する。白血球の単離及び白血球の溶解のために使用するプロトコルは下記の通りである。ここでは、一例として５ｍｌの血液を使用する。しかし、使用する血液の量に応じてプロトコルを調整することができる。
１．５ｍｌの全血を５０ｍｌの円錐形遠心管に加える。
２．５ｍｌの予冷した溶解１液及び１５ｍｌの冷水を試料に加える。管をラックに入れ、管を１０〜１５回転倒させることでよく混合する。
３．周囲温度で１０分間インキュベートする。
４．１５００×ｇで１０分間遠心する。
５．ペレットを乱すことなく、希釈漂白液を入れた廃棄物容器内に上澄みを廃棄する（又はＥＨＳによって推奨される適切な安全対策に従う）。
６．１ｍｌの溶解１液及び３ｍｌの水を遠心管に加え、短時間渦動させることでペレットを再懸濁する。
７．５０００×ｇで１０分間遠心する。
８．白血球ペレットを乱すことなしに上澄みを注意深く廃棄する。
９．最高速度で３０秒〜１分間渦動させることで白血球ペレットを５ｍｌの溶解２液中に再懸濁する。
１０．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）（ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を加え、短時間渦動させ、周囲温度で２０分間インキュベートする。
１１．５ｍｌのローディング液を遠心管に加え、管を渦動させることでよく混合し、この溶液を精製カラム上にロードする。
【００３２】
精製：精製プロセスは脱塩プロセス（段階１７〜２１）も含んでいる。
１２．イオン交換精製カラム（計器上での自動化プロセスを用いて充填された、プラスチック管内の約１．５ｍｌのイオン交換樹脂）の頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１３．上記の段階１１から得られた溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
１４．５ｍｌのローディング液をカラムに適用する。
１５．すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１６．２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
【００３３】
脱塩：
１７．脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
１８．２５ｍＬの１×ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を適用することでカラムを平衡化する。これは、ＬａｂＭａｔｅ ＰＤ−１０緩衝液溜め（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いることで一段階で達成できる。
１９．精製段階１６からの溶出液（２．５ｍｌ）を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
２０．溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
２１．３．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液を各カラムに加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用するできる。
【００３４】
（ｂ）組織試料からのゲノムＤＮＡの単離
下記の段階によって組織試料を調製する。精製プロセスから良好な収量のゲノムＤＮＡを得るためには、完全にホモジナイズした試料を使用することが極めて重要である。
１．微小片に切断することで約１００ｍｇの組織を秤取する。
２．組織を１×ＰＢＳ緩衝液で洗う。１ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液を加え、渦動させ、１０００ＲＰＭで１分間遠心する。洗液を捨て、管内に残った微量の緩衝液をピペットで除去する。
３．０．５ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液を加え、試料をハンドヘルドホモジナイザーでホモジナイズする。
【００３５】
こうして調製した組織試料に対し、ゲノムＤＮＡ単離のための下記の段階を施す。段階４〜７は試料溶解のためであり、段階８〜１２は精製のためであり、段階１３〜１７は脱塩のためである。
４．０．５ｍＬの溶解液をホモジナイズド試料に加え（ＰＢＳと溶解液との比＝１：１）、可能な最高速度で２０〜３０秒間渦動させる。
５．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）溶液を加え、短時間渦動させ、６０℃で１〜１．５時間インキュベートする。
６．インキュベーション期間後、反応管を氷浴中で３分間冷却する。２０μｌのＲＮアーゼＡ溶液（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１５分間インキュベートする。
７．粗溶解物を４ｍｌの無ＤＮアーゼ水及び５ｍｌのローディング液で希釈し、５０００×ｇで１５分間遠心して粒子状物質をペレット化する。
【００３６】
精製
８．精製カラムの頂部からキャップを取り除く。デカントによって溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、カラムアダプターを用いてカラムを５０ｍｌ遠心管内に配置する。
９．溶解液をカラムに移し、重力によって樹脂中を完全に流通させる。
１０．５ｍｌのローディング液をカラムに適用する。
１１．すべてのローディング液が樹脂を通過した後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１２．２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集する。
【００３７】
脱塩
１３．脱塩カラムのキャップを取り除き、溶液を捨てる。ノッチの位置でカラムの閉鎖端を切断し、アダプターを用いてカラムを遠心管内に配置する。
１４．２５ｍＬの１×ＴＥ緩衝液を適用することでカラムを平衡化する。これはＬａｂＭａｔｅ ＰＤ−１０緩衝液溜めを用いることで達成できる。
１５．精製段階１２からの溶出液（２．５ｍｌ）を脱塩カラムに移し、重力によって流通させる。
１６．溶液がゲルベッドに完全に入った後、カラムを新しい５０ｍｌ遠心管内に配置する。
１７．３．５ｍｌの１×ＴＥ緩衝液を各カラムに加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集する。こうして得られた脱塩試料は定量化及び下流用途のために使用できる。
【００３８】
（ｃ）細胞培養物からのゲノムＤＮＡの単離
下記のプロトコルに従って細胞培養細胞を集め、溶解する。精製及び脱塩は、上記のプロトコル（ｂ）（「組織試料からのゲノムＤＮＡの単離」）に記載したようにして行う。
１．１×１０７個〜２．０×１０７個までの細胞を１×ＰＢＳ緩衝液（２×５５ｍＬ）で洗う。細胞を５ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液中に懸濁し、２０００×ｇで１０分間遠心する。緩衝液をペレットから注意深くデカントし、プロセスをもう一度繰り返す。
２．３０秒〜１分間渦動させることで、細胞ペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳ緩衝液中に完全に再懸濁する。
３．４．５ｍｌの溶解液を加え、３０秒〜１分間渦動させる。
４．５０μｌのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加え、短時間（２秒間）渦動させる。
５．６０℃で１〜２時間インキュベートする。
６．管を氷浴中で２分間冷却し、２０μｌのＲＮアーゼＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を加える。
７．３７℃で１５分間インキュベートする。
【００３９】
（ｄ）精製ゲノムＤＮＡ試料の定量化
精製ゲノムＤＮＡ試料の定量化は、ブランクとしての１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）及び光路長１ｃｍのキュベットを使用しながら、ＵＶ分光光度計によって行った。３つの試料の読みをＡ２６０、Ａ２８０及びＡ３２０で求めた。ＤＮＡの収量（μｇ）＝Ａ２６０×５０μｇ×溶出試料体積（３．５ｍｌ）。
【００４０】
（ｅ）プロトコルで使用した溶液の詳細組成
（ｉ）血液ｇＤＮＡプロトコル
溶解１液：３０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２％トリトンＸ１００及び０．６Ｍスクロース。
【００４１】
溶解２液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ。
【００４２】
ローディング液：７００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。
（ii）組織プロトコル
溶解液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１％ＳＤＳ。
【００４３】
ローディング液：７００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス及び１ｍＭ ＥＤＴＡ。
（iii）細胞培養物プロトコル
溶解液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ塩化ナトリウム及び１％ＳＤＳ。
【００４４】
（Ｂ）ゲノムＤＮＡ溶離に関する各種溶液の評価
ゲノムＤＮＡ精製のための最適溶離液を見付けようという努力の中で、血液陰イオン交換体からのゲノムＤＮＡ溶離に関して高イオン塩強度溶液を試験した。
【００４５】
一例として、ここではＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）樹脂を使用した。これらの樹脂は広いｐＨ範囲（３〜１３）にわたって非常に安定であり、９０μｍの平均粒度を有している（続いて、他の陰イオン交換樹脂を試験したが、これらも十分に役立つことが判明した）。適当な抗菌剤（例えば、エタノール又はケトン（ｋｅｔｈｏｎ））と共に、試料ローディング液と同様な強度を有する詳述溶液を用いてカラムを予備充填した。これにより、核酸結合のためにローディング液中の試料をロードするのに先立ってカラムを平衡化する必要性が排除される。
【００４６】
ここで使用した供給源細胞はヒト血液であり、上記の（Ａ）（ａ）に記載した血液プロトコルに準拠した。２〜３Ｍの塩濃度を使用した場合でも、それはイオン交換カラムからのゲノムＤＮＡの回収率を顕著に向上させないことが判明した。溶離後、ＮＡＰ−１０又はＮＡＰ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムを用いてすべての試料を脱塩し、ＵＶ分光光度計を用いてＤＮＡを定量化した。良好な回収率を与え得る緩衝液又は溶液を同定するため、様々な塩類の組合せを評価した。
【００４７】
個別の実験により、ゲノムＤＮＡの溶離に関して下記の溶離用緩衝液／溶液の組合せを評価した。
１．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ。
２．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ炭酸ナトリウム。
３．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ過塩素酸ナトリウム。
４．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ重炭酸ナトリウム。
５．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ塩化マグネシウム。
６．２Ｍヨウ化ナトリウム。
７．２Ｍ過塩素酸ナトリウム。
８．３Ｍ酢酸アンモニウム。
９．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ重炭酸ナトリウム。
１０．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ炭酸ナトリウム。
１１．３Ｍ酢酸アンモニウム＋０．２Ｍ二ホウ酸ナトリウム。
１２．３Ｍ重炭酸アンモニウム。
１３．３Ｍ重炭酸ナトリウム（完全には溶解せず）。
１４．３Ｍ炭酸ナトリウム。
１５．３Ｍリン酸ナトリウム（完全には溶解せずに沈殿する）。
１６．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋２５ｍＭ水酸化ナトリウム。
１７．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ水酸化ナトリウム。
１８．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋７５ｍＭ水酸化ナトリウム。
１９．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋１００ｍＭ水酸化ナトリウム。
２０．５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０００ｍＭ ＮａＣｌ＋７５ｍＭ水酸化リチウム。
２１．２Ｍ塩＋５００ｍＭ Ｌ−アルギニン。
２２．１Ｍ塩化ナトリウム＋１Ｍ炭酸ナトリウム。
【００４８】
代表的な結果を下記表１に示す。データから明らかな通り、２Ｍ塩溶液自体が溶離するゲノムＤＮＡは、塩と水酸化ナトリウムの組合せ又は塩とアルギニンの組合せを用いて溶離できるゲノムＤＮＡの１／２未満である。
【００４９】
【表１】
残りの結合物質の回収は、高い塩濃度と水酸化ナトリウムを用いて高めたｐＨとの組合せで達成できる。しかし、水酸化ナトリウムは苛性を示すばかりでなく、核酸の不可逆的な変性及び経時的な分解を引き起こすことがある。
【００５０】
また、対イオンとして使用される陽イオン並びに溶離のｐＨはＨＭＶ核酸の回収率に対して影響を及ぼすと共に、強アルカリ（例えば、水酸化ナトリウム）の使用は夾雑物の同時溶離及び生成物の安定性に対する有害効果のため回収率にとって有害であり得ることも認められた。
【００５１】
カルボン酸基と共にグアニジニウム基を有するアルギニンが溶離プロセスにおいて劇的な効果を示したので、回収率の向上に寄与するのはカルボン酸基又はグアニジニウム基のいずれであるかを確認するため、他のアミノ酸及びグアニジニウム塩を評価すると共に、アミノ酸とグアニジニウム塩との組合せも評価した。結果を表２にまとめて示す。
【００５２】
【表２】
ゲノムＤＮＡの回収率及び溶離を向上させる溶離液は、約１０．５〜１１．６の高いｐＨという共通の特徴を有することが注目された。グアニジンを用いた核酸溶離の向上は、溶離液中に炭酸塩（又は重炭酸塩）が存在することで促進されるように思われる。このような観察結果に基づき、高いｐＨの効果を試験するためにさらなる実験を実施した。炭酸ナトリウムを含む２Ｍ塩化ナトリウム或いはトリス塩基又はアルギニンを含む２Ｍ塩化ナトリウムを比較した。得られた結果を表３に示す。
【００５３】
【表３】
数種の溶液の評価結果に基づけば、塩強度に加えてｐＨがゲノムＤＮＡの回収に決定的な役割を果たすように思われる。溶離の向上のためには、１〜２Ｍ塩化ナトリウムと０．２５〜０．５Ｍアルギニン、０．５〜１Ｍ炭酸ナトリウム又は０．５〜１Ｍトリス塩基との組合せが使用できる。
【００５４】
高いｐＨがイオン交換樹脂からの多量のゲノムＤＮＡの回収を助ける因子であるように思われたので、塩とグアニジン誘導体とのさらにいくつかの組合せを溶離液として評価したが、これらはいずれも溶離液に高いｐＨを与えた。
１．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．２Ｍ Ｌ−アルギニン
２．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ 炭酸グアニジン
３．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ グリシン
４．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ 炭酸グアニジン＋０．５Ｍ Ｌ−グルタミン酸
５．２Ｍ ＮａＣｌ＋０．５Ｍ プロピオン酸グアニジン
結果は、１Ｍ〜２Ｍ塩化ナトリウム溶液へのアルギニン、炭酸グアニジン又は他のグアニジン誘導体（例えば、プロピオン酸グアニジン）の添加がイオン交換樹脂からのゲノムＤＮＡの溶離に対して同様な効果を有することを明確に実証している（表４）。
【００５５】
【表４】
（Ｃ）溶離液中におけるＬ−アルギニン、炭酸グアニジン及び炭酸カリウムの比較
塩化ナトリウムと炭酸ナトリウムの組合せがある程度の回収率向上をもたらしたので、炭酸カリウムを塩化ナトリウムと組み合わせた溶液を炭酸グアニジン及びＬ−アルギニンと比較して評価する。塩化ナトリウム及び炭酸ナトリウムの溶液のｐＨは、イオン交換樹脂から核酸を完全に回収するためには最適でない。炭酸カリウムは一層高いｐＨの溶液を与えるので、イオン交換樹脂からの核酸の一層高い回収率を与えるものと予想される。実際、塩化ナトリウムと炭酸カリウムの組合せは高いｐＨを有する溶液を与え、溶離プロファイルは炭酸グアニジン又はアルギニンを含む溶液に十分匹敵していた。実験の詳細は上記セクション（Ｂ）の場合と同様である。この場合にも、ゲノムＤＮＡ供給源としてヒト血液を使用し、（Ａ）（ａ）に記載した血液プロトコルに準拠した。結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
表５中のデータから明らかな通り、炭酸カリウムを含む塩化ナトリウム溶液は、炭酸グアニジン又はＬ−アルギニンを含む溶液と比較した場合、イオン交換樹脂からのゲノムＤＮＡ溶離に関して等しく有効である。
【００５７】
各種添加剤の系統的な評価に基づけば、塩強度に加えてｐＨが核酸の回収に決定的な役割を果たすように思われる。溶離の向上のためには、１〜２Ｍ塩化ナトリウムと０．２５〜０．５Ｍアルギニン、０．５Ｍ炭酸カリウム又は０．５Ｍ炭酸グアニジンとの組合せが使用できる。０．５〜１Ｍ炭酸ナトリウム又は０．５〜１Ｍトリス塩基もまた、溶離を向上させるために使用できる。
【００５８】
（Ｄ）血液からのゲノムＤＮＡ精製
プロトコルセクションに記載した手順を用いて８ｍｌのヒト血液試料を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、さらに５ｍｌのローディング液をカラム上に加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液（１Ｍ塩化ナトリウム＋０．５Ｍ炭酸カリウム）を加え、ゲノムＤＮＡを含む溶出液を捕集管に捕集した。得られた生成物をＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動（図１）によって決定した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析（図２）によって評価した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、制限酵素消化（図３）、多重ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ（図４）のような下流用途においても評価した。
【００５９】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、血液からの精製ゲノムＤＮＡは大きいサイズを有することが明らかである（図１）。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた（図２）。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された。
【００６０】
精製ゲノムＤＮＡの品質をいくつかの方法で評価した。
【００６１】
ＤＮＡに対し、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図３、レーン２、４、６は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５は酵素で消化した試料である）。
【００６２】
ゲノムＤＮＡ試料の品質を、多重ＰＣＲ反応における効率によって間接的に測定した。この試験のためには、Ｐ４５０遺伝子に関するロングレンジ多重ＰＣＲを使用した（ＣｏｄｅＬｉｎｋ Ｐ４５０プロトコル、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ３Ａ５からの３つのアンプリコンを単一の反応で増幅した。アンプリコンのサイズは３３５〜２６００ｂｐの範囲内にある。ＰＣＲ生成物のサイズ及び収量はＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００及びＤＮＡ ７５００キットによって決定した。多重ＰＣＲ反応は、試験したすべての試料について十分に役立った（データは示さず）。
【００６３】
ゲノムＤＮＡ試料の品質はまた、リアルタイムＰＣＲアッセイによっても試験した。リアルタイムＰＣＲ実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。試験したすべての試料は非常によく似た増幅プロファイルを示している（図４）。
【００６４】
同じ精製プロセスは、他の動物からの血液試料にも成功裡に適用された。ラット、モルモット、ウマ、ニワトリ及びヒツジのような各種動物から高品質のゲノムＤＮＡが単離された。
【００６５】
（Ｅ）組織試料からのゲノムＤＮＡの単離
２００ミリグラムのラット肝臓組織をホモジナイズし、プロトコルセクションに記載したようにして溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、遠心して粒子状物質をペレット化した。透明な溶解物をイオン交換精製カラム上にロードした。すべての溶液が樹脂を通過した後、５ｍｌのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液（１Ｍ塩化ナトリウム＋０．５Ｍ炭酸カリウム）をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムＤＮＡをＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析によって評価した。プロトコルの一貫性にアクセスするために複数の試料を処理した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動（図５）によって決定した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、リアルタイムＰＣＲ（図６）及び制限酵素消化（図７）のような下流用途においても評価した。
【００６６】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、ラット肝臓組織からの精製ゲノムＤＮＡ試料はいずれも大きいサイズを有することが明らかである（図５）。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された（データは示さず）。
【００６７】
精製ゲノムＤＮＡの品質をいくつかの方法で評価した。
【００６８】
ゲノムＤＮＡ試料の品質をリアルタイムＰＣＲアッセイによって試験した。リアルタイムＰＣＲ実験は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行った。試験したすべての試料は非常によく似た増幅プロファイルを示している（図６）。
【００６９】
ＤＮＡに対し、ＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図７、レーン２、４、６、８は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５、７は酵素で消化した試料である）。
【００７０】
（Ｆ）細胞培養物からのゲノムＤＮＡの単離
プロトコルセクションに記載した手順を用いて約２×１０７個のＭＲＣ５細胞を溶解した。粗溶解物をローディング液で希釈し、イオン交換精製カラムに移した。すべての溶液が樹脂を通過した後、５ｍｌのローディング液をカラムに加えた。樹脂の上部にもはや溶液が存在しなくなった後、２．５ｍｌの溶離液をカラムに加え、生成物を溶出液中に捕集した。こうして得られたゲノムＤＮＡをＮＡＰ−２５カラムを用いて脱塩した。生成物の純度をＵＶ分光測光及びゲル分析によって評価した。単離したゲノムＤＮＡのサイズをパルス電界ゲル電気泳動によって決定した。この方法によって得られたゲノムＤＮＡはまた、リアルタイムＰＣＲ及び制限酵素消化のような下流用途においても評価した。
【００７１】
パルス電界ゲル電気泳動によれば、ＭＲＣ５細胞からの精製ゲノムＤＮＡ試料はいずれも大きいサイズ（１００Ｋｂ、図８）を有することが明らかである。試料の純度をアガロースゲル分析によって調べた。それによれば、単離されたゲノムＤＮＡは純粋であってＲＮＡ汚染のないことが実証された（データは示さず）。
【００７２】
精製ゲノムＤＮＡの品質を制限酵素消化によって評価した。ＤＮＡに対し、ＥｃｏＲＩを用いた制限酵素消化を施した。精製ゲノムＤＮＡ（２５０μｇ）を４０単位の酵素で消化した。未消化ＤＮＡ試料と並行して、消化試料をアガロースゲル上で分析した。ゲルイメージは、すべてのゲノムＤＮＡが完全に消化されたことを示している（図９、レーン２、４、６、８、１０、１２は未消化の精製ゲノムＤＮＡを表す一方、レーン１、３、５、７、９、１１は酵素で消化した試料である）。
【００７３】
本明細書中で言及された特許、特許出願公開及びその他の公表参考文献のすべては、各々が個別かつ詳細に引用されて本明細書中に組み込まれた場合と同じく、その全体が援用によって本明細書の内容の一部をなしている。以上、本発明の好ましい例示的な実施形態を説明してきたが、限定のためではなく例示を目的として示される記載の実施形態以外の実施形態によって本発明が実施できることは当業者にとって容易に理解されよう。本発明は、以下に示す特許請求の範囲のみによって限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞から核酸を分離及び／又は精製する方法であって、
ａ）前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
ｂ）陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、前記核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、
ｃ）核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体から核酸を溶離する段階、及び
ｄ）下流用途に適するように前記溶離核酸を脱塩する段階
を含んでなる方法において、
前記水性移動相のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３にするような組成物を前記溶離液中に添加することを含み、溶離液中における前記組成物の存在が前記組成物の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことによって改良された方法。
【請求項２】
ｐＨが約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨが約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が炭酸カリウムを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が炭酸カリウムである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記炭酸カリウムが約０．１〜２Ｍの濃度で存在する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
水性移動相中における前記組成物の存在が、前記組成物の不存在下での同じ陰イオン交換体からの前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率を４０％以上増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
水性移動相中における前記組成物の存在が、前記組成物の不存在下での同じ陰イオン交換体からの前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率を約４０％〜約４００％増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換体がＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換体がＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱ樹脂からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が血液細胞又は細胞培養細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞がホモジナイズした組織試料から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
細胞から核酸を分離及び／又は精製するためのキットであって、
ａ）前記細胞から核酸含有水溶液を生成するための溶解液、
ｂ）核酸を結合するための、固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体、
ｃ）前記陰イオン交換体から核酸を溶離するための溶離液であって、約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のｐＨを有する溶離液、及び
ｄ）前記溶離核酸を脱塩するための脱塩手段
を含んでなるキット。
【請求項１５】
前記溶離液のｐＨが約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２である、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
ｐＨが約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である、請求項１４記載のキット。
【請求項１７】
前記組成物が炭酸カリウムを含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１８】
前記組成物が炭酸カリウムである、請求項１４記載のキット。
【請求項１９】
陰イオン交換体が高流速樹脂である、請求項１４記載のキット。
【請求項２０】
陰イオン交換体がＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱ樹脂からなる群から選択される、請求項１４記載のキット。
【請求項１】
細胞から核酸を分離及び／又は精製する方法であって、
ａ）前記細胞を溶解液で溶解して核酸含有水溶液を生成する段階、
ｂ）陰イオン交換体が核酸を結合するような条件下で、前記核酸含有水溶液を固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体に接触させる段階、
ｃ）核酸溶離液からなる水性移動相を用いて前記陰イオン交換体から核酸を溶離する段階、及び
ｄ）下流用途に適するように前記溶離核酸を脱塩する段階
を含んでなる方法において、
前記水性移動相のｐＨを約ｐＨ９〜約ｐＨ１３にするような組成物を前記溶離液中に添加することを含み、溶離液中における前記組成物の存在が前記組成物の不存在下での前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率の増加をもたらすことによって改良された方法。
【請求項２】
ｐＨが約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｐＨが約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が炭酸カリウムを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が炭酸カリウムである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記炭酸カリウムが約０．１〜２Ｍの濃度で存在する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
水性移動相中における前記組成物の存在が、前記組成物の不存在下での同じ陰イオン交換体からの前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率を４０％以上増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
水性移動相中における前記組成物の存在が、前記組成物の不存在下での同じ陰イオン交換体からの前記核酸の回収率に比べて陰イオン交換体からの核酸回収率を約４０％〜約４００％増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
陰イオン交換体がＡＮＸ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
陰イオン交換体がＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱ樹脂からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が血液細胞又は細胞培養細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞がホモジナイズした組織試料から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
細胞から核酸を分離及び／又は精製するためのキットであって、
ａ）前記細胞から核酸含有水溶液を生成するための溶解液、
ｂ）核酸を結合するための、固体支持マトリックスに結合された陰イオン交換体、
ｃ）前記陰イオン交換体から核酸を溶離するための溶離液であって、約ｐＨ９〜約ｐＨ１３のｐＨを有する溶離液、及び
ｄ）前記溶離核酸を脱塩するための脱塩手段
を含んでなるキット。
【請求項１５】
前記溶離液のｐＨが約ｐＨ１０〜約ｐＨ１２である、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
ｐＨが約ｐＨ１０．５〜約ｐＨ１１．６である、請求項１４記載のキット。
【請求項１７】
前記組成物が炭酸カリウムを含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１８】
前記組成物が炭酸カリウムである、請求項１４記載のキット。
【請求項１９】
陰イオン交換体が高流速樹脂である、請求項１４記載のキット。
【請求項２０】
陰イオン交換体がＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＸＬ及びＣａｐｔｏＱ樹脂からなる群から選択される、請求項１４記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５０４７３８（Ｐ２０１０−５０４７３８Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２９３５０（Ｐ２００９−５２９３５０）
【出願日】平成１９年９月１９日（２００７．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３９６６４
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１９日（２００７．９．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７８８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３９６６４
【国際公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【出願人】（５９８０４１４６３）ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・コーポレイション (43)
【住所又は居所原語表記】８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕｅ， Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １３２７，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ ０８８５５−１３２７，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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