難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤、並びにかかる薬剤及び中性オリゴ糖を含有する組成物
【課題】
化学的に安定で、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供する。
【解決手段】
難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤。弱酸は好ましくはウロン酸又はフェノール酸である。また、かかる薬剤及び難消化性の中性オリゴ糖を含むビフィズス菌増殖作用を有する組成物も提供される。
化学的に安定で、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供する。
【解決手段】
難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤。弱酸は好ましくはウロン酸又はフェノール酸である。また、かかる薬剤及び難消化性の中性オリゴ糖を含むビフィズス菌増殖作用を有する組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤に関する。本発明は、かかる薬剤及び中性オリゴ糖を含有するビフィズス菌増殖作用を有する組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢は、摂取された食物やその代謝産物等を栄養素として増殖し、人間の健康や疾病と密接に関係していると言われる。腸内細菌叢の共生、あるいは拮抗関係は、年齢と共に変化し、老齢期になると有用菌であるビフィズス菌を始めとする善玉菌が減少し、日和見菌である大腸菌や、腸内の腐敗をもたらすウォルシュ菌が増加する。
【０００３】
来るべき老齢化社会に向け、腸内細菌叢を改善する目的で、様々なビフィズス菌増殖因子が提案されている。その多くは中性オリゴ糖であり、消化液で分解されずに大腸に到達し、ビフィズス菌に選択的に資化されることを特徴としている（非特許文献１〜６、特許文献１）。
【０００４】
中性オリゴ糖には、それぞれ所定の有効量があるが、食品加工プロセス中に分解が起こる場合等、期待する効果を得るために大目の添加が必要となることもある。特に飲料の中には、菌汚染を忌避する目的で低ｐＨ（弱酸領域）で提供されるものも多く、こうした場合、製造から販売されるまでの期間や環境に留意し、分解等による減量を考慮した適切な添加量を設定する必要がある。この点において、化学的に安定であり、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供することは、市場的意義が大きい。
【非特許文献１】奥，栄養学雑誌，４４，２９１（１９８６）
【非特許文献２】石川等，ビフィズス，９，５，（１９９５）
【非特許文献３】Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｆｄｏｂａｃｔ．Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ．，１３，５１，（１９９４）
【非特許文献４】坂井等，澱粉化学，６３，１６７（１９９０）
【非特許文献５】Ａｇｈｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｎｕｔｒ．，１２８， １２８３，（１９９８）
【非特許文献６】林等，医学と生物学，１１９，１５（１９８９）
【特許文献１】特開平１０−２９０６８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、化学的に安定で、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、難消化性のオリゴ糖に弱酸であるウロン酸やフェノール酸を結合したオリゴ糖（酸性オリゴ糖）が、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅することを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００７】
即ち、本発明は、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸（好ましくはウロン酸又はフェノール酸、特にグルクロン酸）が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。
【０００８】
また、本発明によれば、かかる薬剤、及び難消化性の中性オリゴ糖を含むことを特徴とするビフィズス菌増殖作用を有する組成物も提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の薬剤の有効成分である酸性オリゴ糖は、分子構造内にカルボン酸を有することから、酸や酵素等の作用を受け難く、一般のオリゴ糖より化学的に安定である。従って、本発明によれば、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅でき、しかも化学的に安定な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の薬剤の有効成分である酸性オリゴ糖は、基本骨格である難消化性オリゴ糖に弱酸が結合されている分子構造を有することを特徴とする。
【００１１】
このような分子構造を有するオリゴ糖は従来公知のいかなる方法でも製造することができるが、例えば特開平１１−３１３７００号公報に記載されているように、弱酸が結合された多糖を含む天然原料（例えばコーンスターチ製造時の副産物であるトウモロコシの種皮等）を酸及び／又は酵素で加水分解して多糖をオリゴ糖に変換することによって得ることができる。加水分解物には目的とする酸性オリゴ糖に加えて単糖や中性オリゴ糖も通常含まれているので、適当な方法で酸性オリゴ糖のみを分離抽出して用いればよい。
【００１２】
本発明の酸性オリゴ糖では、基本骨格である難消化性オリゴ糖に結合される弱酸は、ヒトの体内に摂取・吸収されても安全な弱酸ならいかなる弱酸であることもできるが、弱酸が結合された多糖を含む天然原料からの加水分解により酸性オリゴ糖を得る場合、弱酸は通常、グルクロン酸、４−０−メチルグルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸又はフェルラ酸、コマール酸等のフェノール酸である。弱酸のオリゴ糖への結合様式は通常、弱酸残基がオリゴ糖の側鎖として存在する様式であると考えられる。また、弱酸のオリゴ糖の構成単糖に対する結合比率は通常、１／２以下である。
【００１３】
本発明の酸性オリゴ糖において基本骨格である難消化性オリゴ糖の平均重合度は、オリゴ糖の重合度として通常規定される範囲（二から十数）であればいずれの値でもよいが、得られる酸性オリゴ糖の粘度の低さ及び取扱いの容易さの観点からは平均重合度は２〜１０であることが好ましい。平均重合度のさらに好ましい範囲は２〜８であり、特に好ましい範囲は２〜７である。難消化性オリゴ糖の平均重合度の制御は当業者には周知であるのでここでは詳細に述べないが、例えば弱酸が結合された多糖を含む天然原料からの加水分解により酸性オリゴ糖を得る場合、オリゴ糖の平均重合度の制御は加水分解時間や加水分解時の反応溶液のｐＨを適宜調節することによって行うことができる。ここで、本発明において「難消化性オリゴ糖」とは、消化液で実質的に分解されず、従って小腸で吸収されずにそのまま大腸に到達する程度の消化性しか有さないオリゴ糖を意味し、例えばキシロースが複数個重合したキシロオリゴ糖がこれに該当する。また、このオリゴ糖はホモオリゴ糖である必要はなく、２種以上の単糖が重合したヘテロオリゴ糖であってもよい。
【００１４】
本発明の薬剤と混合する難消化性の中性オリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用があれば特に限定されるものではないが、例えば、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、マンノオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、アラビノガラクトオリゴ糖、ガラクトマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ糖等を用いることができる。また、本発明の薬剤と難消化性の中性オリゴ糖を混合して組成物を調製する場合、その配合比率は特に限定されないが、本発明の薬剤１０〜９０重量％に対して難消化性の中性オリゴ糖９０〜１０重量％を配合することが好ましい。
【実施例】
【００１５】
以下、製造例１〜５により本発明の酸性オリゴ糖の製造方法を例示し、次に検証試験１及び２により、本発明の酸性オリゴ糖が難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅することを具体的に示す。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１６】
（製造例１）
トウモロコシの種皮を、特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間の適当な時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を細胞壁分解酵素処理後、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらにＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムで単糖成分を除去した後（図１）、強塩基型イオン交換樹脂に吸着させて、ＮａＯＨで脱離させ、グルクロノキシロオリゴ糖を得た。
【００１７】
（製造例２）
トウモロコシの種皮を、特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間の適当な時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を細胞壁分解酵素処理後、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらにＣａ型カチオン交換樹脂によるクロマト分離で単糖成分を分離除去し粗精製液を得た。この粗精製液を、Ｎａ型とＣａ型を連結した配位子交換カラムでＨＰＬＣ分析したところ、酸性のオリゴ糖成分を主成分（３４％）とする糖鎖（ＡＯ３４）であることがわかった（図２、表１）。このオリゴ糖液の構成糖を調べたところ、１０％のグルクロン酸を含むヘテロ糖鎖であることがわかった（表２）。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
（製造例３）
製造例１で得られたオリゴ糖液を弱塩基型イオン交換樹脂に吸着させ、４％ＮａＣｌで脱離させて、高純度グルクロノキシロオリゴ糖（純度９９％以上）を得た。得られたグルクロノキシロオリゴ糖には若干（０．３％程度）のフェルラ酸も認められた（図３）。主鎖となるキシロオリゴ糖（アラビノースも平均で０．１個結合）の平均重合度は４．１であり、これにグルクロン酸が平均で１．４個結合した構造を持っていた（表３）。
【００２１】
【表３】
【００２２】
（製造例４）
製造例２で得られたオリゴ糖液をＮａ＋カチオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０、三菱化学（株））に通液して酸性成分と中性成分を分離した（図４）。得られた酸性オリゴ糖（ＡＯ７５）は純度７５％であった。
【００２３】
（製造例５）
製造例４で得られた酸性オリゴ糖を、アニオン交換樹脂（ＷＡ３０）に通液した。吸着成分を塩化ナトリウムで溶出した後、ゲル濾過（ＢｉｏｇｅｌＰ−２）で脱塩し、高純度（純度＞９９％）の酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）を得た（図５）。
【００２４】
この酸性オリゴ糖の糖組成を分析したところ、中性成分はキシロースのみであった。また、この酸性オリゴ糖を還元処理するとグルコースが生じることから、結合している弱酸性分の殆どはグルクロン酸であることがわかった。さらに、このグルクロン酸の結合様式の確認のため、β−グルクロニダーゼを作用させたところ、遊離が認められず、結合様式はα結合であった。
【００２５】
この酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の重合度は平均で７．０であり、糖組成はキシロース約７２％、グルクロン酸約２８％であった（表４）。また、この酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の推定される平均的な基本構造は、キシロース５．０個からなる主鎖にグルクロン酸が２個側鎖として結合した構造を保持していた（図６）。
【表４】
【００２６】
検証試験１： 腸内細菌に対する資化性試験
製造例５で得られた酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の表５に示す３０種類の腸内細菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの資化性（資化選択性）試験を行った。比較として、表５に示す５種類の難消化性の中性オリゴ糖の資化選択性を併せて調べた。また、混合例として、酸性オリゴ糖３４％とアラビノキシロオリゴ糖等の中性の難消化性オリゴ糖６６％を含む混合品（ＡＯ３４）の資化選択性も調べた。
【００２７】
試験方法
予備培養後の各腸内細菌を各オリゴ糖を炭素源とした液体培地に植菌し、３７℃、４８時間培養後の培地のｐＨを測定して調べた。
【００２８】
結果
難消化性の中性オリゴ糖は有用菌であるビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｉｒｕｍｕ属細菌）に対する資化選択性を示したが、ＡＯ９９はビフィズス菌を含むいずれの腸内細菌に対してもほとんど資化性を示さなかった。（表５）。また、混合品ＡＯ３４は中性オリゴ糖と同様にビフィズス菌に対する資化選択性を示した。この結果から、酸性オリゴ糖自体にはビフィズス菌増殖作用がないことがわかる。
【００２９】
【表５】
＊ オリゴ糖の略号の説明
ＡＯ９９： 製造例５で得られた酸性オリゴ糖
ＮＯ： アラビノキシロオリゴ糖
ＦＯＳ： フラクトオリゴ糖
ＧＯ： ガラクトオリゴ糖
ＩＭＯ： イソマルトオリゴ糖
ＬＳ： 乳果オリゴ糖
ＡＯ３４： 酸性オリゴ糖３４％とアラビノキシロオリゴ糖６６％の混合品
＊ 記号の説明
− ： ＞ｐＨ６．０
± ： ｐＨ５．５〜５．９
＋ ： ｐＨ５．０〜５．４
＋＋ ： ｐＨ４．５〜４．９
＋＋＋ ： ＜ｐＨ４．４
【００３０】
検証試験２： ラットによる整腸作用試験
製造例４で得られた酸性オリゴ糖７５％とアラビノキシロオリゴ糖（中性オリゴ糖）２５％の混合物（ＡＯ７５）をラットに摂取させ、その整腸作用を調べた。
【００３１】
試験方法
４週齢のＷｉｓｔａｒ Ｈａｎｏｖａｒ ＧＡＬＡＳ雄ラットを市販固形飼料にて５日間予備飼育後、平均体重が同じになるように１群８匹（ｎ＝８）で３群に分け、４週間ラットに飼料と水を自由摂取させた後、解剖に供した。飼育環境は、温度２３±１℃、相対湿度３０〜５０％、明暗周期１２時間の条件とした。ＡＯ７５を１％含有する飼料を摂取させた群をＡＯ７５ １％群とした。対照として、ＡＯ７５をセルロースに置換えた飼料を摂取させた群をコントロール群とし、ＡＯ７５をアラビノキシロオリゴ糖に置換えた飼料を摂取させた群をＮＯ９９ １％群とした。また、参考のため、アラビノキシロオリゴ糖を２％含有する飼料を摂取させた群をＮＯ９９ ２％群とした。
【００３２】
飼育期間中は、体重、飼料摂取量を週に３回測定した。
【００３３】
ラットの解剖は、一昼夜絶食後、エーテル麻酔下で行い、門脈、腹部大動脈から採血して失血死させ、肝臓、腎臓、盲腸を摘出し、各臓器は重量を測定するとともに、盲腸内ｐＨを測定した。
【００３４】
盲腸内細菌叢の同定は、盲腸内容物を懸濁、希釈した後、２種の非選択培地、４種の選択培地にそれぞれ塗布し、好気、嫌気各条件下で培養後、選択培地に生育したコロニー数を数えるとともに、非選択培地に生育したコロニーについて、グラム染色、好気生育テスト等を行い、菌叢を同定した。盲腸内容物については、以下の条件のＨＰＣＬによって短鎖脂肪酸類を定量した。
溶離液 ：３ｍＭ過塩素酸溶液
カラム ：Ｒｓｐａｃｋ ＫＣ−８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）２本連結
カラム温度 ：５０℃
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ検出器（４３０ｎｍ）
ポストカラムシステム：反応液ＳＴＲ−３（１０倍希釈）０．６ｍｌ／ｍｉｎ
アプライ ：１００μｌ
【００３５】
結果
体重及び飼料摂取量は、コントロール群やＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群間に差は見られず（表６）、肝臓、腎臓重量に変化は見られなかったが、ＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群で盲腸重量の有意な増加と盲腸内ｐＨの低下傾向が観察された（表７）。さらにＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群とでは、コントロール群と比べてビフィズス菌数が十倍以上増加し（表８）、占有率（％）も数百倍増加した（図７）。また、盲腸内容物中の短鎖脂肪酸量を調べたところ、ＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群とでは、コントロール群と比べて全短鎖脂肪酸量が増加の傾向にあり、そのうち特に、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸が増加傾向にあった（表９）。また、ＮＯ９９ １％群とＡＯ７５ １％群とではこれらの効果に差はなかった。ＮＯ９９ １％群とＮＯ９９ ２％群とでは、ＮＯ９９ ２％群の方がＮＯ９９ １％群よりほぼ２倍優れた（図７参照）ビフィズス菌増殖作用を示した。
【００３６】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【００３７】
考察
検証試験２から、中性オリゴ糖を１％投与した場合（ＮＯ９９ １％群）と、中性オリゴ糖を０．２５％、酸性オリゴ糖を０．７５％投与した場合（ＡＯ７５ １％群）とでは、整腸作用（ビフィズス菌増殖作用）に差は認められなかった。つまり、中性オリゴ糖の添加量の３／４を酸性オリゴ糖に置き換えても、中性オリゴ糖のみを添加したときとほぼ同じ効果が得られた。
通常、難消化性の中性オリゴ糖の整腸作用効果は添加量にある程度依存するため、難消化性の中性オリゴ糖の添加量を１／４に減らすと、その整腸効果も１／４程度に低下すると考えられる。このことは、検証試験２で中性オリゴ糖の添加量を２倍にしたＮＯ９９ ２％群がＮＯ９９ １％群と比べてほぼ２倍優れたビフィズス菌増殖効果を示したことからも裏付けられる。よって、検証試験２で中性オリゴ糖を減らし、その分酸性オリゴ糖を増やしてもその効果が変わらないのは、酸性オリゴ糖それ自体にも整腸作用があるか、それとも酸性オリゴ糖に他のオリゴ糖の整腸作用を増幅する働きがあるかどちらかである。ここで、検証試験１で、酸性オリゴ糖自体には資化性、つまり整腸作用がないことが分かっている。従って、この試験の結果は、酸性オリゴ糖が他のオリゴ糖の整腸作用（ビフィズス菌増殖作用）を増幅する働きを示したためであると考えられる。
【００３８】
結論
以上の結果から、酸性オリゴ糖自体はビフィズス菌増殖作用を有さないが、中性オリゴ糖と組合せて投与すると中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する働きがあることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】トウモロコシ種皮酸分解物のゲル濾過結果を示す。
【図２】酸性オリゴ糖粗精製物のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図３】酸性オリゴ糖中のフェルラ酸を示す。
【図４】酸性オリゴ糖の分離精製を示す。
【図５】酸性オリゴ糖の精製結果を示す。
【図６】酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の平均的な基本構造（推定）を示す。
【図７】盲腸内細菌叢の占有率を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤に関する。本発明は、かかる薬剤及び中性オリゴ糖を含有するビフィズス菌増殖作用を有する組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内細菌叢は、摂取された食物やその代謝産物等を栄養素として増殖し、人間の健康や疾病と密接に関係していると言われる。腸内細菌叢の共生、あるいは拮抗関係は、年齢と共に変化し、老齢期になると有用菌であるビフィズス菌を始めとする善玉菌が減少し、日和見菌である大腸菌や、腸内の腐敗をもたらすウォルシュ菌が増加する。
【０００３】
来るべき老齢化社会に向け、腸内細菌叢を改善する目的で、様々なビフィズス菌増殖因子が提案されている。その多くは中性オリゴ糖であり、消化液で分解されずに大腸に到達し、ビフィズス菌に選択的に資化されることを特徴としている（非特許文献１〜６、特許文献１）。
【０００４】
中性オリゴ糖には、それぞれ所定の有効量があるが、食品加工プロセス中に分解が起こる場合等、期待する効果を得るために大目の添加が必要となることもある。特に飲料の中には、菌汚染を忌避する目的で低ｐＨ（弱酸領域）で提供されるものも多く、こうした場合、製造から販売されるまでの期間や環境に留意し、分解等による減量を考慮した適切な添加量を設定する必要がある。この点において、化学的に安定であり、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供することは、市場的意義が大きい。
【非特許文献１】奥，栄養学雑誌，４４，２９１（１９８６）
【非特許文献２】石川等，ビフィズス，９，５，（１９９５）
【非特許文献３】Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｆｄｏｂａｃｔ．Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ．，１３，５１，（１９９４）
【非特許文献４】坂井等，澱粉化学，６３，１６７（１９９０）
【非特許文献５】Ａｇｈｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ ｏｆ Ｎｕｔｒ．，１２８， １２８３，（１９９８）
【非特許文献６】林等，医学と生物学，１１９，１５（１９８９）
【特許文献１】特開平１０−２９０６８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、化学的に安定で、かつ中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、難消化性のオリゴ糖に弱酸であるウロン酸やフェノール酸を結合したオリゴ糖（酸性オリゴ糖）が、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅することを見出し、本発明を完成させるに到った。
【０００７】
即ち、本発明は、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸（好ましくはウロン酸又はフェノール酸、特にグルクロン酸）が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤である。
【０００８】
また、本発明によれば、かかる薬剤、及び難消化性の中性オリゴ糖を含むことを特徴とするビフィズス菌増殖作用を有する組成物も提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の薬剤の有効成分である酸性オリゴ糖は、分子構造内にカルボン酸を有することから、酸や酵素等の作用を受け難く、一般のオリゴ糖より化学的に安定である。従って、本発明によれば、難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅でき、しかも化学的に安定な薬剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の薬剤の有効成分である酸性オリゴ糖は、基本骨格である難消化性オリゴ糖に弱酸が結合されている分子構造を有することを特徴とする。
【００１１】
このような分子構造を有するオリゴ糖は従来公知のいかなる方法でも製造することができるが、例えば特開平１１−３１３７００号公報に記載されているように、弱酸が結合された多糖を含む天然原料（例えばコーンスターチ製造時の副産物であるトウモロコシの種皮等）を酸及び／又は酵素で加水分解して多糖をオリゴ糖に変換することによって得ることができる。加水分解物には目的とする酸性オリゴ糖に加えて単糖や中性オリゴ糖も通常含まれているので、適当な方法で酸性オリゴ糖のみを分離抽出して用いればよい。
【００１２】
本発明の酸性オリゴ糖では、基本骨格である難消化性オリゴ糖に結合される弱酸は、ヒトの体内に摂取・吸収されても安全な弱酸ならいかなる弱酸であることもできるが、弱酸が結合された多糖を含む天然原料からの加水分解により酸性オリゴ糖を得る場合、弱酸は通常、グルクロン酸、４−０−メチルグルクロン酸、ガラクツロン酸等のウロン酸又はフェルラ酸、コマール酸等のフェノール酸である。弱酸のオリゴ糖への結合様式は通常、弱酸残基がオリゴ糖の側鎖として存在する様式であると考えられる。また、弱酸のオリゴ糖の構成単糖に対する結合比率は通常、１／２以下である。
【００１３】
本発明の酸性オリゴ糖において基本骨格である難消化性オリゴ糖の平均重合度は、オリゴ糖の重合度として通常規定される範囲（二から十数）であればいずれの値でもよいが、得られる酸性オリゴ糖の粘度の低さ及び取扱いの容易さの観点からは平均重合度は２〜１０であることが好ましい。平均重合度のさらに好ましい範囲は２〜８であり、特に好ましい範囲は２〜７である。難消化性オリゴ糖の平均重合度の制御は当業者には周知であるのでここでは詳細に述べないが、例えば弱酸が結合された多糖を含む天然原料からの加水分解により酸性オリゴ糖を得る場合、オリゴ糖の平均重合度の制御は加水分解時間や加水分解時の反応溶液のｐＨを適宜調節することによって行うことができる。ここで、本発明において「難消化性オリゴ糖」とは、消化液で実質的に分解されず、従って小腸で吸収されずにそのまま大腸に到達する程度の消化性しか有さないオリゴ糖を意味し、例えばキシロースが複数個重合したキシロオリゴ糖がこれに該当する。また、このオリゴ糖はホモオリゴ糖である必要はなく、２種以上の単糖が重合したヘテロオリゴ糖であってもよい。
【００１４】
本発明の薬剤と混合する難消化性の中性オリゴ糖は、ビフィズス菌増殖作用があれば特に限定されるものではないが、例えば、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノオリゴ糖、マンノオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、アラビノガラクトオリゴ糖、ガラクトマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ糖等を用いることができる。また、本発明の薬剤と難消化性の中性オリゴ糖を混合して組成物を調製する場合、その配合比率は特に限定されないが、本発明の薬剤１０〜９０重量％に対して難消化性の中性オリゴ糖９０〜１０重量％を配合することが好ましい。
【実施例】
【００１５】
以下、製造例１〜５により本発明の酸性オリゴ糖の製造方法を例示し、次に検証試験１及び２により、本発明の酸性オリゴ糖が難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅することを具体的に示す。なお、実施例の記載は純粋に発明の理解のためのみに挙げるものであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１６】
（製造例１）
トウモロコシの種皮を、特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間の適当な時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を細胞壁分解酵素処理後、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらにＢｉｏｇｅｌ Ｐ２カラムで単糖成分を除去した後（図１）、強塩基型イオン交換樹脂に吸着させて、ＮａＯＨで脱離させ、グルクロノキシロオリゴ糖を得た。
【００１７】
（製造例２）
トウモロコシの種皮を、特開平１１−３１３７００号公報に例示されている方法に従って酸分解した。具体的には、トウモロコシの種皮にシュウ酸を添加してｐＨを２付近に調整し、１３０℃で３０分〜３時間の適当な時間加圧分解して分解糖液を得た。得られた分解糖液を細胞壁分解酵素処理後、活性炭処理し、イオン交換樹脂に通液し、さらにＣａ型カチオン交換樹脂によるクロマト分離で単糖成分を分離除去し粗精製液を得た。この粗精製液を、Ｎａ型とＣａ型を連結した配位子交換カラムでＨＰＬＣ分析したところ、酸性のオリゴ糖成分を主成分（３４％）とする糖鎖（ＡＯ３４）であることがわかった（図２、表１）。このオリゴ糖液の構成糖を調べたところ、１０％のグルクロン酸を含むヘテロ糖鎖であることがわかった（表２）。
【００１８】
【表１】
【００１９】
【表２】
【００２０】
（製造例３）
製造例１で得られたオリゴ糖液を弱塩基型イオン交換樹脂に吸着させ、４％ＮａＣｌで脱離させて、高純度グルクロノキシロオリゴ糖（純度９９％以上）を得た。得られたグルクロノキシロオリゴ糖には若干（０．３％程度）のフェルラ酸も認められた（図３）。主鎖となるキシロオリゴ糖（アラビノースも平均で０．１個結合）の平均重合度は４．１であり、これにグルクロン酸が平均で１．４個結合した構造を持っていた（表３）。
【００２１】
【表３】
【００２２】
（製造例４）
製造例２で得られたオリゴ糖液をＮａ＋カチオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０、三菱化学（株））に通液して酸性成分と中性成分を分離した（図４）。得られた酸性オリゴ糖（ＡＯ７５）は純度７５％であった。
【００２３】
（製造例５）
製造例４で得られた酸性オリゴ糖を、アニオン交換樹脂（ＷＡ３０）に通液した。吸着成分を塩化ナトリウムで溶出した後、ゲル濾過（ＢｉｏｇｅｌＰ−２）で脱塩し、高純度（純度＞９９％）の酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）を得た（図５）。
【００２４】
この酸性オリゴ糖の糖組成を分析したところ、中性成分はキシロースのみであった。また、この酸性オリゴ糖を還元処理するとグルコースが生じることから、結合している弱酸性分の殆どはグルクロン酸であることがわかった。さらに、このグルクロン酸の結合様式の確認のため、β−グルクロニダーゼを作用させたところ、遊離が認められず、結合様式はα結合であった。
【００２５】
この酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の重合度は平均で７．０であり、糖組成はキシロース約７２％、グルクロン酸約２８％であった（表４）。また、この酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の推定される平均的な基本構造は、キシロース５．０個からなる主鎖にグルクロン酸が２個側鎖として結合した構造を保持していた（図６）。
【表４】
【００２６】
検証試験１： 腸内細菌に対する資化性試験
製造例５で得られた酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の表５に示す３０種類の腸内細菌に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの資化性（資化選択性）試験を行った。比較として、表５に示す５種類の難消化性の中性オリゴ糖の資化選択性を併せて調べた。また、混合例として、酸性オリゴ糖３４％とアラビノキシロオリゴ糖等の中性の難消化性オリゴ糖６６％を含む混合品（ＡＯ３４）の資化選択性も調べた。
【００２７】
試験方法
予備培養後の各腸内細菌を各オリゴ糖を炭素源とした液体培地に植菌し、３７℃、４８時間培養後の培地のｐＨを測定して調べた。
【００２８】
結果
難消化性の中性オリゴ糖は有用菌であるビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｉｒｕｍｕ属細菌）に対する資化選択性を示したが、ＡＯ９９はビフィズス菌を含むいずれの腸内細菌に対してもほとんど資化性を示さなかった。（表５）。また、混合品ＡＯ３４は中性オリゴ糖と同様にビフィズス菌に対する資化選択性を示した。この結果から、酸性オリゴ糖自体にはビフィズス菌増殖作用がないことがわかる。
【００２９】
【表５】
＊ オリゴ糖の略号の説明
ＡＯ９９： 製造例５で得られた酸性オリゴ糖
ＮＯ： アラビノキシロオリゴ糖
ＦＯＳ： フラクトオリゴ糖
ＧＯ： ガラクトオリゴ糖
ＩＭＯ： イソマルトオリゴ糖
ＬＳ： 乳果オリゴ糖
ＡＯ３４： 酸性オリゴ糖３４％とアラビノキシロオリゴ糖６６％の混合品
＊ 記号の説明
− ： ＞ｐＨ６．０
± ： ｐＨ５．５〜５．９
＋ ： ｐＨ５．０〜５．４
＋＋ ： ｐＨ４．５〜４．９
＋＋＋ ： ＜ｐＨ４．４
【００３０】
検証試験２： ラットによる整腸作用試験
製造例４で得られた酸性オリゴ糖７５％とアラビノキシロオリゴ糖（中性オリゴ糖）２５％の混合物（ＡＯ７５）をラットに摂取させ、その整腸作用を調べた。
【００３１】
試験方法
４週齢のＷｉｓｔａｒ Ｈａｎｏｖａｒ ＧＡＬＡＳ雄ラットを市販固形飼料にて５日間予備飼育後、平均体重が同じになるように１群８匹（ｎ＝８）で３群に分け、４週間ラットに飼料と水を自由摂取させた後、解剖に供した。飼育環境は、温度２３±１℃、相対湿度３０〜５０％、明暗周期１２時間の条件とした。ＡＯ７５を１％含有する飼料を摂取させた群をＡＯ７５ １％群とした。対照として、ＡＯ７５をセルロースに置換えた飼料を摂取させた群をコントロール群とし、ＡＯ７５をアラビノキシロオリゴ糖に置換えた飼料を摂取させた群をＮＯ９９ １％群とした。また、参考のため、アラビノキシロオリゴ糖を２％含有する飼料を摂取させた群をＮＯ９９ ２％群とした。
【００３２】
飼育期間中は、体重、飼料摂取量を週に３回測定した。
【００３３】
ラットの解剖は、一昼夜絶食後、エーテル麻酔下で行い、門脈、腹部大動脈から採血して失血死させ、肝臓、腎臓、盲腸を摘出し、各臓器は重量を測定するとともに、盲腸内ｐＨを測定した。
【００３４】
盲腸内細菌叢の同定は、盲腸内容物を懸濁、希釈した後、２種の非選択培地、４種の選択培地にそれぞれ塗布し、好気、嫌気各条件下で培養後、選択培地に生育したコロニー数を数えるとともに、非選択培地に生育したコロニーについて、グラム染色、好気生育テスト等を行い、菌叢を同定した。盲腸内容物については、以下の条件のＨＰＣＬによって短鎖脂肪酸類を定量した。
溶離液 ：３ｍＭ過塩素酸溶液
カラム ：Ｒｓｐａｃｋ ＫＣ−８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）２本連結
カラム温度 ：５０℃
流速 ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出 ：ＵＶ検出器（４３０ｎｍ）
ポストカラムシステム：反応液ＳＴＲ−３（１０倍希釈）０．６ｍｌ／ｍｉｎ
アプライ ：１００μｌ
【００３５】
結果
体重及び飼料摂取量は、コントロール群やＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群間に差は見られず（表６）、肝臓、腎臓重量に変化は見られなかったが、ＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群で盲腸重量の有意な増加と盲腸内ｐＨの低下傾向が観察された（表７）。さらにＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群とでは、コントロール群と比べてビフィズス菌数が十倍以上増加し（表８）、占有率（％）も数百倍増加した（図７）。また、盲腸内容物中の短鎖脂肪酸量を調べたところ、ＮＯ９９ １％群、ＮＯ９９ ２％群とＡＯ７５ １％群とでは、コントロール群と比べて全短鎖脂肪酸量が増加の傾向にあり、そのうち特に、コハク酸、乳酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸が増加傾向にあった（表９）。また、ＮＯ９９ １％群とＡＯ７５ １％群とではこれらの効果に差はなかった。ＮＯ９９ １％群とＮＯ９９ ２％群とでは、ＮＯ９９ ２％群の方がＮＯ９９ １％群よりほぼ２倍優れた（図７参照）ビフィズス菌増殖作用を示した。
【００３６】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【００３７】
考察
検証試験２から、中性オリゴ糖を１％投与した場合（ＮＯ９９ １％群）と、中性オリゴ糖を０．２５％、酸性オリゴ糖を０．７５％投与した場合（ＡＯ７５ １％群）とでは、整腸作用（ビフィズス菌増殖作用）に差は認められなかった。つまり、中性オリゴ糖の添加量の３／４を酸性オリゴ糖に置き換えても、中性オリゴ糖のみを添加したときとほぼ同じ効果が得られた。
通常、難消化性の中性オリゴ糖の整腸作用効果は添加量にある程度依存するため、難消化性の中性オリゴ糖の添加量を１／４に減らすと、その整腸効果も１／４程度に低下すると考えられる。このことは、検証試験２で中性オリゴ糖の添加量を２倍にしたＮＯ９９ ２％群がＮＯ９９ １％群と比べてほぼ２倍優れたビフィズス菌増殖効果を示したことからも裏付けられる。よって、検証試験２で中性オリゴ糖を減らし、その分酸性オリゴ糖を増やしてもその効果が変わらないのは、酸性オリゴ糖それ自体にも整腸作用があるか、それとも酸性オリゴ糖に他のオリゴ糖の整腸作用を増幅する働きがあるかどちらかである。ここで、検証試験１で、酸性オリゴ糖自体には資化性、つまり整腸作用がないことが分かっている。従って、この試験の結果は、酸性オリゴ糖が他のオリゴ糖の整腸作用（ビフィズス菌増殖作用）を増幅する働きを示したためであると考えられる。
【００３８】
結論
以上の結果から、酸性オリゴ糖自体はビフィズス菌増殖作用を有さないが、中性オリゴ糖と組合せて投与すると中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する働きがあることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】トウモロコシ種皮酸分解物のゲル濾過結果を示す。
【図２】酸性オリゴ糖粗精製物のＨＰＬＣ分析結果を示す。
【図３】酸性オリゴ糖中のフェルラ酸を示す。
【図４】酸性オリゴ糖の分離精製を示す。
【図５】酸性オリゴ糖の精製結果を示す。
【図６】酸性オリゴ糖（ＡＯ９９）の平均的な基本構造（推定）を示す。
【図７】盲腸内細菌叢の占有率を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【請求項２】
弱酸がウロン酸又はフェノール酸であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
弱酸がグルクロン酸であることを特徴とする請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤、及び難消化性の中性オリゴ糖を含むことを特徴とするビフィズス菌増殖作用を有する組成物。
【請求項１】
難消化性の中性オリゴ糖のビフィズス菌増殖作用を増幅する薬剤であって、難消化性の中性オリゴ糖に弱酸が結合された酸性オリゴ糖を有効成分とすることを特徴とする薬剤。
【請求項２】
弱酸がウロン酸又はフェノール酸であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
弱酸がグルクロン酸であることを特徴とする請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤、及び難消化性の中性オリゴ糖を含むことを特徴とするビフィズス菌増殖作用を有する組成物。
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【図２】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図３】
【公開番号】特開２００６−２６５１７０（Ｐ２００６−２６５１７０Ａ）
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−８５３０３（Ｐ２００５−８５３０３）
【出願日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
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