電場の確立に付随したピークの広幅化を少なくする方法および装置
【課題】毛細管電気泳動過程での作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする方法、およびこのような方法を行うのに有用な装置を提供すること。
【解決手段】このような方法は、初期電場傾斜中に使用される最大傾斜速度を規定する工程、その作業電場が確立される最短時間を規定する工程、および／または初期電場傾斜中に、分離媒体の温度を一定範囲内に維持する工程を包含する。それに加えて、ピーク広幅化を少なくするのに効果的な傾斜速度を決定する方法が開示されている。
【解決手段】このような方法は、初期電場傾斜中に使用される最大傾斜速度を規定する工程、その作業電場が確立される最短時間を規定する工程、および／または初期電場傾斜中に、分離媒体の温度を一定範囲内に維持する工程を包含する。それに加えて、ピーク広幅化を少なくするのに効果的な傾斜速度を決定する方法が開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、毛細管電気泳動を実行する方法および装置に関する。さらに具体的には、本発明は、この毛細管電気泳動方法を行うのに使用される作業の確立中に起こるピーク広幅化を少なくする方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
生体高分子および小分子の電気泳動分離は、現代の生物学および生物工学で極めて重要であり、ＤＮＡ配列決定、タンパク質の分子量決定、遺伝子地図作製などのような技術において、中心的な役割を果たす。特に好ましい電気泳動フォーマットは、毛細管電気泳動（ＣＥ）であり、その電気泳動は、内径が小さい（例えば、５μｍと１００μｍの間）毛細管チャンネルで実行される。多くの用途では、毛細管電気泳動は、狭いボアの毛細管がジュール熱を消散する性能によって、高い電場を使用することが可能となり、それにより、分離が速くなって、分析物の拡散効果が少なくなるので、伝統的なスラブベースのフォーマットよりも高い分離性能が得られる。それに加えて、毛細管電気泳動は、試料装填工程、分析物検出工程および分離媒体補充工程を自動化する性能があるために、自動化に適している。
【０００３】
毛細管電気泳動の商業的に重要な特定の用途には、極めて高い分離効率が必要である。例えば、ＤＮＡ配列決定分離では、１メートルあたり二千万枚のプレート数が必要であり得る。この種の性能を達成するために、ピーク広幅化（従って、低い分離効率）、例えば、この毛細管の管腔内での放射状温度プロフィール、その試料注入容量、溶質−壁相互作用、サイホン作用、有限検出容量などにより生じるピーク広幅化を引き起こし得る機器の影響を少なくするように、可能な限り、あらゆることを行わなければならない（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｐ．１，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。それに加えて、大規模なＤＮＡ配列決定操作では、高い処理能力が必要とされているために、その電気泳動分析の分離性能を高めるために行うあらゆる手段は、好ましくは、その速度を著しく遅くせず、従って、その工程の処理能力を低下させないようにする。
【０００４】
従って、その分析速度を犠牲にすることなく、ピーク広幅化の根底にある機構およびＣＥ分離に対するこのような機構の影響を減少するための技術をさらに理解すれば、毛細管電気泳動および関連した用途の分野に対して、重要な寄与となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、毛細管電気泳動プロセスの初期電場傾斜段階中での電場強度および／または流体分離媒体の温度の上昇割合を制御することにより、該分離媒体で実行される毛細管電気泳動分離の分離性能を高めるのに有用な方法および装置の発見に関する。
１局面では、本発明は、毛細管電気泳動方法を包含し、ここで、作業電場は、規定傾斜速度に従った制御様式で、初期電場傾斜中に確立される。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、該作業電場は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で、確立される。本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、該作業電場は、少なくとも約１０秒間にわたって確立される。本発明のこの局面のさらに他の好ましい実施形態では、該作業電場は、該作業電場の該確立に付随したピーク広幅化の量を少なくとも約１０％だけ少なくする傾斜速度で、確立される。本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、該作業電場は、該作業電場が制御様式で確立されていないときに達成される読み長さよりも少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくする傾斜速度で、確立される。
【０００６】
他の局面では、本発明は、作業電場の確立中に起こるピーク広幅化の量の所望の低減を生じる方法を包含し、該方法は、複数の異なる傾斜速度の各々で、該作業電場を確立する工程であって、該傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である工程；各作業に対して観察されたピーク広幅化の程度を分析する工程；およびピーク広幅化の所望の低減が生じた傾斜速度以下の傾斜速度を選択する工程を包含する。
【０００７】
さらに他の局面では、本発明は、毛細管電気泳動方法を包含し、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する。好ましい１実施形態では、該毛細管を取り囲む該環境の該温度は、該初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度をこのような初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度の約０．４℃以内まで維持するのに十分な量だけ、下げられる。他の好ましい実施形態では、初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度は、該初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度をこのような初期電場傾斜中の該毛細管の入口末端で約６００μｍ未満の該流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な範囲まで該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、下げられる。さらに他の好ましい実施形態では、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度は、初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、下げられる。
【０００８】
本発明のこれらのおよび他の局面、実施形態および特徴は、以下の説明、図面および添付の請求の範囲を参照して、よく理解できる。
【０００９】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
【００１０】
（項目１） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場を確立したときに起こるピーク広幅化を少なくする改良点は、
約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００１１】
（項目２） 前記傾斜速度が、約０．０５Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約３．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１２】
（項目３） 前記傾斜速度が、約０．１Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約１．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１３】
（項目４） 前記流体分離媒体が、非架橋重合体を含有する緩衝液である、項目１に記載の方法。
【００１４】
（項目５） 前記流体分離媒体が、緩衝液である、項目１に記載の方法。
【００１５】
（項目６） 前記作業電場が、約５０Ｖ／ｃｍ〜約３０００Ｖ／ｃｍの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１６】
（項目７） 前記分析物種が、核酸である、項目１に記載の方法。
【００１７】
（項目８） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場を確立したときに起こるピーク広幅化を少なくする改良点は、
少なくとも約１０秒間にわたって、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００１８】
（項目９） 前記作業電場が、約２０秒間〜約４０００秒間の範囲の期間にわたって確立される、項目８に記載の方法。
【００１９】
（項目１０） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
該作業電場の該確立に付随したピーク広幅化の量を少なくとも約１０％だけ少なくする傾斜速度で、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００２０】
（項目１１） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、ピーク広幅化量の所望の低減を生じる改良点は、
複数の電気泳動作業の各々に対して、複数の異なる傾斜速度の各々で、該作業電場を確立する工程であって、該傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である工程；
各作業に対して観察されたピーク広幅化の程度を分析する工程；および
ピーク広幅化の所望の低減が生じた傾斜速度以下の傾斜速度を選択する工程を包含する、
方法。
【００２１】
（項目１２） 核酸種が、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離される型の毛細管電気泳動方法であって、改良点は、
該作業電場が制御様式で確立されていないときに達成される読み長さよりも少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な規定傾斜速度に従って、制御様式で、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００２２】
（項目１３） 毛細管電気泳動を実行する方法であって、該方法は、
管腔を有する毛細管電気泳動チャンネルを提供する工程；
該管腔に位置している流動性分離媒体を提供する工程；
該管腔に分析物種を導入する工程；
該管腔内で、該分析物種の電気泳動を起こすのに十分な作業電場を確立する工程を包含し、
ここで、該作業電場は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で確立される、
方法。
【００２３】
（項目１４） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度を、このような初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．４℃以内まで維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００２４】
（項目１５） 初期電場傾斜中の前記分離媒体の前記温度が、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．２℃以内まで維持される、項目１４に記載の方法。
【００２５】
（項目１６） 初期電場傾斜中の前記分離媒体の前記温度が、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．１℃以内まで維持される、項目１４に記載の方法。
【００２６】
（項目１７） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度を、このような初期電場傾斜中の該毛細管の入口末端で約６００μｍ未満の該流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００２７】
（項目１８） 前記初期電場傾斜中の前記流体分離媒体の前記位置ずれが、約２００μｍ未満である、項目１７に記載の方法。
【００２８】
（項目１９） 前記初期電場傾斜中の前記流体分離媒体の前記位置ずれが、約２０μｍ未満である、項目１７に記載の方法。
【００２９】
（項目２０） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、核酸種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を、少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００３０】
（項目２１） 前記初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を、少なくとも約５０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度が下げられる、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図２】図２は、種々の代替的で連続的な電場対時間プロフィールを含む代表的な初期電場傾斜のいくつかの概略図を示す。
【図３】図３は、初期電場傾斜を使用することなく、また、８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図４】図４は、初期電場傾斜を使用することなく、また、６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図５】図５は、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用し、また、８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図６】図６は、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用し、また、６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図７】図７は、１６０Ｖ／ｃｍの作業電場および８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、ＬＯＲに対する初期電場傾斜の種々の傾斜速度の効果を示す。
【図８】図８は、１２０Ｖ／ｃｍの電場および６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、分解能限界に対する初期電場傾斜の種々の傾斜速度の効果を示す。
【図９】図９は、８Ｍ尿素を含有する分離媒体での作業電場の関数としてのＬＯＲに対する０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を有する初期電場傾斜を使用することの効果を示す。
【図１０】図１０は、６Ｍ尿素を含有する分離媒体での作業電場の関数としてのＬＯＲに対する０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を有する初期電場傾斜を使用することの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
今ここで、本発明の好ましい実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の図面で図示されている。本発明は、好ましい実施形態に関連して記述されているものの、このような実施形態は、本発明をそれらの実施形態に限定するように解釈されないことが分かる。逆に、本発明は、代替物、改良物および等価物を含むように解釈され、これらは、添付の請求の範囲で描写されるように、本発明の範囲内であり得る。
【００３３】
本発明は、部分的には、作業電場がまず確立されたときに相当な量のピーク広幅化が起きること、およびこのようなピーク広幅化は、初期電場傾斜中において制御様式で作業電場を確立することにより、および／または作業電場の確立中において分離媒体の温度を一定値で維持することにより、大きく低減できるという発見に基づいている。
【００３４】
（Ｉ．定義）
他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、以下の意味を有するように解釈される：
「分離媒体」とは、そこを通って電気泳動分離を行う毛細管の管腔内に典型的に位置している媒体を意味する。代表的な分離媒体には、架橋ゲル、未架橋重合体溶液、または重合体を含まない溶媒（例えば、緩衝水）が挙げられる。必要に応じて、分離媒体は、変性剤、例えば、分散剤（例えば、ＳＤＳ）または有機物（例えば、尿素またはホルムアミド）を含有し得る。
【００３５】
「流体分離媒体」とは、運動がないと剪断応力を保持できない電気泳動分離媒体、すなわち、剪断応力に応答して流動する媒体を意味する。流体分離媒体の例には、液体および溶液（例えば、緩衝化した重合体水溶液）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「作業電場」とは、電気泳動分離を行うのに使用する電場を意味する。毛細管電気泳動で使用する典型的な作業電場は、約５０Ｖ／ｃｍ〜約３０００Ｖ／ｃｍまたはそれ以上の範囲である。
【００３７】
「初期電場傾斜」とは、作業電場が最初に確立される期間における電場対時間のプロフィールを意味する。
【００３８】
「傾斜速度」とは、初期電場傾斜の全経過時間Ｔで割った作業電場Ｅを意味する。例えば、もし、作業電場が１００Ｖ／ｃｍであり、この作業電場に達するための初期電場傾斜が１０秒かかるなら、傾斜速度は、１０Ｖ／ｃｍ−ｓである。
【００３９】
「毛細管」または「毛細管チューブ」とは、一定容量の分離媒体を支持できるチューブまたはチャンネルまたは他の構造体を意味する。毛細管の形状は、大きく変わり得、円形、長方形または正方形の断面を備えたチューブ、チャンネル、グローブド（ｇｒｏｖｅｄ）プレートなどが挙げられる。毛細管は、広範囲の周知技術（例えば、引張り、エッチング、光食刻法など）により作製され得る。本発明と共に使用する毛細管の重要な特徴には、その毛細管管腔の表面積：容量比がある。この比が高いと、電気泳動中に生じるジュール熱の効率的な消散が可能となる。好ましくは、約０．４〜０．０４μｍ-1の範囲の比が使用される。これらの比は、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の内径を有する円形断面を備えた管状毛細管の表面積：容量比に相当している。毛細管は、個々の要素として、またはモノリシック基板で形成されるチャンネルとして、形成され得る（例えば、Ｐａｃｅ，米国特許第４，９０８，１１２号；Ｓｏａｎｅ ａｎｄ Ｓｏａｎｅ，米国特許第５，１２６，０２２号）。毛細管は、そこを通って試料分析物が毛細管の管腔へと導入される「入口末端」を含む。
【００４０】
（ＩＩ．好ましい実施形態の説明）
ＣＥ毛細管で作業電場が確立されたとき、この毛細管の管腔に位置している分離媒体の温度は、一般に、ジュール加熱のために高くなる（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｐ．１，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９２））。ジュール加熱の結果、分離媒体の平均温度の上昇ΔＴだけでなく、分離媒体の温度が管腔の中心線で高くなり周辺で低くなるように、分離媒体内で放物線状の放射温度プロフィールが形成される。
【００４１】
温度上昇ΔＴの規模は、多数のパラメータの関数であり、これらのパラメータには、この毛細管の形状、材料および寸法、この分離媒体および毛細管の材料の熱伝導性、毛細管と周囲の環境との間の熱移動効率、分離媒体の導電率、および分離媒体の導電率の温度依存性の規模が挙げられるが、これらに限定されない。ΔＴの規模は、一般に、これらのパラメータの非線形関数である。
【００４２】
一般に、物質が加熱されるとき、その構成原子のさらに激しい熱振動があるために、その物質は膨張する。温度上昇に応答して物質が膨張する程度は、その熱膨張率によって特徴付けられ、この場合、本明細書中で使用する「熱膨張率」との用語は、物質の温度上昇の結果として、その物質の初期寸法（例えば、長さ、面積または容量）に対する物質の寸法の増大に関連した比例定数を意味する。例えば、最初の近似値に対して、熱膨張による物質の長さの増大は、ΔＬ／Ｌは、以下の関係に従って、温度変化ΔＴと比例している：ΔＬ／Ｌ＝αLΔＴ
ここで、αLは、その物質の線膨張率である。しかしながら、綿密に検査すると、αLは、一般に、絶対的に一定ではなく、むしろ、温度と共に僅かに上昇することが分かる。数種の選択した物質の線膨張率の代表的な値は、以下の表１で示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
流体物質が、堅い壁および少なくとも１個の開放末端を有するチャンネルで、熱膨張を受けるとき、流れが誘発されて、この流体物質の有限な位置ずれが起こる。本発明者は、このような膨張で駆動された流れが、一定操作条件下にて、毛細管電気泳動過程の初期電場傾斜部分の間で現れること、およびこのような流れにより引き起こされる分離媒体の位置ずれが、分離性能に好ましくない影響を与え得ることを発見した。さらに、本発明者は、この効果が、ＣＥ技術分野で頻繁に見られるものと類似のシステム、すなわち、流体分離媒体、高い電場、および剛性材料から形成された長く狭いチャンネル（例えば、５０μｍの内径および５０ｃｍの長さを有する溶融シリカ毛細管チューブ）を使用するシステムにおいて、特に顕著に見られると決定した。特に、最初の近似値に対して、初期電場傾斜中における流体分離媒体の位置ずれの広がりによって、本発明者は、この位置ずれが、（１）毛細管の長さの増大と共に大きくなり、（２）流体分離媒体の熱膨張率の上昇と共に大きくなり、（３）流体分離媒体の導電性が高くなるにつれて大きくなり、（４）毛細管の外面とその周囲との間の熱移動率が低くなるにつれて大きくなり、（５）作業電場が高くなるにつれて大きくなり、そして（６）毛細管の内径が増大するにつれて大きくなることを発見した。
【００４５】
前述の理論的な考察は、本発明を理解し説明するのを助けるために提供されているものの、この考察は、決して、本発明の範囲をこのまたは他の任意の特定の理論的な形態に限定するものと見なすべきではない。
【００４６】
第一局面では、本発明は、流体分離媒体を使用するＣＥ分離で作業電場を制御せずに確立することにより引き起こされるピーク広幅化の量を少なくする方法および装置を包含する。さらに具体的には、本発明のこの局面は、分析物種（例えば、核酸）が作業電場Ｅの影響下にて流体分離媒体を介して差動電気泳動移動により分離される毛細管電気泳動システムを包含し、ここで、この作業電場は、特徴的な傾斜速度を有する規定電場対時間プロフィールに従って、制御様式で、初期電場傾斜中にて、確立される。
【００４７】
本発明に従った代表的な好ましい電場対時間プロフィールには、不連続な多段階プルフィール、連続線形プロフィール、連続非線形プロフィール、またはこのような非連続プロフィールおよび連続プロフィールの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。それに加えて、この初期電場傾斜の経過時間Ｔおよび作業電場Ｅの値は、要求に応じて、特定の用途により変えられ得る。好ましくは、この初期電場傾斜は、電場対時間プロフィールを含み、これは、ピーク広幅化を少なくするだけでなく、ピーク広幅化の所望の低減に一致したできるだけ短い経過時間Ｔで作業電場Ｅを達成するのに役立つ。
【００４８】
好ましい１実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、この場合、各段階は、電場および時間の特定の変化ΔＥおよびΔｔにより特徴付けられる。図１Ａは、このような不連続な多段階の電場対時間プロフィールの概略図である。一般に、ΔＥが小さくなるかおよび／またはΔｔが大きくなるにつれて、この初期電場傾斜のピーク広幅化に対する影響は、少なくなる。
【００４９】
特に好ましい１実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、ここで、各段階に対するΔＥおよびΔｔの値は、例えば、図１Ａで概略的に描写するように、等しい。それゆえ、このような電場対時間プロフィールを特徴付けるためには、作業電場Ｅに対する値、各段階での電場の変化ΔＥ、および各段階に対する時間Δｔを特定する必要があるにすぎない。
【００５０】
他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、ここで、各段階に対するΔＥおよびΔｔの値は、例えば、図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄで概略的に描写するように、等しくない。図１Ｂは、不連続な多段階の電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥおよびΔｔの両方の値は、各段階で大きくなっている。あるいは、図１Ｃは、電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥの値は、各段階で小さくなっており、そしてΔＴの値は、各段階に対して同じである。最後に、図１Ｄは、電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥおよびΔｔの両方の値は、各段階で無秩序に変わっている。ジュール加熱により起こる毛細管管腔の内側での温度上昇は、典型的には、電場強度の増大する非線形関数であるので、図１Ｃで概略的に描写している電場対時間プロフィール（ここで、ΔＥの値は、各段階で小さくなっている）は、それが、この初期電場傾斜の経過時間Ｔが短くなると同時に、ピーク広幅化に対する初期電場傾斜の影響を少なくするのに役立つために、特に好ましい。
【００５１】
Ｅ、ΔＥおよびΔｔの値は、好ましくは、不連続な多段階の電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜を使用している間、特定用途の要件に依存して変わるものの、作業電場値Ｅの値は、約５０Ｖ／ｃｍと３０００Ｖ／ｃｍの間であり、１段階あたりの時間Δｔは、約５秒と２００秒の間であり、そして１段階あたりの電場の変化ΔＥは、約１Ｖ／ｃｍと２００Ｖ／ｃｍの間である。さらに好ましくは、Ｅは、約８０Ｖ／ｃｍと３２０Ｖ／ｃｍの間であり、Δｔは、約１０秒と１００秒の間であり、そしてΔＥは、約２Ｖ／ｃｍと６０Ｖ／ｃｍの間である。
【００５２】
他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、連続的な電場対時間プロフィールにより特徴付けられる。図２で示すように、この連続的な電場対時間プロフィールは、線形（例えば、図２の直線１）、凹状（例えば、図２の曲線２）、凸状（例えば、図２の曲線３）、または線形、凹状および／または凸状の種々の組合せ（例えば、図２の曲線４）であり得る。図１Ｃに関連して述べると、好ましくは、その連続的な電場対時間プロフィールは、ジュール加熱により起こる温度上昇の通常の非線形性のために、線形または凸状である。
【００５３】
本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、階段状プロフィールおよび連続プロフィールの組合せを含む電場対時間プロフィールにより、特徴付けられる。
【００５４】
ピーク広幅化を少なくする（従って、分離性能を改良する）特定範囲の初期電場傾斜の傾斜速度値は、多数の実験パラメータに依存しており、これには、毛細管の形状、材料および寸法（特に、毛細管の長さ）、分離媒体および毛細管の熱伝導率、分離媒体の熱膨張率と毛細管の熱膨張率との差、毛細管と周囲の環境との間の熱移動の効率、分離媒体の導電率、および分離媒体の導電率の温度依存性が挙げられる。特に、最初の近似値に対して、（１）毛細管の長さの増大と共に、（２）流体分離媒体の熱膨張率の上昇と共に、（３）流体分離媒体の導電性が高くなるにつれて、（４）毛細管の外面とその周囲との間の熱移動率が低くなるにつれて、（５）作業電場が高くなるにつれて、そして（６）毛細管の内径が増大するにつれて、より低い傾斜速度が必要となる。
【００５５】
従って、一定セットの操作条件下にて、ピーク広幅化を少なくする初期電場傾斜の傾斜速度を決定するためには、以下の手順が使用され得る。まず、複数の電気泳動作業の各々に対して、初期電場傾斜を使用して、作業電場を確立し、この場合、各作業は、異なる傾斜速度を使用し、また、この傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である。次に、例えば、各作業において、選択したピークの半分の高さでのピーク幅を測定することにより、各作業に対して観察されるピーク広幅化の程度を分析する。最後に、好ましい傾斜速度として、ピーク広幅化を所望程度で少なくするものを選択する。
【００５６】
使用する特定の傾斜プロフィール（例えば、段差、連続、または段差と連続の組合せ）とは関係なく、好ましくは、この初期電場傾斜の傾斜速度は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ未満である。さらに好ましくは、この初期電場傾斜の傾斜速度は、約０．０５Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約３．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である。特に好ましい実施形態では、この傾斜速度は、約０．１Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約１．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である。
【００５７】
あるいは、この作業電場は、少なくとも約１０秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。さらに好ましくは、この作業電場は、約２０秒〜約５００秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。さらに好ましくは、この作業電場は、約５００秒〜約４０００秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。
【００５８】
好ましくは、作業電場Ｅは、約５０Ｖ／ｃｍと３０００Ｖ／ｃｍの間の範囲、さらに好ましくは、約８０Ｖ／ｃｍと５００Ｖ／ｃｍの間の範囲である。
【００５９】
本発明のこの第一局面のさらに他の好ましい実施形態では、この作業電場は、初期電場傾斜を使用しないときに見られるものと比較して、この作業電場の確立に付随したピーク広幅化の低減が少なくとも約１０％の量となる傾斜速度、さらに好ましくは、ピーク広幅化の低減が少なくとも約２５％の量となる傾斜速度、ピーク広幅化の低減が少なくとも約４０％の量となる傾斜速度を有する初期電場プロフィールを使用して、確立される。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施形態では、その分析物種は、核酸であり、その作業電場は、初期電場傾斜を使用しないときに見られるものと比較して、少なくとも約２０個のヌクレオチド、好ましくは、約４０個のヌクレオチド、さらに好ましくは、約８０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくする傾斜速度を有する初期電場プロフィールを使用して、確立される。
【００６１】
他の局面では、本発明は、初期電場傾斜中において、この分離媒体の平均温度を実質的に一定の値で維持するのに十分な量だけ、初期電場傾斜中における毛細管を取り囲む環境の温度を下げることにより、ＣＥ分離で作業電場を適用することにより起こるピーク広幅化の量を少なくする方法および装置を包含する。本明細書中で使用する「平均温度」との用語は、空間的な平均温度を意味し、この場合、この温度は、電気泳動移動方向に垂直な寸法（例えば、円筒形毛細管の場合、この寸法は、その半径である）を横切って、平均化される。
【００６２】
特に、本発明のこの局面の方法によれば、この初期電場傾斜中において、この毛細管を横切る電場が大きくなるにつれて、この毛細管を取り囲む環境の温度は、毛細管の管腔内に位置している分離媒体の平均温度を初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．４℃以内（さらに好ましくは、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．２℃以内、さらにより好ましくは、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．１℃以内）で維持するのに十分な量だけ、下げられる。
【００６３】
本発明のこの第二局面の他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜中において、この毛細管の管腔内に位置している流体分離媒体の温度は、このような初期電場傾斜中の毛細管の入口末端で約６００μｍ未満（好ましくは、約２００μｍ未満、さらに好ましくは、約２０μｍ未満）の流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な量だけ、この毛細管を取り囲む環境の温度を下げることにより、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持される。
【００６４】
本発明のこの局面の好ましい１実施形態では、この毛細管の管腔内に位置している分離媒体の温度は、毛細管を横切って加えられる電場と毛細管を通って測定した電流との間の関係を測定することにより、モニターされる。いかにして、特定の分離媒体の伝導率が温度の関数として変わるかを知ることにより、この電場が大きくなるにつれて、分離媒体の温度の正確な測定値を得ることが可能となる。それゆえ、この分離媒体の温度が上昇し始めるにつれて、その周囲の温度は、アクティブフィードバック制御を使用して低くされる。あるいは、この毛細管の管腔内に位置している分離媒体の温度は、この媒体の温度対電場の特性の事前の治験に基づいた事前にプログラムされた温度傾斜を用いて、実質的に一定で維持される。
【００６５】
大ていは、本発明で具体化した改良を除いて、本発明に従ってＣＥ分離を行うのに使用される方法および装置は、他の文献（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））で一般的に記述されているように、従来のＣＥ方法および装置を使用して実行され得る。例えば、本発明の方法を実施するには、標準的な毛細管チューブ（例えば、ポリイミド被覆した溶融シリカ毛細管チューブ）、流体分離媒体（例えば、緩衝化した重合体溶液または重合体を含まない緩衝液）、試料注入技術（例えば、動電学的な注入または水力学的な注入）、自動化したシステム制御装置（例えば、デジタルコンピュータ）、および検出技術（例えば、蛍光または吸光度）が利用され得る。
【００６６】
しかしながら、本発明の方法を行うのに使用するＣＥシステムは、ある種の非標準的な機能および性能を含む。本発明で使用するＣＥシステムの電源部分は、初期電場傾斜の電場対時間プロフィールを制御できるように、プログラム化可能な電子制御装置（例えば、パーソナルコンピュータ）により制御可能であるべきである。それに加えて、この初期電場傾斜のアクティブフィードバック制御を使用する場合、この電子制御装置は、この電気泳動毛細管を通る電流をモニターする電流モニターに接続するべきであり、また、その電流測定に応答して毛細管を横切る電場を自動的に調節可能であるべきである。また、本発明と併用するＣＥシステムは、その毛細管チャンネルを取り囲む環境の温度を制御する温度制御システムを使用するべきである。この温度制御システムは、この周囲環境の温度を、この毛細管の実質的に全長に沿って、約０．１℃以内まで制御できるべきであり、この周囲環境の温度を０．１℃ずつ変えるべきであり、そして初期電場傾斜中において周囲環境の温度を調節できるべきであり、この場合、必要に応じて、このような変化は、この毛細管管腔で位置している分離媒体の温度変化に応答性である。
【００６７】
（ＩＩＩ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの実施例は、純粋に、本発明を代表するものと解釈され、いずれの様式でも、その範囲を限定するものとは解釈されない。
【００６８】
（材料および方法）
全ての電気泳動分離は、５０ｃｍの毛細管アレイ（ｐ／ｎ ４３０５７８７）を備えたＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐ/ｎ ４３０８０５８）を使用して、実行した。この３７００システムは、約９６本の別個の溶融シリカ分離毛細管を含み、各毛細管は、被覆していない内面、５０ｃｍの全長、５０ｃｍの有効分離長、および５０μｍの内径を有する。この３７００システムでの試料分析物の蛍光検出は、鞘流れ検出システムを使用して、達成される（例えば、Ｋａｍｂａｒａら、米国特許第５，５２９，６７９号；Ｄｏｖｉｃｈｉら、米国特許第５，４３９，５７８号）。
【００６９】
種々の操作条件下にて分離性能を特徴付けるために、サイズが３５個、５０個、７５個、１００個、１３９個、１５０個、１６０個、２００個、２５０個、３００個、３４０個、３５０個、４００個、４５０個、４９０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個および７００個のヌクレオチドの２０個の標準ＤＮＡ断片を含む標準試料混合物を使用した。この混合物の各断片を、ＴＥＴ染料で標識した。この試料混合物を、約０．０３ｎＭの最終濃度まで、脱イオンホルムアミドおよび０．３ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムに溶解した。
【００７０】
この毛細管アレイの温度を、５０℃±０．１℃で維持した。それらの毛細管の入口末端を試料混合物に浸漬しつつ、３０秒間にわたって、５０Ｖ／ｃｍの電場を加えることにより、これらの毛細管に試料を注入した。
【００７１】
使用した分離媒体は、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＰＯＰ６重合体（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐ/ｎ ４３０６７３３）の改良型であり、ここで、その変性剤は、６Ｍまたは８Ｍのいずれかの濃度で尿素を含有する代替変性剤で置き換えた。このＰＯＰ６重合体は、直鎖状置換ポリアシルアミドの溶液である。
【００７２】
各電気泳動図は、「分解能限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、すなわち、「ＬＯＲ」と呼ばれるパラメータを使用して、特徴付けた。ＬＯＲは、電気泳動図中の１地点として規定され、これは、電気泳動図のその位置に位置しているポリヌクレオチド断片のサイズによって表され、その位置では、以下の関係が満たされる：
【００７３】
【化１】
【００７４】
ここで、Ｘ2は、ピーク２の中心位置であり、Ｘ1は、ピーク１の中心位置であり、Ｗ1は、ピーク１の半分の高さでのピーク幅であり、そしてＷ2は、ピーク２の半分の高さでのピーク幅であり、ここで、ピーク１および２は、単一のヌクレオチドだけサイズが異なるＤＮＡ断片である。この標準混合物中の実質断片は１個より多いヌクレオチドだけサイズが異なるので、その単一ヌクレオチド間隔（Ｘ2−Ｘ1）は、この試料混合物中の２０個の断片の各々の位置Ｘをプロットすることにより、これらのデータ点を三次多項式に当てはめることにより、そして得られた適合曲線の内挿に基づいて、単一ヌクレオチド計算間隔（Ｘ2−Ｘ1）を決定することにより、サイズの関数として、概算した。半分の高さでのピーク幅Ｗ1およびＷ2は、単一のヌクレオチドだけサイズが異なる断片のピーク幅が２０個の実際のピーク幅のうちの最も近いピークの幅と同じであると仮定して、概算した。実際には、実質自動化塩基呼び出しアルゴリズム（ａｃｔｕａｌ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）は、典型的には、そのＬＯＲを超える１００個〜２００個のヌクレオチドを塩基呼び出しすることができ、それゆえ、もし、一定の分離に対して、そのＬＯＲが５００であるなら、約７００個のヌクレオチドまで、正確な（すなわち、約９８％より高い精度）塩基呼び出しを予想できる。
【００７５】
（実施例１）
（２種の異なる分離媒体でのＬＯＲに対する作業電圧の効果）
図３および４は、多数の異なる作業電場の各々において、約９６枚の異なる電気泳動図に対するＬＯＲ値を示す。図３では、その分離媒体は、８Ｍの尿素変性剤を含有していたのに対して、図４では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。各プロットのｙ軸は、そのＬＯＲ値を示すのに対して、各プロットのｘ軸は、７００個のヌクレオチド断片が検出器に到達するのに必要な時間Ｔ700を示す。このデータから明らかに分かるように、両方の分離媒体に対して、その電場が大きくなるにつれて、それゆえ、Ｔ700が短くなるにつれて、そのＬＯＲの平均値ＬＯＲavgは、小さくなり、そしてＬＯＲの標準偏差ＳＤLORは、大きくなった。それに加えて、ＳＤLORの規模は、ＬＯＲavgと比較して、大きかった。図３および４のデータに対するＬＯＲavgおよびＳＤLORの値は、以下の表２および３で提示する。それゆえ、これらのデータは、この作業電場を高くすることによりその分析速度を上げるとき、ＬＯＲの低下およびＳＤLORの上昇という相当なペナルティを払わされることを示す。例えば、以下の表２で提示したデータによれば、この作業電場を９０Ｖ／ｃｍから１３０Ｖ／ｃｍへと高めることにより、１６５個のヌクレオチドのＬＯＲ低下が観察された。
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
【００７８】
（実施例２）
（作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜の効果）
図５および６は、図３および４と比較するとき、２種の異なる分離媒体における作業電場の関数としてのＬＯＲに対する制御した初期電場傾斜の効果を示す。図５では、その分離媒体は、８Ｍの尿素変性剤を含有していたのに対して、図６では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。図５および６の両方の実験では、その初期電場傾斜は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを使用して、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓであり、ここで、ΔＥは、１０Ｖ／ｃｍであり、そしてΔｔは、各段階において、４０秒であった。これらのデータから明らかに分かるように、この初期電場傾斜を導入すると、研究した作業電場の各々において、ＬＯＲavgの実質的な上昇およびＳＤLORの低下が生じた。しかしながら、この効果は、さらに高い電場では、非常に顕著であった。それゆえ、これらのデータは、本発明による制御した初期電場傾斜を使用することにより、分離性能を犠牲にすることなく、さらに高い作業電場が使用でき、結果的に、相当に短い分析時間が達成され得、著しく高い全処理能力につながる。図５および６のデータに対するＬＯＲavgおよびＳＤLORに対する値は、以下の表４および５で提示する。
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
（実施例３）
（ＬＯＲに対する傾斜速度の効果）
図７および８は、２種の異なる分離媒体における２種の異なる作業電場でのＬＯＲに対する初期電場傾斜の傾斜速度の効果を示す。これらの初期電場傾斜の各々は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを含んでおり、ここで、各傾斜速度に対して、ΔＥおよびΔｔの値は、等しかった。
【００８２】
図７では、その作業電場は、１６０Ｖ／ｃｍであり、その分離媒体は、８Ｍの尿素を含有していた。図７で示した異なる傾斜速度は、ΔＥを５００Ｖで保持してΔｔを１０秒と８０秒の間で変えることにより、達成された。図７のデータで明らかに分かるように、約０．１２Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を使用すると、殆ど８０個のヌクレオチドのＬＯＲの上昇が得られた。
【００８３】
図８では、その作業電場は、１２０Ｖ／ｃｍであり、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。これらの異なる傾斜速度は、ΔＥを５００Ｖで保持してΔｔを５秒と４０秒の間で変えることにより、達成された。図８のデータで明らかに分かるように、約０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を使用すると、殆ど１００個のヌクレオチドのＬＯＲの上昇が得られた。
【００８４】
（実施例４）
（作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜を使用することの効果）
図９および１０は、作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜を使用することの効果を示している。この初期電場傾斜の傾斜速度は、両方の場合において、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓであり、この場合、これらの初期電場傾斜は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを使用して達成され、ここで、ΔＥの値は、１０Ｖ／ｃｍであり、そしてΔｔの値は、４０秒であった。図９では、その分離媒体は、８Ｍの尿素を含有していたのに対して、図１０では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。図９および１０の両方で示したプロットは、明らかに、初期電場傾斜が分離性能に対して有し得る劇的な効果を説明し、また、この効果がさらに高い作業電場ではより顕著になることを示している。分離速度に対する初期電場傾斜を使用することの劇的な効果もまた、図９および１０のデータで、明らかに分かる。例えば、図１０を参照すると、初期電場傾斜を使用することなく６００のＬＯＲを達成するためには、その作業電場は、１００Ｖ／ｃｍを超えることができないのに対して、もし、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用するなら、１５０Ｖ／ｃｍの作業電場が使用され得、その結果、分析時間が約５０％短くなる（この初期電場傾斜を起こすのに必要な１０分間は含めない）。
【００８５】
全ての文献および特許出願の内容は、各個々の文献または特許出願の内容が具体的かつ個別的に本明細書中で参考として援用されているように、同じ程度まで、本明細書中で参考として援用されている。
【００８６】
少数の実施形態だけを詳細に上で記述したものの、電気泳動分野の当業者は、その教示から逸脱することなく、その好ましい実施形態において、改良が可能であることを明らかに理解している。例えば、制御した初期電場傾斜および温度傾斜プロトコルの両方を組み合わせて使用して、本発明を実施し得る。このような改良の全ては、上記請求の範囲の範囲内に含まれると解釈される。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、毛細管電気泳動を実行する方法および装置に関する。さらに具体的には、本発明は、この毛細管電気泳動方法を行うのに使用される作業の確立中に起こるピーク広幅化を少なくする方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
生体高分子および小分子の電気泳動分離は、現代の生物学および生物工学で極めて重要であり、ＤＮＡ配列決定、タンパク質の分子量決定、遺伝子地図作製などのような技術において、中心的な役割を果たす。特に好ましい電気泳動フォーマットは、毛細管電気泳動（ＣＥ）であり、その電気泳動は、内径が小さい（例えば、５μｍと１００μｍの間）毛細管チャンネルで実行される。多くの用途では、毛細管電気泳動は、狭いボアの毛細管がジュール熱を消散する性能によって、高い電場を使用することが可能となり、それにより、分離が速くなって、分析物の拡散効果が少なくなるので、伝統的なスラブベースのフォーマットよりも高い分離性能が得られる。それに加えて、毛細管電気泳動は、試料装填工程、分析物検出工程および分離媒体補充工程を自動化する性能があるために、自動化に適している。
【０００３】
毛細管電気泳動の商業的に重要な特定の用途には、極めて高い分離効率が必要である。例えば、ＤＮＡ配列決定分離では、１メートルあたり二千万枚のプレート数が必要であり得る。この種の性能を達成するために、ピーク広幅化（従って、低い分離効率）、例えば、この毛細管の管腔内での放射状温度プロフィール、その試料注入容量、溶質−壁相互作用、サイホン作用、有限検出容量などにより生じるピーク広幅化を引き起こし得る機器の影響を少なくするように、可能な限り、あらゆることを行わなければならない（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｐ．１，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。それに加えて、大規模なＤＮＡ配列決定操作では、高い処理能力が必要とされているために、その電気泳動分析の分離性能を高めるために行うあらゆる手段は、好ましくは、その速度を著しく遅くせず、従って、その工程の処理能力を低下させないようにする。
【０００４】
従って、その分析速度を犠牲にすることなく、ピーク広幅化の根底にある機構およびＣＥ分離に対するこのような機構の影響を減少するための技術をさらに理解すれば、毛細管電気泳動および関連した用途の分野に対して、重要な寄与となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、毛細管電気泳動プロセスの初期電場傾斜段階中での電場強度および／または流体分離媒体の温度の上昇割合を制御することにより、該分離媒体で実行される毛細管電気泳動分離の分離性能を高めるのに有用な方法および装置の発見に関する。
１局面では、本発明は、毛細管電気泳動方法を包含し、ここで、作業電場は、規定傾斜速度に従った制御様式で、初期電場傾斜中に確立される。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、該作業電場は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で、確立される。本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、該作業電場は、少なくとも約１０秒間にわたって確立される。本発明のこの局面のさらに他の好ましい実施形態では、該作業電場は、該作業電場の該確立に付随したピーク広幅化の量を少なくとも約１０％だけ少なくする傾斜速度で、確立される。本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、該作業電場は、該作業電場が制御様式で確立されていないときに達成される読み長さよりも少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくする傾斜速度で、確立される。
【０００６】
他の局面では、本発明は、作業電場の確立中に起こるピーク広幅化の量の所望の低減を生じる方法を包含し、該方法は、複数の異なる傾斜速度の各々で、該作業電場を確立する工程であって、該傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である工程；各作業に対して観察されたピーク広幅化の程度を分析する工程；およびピーク広幅化の所望の低減が生じた傾斜速度以下の傾斜速度を選択する工程を包含する。
【０００７】
さらに他の局面では、本発明は、毛細管電気泳動方法を包含し、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する。好ましい１実施形態では、該毛細管を取り囲む該環境の該温度は、該初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度をこのような初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度の約０．４℃以内まで維持するのに十分な量だけ、下げられる。他の好ましい実施形態では、初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度は、該初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度をこのような初期電場傾斜中の該毛細管の入口末端で約６００μｍ未満の該流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な範囲まで該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、下げられる。さらに他の好ましい実施形態では、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度は、初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、下げられる。
【０００８】
本発明のこれらのおよび他の局面、実施形態および特徴は、以下の説明、図面および添付の請求の範囲を参照して、よく理解できる。
【０００９】
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
【００１０】
（項目１） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場を確立したときに起こるピーク広幅化を少なくする改良点は、
約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００１１】
（項目２） 前記傾斜速度が、約０．０５Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約３．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１２】
（項目３） 前記傾斜速度が、約０．１Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約１．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１３】
（項目４） 前記流体分離媒体が、非架橋重合体を含有する緩衝液である、項目１に記載の方法。
【００１４】
（項目５） 前記流体分離媒体が、緩衝液である、項目１に記載の方法。
【００１５】
（項目６） 前記作業電場が、約５０Ｖ／ｃｍ〜約３０００Ｖ／ｃｍの範囲である、項目１に記載の方法。
【００１６】
（項目７） 前記分析物種が、核酸である、項目１に記載の方法。
【００１７】
（項目８） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場を確立したときに起こるピーク広幅化を少なくする改良点は、
少なくとも約１０秒間にわたって、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００１８】
（項目９） 前記作業電場が、約２０秒間〜約４０００秒間の範囲の期間にわたって確立される、項目８に記載の方法。
【００１９】
（項目１０） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
該作業電場の該確立に付随したピーク広幅化の量を少なくとも約１０％だけ少なくする傾斜速度で、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００２０】
（項目１１） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、ピーク広幅化量の所望の低減を生じる改良点は、
複数の電気泳動作業の各々に対して、複数の異なる傾斜速度の各々で、該作業電場を確立する工程であって、該傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である工程；
各作業に対して観察されたピーク広幅化の程度を分析する工程；および
ピーク広幅化の所望の低減が生じた傾斜速度以下の傾斜速度を選択する工程を包含する、
方法。
【００２１】
（項目１２） 核酸種が、作業電場の影響下にて、流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離される型の毛細管電気泳動方法であって、改良点は、
該作業電場が制御様式で確立されていないときに達成される読み長さよりも少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な規定傾斜速度に従って、制御様式で、該作業電場を確立する工程を包含する、
方法。
【００２２】
（項目１３） 毛細管電気泳動を実行する方法であって、該方法は、
管腔を有する毛細管電気泳動チャンネルを提供する工程；
該管腔に位置している流動性分離媒体を提供する工程；
該管腔に分析物種を導入する工程；
該管腔内で、該分析物種の電気泳動を起こすのに十分な作業電場を確立する工程を包含し、
ここで、該作業電場は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下の傾斜速度で確立される、
方法。
【００２３】
（項目１４） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度を、このような初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．４℃以内まで維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００２４】
（項目１５） 初期電場傾斜中の前記分離媒体の前記温度が、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．２℃以内まで維持される、項目１４に記載の方法。
【００２５】
（項目１６） 初期電場傾斜中の前記分離媒体の前記温度が、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の温度の約０．１℃以内まで維持される、項目１４に記載の方法。
【００２６】
（項目１７） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、分析物種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の該分離媒体の平均温度を、このような初期電場傾斜中の該毛細管の入口末端で約６００μｍ未満の該流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００２７】
（項目１８） 前記初期電場傾斜中の前記流体分離媒体の前記位置ずれが、約２００μｍ未満である、項目１７に記載の方法。
【００２８】
（項目１９） 前記初期電場傾斜中の前記流体分離媒体の前記位置ずれが、約２０μｍ未満である、項目１７に記載の方法。
【００２９】
（項目２０） 毛細管電気泳動方法であって、ここで、核酸種は、作業電場の影響下にて、毛細管内に位置している流体分離媒体を介して、差動電気泳動移動により分離され、該作業電場の確立に付随したピーク広幅化を少なくする改良点は、
初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を、少なくとも約２０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度を下げる工程を包含する、
方法。
【００３０】
（項目２１） 前記初期電場傾斜中の分離媒体の平均温度を、少なくとも約５０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくするのに十分な範囲まで、該初期電場傾斜を開始する前の該分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持するのに十分な量だけ、該初期電場傾斜中における該毛細管を取り囲む環境の温度が下げられる、項目２０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、種々の代替的で不連続な多段階電場対時間プロフィールを含む数個の代表的な初期電場傾斜の概略図を示す。
【図２】図２は、種々の代替的で連続的な電場対時間プロフィールを含む代表的な初期電場傾斜のいくつかの概略図を示す。
【図３】図３は、初期電場傾斜を使用することなく、また、８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図４】図４は、初期電場傾斜を使用することなく、また、６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図５】図５は、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用し、また、８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図６】図６は、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用し、また、６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、多数の作業電場の各々における約９６本の異なる毛細管での７００個のヌクレオチドＤＮＡ断片のＬＯＲ対移動時間のプロットを示す。
【図７】図７は、１６０Ｖ／ｃｍの作業電場および８Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、ＬＯＲに対する初期電場傾斜の種々の傾斜速度の効果を示す。
【図８】図８は、１２０Ｖ／ｃｍの電場および６Ｍ尿素を含有する分離媒体を使用して、分解能限界に対する初期電場傾斜の種々の傾斜速度の効果を示す。
【図９】図９は、８Ｍ尿素を含有する分離媒体での作業電場の関数としてのＬＯＲに対する０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を有する初期電場傾斜を使用することの効果を示す。
【図１０】図１０は、６Ｍ尿素を含有する分離媒体での作業電場の関数としてのＬＯＲに対する０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を有する初期電場傾斜を使用することの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
今ここで、本発明の好ましい実施形態を詳細に参照するが、それらの例は、添付の図面で図示されている。本発明は、好ましい実施形態に関連して記述されているものの、このような実施形態は、本発明をそれらの実施形態に限定するように解釈されないことが分かる。逆に、本発明は、代替物、改良物および等価物を含むように解釈され、これらは、添付の請求の範囲で描写されるように、本発明の範囲内であり得る。
【００３３】
本発明は、部分的には、作業電場がまず確立されたときに相当な量のピーク広幅化が起きること、およびこのようなピーク広幅化は、初期電場傾斜中において制御様式で作業電場を確立することにより、および／または作業電場の確立中において分離媒体の温度を一定値で維持することにより、大きく低減できるという発見に基づいている。
【００３４】
（Ｉ．定義）
他に述べられていなければ、本明細書中で使用する以下の用語および語句は、以下の意味を有するように解釈される：
「分離媒体」とは、そこを通って電気泳動分離を行う毛細管の管腔内に典型的に位置している媒体を意味する。代表的な分離媒体には、架橋ゲル、未架橋重合体溶液、または重合体を含まない溶媒（例えば、緩衝水）が挙げられる。必要に応じて、分離媒体は、変性剤、例えば、分散剤（例えば、ＳＤＳ）または有機物（例えば、尿素またはホルムアミド）を含有し得る。
【００３５】
「流体分離媒体」とは、運動がないと剪断応力を保持できない電気泳動分離媒体、すなわち、剪断応力に応答して流動する媒体を意味する。流体分離媒体の例には、液体および溶液（例えば、緩衝化した重合体水溶液）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「作業電場」とは、電気泳動分離を行うのに使用する電場を意味する。毛細管電気泳動で使用する典型的な作業電場は、約５０Ｖ／ｃｍ〜約３０００Ｖ／ｃｍまたはそれ以上の範囲である。
【００３７】
「初期電場傾斜」とは、作業電場が最初に確立される期間における電場対時間のプロフィールを意味する。
【００３８】
「傾斜速度」とは、初期電場傾斜の全経過時間Ｔで割った作業電場Ｅを意味する。例えば、もし、作業電場が１００Ｖ／ｃｍであり、この作業電場に達するための初期電場傾斜が１０秒かかるなら、傾斜速度は、１０Ｖ／ｃｍ−ｓである。
【００３９】
「毛細管」または「毛細管チューブ」とは、一定容量の分離媒体を支持できるチューブまたはチャンネルまたは他の構造体を意味する。毛細管の形状は、大きく変わり得、円形、長方形または正方形の断面を備えたチューブ、チャンネル、グローブド（ｇｒｏｖｅｄ）プレートなどが挙げられる。毛細管は、広範囲の周知技術（例えば、引張り、エッチング、光食刻法など）により作製され得る。本発明と共に使用する毛細管の重要な特徴には、その毛細管管腔の表面積：容量比がある。この比が高いと、電気泳動中に生じるジュール熱の効率的な消散が可能となる。好ましくは、約０．４〜０．０４μｍ-1の範囲の比が使用される。これらの比は、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲の内径を有する円形断面を備えた管状毛細管の表面積：容量比に相当している。毛細管は、個々の要素として、またはモノリシック基板で形成されるチャンネルとして、形成され得る（例えば、Ｐａｃｅ，米国特許第４，９０８，１１２号；Ｓｏａｎｅ ａｎｄ Ｓｏａｎｅ，米国特許第５，１２６，０２２号）。毛細管は、そこを通って試料分析物が毛細管の管腔へと導入される「入口末端」を含む。
【００４０】
（ＩＩ．好ましい実施形態の説明）
ＣＥ毛細管で作業電場が確立されたとき、この毛細管の管腔に位置している分離媒体の温度は、一般に、ジュール加熱のために高くなる（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｃｈａｐ．１，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，（１９９２））。ジュール加熱の結果、分離媒体の平均温度の上昇ΔＴだけでなく、分離媒体の温度が管腔の中心線で高くなり周辺で低くなるように、分離媒体内で放物線状の放射温度プロフィールが形成される。
【００４１】
温度上昇ΔＴの規模は、多数のパラメータの関数であり、これらのパラメータには、この毛細管の形状、材料および寸法、この分離媒体および毛細管の材料の熱伝導性、毛細管と周囲の環境との間の熱移動効率、分離媒体の導電率、および分離媒体の導電率の温度依存性の規模が挙げられるが、これらに限定されない。ΔＴの規模は、一般に、これらのパラメータの非線形関数である。
【００４２】
一般に、物質が加熱されるとき、その構成原子のさらに激しい熱振動があるために、その物質は膨張する。温度上昇に応答して物質が膨張する程度は、その熱膨張率によって特徴付けられ、この場合、本明細書中で使用する「熱膨張率」との用語は、物質の温度上昇の結果として、その物質の初期寸法（例えば、長さ、面積または容量）に対する物質の寸法の増大に関連した比例定数を意味する。例えば、最初の近似値に対して、熱膨張による物質の長さの増大は、ΔＬ／Ｌは、以下の関係に従って、温度変化ΔＴと比例している：ΔＬ／Ｌ＝αLΔＴ
ここで、αLは、その物質の線膨張率である。しかしながら、綿密に検査すると、αLは、一般に、絶対的に一定ではなく、むしろ、温度と共に僅かに上昇することが分かる。数種の選択した物質の線膨張率の代表的な値は、以下の表１で示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
流体物質が、堅い壁および少なくとも１個の開放末端を有するチャンネルで、熱膨張を受けるとき、流れが誘発されて、この流体物質の有限な位置ずれが起こる。本発明者は、このような膨張で駆動された流れが、一定操作条件下にて、毛細管電気泳動過程の初期電場傾斜部分の間で現れること、およびこのような流れにより引き起こされる分離媒体の位置ずれが、分離性能に好ましくない影響を与え得ることを発見した。さらに、本発明者は、この効果が、ＣＥ技術分野で頻繁に見られるものと類似のシステム、すなわち、流体分離媒体、高い電場、および剛性材料から形成された長く狭いチャンネル（例えば、５０μｍの内径および５０ｃｍの長さを有する溶融シリカ毛細管チューブ）を使用するシステムにおいて、特に顕著に見られると決定した。特に、最初の近似値に対して、初期電場傾斜中における流体分離媒体の位置ずれの広がりによって、本発明者は、この位置ずれが、（１）毛細管の長さの増大と共に大きくなり、（２）流体分離媒体の熱膨張率の上昇と共に大きくなり、（３）流体分離媒体の導電性が高くなるにつれて大きくなり、（４）毛細管の外面とその周囲との間の熱移動率が低くなるにつれて大きくなり、（５）作業電場が高くなるにつれて大きくなり、そして（６）毛細管の内径が増大するにつれて大きくなることを発見した。
【００４５】
前述の理論的な考察は、本発明を理解し説明するのを助けるために提供されているものの、この考察は、決して、本発明の範囲をこのまたは他の任意の特定の理論的な形態に限定するものと見なすべきではない。
【００４６】
第一局面では、本発明は、流体分離媒体を使用するＣＥ分離で作業電場を制御せずに確立することにより引き起こされるピーク広幅化の量を少なくする方法および装置を包含する。さらに具体的には、本発明のこの局面は、分析物種（例えば、核酸）が作業電場Ｅの影響下にて流体分離媒体を介して差動電気泳動移動により分離される毛細管電気泳動システムを包含し、ここで、この作業電場は、特徴的な傾斜速度を有する規定電場対時間プロフィールに従って、制御様式で、初期電場傾斜中にて、確立される。
【００４７】
本発明に従った代表的な好ましい電場対時間プロフィールには、不連続な多段階プルフィール、連続線形プロフィール、連続非線形プロフィール、またはこのような非連続プロフィールおよび連続プロフィールの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。それに加えて、この初期電場傾斜の経過時間Ｔおよび作業電場Ｅの値は、要求に応じて、特定の用途により変えられ得る。好ましくは、この初期電場傾斜は、電場対時間プロフィールを含み、これは、ピーク広幅化を少なくするだけでなく、ピーク広幅化の所望の低減に一致したできるだけ短い経過時間Ｔで作業電場Ｅを達成するのに役立つ。
【００４８】
好ましい１実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、この場合、各段階は、電場および時間の特定の変化ΔＥおよびΔｔにより特徴付けられる。図１Ａは、このような不連続な多段階の電場対時間プロフィールの概略図である。一般に、ΔＥが小さくなるかおよび／またはΔｔが大きくなるにつれて、この初期電場傾斜のピーク広幅化に対する影響は、少なくなる。
【００４９】
特に好ましい１実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、ここで、各段階に対するΔＥおよびΔｔの値は、例えば、図１Ａで概略的に描写するように、等しい。それゆえ、このような電場対時間プロフィールを特徴付けるためには、作業電場Ｅに対する値、各段階での電場の変化ΔＥ、および各段階に対する時間Δｔを特定する必要があるにすぎない。
【００５０】
他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、複数の不連続段階を含む電場対時間プロフィールにより特徴付けられ、ここで、各段階に対するΔＥおよびΔｔの値は、例えば、図１Ｂ、図１Ｃおよび図１Ｄで概略的に描写するように、等しくない。図１Ｂは、不連続な多段階の電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥおよびΔｔの両方の値は、各段階で大きくなっている。あるいは、図１Ｃは、電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥの値は、各段階で小さくなっており、そしてΔＴの値は、各段階に対して同じである。最後に、図１Ｄは、電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜の概略図を示し、ここで、ΔＥおよびΔｔの両方の値は、各段階で無秩序に変わっている。ジュール加熱により起こる毛細管管腔の内側での温度上昇は、典型的には、電場強度の増大する非線形関数であるので、図１Ｃで概略的に描写している電場対時間プロフィール（ここで、ΔＥの値は、各段階で小さくなっている）は、それが、この初期電場傾斜の経過時間Ｔが短くなると同時に、ピーク広幅化に対する初期電場傾斜の影響を少なくするのに役立つために、特に好ましい。
【００５１】
Ｅ、ΔＥおよびΔｔの値は、好ましくは、不連続な多段階の電場対時間プロフィールを含む初期電場傾斜を使用している間、特定用途の要件に依存して変わるものの、作業電場値Ｅの値は、約５０Ｖ／ｃｍと３０００Ｖ／ｃｍの間であり、１段階あたりの時間Δｔは、約５秒と２００秒の間であり、そして１段階あたりの電場の変化ΔＥは、約１Ｖ／ｃｍと２００Ｖ／ｃｍの間である。さらに好ましくは、Ｅは、約８０Ｖ／ｃｍと３２０Ｖ／ｃｍの間であり、Δｔは、約１０秒と１００秒の間であり、そしてΔＥは、約２Ｖ／ｃｍと６０Ｖ／ｃｍの間である。
【００５２】
他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、連続的な電場対時間プロフィールにより特徴付けられる。図２で示すように、この連続的な電場対時間プロフィールは、線形（例えば、図２の直線１）、凹状（例えば、図２の曲線２）、凸状（例えば、図２の曲線３）、または線形、凹状および／または凸状の種々の組合せ（例えば、図２の曲線４）であり得る。図１Ｃに関連して述べると、好ましくは、その連続的な電場対時間プロフィールは、ジュール加熱により起こる温度上昇の通常の非線形性のために、線形または凸状である。
【００５３】
本発明のこの局面の他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜は、階段状プロフィールおよび連続プロフィールの組合せを含む電場対時間プロフィールにより、特徴付けられる。
【００５４】
ピーク広幅化を少なくする（従って、分離性能を改良する）特定範囲の初期電場傾斜の傾斜速度値は、多数の実験パラメータに依存しており、これには、毛細管の形状、材料および寸法（特に、毛細管の長さ）、分離媒体および毛細管の熱伝導率、分離媒体の熱膨張率と毛細管の熱膨張率との差、毛細管と周囲の環境との間の熱移動の効率、分離媒体の導電率、および分離媒体の導電率の温度依存性が挙げられる。特に、最初の近似値に対して、（１）毛細管の長さの増大と共に、（２）流体分離媒体の熱膨張率の上昇と共に、（３）流体分離媒体の導電性が高くなるにつれて、（４）毛細管の外面とその周囲との間の熱移動率が低くなるにつれて、（５）作業電場が高くなるにつれて、そして（６）毛細管の内径が増大するにつれて、より低い傾斜速度が必要となる。
【００５５】
従って、一定セットの操作条件下にて、ピーク広幅化を少なくする初期電場傾斜の傾斜速度を決定するためには、以下の手順が使用され得る。まず、複数の電気泳動作業の各々に対して、初期電場傾斜を使用して、作業電場を確立し、この場合、各作業は、異なる傾斜速度を使用し、また、この傾斜速度の少なくとも一部は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ以下である。次に、例えば、各作業において、選択したピークの半分の高さでのピーク幅を測定することにより、各作業に対して観察されるピーク広幅化の程度を分析する。最後に、好ましい傾斜速度として、ピーク広幅化を所望程度で少なくするものを選択する。
【００５６】
使用する特定の傾斜プロフィール（例えば、段差、連続、または段差と連続の組合せ）とは関係なく、好ましくは、この初期電場傾斜の傾斜速度は、約５Ｖ／ｃｍ−ｓ未満である。さらに好ましくは、この初期電場傾斜の傾斜速度は、約０．０５Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約３．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である。特に好ましい実施形態では、この傾斜速度は、約０．１Ｖ／ｃｍ−ｓ〜約１．０Ｖ／ｃｍ−ｓの範囲である。
【００５７】
あるいは、この作業電場は、少なくとも約１０秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。さらに好ましくは、この作業電場は、約２０秒〜約５００秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。さらに好ましくは、この作業電場は、約５００秒〜約４０００秒の経過時間Ｔを有する初期電場傾斜を使用して、確立すべきである。
【００５８】
好ましくは、作業電場Ｅは、約５０Ｖ／ｃｍと３０００Ｖ／ｃｍの間の範囲、さらに好ましくは、約８０Ｖ／ｃｍと５００Ｖ／ｃｍの間の範囲である。
【００５９】
本発明のこの第一局面のさらに他の好ましい実施形態では、この作業電場は、初期電場傾斜を使用しないときに見られるものと比較して、この作業電場の確立に付随したピーク広幅化の低減が少なくとも約１０％の量となる傾斜速度、さらに好ましくは、ピーク広幅化の低減が少なくとも約２５％の量となる傾斜速度、ピーク広幅化の低減が少なくとも約４０％の量となる傾斜速度を有する初期電場プロフィールを使用して、確立される。
【００６０】
本発明の他の好ましい実施形態では、その分析物種は、核酸であり、その作業電場は、初期電場傾斜を使用しないときに見られるものと比較して、少なくとも約２０個のヌクレオチド、好ましくは、約４０個のヌクレオチド、さらに好ましくは、約８０個のヌクレオチドだけ読み長さを大きくする傾斜速度を有する初期電場プロフィールを使用して、確立される。
【００６１】
他の局面では、本発明は、初期電場傾斜中において、この分離媒体の平均温度を実質的に一定の値で維持するのに十分な量だけ、初期電場傾斜中における毛細管を取り囲む環境の温度を下げることにより、ＣＥ分離で作業電場を適用することにより起こるピーク広幅化の量を少なくする方法および装置を包含する。本明細書中で使用する「平均温度」との用語は、空間的な平均温度を意味し、この場合、この温度は、電気泳動移動方向に垂直な寸法（例えば、円筒形毛細管の場合、この寸法は、その半径である）を横切って、平均化される。
【００６２】
特に、本発明のこの局面の方法によれば、この初期電場傾斜中において、この毛細管を横切る電場が大きくなるにつれて、この毛細管を取り囲む環境の温度は、毛細管の管腔内に位置している分離媒体の平均温度を初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．４℃以内（さらに好ましくは、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．２℃以内、さらにより好ましくは、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度の約０．１℃以内）で維持するのに十分な量だけ、下げられる。
【００６３】
本発明のこの第二局面の他の好ましい実施形態では、この初期電場傾斜中において、この毛細管の管腔内に位置している流体分離媒体の温度は、このような初期電場傾斜中の毛細管の入口末端で約６００μｍ未満（好ましくは、約２００μｍ未満、さらに好ましくは、約２０μｍ未満）の流体分離媒体の位置ずれを生じるのに十分な量だけ、この毛細管を取り囲む環境の温度を下げることにより、初期電場傾斜を開始する前の分離媒体の平均温度に関して実質的に一定に維持される。
【００６４】
本発明のこの局面の好ましい１実施形態では、この毛細管の管腔内に位置している分離媒体の温度は、毛細管を横切って加えられる電場と毛細管を通って測定した電流との間の関係を測定することにより、モニターされる。いかにして、特定の分離媒体の伝導率が温度の関数として変わるかを知ることにより、この電場が大きくなるにつれて、分離媒体の温度の正確な測定値を得ることが可能となる。それゆえ、この分離媒体の温度が上昇し始めるにつれて、その周囲の温度は、アクティブフィードバック制御を使用して低くされる。あるいは、この毛細管の管腔内に位置している分離媒体の温度は、この媒体の温度対電場の特性の事前の治験に基づいた事前にプログラムされた温度傾斜を用いて、実質的に一定で維持される。
【００６５】
大ていは、本発明で具体化した改良を除いて、本発明に従ってＣＥ分離を行うのに使用される方法および装置は、他の文献（例えば、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｌｂｕｒｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））で一般的に記述されているように、従来のＣＥ方法および装置を使用して実行され得る。例えば、本発明の方法を実施するには、標準的な毛細管チューブ（例えば、ポリイミド被覆した溶融シリカ毛細管チューブ）、流体分離媒体（例えば、緩衝化した重合体溶液または重合体を含まない緩衝液）、試料注入技術（例えば、動電学的な注入または水力学的な注入）、自動化したシステム制御装置（例えば、デジタルコンピュータ）、および検出技術（例えば、蛍光または吸光度）が利用され得る。
【００６６】
しかしながら、本発明の方法を行うのに使用するＣＥシステムは、ある種の非標準的な機能および性能を含む。本発明で使用するＣＥシステムの電源部分は、初期電場傾斜の電場対時間プロフィールを制御できるように、プログラム化可能な電子制御装置（例えば、パーソナルコンピュータ）により制御可能であるべきである。それに加えて、この初期電場傾斜のアクティブフィードバック制御を使用する場合、この電子制御装置は、この電気泳動毛細管を通る電流をモニターする電流モニターに接続するべきであり、また、その電流測定に応答して毛細管を横切る電場を自動的に調節可能であるべきである。また、本発明と併用するＣＥシステムは、その毛細管チャンネルを取り囲む環境の温度を制御する温度制御システムを使用するべきである。この温度制御システムは、この周囲環境の温度を、この毛細管の実質的に全長に沿って、約０．１℃以内まで制御できるべきであり、この周囲環境の温度を０．１℃ずつ変えるべきであり、そして初期電場傾斜中において周囲環境の温度を調節できるべきであり、この場合、必要に応じて、このような変化は、この毛細管管腔で位置している分離媒体の温度変化に応答性である。
【００６７】
（ＩＩＩ．実施例）
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの実施例は、純粋に、本発明を代表するものと解釈され、いずれの様式でも、その範囲を限定するものとは解釈されない。
【００６８】
（材料および方法）
全ての電気泳動分離は、５０ｃｍの毛細管アレイ（ｐ／ｎ ４３０５７８７）を備えたＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐ/ｎ ４３０８０５８）を使用して、実行した。この３７００システムは、約９６本の別個の溶融シリカ分離毛細管を含み、各毛細管は、被覆していない内面、５０ｃｍの全長、５０ｃｍの有効分離長、および５０μｍの内径を有する。この３７００システムでの試料分析物の蛍光検出は、鞘流れ検出システムを使用して、達成される（例えば、Ｋａｍｂａｒａら、米国特許第５，５２９，６７９号；Ｄｏｖｉｃｈｉら、米国特許第５，４３９，５７８号）。
【００６９】
種々の操作条件下にて分離性能を特徴付けるために、サイズが３５個、５０個、７５個、１００個、１３９個、１５０個、１６０個、２００個、２５０個、３００個、３４０個、３５０個、４００個、４５０個、４９０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個および７００個のヌクレオチドの２０個の標準ＤＮＡ断片を含む標準試料混合物を使用した。この混合物の各断片を、ＴＥＴ染料で標識した。この試料混合物を、約０．０３ｎＭの最終濃度まで、脱イオンホルムアミドおよび０．３ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムに溶解した。
【００７０】
この毛細管アレイの温度を、５０℃±０．１℃で維持した。それらの毛細管の入口末端を試料混合物に浸漬しつつ、３０秒間にわたって、５０Ｖ／ｃｍの電場を加えることにより、これらの毛細管に試料を注入した。
【００７１】
使用した分離媒体は、市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７００ ＰＯＰ６重合体（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ｐ/ｎ ４３０６７３３）の改良型であり、ここで、その変性剤は、６Ｍまたは８Ｍのいずれかの濃度で尿素を含有する代替変性剤で置き換えた。このＰＯＰ６重合体は、直鎖状置換ポリアシルアミドの溶液である。
【００７２】
各電気泳動図は、「分解能限界（ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」、すなわち、「ＬＯＲ」と呼ばれるパラメータを使用して、特徴付けた。ＬＯＲは、電気泳動図中の１地点として規定され、これは、電気泳動図のその位置に位置しているポリヌクレオチド断片のサイズによって表され、その位置では、以下の関係が満たされる：
【００７３】
【化１】
【００７４】
ここで、Ｘ2は、ピーク２の中心位置であり、Ｘ1は、ピーク１の中心位置であり、Ｗ1は、ピーク１の半分の高さでのピーク幅であり、そしてＷ2は、ピーク２の半分の高さでのピーク幅であり、ここで、ピーク１および２は、単一のヌクレオチドだけサイズが異なるＤＮＡ断片である。この標準混合物中の実質断片は１個より多いヌクレオチドだけサイズが異なるので、その単一ヌクレオチド間隔（Ｘ2−Ｘ1）は、この試料混合物中の２０個の断片の各々の位置Ｘをプロットすることにより、これらのデータ点を三次多項式に当てはめることにより、そして得られた適合曲線の内挿に基づいて、単一ヌクレオチド計算間隔（Ｘ2−Ｘ1）を決定することにより、サイズの関数として、概算した。半分の高さでのピーク幅Ｗ1およびＷ2は、単一のヌクレオチドだけサイズが異なる断片のピーク幅が２０個の実際のピーク幅のうちの最も近いピークの幅と同じであると仮定して、概算した。実際には、実質自動化塩基呼び出しアルゴリズム（ａｃｔｕａｌ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ）は、典型的には、そのＬＯＲを超える１００個〜２００個のヌクレオチドを塩基呼び出しすることができ、それゆえ、もし、一定の分離に対して、そのＬＯＲが５００であるなら、約７００個のヌクレオチドまで、正確な（すなわち、約９８％より高い精度）塩基呼び出しを予想できる。
【００７５】
（実施例１）
（２種の異なる分離媒体でのＬＯＲに対する作業電圧の効果）
図３および４は、多数の異なる作業電場の各々において、約９６枚の異なる電気泳動図に対するＬＯＲ値を示す。図３では、その分離媒体は、８Ｍの尿素変性剤を含有していたのに対して、図４では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。各プロットのｙ軸は、そのＬＯＲ値を示すのに対して、各プロットのｘ軸は、７００個のヌクレオチド断片が検出器に到達するのに必要な時間Ｔ700を示す。このデータから明らかに分かるように、両方の分離媒体に対して、その電場が大きくなるにつれて、それゆえ、Ｔ700が短くなるにつれて、そのＬＯＲの平均値ＬＯＲavgは、小さくなり、そしてＬＯＲの標準偏差ＳＤLORは、大きくなった。それに加えて、ＳＤLORの規模は、ＬＯＲavgと比較して、大きかった。図３および４のデータに対するＬＯＲavgおよびＳＤLORの値は、以下の表２および３で提示する。それゆえ、これらのデータは、この作業電場を高くすることによりその分析速度を上げるとき、ＬＯＲの低下およびＳＤLORの上昇という相当なペナルティを払わされることを示す。例えば、以下の表２で提示したデータによれば、この作業電場を９０Ｖ／ｃｍから１３０Ｖ／ｃｍへと高めることにより、１６５個のヌクレオチドのＬＯＲ低下が観察された。
【００７６】
【表２】
【００７７】
【表３】
【００７８】
（実施例２）
（作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜の効果）
図５および６は、図３および４と比較するとき、２種の異なる分離媒体における作業電場の関数としてのＬＯＲに対する制御した初期電場傾斜の効果を示す。図５では、その分離媒体は、８Ｍの尿素変性剤を含有していたのに対して、図６では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。図５および６の両方の実験では、その初期電場傾斜は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを使用して、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓであり、ここで、ΔＥは、１０Ｖ／ｃｍであり、そしてΔｔは、各段階において、４０秒であった。これらのデータから明らかに分かるように、この初期電場傾斜を導入すると、研究した作業電場の各々において、ＬＯＲavgの実質的な上昇およびＳＤLORの低下が生じた。しかしながら、この効果は、さらに高い電場では、非常に顕著であった。それゆえ、これらのデータは、本発明による制御した初期電場傾斜を使用することにより、分離性能を犠牲にすることなく、さらに高い作業電場が使用でき、結果的に、相当に短い分析時間が達成され得、著しく高い全処理能力につながる。図５および６のデータに対するＬＯＲavgおよびＳＤLORに対する値は、以下の表４および５で提示する。
【００７９】
【表４】
【００８０】
【表５】
【００８１】
（実施例３）
（ＬＯＲに対する傾斜速度の効果）
図７および８は、２種の異なる分離媒体における２種の異なる作業電場でのＬＯＲに対する初期電場傾斜の傾斜速度の効果を示す。これらの初期電場傾斜の各々は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを含んでおり、ここで、各傾斜速度に対して、ΔＥおよびΔｔの値は、等しかった。
【００８２】
図７では、その作業電場は、１６０Ｖ／ｃｍであり、その分離媒体は、８Ｍの尿素を含有していた。図７で示した異なる傾斜速度は、ΔＥを５００Ｖで保持してΔｔを１０秒と８０秒の間で変えることにより、達成された。図７のデータで明らかに分かるように、約０．１２Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を使用すると、殆ど８０個のヌクレオチドのＬＯＲの上昇が得られた。
【００８３】
図８では、その作業電場は、１２０Ｖ／ｃｍであり、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。これらの異なる傾斜速度は、ΔＥを５００Ｖで保持してΔｔを５秒と４０秒の間で変えることにより、達成された。図８のデータで明らかに分かるように、約０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの傾斜速度を使用すると、殆ど１００個のヌクレオチドのＬＯＲの上昇が得られた。
【００８４】
（実施例４）
（作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜を使用することの効果）
図９および１０は、作業電場の関数としてのＬＯＲに対する初期電場傾斜を使用することの効果を示している。この初期電場傾斜の傾斜速度は、両方の場合において、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓであり、この場合、これらの初期電場傾斜は、不連続な階段状の電場対時間プロフィールを使用して達成され、ここで、ΔＥの値は、１０Ｖ／ｃｍであり、そしてΔｔの値は、４０秒であった。図９では、その分離媒体は、８Ｍの尿素を含有していたのに対して、図１０では、その分離媒体は、６Ｍの尿素を含有していた。図９および１０の両方で示したプロットは、明らかに、初期電場傾斜が分離性能に対して有し得る劇的な効果を説明し、また、この効果がさらに高い作業電場ではより顕著になることを示している。分離速度に対する初期電場傾斜を使用することの劇的な効果もまた、図９および１０のデータで、明らかに分かる。例えば、図１０を参照すると、初期電場傾斜を使用することなく６００のＬＯＲを達成するためには、その作業電場は、１００Ｖ／ｃｍを超えることができないのに対して、もし、０．２５Ｖ／ｃｍ−ｓの初期電場傾斜を使用するなら、１５０Ｖ／ｃｍの作業電場が使用され得、その結果、分析時間が約５０％短くなる（この初期電場傾斜を起こすのに必要な１０分間は含めない）。
【００８５】
全ての文献および特許出願の内容は、各個々の文献または特許出願の内容が具体的かつ個別的に本明細書中で参考として援用されているように、同じ程度まで、本明細書中で参考として援用されている。
【００８６】
少数の実施形態だけを詳細に上で記述したものの、電気泳動分野の当業者は、その教示から逸脱することなく、その好ましい実施形態において、改良が可能であることを明らかに理解している。例えば、制御した初期電場傾斜および温度傾斜プロトコルの両方を組み合わせて使用して、本発明を実施し得る。このような改良の全ては、上記請求の範囲の範囲内に含まれると解釈される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１７４９５１（Ｐ２０１１−１７４９５１Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−１３３７２７（Ｐ２０１１−１３３７２７）
【出願日】平成２３年６月１５日（２０１１．６．１５）
【分割の表示】特願２０１１−９３４０２（Ｐ２０１１−９３４０２）の分割
【原出願日】平成１２年７月２６日（２０００．７．２６）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３３７２７（Ｐ２０１１−１３３７２７）
【出願日】平成２３年６月１５日（２０１１．６．１５）
【分割の表示】特願２０１１−９３４０２（Ｐ２０１１−９３４０２）の分割
【原出願日】平成１２年７月２６日（２０００．７．２６）
【出願人】（３１０００９７７５）アプライド バイオシステムズ リミテッド ライアビリティー カンパニー (19)
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