電気的分析方法
【課題】簡便な操作で、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析方法を提供する。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、カーボンナノチューブを感知部として用い、前記標識酵素として加水分解酵素を用い、前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、カーボンナノチューブを感知部として用い、前記標識酵素として加水分解酵素を用い、前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気的分析方法に関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査のような生体試料の分析においては、微量成分を測定する場合が多いため、検出感度や精度の高い分析方法が求められている。このような分析方法としては、特異的な相互作用、例えば、抗原抗体反応や酵素−基質反応を利用することに加え、更に、電気的分析手段を組み合わせることにより高い検出感度を達成することが試みられている。
【０００３】
また、電気的分析手段として、カーボンナノチューブ（以下、ＣＮＴと称することがある）電極を利用することが試みられている。
一方で、ＣＮＴにπ−π相互作用を介して、芳香族環（例えばピレン等）が吸着することは広く知られている（非特許文献１）。また、この原理を利用し、特異的な相互作用を分析する方法が試みられている。
【０００４】
例えば、ＣＮＴ電極を用いた測定法で、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を利用し、その基質としてナフチルホスフェート（ナフタレン環）を利用し、生成したナフトールを電気化学的に検出する方法（非特許文献２）や、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識酵素として利用し、その基質として過酸化水素、生成物ではなくメディエーターとしてハイドロキノンを利用する方法（非特許文献３）あるいは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を単なる酵素として利用し、その基質として過酸化水素、生成物ではなくメディエーターとしてフェノール類を利用する方法（非特許文献４）が報告されている。しかし、いずれもＣＮＴ電極特有の高い検出感度を達成することができず、実用化には至っていない。
【０００５】
また、最近、ＣＮＴ電極を用いた測定法で、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を利用し、その基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を利用し、生成したｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）を検出する方法（非特許文献５）が報告されている。しかし、この方法は、プレートを使用したバッチ式によるＥＬＩＳＡ法で実施することを試みており、プレート内で生成したｐＡＰを測定するために、反応液をＣＮＴ電極に移して検出するものであるため、操作が煩雑であり、正確性や感度の面で劣ることが予想された。
【０００６】
【非特許文献１】Chen,R.J. J.Am.Chem.Soc 2001,123,3838-3839
【非特許文献２】Lenihan JS, J Nanosci Nanotechnol. 2004 Jul;4(6):600-4.
【非特許文献３】Yu,X. Mol.BioSyst.2005,1,70-78
【非特許文献４】S. Korkut, Talanta 2008,76,1147-1152
【非特許文献５】P.J. Lamas-Ardisana, Anal.Chim. Acta 615 (2008) 30-38
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの従来技術が公知であるにもかかわらず、微量成分を測定するには、更に高い検出感度や精度が要求されている。本発明者は、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法において、前記標識酵素としてアルカリホスファターゼを用い、前記生成物が芳香環を一つのみ含み（あるいは、カーボンナノチューブ上に濃縮可能であり、）、前記複合体をカーボンナノチューブ上（に結合した状態）で形成させることにより、芳香環を一つのみ含む前記生成物はカーボンナノチューブ上に著しく濃縮され、電気化学的測定により、蓄積された前記生成物を分析することにより、検出感度や精度を飛躍的に向上させることができることを見出した。
なお、この際用いられるカーボンナノチューブとは、一様な平面のグラファイト以外のフラーレン、カーボンナノホーン等ナノカーボン構造体を含み、更に好ましくは、炭素によって作られるグラフェンシートが単層あるいは多層の同軸管状になった物質である。
従って、本発明の課題は、簡便な操作で、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、
カーボンナノチューブを感知部として用い、
前記標識酵素として加水分解酵素を用い、
前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である
ことを特徴とする分析方法、
［２］前記複合体が、前記感知部と連続して又は同領域に形成される、［１］の分析方法、
［３］前記複合体をカーボンナノチューブに結合した状態で形成させる、［１］又は［２］の分析方法、
［４］前記生成物が芳香環を含みかつ該芳香環が一つのみである物質である、［１］〜［３］の分析方法、
［５］前記加水分解酵素がアルカリホスファターゼである、［１］〜［４］の分析方法、
［６］前記生成物がｐ−アミノフェノールである、［１］〜［５］の分析方法、
［７］分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナー、標識酵素及び該標識酵素の基質、及びカーボンナノチューブを固定された感知部を含むキット、
［８］［１］〜［６］の分析方法に用いるための、［７］のキット
に関する。
【０００９】
なお、「カーボンナノチューブ上に濃縮される」とは、カーボンナノチューブへの結合、蓄積、吸着、取り込み、沈殿、析出、不溶化等を含み、これらは、前記生成物が生じる反応を流動的条件下で行っても容易にはカーボンナノチューブから脱離しない状態を意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の具体的な一態様として、図１に示す反応模式図に基づいて説明する。選択的相互作用として抗原抗体反応（サンドイッチ法）を利用し、抗原３を分析対象物として、カーボンナノチューブ上に前記抗原に特異的に反応する第一抗体２を固定化した感知部を作用極１として用い、前記抗原に特異的に反応する第２抗体をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したＡＬＰ標識第二抗体４を使用して、サンドイッチ複合体を形成させ、前記ＡＬＰの基質であるｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を利用して以下に示す反応式１に基づく、ＡＬＰの酵素反応により、生じた生成物であるｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）がカーボンナノチューブ上に濃縮され、反応式２に基づく酸化還元電流を測定することにより、前記抗原量を決定する。
【００１２】
なお、電気化学的分析法として、上記作用極１に加え、対極、及び参照極を備えた電極部を用いるアンペロメトリック型分析法を使用し、具体的には、作用極、対極、参照極をポテンショスタットに接続し、参照極電位に対し、作用極電位を掃引し、カーボンナノチューブ上に濃縮されたｐ−アミノフェノールの酸化に伴い発生する酸化電流を測定する。
【００１３】
【化１】
［式中、ｐＡＰＰはｐ−アミノフェニルホスフェートであり、ｐＡＰはｐ−アミノフェノールであり、ｐＱＩはｐ−キノンイミンである］
【００１４】
本発明で利用することのできる選択的相互作用は、一方が分析対象物質となることができる相互作用であって、被検試料中の分析対象存在量に相関して、複合体を形成することができる限り、特に限定されるものではなく、代表的なものとしては、例えば、抗原抗体反応、核酸間ハイブリダイゼーション反応、核酸−タンパク質間相互作用、レセプタ−リガンド間相互作用、タンパク質間相互作用（例えば、ＩｇＧとプロテインＡとの反応）、低分子−タンパク質間相互作用（例えば、ビオチンとアビジンとの反応）を挙げることができる。
【００１５】
また、前記相互作用以外にも、選択的相互作用を示す特異的パートナーが存在する種々の物質が公知であり、分析対象物質としては、例えば、タンパク質（酵素、抗原／抗体、レクチン等）、ペプチド、脂質、ホルモン（アミン、アミノ酸誘導体、ペプチド、タンパク質等からなる含窒素ホルモン、及びステロイドホルモン）、核酸、糖鎖（例えば、糖、オリゴ糖、多糖等）、薬物、色素、低分子化合物、有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、又は、ウィルス若しくは細胞を構成する分子、血球などが挙げられる。
【００１６】
例えば、選択的相互作用として抗原抗体反応を利用する場合には、分析対象物質とその特異的パートナーとの組合せは、抗原（分析対象物質）と抗体（特異的パートナー）との組合せ、あるいは、抗体（分析対象物質）と抗原（特異的パートナー）との組合せとなる。
【００１７】
アルカリホスファターゼによる標識化物を含めた試薬構成は、その利用する選択的相互作用に基づいて、適宜選択することができ、例えば、抗原抗体反応を利用する場合には、各種公知方法、例えば、サンドイッチ法、二段階法、競合法、阻害法等を利用することができる。サンドイッチ法の場合には、図１に示すように、固定化パートナーと標識パートナーの組合せを用いることができる。二段階法の場合には、固定化パートナー、未標識パートナー、前記未標識パートナーにのみ特異的に反応する物質の標識化物の組合せ、具体的には、一次抗体／標識化二次抗体を用いる方法、ビオチン化抗体／標識化アビジンを用いる方法などを用いることができる。競合法の場合には、分析対象物質（標準物質）の標識化物（既知量）と固定化パートナーの組合せを用いることができる。
【００１８】
前記被検材料としては、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、大便、汗、粘液、涙、随液、鼻汁、頸部又は膣の分泌液、精液、胸膜液、羊水、腹水、中耳液、関節液、胃吸引液、組織・細胞等の抽出液や破砕液等の生体液を含むほとんど全ての液体試料が用いられる。
【００１９】
前記標識物質としては、それが関与する反応による生成物が電気化学的に分析可能であり、かつ芳香環一つのみを含む物質を産生し得る酵素であれば、特に限定されるものではないが、具体的には、ホスファターゼ、エステラーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、更に好ましくはアルカリホスファターゼが挙げられる。
【００２０】
本発明で用いるカーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質は、前記標識物質による加水分解反応等により生じる物質であり、かつカーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質であり、電気化学的に分析可能である限り、特に限定されるものではないが、好ましくはカーボンナノチューブの内径又は曲率と比較してサイズが小さい物質であり、更に好ましくは芳香環を一つのみ含む物質である。
【００２１】
具体的な生成物としては、ｐ−アミノフェノール、アミノフェノール、クロロフェノール、メトキシフェノール、ジメトキシフェノール、アセトアミドフェノール、メチルフェノール、ジメチルフェノール、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、及びこれらの構造異性体等のフェノール類、ベンゾキノン及びこれらの構造異性体等のキノン類が挙げられ、好ましくはｐ−アミノフェノールである。
【００２２】
前記基質としては、これらのリン酸化された物質を用い、それ自体はＣＮＴに反応しないか反応が弱いことが望ましく、好ましくは、アルカリホスファターゼの基質として、ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）を用いると良い。
【００２３】
カーボンナノチューブ上に電気化学的に分析可能な物質が濃縮され、従来法と比較して、検出感度や精度を飛躍的に高めることができる理由は、現時点では必ずしも判明していないが、本発明者は以下の機構を推測している。なお、本発明は、以下の推測に限定されるものではない。
【００２４】
例えば、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）を利用した場合、生成物であるＰ−アミノフェノール（ｐ−ＡＰ）はカーボンナノチューブとの間にπ−π相互作用や疎水的相互作用を持つと同時に、ｐ−アミノフェノールは芳香環を一つしか持たないため、カーボンナノチューブの内径又は曲率と比較してもサイズ的に小さく、カーボンナノチューブの様な微細構造を持つ炭素担体に対して、取り込まれ、このことにより、カーボンナノチューブ上に濃縮されると推測される。また、カーボンナノチューブの近くで、生成物を生成させることで、濃縮が著しく促進されると推測される。
【００２５】
これは実施例で示した通り、カーボンナノチューブ電極を用いて、標識酵素としてアルカリホスファターゼ、基質としてナフチルホスフェートを利用して、生成したナフトールを電気化学的に検出する場合や、市販カーボン電極を用いて、標識酵素としてアルカリホスファターゼ、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェートを利用して、生成したｐ−アミノフェノールを電気化学的に検出する場合、また、酵素反応と同時ではなく、ｐ−アミノフェノールをＣＮＴ電極で電気化学的に検出す場合には、検出感度や精度を飛躍的に高めることができないことから推測される。
【００２６】
本発明で用いるカーボンナノチューブを感知部に用いる場合とは、一般的なＣＮＴ電極を意味し、具体的には、電極部は絶縁性の基板上に少なくとも対極と該感知部であるカーボンナノチューブを含む作用極を有するアンペロメトリック型電極であり、好ましくは更に参照極を有し、前記電極部における電荷の変化を電流変化として捉えることにより、分析対象物質を検出するようになっている。
なお、電流の変化を捉える方法としては、電流測定の他、サイクリックボルタノメトリー、微分パルスボルタノメトリー、微分パルスアンペロメトリー、クロノアンペロメトリー等、広く知られた方法を用いることができる。
【００２７】
また、別の態様として、電極部は絶縁性の基板上にカーボンナノチューブを含む電極及び参照極を有し、前記電極１がゲート自身又はゲートと通電可能な状態にある導電性電極を有する電界効果トランジスタであるボルタノメトリック型電極であり、前記ゲート自身又はゲートと通電可能な状態にある導電性電極における電荷の変化を電圧（電位）変化として捉え、ソース電極とドレイン電極との間に流れる電流値の変化を検出することにより、分析対象物質を検出するようになっている。この時、参照極は前記電極の表面で起こる電圧（電位）変化を安定に測定するため、基準となる電位を与え、通常は銀・塩化銀電極等と広く知られた電極を適宜用い、参照極に所定の電圧を交流もしくは直流で印加することにより、電解効果トランジスタの電気化学的特性の動作点を調整することができる。この時、電界効果トランジスタの代わりに薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）、単電子トランジスタ（ＳＥＴ）を用いても良い。
【００２８】
本発明で用いる電気化学的分析方法とは、前記記載のアンペロメトリック型電極又はボルタノメトリック型電極を用いた分析法であり、カーボンナノチューブを感知部として用いた場合、カーボンナノチューブを含む感知部上に濃縮可能な物質が起こすカーボンナノチューブ上での電荷の変化を電流の変化として捉える分析、カーボンナノチューブ上での電荷の変化を電圧（電位）の変化として捉える分析、カーボンナノチューブ上での電荷の変化を電気的抵抗（又はインピーダンス）の変化として捉える分析などが含まれる。
【００２９】
カーボンナノチューブを感知部として用いる場合、例えば、図２に示すように、分析対象物質（抗原）３と選択的に相互作用する特異的パートナー（第一抗体）２が、感知部（作用極）１とは別の複合体形成用担体（粒子）５に固定化されているが、該感知部と該複合体形成用担体とが、仕切りで隔てられていたり、その間の生成物の移動に操作が必要とされていたりすることなく、連続していると良い。
例えば、図２に示すように、複合体形成用粒子上に、第一抗体−抗原−ＡＬＰ標識第二抗体４からなる複合体を形成し、近接したカーボンナノチューブに濃縮された生成物（ｐＡＰ）を電気化学的に測定を行うことが挙げられる。
【００３０】
また、カーボンナノチューブを感知部として用いる場合の別の態様としては、分析対象物質と選択的に相互作用する特異的パートナーは、そこで形成される複合体と感知部が同領域に配置されるように、感知部にあればどこでも良く、好ましくはカーボンナノチューブに固定化された態様（例えば、図１）が挙げられる。選択的相互作用反応により該複合体を形成した後、近接したカーボンナノチューブに濃縮された生成物を電気化学的に測定を行うことができれば良い。
【００３１】
特異的パートナー及び／又は標識酵素のカーボンナノチューブへの固定化法は直接的に固定するもの、あるいは間接的に固定するものなどの制限は無く、選択的相互作用反応の性質に合わせて、任意の方法を使用することができる。例えば、カーボンナノチューブに直接的に物理吸着や共有結合で結合させても良いし、あらかじめカーボンナノチューブにアンカー部を有するフレキシブルスペーサーを介して間接的に結合させても良く、これらはChemical Reviews 2006年 106巻、1105-1136等に記載され、広く知られている方法を選択することができる。また、国際公開第ＷＯ ２００６／０３８４５６号記載の高分子ポリマー等を利用してカーボンナノチューブに固定化しても良い。
【００３２】
また、該特異的パートナー及び／又は標識酵素をカーボンナノチューブに固定化した後、牛血清アルブミン、ポリエチレンオキシドまたは他の不活性分子により表面を処理したり、特定物質の固定化層の上に付着層で被覆することにより非特異的反応を抑制したり、透過することのできる物質を選択したり、制御したりすることもできる。
【００３３】
本発明に用いるカーボンナノチューブとしては、例えば、炭素原子のみからなり、直径が０．４〜５０ｎｍ、長さが約１〜数１００μｍの一次元性のナノ材料であることが好ましい。
【００３４】
前記カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴｓ；single-walled carbon nanotubes）であることが好ましい。カーボンナノチューブの化学構造はグラファイト層を丸めてつなぎ合わせたもので表されるが、「単層カーボンナノチューブ」とは、このグラファイト層の数が１枚だけのものである。なお、グラファイト層の巻き方（らせん度）に依存して電子構造が金属的になったり、半導体的になったりすることが知られている。前記構成によれば、直径が小さいため、より高密度に成長でき、その結果、表面積が格段に増加することができる。更に、結晶性も良いため、物質を表面に固定化しやすいという利点がある。
【００３５】
また、カーボンナノチューブを形成する技術は、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されないが、アーク放電法、レーザーアブレーション法、化学気相成長法（ＣＶＤ法）、例えば、熱化学気相成長法やプラズマ化学気相成長、ＨｉＰＣＯ法、スーパーグロースＣＶＤ法などの他、液相合成法などが挙げられる。カーボンナノチューブをアンペロメトリック型の感知部として用いる場合、又はボルタノメトリック型のゲートと通電可能な状態にある感知部として用いる場合として用いる場合は、予め上記の方法にて合成したカーボンナノチューブを電極上に塗布等により固定しても良く、好ましくは金属表面から、直接成長させ、感知部であり、かつ電極として用いることが好ましく、例えば、特開２００８−６４７２４号記載の熱化学気相成長法等の化学気相成長法を用いて金属表面から直接成長させることが好ましい。これにより、電気的・機械的に金属表面と良好に接触し、電極の性能と安定性を劇的に向上させることができる。
【００３６】
また、カーボンナノチューブ電極は、リソグラフィーの方法を用いて、数ミクロンの金属表面上に形成することができるため、特許第２５９０００２号記載のくし形金属表面上に形成させても良い。また、複数個同時に１つの基板上に形成することができ、これにより、同時複数項目計測が容易になる。
また、カーボンナノチューブをボルタノメトリック型のゲート部として用いる場合、例えば、国際公開ＷＯ ２００６／０２５４８１号等記載の方法により、形成することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
《実施例１：Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）の測定（ＣＮＴ−ＡＬＰ系）》
１−１．カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）作用極をもつ電極部、感知部の作製
図３に示すパターンからなる電極部を「Electrochemistry Communications 9, 2007, 13-18」記載の方法に基づき作製した。即ち、ＳｉＯ２／Ｓｉ基板上にフォトリソグラフィー法により、Ｐｔ電極部をパターニングした後、作用極（作用極下地面積：４ｍｍ２）上に触媒を塗布し、熱化学気相成長（熱ＣＶＤ）法により、ＣＮＴ作用極２１を作製した。また、電極部の一部に銀・塩化銀インク（ＢＡＳ社製）を塗布することにより、参照極２２を作製し、ＣＮＴ作用極、対極２３、参照極を備えた電極部２６を作製した。ＣＮＴ作用極、対極、参照極の反対側の端部は、接続用コネクター２４として機能し、電極部と接続用コネクターはリード部２５で結ばれ、電極部と接続用コネクター部以外は絶縁膜により覆った。
なお、ＣＮＴ作用極を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した結果を図４に示す。
【００３９】
１−２．抗ＨＢｓモノクローナル抗体がＣＮＴ作用極上に固定化された感知部の作製
次に、上記電極部のＣＮＴ作用極上に、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にＨＢｓ抗原に対する抗体である抗ＨＢｓモノクローナル抗体（ＩｇＧ：自社製）１ｍｇ／ｍＬを含む水溶液２μＬを適下し、３７℃、飽和水蒸気圧下で３０分間固定化させた。その後、溶媒を２５℃、湿度４０％の条件下で、１時間乾燥、真空デシケーター内で室温にて２時間乾燥させた後、１％カゼイン（和光純薬社製）含有０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液（ＳＩＧＭＡ社製、ｐＨ８．０）中に３０分間振とう下、浸漬させて、未反応部をブロッキングし、さらに、脱塩水を用いて基板を洗浄後乾燥し、電極部に特定物質として抗ＨＢｓモノクローナル抗体が固定化された感知部として用いた。
【００４０】
１−３．市販カーボン電極を作用極とした電極部、感知部の作製（対照実験用カーボン電極部）
次に、ＣＮＴ作用極の効果を調べるため、市販カーボン電極（EP-P DEP Chip：北斗科学産業社製）を用い、上記の項目１−２と同様の方法にてEP-P DEP Chipのカーボン作用極上に抗ＨＢｓモノクローナル抗体を固定し、電極部に特定物質として抗ＨＢｓモノクローナル抗体が固定化された感知部として用いた。
【００４１】
１−４．アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）溶液の作製
抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（自社製）、ＡＬＰ（ロシュ社製）、架橋試薬（Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate：ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、「高感度酵素免疫測定法（石川栄治：学会出版センター、１９９３）」記載のマレイミド・ヒンジ法に基づき、ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）を作製した。得られた酵素標識抗体［ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）］を０．１％カゼイン及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、緩衝液Ａと称する）にて所定の濃度に調整した溶液を、ＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体溶液とした。
【００４２】
１−５．ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）基質溶液の作製
２ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ：Universal sensors社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ｐＡＰＰ基質溶液とした。
【００４３】
１−６．２−ナフチルホスフェート（ＮＰ）基質溶液の作製（対照実験用）
２ｍｍｏｌ／Ｌ ２−ナフチルホスフェート（ＮＰ：Alfa Aesar社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ＮＰ基質溶液とした。
【００４４】
１−７．ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）溶液の作製（対照実験用）
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ：和光純薬社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ｐＡＰ溶液とした。
【００４５】
１−８．ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体−ＨＢｓ抗原−抗ＨＢｓモノクローナル抗体複合体（ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体）固定化電極部の作製
上記項目１−２で作成した抗ＨＢｓモノクローナル抗体固定化電極部を、ＨＢｓ抗原溶液［ＨＢｓ抗原（組換え品、サブタイプａｄｗ：自社製）を緩衝液Ａにて所定濃度に調整した溶液］及びＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体溶液（２μｇ／ｍＬ）を１：１の割合で混合した溶液中に振とう下、浸漬させて、７分間反応させた後、脱塩水を用いて、電極を洗浄・風乾して、ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極とした。
【００４６】
１−９．流路の作製と流動条件制御装置の構築及び電気化学アナライザーによるＨＢｓ抗原の測定
図５〜図７に示すバイオセンサユニットを作製した。図５〜図７に示すように、反応溶液の液入口３２、液出口３３としてガラス板の２ヶ所に穴（開口部）を開けたウインドー（window）３１と、上記１−８で作製したＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極部３７を備えた基板３６とを用いて、両面テープ（厚み０．６４ｍｍ：３Ｍ社製）を縦長の流路の形状に切り抜くことにより作製したガスケット３４を上下から挟むことにより、中空状態の流路３５の作製を行い、流路内に各電極部を保持させ、バイオセンサユニット４１とした。
【００４７】
次に、バイオセンサユニット４１の流路入口に、図８に示すように、試薬（基質溶液）サーバー４２及びポンプ４３をチューブにより接続し、流路出口に廃液サーバー４４を接続し、流速３６０μＬ／ｍｉｎにて、流路内に試薬サーバーから上記１−５又は１−６で作製した基質溶液を入口から出口方向へ流し、３分後にその送液状態を維持したまま、以下に示す条件にて、電気化学的測定を行った。
【００４８】
また、電気化学的測定は、図８に示すように、作用極、参照極、対極の各接続用コネクター４５を電気化学アナライザー（モデル８３２Ａ：ＡＬＳ社製）４６にそれぞれ接続し、サイクリックボルタノメトリー法（ＣＶ）により、ｐＡＰＰ基質溶液又はＮＰ基質溶液を送液状態のままで、参照極に対して−０．３Ｖと０．４Ｖとの間で電位を変化させ、電気化学的応答を測定した。
【００４９】
１−１０．測定結果
（１）ＨＢｓ抗原（測定対象化合物）の存在に基づく酸化電流の検出（基質の比較）
測定結果の１例としてＣＮＴ作用極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原濃度０Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図９に、ＨＢｓ抗原濃度１５Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図１０に、またＣＮＴ作用極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原濃度０Ｕ／ｍＬ及び１５Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図１１、図１２にそれぞれ示す。
【００５０】
ＨＢｓ抗原濃度が１５Ｕ／ｍＬの場合、参照極に対して＋０．１３０Ｖの電位（酸化電位）にて、ｐＡＰの酸化反応に伴う酸化電流として、８５８５ｎＡの酸化電流が検出（図１０）され、参照極に対して−０．１１７Ｖの電位（酸化電位）にて、ナフトールの酸化反応に伴う酸化電流として、２９１．９ｎＡの酸化電流が検出（図１２）されたのに対し、ＨＢｓ抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの場合（図９、図１１）、同様の酸化電流は検出されなかった。
【００５１】
（２）ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部を用いたｐＡＰＰ及びＮＰの測定結果
（２−１）電気化学的分析法による測定結果
ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部を用いたｐＡＰＰ及びＮＰの測定結果を表１に示す。酸化電流値は、市販カーボン電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは１６０．２ｎＡであり、ＮＰは４６．６４ｎＡである一方、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは８５８５ｎＡであり、ＮＰは２９１．９ｎＡであった。ｐＡＰＰおよびＮＰのいずれにおいても、ＣＮＴ電極の方が高い感度を示した。
【００５２】
（２−２）化学発光法による測定結果
さらに、一般的に、ＣＮＴ電極の方が市販カーボン電極よりも表面積が大きいと考えられるため、各電極部におけるＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量（固定化量）の影響を取り除くため、それぞれの固定化量当りの酸化電流値を用いて比較を行った。
まず、化学発光法により、固定化量を測定した。各ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極上のＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量を比較するため、化学発光法を用いた。具体的には各ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極をＣＤＰｓｔａｒ溶液（ＡＢＩ社製）に浸漬させて、ＣＣＤカメラ（ORCA II ER：浜松ホトニクス社製）にて１０分間撮影し、その発光量積算値からＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量を比較した。
【００５３】
結果を表１に示す。ｐＡＰＰを使用した場合、ＣＮＴ電極においては、４２４０ｋｃｏｕｎｔを検出し、市販カーボン電極においては、１８３０ｋｃｏｕｎｔを検出した。これにより固定化量あたりの酸化電流値（酸化電流値／化学発光量）を求めると、市販カーボン電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは０．０８７５であり、ＮＰは０．０２５５である一方、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは２．０２４８であり、ＮＰは０．０６８８であった。
【００５４】
（２−１）の結果から、それぞれの固定化量当りの酸化電流値を用いて比較を行うと、市販カーボン電極を使用した場合には、ｐＡＰＰはＮＰに対して、約３．４倍の強度の酸化電流値を示すのに対し、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰはＮＰに対して、約３０倍の強度の酸化電流値を示すことがわかった。
このことから、電気化学分析法において、ＣＮＴを作用極とし、かつ基質としてｐＡＰＰを用いた場合には、表面積の効果だけでは考えられない著しい感度の上昇を示すことがわかった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
（３）ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部によるｐＡＰの測定結果
ＡＬＰによって生成するｐＡＰが作用極部に存在していれば、シグナルを検出できるか否かを検討した。比較実験として、ＡＬＰの固定化されていないＣＮＴ電極部及びＡＬＰの固定化されていない市販カーボン電極部を用いてｐＡＰ溶液を測定した結果を、表２に示す。
この表において、それぞれの酸化電流値を比較すると、ＣＮＴ電極部を用いた場合は、市販カーボン電極部を用いた場合に比べて、約１．６倍の強度の酸化電流値しか示さない。
一方、表１に示す通り、ＡＬＰ標識複合体がＣＮＴ作用極及び市販カーボン作用極に固定化された場合を比較すると、ＣＮＴ電極部を用いた場合は、市販カーボン電極部を用いた場合に比べて約３０倍以上の強度の酸化電流値を示すことから、ＡＬＰ標識複合体がＣＮＴ作用極近傍（あるいは上）に固定化されていることが重要であることが分かった。
【００５７】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の分析方法は各種分析対象物質の、例えば、免疫学的反応測定の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明におけるＣＮＴ作用極上での反応を模式的に示す説明図である。
【図２】本発明の別の態様におけるＣＮＴ作用極上での反応を模式的に示す説明図である。
【図３】実施例１で作製した電極部の構造を模式的に示す斜視図である。
【図４】実施例１で作製したＣＮＴ作用極のＳＥＭ写真である。
【図５】実施例１で作製したバイオセンサユニットの製造手順を模式的に示す説明図である。
【図６】図５に示すバイオセンサユニットの模式的平面図である。
【図７】図５に示すバイオセンサユニットの内部構造を模式的に示す断面図である。
【図８】図５に示すバイオセンサユニットを、試薬サーバー及び廃液サーバーと電気化学アナライザーとに接続した状態を模式的に示す斜視図である。
【図９】ＣＮＴ電極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝０Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１０】ＣＮＴ電極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝１５Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１１】ＣＮＴ電極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝０Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１２】ＣＮＴ電極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝１５Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気的分析方法に関する。なお、本明細書における「分析」には、分析対象物質の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象物質の量を定量的又は半定量的に決定する「測定」とが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査のような生体試料の分析においては、微量成分を測定する場合が多いため、検出感度や精度の高い分析方法が求められている。このような分析方法としては、特異的な相互作用、例えば、抗原抗体反応や酵素−基質反応を利用することに加え、更に、電気的分析手段を組み合わせることにより高い検出感度を達成することが試みられている。
【０００３】
また、電気的分析手段として、カーボンナノチューブ（以下、ＣＮＴと称することがある）電極を利用することが試みられている。
一方で、ＣＮＴにπ−π相互作用を介して、芳香族環（例えばピレン等）が吸着することは広く知られている（非特許文献１）。また、この原理を利用し、特異的な相互作用を分析する方法が試みられている。
【０００４】
例えば、ＣＮＴ電極を用いた測定法で、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を利用し、その基質としてナフチルホスフェート（ナフタレン環）を利用し、生成したナフトールを電気化学的に検出する方法（非特許文献２）や、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を標識酵素として利用し、その基質として過酸化水素、生成物ではなくメディエーターとしてハイドロキノンを利用する方法（非特許文献３）あるいは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を単なる酵素として利用し、その基質として過酸化水素、生成物ではなくメディエーターとしてフェノール類を利用する方法（非特許文献４）が報告されている。しかし、いずれもＣＮＴ電極特有の高い検出感度を達成することができず、実用化には至っていない。
【０００５】
また、最近、ＣＮＴ電極を用いた測定法で、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を利用し、その基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を利用し、生成したｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）を検出する方法（非特許文献５）が報告されている。しかし、この方法は、プレートを使用したバッチ式によるＥＬＩＳＡ法で実施することを試みており、プレート内で生成したｐＡＰを測定するために、反応液をＣＮＴ電極に移して検出するものであるため、操作が煩雑であり、正確性や感度の面で劣ることが予想された。
【０００６】
【非特許文献１】Chen,R.J. J.Am.Chem.Soc 2001,123,3838-3839
【非特許文献２】Lenihan JS, J Nanosci Nanotechnol. 2004 Jul;4(6):600-4.
【非特許文献３】Yu,X. Mol.BioSyst.2005,1,70-78
【非特許文献４】S. Korkut, Talanta 2008,76,1147-1152
【非特許文献５】P.J. Lamas-Ardisana, Anal.Chim. Acta 615 (2008) 30-38
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの従来技術が公知であるにもかかわらず、微量成分を測定するには、更に高い検出感度や精度が要求されている。本発明者は、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法において、前記標識酵素としてアルカリホスファターゼを用い、前記生成物が芳香環を一つのみ含み（あるいは、カーボンナノチューブ上に濃縮可能であり、）、前記複合体をカーボンナノチューブ上（に結合した状態）で形成させることにより、芳香環を一つのみ含む前記生成物はカーボンナノチューブ上に著しく濃縮され、電気化学的測定により、蓄積された前記生成物を分析することにより、検出感度や精度を飛躍的に向上させることができることを見出した。
なお、この際用いられるカーボンナノチューブとは、一様な平面のグラファイト以外のフラーレン、カーボンナノホーン等ナノカーボン構造体を含み、更に好ましくは、炭素によって作られるグラフェンシートが単層あるいは多層の同軸管状になった物質である。
従って、本発明の課題は、簡便な操作で、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
［１］被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、
カーボンナノチューブを感知部として用い、
前記標識酵素として加水分解酵素を用い、
前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である
ことを特徴とする分析方法、
［２］前記複合体が、前記感知部と連続して又は同領域に形成される、［１］の分析方法、
［３］前記複合体をカーボンナノチューブに結合した状態で形成させる、［１］又は［２］の分析方法、
［４］前記生成物が芳香環を含みかつ該芳香環が一つのみである物質である、［１］〜［３］の分析方法、
［５］前記加水分解酵素がアルカリホスファターゼである、［１］〜［４］の分析方法、
［６］前記生成物がｐ−アミノフェノールである、［１］〜［５］の分析方法、
［７］分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナー、標識酵素及び該標識酵素の基質、及びカーボンナノチューブを固定された感知部を含むキット、
［８］［１］〜［６］の分析方法に用いるための、［７］のキット
に関する。
【０００９】
なお、「カーボンナノチューブ上に濃縮される」とは、カーボンナノチューブへの結合、蓄積、吸着、取り込み、沈殿、析出、不溶化等を含み、これらは、前記生成物が生じる反応を流動的条件下で行っても容易にはカーボンナノチューブから脱離しない状態を意味する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析を実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の具体的な一態様として、図１に示す反応模式図に基づいて説明する。選択的相互作用として抗原抗体反応（サンドイッチ法）を利用し、抗原３を分析対象物として、カーボンナノチューブ上に前記抗原に特異的に反応する第一抗体２を固定化した感知部を作用極１として用い、前記抗原に特異的に反応する第２抗体をアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で標識したＡＬＰ標識第二抗体４を使用して、サンドイッチ複合体を形成させ、前記ＡＬＰの基質であるｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）を利用して以下に示す反応式１に基づく、ＡＬＰの酵素反応により、生じた生成物であるｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）がカーボンナノチューブ上に濃縮され、反応式２に基づく酸化還元電流を測定することにより、前記抗原量を決定する。
【００１２】
なお、電気化学的分析法として、上記作用極１に加え、対極、及び参照極を備えた電極部を用いるアンペロメトリック型分析法を使用し、具体的には、作用極、対極、参照極をポテンショスタットに接続し、参照極電位に対し、作用極電位を掃引し、カーボンナノチューブ上に濃縮されたｐ−アミノフェノールの酸化に伴い発生する酸化電流を測定する。
【００１３】
【化１】
［式中、ｐＡＰＰはｐ−アミノフェニルホスフェートであり、ｐＡＰはｐ−アミノフェノールであり、ｐＱＩはｐ−キノンイミンである］
【００１４】
本発明で利用することのできる選択的相互作用は、一方が分析対象物質となることができる相互作用であって、被検試料中の分析対象存在量に相関して、複合体を形成することができる限り、特に限定されるものではなく、代表的なものとしては、例えば、抗原抗体反応、核酸間ハイブリダイゼーション反応、核酸−タンパク質間相互作用、レセプタ−リガンド間相互作用、タンパク質間相互作用（例えば、ＩｇＧとプロテインＡとの反応）、低分子−タンパク質間相互作用（例えば、ビオチンとアビジンとの反応）を挙げることができる。
【００１５】
また、前記相互作用以外にも、選択的相互作用を示す特異的パートナーが存在する種々の物質が公知であり、分析対象物質としては、例えば、タンパク質（酵素、抗原／抗体、レクチン等）、ペプチド、脂質、ホルモン（アミン、アミノ酸誘導体、ペプチド、タンパク質等からなる含窒素ホルモン、及びステロイドホルモン）、核酸、糖鎖（例えば、糖、オリゴ糖、多糖等）、薬物、色素、低分子化合物、有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、又は、ウィルス若しくは細胞を構成する分子、血球などが挙げられる。
【００１６】
例えば、選択的相互作用として抗原抗体反応を利用する場合には、分析対象物質とその特異的パートナーとの組合せは、抗原（分析対象物質）と抗体（特異的パートナー）との組合せ、あるいは、抗体（分析対象物質）と抗原（特異的パートナー）との組合せとなる。
【００１７】
アルカリホスファターゼによる標識化物を含めた試薬構成は、その利用する選択的相互作用に基づいて、適宜選択することができ、例えば、抗原抗体反応を利用する場合には、各種公知方法、例えば、サンドイッチ法、二段階法、競合法、阻害法等を利用することができる。サンドイッチ法の場合には、図１に示すように、固定化パートナーと標識パートナーの組合せを用いることができる。二段階法の場合には、固定化パートナー、未標識パートナー、前記未標識パートナーにのみ特異的に反応する物質の標識化物の組合せ、具体的には、一次抗体／標識化二次抗体を用いる方法、ビオチン化抗体／標識化アビジンを用いる方法などを用いることができる。競合法の場合には、分析対象物質（標準物質）の標識化物（既知量）と固定化パートナーの組合せを用いることができる。
【００１８】
前記被検材料としては、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、大便、汗、粘液、涙、随液、鼻汁、頸部又は膣の分泌液、精液、胸膜液、羊水、腹水、中耳液、関節液、胃吸引液、組織・細胞等の抽出液や破砕液等の生体液を含むほとんど全ての液体試料が用いられる。
【００１９】
前記標識物質としては、それが関与する反応による生成物が電気化学的に分析可能であり、かつ芳香環一つのみを含む物質を産生し得る酵素であれば、特に限定されるものではないが、具体的には、ホスファターゼ、エステラーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、更に好ましくはアルカリホスファターゼが挙げられる。
【００２０】
本発明で用いるカーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質は、前記標識物質による加水分解反応等により生じる物質であり、かつカーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質であり、電気化学的に分析可能である限り、特に限定されるものではないが、好ましくはカーボンナノチューブの内径又は曲率と比較してサイズが小さい物質であり、更に好ましくは芳香環を一つのみ含む物質である。
【００２１】
具体的な生成物としては、ｐ−アミノフェノール、アミノフェノール、クロロフェノール、メトキシフェノール、ジメトキシフェノール、アセトアミドフェノール、メチルフェノール、ジメチルフェノール、ヒドロキノン、レゾルシノール、カテコール、及びこれらの構造異性体等のフェノール類、ベンゾキノン及びこれらの構造異性体等のキノン類が挙げられ、好ましくはｐ−アミノフェノールである。
【００２２】
前記基質としては、これらのリン酸化された物質を用い、それ自体はＣＮＴに反応しないか反応が弱いことが望ましく、好ましくは、アルカリホスファターゼの基質として、ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）を用いると良い。
【００２３】
カーボンナノチューブ上に電気化学的に分析可能な物質が濃縮され、従来法と比較して、検出感度や精度を飛躍的に高めることができる理由は、現時点では必ずしも判明していないが、本発明者は以下の機構を推測している。なお、本発明は、以下の推測に限定されるものではない。
【００２４】
例えば、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐ−ＡＰＰ）を利用した場合、生成物であるＰ−アミノフェノール（ｐ−ＡＰ）はカーボンナノチューブとの間にπ−π相互作用や疎水的相互作用を持つと同時に、ｐ−アミノフェノールは芳香環を一つしか持たないため、カーボンナノチューブの内径又は曲率と比較してもサイズ的に小さく、カーボンナノチューブの様な微細構造を持つ炭素担体に対して、取り込まれ、このことにより、カーボンナノチューブ上に濃縮されると推測される。また、カーボンナノチューブの近くで、生成物を生成させることで、濃縮が著しく促進されると推測される。
【００２５】
これは実施例で示した通り、カーボンナノチューブ電極を用いて、標識酵素としてアルカリホスファターゼ、基質としてナフチルホスフェートを利用して、生成したナフトールを電気化学的に検出する場合や、市販カーボン電極を用いて、標識酵素としてアルカリホスファターゼ、基質としてｐ−アミノフェニルホスフェートを利用して、生成したｐ−アミノフェノールを電気化学的に検出する場合、また、酵素反応と同時ではなく、ｐ−アミノフェノールをＣＮＴ電極で電気化学的に検出す場合には、検出感度や精度を飛躍的に高めることができないことから推測される。
【００２６】
本発明で用いるカーボンナノチューブを感知部に用いる場合とは、一般的なＣＮＴ電極を意味し、具体的には、電極部は絶縁性の基板上に少なくとも対極と該感知部であるカーボンナノチューブを含む作用極を有するアンペロメトリック型電極であり、好ましくは更に参照極を有し、前記電極部における電荷の変化を電流変化として捉えることにより、分析対象物質を検出するようになっている。
なお、電流の変化を捉える方法としては、電流測定の他、サイクリックボルタノメトリー、微分パルスボルタノメトリー、微分パルスアンペロメトリー、クロノアンペロメトリー等、広く知られた方法を用いることができる。
【００２７】
また、別の態様として、電極部は絶縁性の基板上にカーボンナノチューブを含む電極及び参照極を有し、前記電極１がゲート自身又はゲートと通電可能な状態にある導電性電極を有する電界効果トランジスタであるボルタノメトリック型電極であり、前記ゲート自身又はゲートと通電可能な状態にある導電性電極における電荷の変化を電圧（電位）変化として捉え、ソース電極とドレイン電極との間に流れる電流値の変化を検出することにより、分析対象物質を検出するようになっている。この時、参照極は前記電極の表面で起こる電圧（電位）変化を安定に測定するため、基準となる電位を与え、通常は銀・塩化銀電極等と広く知られた電極を適宜用い、参照極に所定の電圧を交流もしくは直流で印加することにより、電解効果トランジスタの電気化学的特性の動作点を調整することができる。この時、電界効果トランジスタの代わりに薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）、単電子トランジスタ（ＳＥＴ）を用いても良い。
【００２８】
本発明で用いる電気化学的分析方法とは、前記記載のアンペロメトリック型電極又はボルタノメトリック型電極を用いた分析法であり、カーボンナノチューブを感知部として用いた場合、カーボンナノチューブを含む感知部上に濃縮可能な物質が起こすカーボンナノチューブ上での電荷の変化を電流の変化として捉える分析、カーボンナノチューブ上での電荷の変化を電圧（電位）の変化として捉える分析、カーボンナノチューブ上での電荷の変化を電気的抵抗（又はインピーダンス）の変化として捉える分析などが含まれる。
【００２９】
カーボンナノチューブを感知部として用いる場合、例えば、図２に示すように、分析対象物質（抗原）３と選択的に相互作用する特異的パートナー（第一抗体）２が、感知部（作用極）１とは別の複合体形成用担体（粒子）５に固定化されているが、該感知部と該複合体形成用担体とが、仕切りで隔てられていたり、その間の生成物の移動に操作が必要とされていたりすることなく、連続していると良い。
例えば、図２に示すように、複合体形成用粒子上に、第一抗体−抗原−ＡＬＰ標識第二抗体４からなる複合体を形成し、近接したカーボンナノチューブに濃縮された生成物（ｐＡＰ）を電気化学的に測定を行うことが挙げられる。
【００３０】
また、カーボンナノチューブを感知部として用いる場合の別の態様としては、分析対象物質と選択的に相互作用する特異的パートナーは、そこで形成される複合体と感知部が同領域に配置されるように、感知部にあればどこでも良く、好ましくはカーボンナノチューブに固定化された態様（例えば、図１）が挙げられる。選択的相互作用反応により該複合体を形成した後、近接したカーボンナノチューブに濃縮された生成物を電気化学的に測定を行うことができれば良い。
【００３１】
特異的パートナー及び／又は標識酵素のカーボンナノチューブへの固定化法は直接的に固定するもの、あるいは間接的に固定するものなどの制限は無く、選択的相互作用反応の性質に合わせて、任意の方法を使用することができる。例えば、カーボンナノチューブに直接的に物理吸着や共有結合で結合させても良いし、あらかじめカーボンナノチューブにアンカー部を有するフレキシブルスペーサーを介して間接的に結合させても良く、これらはChemical Reviews 2006年 106巻、1105-1136等に記載され、広く知られている方法を選択することができる。また、国際公開第ＷＯ ２００６／０３８４５６号記載の高分子ポリマー等を利用してカーボンナノチューブに固定化しても良い。
【００３２】
また、該特異的パートナー及び／又は標識酵素をカーボンナノチューブに固定化した後、牛血清アルブミン、ポリエチレンオキシドまたは他の不活性分子により表面を処理したり、特定物質の固定化層の上に付着層で被覆することにより非特異的反応を抑制したり、透過することのできる物質を選択したり、制御したりすることもできる。
【００３３】
本発明に用いるカーボンナノチューブとしては、例えば、炭素原子のみからなり、直径が０．４〜５０ｎｍ、長さが約１〜数１００μｍの一次元性のナノ材料であることが好ましい。
【００３４】
前記カーボンナノチューブは、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴｓ；single-walled carbon nanotubes）であることが好ましい。カーボンナノチューブの化学構造はグラファイト層を丸めてつなぎ合わせたもので表されるが、「単層カーボンナノチューブ」とは、このグラファイト層の数が１枚だけのものである。なお、グラファイト層の巻き方（らせん度）に依存して電子構造が金属的になったり、半導体的になったりすることが知られている。前記構成によれば、直径が小さいため、より高密度に成長でき、その結果、表面積が格段に増加することができる。更に、結晶性も良いため、物質を表面に固定化しやすいという利点がある。
【００３５】
また、カーボンナノチューブを形成する技術は、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されないが、アーク放電法、レーザーアブレーション法、化学気相成長法（ＣＶＤ法）、例えば、熱化学気相成長法やプラズマ化学気相成長、ＨｉＰＣＯ法、スーパーグロースＣＶＤ法などの他、液相合成法などが挙げられる。カーボンナノチューブをアンペロメトリック型の感知部として用いる場合、又はボルタノメトリック型のゲートと通電可能な状態にある感知部として用いる場合として用いる場合は、予め上記の方法にて合成したカーボンナノチューブを電極上に塗布等により固定しても良く、好ましくは金属表面から、直接成長させ、感知部であり、かつ電極として用いることが好ましく、例えば、特開２００８−６４７２４号記載の熱化学気相成長法等の化学気相成長法を用いて金属表面から直接成長させることが好ましい。これにより、電気的・機械的に金属表面と良好に接触し、電極の性能と安定性を劇的に向上させることができる。
【００３６】
また、カーボンナノチューブ電極は、リソグラフィーの方法を用いて、数ミクロンの金属表面上に形成することができるため、特許第２５９０００２号記載のくし形金属表面上に形成させても良い。また、複数個同時に１つの基板上に形成することができ、これにより、同時複数項目計測が容易になる。
また、カーボンナノチューブをボルタノメトリック型のゲート部として用いる場合、例えば、国際公開ＷＯ ２００６／０２５４８１号等記載の方法により、形成することができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
《実施例１：Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓ抗原）の測定（ＣＮＴ−ＡＬＰ系）》
１−１．カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）作用極をもつ電極部、感知部の作製
図３に示すパターンからなる電極部を「Electrochemistry Communications 9, 2007, 13-18」記載の方法に基づき作製した。即ち、ＳｉＯ２／Ｓｉ基板上にフォトリソグラフィー法により、Ｐｔ電極部をパターニングした後、作用極（作用極下地面積：４ｍｍ２）上に触媒を塗布し、熱化学気相成長（熱ＣＶＤ）法により、ＣＮＴ作用極２１を作製した。また、電極部の一部に銀・塩化銀インク（ＢＡＳ社製）を塗布することにより、参照極２２を作製し、ＣＮＴ作用極、対極２３、参照極を備えた電極部２６を作製した。ＣＮＴ作用極、対極、参照極の反対側の端部は、接続用コネクター２４として機能し、電極部と接続用コネクターはリード部２５で結ばれ、電極部と接続用コネクター部以外は絶縁膜により覆った。
なお、ＣＮＴ作用極を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した結果を図４に示す。
【００３９】
１−２．抗ＨＢｓモノクローナル抗体がＣＮＴ作用極上に固定化された感知部の作製
次に、上記電極部のＣＮＴ作用極上に、０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にＨＢｓ抗原に対する抗体である抗ＨＢｓモノクローナル抗体（ＩｇＧ：自社製）１ｍｇ／ｍＬを含む水溶液２μＬを適下し、３７℃、飽和水蒸気圧下で３０分間固定化させた。その後、溶媒を２５℃、湿度４０％の条件下で、１時間乾燥、真空デシケーター内で室温にて２時間乾燥させた後、１％カゼイン（和光純薬社製）含有０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ／０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ水溶液（ＳＩＧＭＡ社製、ｐＨ８．０）中に３０分間振とう下、浸漬させて、未反応部をブロッキングし、さらに、脱塩水を用いて基板を洗浄後乾燥し、電極部に特定物質として抗ＨＢｓモノクローナル抗体が固定化された感知部として用いた。
【００４０】
１−３．市販カーボン電極を作用極とした電極部、感知部の作製（対照実験用カーボン電極部）
次に、ＣＮＴ作用極の効果を調べるため、市販カーボン電極（EP-P DEP Chip：北斗科学産業社製）を用い、上記の項目１−２と同様の方法にてEP-P DEP Chipのカーボン作用極上に抗ＨＢｓモノクローナル抗体を固定し、電極部に特定物質として抗ＨＢｓモノクローナル抗体が固定化された感知部として用いた。
【００４１】
１−４．アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）溶液の作製
抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（自社製）、ＡＬＰ（ロシュ社製）、架橋試薬（Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate：ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて、「高感度酵素免疫測定法（石川栄治：学会出版センター、１９９３）」記載のマレイミド・ヒンジ法に基づき、ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）を作製した。得られた酵素標識抗体［ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体（Ｆａｂ’）］を０．１％カゼイン及び０．１５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを含む０．１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）（以下、緩衝液Ａと称する）にて所定の濃度に調整した溶液を、ＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体溶液とした。
【００４２】
１−５．ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ）基質溶液の作製
２ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−アミノフェニルホスフェート（ｐＡＰＰ：Universal sensors社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ｐＡＰＰ基質溶液とした。
【００４３】
１−６．２−ナフチルホスフェート（ＮＰ）基質溶液の作製（対照実験用）
２ｍｍｏｌ／Ｌ ２−ナフチルホスフェート（ＮＰ：Alfa Aesar社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ＮＰ基質溶液とした。
【００４４】
１−７．ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ）溶液の作製（対照実験用）
０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ ｐ−アミノフェノール（ｐＡＰ：和光純薬社製）、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４を含む０．０５ｍｏｌ／Ｌジエタノールアミン溶液（ｐＨ９．４）を作製し、ｐＡＰ溶液とした。
【００４５】
１−８．ＡＬＰ標識抗ＨＢｓウサギポリクローナル抗体−ＨＢｓ抗原−抗ＨＢｓモノクローナル抗体複合体（ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体）固定化電極部の作製
上記項目１−２で作成した抗ＨＢｓモノクローナル抗体固定化電極部を、ＨＢｓ抗原溶液［ＨＢｓ抗原（組換え品、サブタイプａｄｗ：自社製）を緩衝液Ａにて所定濃度に調整した溶液］及びＡＬＰ標識抗ＨＢｓ抗体溶液（２μｇ／ｍＬ）を１：１の割合で混合した溶液中に振とう下、浸漬させて、７分間反応させた後、脱塩水を用いて、電極を洗浄・風乾して、ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極とした。
【００４６】
１−９．流路の作製と流動条件制御装置の構築及び電気化学アナライザーによるＨＢｓ抗原の測定
図５〜図７に示すバイオセンサユニットを作製した。図５〜図７に示すように、反応溶液の液入口３２、液出口３３としてガラス板の２ヶ所に穴（開口部）を開けたウインドー（window）３１と、上記１−８で作製したＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極部３７を備えた基板３６とを用いて、両面テープ（厚み０．６４ｍｍ：３Ｍ社製）を縦長の流路の形状に切り抜くことにより作製したガスケット３４を上下から挟むことにより、中空状態の流路３５の作製を行い、流路内に各電極部を保持させ、バイオセンサユニット４１とした。
【００４７】
次に、バイオセンサユニット４１の流路入口に、図８に示すように、試薬（基質溶液）サーバー４２及びポンプ４３をチューブにより接続し、流路出口に廃液サーバー４４を接続し、流速３６０μＬ／ｍｉｎにて、流路内に試薬サーバーから上記１−５又は１−６で作製した基質溶液を入口から出口方向へ流し、３分後にその送液状態を維持したまま、以下に示す条件にて、電気化学的測定を行った。
【００４８】
また、電気化学的測定は、図８に示すように、作用極、参照極、対極の各接続用コネクター４５を電気化学アナライザー（モデル８３２Ａ：ＡＬＳ社製）４６にそれぞれ接続し、サイクリックボルタノメトリー法（ＣＶ）により、ｐＡＰＰ基質溶液又はＮＰ基質溶液を送液状態のままで、参照極に対して−０．３Ｖと０．４Ｖとの間で電位を変化させ、電気化学的応答を測定した。
【００４９】
１−１０．測定結果
（１）ＨＢｓ抗原（測定対象化合物）の存在に基づく酸化電流の検出（基質の比較）
測定結果の１例としてＣＮＴ作用極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原濃度０Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図９に、ＨＢｓ抗原濃度１５Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図１０に、またＣＮＴ作用極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原濃度０Ｕ／ｍＬ及び１５Ｕ／ｍＬの場合のＣＶ測定結果を図１１、図１２にそれぞれ示す。
【００５０】
ＨＢｓ抗原濃度が１５Ｕ／ｍＬの場合、参照極に対して＋０．１３０Ｖの電位（酸化電位）にて、ｐＡＰの酸化反応に伴う酸化電流として、８５８５ｎＡの酸化電流が検出（図１０）され、参照極に対して−０．１１７Ｖの電位（酸化電位）にて、ナフトールの酸化反応に伴う酸化電流として、２９１．９ｎＡの酸化電流が検出（図１２）されたのに対し、ＨＢｓ抗原濃度が０Ｕ／ｍＬの場合（図９、図１１）、同様の酸化電流は検出されなかった。
【００５１】
（２）ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部を用いたｐＡＰＰ及びＮＰの測定結果
（２−１）電気化学的分析法による測定結果
ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部を用いたｐＡＰＰ及びＮＰの測定結果を表１に示す。酸化電流値は、市販カーボン電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは１６０．２ｎＡであり、ＮＰは４６．６４ｎＡである一方、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは８５８５ｎＡであり、ＮＰは２９１．９ｎＡであった。ｐＡＰＰおよびＮＰのいずれにおいても、ＣＮＴ電極の方が高い感度を示した。
【００５２】
（２−２）化学発光法による測定結果
さらに、一般的に、ＣＮＴ電極の方が市販カーボン電極よりも表面積が大きいと考えられるため、各電極部におけるＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量（固定化量）の影響を取り除くため、それぞれの固定化量当りの酸化電流値を用いて比較を行った。
まず、化学発光法により、固定化量を測定した。各ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極上のＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量を比較するため、化学発光法を用いた。具体的には各ＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体固定化電極をＣＤＰｓｔａｒ溶液（ＡＢＩ社製）に浸漬させて、ＣＣＤカメラ（ORCA II ER：浜松ホトニクス社製）にて１０分間撮影し、その発光量積算値からＡＬＰ標識ＨＢｓ複合体の量を比較した。
【００５３】
結果を表１に示す。ｐＡＰＰを使用した場合、ＣＮＴ電極においては、４２４０ｋｃｏｕｎｔを検出し、市販カーボン電極においては、１８３０ｋｃｏｕｎｔを検出した。これにより固定化量あたりの酸化電流値（酸化電流値／化学発光量）を求めると、市販カーボン電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは０．０８７５であり、ＮＰは０．０２５５である一方、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰは２．０２４８であり、ＮＰは０．０６８８であった。
【００５４】
（２−１）の結果から、それぞれの固定化量当りの酸化電流値を用いて比較を行うと、市販カーボン電極を使用した場合には、ｐＡＰＰはＮＰに対して、約３．４倍の強度の酸化電流値を示すのに対し、ＣＮＴ電極部を用いた場合、ｐＡＰＰはＮＰに対して、約３０倍の強度の酸化電流値を示すことがわかった。
このことから、電気化学分析法において、ＣＮＴを作用極とし、かつ基質としてｐＡＰＰを用いた場合には、表面積の効果だけでは考えられない著しい感度の上昇を示すことがわかった。
【００５５】
【表１】
【００５６】
（３）ＣＮＴ電極部及び市販カーボン電極部によるｐＡＰの測定結果
ＡＬＰによって生成するｐＡＰが作用極部に存在していれば、シグナルを検出できるか否かを検討した。比較実験として、ＡＬＰの固定化されていないＣＮＴ電極部及びＡＬＰの固定化されていない市販カーボン電極部を用いてｐＡＰ溶液を測定した結果を、表２に示す。
この表において、それぞれの酸化電流値を比較すると、ＣＮＴ電極部を用いた場合は、市販カーボン電極部を用いた場合に比べて、約１．６倍の強度の酸化電流値しか示さない。
一方、表１に示す通り、ＡＬＰ標識複合体がＣＮＴ作用極及び市販カーボン作用極に固定化された場合を比較すると、ＣＮＴ電極部を用いた場合は、市販カーボン電極部を用いた場合に比べて約３０倍以上の強度の酸化電流値を示すことから、ＡＬＰ標識複合体がＣＮＴ作用極近傍（あるいは上）に固定化されていることが重要であることが分かった。
【００５７】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の分析方法は各種分析対象物質の、例えば、免疫学的反応測定の用途に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明におけるＣＮＴ作用極上での反応を模式的に示す説明図である。
【図２】本発明の別の態様におけるＣＮＴ作用極上での反応を模式的に示す説明図である。
【図３】実施例１で作製した電極部の構造を模式的に示す斜視図である。
【図４】実施例１で作製したＣＮＴ作用極のＳＥＭ写真である。
【図５】実施例１で作製したバイオセンサユニットの製造手順を模式的に示す説明図である。
【図６】図５に示すバイオセンサユニットの模式的平面図である。
【図７】図５に示すバイオセンサユニットの内部構造を模式的に示す断面図である。
【図８】図５に示すバイオセンサユニットを、試薬サーバー及び廃液サーバーと電気化学アナライザーとに接続した状態を模式的に示す斜視図である。
【図９】ＣＮＴ電極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝０Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１０】ＣＮＴ電極及びｐＡＰＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝１５Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１１】ＣＮＴ電極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝０Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【図１２】ＣＮＴ電極及びＮＰ基質溶液を用いて、ＨＢｓ抗原（抗原濃度＝１５Ｕ／ｍＬ）のＣＶ測定の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、
カーボンナノチューブを感知部として用い、
前記標識酵素として加水分解酵素を用い、
前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である
ことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記複合体が、前記感知部と連続して又は同領域に形成される、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記複合体をカーボンナノチューブに結合した状態で形成させる、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記生成物が芳香環を含みかつ該芳香環が一つのみである物質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記生成物がｐ−アミノフェノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナー、標識酵素及び該標識酵素の基質、及びカーボンナノチューブを固定された感知部を含むキット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法に用いるための、請求項７に記載のキット。
【請求項１】
被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識酵素とを含む複合体を形成させ、前記標識酵素の生成物を電気的に分析する方法であって、
カーボンナノチューブを感知部として用い、
前記標識酵素として加水分解酵素を用い、
前記生成物が、カーボンナノチューブ上に濃縮可能な物質である
ことを特徴とする分析方法。
【請求項２】
前記複合体が、前記感知部と連続して又は同領域に形成される、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記複合体をカーボンナノチューブに結合した状態で形成させる、請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記生成物が芳香環を含みかつ該芳香環が一つのみである物質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記加水分解酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記生成物がｐ−アミノフェノールである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項７】
分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナー、標識酵素及び該標識酵素の基質、及びカーボンナノチューブを固定された感知部を含むキット。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析方法に用いるための、請求項７に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１５６６０５（Ｐ２０１０−１５６６０５Ａ）
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３３４８４９（Ｐ２００８−３３４８４９）
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
【公開日】平成２２年７月１５日（２０１０．７．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月２６日（２００８．１２．２６）
【出願人】（５９１１２２９５６）三菱化学メディエンス株式会社 (45)
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