電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結された高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体及びその製造方法
【課題】生体内で標的部位へのｓｉＲＮＡ送達効率が高く、比較的低い濃度の投与でも治療用ｓｉＲＮＡを生体内の癌組織などの標的部位に効率的に送達することができ、各種疾病の治療のために広範囲に使用することのできる高分子−ｓｉＲＮＡ担体及びその製造方法を提供する。
【解決手段】本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、高分子（Ａ）とｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結されたＡ−Ｂの構造を有する。ここで、Ａは正電荷と官能基とを有する高分子であり、Ｂは片末端又は両末端に官能基を有するｓｉＲＮＡである。
【解決手段】本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、高分子（Ａ）とｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結されたＡ−Ｂの構造を有する。ここで、Ａは正電荷と官能基とを有する高分子であり、Ｂは片末端又は両末端に官能基を有するｓｉＲＮＡである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子にｓｉＲＮＡが結合された高分子−ｓｉＲＮＡ担体及びその用途に関し、より詳細には、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されることで安定した高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療のコア技術は、強い負電荷を帯びているオリゴヌクレオチドをどのようにして所望の組織内に送達するかに拠る。一般に、生きている細胞は、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドなどの巨大分子の透過性が非常に低い。一部の低分子量物質のみ非常に低い割合で生きている細胞の細胞膜を通過して細胞内部の細胞質又は核に入り込むことができるため、タンパク質又はオリゴヌクレオチドを含む巨大分子を送達する上で制限要因となっている。このような問題を克服するための様々な遺伝子担体及びその送達方法に関する研究が行われてきた。各種ウイルスを用いた送達法がそのうちの１つである。ウイルスを用いた送達法は、送達効率の面では優れているが、ウイルス遺伝子による宿主の遺伝子発現機能への影響及び発癌可能性により、臨床適用には問題があった。よって、ウイルスの高いトランスフェクション効率を維持し、かつ体内での安定した遺伝子送達を可能にする担体の開発が求められている。
【０００３】
細胞で特定の遺伝子の発現を阻害するのに卓越した効果を発揮するものとして「ＲＮＡ干渉（RNA interference; RNAi）」が遺伝子治療分野で脚光を浴びている。ｓｉＲＮＡの高い活性及び精密な遺伝子選択性により過去２０年間研究され、現在治療剤として活用されているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に代替する治療剤として期待されている。そこで、現在３０社以上の製薬会社と生命工学会社がｓｉＲＮＡに基づく治療剤の開発に取り組んでいる。特に、糖尿病、肥満、リウマチ、パーキンソン病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ、癌などの疾病を治療するためのｓｉＲＮＡ関連治療剤を開発済み又は開発中である。
【０００４】
ｓｉＲＮＡは、約１９〜２３個のヌクレオチドからなる短い二本鎖ＲＮＡであり、これらと相補的な塩基配列を有する標的遺伝子のｍＲＮＡを標的として遺伝子発現を抑制する。すなわち、特定の遺伝子の発現代謝過程を調節するｍＲＮＡを特異的に分解し、標的遺伝子のタンパク質合成を中断させて疾病を治療する。そこで、強い負電荷を帯びているｓｉＲＮＡを生体内に送達するために、カチオン性リポソームやミセル及びカチオン性高分子を使用した担体が研究されている。ｓｉＲＮＡは、安定性が低いため、生体内で血漿に大量に存在する様々な分解酵素により短時間で分解され、特に注射治療剤の場合、化学的に安定して処理されないとより速く破壊され、ｓｉＲＮＡが有するアニオン性により、同様に負電荷を帯びている細胞膜を透過することが難しく、結果として、細胞内への送達性が低下し、その治療効率が急激に低下するという問題があった。ｓｉＲＮＡは、二本鎖からなるものの、ＲＮＡを構成するリボース糖の結合はＤＮＡを構成するデオキシリボース糖の結合に比べて化学的に非常に不安定であり、ほとんどが生体内での半減期が約３０分と速く分解されてしまう。また、生体内でｓｉＲＮＡを外部物質と認識して免疫系に副作用を起こすことがある。さらに、ｓｉＲＮＡがもともと意図していた遺伝子部位ではなく、他の部位の遺伝子に影響し、遺伝子塩基配列にクロスハイブリダイゼーションを起こすことがあるという問題があった。
【０００５】
よって、生体内で容易に分解される低い安定性により治療効率が急激に低下する、このようなｓｉＲＮＡの欠点を克服すると共に、体内透過が可能になるように負電荷を中和することのできる担体の開発が重要である。治療剤としてのｓｉＲＮＡ担体は、体内循環性と特定の疾患部位への特異的な蓄積性を有することが好ましく、体内で適切に生分解されなければならない。生体由来高分子の１つであるグリコールキトサンは、生体適合性及び生分解性と優れた癌特異的蓄積性により、優れた抗癌剤担体として既に知られている。本研究室では、グリコールキトサンにヌクレオチドと強力に結合するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加して、正電荷が補われたｓｉＲＮＡ担体（グリコールキトサン−ＰＥＩ）を開発した（特許文献１）。しかしながら、強い負電荷を帯びているｓｉＲＮＡと効果的な複合体を形成する上で、高分子が有する電荷だけでは結合力が不足する。
【０００６】
一方、低分子量ｓｉＲＮＡの低い生体内安定性を補うための高分子担体との効果的な結合を可能にするために、ｓｉＲＮＡの分子量自体を増加させようとする努力が報告されている。Ｊｅａｎ−Ｐａｕｌ Ｂｅｈｒグループは、ｓｉＲＮＡの３’末端にＤＮＡ配列を追加して製造したｓｔｉｃｋｙ ｓｉＲＮＡ（ｓｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ｓｉＲＮＡの生体内送達効率が増加したことを報告し（非特許文献１）、本研究室では、ｓｉＲＮＡの５’末端にチオール基を導入してｓｉＲＮＡ間のジスルフィド結合によりサイズを増加させたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを製造し、生体内安定性と遺伝子発現効果が増加したことを発表した（特許文献２、非特許文献２）。その他に、安定性を確保するためにサイズを増加させたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを製造する方法として架橋剤でジスルフィド結合を導入して多重結合のｓｉＲＮＡを製造した場合に標的遺伝子の発現が抑制されたという報告がある（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国特許出願第２００９−００４１４２８号
【特許文献２】韓国特許出願第２００９−００４２２７３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104 (41): 16050-16055
【非特許文献２】Journal of Controlled release, 2010. 141 (3): 339-346
【非特許文献３】Nature materials, 2010. 9: 272-278
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は、効果的な遺伝子治療剤として使用できるｓｉＲＮＡの生体内安定性と標的部位への送達効率を高めるために、生体適合性に優れた高分子とｓｉＲＮＡを、電荷結合により連結すると共に、生分解性共有結合により連結した、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を製造した。より詳細には、ｓｉＲＮＡ、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、又は多重結合のｓｉＲＮＡを、適切な正電荷を有しかつ反応基を含む高分子と電荷結合させると共に、ｓｉＲＮＡの末端に形成された反応基と共有結合させることにより、疾病細胞の特定のタンパク質の発現を遮断して様々な疾病の治療に適用できる新規なナノ担体である高分子−ｓｉＲＮＡ担体を開発した。
【００１０】
本発明は、前述のような問題を解決するためになされたものであり、ｓｉＲＮＡの生体内安定性及び送達効率を高めることのできる新規なｓｉＲＮＡ担体又は前記ｓｉＲＮＡ担体を含む薬物組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、高分子とｓｉＲＮＡを電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合させたｓｉＲＮＡ担体を提供する。
【００１２】
また、本発明は、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を含むことを特徴とする薬物組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されているため、ｓｉＲＮＡを標的疾病の細胞又は組織に安定して送達することができる。従って、標的部位に選択的にｓｉＲＮＡが蓄積されて特定の疾病タンパク質の発現を遮断できるため有用である。
【００１４】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、癌やその他の疾病モデルに適用できるため、今後広範囲な疾病の治療のための治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で架橋剤を用いてアミンを有するグリコールキトサンに−ＳＨ（チオール基）を導入してチオール化グリコールキトサン（Thiolated Glycol Chitosan; TGC）を製造する過程を示す模式図である。
【図２】実施例２で両末端基が−ＳＨ（チオール基）であるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとチオール化グリコールキトサン（ＴＧＣ）を反応させてジスルフィド結合及び電気的結合による複合体を形成する過程を示す模式図である。
【図３】実施例２のｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとグリコールキトサン又はチオール基の導入の程度が異なるＴＧＣとの複合体が形成されたか否かを示す図である。
【図４】実施例２の図２に示す方法で製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣの結合がなされたか否かを確認するためにＤＴＴ（ジチオスレイトール）で処理して電気泳動したものを示す図である。
【図５】実施例３で製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣ（ＴＧＣ２、ＴＧＣ３、５：１の重量比）で製造された複合体ナノ粒子による細胞での遺伝子発現抑制効果の結果を示す写真である。
【図６】実施例４の方法で近赤外線蛍光物質（Ｃｙ５．５）で修飾されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを用いて製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体のマウスの組織蓄積性及び時間による体内循環性を示すものである。
【図７】実施例５の方法でｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体のマウス癌組織に対する遺伝子発現抑制能の実験結果、すなわちｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体によるモデル標的タンパク質であるＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）の発現が著しく減少したことを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ｓｉＲＮＡを生体内で効率的に送達するために、高分子とｓｉＲＮＡを結合して製造されたｓｉＲＮＡ担体を提供するが、前記ｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されたことを特徴とする。
【００１７】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、高分子と様々な形態のｓｉＲＮＡを結合して製造されるものであり、前記結合は、電荷結合と生分解性共有結合とによるものであって、その構造は次のように表される。
【００１８】
Ａ−Ｂ（Ａ：高分子、Ｂ：様々な形態のｓｉＲＮＡ）
前記Ａは、電荷と官能基とを有する高分子である。具体的には、生体適合性を有する全ての高分子を使用することができ、特に、疾病組織への蓄積効率が高く、薬物担体として使用される生体高分子であるキトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、デキストラン、ヒアルロン酸、アルブミン、又はこれらの化学的誘導体のうち、正電荷と官能基を同時に有するものであれば、特に使用に制限はない。合成高分子としては、ＰＥＩ（polyethylenimine）、ＰＬＧＡ（poly lactic glycolic acid）、及びポリ−Ｌ−リジン（poly-L-lysine）などを使用することができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１９】
前記Ｂは、様々な形態のｓｉＲＮＡであり、単量体ｓｉＲＮＡであってもよく、高分子ｓｉＲＮＡ（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、多量体ｓｉＲＮＡ）であってもよい。前記ｓｉＲＮＡは、１５〜３０個のヌクレオチド単量体ｓｉＲＮＡであるか、又はその重合体である１００〜４００個のヌクレオチドからなる多量体ｓｉＲＮＡであることが好ましい。前記ｓｉＲＮＡの鎖は、分子量１０，０００〜１，０００，０００から選択されることが好ましい。前記ｓｉＲＮＡの配列としては、治療目的のＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）、ＮＦ−ｋＢ、熱ショックタンパク質、熱ショック因子などの配列を用いることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。下記実施例では、ｓｉＲＮＡの送達効能を蛍光で確認するために、ＲＦＰに対するｓｉＲＮＡ塩基配列を用いた。
【００２０】
前記Ａと前記Ｂとは、電荷結合及び生分解性共有結合により連結される。前記電荷結合は、負電荷を帯びているｓｉＲＮＡと正電荷を帯びている高分子間の電荷結合である。両親媒性高分子ナノ粒子の外部に物理的にｓｉＲＮＡを結合する方法は、化学的結合の最大積荷量が約１０％に制限されるのに対して、最大積荷量が９５％と格段に高いため、化学的結合の限界を克服して薬物含有量を大幅に増やすことができる。
【００２１】
前記生分解性結合には、ジスルフィド結合、エステル結合、無水物結合（アンヒドリド結合）、ヒドラゾン結合、酵素特異的ペプチド結合などがあるが、必ずしもこれに限定されるものではない。このような生分解性結合は、特定の生体環境下で分解が可能である。生体環境下で様々な酵素や酸度で生分解される本発明のｓｉＲＮＡと高分子の生分解性結合は、生体内の特定の酵素などにより分解された場合、分離されたｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能である。例えば、生分解性共有結合のための官能基としてチオール基がｓｉＲＮＡの末端と高分子の末端に導入された場合、ｓｉＲＮＡと高分子とはジスルフィド結合という生分解性結合を形成するが、生体内に前記ジスルフィド結合を有するｓｉＲＮＡと高分子ナノ粒子が導入されると、生体内に存在するグルタチオン（ＧＳＨ）によりｓｉＲＮＡが還元されて分離される。特に、癌細胞ではグルタチオン（ＧＳＨ）の濃度が増加するという報告を考慮すると、本発明の高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体のジスルフィド結合などの生分解性結合が癌組織中でも効果的に生分解されて、ｓｉＲＮＡを標的部位に効果的に送達できることが分かる。
【００２２】
高分子とｓｉＲＮＡの結合が電荷結合のみでなされる場合は、結合力が強くないため、ｓｉＲＮＡと結合して使用できる高分子の範囲が制限される。また、生体内で不安定であり、目的とする部位に到達する前に分離されるという問題があった。しかし、本発明のｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが、電荷結合により結合されると共に、化学的な生分解性共有結合により結合されるため、生体適合性がさらに向上し、ｓｉＲＮＡを標的部位に安定して送達することができるので、より優れている。
【００２３】
本発明のＡ（高分子）とＢ（ｓｉＲＮＡ）の結合によるｓｉＲＮＡ担体の製造は、次の方法により行ってもよい。
【００２４】
（ａ）正電荷を有する高分子に生分解性共有結合のための官能基を導入する段階
（ｂ）ｓｉＲＮＡの片末端又は両末端に官能基を導入するか、又は活性化する段階
（ｃ）前記段階（ａ）で製造した高分子と前記段階（ｂ）で製造したｓｉＲＮＡを電荷結合及び生分解性共有結合により安定して結合してナノ粒子を製造する段階
【００２５】
前記方法は、結合方式によっては各段階を同時に行ってもよい。前記方法で製造された高分子ナノ粒子は、水溶液中で効率的に様々な形態のｓｉＲＮＡと複合体を形成し、ナノサイズの自己集合体（self-assembly）を形成することができ、特定の疾病部位に選択的に蓄積される（例えば、新生血管標的型ＥＰＲ、癌・リウマチ・炎症性疾患）。前記のように製造された本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、サイズが１０〜２０００ｎｍであり、分子量が１０3〜１０7Ｄａであることが好ましい。
【００２６】
一方、本発明のｓｉＲＮＡ担体は、薬学的組成物の有効成分として使用することもできる。従って、本発明は、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を有効量含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本発明の薬学的組成物は、投与のために、本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体の他に、薬学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよい。
【００２８】
薬学的に許容可能な担体は本発明の有効成分と両立可能でなければならず、薬学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びエタノールのいずれか１成分を使用してもよく、２成分以上を混合して使用してもよい。本発明の薬学的組成物には、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化してもよい。
【００２９】
さらに、本発明の薬学的組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化してもよく、単位投与量又は多投与量容器、例えば密封されたアンプルや瓶などで提供してもよい。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与が可能である。本発明による薬学的組成物の投与経路は、例えば口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下、又は局所投与が可能であるが、これらに限定されるものではない。このような臨床投与のために、本発明の薬学的組成物は、公知の技術を用いて適切な剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤又は食用担体と混合するか、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセルに密封するか、又は錠剤に圧縮して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合して摂取型錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態で使用することができる。また、注射用、非経口投与用などの各種剤形は、当該技術分野における公知の技法又は通用する技法により製造することができる。
【００３１】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などによってその範囲が多様であり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に決定することができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１．親水性高分子であるグリコールキトサンへのチオール基の導入
グリコールキトサンは、生体毒性がなく、癌組織に効率的に蓄積されるが、正電荷が弱いため、それ自体ではｓｉＲＮＡとの効率的な電荷結合が不可能である。従って、ヘテロ二官能性架橋剤（heterobifunctional cross linker）であるｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰを用いて、アミノ基がピリジルジチオール基で活性化されたグリコールキトサン誘導体を形成した。
【００３３】
３０ｍｇのグリコールキトサン（分子量２５０ｋＤａ）をｐＨ７．４のリン酸緩衝液１０ｍｌに溶解し、それぞれ１、２、５ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（分子量５２７．５７Ｄａ、グリコールキトサンのアミノ基に対して２、５、１０％）と室温で一日間反応させた。その後、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を４、９、１８ｍｇずつそれぞれ添加して３時間反応させ、１Ｍ ＨＣｌ溶液で各溶液のｐＨを３〜４に下げた。その後、カットオフ１２，０００Ｄａの透析膜を用いて２４時間透析して反応していないｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰとＤＴＴを除去し、凍結乾燥した（図１）。
【００３４】
実施例２．チオール基を有する高分子オリゴヌクレオチドとグリコールキトサン高分子の接合
チオール基を有する高分子ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡは、安定性と負電荷量が増加し、電荷結合とジスルフィド結合を同時に用いて、これをチオール基が導入された親水性高分子グリコールキトサン（ＴＧＣ）に連結して複合体を形成した。
【００３５】
５０ｕｇのｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と２５０ｕｇのチオール基を有するグリコールキトサン高分子（ＴＧＣ）を１００ｕＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して混合し、３７゜で１時間反応させることにより、安定した複合体を形成した（図２）。ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡと官能基を導入していない純粋なグリコールキトサンだけでは結合が行われず、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣの複合体を形成する際、ＴＧＣの−ＳＨ基置換程度（２％：ＴＧＣ１、５％：ＴＧＣ２、１０％：ＴＧＣ３）によるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとの複合体の形成を図３に示す。ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣを種々の重量比で混合し、３７゜で１時間反応させた後、８％のアクリルアミドゲルで１５０Ｖ、３５分間の電気泳動を行った。その後、サイバーゴールドで染色し、ゲルドキュメント装置を用いて複合体の形成と反応していない余分なｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを確認した。また、複合体を形成した後、これがジスルフィド結合によることを確認するために、ＤＴＴを３７゜で３時間処理し、前記のように電気泳動することにより、単分子量のｓｉＲＮＡに還元されることを確認した（図４）。
【００３６】
実施例３．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体の送達による遺伝子発現抑制効果の細胞実験による検証
ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣ（ＴＧＣ２、ＴＧＣ３、５：１の重量比）で製造された複合体ナノ粒子を、ｓｉＲＮＡ濃度が５０ｎＭになるように、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｍｏｎｏ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ、Ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ）と共に、ＲＦＰが発現する黒色腫細胞株であるＲＦＰ−Ｂ１６／Ｆ１０（１．２×１０5／ｄｉｓｈ）細胞に処理し、２４時間後にＲＦＰ発現抑制効能を蛍光顕微鏡画像で取得した。本実験では、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）に対するｓｉＲＮＡを製造して使用し、対照群として使用したＭｏｎｏ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ、Ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦのＬＦは、Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００を示すものである（図５）。ＴＧＣによるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ送達がＲＦＰ遺伝子発現抑制に効率的であることを確認した。
【００３７】
実施例４．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体のマウス組織内の分布及び癌標的性の検証
近赤外線蛍光物質（Ｃｙ５．５）で修飾されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを用いて形成したｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体を、ＳＣＣ７癌細胞が移植されたマウスの尾静脈に注射した後、時間別に非侵襲的光学画像によりマウス体内での物質の循環を観察した。担体ＴＧＣと結合させることなく注射されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡやｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ複合体に比べて、ＴＧＣと複合体を形成したＣｙ５．５標識ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡの場合、癌組織に特異的に蓄積されることを確認し、特に、ＴＧＣ３と複合体を形成した実験群で癌標的性と体内保存性が最も優れていることを確認した（図６）。
【００３８】
実施例５．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体の送達による遺伝子発現抑制効果の動物実験による検証
ヌードマウスに１×１０6個のＲＦＰ−Ｂ１６／Ｆ１０黒色腫細胞株を背中の腰の下に注射して動物癌モデルを作成し、光学装置により、マウスからＲＦＰ蛍光が検出されたときからｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３複合体を２日間隔で２回（ｄａｙ０とｄａｙ２）尾静脈に注射し、血管を介して送達されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡによる癌組織中のＲＦＰ発現効果を比較した。図７は、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３複合体を注射した場合に癌組織のＲＦＰの発現が著しく減少したことを示す。また、第６日目に癌組織を摘出して癌組織中のＲＮＡを全て抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（reverse transcription polymerase chain reaction）で組織中のＲＦＰの発現量を比較し、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３を注射したマウスの組織での効率的なＲＦＰ発現減少を確認した。
【００３９】
前述のように、本発明により、電荷結合により連結されると共に、生分解性結合により連結されて製造された高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子の形態を有する新しい剤形のｓｉＲＮＡ担体は、水溶液中でナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡを生体内で標的部位に安定して送達することができるため、ｓｉＲＮＡによる治療効率を向上させることができる。
【００４０】
従って、本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、様々な癌や疾病モデルに適用できるという利点がある。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子にｓｉＲＮＡが結合された高分子−ｓｉＲＮＡ担体及びその用途に関し、より詳細には、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されることで安定した高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療のコア技術は、強い負電荷を帯びているオリゴヌクレオチドをどのようにして所望の組織内に送達するかに拠る。一般に、生きている細胞は、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドなどの巨大分子の透過性が非常に低い。一部の低分子量物質のみ非常に低い割合で生きている細胞の細胞膜を通過して細胞内部の細胞質又は核に入り込むことができるため、タンパク質又はオリゴヌクレオチドを含む巨大分子を送達する上で制限要因となっている。このような問題を克服するための様々な遺伝子担体及びその送達方法に関する研究が行われてきた。各種ウイルスを用いた送達法がそのうちの１つである。ウイルスを用いた送達法は、送達効率の面では優れているが、ウイルス遺伝子による宿主の遺伝子発現機能への影響及び発癌可能性により、臨床適用には問題があった。よって、ウイルスの高いトランスフェクション効率を維持し、かつ体内での安定した遺伝子送達を可能にする担体の開発が求められている。
【０００３】
細胞で特定の遺伝子の発現を阻害するのに卓越した効果を発揮するものとして「ＲＮＡ干渉（RNA interference; RNAi）」が遺伝子治療分野で脚光を浴びている。ｓｉＲＮＡの高い活性及び精密な遺伝子選択性により過去２０年間研究され、現在治療剤として活用されているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に代替する治療剤として期待されている。そこで、現在３０社以上の製薬会社と生命工学会社がｓｉＲＮＡに基づく治療剤の開発に取り組んでいる。特に、糖尿病、肥満、リウマチ、パーキンソン病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エイズ、癌などの疾病を治療するためのｓｉＲＮＡ関連治療剤を開発済み又は開発中である。
【０００４】
ｓｉＲＮＡは、約１９〜２３個のヌクレオチドからなる短い二本鎖ＲＮＡであり、これらと相補的な塩基配列を有する標的遺伝子のｍＲＮＡを標的として遺伝子発現を抑制する。すなわち、特定の遺伝子の発現代謝過程を調節するｍＲＮＡを特異的に分解し、標的遺伝子のタンパク質合成を中断させて疾病を治療する。そこで、強い負電荷を帯びているｓｉＲＮＡを生体内に送達するために、カチオン性リポソームやミセル及びカチオン性高分子を使用した担体が研究されている。ｓｉＲＮＡは、安定性が低いため、生体内で血漿に大量に存在する様々な分解酵素により短時間で分解され、特に注射治療剤の場合、化学的に安定して処理されないとより速く破壊され、ｓｉＲＮＡが有するアニオン性により、同様に負電荷を帯びている細胞膜を透過することが難しく、結果として、細胞内への送達性が低下し、その治療効率が急激に低下するという問題があった。ｓｉＲＮＡは、二本鎖からなるものの、ＲＮＡを構成するリボース糖の結合はＤＮＡを構成するデオキシリボース糖の結合に比べて化学的に非常に不安定であり、ほとんどが生体内での半減期が約３０分と速く分解されてしまう。また、生体内でｓｉＲＮＡを外部物質と認識して免疫系に副作用を起こすことがある。さらに、ｓｉＲＮＡがもともと意図していた遺伝子部位ではなく、他の部位の遺伝子に影響し、遺伝子塩基配列にクロスハイブリダイゼーションを起こすことがあるという問題があった。
【０００５】
よって、生体内で容易に分解される低い安定性により治療効率が急激に低下する、このようなｓｉＲＮＡの欠点を克服すると共に、体内透過が可能になるように負電荷を中和することのできる担体の開発が重要である。治療剤としてのｓｉＲＮＡ担体は、体内循環性と特定の疾患部位への特異的な蓄積性を有することが好ましく、体内で適切に生分解されなければならない。生体由来高分子の１つであるグリコールキトサンは、生体適合性及び生分解性と優れた癌特異的蓄積性により、優れた抗癌剤担体として既に知られている。本研究室では、グリコールキトサンにヌクレオチドと強力に結合するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加して、正電荷が補われたｓｉＲＮＡ担体（グリコールキトサン−ＰＥＩ）を開発した（特許文献１）。しかしながら、強い負電荷を帯びているｓｉＲＮＡと効果的な複合体を形成する上で、高分子が有する電荷だけでは結合力が不足する。
【０００６】
一方、低分子量ｓｉＲＮＡの低い生体内安定性を補うための高分子担体との効果的な結合を可能にするために、ｓｉＲＮＡの分子量自体を増加させようとする努力が報告されている。Ｊｅａｎ−Ｐａｕｌ Ｂｅｈｒグループは、ｓｉＲＮＡの３’末端にＤＮＡ配列を追加して製造したｓｔｉｃｋｙ ｓｉＲＮＡ（ｓｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ｓｉＲＮＡの生体内送達効率が増加したことを報告し（非特許文献１）、本研究室では、ｓｉＲＮＡの５’末端にチオール基を導入してｓｉＲＮＡ間のジスルフィド結合によりサイズを増加させたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを製造し、生体内安定性と遺伝子発現効果が増加したことを発表した（特許文献２、非特許文献２）。その他に、安定性を確保するためにサイズを増加させたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを製造する方法として架橋剤でジスルフィド結合を導入して多重結合のｓｉＲＮＡを製造した場合に標的遺伝子の発現が抑制されたという報告がある（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国特許出願第２００９−００４１４２８号
【特許文献２】韓国特許出願第２００９−００４２２７３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104 (41): 16050-16055
【非特許文献２】Journal of Controlled release, 2010. 141 (3): 339-346
【非特許文献３】Nature materials, 2010. 9: 272-278
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者は、効果的な遺伝子治療剤として使用できるｓｉＲＮＡの生体内安定性と標的部位への送達効率を高めるために、生体適合性に優れた高分子とｓｉＲＮＡを、電荷結合により連結すると共に、生分解性共有結合により連結した、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を製造した。より詳細には、ｓｉＲＮＡ、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、又は多重結合のｓｉＲＮＡを、適切な正電荷を有しかつ反応基を含む高分子と電荷結合させると共に、ｓｉＲＮＡの末端に形成された反応基と共有結合させることにより、疾病細胞の特定のタンパク質の発現を遮断して様々な疾病の治療に適用できる新規なナノ担体である高分子−ｓｉＲＮＡ担体を開発した。
【００１０】
本発明は、前述のような問題を解決するためになされたものであり、ｓｉＲＮＡの生体内安定性及び送達効率を高めることのできる新規なｓｉＲＮＡ担体又は前記ｓｉＲＮＡ担体を含む薬物組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、高分子とｓｉＲＮＡを電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合させたｓｉＲＮＡ担体を提供する。
【００１２】
また、本発明は、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を含むことを特徴とする薬物組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されているため、ｓｉＲＮＡを標的疾病の細胞又は組織に安定して送達することができる。従って、標的部位に選択的にｓｉＲＮＡが蓄積されて特定の疾病タンパク質の発現を遮断できるため有用である。
【００１４】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、癌やその他の疾病モデルに適用できるため、今後広範囲な疾病の治療のための治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１で架橋剤を用いてアミンを有するグリコールキトサンに−ＳＨ（チオール基）を導入してチオール化グリコールキトサン（Thiolated Glycol Chitosan; TGC）を製造する過程を示す模式図である。
【図２】実施例２で両末端基が−ＳＨ（チオール基）であるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとチオール化グリコールキトサン（ＴＧＣ）を反応させてジスルフィド結合及び電気的結合による複合体を形成する過程を示す模式図である。
【図３】実施例２のｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとグリコールキトサン又はチオール基の導入の程度が異なるＴＧＣとの複合体が形成されたか否かを示す図である。
【図４】実施例２の図２に示す方法で製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣの結合がなされたか否かを確認するためにＤＴＴ（ジチオスレイトール）で処理して電気泳動したものを示す図である。
【図５】実施例３で製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣ（ＴＧＣ２、ＴＧＣ３、５：１の重量比）で製造された複合体ナノ粒子による細胞での遺伝子発現抑制効果の結果を示す写真である。
【図６】実施例４の方法で近赤外線蛍光物質（Ｃｙ５．５）で修飾されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを用いて製造されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体のマウスの組織蓄積性及び時間による体内循環性を示すものである。
【図７】実施例５の方法でｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体のマウス癌組織に対する遺伝子発現抑制能の実験結果、すなわちｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体によるモデル標的タンパク質であるＲＦＰ（Red Fluorescent Protein）の発現が著しく減少したことを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ｓｉＲＮＡを生体内で効率的に送達するために、高分子とｓｉＲＮＡを結合して製造されたｓｉＲＮＡ担体を提供するが、前記ｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合と生分解性共有結合により同時に結合されたことを特徴とする。
【００１７】
本発明によるｓｉＲＮＡ担体は、高分子と様々な形態のｓｉＲＮＡを結合して製造されるものであり、前記結合は、電荷結合と生分解性共有結合とによるものであって、その構造は次のように表される。
【００１８】
Ａ−Ｂ（Ａ：高分子、Ｂ：様々な形態のｓｉＲＮＡ）
前記Ａは、電荷と官能基とを有する高分子である。具体的には、生体適合性を有する全ての高分子を使用することができ、特に、疾病組織への蓄積効率が高く、薬物担体として使用される生体高分子であるキトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、デキストラン、ヒアルロン酸、アルブミン、又はこれらの化学的誘導体のうち、正電荷と官能基を同時に有するものであれば、特に使用に制限はない。合成高分子としては、ＰＥＩ（polyethylenimine）、ＰＬＧＡ（poly lactic glycolic acid）、及びポリ−Ｌ−リジン（poly-L-lysine）などを使用することができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００１９】
前記Ｂは、様々な形態のｓｉＲＮＡであり、単量体ｓｉＲＮＡであってもよく、高分子ｓｉＲＮＡ（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、多量体ｓｉＲＮＡ）であってもよい。前記ｓｉＲＮＡは、１５〜３０個のヌクレオチド単量体ｓｉＲＮＡであるか、又はその重合体である１００〜４００個のヌクレオチドからなる多量体ｓｉＲＮＡであることが好ましい。前記ｓｉＲＮＡの鎖は、分子量１０，０００〜１，０００，０００から選択されることが好ましい。前記ｓｉＲＮＡの配列としては、治療目的のＶＥＧＦ（Vascular Endothelial Growth Factor）、ＮＦ−ｋＢ、熱ショックタンパク質、熱ショック因子などの配列を用いることが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。下記実施例では、ｓｉＲＮＡの送達効能を蛍光で確認するために、ＲＦＰに対するｓｉＲＮＡ塩基配列を用いた。
【００２０】
前記Ａと前記Ｂとは、電荷結合及び生分解性共有結合により連結される。前記電荷結合は、負電荷を帯びているｓｉＲＮＡと正電荷を帯びている高分子間の電荷結合である。両親媒性高分子ナノ粒子の外部に物理的にｓｉＲＮＡを結合する方法は、化学的結合の最大積荷量が約１０％に制限されるのに対して、最大積荷量が９５％と格段に高いため、化学的結合の限界を克服して薬物含有量を大幅に増やすことができる。
【００２１】
前記生分解性結合には、ジスルフィド結合、エステル結合、無水物結合（アンヒドリド結合）、ヒドラゾン結合、酵素特異的ペプチド結合などがあるが、必ずしもこれに限定されるものではない。このような生分解性結合は、特定の生体環境下で分解が可能である。生体環境下で様々な酵素や酸度で生分解される本発明のｓｉＲＮＡと高分子の生分解性結合は、生体内の特定の酵素などにより分解された場合、分離されたｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能である。例えば、生分解性共有結合のための官能基としてチオール基がｓｉＲＮＡの末端と高分子の末端に導入された場合、ｓｉＲＮＡと高分子とはジスルフィド結合という生分解性結合を形成するが、生体内に前記ジスルフィド結合を有するｓｉＲＮＡと高分子ナノ粒子が導入されると、生体内に存在するグルタチオン（ＧＳＨ）によりｓｉＲＮＡが還元されて分離される。特に、癌細胞ではグルタチオン（ＧＳＨ）の濃度が増加するという報告を考慮すると、本発明の高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子担体のジスルフィド結合などの生分解性結合が癌組織中でも効果的に生分解されて、ｓｉＲＮＡを標的部位に効果的に送達できることが分かる。
【００２２】
高分子とｓｉＲＮＡの結合が電荷結合のみでなされる場合は、結合力が強くないため、ｓｉＲＮＡと結合して使用できる高分子の範囲が制限される。また、生体内で不安定であり、目的とする部位に到達する前に分離されるという問題があった。しかし、本発明のｓｉＲＮＡ担体は、高分子とｓｉＲＮＡが、電荷結合により結合されると共に、化学的な生分解性共有結合により結合されるため、生体適合性がさらに向上し、ｓｉＲＮＡを標的部位に安定して送達することができるので、より優れている。
【００２３】
本発明のＡ（高分子）とＢ（ｓｉＲＮＡ）の結合によるｓｉＲＮＡ担体の製造は、次の方法により行ってもよい。
【００２４】
（ａ）正電荷を有する高分子に生分解性共有結合のための官能基を導入する段階
（ｂ）ｓｉＲＮＡの片末端又は両末端に官能基を導入するか、又は活性化する段階
（ｃ）前記段階（ａ）で製造した高分子と前記段階（ｂ）で製造したｓｉＲＮＡを電荷結合及び生分解性共有結合により安定して結合してナノ粒子を製造する段階
【００２５】
前記方法は、結合方式によっては各段階を同時に行ってもよい。前記方法で製造された高分子ナノ粒子は、水溶液中で効率的に様々な形態のｓｉＲＮＡと複合体を形成し、ナノサイズの自己集合体（self-assembly）を形成することができ、特定の疾病部位に選択的に蓄積される（例えば、新生血管標的型ＥＰＲ、癌・リウマチ・炎症性疾患）。前記のように製造された本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、サイズが１０〜２０００ｎｍであり、分子量が１０3〜１０7Ｄａであることが好ましい。
【００２６】
一方、本発明のｓｉＲＮＡ担体は、薬学的組成物の有効成分として使用することもできる。従って、本発明は、高分子−ｓｉＲＮＡ担体を有効量含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本発明の薬学的組成物は、投与のために、本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体の他に、薬学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよい。
【００２８】
薬学的に許容可能な担体は本発明の有効成分と両立可能でなければならず、薬学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びエタノールのいずれか１成分を使用してもよく、２成分以上を混合して使用してもよい。本発明の薬学的組成物には、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、本発明の薬学的組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化してもよい。
【００２９】
さらに、本発明の薬学的組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化してもよく、単位投与量又は多投与量容器、例えば密封されたアンプルや瓶などで提供してもよい。
【００３０】
本発明の薬学的組成物は、経口投与又は非経口投与が可能である。本発明による薬学的組成物の投与経路は、例えば口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下、又は局所投与が可能であるが、これらに限定されるものではない。このような臨床投与のために、本発明の薬学的組成物は、公知の技術を用いて適切な剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与時には、不活性希釈剤又は食用担体と混合するか、硬質もしくは軟質ゼラチンカプセルに密封するか、又は錠剤に圧縮して投与することができる。経口投与用の場合、活性化合物は、賦形剤と混合して摂取型錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態で使用することができる。また、注射用、非経口投与用などの各種剤形は、当該技術分野における公知の技法又は通用する技法により製造することができる。
【００３１】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などによってその範囲が多様であり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば容易に決定することができる。
【実施例】
【００３２】
実施例１．親水性高分子であるグリコールキトサンへのチオール基の導入
グリコールキトサンは、生体毒性がなく、癌組織に効率的に蓄積されるが、正電荷が弱いため、それ自体ではｓｉＲＮＡとの効率的な電荷結合が不可能である。従って、ヘテロ二官能性架橋剤（heterobifunctional cross linker）であるｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰを用いて、アミノ基がピリジルジチオール基で活性化されたグリコールキトサン誘導体を形成した。
【００３３】
３０ｍｇのグリコールキトサン（分子量２５０ｋＤａ）をｐＨ７．４のリン酸緩衝液１０ｍｌに溶解し、それぞれ１、２、５ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（分子量５２７．５７Ｄａ、グリコールキトサンのアミノ基に対して２、５、１０％）と室温で一日間反応させた。その後、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を４、９、１８ｍｇずつそれぞれ添加して３時間反応させ、１Ｍ ＨＣｌ溶液で各溶液のｐＨを３〜４に下げた。その後、カットオフ１２，０００Ｄａの透析膜を用いて２４時間透析して反応していないｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰとＤＴＴを除去し、凍結乾燥した（図１）。
【００３４】
実施例２．チオール基を有する高分子オリゴヌクレオチドとグリコールキトサン高分子の接合
チオール基を有する高分子ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡは、安定性と負電荷量が増加し、電荷結合とジスルフィド結合を同時に用いて、これをチオール基が導入された親水性高分子グリコールキトサン（ＴＧＣ）に連結して複合体を形成した。
【００３５】
５０ｕｇのｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と２５０ｕｇのチオール基を有するグリコールキトサン高分子（ＴＧＣ）を１００ｕＬのＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解して混合し、３７゜で１時間反応させることにより、安定した複合体を形成した（図２）。ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡと官能基を導入していない純粋なグリコールキトサンだけでは結合が行われず、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣの複合体を形成する際、ＴＧＣの−ＳＨ基置換程度（２％：ＴＧＣ１、５％：ＴＧＣ２、１０％：ＴＧＣ３）によるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとの複合体の形成を図３に示す。ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣを種々の重量比で混合し、３７゜で１時間反応させた後、８％のアクリルアミドゲルで１５０Ｖ、３５分間の電気泳動を行った。その後、サイバーゴールドで染色し、ゲルドキュメント装置を用いて複合体の形成と反応していない余分なｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを確認した。また、複合体を形成した後、これがジスルフィド結合によることを確認するために、ＤＴＴを３７゜で３時間処理し、前記のように電気泳動することにより、単分子量のｓｉＲＮＡに還元されることを確認した（図４）。
【００３６】
実施例３．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体の送達による遺伝子発現抑制効果の細胞実験による検証
ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡとＴＧＣ（ＴＧＣ２、ＴＧＣ３、５：１の重量比）で製造された複合体ナノ粒子を、ｓｉＲＮＡ濃度が５０ｎＭになるように、対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ、Ｍｏｎｏ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ、Ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ）と共に、ＲＦＰが発現する黒色腫細胞株であるＲＦＰ−Ｂ１６／Ｆ１０（１．２×１０5／ｄｉｓｈ）細胞に処理し、２４時間後にＲＦＰ発現抑制効能を蛍光顕微鏡画像で取得した。本実験では、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）に対するｓｉＲＮＡを製造して使用し、対照群として使用したＭｏｎｏ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦ、Ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ／ＬＦのＬＦは、Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM ２０００を示すものである（図５）。ＴＧＣによるｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ送達がＲＦＰ遺伝子発現抑制に効率的であることを確認した。
【００３７】
実施例４．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体のマウス組織内の分布及び癌標的性の検証
近赤外線蛍光物質（Ｃｙ５．５）で修飾されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡを用いて形成したｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ複合体を、ＳＣＣ７癌細胞が移植されたマウスの尾静脈に注射した後、時間別に非侵襲的光学画像によりマウス体内での物質の循環を観察した。担体ＴＧＣと結合させることなく注射されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡやｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＰＥＩ複合体に比べて、ＴＧＣと複合体を形成したＣｙ５．５標識ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡの場合、癌組織に特異的に蓄積されることを確認し、特に、ＴＧＣ３と複合体を形成した実験群で癌標的性と体内保存性が最も優れていることを確認した（図６）。
【００３８】
実施例５．チオール基が導入されたグリコールキトサン高分子と高分子オリゴヌクレオチド（ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ）の複合体の送達による遺伝子発現抑制効果の動物実験による検証
ヌードマウスに１×１０6個のＲＦＰ−Ｂ１６／Ｆ１０黒色腫細胞株を背中の腰の下に注射して動物癌モデルを作成し、光学装置により、マウスからＲＦＰ蛍光が検出されたときからｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３複合体を２日間隔で２回（ｄａｙ０とｄａｙ２）尾静脈に注射し、血管を介して送達されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡによる癌組織中のＲＦＰ発現効果を比較した。図７は、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３複合体を注射した場合に癌組織のＲＦＰの発現が著しく減少したことを示す。また、第６日目に癌組織を摘出して癌組織中のＲＮＡを全て抽出し、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（reverse transcription polymerase chain reaction）で組織中のＲＦＰの発現量を比較し、ｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ−ＴＧＣ３を注射したマウスの組織での効率的なＲＦＰ発現減少を確認した。
【００３９】
前述のように、本発明により、電荷結合により連結されると共に、生分解性結合により連結されて製造された高分子−ｓｉＲＮＡナノ粒子の形態を有する新しい剤形のｓｉＲＮＡ担体は、水溶液中でナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡを生体内で標的部位に安定して送達することができるため、ｓｉＲＮＡによる治療効率を向上させることができる。
【００４０】
従って、本発明による高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、様々な癌や疾病モデルに適用できるという利点がある。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子（Ａ）とｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結された下記構造：
Ａ−Ｂ
（ここで、Ａは正電荷と官能基とを有する高分子であり、Ｂは片末端又は両末端に官能基を有するｓｉＲＮＡである）の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項２】
前記高分子（Ａ）は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、デキストラン、ヒアルロン酸、アルブミン、又はこれらの誘導体のうち正電荷を有するものから選択されるものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、片末端又は両末端に高分子との連結のための官能基がついている形態のものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、単量体ｓｉＲＮＡ、複数のｓｉＲＮＡが分解性結合により連結されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、又は多量体ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、１５〜３０個のヌクレオチド単量体ｓｉＲＮＡ、又はその重合体である１００〜４００個のヌクレオチドからなる多量体ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項６】
前記高分子（Ａ）と前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結されたものであり、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合のみで連結された場合に比べて生体内安定性がさらに増加したことを特徴とする、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項７】
前記高分子（Ａ）と前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）の生分解性共有結合は、ジスルフィド結合、エステル結合、無水物結合、ヒドラゾン結合、及び酵素特異的ペプチド結合から選択されるものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項８】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体のサイズが１０〜２０００ｎｍである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項９】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体の分子量が１０3〜１０7Ｄａである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１０】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、水系で電荷結合と生分解性共有結合を同時に用いてｓｉＲＮＡと高分子が連結されているものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体が癌の治療のために使用されるものである、高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体を有効量含む抗癌剤組成物。
【請求項１３】
（ａ）正電荷を有する高分子に生分解性共有結合のための官能基を導入する段階と、
（ｂ）ｓｉＲＮＡの片末端又は両末端に官能基を導入するか、又は活性化する段階と、
（ｃ）前記段階（ａ）で製造した高分子と前記段階（ｂ）で製造したｓｉＲＮＡを電荷結合及び生分解性共有結合により結合してナノ粒子を形成する段階と
を含むｓｉＲＮＡ担体の製造方法。
【請求項１】
高分子（Ａ）とｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結された下記構造：
Ａ−Ｂ
（ここで、Ａは正電荷と官能基とを有する高分子であり、Ｂは片末端又は両末端に官能基を有するｓｉＲＮＡである）の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項２】
前記高分子（Ａ）は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリエチレンイミン、デキストラン、ヒアルロン酸、アルブミン、又はこれらの誘導体のうち正電荷を有するものから選択されるものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、片末端又は両末端に高分子との連結のための官能基がついている形態のものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、単量体ｓｉＲＮＡ、複数のｓｉＲＮＡが分解性結合により連結されたｐｏｌｙ−ｓｉＲＮＡ、又は多量体ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項５】
前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）は、１５〜３０個のヌクレオチド単量体ｓｉＲＮＡ、又はその重合体である１００〜４００個のヌクレオチドからなる多量体ｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項６】
前記高分子（Ａ）と前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）が電荷結合と生分解性共有結合により同時に連結されたものであり、高分子とｓｉＲＮＡが電荷結合のみで連結された場合に比べて生体内安定性がさらに増加したことを特徴とする、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項７】
前記高分子（Ａ）と前記ｓｉＲＮＡ（Ｂ）の生分解性共有結合は、ジスルフィド結合、エステル結合、無水物結合、ヒドラゾン結合、及び酵素特異的ペプチド結合から選択されるものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項８】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体のサイズが１０〜２０００ｎｍである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項９】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体の分子量が１０3〜１０7Ｄａである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１０】
前記高分子−ｓｉＲＮＡ担体は、水系で電荷結合と生分解性共有結合を同時に用いてｓｉＲＮＡと高分子が連結されているものである、請求項１に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体が癌の治療のために使用されるものである、高分子−ｓｉＲＮＡ担体。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の高分子−ｓｉＲＮＡ担体を有効量含む抗癌剤組成物。
【請求項１３】
（ａ）正電荷を有する高分子に生分解性共有結合のための官能基を導入する段階と、
（ｂ）ｓｉＲＮＡの片末端又は両末端に官能基を導入するか、又は活性化する段階と、
（ｃ）前記段階（ａ）で製造した高分子と前記段階（ｂ）で製造したｓｉＲＮＡを電荷結合及び生分解性共有結合により結合してナノ粒子を形成する段階と
を含むｓｉＲＮＡ担体の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−５５３００（Ｐ２０１２−５５３００Ａ）
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２３２７６４（Ｐ２０１０−２３２７６４）
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（３０４０３９５４８）コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (36)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２２日（２０１２．３．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１０月１５日（２０１０．１０．１５）
【出願人】（３０４０３９５４８）コリア・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー (36)
【Ｆターム（参考）】
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