青色光バイオスイッチ
【課題】 ＬＫＰ１、ＬＫＰ２、およびそのＣ８２Ａ変異を用いた青色光によるバイオスイッチで、青色光の量により、相互作用のオン／オフ、ならびに、強光による遺伝子導入生物の殺傷が可能である技術の提供。
【解決手段】 青色光による遺伝子の発現制御に、ＬＫＰ１、ＬＫＰ２、変異型ＬＫＰ１および／または変異型ＬＫＰ２を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。植物ウイルス由来のプロモーターの下流に、ＬＫＰ２のプロモーターを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するＬＫＰ２遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。 生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする当該合成遺伝子の使用。当該合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【解決手段】 青色光による遺伝子の発現制御に、ＬＫＰ１、ＬＫＰ２、変異型ＬＫＰ１および／または変異型ＬＫＰ２を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。植物ウイルス由来のプロモーターの下流に、ＬＫＰ２のプロモーターを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するＬＫＰ２遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。 生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする当該合成遺伝子の使用。当該合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、LKP1、LKP2、およびそのC82A変異を用いた青色光によるバイオスイッチに関する。
本発明において用いる略語は以下のとおりである。
ADO ADAGIO
APRR シロイヌナズナ偽応答調節因子
ASK シロイヌナズナSkp1様タンパク質
3-AT 3-amino-1H-1,2,4-triazole
CaMV カリフラワーモザイクウイルス
CCA1 概日時計関連因子1
CFP シアン蛍光タンパク質
CO CONSTANS
COL CONSTANS LIKE
CRY クリプトクローム
DAPl 4',6-diamidino-2-phenylindole
Di19 乾燥誘導性遺伝子19
FKF1 フラビン結合性ケルヒ繰り返しF-box 1
FKL FKF様
GFP 緑色蛍光タンパク質
GUS β-グルクロニダーゼ
LD 長日光周期
LHY late elongated hypocotyl-1［後期伸長化胚軸因子-1］
LKP2 LOVケルヒタンパク質2
LOV light, oxygen and voltage
PHOT フォトトロピン
PHY フィトクローム
PRR 疑似反応調節因子
SCF Skp1-Cullin-F-boxタンパク質
TOC1 timing of cab expression 1［CAB発現タイミング因子1］
YFP 黄色蛍光タンパク質
ZTL ZEITLUPE
【背景技術】
【０００２】
根、葉、茎の十分な生育とともに抽台時期ならびに開花時期を制御することができる主要作物や高価な花卉類など園芸植物のトランスジェニック植物の作製方法や、該作製方法により得られるトランスジェニック植物を提供することを目的として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータの下流に、ＬＯＶドメイン及びケルヒ（ｋｅｌｃｈ）繰返しを有する青色光受容体タンパク質ＬＫＰ１のプロモータを介して該ＬＫＰ１遺伝子が連結されている発現ベクターにより植物を形質転換し、青色光受容体タンパク質を過剰発現するトランスジェニック植物を作製する発明が既に出願されている（特許文献１）。
【０００３】
これまで、導入遺伝子の発現制御には化学物質受容体を用いる例がほとんどであり、青色光受容体であるLKPファミリータンパク質、あるいは、そのLOVドメインを単体で用いた例はない。化学物質で遺伝子発現を誘導する場合には、その化学物質のコスト、生体、環境に与える影響が問題となる。植物では光で発現誘導が起こるCAB遺伝子等のプロモータを遺伝子発現に利用する例はあるが、この場合は内在の光受容体とシグナル伝達系を用いるため、反応に必要な因子が多く、植物以外の生物には用いることができなかった。また、遺伝子組換え個体や細胞だけを必要に応じて非遺伝子組換え個体や非遺伝子組換え細胞が混在する集団から殺すことは従来技術では困難であった。
【特許文献１】特開２００１−３５２８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、LKP1、LKP2、およびそのC82A変異を用いた青色光によるバイオスイッチで、青色光の量により、相互作用のオン／オフ、ならびに、強光による遺伝子導入生物の殺傷が可能である技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（８）の青色光による遺伝子発現制御方法を要旨とする。
（１）青色光による遺伝子の発現制御に、LKP1、LKP2、変異型LKP1および／または変異型LKP2を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。
（２）LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する上記（１）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（３）相互作用因子がTOC1および／またはAPRR５および／またはDi19および／またはCOおよび／またはCOLである上記（２）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（４）LKP2のＦ-box領域と、ASKとの相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する上記（１）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（５）導入されたLKP1遺伝子、LKP2遺伝子、変異型LKP1遺伝子および／または変異型LKP2遺伝子の転写がオン／オフされる上記（１）ないし（４）のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法。
（６）LKP2遺伝子が、植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン及びケルヒ繰返しを有するLKP2遺伝子が連結されている発現ベクターにより導入された遺伝子である上記（５）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（７）LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている遺伝子である上記（６）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（８）LKP2のプロモータのプロモータとしてLKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いることを特徴とする上記（６）または（７）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（９）上記（１）ないし（８）のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法を用いることを特徴とする青色光による植物の生育制御方法。
【０００６】
本発明は、以下の（１０）〜（１２）の合成遺伝子を要旨とする。
（１０）植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するLKP2遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。
（１１）LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている上記（１０）の合成遺伝子。
（１２）LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いる上記（１０）または（１１）の合成遺伝子。
【０００７】
本発明は、以下の（１３）〜（１６）の合成遺伝子の使用を要旨とする。
（１３）生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする請求項１０、１１または１２の合成遺伝子の使用。
（１４）生物が植物であるの上記（１３）の使用。
（１５）生物が酵母であるの上記（１３）の使用。
（１６）生物が動物であるの上記（１３）の使用。
【０００８】
本発明は、以下の（１７）の細胞、組織、器官または生物全体を要旨とする。
（１７）上記（１０）、（１１）または（１２）の合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【発明の効果】
【０００９】
LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされるため、これを光スイッチに利用することができる。例えば、酵母２ハイブリッド系のマーカー遺伝子の代わりに任意の遺伝子を繋げば、青色光に依存してその遺伝子の転写がオン／オフできる。また、この系は他生物にも応用可能である。更に、光量に応じて、相互作用のオン／オフだけでなく、遺伝子導入細胞、個体のみを殺傷することも可能である。制御に薬剤を用いないので、化学物質と比べ、低コストであり、環境に与える影響も考慮しなくてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、植物青色光受容体候補遺伝子ＬＫＰ２の研究を行い、LKP2プロモータ活性が、幼植物体全体、ロゼット葉、根端、萼、若いさやで認められることを明らかにした。なお、LKP2は本発明者らによってアミノ酸配列が示されている（上記の特許文献１参照）。
【００１１】
また、緑色蛍光タンパク質（GFP，green fluorescent protein）とLKP2を用いた解析から、LKP2が核タンパク質である証拠を得た。
【００１２】
更に、酵母２ハイブリッド系を用いた解析から、ＬＫＰ２がＦ-box領域で、ASK1、２、３、４、５、１１、１４、２０a、２０bと相互作用すること、LKP2がLKPファミリータンパク質であるLKP1、LKP2、FKF1と相互作用すること、LKP1およびLKP2が各々LOVドメインでTOC1とAPRR５と相互作用することを見いだした。
【００１３】
LOVドメインを介したこれらの相互作用は強い光によって影響を受け、赤色、遠赤色、緑色では影響を受けないものの、青色光によって相互作用の阻害効果が認められた。
【００１４】
LKP1及びLKP2のLOVドメインに位置する８２番目のシステイン残基をアラニン置換した場合、この青色光による効果はさらに顕著となった。
【００１５】
野生型のLKP1、LKP2は５０μmol photon/m2/secの青色光では野生型のタンパク質を発現する酵母は生育に影響を受けなかったが、変異型のLKP1或いはLKP2タンパク質を発現する酵母は培地上で生育することができなかった。
【００１６】
これは導入された変異型青色光受容体LKPタンパク質によって吸収された光エネルギーが生体内物質に悪影響を与えたためだと考えられる。
【００１７】
これらの知見から、発明者は青色光バイオスイッチ、すなわち、LKP1、LKP2、変異型LKP1、LKP2を用いた青色光による遺伝子発現制御、生育制御を行う本発明を完成するに至った。
本発明に係る研究を要約すると以下の通りである。
Arabidopsis thaliana Heynh.［シロイヌナズナ］のADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質には、LOVドメイン、F-boxモチーフ、ケルヒ繰り返し領域が一つずつ存在する。LKP2はこのファミリーのメンバーであり、シロイヌナズナの概日オシレータ内部または非常に近傍で機能している［Shultz et al., (2001) Plant Cell 13: 2659-2670］。プロモータ-GUS融合実験により、LKP2遺伝子はロゼット葉において高活性であることが判明した。CaMV35S:LKP2-GFP植物ではGFPに関連する蛍光が核内に検出され、そこからLKP2は核タンパク質であると考えられた。酵母2-ハイブリッド分析によれば、LKP2は一部のシロイヌナズナSkp-1様タンパク質（ASK）と相互作用し、これは他のADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の場合と同様であることが示されているが、そこからLKP2はSCF（Skp1-Cullin-F-boxタンパク質）複合体を形成することが可能であり、これはユビキチンE3リガーゼとして機能すると考えられる。LKP2は自分自身だけでなく、ファミリーの他のメンバーであるLKP1やFKF1とも相互作用する。また2-ハイブリッド分析によれば、LKP2は時計成分であるTOC1と相互作用するが、TOC1遺伝子発現に対する負の調節因子であるCCA1やLHYとは相互作用しないことが示された。LKP2のLOVドメインはTOC1との相互作用について必要かつ十分であることが示された。LKP2とAPRR5（TOC1のパラログ）の相互作用も観察されたが、LKP2は他のTOC1パラログであるAPRR3、APRR7、APRR9と相互作用しなかった。
【００１８】
図1に、遺伝子組み換えシロイヌナズナにおけるGUS活性の組織化学的局在化を示す。
LKP2プロモータ-GUS融合遺伝子を含む遺伝子組み換えシロイヌナズナ（T3）植物を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上で育成し、続いてバーミキュライトビーズ上で育成した。GUS活性は6日齢の苗木（A）、14日齢のロゼット植物（B）、花（C）、若い長角果（D）、47日齢植物の古い長角果（E）において観察されている。バーはA、C-Eでは1mm、Bでは5mmである。
【００１９】
図2に、GFP-LKP2融合タンパク質の細胞内局在を示す。
35S::GFP T3植物（A、B）と35S::GFP-LKP2 T3植物（C-G）の根を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上、16時間光照射/8時間暗闇のサイクルで成長させ、これを光学顕微鏡（A、C、E）、蛍光顕微鏡（B、D、G）、共焦点レーザ操作顕微鏡（H）を用いて観察した。35S::GFP-LKP2 T3植物を4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で染色し、蛍光顕微鏡（F）で観察した。バーはA-Dでは100μm、E-Hでは10μmである。
【００２０】
図3に、シロイヌナズナSkp1オーソログ（ASKs）とLKPファミリータンパク質の間の酵母2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）ASKs（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20a、ASK20b）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（上）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（下）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。アステリスクは30mM 3-ATを供給してHIS3レポーター遺伝子の基礎活性を抑制したSD-AHLW培地を示し、その結果非特異的バックグラウンド増殖が抑えられている。Clontechより取得した2種類のプラスミドで、GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、アミノ酸72-390（GenBank受入番号#K01700）、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原（GenBank位置SV4CG）をエンコードするものを、陽性対照とした。
（B-D）LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域を用いて2-ハイブリッド相互作用試験を行った。試験対象となる全タンパク質の発現は、イムノブロット分析により確認した（データ示さず）。
【００２１】
図4に、LKPファミリータンパク質間の2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）LKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体およびGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。アステリスクは30mM 3-ATを供給してHIS3レポーター遺伝子の基礎活性を抑制したSD-AHLW培地を示し、その結果非特異的バックグラウンド増殖が抑えられている。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。試験対象となる全タンパク質の発現は、イムノブロット分析により確認した（データ示さず）。
【００２２】
図5に、LKPファミリータンパク質に対する時計関連因子の相互作用を示す。
（A）時計関連因子（TOC1、CCA1、LHY）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２３】
図6に、LKP2ドメインに対するTOC1の相互作用を示す。
（A）TOC1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２４】
図7に、酵母でのLKPファミリータンパク質に対するAPRR/TOC1ファミリータンパク質の相互作用を示す。
（A）APRR/TOC1ファミリータンパク質（TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２５】
図8に、LKP2ドメインに対するAPRR5の相互作用を示す。
（A）APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2ドメインまたはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２６】
図９に、各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用を示す。
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、光子量41μmol/m-2/s-1の各種光条件下（暗条件下、白色光下、青色光下、赤色光下）にて酵母を生育させ解析を行った。
【００２７】
図１０に、各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用を示す。
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、暗条件下及び、光子量50μmol/m-2/s-1、100μmol/m-2/s-1、190μmol/m-2/s-1の青色光下にて酵母を生育させ解析を行った。
【００２８】
LKP2に関してみるならば、LKP2遺伝子を過剰発現する植物を長日条件で育成する場合には遅延開花の表現型が現れ、連続光または遮光条件下では、いずれの場合もCAB2またはCCR2に対する時計調節性遺伝子について不規則なプロモーター活性が現れたが、これらの事実からLKP2は概日時計に近い場所で機能していると考えられる（Schltz et al. 2001）。LKP2タンパク質はLKP1/ZTL、TOC1、PRR5に対しても相互作用する能力があった（Yasuhara et al. 2004）。PRR5はPRR/TOC1ファミリータンパク質の一員であると考えられており、このファミリータンパク質は概日時計の調節に作用していると考えられている（Sato et al. 2002, Yamamoto et al. 2003）。概日時計調節ならびに開花期調節におけるLKP2の機能をより深く理解するため、酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2に相互作用するタンパク質因子について、単離、分子的相互作用、局在に関して記述する。
【００２９】
図１１に、酵母2-ハイブリッド系におけるAtDi19とFKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の相互作用を示す。
LKP1/ZTL、LKP2、またはFKF1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、Di19のGAL4活性化融合体を含む酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）（右）寒天培地上で育成したもの。pGBKT7とpGADT7の空ベクターをネガティブ対照に用いた（ベクター）。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質と、GAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドをポジティブ対照に用いた。酵母細胞内におけるLKP1/ZTL、LKP2、FKF1に融合したGAL4 DNA結合ドメイン、あるいはDi19に融合したGAL4活性化ドメインの確認は、抗cMyc抗体または抗血液凝集素抗体をそれぞれ用いたイムノブロットにより行った（図１７のA、B）。
【００３０】
図１２に、ボンバードメント処理を行ったシロイヌナズナ葉柄細胞におけるGUS活性の組織化学的な局在を示す。Di19-GUSの核内局在（A）、ならびに空ベクターpBI221を用いてボンバードメント処理したGUS対照の全体的な細胞質染色(C)。DAPI染色は細胞核を示す（B）。スケールバー=0.05mm。
【００３１】
図１３に、CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）COL1欠失体のLKP2に対する相互作用。LKP2タンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COL1欠失タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。切断されたCOL1タンパク質の構成は、アミノ酸145-355、163-355、195-355、228-355、286-327であった。163-355、195-355、228-355、または286-327に対応するCOL1に融合されたGAL4 DNA結合ドメイン、またはLKP2に融合されたGAL4活性化ドメインの発現はイムノブロット法により確認した（図１７のA、C）。
（B）CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する相互作用。上部パネル：LKPファミリータンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COLファミリータンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。上部列の数字はCOLファミリータンパク質の識別番号を示しており、例えば「1」は「COL1」を示す。下部パネル：LKPファミリータンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体と、COLファミリータンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。上部列の数字はCOLファミリータンパク質の識別番号を示しており、例えば「6」は「COL6」を示す。2-ハイブリッドスポットアッセイにおけるGAL4 DNA結合ドメインまたはGAL4活性化ドメイン融合体の発現はイムノブロット法により確認した（図１７のA、D、E）。
（C）CO欠失体のLKP2に対する相互作用。CO欠失タンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、LKP2タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。切断されたCOタンパク質の構成は、アミノ酸106-373、140-373、157-373、175-373、208-373、241-373、175-326、175-305、175-275、175-239、175-206、306-348であった。175-373、208-373、241-373、175-326、306-348に対応するCOに融合されたGAL4 DNA結合ドメインの発現はイムノブロット法により確認した（図１７のF）。
（D）COまたはCOL1に対するLKP2の相互作用ドメイン。LKP2ドメインのGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COまたはCOL1タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。pGBKT7とpGADT7をベクターのみのネガティブ対照ベクターとして用いた。GAL4 DNA結合ドメインを保有するネズミp53タンパク質と、GAL4活性化ドメインを保有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドをポジティブ対照に用いた。L、LOVドメイン；F、F-box；K、kelch反復領域；LF、LOVドメイン＋F-box；LK、LOVドメイン＋kelch反復領域；FK、F-box＋kelch反復領域。LKP2ドメインに融合されたGAL4活性化ドメインの発現は、イムノブロット法により確認した（図１７のG）。
【００３２】
図１４に、CFP-LKP2とYFP-COの細胞内局在を示す。
CFP-LKP2とYFP（A-D）、CFPとYFP-CO（E-H）、またはCFP-LKP2とYFP-CO（I-L）を発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞を同時ボンバードメント処理した。タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-CO（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３３】
図１５に、CFP-LKP2とYFP-COL1の細胞内局在を示す。
CFP-LKP2とYFP（A-D）、CFPとYFP-COL1（E-H）、またはCFP-LKP2とYFP-COL1（I-L）を発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞の同時ボンバードメント処理を行った。タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-COL1（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３４】
図１６に、CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP、SCL28-RFPの核内局在を示す。
CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP（A、B、C、D）またはCFP-LKP2、YFP-CO、SCL28-RFPを発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞の同時ボンバードメント処理を行った。CPP（A、E）、YFP（B、F）、RFP（C、G）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３５】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（シロイヌナズナにおけるLKP2（LOVケルヒタンパク質2）の分子パートナーとしてのASKと時計関連タンパク質の同定）
概日リズムは生物内部における約24時間のサイクルであり、シアノバクテリアから高等植物まで保存されており、24時間の1日に適応するために、進化の過程で発達したと考えられている。概日リズムは生物時計によりつくり出され、協調されている。この生物時計は概日オシレータとも呼ばれる。高等植物では、多数の遺伝子発現が概日調節されている。これらの遺伝子の中には、光合成、光受容体、光防護、防寒の役目を果たすものがあり、また炭素、窒素、硫黄経路や糖移動酵素のための遺伝子も存在する（Harmer et al., 2000）。
【００３７】
近年、概日オシレータは日常生活だけでなく、植物の開花時期制御などといった季節変化の認識にも非常に重要であることが示されている。ある開花時期遺伝子はCONSTANS（CO）と呼ばれ、シロイヌナズナにおける光周期経路を調節する鍵となっている。COの発現は概日時計に調節されている。CO発現は夕方に生じる。光存在下のCOタンパク質レベルが開花に対する鍵らしい（Schultz and Kay, 2003; Yanovsky and Kay, 2003）。
高等植物で十分に特徴が調べられている概日オシレータは、TOC1と、2種類のMyb様DNA結合タンパク質であるCCA1ならびにLHYの間のフィードバックループ系である。TOC1はCCA1とLHY遺伝子の発現に正の影響を与えるが、CCA1とLHYはTOC1の発現に負の制御を行う（Alabadi et al., 2001）。TOC1はシロイヌナズナにおける二成分系の疑似応答調節因子の小規模タンパク質ファミリーに属しており、他の二成分系の応答調節因子に似ているが、不変性のリン酸受容アスパラギン酸部位を持たない（Makino et al., 2000; Strayer et al., 2000）。このタンパク質ファミリーのメンバーではAPRR9、APRR7、APRR5、APRR3、そしてAPRR1またはTOC1の順番で、夜明け後にmRNAの蓄積が2〜3時間間隔で順番に開始する。APRR9遺伝子の発現は赤色光により誘導され、APRR1/TOC1を過剰発現する植物においては下方調節される（Makino et al., 2001, 2002）。APRRファミリーのメンバーは概日リズムを調節して、局地環境に合わせているらしい（Michael et al., 2003）。
【００３８】
本発明者らはシロイヌナズナのゲノム分析により新しい青色光受容体を同定しようと試みたところ、LOVドメイン、F-box、ケルヒ繰り返し領域をそれぞれ一つずつ持つユニークなタンパク質をコードする、2種類の遺伝子を発見した（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）。
【００３９】
LOVドメインはPHOT1とPHOT2に見られる青色光感受性モチーフであり、光屈性、葉緑体の運動、気孔の開口などに関与している（Briggs et al., 2001; Briggs and Christie 2002）。F-boxはF-boxタンパク質に見られるモチーフであり、アダプタとして特異的基質を核ユビキチンタンパク質リガーゼサブユニットに運び、ユビキチン化とそれに続く分解に導く（Craig and Tyers, 1999; Xiao and Jang, 2000）。酵母と哺乳類では、F-boxタンパク質はCul1、Rbx1、Skp1と共にSCF複合体を形成する。これら3種類のタンパク質は核ユビキチンリガーゼ（E3）を形成し、F-boxタンパク質はユビキチン化する標的を認識する際に機能し、またそれらのF-boxモチーフ領域はSkp1の結合に関連している。ユビキチン化された標的タンパク質はその後、ATP依存性の方法で、26Sプロテアソームにより分解される。ケルヒ繰り返しは1ドメインの超円筒（β-プロペラ）構造の形で編成されていると考えられるが、この構造は、酵母と哺乳類両方のF-boxタンパク質のC末端に見られるモチーフであるWD40の繰り返しにより形成される構造と類似している（Patton et al., 1998; Winston et al., 1999）。これらの繰り返しはタンパク質-タンパク質相互作用に関与していると推定されている（Andrade et al., 2001）。本発明者らはLOVケルヒタンパク質1と2に対するこれらのタンパク質をLKP1とLKP2と名付けた（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）。LKP1遺伝子はZTLと同一であり、この遺伝子を変異させることにより、時計調節性遺伝子発現のリズムと葉の動きが遅延することになる（Somers et al., 2000）。またLKP1/ZTLはADO1と同一であり、この遺伝子をT-DNAノックアウトすることにより、赤色光中における子葉運動のリズム障害が生じる（Jarillo et al., 2001）。ADO1/LKP1/ZTLはPHYBとCRY1のC末端領域と相互作用することが示された（Jarillo et al., 2001）。LKP2の機能は、35S:LKP2植物を用いて分析された（Schutz et al., 2001）。これらの植物は定常光と暗黒の両条件下での概日時計出力に対するリズム障害表現型、胚軸伸長を示し、長日条件下で開花遅延表現型を示したが短日条件下ではそれを示さず、そのためシロイヌナズナにおいてLKP2は概日オシレータの内部または非常に近い場所で機能していると考えられた。LKP2はADO2ならびにFKL2と同一である（Nelson et al., 2000; Somers et al., 2000; Jarillo et al., 2001）。このファミリー中の他のタンパク質はFKF1またはADO3である。ADO3/FKF1遺伝子はfkf1変異体中の変異遺伝子として同定されており、この変異体は長日条件下で開花遅延するが、春化処理またはジベレリン処置により救助できる（Nelson et al., 2000）。
【００４０】
本発明者らが本実施例で示すのは、LKP2のプロモータ活性、LKP2の細胞内局在、ならびにシロイヌナズナSkp-1様タンパク質（ASK）に対する、また概日時計成分と可能性のある補助因子に対するLKP2の分子的相互作用である。また本実施例ではこの相互作用の重要性をLKP2の機能に関して考察する。
【００４１】
［材料と方法］
植物材料と生育条件
Arabidopsis thaliana（Columbia生態型）の種子を、0.8%寒天を含む発芽培地（GM）（Valvekens et al., 1988）に無菌的に播種し、暗黒下3日間にわたり4℃でインキュベートして休眠を破り、その後、22℃における16時間光照射（約100μmol s-1 m-2）と8時間暗による長日条件下で成長させた。
【００４２】
DNAシーケンス分析
シーケンス用のプラスミドDNAテンプレートは自動プラスミド単離機（PI-200とPI-50alpha、Kurabo、Osaka、Japan）で調製した。DNAシーケンスの決定は、BigDye Terminator Cycle Sequence法により、DNAシーケンサ（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer；Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）上で実施した。GENETYX（Software Development, Tokyo, Japan）ならびにSequencher（Gene Codes Corporation、Ann Arbor、MI、USA）ソフトウェアシステムを用いてDNAシーケンス解析を行った。
【００４３】
遺伝子組み換え植物
ATG開始コドンからLKP2コーディングシーケンスに20bpオーバーラップする1.6kbの5'非コーディング領域を、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、CA、USA）を用いて、シロイヌナズナのゲノムDNAよりPCR増幅した。使用プライマは5'-GAGAGCTAGCTCTCCGGCAAAGTCTCGACC-3'（配列番号１）ならびに5'-TCTCCCCGGGCACTCCATTTGATTTTGCAT-3'（配列番号２）であり、これらはそれぞれ各末端でNheI部位ならびにSmaI部位として導入された。PCR断片をpCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）中にサブクローンし、全体をシーケンス分析してシーケンスを確認し、その後プロモータを持たないβ-グルクロニダーゼ（GUS）発現ベクターであるpBI101（Clontech、Palo Alto、CA、USA）中へ結合させた。結果として得られたコンストラクトをシーケンス解析し、LKP2の最初の6アミノ酸がGUSタンパク質領域にインフレーム融合していることを確認した。
GFPのS65T修正版（smRS-GFP）（Davis and Vierstra, 1996）を用いてGFP-LKP2コンストラクトを作成した。GFPコーディング領域のPCR増幅は、Arabidopsis Biological Resource Center（Columbus、OH、USA）より入手したpsmRS-GFPをもとに、5'-GAGATCTAGACAATGAGTAAAGGAGAAGAA-3'（配列番号３）ならびに5'-TCTCAGGCCTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3'（配列番号４）のプライマを用いて実施したが、これらのプライマにより、それぞれ各末端でXbaI部位とStuI部位が導入された。LKP2コーディング領域のPCR増幅も同様に、cDNAをもとに5'-GAGAAGGCCTTATGCAAAATCAAATGGAGT-3'（配列番号５）と5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号６）のプライマを用いて実施したが、これらのプライマにより、それぞれ各末端でStuI部位とBamHI部位が導入された。両PCR断片をサブクローンし、全体をシーケンス分析してシーケンスを確認し、StuI部位に結合させ、再度シーケンス分析を行った。次にGFP-LKP2断片を、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモータを含む発現ベクターであるpBE2113内に導入した（Mitsuhara et al., 1996）。
シロイヌナズナ植物のアグロバクテリウム媒介性形質転換は、簡易in planta浸潤法により実施した（Clough and Bent, 1998）。形質転換株の選択は、50μg/mLカナマイシンを含むGM寒天上で行った。
【００４４】
GUS染色、GFP、DAPI観察
形質転換植物中のGUS活性の組織化学的定位は、既発表論文（Nakashima et al., 1977）に従って実施した。GFP活性ならびに4',6'-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色の光学像は、Olympus BX51顕微鏡（Olympus、Tokyo、Japan）により、蛍光ユニットと適切なフィルタユニットを用いて取得した。またGFP蛍光の可視化は、Leica TCS-E共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Leica Microsystems GmbH、Mannheim、Germany）により、空冷式アルゴンイオンレーザー系を用いて行った。
【００４５】
RNAゲルブロット分析
総RNAは既発表論文（Kiyosue et al., 1992）に従って植物全体から単離し、ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル中で分画し、ナイロンフィルタ上にブロットした。DIG標識化RNAプローブはLKP2 cDNAまたはGFPのコーディング領域より調製したものを用いて、メーカー（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）の指示に従ってハイブリダイゼーションを行った。科学蛍光シグナルの検出は、Light Captureシステム（AE-6962；Atto、Tokyo、Japan）を用いて行った。
【００４６】
酵母2-ハイブリッドクローンと分析
LKP1、LKP2、FKF1、ASK、TOC1、CCA1、LHY、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9の全長cDNAのコロンビア版の入手源は、cDNAライブラリスクリーニング（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）、ReverTra Dash（Toyobo、Osaka、Japan）を用いたRT-PCR、またはRIKEN Bio Resource Center（Tsukuba、Japan）であった。クローンをPCR増幅して適当な制限酵素部位を生成し、pCR-TOPO（Invitrogen）内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。PCRに用いたプライマは以下の通りである。
LKP1には5'-AGGATCCGTATGGAGTGGGACAGTGGTTCC-3'（配列番号７）ならびに5'-AGGATCCTTACGTGAGATAGCTCGCTAGTG-3'（配列番号８）；
LKP2には5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号９）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号１０）；
FKF1には5'-AGGATCCGTATGGCGAGAGAACATGCGATC-3'（配列番号１１）ならびに5'-AGGATCCCTTTACAGATCCGAGTCTTGCCG-3'（配列番号１２）；
ASK1には5'-AGGATCCGTATGTCTGCGAAGAAGATTGTG-3'（配列番号１３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGGTTCT-3'（配列番号１４）；
ASK2には5'-AGGATCCGTATGTCGACGGTGAGAAAAATC-3'（配列番号１５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAACGCCCACTGATTCT-3'（配列番号１６）；
ASK3には5'-AGGATCCGTATGGCAGAAACGAAGAAGATG-3'（配列番号１７）ならびに5'-AGGATCCTCACTCGAACGCCCACCTGTTCT-3'（配列番号１８）；
ASK4には5'-AGGATCCGTATGGCAGAAACGAAGAAGATG-3'（配列番号１９）ならびに5'-AGGATCCTCACTCGAACGCCCACTTGTTCT-3'（配列番号２０）；
ASK5には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGATCATGTGG-3'（配列番号２１）ならびに5'-AGGATCCTCATTGAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号２２）；
ASK7には5'-AGGATCCGTATGTCGACAAAAAAGATCATG-3'（配列番号２３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTGT-3'（配列番号２４）；
ASK8には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAAAAGATCATG-3'（配列番号２５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTCT-3'（配列番号２６）；
ASK9には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGAAGATCATA-3'（配列番号２７）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTCT-3'（配列番号２８）；
ASK10には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGAAGATCATA-3'（配列番号２９）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAACCCCATTGATTCT-3'（配列番号３０）；
ASK11には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGATGATCGTG-3'（配列番号３１）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３２）；
ASK12には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGATGATCGTG-3'（配列番号３３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３４）；
ASK13には5'-AGGATCCGTATGTCGAAGATGGTTATGTTG-3'（配列番号３５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３６）；
ASK14には5'-AGGATCCGTATGTCTTCCAACAAGATTGTT-3'（配列番号３７）ならびに5'-AGGATCCCTATTCAAAAGCCCATGCGTTTT-3'（配列番号３８）；
ASK15には5'-AGGATCCGTATGTCTTCTAACAAGATTGTG-3'（配列番号３９）ならびに5'-AGGATCCCTAGGGCTTTGGATCTTCGTGTT-3'（配列番号４０）；
ASK17には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGAAGATTGTG-3'（配列番号４１）ならびに5'-AGGATCCTTAATTGAAAGCCCATTCGTTCT-3'（配列番号４２）；
ASK18には5'-AGGATCCGTATGGCTTCTTCTTCCGAAGAG-3'（配列番号４３）ならびに5'-AGGATCCTTACTCATTAAAAGTCCAAGCAT-3'（配列番号４４）；
ASK19には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAAAAGATTGTG-3'（配列番号４５）ならびに5'-AGGATCCCTAGGGTTTTGGAACTTGTTGTT-3'（配列番号４６）；
ASK20Aには5'-AAGATCTGTATGTCAGAAGGTGATTTGGCC-3'（配列番号４７）ならびに5'-TAGATCTCAGCCTTGTGATCTGTGAAACAG-3'（配列番号４８）；
ASK20Bには5'-AAGATCTGTATGTCAGAAGGTGATTTGGCC-3'（配列番号４９）ならびに5'-TAGATCTTGGAGATTGACCTGTATGCCGTC-3'（配列番号５０）；
TOC1には5'-AGAGCTCGTATGGATTTGAACGGTGAGTGT-3'（配列番号５１）ならびに5'-AGAGCTCTCAAGTTCCCAAAGCATCATCCT-3'（配列番号５２）；
CCA1には5'-AGGATCCGTATGGAGACAAATTCGTCTGGA-3'（配列番号５３）ならびに5'-ACGGATCCCTCATGTGGAAGCTTGAGTTTC-3'（配列番号５４）；
LHYには5'-AGGATCCGTATGGATACTAATACATCTGGA-3'（配列番号５５）ならびに5'-ACGGATCCTCATGTAGAAGCTTCTCCTTCC-3'（配列番号５６）；
APRR3には5'-AGGATCCGTATGTGTTTTAATAACATTGAA-3'（配列番号５７）ならびに5'-AGGATCCTCAATTGTCTTCACTTCCTGATT-3'（配列番号５８）；
APRR5には5'-AGGATCCGTATGTGGCAAACGTGGCCACGT-3'（配列番号５９）ならびに5'-TGGATCCTATGGAGCTTGTGTGGATTGGAC-3'（配列番号６０）；
APRR7には5'-ACCCGGGTATGAATGCTAATGAGGAGGGGG-3'（配列番号６１）ならびに5'-ACCCGGGTTAGCTATCCTCAATGTTTTTTA-3'（配列番号６２）；
APRR9には5'-AGGATCCGTATGGGGGAGATTGTGGTTTTA-3'（配列番号６３）ならびに5'-TGGATCCTCATGATTTTGTAGACGCGTCTG-3'（配列番号６４）。
【００４７】
これらのPCRプライマはRT-PCRにも用いた。
LKP2の各ドメインコンストラクトもやはりPCRにより構築し、pCR4-TOPO（Invitrogen）内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。
PCRに用いたプライマは以下の通りである。
LKP2のLOVドメイン（L）には5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号６５）ならびに5'-TGGATCCTTAGGGCCCAGGCCTTCTAGGAATTTCTTTTGC-3'（配列番号６６）；
LKP2のF-box領域（F）には5'-AGGATCCGTATATCTCGCTCATTTACTTCT-3'（配列番号６７）ならびに5'-TGGATCCTTACCTTTTTGCACCGGGAACAC-3'（配列番号６８）；
LKP2のケルヒ繰り返し領域（K）には5'-AGGATCCGTATTGGTTGGGTGCGACTGGCC-3'（配列番号６９）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７０）；
LKP2のLFには5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号７１）ならびに5'-TGGATCCTTACCTTTTTGCACCGGGAACAC-3'（配列番号７２）；
LKP2のFKには5'-AGGATCCGTATATCTCGCTCATTTACTTCT-3'（配列番号７３）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７４）。
【００４８】
LKP2のLK（L+K）コンストラクトのためには、Lには5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号７５）と5'-AGATCTAGGCCTTCTAGGAATTTCTTTTGC-3'（配列番号７６）、Kには5'-AAGATCTATTGGTTGGGTGCGACTGGCCCG-3'（配列番号７７）と5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７８）のプライマセットを用いて、2種類のPCR断片を生成し、pCR-TOPO内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。
【００４９】
次にL断片をBamHIとBglIIの二重消化により切り出し、pCR4サブクローン化K断片内部のBglII部位に結合させた。接合領域はシーケンス分析してフレーム内接合を確認した。サブクローン化断片は適切な制限酵素で切り出し、GAL4活性化ドメインを含むpGADT7、あるいはGAL4 DNA結合ドメインを含むpGBKT7のマルチクローニング部位内に導入した（Clontech）。接合領域はシーケンス分析してフレーム内接合を確認した。コンストラクトの適当な対をAH109酵母細胞内に導入した。
形質転換株の増殖は、ロイシンとトリプトファンが欠如した合成完全（SD）培地上で行い、アデニン（Ade）、ヒスチジン（His）、ロイシン（Leu）、トリプトファン（Trp）の欠如したSD培地上で、3-amino-1,2,4-triazole（3-AT）添加または非添加条件下にて、分析した。
【００５０】
相互作用試験は、Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3のユーザマニュアルと、Clontechから得たYeast Protocols Handbookの記述に従って、少なくとも3種類の独立した形質転換株を用いて実施した。この系においてレポーター遺伝子のADE2、HIS3、MEL1/LacZは、完全に異なる3種類のGAL4上流活性化シーケンスとTATAボックスエレメントの調節下にある。HIS3栄養マーカーを用いて弱陽性相互作用を同定することが可能である一方、ADE2マーカーは非常に厳密であり擬陽性の発生率を減少させる（James et al., 1996）。lacZレポーターの発現により2-ハイブリッド相互作用がさらに確認され、擬陽性が減少する。
【００５１】
スポット分析では、LeuとTrpの存在しないSD培地中での一晩の液体培養（OD600=1.5）を、Ade、His、Leu、Trpの存在しないSD寒天培地上に、3-ATの存在下または非存在下にてスポットした（5μL）。酵母コロニーの培養は30℃で、赤、遠赤外、青、緑、白色光（フォトン束密度40μmol s-1 m-2）（LED系：Sanyo、Osaka、Japan）または暗黒条件下で行った。β-ガラクトシダーゼ活性分析のために、それぞれの一晩培養から得た酵母細胞を遠心沈殿させ、凍結-融解を3回繰り返して透過化処理を行った。粗抽出物はO-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside存在下、30℃でインキュベートし、OD420を記録した。活性はMiller単位で示した。
【００５２】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析のために、酵母細胞を50ml YPD（酵母抽出物/ペプトン/ブドウ糖）培地中で4-8時間にわたり増殖させ（OD600=0.6）、遠心により沈殿させ、液体窒素中で凍結した。沈殿には400μlの抽出緩衝液（40mM Tris-HCl［pH6.8］、8M尿素、5% SDS、0.1mM EDTA、0.4mg/mlブロモフェノールブルー、0.8% 2-メルカプトエタノール、6.2μg/mlペプスタチンA、1.86μMロイペプチン、9.0mMベンズアミド、23.0μg/mlアプロチニン、0.77mg/mlフェニルメチルスルホニルフルオライド）を添加し、ホモジナイズした。細胞の粗抽出物（12μl）を各レーンに載せ、SDS-PAGEによりタンパク質の分離を行い、ニトロセルロース上に電気的に転写した。ここでは抗mycまたは抗HA抗体を用いて、試験対象のタンパク質を検出した。
【００５３】
［結果］
LKP2遺伝子のプロモータ活性
組織特異的なLKP2 mRNAレベルはこれまでに調査されており、それによるとLKP2のmRNAがロゼット葉、花、長角果に蓄積し、少量のmRNAが根、茎、茎葉、種子に検出されている（Shultz et al., 2001）。LKP2のプロモータ活性をモニターするため、本発明者らはLKP2プロモータであるGUSコンストラクトを含む、遺伝子組み換えシロイヌナズナ植物を作成した（図1）。GUSシグナルは、苗木では全部分に検出されたが、2週齢のロゼット植物ではロゼット葉と根端に限定されていた。花ではGUS活性はがく片に検出された。GUSシグナルは若い長角果に検出されたが、古い長角果には検出されなかった。これらの結果は、RT-PCRにより検出されたLKP2のmRNAレベルに一致しており（Schultz et al., 2001）、そのことから1.6kbのプロモータ領域がLKP2発現を調節するために十分な要素を有していると考えられる。
【００５４】
GFP-LKP2の細胞内局在
LKP2の細胞内局在を可視化するため、本発明者らはCaMV 35Sプロモータに由来するGFP-LKP2融合コンストラクトをシロイヌナズナに導入し、RNAゲルブロット分析により高発現株を選択した（データ示さず）。この遺伝子組み換え植物は、35S:LKP2植物に見られるのと同様の胚軸伸長と開花遅延の表現型を示しており（Schultz et al., 2001）、この遺伝子組み換え植物において導入されたLKP2-GFPタンパク質が機能していると考えられる（データ示さず）。これらの株ではGFP関連蛍光は核内に分布していたが核小体には見られず（図2H）、35S:GFP植物の細胞全体にわたり、非常に強いGFPシグナルが検出された（図2B）。これらのデータからLKP2は核タンパク質であると考えられる。
【００５５】
F-boxタンパク質としてのLKP2
シロイヌナズナでは、これまでに700種類を超えるF-boxタンパク質がゲノム分析により同定されている（Gagne et al., 2002; Kuroda et al., 2002; Risseuw et al., 2003）。しかし、これらの公表データは主にコンピュータプログラム分析に基づいているため、F-box活性のないタンパク質や、進化途上で活性を消失したタンパク質もその数に含まれているだろう。LKP2がF-boxタンパク質として機能することを確認するため、ここでは酵母2-ハイブリッド系で、シロイヌナズナSKP1様（ASK）タンパク質を用いた相互作用試験を行った（図3A）。試験対象となった19種類のASKタンパク質（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20A、ASK20B）のうち、LKP2が相互作用したのは9種類（ASK1-5、ASK11、ASK14、ASK20A、ASK20B）であった。LKP2のASKタンパク質との相互作用は、ASK3-5、ASK20A、ASK20B以外の2種類によるASKタンパク質との相互作用と類似していた。LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域のアミノ酸シーケンスは相互に類似しているため（LKP1とLKP2、68.1%；LKP2とLKP3、63.8%；LKP1とLKP3、66.0%の相同性）、これらのタンパク質のASK選択性（ASK1、ASK2、ASK11、ASK14）は意外ではない。さらにASK1、ASK2、ASK11は、シロイヌナズナ内の広範囲のF-boxタンパク質と相互作用する（Gagne et al., 2002; Risseeuw et al., 2003）。LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域はASKタンパク質の結合のためには十分である（図3B-D）。
【００５６】
ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質との相互作用
分裂酵母と哺乳類では、F-boxタンパク質はホモならびにヘテロダイマーとして機能すると報告されている（Kominami et al., 1998; Suzuki et al., 2000）。さらに、WC-1タンパク質は、アカパンカビの青色光センシングに関連するZnフィンガー転写因子を含むLOVドメインの一つであるが、このタンパク質について自己二量体化が報告されている（Ballario et al., 1998）。そのため本実施例では酵母2-ハイブリッド系を用いて、ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質に対するLKP2の相互作用を調べた。制限培地上での酵母増殖試験によれば、LKP2とLKP1、LKP2とLKP2、LKP2とFKF1の間には相互作用が観察されたが、LKP1とLKP1や、LKP1とFKF1の間には何も検出されなかった（図4A）。この相互作用はβ-ガラクトシダーゼ活性によっても確認された（図4B）。これらの結果から、LKP2はLKPファミリータンパク質と協同して機能するらしいと考えられる。本発明では異なる光条件下（赤、遠赤外、青、緑、白色）で、光の性質が制限培地上の酵母増殖に及ぼす影響を調べたが、増殖に違いは見られなかった（データ示さず）。
【００５７】
LKP2の概日時計成分に対する相互作用
35S:LKP2植物を用いた分析から、LKP2は概日オシレータの内部もしくはその非常に近くで機能していると考えられた（Schultz et al., 2001）。LKP2は核タンパク質であるため（図2）、本発明では核局在化時計関連因子に対するLKP2の相互作用分析を実施した。Ade、His、Leu、Trpを含まないSD培地上での増殖試験においては、LKP1とTOC1については強い相互作用が検出され、LKP1とTOC1については弱い相互作用が検出された（図5A）。これらの相互作用はベイト/プレイの配置を逆転させた場合にも観察された（データ示さず）。FKF1とTOC1の間には相互作用は見られなかった。CCA1またはLHYに対するLKP2の相互作用は検出されなかった。LKP1とFKF1も同じくCCA1やLHYとは相互作用しなかった。β-ガラクトシダーゼ活性を調べてこれらの相互作用を確認した。LKP2とTOC1コンストラクトを保有する酵母においては強いガラクトシダーゼ活性が検出され、LKP1とTOC1コンストラクトを保有する酵母では弱い活性が検出された（図5B）。分析対象となったその他のコンストラクトの組み合わせを保有する酵母においては、有意なガラクトシダーゼ活性は全く検出されなかった。これらの結果からも、TOC1はLKP1とLKP2の両方に対して相互作用可能であるが、FKF1とは相互作用できないと考えられる。いずれの相互作用も、本発明者らが実施した光品質処理による影響を一切受けなかった（データ示さず）。
TOC1に結合するLKP2ポリペプチドの一部についても、同様に酵母2-ハイブリッド系により局在化を調べた。LKP2のドメイン1個または2個を発現するコンストラクト6種類を調査対象とした（図6）。この2-ハイブリッド系では、LOVドメインを含むペプチドとTOC1の間に相互作用が検出されたが、TOC1とLOVドメインを含まないLKP2ペプチドの間には相互作用は検出されなかった。これらの結果から、LKP2のLOVドメインはTOC1を結合するために必要十分であることが示される。
【００５８】
TOC1パラログに対するLKP2の相互作用
TOC1はシロイヌナズナの中央オシレータの一成分であり、myb様のDNA結合タンパク質であるCCA1とLHYと共に、フィードバックループを形成する。一方ではシロイヌナズナには4種類のTOC1パラログ、すなわちAPRR3、APRR5、APRR7、APRR9が存在している。LKP2結合の特異性を分析するため、本発明ではAPRRファミリータンパク質を用いて2-ハイブリッド分析を行った（図7A、B）。TOC1の場合と同じく、LKP2とAPRR5の間には強い相互作用が検出され、LKP1とAPRR5の間には弱い相互作用が検出された。これらの相互作用はベイト/プレイの配置を逆転させた場合にも観察された（データ示さず）。LKPファミリータンパク質とその他のAPRRファミリータンパク質の間にその他の相互作用は検出されなかった。APRR5に結合するLKP2ポリペプチドの一部についても、同様に酵母2-ハイブリッド系により調査を行った。TOC1の場合と同じく、LKP2のLOVドメインはAPRR5を結合するために必要十分である（図8）。
【００５９】
［考察］
本実施例で本発明者らは、1.6-kbのプロモータ領域とGUSレポーター遺伝子を融合させることによる、LKP2遺伝子のプロモータ活性を示している。LKP2プロモータ-GUS融合体の高発現は、子葉とロゼット植物に観察されたが（図1A、B）、そこでは比較的高レベルのプロモータ活性、あるいはLKP1とFKF1のmRNA蓄積が報告されている（Kiyosue and Wada, 2000; Nelson et al., 2000）。またLKP2プロモータ-GUS活性が検出された部位は、LKP1とFKF1プロモータの活性が報告された（Nelson et al., 2000）部位であるがく片（図1C）、FKF1プロモータ-GUS活性が報告された（Nelson et al., 2000）部位である根端（図1B）、LKP1プロモータ-GUS植物においてGUS活性が検出されている（Kiyosue and Wada, 2000）若い長角果（図1D）等である。LKP2はLKP1とFKF1に相互作用しうるため（図4）、LKP1および/あるいはFKF1が共通して発現する場所で、LKP2はそれらに対して作用する可能性がある。また、本発明者らはLKP2がTOC1とAPRR5に相互作用しうることを示した（図5,7）。APRR5の器官特異的な発現についてはまだ調査が行われていないが、TOC1とAPRR5の発現がロゼット葉に検出されており（Makino et al., 2000; Sato et al., 2002）、これはLKP2プロモータ活性とLKP2発現がロゼット葉に存在する点と一致している（図1）（Schultz et al., 2001）。
35S:GFP-LKP2植物において、GFP関連シグナルは核内に分布しているが、核小体には分布していなかった（図2H）。この分布パターンは35S:GFP-LKP1植物のGFPシグナルの場合や（Kiyosue and Wada, 2000）、異なるシロイヌナズナ組織中のASK1に対するシグナルの免疫局在の場合と同一であるが（Farras et al., 2001）、これはLKP2がLKP1とASK1にタンパク質-タンパク質相互作用する点に一致している（図3、4）。TOC1はLKP2と相互作用可能であり（図7）、また核内に位置している（Makino et al., 2000）。一時的に形質移入されたタバコ細胞中のYFP-TOC1シグナルは、核内で小斑点状のパターンを示し、そこからTOC1はおそらくトランスクリプトーム、スプライセオソーム、プロテアソームで機能する可能性が考えられる。これはLKP2がおそらく標的タンパク質をユビキチン化するSCF複合体として機能している点に一致しており、この場合のユビキチン化は、標的タンパク質を分解のためにプロテアソームまで輸送する引き金になっている（Strayer et al., 2000）。APRR5の細胞内局在に関する報告はまだ存在しないが、APRR5はC末端領域にCCTドメインが存在することから核タンパク質であると思われる。CCTドメインはCONSTANS、CONSTANS様、ならびにAPRR/TOC1ファミリータンパク質に見られる共通モチーフであり、これらのタンパク質の核局在に重要であると考えられている（Makino et al., 2000; Robson et al., 2001）。
シロイヌナズナでは21種類のSkp1様ASK遺伝子が存在するが、ASK6とASK15はフレームシフトを有するため偽遺伝子であると考えられている（Risseeuw et al., 2003）。ASK20からは選択的スプライシングにより、同一遺伝子から2種類のタンパク質ASK20AとASK20Bが生成される（Risseeuw et al., 2003）。本発明での結果から、LKP2はLKP1やFKF1と同様に、ASK1、ASK2、ASK11、ASK14と相互作用することが示された（図3）。ASK1、ASK2、ASK11に対するLKP1の酵母2-ハイブリッド相互作用や、ASK1に対するFKF1の同じ相互作用についてもこれまでに報告されている（Kuroda et al., 2002; Risseeuw et al., 2003）。またRisseeuw et al.の報告によれば、ASK3、ASK4、ASK7、ASK8、ASK9、ASK12、ASK19に対してLKP1が相互作用するというが、本発明で本発明者らが行った2-ハイブリッド分析においては、ASK4を除きこれらは検出されなかった。これらの違いはおそらく培養条件やベクター系が原因だろう。本実施例では2-ハイブリッドアッセイを30℃の厳密な選択条件で実施したが、彼らのアッセイは20℃で実施された。本発明で使用した酵母2-ハイブリッドベクターのほうが信頼性が高いが、その理由は3種類のレポーター遺伝子（ADE2、HIS3、MEL1/lacZ）が、完全に異種である3種類のプロモータの調節下にあるためである。動物と酵母のSkp1タンパク質は、Cul1やRbx1に結合するのと同様に、F-boxタンパク質のF-box領域に結合してSCF複合体を形成し、この複合体はF-boxタンパク質により認識される標的タンパク質に対するE3ユビキチンリガーゼとして働くことが知られている（Skowyra et al., 1999; Kamura et al., 1999）。ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質のF-box領域が、シロイヌナズナSkp1様タンパク質と相互作用することから（図3B-D）、これらのタンパク質はSCF複合体の成分であり、E3ユビキチンリガーゼとして働くと考えられる。
図4には、LKP2がLKPファミリータンパク質と相互作用することが示されている。LKP2はLKP1、LKP2、またはFKF1と協働して異なる各種基質を認識する可能性もあり、またLKP2はこれらのファミリータンパク質が分解する場合に機能する可能性もある。Kim et al. (2003)の報告によれば、ZTL（LKP1）タンパク質レベルは、異なる概日フェーズに特異的なプロテアソーム依存性分解により調節されている。LKP2はZTL（LKP1）と相互作用しうるため、LKP2によりZTL（LKP1）がユビキチン化される可能性がある。
LKP2 LOVドメインコンストラクトは、APRR1/TOC1ならびにAPRR5と十分に相互作用した（図6、8）。LOVドメインを含む領域がタンパク質-タンパク質相互作用に関連していることは、PHOT1（NPH1）とNPH3の比較においても示されている（Motchoulski and Liscum, 1999）。アカパンカビの青色光センシング転写因子であるWC-1では、LOVドメインが自己二量体化に関与していることが示されている（Ballario et al., 1998）。LOVドメインはいずれの青色受容体にも見られるため、LKP2のLOVドメインの相互作用活性は光により調節されている可能性がある。しかし本実施例で実験した範囲では、LKP2 LOVドメイン含有領域を介して光の品質がタンパク質-タンパク質相互作用に影響することはなかった。だがLKP2 LOVドメインのN末端につながったGAL4活性化ドメインやDNA結合ドメインが光感受性に影響しているか、あるいは酵母に欠落しているある種の因子が光センシングに必要であるという可能性を除外することは出来ない。
酵母2-ハイブリッド系においてLKP1とLKP2はTOC1とAPRR5の両者に対して相互作用したが、FKF1とAPRR/TOC1ファミリータンパク質の間の相互作用は検出されなかった（図7）。LKP1、LKP2、FKF1のアミノ酸シーケンスは全体的に類似しており（LKP1とLKP2、74.1%；LKP2とFKF1、61.9%；LKP1とFKF1、66.1%）、全てにLOVドメイン、F-box、ケルヒ繰り返し領域があるにもかかわらず、FKF1の遺伝子発現プロファイルは、LKP1やLKP2の場合と異なっていた。1日を通して見るとFKF1のmRNAレベルは律動的であるが、これに対してLKP1とLKP2では一定にである（Kiyosue and Wada, 2000; Nelson et al., 2000; Schultz et al., 2001）。FKF1とLKP1やLKP2を隔てるこれらの違いが、FKF1と他のLKPファミリータンパク質の間の機能的区別を意味することになる。
LKP1とLKP2はいずれもTOC1とAPRR5に相互作用するという事実は、LKP1とLKP2に機能的重複性が見られる可能性を反映しているようだ。35S:LKP1と35S:LKP2植物に見られる、胚軸の伸長や長日条件下での開花遅延などといった発現型は類似しており、それらのアミノ酸シーケンスは類似している（73.0%同一性）ことから、それらの機能が重複していると考えるのはきわめて自然な成り行きである。しかし、ADO1/ZTL/LKP1中にT-DNAインサートを持ち、ADO1/ZTL/LKP1の発現をノックアウトした植物株では、CCR2発現のリズムが遅延し、子葉先端運動が見られることから（Jarillo et al., 2001）、LKP1とLKP2の重複性はごく一部であると考えられる。
TOC1とAPRR5に対するLKP2の相互作用について、少なくとも2種類の説明が可能である。一つはTOC1とAPRR5はSCFLKP2複合体のユビキチン化に対する標的であるというもの、あるいはLKP2はTOC1とAPRR5の安定性に関与しているというものである。TOC1は特徴がよく知られており、概日オシレータの成分である可能性がある（Schultz and Kay, 2003）。APRR5は時計に対する概日シグナルの増幅に影響し、概日出力を調節していることが報告されている。APRR5のT-DNA挿入個体では、時計媒介性の葉の運動期間が短縮され（Michael et al., 2003）、青色光条件下ではCCA1とCCR２の発現期間が短縮される（Eriksson et al., 2003）。APRR5を過剰発現する植物では、時計調節型遺伝子に対するmRNAレベルの規模は減少するが、そのリズム性は不変であるらしい（Sato et al., 2002）。そのため、35S:LKP2植物では大量のLKP2が、TOC1とAPRR5の両タンパク質レベルを減少させ、その結果リズム障害の表現型が生じる可能性がある。
もう一つの説明は、TOC1とAPRR5がLKP2へのシグナル伝達において作用し、標的タンパク質のユビキチン化を行っているというものである。ZTL（LKP1）のケルヒ繰り返し領域に点変異のある植物では、その変異の結果アミノ酸がAspからAsnに置換されており、概日リズム遅延の表現型が見られる（Somers et al., 2000）。ケルヒ繰り返しはベータプロペラ構造を形成すると予想され、概日時計関連のユビキチン化基質におけるタンパク質-タンパク質相互作用において機能すると考えられる。Steve Kayのグループは、DOF（ワンフィンガーによるDNA結合）転写因子を単離しており、これはLKP2のケルヒ繰り返し領域と相互作用するが、その変異体（AspをAsnに置換）とは相互作用しない。因子の一つが過剰発現する結果、リズム障害を有する表現型が生じる（Kay, 2002）。そのためTOC1および/あるいはAPRR5が、そのようなケルヒ繰り返し相互作用因子とLKP2の間の相互作用を調節し、LKP2の機能を調節する可能性がある。
本発明では酵母2-ハイブリッド分析により、TOC1とAPRR5に対するLKP1とLKP2の相互作用を示した。これらの相互作用を確認するためには、たとえば免疫共沈降、プルダウン分析、in vivo相互作用などから支持データを得る必要がある。本発明では予備的な免疫共沈降分析を実施したが、それにもかかわらずこれらのタンパク質の間には強い相互作用は観察されなかった（データ示さず）。ここでは、何らかの光受容性発色団が存在することによって相互作用が影響されうると考えたが、これはNPH3に対するPHOT1（NPH1）の相互作用において、フラビンモノヌクレオチド（FMN）がPHOT1のLOVドメインに結合しなければならないためである（Motchoulski and Liscum, 1999）。最近の報告によれば、FKF1のLOVドメインはFMNに結合し、またLKP1（ZTL1）とLKP2のLOVドメインはFKF1に類似した分光特性を有するという（Imaizumi et al., 2003）。そのため、LOVドメインを介したTOC1とAPRR5に対するLKP1とLKP2の相互作用のためには、適切なフラビン類がLOVドメインに結合しなければならない可能性がある。
本発明に係る草稿がレビューされている途中に、シロイヌナズナではZTLによるTOC1の標的化分解により概日機能が調節されることをMas et al.（2003）が示したが、彼らはZTL（LKP1）に対してTOC1が物理的相互作用し、それがztl変異により無効化され、その結果構成レベルのTOC1タンパク質発現が生じることを示している。また彼らは、暗黒に依存するTOC1タンパク質の分解には機能的ZTL（LKP1）が必要であり、プロテアソーム経路を阻害することによりこの分解が阻害されることを示した。2-ハイブリッド分析において、LKP2はZTL（LKP1）とTOC1を認識できるため（図4）、TOC1分解に際してLKP2はLKP1と協働している可能性がある。この可能性を調べるためにはさらに研究が必要である。Mas et al.によれば、ZTLとTOC1の間には比較的強い2-ハイブリッド相互作用が、またLKP2とTOC1の間には比較的弱い相互作用が示されたが、本稿ではLKP2とTOC1の間に比較的強い相互作用が見られた（図5）。これはおそらく、本稿ではGAL4系を使用し、彼らはLexA系を使用していることによる違いが原因であろう。ある種のタンパク質間相互作用はGAL4ベースの2-ハイブリッド系では検出されないがLexAベースの系では検出可能となり、その逆の場合もあるということはよく知られている（Gyuris et al., 1993; Golemis et al., 1996; Mendelsohn and Brent, 1994）。
【実施例２】
【００６０】
（各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用）
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、光子量41μmol/m-2/s-1の各種光条件下（暗条件下、白色光下、青色光下、赤色光下）にて酵母を生育させ解析を行った。
（各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用）
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、暗条件下及び、光子量50μmol/m-2/s-1、100μmol/m-2/s-1、190μmol/m-2/s-1の青色光下にて酵母を生育させ解析を行った。
【００６１】
[結果]
シロイヌナズナphot1、phot2ではLOV domainが青色光に応答し、システイン残基を介してFMN（Flabin mononucleotide）と結合、遊離することが報告されている。このシステイン残基に変異を入れることによりFMNとの結合能力が失われ、また、自己リン酸化反応の消失や、光屈性の消失など様々な現象に変化が認められる。LKP1、LKP2のLOV domainにもこのシステイン残基は保存されており、FKF1のLOV domainについては実際にFMNと結合することが示されている（imaizumi et al.2003）。本発明では、LKP1、LKP2のシステイン（C）をアラニン（A）に置換したコンストラクト（LKP1 C82A、LKP2 C82A）を作製し、APRR1/TOC1、APRR5との相互作用に与える影響を解析した。これらのLKP変異体との相互作用は暗条件下、赤色光下において変化は認められないものの、白色光下ではやや相互作用が弱くなり、青色光下においては完全に相互作用が消失した（図9）。
次に、青色光下で光強度を50、100、190に振り分け光強度による相互作用に与える影響を解析した。光子量50の時点でLKP1 C82A、LKP2 C82AとAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用が完全に消失した。光子量190では変異体LKP1、LKP2のみでなく野生型LKP1とAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用との相互作用も消失していた。また、光強度を上昇させるにつれて変異体LKP1、LKP2を含むAH109株はSD-Leu、Trp培地（SD-LW）でも生育が阻害されていた（図10）。
【００６２】
[考察]
LKP1、LKP2のシステイン（C）をアラニン（A）に置換したコンストラクトを用いて、青色光下でAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用を解析した際には野生型LKP1、LKP2との間で認められていた相互作用が消失していた。
酵母2-Hybrid用のベクターにはHA-tagや転写活性化領域等が含まれており、これらとLKP1、LKP2との融合タンパク質として発現させているためにLKP1、LKP2のタンパク質構造が変化し、青色光に対する反応が起こりにくくなっているが、変異体を用いることにより青色光に対する反応が認めらにくくなっているという可能性が考えられる。実際に、LKP1（ZTL）によるTOC1のプロテアソーム系に依存した分解は暗下で促進され、明下ではTOC1タンパク質が蓄積することが報告されている（Mas et al.2003）。この結果は、暗下でのみLKP1とTOC1が相互作用し、明下ではTOC1との相互作用が認められなくなるという仮説を支持するものであると考えられる。
強光下で、変異型LKP1、LKP2を含むAH109株がSD-Leu、Trp培地（SD-LW）でも生育が阻害されるという現象は酵母内で発現している変異型LKP1、LKP2のタンパク質が不安定になるために起こるという可能性が考えられる。強光下において変異型LKP1、LKP2のタンパク質が不安定になる原因と機構については、現時点では定かではないが、ウエスタンブロット等を実施し、タンパク質の安定性を評価する必要があるだろう。
【実施例３】
【００６３】
（LKP2を核小体へ取り込む能力を持つLKP2相互作用因子の同定）
LKP2はF-boxタンパク質であり、概日時計オシレータの中心部または近傍で機能すると考えられている。LKP2の基質として作用するタンパク質の種類を決定する第一段階として、LKP2をバイトに用いて酵母2-ハイブリッドスクリーニングを実施したところ、2種類の相互作用因子Di19とCOL1が単離された。一時的に発現したDi19-GUS融合タンパク質はシロイヌナズナ葉柄細胞の核内に局在した。同様にCOL1と他のCO/COLファミリータンパク質にもLKP1/ZTL、LKP2またはFKF1と相互作用する能力があった。COまたはCOL1のLKP2結合部位は各タンパク質の中心付近に存在していた。COまたはCOL1のCCTモチーフはLKP2と相互作用するための十分条件にはならない。LKP2はF-boxとkelch反復を有するCOを認識し、他方ではLOVドメインを有するCOL1を認識した。LKP2をシアン蛍光タンパク質（CFP）と融合させてタマネギ表皮細胞内で一時的に発現させた場合に、CFP-LKP2シグナルは核と細胞質ゾル内に局在した。黄色蛍光タンパク質（YFP）-COとYFP-COL1は一時的に発現する場合にはいずれも核内局在しており、核小体を形成していた。しかしCOまたはCOL1に融合させたYFPと同時にCFP-LKP2を発現させるとCFP-LKP2が核内に取り込まれる結果が生じた。さらにCFP-LKP2とYFP-COのシグナルはpU2B"-mRFPのシグナルと共に局在していたが、このうち後者はカハールボディのマーカーである。これらの結果から、LKP2はCO/COLファミリータンパク質と共に核小体内で機能している可能性が考えられる。
【００６４】
［はじめに］
ユビキチンは熱安定性の76アミノ酸ペプチドであり、2個のαへリックス構造と5個のβシートにより構成され、真核生物において保存性が高い。ユビキチンの著名な機能はプロテアソーム依存性のタンパク質分解に対するシグナルである。しかしユビキチン化、すなわち他のタンパク質に対するユビキチンの共有結合によって調節される多数の細胞過程、すなわちウイルス出芽、細胞周期調節、DNA修復、転写調節、キナーゼ活性調節、タンパク質間相互作用、ユビキチン化タンパク質の細胞内局在などが存在する。このような調節に関してはユビキチンのポリマー化部位と状態が非常に重要である。K48にリンクされたポリユビキチン化は26Sプロテアソームに対する標的シグナルであるという可能性があり、一方でモノユビキチン化ならびにK63にリンクされたポリユビキチン化は各種の細胞内過程に対するシグナルであるという可能性がある（Deng et al. 2000, Hicke 2001, Pickart 2001, Hicke and Dunn 2003, Muratani and Tansey 2003, Pickart and Eddins 2004, Sakai et al. 2004, Shcherbik and Haines 2004, Sun and Chen 2004, Vodermaier 2004）。
ユビキチン化は3種類の酵素、すなわちユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチン-タンパク質リガーゼ（E3）により生じる。E1はATP依存性アデニル化を介して、ユビキチンとチオエステル結合を生じる。E2は活性化ユビキチンを受け取り、それを標的タンパク質に輸送する。E2はユビキチンと標的タンパク質の間のイソペプチド結合を触媒することが可能であるが、ほとんどの場合にE3が必要になる。E3はユビキチンの結合したE2からユビキチンを受け取ってそれを基質に輸送するか（HECT型）、あるいはユビキチンの結合したE2と基質を結合させる架橋因子として作用してから基質に対する活性化ユビキチンの結合反応を触媒する（RING、PHD、ならびにU-box型）。E3は基質特異性の決定に関係していることから真核生物ではこれらの酵素について大規模で多様なグループが存在する（Hedge 2004, Johnston and Madura 2004, Pickart and Eddins 2004）。
【００６５】
植物においてはゲノムシーケンスプロジェクトの結果として、多数の推定E3遺伝子が記録・同定されている。報告によれば、シロイヌナズナのゲノムは500種類以上のRINGドメインタンパク質と、600-700種類以上の潜在的なF-boxタンパク質をエンコードしている（Gagne et al. 2002, Kuroda et al. 2002）。これらのE3遺伝子は植物の発達、形態形成、ホルモン反応性などに関して機能することが示されている（Moon et al. 2004, Schwechheimer and Villalobos 2004）。
UFO（UNUSUAL FLORAL ORGANS）は植物について初めて同定されたF-boxタンパク質であり、花の分裂組織同一性や、花の組織発達に関して機能する（Levin and Meyerowitz 1995, Samach et al. 1999）。
COP1（Constitutive Photomorphogenesis 1）は光形態形成受容体であり、HY5（Long Hypocotyl 5）（Osterlund et al. 2000, Saijo et al. 2003）、phyA（phytochrome A）（Sco et al. 2004）ならびにLAF1（Long After Far Red Light 1）（Sco et al. 2003）の分解に関与する単一サブユニットのRING型E3である。
SINAT5（SEVEN IN ABSENTIA IN ARABIDOPSIS THALIANA 5）もやはり単一サブユニットのRING型E3であり、NAC1（NAM/CUC-like protein 1）のユビキチン化に関与しているが、このNAC1はオーキシンに反応する側根形成に対する転写活性化因子である（Xie et al. 2002）。
TIR1（TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1）はAUX/IAAファミリータンパク質の安定性を調節するが、このタンパク質にはARFs（オーキシン反応因子）に対する機能的抑制因子として作用する能力がある（Gray et al. 2001, Tiwari et al. 2001, Tiwari et al. 2004）。
SLY1（SLEEPY 1）はDELLAファミリータンパク質の安定性を調節してジベレリンシグナル伝達に関与している（Dill et al. 2004, Fu et al. 2004）。
EBF1（EIN3-binding F-box 1）とEBF2はエチレン反応性の転写活性化因子EIN3（Ethylene Insensitive 3）レベルを調節する（Guo and Ecker 2003, Potuschak et al. 2003, Gagne et al. 2004）。
COI1（Coronatine Insensitive 1）はジャスモン酸シグナル伝達に関与している（Xu et al. 2002）。
FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質はF-boxタンパク質であり、シロイヌナズナの概日時計と開花期に影響を及ぼす。この小規模なファミリーはLKP1/ZTL、LKP2/FKL、FKF1の3種類により構成される（Kiyosue and Wada 2000, Nelson et al. 2000, Somers et al. 2000）。このタンパク質ファミリーの各成分にはF-boxであるLOVならびkelch反復ドメインが含まれる。これらのLOVドメイン構造はPHOT1ならびにPHOT2青色光受容体のドメイン構造に類似しており（Briggs et al. 2001, Briggs and Christie 2002, Cheng et al. 2003）、FMNに結合可能である（Imaizumi et al. 2003）。これらのF-boxドメインは、いくつかのASK（Arabidopsis SKP1）タンパク質と相互作用することが示されている（Kuroda et al. 2002, Risseeuw et al. 2003, Yasuhara et al. 2004）。Kelch反復はWD40反復に似たβプロペラ構造とタンパク質間相互作用モジュールを形成すると考えられる（Li et al. 2004）。ZTLは概日時計において機能しTOC1（Timing of CAB Expression 1）分解に関与することが示されているが、このTOC1は中心概日オシレータの成分であると見なされている（Mas et al. 2003, Somers et al. 2004）。FKF1（Flavin binding, KELCH repeat, F-box 1）の遺伝子発現は概日時計により調節されているが、このFKF1は青色光受容体であり、開花期遺伝子CO（CONSTANS）の発現を調節することが報告されている（Nelson et al. 2000, Imaizumi et al. 2003）。
【００６６】
LOV KELCH PROTEIN2（LKP2）に関してみるならば、LKP2遺伝子を過剰発現する植物を長日条件で育成する場合には遅延開花の表現型が現れ、連続光または遮光条件下では、いずれの場合もCAB2またはCCR2に対する時計調節性遺伝子について不規則なプロモーター活性が現れたが、これらの事実からLKP2は概日時計に近い場所で機能していると考えられる（Schltz et al. 2001）。LKP2タンパク質はLKP1/ZTL、TOC1、PRR5に対しても相互作用する能力があった（Yasuhara et al. 2004）。PRR5はPRR/TOC1ファミリータンパク質の一員であると考えられており、このファミリータンパク質は概日時計の調節に作用していると考えられている（Sato et al. 2002, Yamamoto et al. 2003）。概日時計調節ならびに開花期調節におけるLKP2の機能をより深く理解するため、本実施例では酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2に相互作用するタンパク質因子を単離した。本実施例ではLKP2と活性相互作用を示す因子について、単離、分子的相互作用、局在に関して報告を行う。
【００６７】
［材料と方法］
DNAシーケンス分析
シーケンス分析に用いるプラスミドDNAテンプレートの調製と、DNAシーケンスの決定は既出論文どおり実施した（Yasuhara et al. 2004）。GENETYX（Software Development, Tokyo, Japan）ならびにSequencher（Gene Codes Co., Ann Arbor, MI, USA）ソフトウェアシステムを用いてDNAシーケンス分析を行った。
【００６８】
cDNAライブラリ構築と酵母2-ハイブリッドアッセイ
2-ハイブリッドアッセイは既報の通り実施した（Yasuhara et al. 2004）。cDNAライブラリ構築とそれに続く2-ハイブリッドスクリーニングは製造元の指示（MATCH-MAKER Library Construction & Screening Kit, Clontech, Palo Alto, CA, USA）に従って行ったが、これには22℃にて16時間の明条件と8時間の暗条件というLD条件下生育し、照明開始後4時間間隔（0、4、8、12、16、20時間）で収穫したシロイヌナズナ（Columbia生態型）のロゼット葉から単離したRNAを用いた。GAL4活性化ドメインを有する全長LKP2 cDNAをバイトとして用いた。
【００６９】
cDNAクローン
Di19、CO、COL1-10、COL13-16に対するcDNAのColumbia版は、ReverTra Dash（Toyobo, Osaka, Japan）を用いたRT-PCRによって、あるいは理研バイオリソースセンター（Tsukuba, Japan）より取得した。クローンはPCR増幅して適切な制限酵素部位を生成し、pGEM-T Easyベクター（Promega, Madison, WI, USA）中にサブクローニングを行い、シーケンス分析により検証し、pGBK7とpGADT7の各ベクター中にサブクローニングした。
PCRに用いたプライマは以下の通りであった。
Di19については5'-GGATCCGAATTCATGGACGCTGATTCCAAG-3’（配列番号７９）と5'-GGATCCGAATTCGACTTCATCGAAAATGGC-3’ （配列番号８０）；
COについては5'-AGGATCCGTATGTTGAAACAAGAGAGTAAC-3’ （配列番号８１）と5'-AGGATCCTCAGAATGAAGGAACAATCCCAT-3’ （配列番号８２）；
COL1については5'-AGGATCCTTATGTTGAAAGTAGAGAGTAAC-3’ （配列番号８３）と5'-AGGATCCTCAGAATGATGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号８４）；
COL2については5'-AGGATCCGTGAGTACCTTGATCTTGTGGAT-3’ （配列番号８５）と5'-AGGATCCTTAGAAGGAAGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号８６）；
COL3については5'-AGGATCCGTGAAATCACTAATTTGTTTTCC-3’ （配列番号８７）と5'-AGGATCCTCAGAAACTCGGAACAACACCGA-3’ （配列番号８８）；
COL4については5'-AAGATCTGTTCAGCTGAGGAAGTTCCGGGA-3’ （配列番号８９）と5'-AAGATCTCTAAAATGTAGGTACAAGTCCGA-3’ （配列番号９０）；
COL5については5'-AGGATCCGTGGTTCTTCTGACTTTATGTTT-3’ （配列番号９１）と5'-AGGATCCTCAGAACGTTGGTACGACACCGT-3’ （配列番号９２）；
COL6については5'-ATGATCAGAGATCAAGATGAAGGTGATGAG-3’ （配列番号９３）と5'-AGAGCTCTTAGTGAGCAACACCAATTGAAG-3’ （配列番号９４）；
COL7については5'-AGGATCCGTAAGGAACCAAACGATGTTGGA-3’ （配列番号９５）と5'-AGGATCCTCACGTCAAAAGTGACGTCCTCT-3’ （配列番号９６）；
COL8については5'-AGGATCCGTTTGATGAGCTGCAAGAAAGAT-3’ （配列番号９７）と5'-AGGATCCCTAAGAGTCGATGGCTAAAGATC-3’ （配列番号９８）；
COL9については5'-AGGATCCGTATGTGTGAAGATGACTTCTAC-3’ （配列番号９９）と5'-AGAGCTCTCAATAACTTCTGGTTGGGGTGA-3’ （配列番号１００）；
COL10については5'-AGGATCCGTGTATGTGAGGATGACTTCAAT-3’ （配列番号１０１）と5'-AGGATCCTCAGTAGCTTCTTGTTGGGCTCA-3’ （配列番号１０２）；
COL13については5'-AGGATCCGTATCCGACAGCTCCGTGGACTA-3’ （配列番号１０３）と5'-AGGATCCTCATGGATCTGCTGCCTTGGCGA-5'（配列番号１０４）；
COL14については5'-AGGATCCGGACTAATCATAGCACTGGCCAG-3’ （配列番号１０５）と5'-AGGATCCCTAAGGATCTGTAGCTTTCACAA-3’ （配列番号１０６）；
COL15については5'-AGGATCCGTACTACTACTAATCCTAGTGGT-3’ （配列番号１０７）と5'-AGGATCCTTAAGGGTAAGGAGCTTCACTAG-3’ （配列番号１０８）；
COL16については5'-AGGATCCGTGATGATGATCGAAAAGACGTG-3’ （配列番号１０９）と5'-AGGATCCTCAGTAATTAACACCTAATGGTG-3’ （配列番号１１０）。
【００７０】
COL1欠失体を得るためには各コンストラクトをPCR増幅し、pGEM-T Easyベクター（Promega）中にサブクローニングを行い、シーケンス分析により検証し、2-ハイブリッドベクター中に連結した。
PCR用のフォワードプライマーは
5'-AGGATCCGTCCTAATTCAGGGAAAAACAGT-3’ （配列番号１１１）、
5'-AGGATCCGTTTTCTGAACCTTGTTGATTAT-3’ （配列番号１１２）、
5'-AGGATCCGTGGGGAAGATGGAGTTGTTCCA-3’ （配列番号１１３）、
5'-AGGATCCGTGCTCTTCGAAGCTCCAATGGT-3’ （配列番号１１４）、
5'-AGGATCCGTAGAGAAGCTAGAGTCCTGAGA-3’ （配列番号１１５）であり、
リバースプライマーは
5'-AGGATCCTCAGAATGATGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号１１６）と
5'-AGGATCCCTTTGCAAACCGGCCCTTGATCC-3’ （配列番号１１７）であった。
【００７１】
CO欠失体を得るためには各コンストラクトをPCR増幅し、サブクローニングを行い、シーケンス分析し、2-ハイブリッドベクター中に連結した。
PCR用のフォワードプライマーは
5'-AGGATCCGTCTACCAATTTCTGGAAACTCT-3’ （配列番号１１８）、
5'-AGGATCCGTGAAGGTGAAGAAGGTGATAAG-3’ （配列番号１１９）、
5'-AGGATCCGTCCTAATTCAGACAAAAATAAC-3’ （配列番号１２０）、
5'-AGGATCCGTGAGTATCTAAACCTTGTGGAT-3’ （配列番号１２１）、
5'-AGGATCCGTTACGGGGGAGATAGAGTTGTT-3’ （配列番号１２２）、
5'-AGGATCCGTTCAGGGACTCACTACAACGAC-3’ （配列番号１２３）、
5'-AGGATCCGTGAGTATCTAAACCTTGTGGAT-3’ （配列番号１２４）、
5'-AGGATCCGTAGAGAAGCCAGGGTCCTGAGA-3’ （配列番号１２５）であり、
リバースプライマーは
5'-AGGATCCTCAGAATGAAGGAACAATCCCAA-3’ （配列番号１２６）、
5'-AGGATCCTATTGTCTTCTCAAATTTCCTTG-3’ （配列番号１２７）、
5'-AGGATCCGTCCATTGGACTGAGTTGTGTTA-3’ （配列番号１２８）、
5'-AGGATCCAGCTGTTGTGACACATGCTGTTG-3’ （配列番号１２９）、
5'-AGGATCCGCCATATTTGATATTGAACTGAA-3’ （配列番号１３０）、
5'-AGGATCCCGTCTGTGGTACGCTGCAGTTTT-3’ （配列番号１３１）、
5'-AGGATCCTCTCTTTGCGAACCGGCCATTGA-3’ （配列番号１３２）であった。
【００７２】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析のために、50mlのYPD（酵母抽出物/ペプトン/デキストロース）培地中で4-8時間にわたり酵母細胞を育成し（OD600=0.6）、遠心分離により沈殿させ、液体窒素中で凍結した。この沈殿を400μlの抽出緩衝液（40mM Tris-HCl、pH 6.8、8M 尿素、5% SDS、0.1mM EDTA、0.4mg ml-1ブロモフェノールブルー、0.8% 2-メルカプトエタノール、6.2μg ml-1 ペプシンA、1.86μM ロイペプチン、9.0mM ベンズアミジン、23.0μg ml-1 アプロチニン、0.77mg ml-1 フェニルメチルスルホニルフッ化物）中に再懸濁し、ホモジナイズした。細胞の粗抽出物（12μl）を各レーンに載せ、タンパク質の分離をSDS-PAGEにより行い、ナイロン膜上に電気的に転写した。タンパク質の検出は、抗cMycまたは抗血球凝集素抗体により行った。
【００７３】
ボンバードメント実験
全長のDi19 cDNAをBamHIで切断し、pB1221バイナリベクター（Clontech）において、CaMV 35Sプロモーターの調節下でGUS受容体遺伝子のフレーム内に融合させた。その結果得られたプラスミドDNAの1μgアリコートを、PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System（BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA）を用いたボンバードメントにより、シロイヌナズナの葉柄に形質導入した。ボンバードメント処理された葉柄を12時間以上25℃条件下で維持し、その後顕微鏡観察によって形質転移成功の徴候を調べた。対照としてpB1221も同様に葉柄へボンバードメント処理した。GUS染色と4’,6-diamino-2-phenylindole（DAPl）観察は、既報どおり実施した（Yasuhara et al. 2004）。
CaMV 35S::CFP（pAVA574）とCaMV 35S::YFP（pAVA554）を保有するトランジェントな発現ベクターを用いて、同時ボンバードメント実験を行った（von Amim et al. 1998）。全長のLKP2、CO、COL1、Di19クローンをBamHIにより切り出し、T4 DNAポリメラーゼにより末端を埋め、pAVA574またはpAVA554の平滑化BglII部位に結合させてフレーム内融合遺伝子を形成し、これをシーケンス分析によって検証した。pU2B"-mRFPとpSCL28を、それぞれカハールボディならびに核スペックルのマーカーとして利用した（Lorkovie et al. 2004）。各プラスミドDNAの1μgアリコートを、ボンバードメントによりタマネギ表皮細胞内に導入した。CFP、YFP、RFPシグナルの検出は、CCDカメラRetiga Exi急冷型Mono12ビット（QimaginG, Burnaby, BC, Canada）と標準CFPまたはYFPフィルタ（Olympus）の付属したBX51顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）により行った。画像分析はMetaMprph Imaging Softwareバージョン6.1（Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA, USA）により行った。三次元デコンヴォリューション化画像の構築は、AutoDeblut/Auto Visualize（バージョン9.3）ソフトウェア（AutoQuant Imaging, New York, NY, USA）を用いて行った。
【００７４】
［結果］
酵母2-ハイブリッドスクリーニングによるDi19とCOL1の単離
酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2と相互作用するタンパク質を単離した。LKP2全長cDNAを保有するpGBKT7ベクターと、シロイヌナズナのロゼット葉から得たRNAを用いて調製したpGAD7ベクター中の2.5×105クローンcDNAライブラリを用いて、酵母細胞を同時形質転換した。220種類の候補クローンを選別したが、これには5mM 3-amino-1H-1,2,4-triazole（3-AT）を含有し、なおかつアデニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを含まないSD培地における相補性を利用した。
二次スクリーニングでは候補クローンより得たプラスミドを単離し、再びpGBKT7-LKP2を用いて酵母細胞中に同時形質転換した。単離した220種類のプラスミドプールのうち、90種類が栄養要求性の相補性を示し、そのうち48種類のコロニーが5mM 3-AT存在下で生育可能であった。これらのコロニーのうち20種類が10mM 3-AT存在下で生育可能であり、14種類のコロニーが15mM 3-AT存在下で生育可能であった。
三次スクリーニングでは15mM 3-AT存在下で生育可能であった14種類のコロニーより得たpGADT7-cDNA単離物について、全てシーケンス解析を行った。
3段階のスクリーニングにより単離した同時形質転換済みのクローンはほとんどがrRNA、葉緑体または液胞タンパク質、ならびにフレーム外クローンであった。これはLKP2は主に細胞核内に存在すると考えられるため（Yasuhara et al. 2004）、葉緑体や液胞タンパク質のクローンは除外した。他のクローンはDnaJ様タンパク質、乾燥誘導性の未知タンパク質（異なるサイズのクローン2種類）、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ、ジンク・フィンガータンパク質などであった。
四次スクリーニングでは酵母細胞に対して5種類のpGADT-cDNAプラスミドのうちそれぞれ1種類と、pGBKT7空ベクターを用いて同時形質転換を行った。その結果、pGBKT7-LKP2非存在下では2種類のクローンが2-ハイブリッド系を活性化した。そのため結果的に、乾燥誘導性の未知タンパク質であるDi19と、ジンク・フィンガータンパク質のCOL1がLKP2結合タンパク質である可能性が示された。
【００７５】
LKP2に対するDi19の相互作用とその細胞内局在
初めはDi19は乾燥誘導性cDNAクローンとして単離されたが（Gosti et al. 1995）、この遺伝子についてそれ以上の情報は存在しなかった。本実施例で得たDi19クローンはいずれも部分的であり、アミノ酸53-206または63-206より得られた切断ペプチドに対応していたので、ここでは全長Di19逆転写（RT）-PCR cDNAを用いて2-ハイブリッドアッセイを行った。全長Di19はLKP2や、LKP/ZTLタンパク質ファミリーの他のメンバーと相互作用した（図1１）。GAL4のDNA結合ドメインと活性化ドメインを交換した場合にもやはり相互作用が生じた（データ示さず）。40μmol m-2s-1条件で赤色光、遠赤外光、青色光、緑色光、白色光について2-ハイブリッド相互作用に対する光の影響は無かった（データ示さず）。
Di19の細胞内局在を可視化するため、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター誘導性βグルコシダーゼ（GUS）-Di19融合タンパク質コンストラクトとベクター対照をボンバードメント法によりシロイヌナズナ葉柄細胞内に導入した。Di19-GUS活性は核内に局在していたが（図１２の(A)、(B)）、ベクター対照GUS活性は何らかの細胞領域またはオルガネラに限定されていなかった（図１２の(C)）。従って細胞内Di19はLKP2と共在している（Yasuhara et al. 2004）。
【００７６】
LKP2に対するCO/COLファミリータンパク質の相互作用
COL1はCO/COL1ファミリータンパク質の一員であり、2個のB-box型ジンクフィンガーモチーフならびにCCTモチーフを保有している（Ledger et al. 2001）。このCCTモチーフは全てのCO/COLならびにPRR/TOC1ファミリータンパク質において保存されているが、CO/COLタンパク質には1個しかB-boxモチーフを保有しないものもある。酵母から単離したCOL1 cDNAは切断されているため、ここでは全長COL1 cDNAと一連の欠失体を用いて（図１３のA）、COL1とLKP2の分子的相互作用を調べた。全長COL1(1-355)はLKP2非存在下でレポーター遺伝子を活性化した。COL1のN末端欠失体(145-355)もやはりLKP2非存在下でこの系を活性化することが可能であった。しかしCOL1(163-355)とCOL1(195-355)はいずれもLKP2の存在に依存してレポーター遺伝子を活性化することが可能であった。COL1(195-355)は2-ハイブリッドスクリーニングで単離されたクローンに対応している。COL1(228-355)とCOL1(286-327)にはCCTモチーフを含む欠失があるが、いずれのタンパク質もレポーター遺伝子を活性化することができなかった。以上の結果からCOL1とLKP2の相互作用にはアミノ酸195-227を含むCOL1領域が必要であると考えられる。40μmol m-2s-1条件下の光に影響を受ける相互作用は存在しなかった（データ示さず）。
ここではまた、他のCO/COLファミリーメンバーに対するLKP/ZTLファミリーメンバーの2-ハイブリッド相互作用を調べた（図１３のB）。ジンクフィンガーモチーフを保有するCOL1の領域は、プレイ挿入無しでレポーター遺伝子を活性化するため、ここでは試験対象となる全てのCO/COLタンパク質からジンクフィンガーモチーフを除去した。CO/COLタンパク質に対するベクターpGBKT7またはpGADT7を用いてバックグラウンドの活性化レベルを低減させた。その結果COとCOL1-6、COL8とCOL13-15がLKP2と相互作用し、またLKP1/ZTLやFKF1と相互作用する事例も一部に存在した。Di19との相互作用と同じく、2-ハイブリッド相互作用に対する光の影響は観察できなかった（データ示さず）。
一連のN-末端ならびにC-末端欠失誘導体を用いて、COとLKP2の相互作用を調べた（図１３のC）。CO(1-373)ならびに一連のN-末端欠失変異体であるCO(106-373)、CO(140-373)、CO(157-373)は、LKP2非依存でレポーター遺伝子を活性化した。このアッセイではCO(175-373)、CO(208-373)、CO(241-373)は有意にLKP2と相互作用した。一連のC末端欠失変異体についてはCO(175-326)がLKP2と相互作用したが、CO(175-305)、CO(175-275)、CO(175-239)、CO(175-206)はLKP2非存在下で活性化を生じた。COL1 CCTにおいて観察された場合と同様に、CO(306-348)のCCTモチーフはLKP2と相互作用しなかった。
2-ハイブリッド系により、COまたはCOL1との相互作用に必要なLKP2のドメインを調べた（図１３のD）。F-boxまたはkelch反復の含有領域はCOに対する相互作用を生じる十分条件であったが、LOVドメイン含有領域はCOL1に対する相互作用を生じる必要十分条件であった。
【００７７】
COまたはCOL1存在下におけるLKP2の核小体形成
COは核内に局在することが報告されている（Robson et al. 2001）。COは転写因子タンパク質であり、核への分配化は転写活性のために重要であると考えられている（Robson et al. 2001）。LKP2もやはり核内に局在することが報告されている（Yasuhara et al. 2004）。これらのタンパク質が細胞内で同時に局在していることを調べるため、シアン蛍光タンパク質（CFP）-LKP2、黄色蛍光タンパク質（YFP）-COならびにYFP-COL1の融合体を構築した。
この蛍光検出系の信頼度を確認するため、ここではまずYFP-COを単独でボンバードメント法により導入し、CFPチャネルを介した画像を取得した。YFP-COタンパク質のYFPシグナルは曝露時間200msでYFPチャネルを介して検出された（第１８図のD）。しかし曝露時間700または1,500msであってもCFPチャネルを介したYFPシグナルは検出されなかった（第１８図のA、B）。曝露時間を4000msにした場合でも、CFPチャネルを介して検出されるYFPシグナルは非常に微弱であった（第１８図のC）。そのため今回の同時局在アッセイでは、曝露時間を1,000ms未満にするよう定めた。
それぞれの融合遺伝子はCaMV 35Sプロモーターの調節下におき、ボンバードメント法によってタマネギ表皮細胞中に導入した。YFP-COならびにYFP-COL1タンパク質は核内に局在し、これらがCFPと同時に発現する時点で核小体を形成していた（図１４のG、図１５のG）。CFP-LKP2はYFPと同時発現する時点で、核内と細胞質ゾル内に観察された（図１４のB、図１５のB）。CFP-LKP2と、YFP-COまたはYFP-COL1をボンバードメント法を用いて同時に導入した場合、CFP結合性蛍光の核-細胞質分配比は増加し、CFP-LKP2は核小体を形成した（図１４のJ、図１５のJ）。CFP-LKP2核小体の位置は、YFP-COまたはYFP-COL1の核小体と完全一致して発現していた（図１４のL、図１５のL）。CFP-LKP2とYFP-COの同時局在は、3次元画像による再現によっても確認された（図２１）。これらの同時局在パターンは、ここで試験したインキュベーション照明条件による影響を受けなかった（データ示さず）。
Di19についても同様に、タマネギ細胞内で同時発現させた時点でYFP-Di19とCFP-LKP2シグナルが同時局在していた。ここでは26個の細胞を調べた。21個の細胞内ではYFP-Di19シグナルは核内だけに検出されたが、CFP-LKP2シグナルは核内と細胞質ゾル内に検出された（図１９）。しかし調査対象の5個の細胞では、CFP-LKP2ならびにYFP-Di19シグナルはいずれも核小体内に局在していた（図２０）。
2種類のマーカーを採用することによって核小体の性質をさらに決定した。一つはカハールボディの分子マーカーであるU2B"［U2核内低分子リボ核タンパク質（snRNP）-特異的B"タンパク質］であり、もう一つはスプライシオソームのスペックルに対するマーカーのSCL28（Mr28のSC35様タンパク質）である（Lorkovic et al. 2004, Shaw and Brown 2004）。タマネギ細胞ではCFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFPのシグナルが同時局在していたが、SCL28-RFPシグナルはCFP-LKP2やYFP-COのシグナルと同時に存在していなかった（図１６）。
【００７８】
［考察］
今回の研究では、Di19ならびにCO/COLファミリータンパク質がFKF/LKP/ZTLタンパク質と相互作用する可能性のある因子であることを明らかにし、その特徴を調べた。Di19は最初に乾燥誘導性のクローンとして単離された（Gosti et al. 1995）。Di19遺伝子は進行性の乾燥途中でシロイヌナズナ植物の根と葉の両方に強く発現した。現在ではDi19ドメインを含む23種類のシーケンスがデータベースに登録されているが、Di19やDi19ドメインの正確な機能はいまだに不明である（Geer et al. 2002）。従ってLKPファミリータンパク質の相互作用がDi19に対して保有する生物学的な意味合いは不明であるが、ストレス反応における機能を示す可能性はある。
COL1タンパク質には、そのN末端に2個の付加ジンクフィンガーモチーフが、またC末端には塩基性領域のCCTモチーフがある（Putterill et al. 1995, Putterill et al. 1997）。CCTモチーフはCO、COL、PRR/TOC1ファミリータンパク質において保存されている（Robson et al. 2001）。ジンクフィンガー領域はB-boxに類似しているが、このB-boxは複数の動物性転写因子におけるタンパク質間相互作用を調節している（Bordon 1998, Torok and Elkin 2000）。COL1に関する遺伝子発現は概日時計により調節されており、その時間パターンはCCA1やLHYの場合に類似している（Schaffer et al. 1998, Wang and Tobin 1998）。シロイヌナズナでCOL1の異所性発現が生じることによってCAB2プロモーターの発現リズムが短縮することになり、フルエンス率に依存する概日リズム障害が現れるが、この事実からCOL1は光入力経路に影響を及ぼすと考えられる（Ledger et al. 2001）。COL1遺伝子発現が低減したアンチセンス植物には概日リズムに対する影響が現れないことから、COLファミリータンパク質には機能的な冗長性があると考えられる（Ledger et al. 2001）。LKP1/ZTLならびにLKP2はいずれもLOVドメインを保有する青色光受容体となり（Kiyosue and Wada 2000, Somers et al. 2000, Imaizumi et al. 2003）、また概日オシレータの非常に近傍で機能していることから（Schultz et al 2001, Somers et al. 2004）、COL1やその他のCOLファミリータンパク質のLKP1/ZTLならびにLKP2に対する相互作用は時計調節におけるこれらタンパク質の機能を反映している可能性がある。
COはシロイヌナズナの光周期経路において開花に関与する重要な調節因子である。光存在下での植物中COレベルは開花期を決定する重要因子であると考えられている（Schultz and Kay 2003, Yanovsky and Kay 2003）。長日型光周期（LD）条件下での開花遅延表現形からCO欠損変異体が単離され、その生物学的機能の特徴が遺伝子的に調べられている（Putterill et al. 1995, Kobayashi et al. 1999, Onouchi et al. 2000, Samach et al. 2000, Robson et al. 2001, Suarez-Lopez et al. 2001）。COタンパク質レベルについてはその転写調節だけでなく、タンパク質分解などの転写後メカニズムによっても調査を行った（Valverde et al. 2004）。LKP2-OX植物はLD条件下で開花遅延表現形を示すため、FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質がCO分解に関与していたとしても意外ではないと思われる。実際にCOタンパク質がユビキチン-プロテアソーム系により分解されることが示されている（Valverde et al. 2004）。COとCOL1のアミノ酸シーケンスは全体的によく類似しているため（64.2%の同一性）、COLタンパク質と同様にLKPファミリータンパク質がCOを認識することは合理的といえるだろう。
CCTドメインはCO/COLならびにPRR/TOC1ファミリータンパク質の核内局在に関与していると思われるが（Makino et al. 2000, Strayer et al. 2000, Robson et al. 2001）、その他の役割もある。co-7変異体には、CCTドメインのR340Qに単一のアミノ酸変異がある。このco-7変異体は開花遅延を示すが、それにもかかわらず緑色蛍光タンパク質（GFP）-co-7融合タンパク質はタマネギ細胞の核内に正しく局在することが示されている（Robson et al. 2001）。LKP2はPRR/TOC1ならびにPRR5と相互作用し（Yasuhara et al. 2004）、COやCOL1とも相互作用することから（図１３のB）、CCTモチーフがこれらの相互作用を調節していると考えられる。しかしCCTモチーフはLKP2結合の十分条件ではない。COならびにCOL1に対するLKP2相互作用部位は明らかにCCTモチーフに隣接したN末端領域に位置している。COに対するLKP2の結合部位は、COL1に対する部位とは異なっていた（図１３のD）。この相互作用部位の違いは、これらのタンパク質の一次構造に見られる違いに起因する可能性があるが、その理由は保存領域であるCCTモチーフやB-boxと比較した場合にCOならびにCOL1に対する結合部位の類似性が比較的少ないためである。
GFP-LKP2融合タンパク質を過剰発現するシロイヌナズナ植物は開花遅延と胚軸の伸張を示し（Yasuhara et al. 2004）、これはLKP2過剰発現植物においても観察されることから（Schultz et al. 2001）、GFPはLKP2の機能に影響しないと考えられる。CFPはGFPの誘導体でありわずか数個のアミノ酸しか変更されていないことから、CFP-LKP2融合タンパク質もやはり生物学的活性を有すると考えられる。今回CFPに対する融合タンパク質としてLKP2を発現させた場合のタマネギ細胞内におけるCFP-LKP2局在は、遺伝子組み換えを行ったシロイヌナズナ植物におけるCFP-LKP2に完全には一致しなかった。タマネギ細胞内でのGFP-LKP2シグナルは細胞質ゾルと核の両方に局在しており、これは未処理CFPの蛍光に類似したパターンであったが（図１４、１５）、シロイヌナズナにおけるGFP-LKP2シグナルについては、核内には見られたが核小体には観察されていない（Yasuhara et al. 2004）。この不一致性はおそらくタンパク質融合体を発現する細胞の相互差異によるものだろう。シロイヌナズナ細胞はある種の付加因子を保有しており、それによってLKP2が核内に保持され、またLKP2が核小体に輸送されるという可能性もある。今回得られた同時発現の結果によれば前者の可能性が支持される。
COに対するGFPの融合体は生物学的活性を保持している。GFP-COの過剰発現はco-2変異を補完し、CO-過剰発現性植物と同様に植物は早期開花した（Robson et al. 2001）。シロイヌナズナならびにタマネギ細胞の両者において、融合タンパク質は核小体内部に局在した（Robson et al. 2001）。YFPもやはりGFPの誘導体であることから、YFP-CO融合タンパク質も同様に生物学的活性を有すると考えられる。現時点でGFP-またはYFP-COL1の生物学的活性に関する報告は発表されていない。COとCOL1の全体的な一次構造が類似しているため、COL1融合体もやはり生物学的活性を有する可能性がある。
CFP-LKP2はYFP-COまたはYFP-COL1と同時発現した場合に限り核小体を形成するが（図１４のJ、図１５のJ）、そのためにLKP2がCOならびにCOL1に対して相互作用するという可能性が支持される。いくつかの核構造やドメインが報告されている（Shaw and Brown 2004）。「スペックル」は核ドメインであり、スプライシング因子と小型RNP粒子が局在する場所である（Misteli 2000, Lamond and Spector 2003）。フィトクロムは光シグナルを受け取った場合に核内に蓄積してスペックル様構造を形成するが、この構造の生物学的機能はやはり未知である（Yamaguchi et al. 1999, Nagatani 2000, Kircher et al. 2002）。YFP-TOC1は特有のスペックル化パターンで核内分布していたが、このことはTOC1がトランスクリプトソーム、スプライシオソーム、またはプロテアソーム内で機能していることを示している（Strayer et al. 2000）。これらの可能性の中でも核小体中におけるプロテアソームの局在化は非常に魅力的であるが、その理由はLKP2がTOC1と相互作用することが可能なF-boxタンパク質であることである（Yasuhara et al. 2004）。しかし私たちはYFP-COまたはYFP-COL1について白色光または遮光条件下にてそれらをCFP-LKP2と同時発現させたが、それらに関連するシグナルの減少を観察することは無かった（データ示さず）。
本実施例でのボンバードメント法による同時形質導入の結果から、LKP2とCOはカハールボディに局在している可能性が考えられた。カハールボディは植物細胞内に存在する大きさ0.2-2.0μmの球形構造であり、しばしば核小体に結合している。カハールボディの機能は不明であるが、実験によってトランスクリプトソームの集合、snRNP集合、スプライシオソームのsnRNAの修飾、核小体内部におけるrRNA修飾に関与するsnRNPの輸送などについて機能しているという証拠が集積されている（Ogg and Lamond 2002, Gall 2000, Gall 2003, Lorkovie and Barta 2004）。
さらに調査を行い、LKP2がF-boxタンパク質としてDi19、CO、またはCOLタンパク質の修飾について機能しているのかどうかについて調べ、また核小体内部でLKP2を移転させるメカニズムを調べる必要がある。
【００７９】
［謝辞］
pAVA574とpAVA554のトランジェント発現ベクターを提供頂いたDr. von Amim、U2B"-mRFPとpSCL28-RFPを含むプラスミドを提供頂いたDr. Z. J. Lorkovic、技術的補助を受けたKayo Sato、Akihiro Komatsu、Shingo Takagi、ならびにcDNAクローンを提供頂いた理研BRCに感謝します。本研究の一部はT.K.に対する新技術・新分野創出のための基礎的研究推進事業（PROBRAIN）、日本文部科学省の科学研究補助金、東レ科学振興財団の補助金による援助を受けている。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の主要なデータである光による相互作用のオン／オフ（遺伝子発現のオン／オフ）には光の質と強さが影響を与えているので、分子生物学実験キット、酵母内での遺伝子発現制御などの分野で実用化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】遺伝子組み換えシロイヌナズナにおけるGUS活性の組織化学的局在化。（A）GUS活性は6日齢の苗木、（B）14日齢のロゼット植物、（C）花、（D）若い長角果、（E）47日齢植物の古い長角果。バーはA、C-Eでは1mm、Bでは5mmである。
【図２】GFP-LKP2融合タンパク質の細胞内局在。35S::GFP T3植物（A、B）と35S::GFP-LKP2 T3植物（C-G）の根を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上、16時間光照射/8時間暗闇のサイクルで成長させ、これを光学顕微鏡（A、C、E）、蛍光顕微鏡（B、D、G）、共焦点レーザ操作顕微鏡（H）を用いて観察した。35S::GFP-LKP2 T3植物を4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で染色し、蛍光顕微鏡（F）で観察した。バーはA-Dでは100μm、E-Hでは10μmである。
【図３】シロイヌナズナSkp1オーソログ（ASKs）とLKPファミリータンパク質の間の酵母2-ハイブリッド相互作用。 （A）ASKs（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20a、ASK20b）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（上）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（下）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B-D）LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域を用いて2-ハイブリッド相互作用試験を行った。
【図４】LKPファミリータンパク質間の2-ハイブリッド相互作用。 （A）LKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体およびGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図５】LKPファミリータンパク質に対する時計関連因子の相互作用。 （A）時計関連因子（TOC1、CCA1、LHY）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図６】LKP2ドメインに対するTOC1の相互作用。 TOC1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。
【図７】酵母でのLKPファミリータンパク質に対するAPRR/TOC1ファミリータンパク質の相互作用。 （A）APRR/TOC1ファミリータンパク質（TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図８】LKP2ドメインに対するAPRR5の相互作用。 （A）APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2ドメインまたはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、AH109の単一コロニー。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図９】各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用。
【図１０】各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用。
【図１１】酵母2-ハイブリッド系におけるAtDi19とFKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の相互作用。
【図１２】ボンバードメント処理を行ったシロイヌナズナ葉柄細胞におけるGUS活性の組織化学的な局在。 Di19-GUSの核内局在（A）、ならびに空ベクターpBI221を用いてボンバードメント処理したGUS対照の全体的な細胞質染色(C)。DAPI染色は細胞核を示す（B）。スケールバー=0.05mm。
【図１３】CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用。 （A）COL1欠失体のLKP2に対する相互作用。 （B）CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する相互作用。 （C）CO欠失体のLKP2に対する相互作用。 （D）COまたはCOL1に対するLKP2の相互作用ドメイン。
【図１４】CFP-LKP2とYFP-COの細胞内局在。 タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-CO（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１５】CFP-LKP2とYFP-COL1の細胞内局在。 タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-COL1（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１６】CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP、SCL28-RFPの核内局在。 CPP（A、E）、YFP（B、F）、RFP（C、G）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１７】CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用のイムノクロマトグラフィーによる検出。 A、B 酵母細胞内におけるLKP1/ZTL、LKP2、FKF1に融合したGAL4 DNA結合ドメイン、あるいはDi19に融合したGAL4活性化ドメインの確認（抗cMyc抗体または抗血液凝集素抗体をそれぞれ用いたイムノブロット）。 A、C アミノ酸145-355、163-355、195-355、228-355、または286-327に対応するCOL1に融合されたGAL4 DNA結合ドメイン、またはLKP2に融合されたGAL4活性化ドメインの発現。 A、D、E 2-ハイブリッドスポットアッセイにおけるGAL4 DNA結合ドメインまたはGAL4活性化ドメイン融合体の発現。 F 175-373、208-373、241-373、175-326、306-348に対応するCOに融合されたGAL4 DNA結合ドメインの発現。 G LKP2ドメインに融合されたGAL4活性化ドメインの発現。
【図１８】蛍光検出系の信頼度を確認するため、YFP-CO単独でボンバードメント法により導入し取得したCFPチャネルを介した画像。
【図１９】YFP-Di19シグナルは核内だけに検出されたが、CFP-LKP2シグナルは核内と細胞質ゾル内に検出された21個の細胞内を示す画像。
【図２０】CFP-LKP2ならびにYFP-Di19シグナルがいずれも核小体内に局在していた５個の細胞内を示す画像。
【図２１】CFP-LKP2とYFP-COの同時局在の3次元画像。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、LKP1、LKP2、およびそのC82A変異を用いた青色光によるバイオスイッチに関する。
本発明において用いる略語は以下のとおりである。
ADO ADAGIO
APRR シロイヌナズナ偽応答調節因子
ASK シロイヌナズナSkp1様タンパク質
3-AT 3-amino-1H-1,2,4-triazole
CaMV カリフラワーモザイクウイルス
CCA1 概日時計関連因子1
CFP シアン蛍光タンパク質
CO CONSTANS
COL CONSTANS LIKE
CRY クリプトクローム
DAPl 4',6-diamidino-2-phenylindole
Di19 乾燥誘導性遺伝子19
FKF1 フラビン結合性ケルヒ繰り返しF-box 1
FKL FKF様
GFP 緑色蛍光タンパク質
GUS β-グルクロニダーゼ
LD 長日光周期
LHY late elongated hypocotyl-1［後期伸長化胚軸因子-1］
LKP2 LOVケルヒタンパク質2
LOV light, oxygen and voltage
PHOT フォトトロピン
PHY フィトクローム
PRR 疑似反応調節因子
SCF Skp1-Cullin-F-boxタンパク質
TOC1 timing of cab expression 1［CAB発現タイミング因子1］
YFP 黄色蛍光タンパク質
ZTL ZEITLUPE
【背景技術】
【０００２】
根、葉、茎の十分な生育とともに抽台時期ならびに開花時期を制御することができる主要作物や高価な花卉類など園芸植物のトランスジェニック植物の作製方法や、該作製方法により得られるトランスジェニック植物を提供することを目的として、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモータの下流に、ＬＯＶドメイン及びケルヒ（ｋｅｌｃｈ）繰返しを有する青色光受容体タンパク質ＬＫＰ１のプロモータを介して該ＬＫＰ１遺伝子が連結されている発現ベクターにより植物を形質転換し、青色光受容体タンパク質を過剰発現するトランスジェニック植物を作製する発明が既に出願されている（特許文献１）。
【０００３】
これまで、導入遺伝子の発現制御には化学物質受容体を用いる例がほとんどであり、青色光受容体であるLKPファミリータンパク質、あるいは、そのLOVドメインを単体で用いた例はない。化学物質で遺伝子発現を誘導する場合には、その化学物質のコスト、生体、環境に与える影響が問題となる。植物では光で発現誘導が起こるCAB遺伝子等のプロモータを遺伝子発現に利用する例はあるが、この場合は内在の光受容体とシグナル伝達系を用いるため、反応に必要な因子が多く、植物以外の生物には用いることができなかった。また、遺伝子組換え個体や細胞だけを必要に応じて非遺伝子組換え個体や非遺伝子組換え細胞が混在する集団から殺すことは従来技術では困難であった。
【特許文献１】特開２００１−３５２８５１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、LKP1、LKP2、およびそのC82A変異を用いた青色光によるバイオスイッチで、青色光の量により、相互作用のオン／オフ、ならびに、強光による遺伝子導入生物の殺傷が可能である技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）〜（８）の青色光による遺伝子発現制御方法を要旨とする。
（１）青色光による遺伝子の発現制御に、LKP1、LKP2、変異型LKP1および／または変異型LKP2を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。
（２）LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する上記（１）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（３）相互作用因子がTOC1および／またはAPRR５および／またはDi19および／またはCOおよび／またはCOLである上記（２）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（４）LKP2のＦ-box領域と、ASKとの相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する上記（１）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（５）導入されたLKP1遺伝子、LKP2遺伝子、変異型LKP1遺伝子および／または変異型LKP2遺伝子の転写がオン／オフされる上記（１）ないし（４）のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法。
（６）LKP2遺伝子が、植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン及びケルヒ繰返しを有するLKP2遺伝子が連結されている発現ベクターにより導入された遺伝子である上記（５）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（７）LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている遺伝子である上記（６）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（８）LKP2のプロモータのプロモータとしてLKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いることを特徴とする上記（６）または（７）の青色光による遺伝子発現制御方法。
（９）上記（１）ないし（８）のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法を用いることを特徴とする青色光による植物の生育制御方法。
【０００６】
本発明は、以下の（１０）〜（１２）の合成遺伝子を要旨とする。
（１０）植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するLKP2遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。
（１１）LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている上記（１０）の合成遺伝子。
（１２）LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いる上記（１０）または（１１）の合成遺伝子。
【０００７】
本発明は、以下の（１３）〜（１６）の合成遺伝子の使用を要旨とする。
（１３）生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする請求項１０、１１または１２の合成遺伝子の使用。
（１４）生物が植物であるの上記（１３）の使用。
（１５）生物が酵母であるの上記（１３）の使用。
（１６）生物が動物であるの上記（１３）の使用。
【０００８】
本発明は、以下の（１７）の細胞、組織、器官または生物全体を要旨とする。
（１７）上記（１０）、（１１）または（１２）の合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【発明の効果】
【０００９】
LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされるため、これを光スイッチに利用することができる。例えば、酵母２ハイブリッド系のマーカー遺伝子の代わりに任意の遺伝子を繋げば、青色光に依存してその遺伝子の転写がオン／オフできる。また、この系は他生物にも応用可能である。更に、光量に応じて、相互作用のオン／オフだけでなく、遺伝子導入細胞、個体のみを殺傷することも可能である。制御に薬剤を用いないので、化学物質と比べ、低コストであり、環境に与える影響も考慮しなくてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明者らは、植物青色光受容体候補遺伝子ＬＫＰ２の研究を行い、LKP2プロモータ活性が、幼植物体全体、ロゼット葉、根端、萼、若いさやで認められることを明らかにした。なお、LKP2は本発明者らによってアミノ酸配列が示されている（上記の特許文献１参照）。
【００１１】
また、緑色蛍光タンパク質（GFP，green fluorescent protein）とLKP2を用いた解析から、LKP2が核タンパク質である証拠を得た。
【００１２】
更に、酵母２ハイブリッド系を用いた解析から、ＬＫＰ２がＦ-box領域で、ASK1、２、３、４、５、１１、１４、２０a、２０bと相互作用すること、LKP2がLKPファミリータンパク質であるLKP1、LKP2、FKF1と相互作用すること、LKP1およびLKP2が各々LOVドメインでTOC1とAPRR５と相互作用することを見いだした。
【００１３】
LOVドメインを介したこれらの相互作用は強い光によって影響を受け、赤色、遠赤色、緑色では影響を受けないものの、青色光によって相互作用の阻害効果が認められた。
【００１４】
LKP1及びLKP2のLOVドメインに位置する８２番目のシステイン残基をアラニン置換した場合、この青色光による効果はさらに顕著となった。
【００１５】
野生型のLKP1、LKP2は５０μmol photon/m2/secの青色光では野生型のタンパク質を発現する酵母は生育に影響を受けなかったが、変異型のLKP1或いはLKP2タンパク質を発現する酵母は培地上で生育することができなかった。
【００１６】
これは導入された変異型青色光受容体LKPタンパク質によって吸収された光エネルギーが生体内物質に悪影響を与えたためだと考えられる。
【００１７】
これらの知見から、発明者は青色光バイオスイッチ、すなわち、LKP1、LKP2、変異型LKP1、LKP2を用いた青色光による遺伝子発現制御、生育制御を行う本発明を完成するに至った。
本発明に係る研究を要約すると以下の通りである。
Arabidopsis thaliana Heynh.［シロイヌナズナ］のADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質には、LOVドメイン、F-boxモチーフ、ケルヒ繰り返し領域が一つずつ存在する。LKP2はこのファミリーのメンバーであり、シロイヌナズナの概日オシレータ内部または非常に近傍で機能している［Shultz et al., (2001) Plant Cell 13: 2659-2670］。プロモータ-GUS融合実験により、LKP2遺伝子はロゼット葉において高活性であることが判明した。CaMV35S:LKP2-GFP植物ではGFPに関連する蛍光が核内に検出され、そこからLKP2は核タンパク質であると考えられた。酵母2-ハイブリッド分析によれば、LKP2は一部のシロイヌナズナSkp-1様タンパク質（ASK）と相互作用し、これは他のADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の場合と同様であることが示されているが、そこからLKP2はSCF（Skp1-Cullin-F-boxタンパク質）複合体を形成することが可能であり、これはユビキチンE3リガーゼとして機能すると考えられる。LKP2は自分自身だけでなく、ファミリーの他のメンバーであるLKP1やFKF1とも相互作用する。また2-ハイブリッド分析によれば、LKP2は時計成分であるTOC1と相互作用するが、TOC1遺伝子発現に対する負の調節因子であるCCA1やLHYとは相互作用しないことが示された。LKP2のLOVドメインはTOC1との相互作用について必要かつ十分であることが示された。LKP2とAPRR5（TOC1のパラログ）の相互作用も観察されたが、LKP2は他のTOC1パラログであるAPRR3、APRR7、APRR9と相互作用しなかった。
【００１８】
図1に、遺伝子組み換えシロイヌナズナにおけるGUS活性の組織化学的局在化を示す。
LKP2プロモータ-GUS融合遺伝子を含む遺伝子組み換えシロイヌナズナ（T3）植物を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上で育成し、続いてバーミキュライトビーズ上で育成した。GUS活性は6日齢の苗木（A）、14日齢のロゼット植物（B）、花（C）、若い長角果（D）、47日齢植物の古い長角果（E）において観察されている。バーはA、C-Eでは1mm、Bでは5mmである。
【００１９】
図2に、GFP-LKP2融合タンパク質の細胞内局在を示す。
35S::GFP T3植物（A、B）と35S::GFP-LKP2 T3植物（C-G）の根を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上、16時間光照射/8時間暗闇のサイクルで成長させ、これを光学顕微鏡（A、C、E）、蛍光顕微鏡（B、D、G）、共焦点レーザ操作顕微鏡（H）を用いて観察した。35S::GFP-LKP2 T3植物を4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で染色し、蛍光顕微鏡（F）で観察した。バーはA-Dでは100μm、E-Hでは10μmである。
【００２０】
図3に、シロイヌナズナSkp1オーソログ（ASKs）とLKPファミリータンパク質の間の酵母2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）ASKs（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20a、ASK20b）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（上）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（下）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。アステリスクは30mM 3-ATを供給してHIS3レポーター遺伝子の基礎活性を抑制したSD-AHLW培地を示し、その結果非特異的バックグラウンド増殖が抑えられている。Clontechより取得した2種類のプラスミドで、GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、アミノ酸72-390（GenBank受入番号#K01700）、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原（GenBank位置SV4CG）をエンコードするものを、陽性対照とした。
（B-D）LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域を用いて2-ハイブリッド相互作用試験を行った。試験対象となる全タンパク質の発現は、イムノブロット分析により確認した（データ示さず）。
【００２１】
図4に、LKPファミリータンパク質間の2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）LKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体およびGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。アステリスクは30mM 3-ATを供給してHIS3レポーター遺伝子の基礎活性を抑制したSD-AHLW培地を示し、その結果非特異的バックグラウンド増殖が抑えられている。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。試験対象となる全タンパク質の発現は、イムノブロット分析により確認した（データ示さず）。
【００２２】
図5に、LKPファミリータンパク質に対する時計関連因子の相互作用を示す。
（A）時計関連因子（TOC1、CCA1、LHY）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２３】
図6に、LKP2ドメインに対するTOC1の相互作用を示す。
（A）TOC1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２４】
図7に、酵母でのLKPファミリータンパク質に対するAPRR/TOC1ファミリータンパク質の相互作用を示す。
（A）APRR/TOC1ファミリータンパク質（TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２５】
図8に、LKP2ドメインに対するAPRR5の相互作用を示す。
（A）APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2ドメインまたはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、AH109の単一コロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドを、陽性対照とした。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。
（B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。イムノブロット分析により試験された全てのタンパク質において、発現レベルに有意差は見られなかった（データ示さず）。
【００２６】
図９に、各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用を示す。
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、光子量41μmol/m-2/s-1の各種光条件下（暗条件下、白色光下、青色光下、赤色光下）にて酵母を生育させ解析を行った。
【００２７】
図１０に、各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用を示す。
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、暗条件下及び、光子量50μmol/m-2/s-1、100μmol/m-2/s-1、190μmol/m-2/s-1の青色光下にて酵母を生育させ解析を行った。
【００２８】
LKP2に関してみるならば、LKP2遺伝子を過剰発現する植物を長日条件で育成する場合には遅延開花の表現型が現れ、連続光または遮光条件下では、いずれの場合もCAB2またはCCR2に対する時計調節性遺伝子について不規則なプロモーター活性が現れたが、これらの事実からLKP2は概日時計に近い場所で機能していると考えられる（Schltz et al. 2001）。LKP2タンパク質はLKP1/ZTL、TOC1、PRR5に対しても相互作用する能力があった（Yasuhara et al. 2004）。PRR5はPRR/TOC1ファミリータンパク質の一員であると考えられており、このファミリータンパク質は概日時計の調節に作用していると考えられている（Sato et al. 2002, Yamamoto et al. 2003）。概日時計調節ならびに開花期調節におけるLKP2の機能をより深く理解するため、酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2に相互作用するタンパク質因子について、単離、分子的相互作用、局在に関して記述する。
【００２９】
図１１に、酵母2-ハイブリッド系におけるAtDi19とFKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の相互作用を示す。
LKP1/ZTL、LKP2、またはFKF1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、Di19のGAL4活性化融合体を含む酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）（右）寒天培地上で育成したもの。pGBKT7とpGADT7の空ベクターをネガティブ対照に用いた（ベクター）。GAL4 DNA結合ドメインを有するネズミp53タンパク質と、GAL4活性化ドメインを有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドをポジティブ対照に用いた。酵母細胞内におけるLKP1/ZTL、LKP2、FKF1に融合したGAL4 DNA結合ドメイン、あるいはDi19に融合したGAL4活性化ドメインの確認は、抗cMyc抗体または抗血液凝集素抗体をそれぞれ用いたイムノブロットにより行った（図１７のA、B）。
【００３０】
図１２に、ボンバードメント処理を行ったシロイヌナズナ葉柄細胞におけるGUS活性の組織化学的な局在を示す。Di19-GUSの核内局在（A）、ならびに空ベクターpBI221を用いてボンバードメント処理したGUS対照の全体的な細胞質染色(C)。DAPI染色は細胞核を示す（B）。スケールバー=0.05mm。
【００３１】
図１３に、CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用を示す。
（A）COL1欠失体のLKP2に対する相互作用。LKP2タンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COL1欠失タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。切断されたCOL1タンパク質の構成は、アミノ酸145-355、163-355、195-355、228-355、286-327であった。163-355、195-355、228-355、または286-327に対応するCOL1に融合されたGAL4 DNA結合ドメイン、またはLKP2に融合されたGAL4活性化ドメインの発現はイムノブロット法により確認した（図１７のA、C）。
（B）CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する相互作用。上部パネル：LKPファミリータンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COLファミリータンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。上部列の数字はCOLファミリータンパク質の識別番号を示しており、例えば「1」は「COL1」を示す。下部パネル：LKPファミリータンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体と、COLファミリータンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。上部列の数字はCOLファミリータンパク質の識別番号を示しており、例えば「6」は「COL6」を示す。2-ハイブリッドスポットアッセイにおけるGAL4 DNA結合ドメインまたはGAL4活性化ドメイン融合体の発現はイムノブロット法により確認した（図１７のA、D、E）。
（C）CO欠失体のLKP2に対する相互作用。CO欠失タンパク質のGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、LKP2タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。プレイとして用いたネガティブ対照ベクターはpGADT7である。切断されたCOタンパク質の構成は、アミノ酸106-373、140-373、157-373、175-373、208-373、241-373、175-326、175-305、175-275、175-239、175-206、306-348であった。175-373、208-373、241-373、175-326、306-348に対応するCOに融合されたGAL4 DNA結合ドメインの発現はイムノブロット法により確認した（図１７のF）。
（D）COまたはCOL1に対するLKP2の相互作用ドメイン。LKP2ドメインのGAL4 DNA結合ドメイン融合体と、COまたはCOL1タンパク質のGAL4活性化ドメイン融合体を発現する酵母細胞を、SD-Leu, Trp（SD-LW）ならびにSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）上で育成した。pGBKT7とpGADT7をベクターのみのネガティブ対照ベクターとして用いた。GAL4 DNA結合ドメインを保有するネズミp53タンパク質と、GAL4活性化ドメインを保有するSV40ラージT抗原をエンコードする2種類のプラスミドをポジティブ対照に用いた。L、LOVドメイン；F、F-box；K、kelch反復領域；LF、LOVドメイン＋F-box；LK、LOVドメイン＋kelch反復領域；FK、F-box＋kelch反復領域。LKP2ドメインに融合されたGAL4活性化ドメインの発現は、イムノブロット法により確認した（図１７のG）。
【００３２】
図１４に、CFP-LKP2とYFP-COの細胞内局在を示す。
CFP-LKP2とYFP（A-D）、CFPとYFP-CO（E-H）、またはCFP-LKP2とYFP-CO（I-L）を発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞を同時ボンバードメント処理した。タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-CO（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３３】
図１５に、CFP-LKP2とYFP-COL1の細胞内局在を示す。
CFP-LKP2とYFP（A-D）、CFPとYFP-COL1（E-H）、またはCFP-LKP2とYFP-COL1（I-L）を発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞の同時ボンバードメント処理を行った。タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-COL1（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３４】
図１６に、CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP、SCL28-RFPの核内局在を示す。
CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP（A、B、C、D）またはCFP-LKP2、YFP-CO、SCL28-RFPを発現するプラスミドを用いて、タマネギ表皮細胞の同時ボンバードメント処理を行った。CPP（A、E）、YFP（B、F）、RFP（C、G）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【００３５】
以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
（シロイヌナズナにおけるLKP2（LOVケルヒタンパク質2）の分子パートナーとしてのASKと時計関連タンパク質の同定）
概日リズムは生物内部における約24時間のサイクルであり、シアノバクテリアから高等植物まで保存されており、24時間の1日に適応するために、進化の過程で発達したと考えられている。概日リズムは生物時計によりつくり出され、協調されている。この生物時計は概日オシレータとも呼ばれる。高等植物では、多数の遺伝子発現が概日調節されている。これらの遺伝子の中には、光合成、光受容体、光防護、防寒の役目を果たすものがあり、また炭素、窒素、硫黄経路や糖移動酵素のための遺伝子も存在する（Harmer et al., 2000）。
【００３７】
近年、概日オシレータは日常生活だけでなく、植物の開花時期制御などといった季節変化の認識にも非常に重要であることが示されている。ある開花時期遺伝子はCONSTANS（CO）と呼ばれ、シロイヌナズナにおける光周期経路を調節する鍵となっている。COの発現は概日時計に調節されている。CO発現は夕方に生じる。光存在下のCOタンパク質レベルが開花に対する鍵らしい（Schultz and Kay, 2003; Yanovsky and Kay, 2003）。
高等植物で十分に特徴が調べられている概日オシレータは、TOC1と、2種類のMyb様DNA結合タンパク質であるCCA1ならびにLHYの間のフィードバックループ系である。TOC1はCCA1とLHY遺伝子の発現に正の影響を与えるが、CCA1とLHYはTOC1の発現に負の制御を行う（Alabadi et al., 2001）。TOC1はシロイヌナズナにおける二成分系の疑似応答調節因子の小規模タンパク質ファミリーに属しており、他の二成分系の応答調節因子に似ているが、不変性のリン酸受容アスパラギン酸部位を持たない（Makino et al., 2000; Strayer et al., 2000）。このタンパク質ファミリーのメンバーではAPRR9、APRR7、APRR5、APRR3、そしてAPRR1またはTOC1の順番で、夜明け後にmRNAの蓄積が2〜3時間間隔で順番に開始する。APRR9遺伝子の発現は赤色光により誘導され、APRR1/TOC1を過剰発現する植物においては下方調節される（Makino et al., 2001, 2002）。APRRファミリーのメンバーは概日リズムを調節して、局地環境に合わせているらしい（Michael et al., 2003）。
【００３８】
本発明者らはシロイヌナズナのゲノム分析により新しい青色光受容体を同定しようと試みたところ、LOVドメイン、F-box、ケルヒ繰り返し領域をそれぞれ一つずつ持つユニークなタンパク質をコードする、2種類の遺伝子を発見した（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）。
【００３９】
LOVドメインはPHOT1とPHOT2に見られる青色光感受性モチーフであり、光屈性、葉緑体の運動、気孔の開口などに関与している（Briggs et al., 2001; Briggs and Christie 2002）。F-boxはF-boxタンパク質に見られるモチーフであり、アダプタとして特異的基質を核ユビキチンタンパク質リガーゼサブユニットに運び、ユビキチン化とそれに続く分解に導く（Craig and Tyers, 1999; Xiao and Jang, 2000）。酵母と哺乳類では、F-boxタンパク質はCul1、Rbx1、Skp1と共にSCF複合体を形成する。これら3種類のタンパク質は核ユビキチンリガーゼ（E3）を形成し、F-boxタンパク質はユビキチン化する標的を認識する際に機能し、またそれらのF-boxモチーフ領域はSkp1の結合に関連している。ユビキチン化された標的タンパク質はその後、ATP依存性の方法で、26Sプロテアソームにより分解される。ケルヒ繰り返しは1ドメインの超円筒（β-プロペラ）構造の形で編成されていると考えられるが、この構造は、酵母と哺乳類両方のF-boxタンパク質のC末端に見られるモチーフであるWD40の繰り返しにより形成される構造と類似している（Patton et al., 1998; Winston et al., 1999）。これらの繰り返しはタンパク質-タンパク質相互作用に関与していると推定されている（Andrade et al., 2001）。本発明者らはLOVケルヒタンパク質1と2に対するこれらのタンパク質をLKP1とLKP2と名付けた（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）。LKP1遺伝子はZTLと同一であり、この遺伝子を変異させることにより、時計調節性遺伝子発現のリズムと葉の動きが遅延することになる（Somers et al., 2000）。またLKP1/ZTLはADO1と同一であり、この遺伝子をT-DNAノックアウトすることにより、赤色光中における子葉運動のリズム障害が生じる（Jarillo et al., 2001）。ADO1/LKP1/ZTLはPHYBとCRY1のC末端領域と相互作用することが示された（Jarillo et al., 2001）。LKP2の機能は、35S:LKP2植物を用いて分析された（Schutz et al., 2001）。これらの植物は定常光と暗黒の両条件下での概日時計出力に対するリズム障害表現型、胚軸伸長を示し、長日条件下で開花遅延表現型を示したが短日条件下ではそれを示さず、そのためシロイヌナズナにおいてLKP2は概日オシレータの内部または非常に近い場所で機能していると考えられた。LKP2はADO2ならびにFKL2と同一である（Nelson et al., 2000; Somers et al., 2000; Jarillo et al., 2001）。このファミリー中の他のタンパク質はFKF1またはADO3である。ADO3/FKF1遺伝子はfkf1変異体中の変異遺伝子として同定されており、この変異体は長日条件下で開花遅延するが、春化処理またはジベレリン処置により救助できる（Nelson et al., 2000）。
【００４０】
本発明者らが本実施例で示すのは、LKP2のプロモータ活性、LKP2の細胞内局在、ならびにシロイヌナズナSkp-1様タンパク質（ASK）に対する、また概日時計成分と可能性のある補助因子に対するLKP2の分子的相互作用である。また本実施例ではこの相互作用の重要性をLKP2の機能に関して考察する。
【００４１】
［材料と方法］
植物材料と生育条件
Arabidopsis thaliana（Columbia生態型）の種子を、0.8%寒天を含む発芽培地（GM）（Valvekens et al., 1988）に無菌的に播種し、暗黒下3日間にわたり4℃でインキュベートして休眠を破り、その後、22℃における16時間光照射（約100μmol s-1 m-2）と8時間暗による長日条件下で成長させた。
【００４２】
DNAシーケンス分析
シーケンス用のプラスミドDNAテンプレートは自動プラスミド単離機（PI-200とPI-50alpha、Kurabo、Osaka、Japan）で調製した。DNAシーケンスの決定は、BigDye Terminator Cycle Sequence法により、DNAシーケンサ（ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer；Applied Biosystems、Foster City、CA、USA）上で実施した。GENETYX（Software Development, Tokyo, Japan）ならびにSequencher（Gene Codes Corporation、Ann Arbor、MI、USA）ソフトウェアシステムを用いてDNAシーケンス解析を行った。
【００４３】
遺伝子組み換え植物
ATG開始コドンからLKP2コーディングシーケンスに20bpオーバーラップする1.6kbの5'非コーディング領域を、Pfu Turbo DNAポリメラーゼ（Stratagene、La Jolla、CA、USA）を用いて、シロイヌナズナのゲノムDNAよりPCR増幅した。使用プライマは5'-GAGAGCTAGCTCTCCGGCAAAGTCTCGACC-3'（配列番号１）ならびに5'-TCTCCCCGGGCACTCCATTTGATTTTGCAT-3'（配列番号２）であり、これらはそれぞれ各末端でNheI部位ならびにSmaI部位として導入された。PCR断片をpCR-Blunt II-TOPO（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）中にサブクローンし、全体をシーケンス分析してシーケンスを確認し、その後プロモータを持たないβ-グルクロニダーゼ（GUS）発現ベクターであるpBI101（Clontech、Palo Alto、CA、USA）中へ結合させた。結果として得られたコンストラクトをシーケンス解析し、LKP2の最初の6アミノ酸がGUSタンパク質領域にインフレーム融合していることを確認した。
GFPのS65T修正版（smRS-GFP）（Davis and Vierstra, 1996）を用いてGFP-LKP2コンストラクトを作成した。GFPコーディング領域のPCR増幅は、Arabidopsis Biological Resource Center（Columbus、OH、USA）より入手したpsmRS-GFPをもとに、5'-GAGATCTAGACAATGAGTAAAGGAGAAGAA-3'（配列番号３）ならびに5'-TCTCAGGCCTTTGTATAGTTCATCCATGCC-3'（配列番号４）のプライマを用いて実施したが、これらのプライマにより、それぞれ各末端でXbaI部位とStuI部位が導入された。LKP2コーディング領域のPCR増幅も同様に、cDNAをもとに5'-GAGAAGGCCTTATGCAAAATCAAATGGAGT-3'（配列番号５）と5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号６）のプライマを用いて実施したが、これらのプライマにより、それぞれ各末端でStuI部位とBamHI部位が導入された。両PCR断片をサブクローンし、全体をシーケンス分析してシーケンスを確認し、StuI部位に結合させ、再度シーケンス分析を行った。次にGFP-LKP2断片を、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモータを含む発現ベクターであるpBE2113内に導入した（Mitsuhara et al., 1996）。
シロイヌナズナ植物のアグロバクテリウム媒介性形質転換は、簡易in planta浸潤法により実施した（Clough and Bent, 1998）。形質転換株の選択は、50μg/mLカナマイシンを含むGM寒天上で行った。
【００４４】
GUS染色、GFP、DAPI観察
形質転換植物中のGUS活性の組織化学的定位は、既発表論文（Nakashima et al., 1977）に従って実施した。GFP活性ならびに4',6'-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色の光学像は、Olympus BX51顕微鏡（Olympus、Tokyo、Japan）により、蛍光ユニットと適切なフィルタユニットを用いて取得した。またGFP蛍光の可視化は、Leica TCS-E共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Leica Microsystems GmbH、Mannheim、Germany）により、空冷式アルゴンイオンレーザー系を用いて行った。
【００４５】
RNAゲルブロット分析
総RNAは既発表論文（Kiyosue et al., 1992）に従って植物全体から単離し、ホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲル中で分画し、ナイロンフィルタ上にブロットした。DIG標識化RNAプローブはLKP2 cDNAまたはGFPのコーディング領域より調製したものを用いて、メーカー（Roche Diagnostics、Mannheim、Germany）の指示に従ってハイブリダイゼーションを行った。科学蛍光シグナルの検出は、Light Captureシステム（AE-6962；Atto、Tokyo、Japan）を用いて行った。
【００４６】
酵母2-ハイブリッドクローンと分析
LKP1、LKP2、FKF1、ASK、TOC1、CCA1、LHY、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9の全長cDNAのコロンビア版の入手源は、cDNAライブラリスクリーニング（Kiyosue and Wada, 2000; Schultz et al., 2001）、ReverTra Dash（Toyobo、Osaka、Japan）を用いたRT-PCR、またはRIKEN Bio Resource Center（Tsukuba、Japan）であった。クローンをPCR増幅して適当な制限酵素部位を生成し、pCR-TOPO（Invitrogen）内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。PCRに用いたプライマは以下の通りである。
LKP1には5'-AGGATCCGTATGGAGTGGGACAGTGGTTCC-3'（配列番号７）ならびに5'-AGGATCCTTACGTGAGATAGCTCGCTAGTG-3'（配列番号８）；
LKP2には5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号９）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号１０）；
FKF1には5'-AGGATCCGTATGGCGAGAGAACATGCGATC-3'（配列番号１１）ならびに5'-AGGATCCCTTTACAGATCCGAGTCTTGCCG-3'（配列番号１２）；
ASK1には5'-AGGATCCGTATGTCTGCGAAGAAGATTGTG-3'（配列番号１３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGGTTCT-3'（配列番号１４）；
ASK2には5'-AGGATCCGTATGTCGACGGTGAGAAAAATC-3'（配列番号１５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAACGCCCACTGATTCT-3'（配列番号１６）；
ASK3には5'-AGGATCCGTATGGCAGAAACGAAGAAGATG-3'（配列番号１７）ならびに5'-AGGATCCTCACTCGAACGCCCACCTGTTCT-3'（配列番号１８）；
ASK4には5'-AGGATCCGTATGGCAGAAACGAAGAAGATG-3'（配列番号１９）ならびに5'-AGGATCCTCACTCGAACGCCCACTTGTTCT-3'（配列番号２０）；
ASK5には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGATCATGTGG-3'（配列番号２１）ならびに5'-AGGATCCTCATTGAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号２２）；
ASK7には5'-AGGATCCGTATGTCGACAAAAAAGATCATG-3'（配列番号２３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTGT-3'（配列番号２４）；
ASK8には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAAAAGATCATG-3'（配列番号２５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTCT-3'（配列番号２６）；
ASK9には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGAAGATCATA-3'（配列番号２７）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTTATTCT-3'（配列番号２８）；
ASK10には5'-AGGATCCGTATGTCGACGAAGAAGATCATA-3'（配列番号２９）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAACCCCATTGATTCT-3'（配列番号３０）；
ASK11には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGATGATCGTG-3'（配列番号３１）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３２）；
ASK12には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGATGATCGTG-3'（配列番号３３）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３４）；
ASK13には5'-AGGATCCGTATGTCGAAGATGGTTATGTTG-3'（配列番号３５）ならびに5'-AGGATCCTCATTCAAAAGCCCATTGATTCT-3'（配列番号３６）；
ASK14には5'-AGGATCCGTATGTCTTCCAACAAGATTGTT-3'（配列番号３７）ならびに5'-AGGATCCCTATTCAAAAGCCCATGCGTTTT-3'（配列番号３８）；
ASK15には5'-AGGATCCGTATGTCTTCTAACAAGATTGTG-3'（配列番号３９）ならびに5'-AGGATCCCTAGGGCTTTGGATCTTCGTGTT-3'（配列番号４０）；
ASK17には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAGAAGATTGTG-3'（配列番号４１）ならびに5'-AGGATCCTTAATTGAAAGCCCATTCGTTCT-3'（配列番号４２）；
ASK18には5'-AGGATCCGTATGGCTTCTTCTTCCGAAGAG-3'（配列番号４３）ならびに5'-AGGATCCTTACTCATTAAAAGTCCAAGCAT-3'（配列番号４４）；
ASK19には5'-AGGATCCGTATGTCTTCGAAAAAGATTGTG-3'（配列番号４５）ならびに5'-AGGATCCCTAGGGTTTTGGAACTTGTTGTT-3'（配列番号４６）；
ASK20Aには5'-AAGATCTGTATGTCAGAAGGTGATTTGGCC-3'（配列番号４７）ならびに5'-TAGATCTCAGCCTTGTGATCTGTGAAACAG-3'（配列番号４８）；
ASK20Bには5'-AAGATCTGTATGTCAGAAGGTGATTTGGCC-3'（配列番号４９）ならびに5'-TAGATCTTGGAGATTGACCTGTATGCCGTC-3'（配列番号５０）；
TOC1には5'-AGAGCTCGTATGGATTTGAACGGTGAGTGT-3'（配列番号５１）ならびに5'-AGAGCTCTCAAGTTCCCAAAGCATCATCCT-3'（配列番号５２）；
CCA1には5'-AGGATCCGTATGGAGACAAATTCGTCTGGA-3'（配列番号５３）ならびに5'-ACGGATCCCTCATGTGGAAGCTTGAGTTTC-3'（配列番号５４）；
LHYには5'-AGGATCCGTATGGATACTAATACATCTGGA-3'（配列番号５５）ならびに5'-ACGGATCCTCATGTAGAAGCTTCTCCTTCC-3'（配列番号５６）；
APRR3には5'-AGGATCCGTATGTGTTTTAATAACATTGAA-3'（配列番号５７）ならびに5'-AGGATCCTCAATTGTCTTCACTTCCTGATT-3'（配列番号５８）；
APRR5には5'-AGGATCCGTATGTGGCAAACGTGGCCACGT-3'（配列番号５９）ならびに5'-TGGATCCTATGGAGCTTGTGTGGATTGGAC-3'（配列番号６０）；
APRR7には5'-ACCCGGGTATGAATGCTAATGAGGAGGGGG-3'（配列番号６１）ならびに5'-ACCCGGGTTAGCTATCCTCAATGTTTTTTA-3'（配列番号６２）；
APRR9には5'-AGGATCCGTATGGGGGAGATTGTGGTTTTA-3'（配列番号６３）ならびに5'-TGGATCCTCATGATTTTGTAGACGCGTCTG-3'（配列番号６４）。
【００４７】
これらのPCRプライマはRT-PCRにも用いた。
LKP2の各ドメインコンストラクトもやはりPCRにより構築し、pCR4-TOPO（Invitrogen）内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。
PCRに用いたプライマは以下の通りである。
LKP2のLOVドメイン（L）には5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号６５）ならびに5'-TGGATCCTTAGGGCCCAGGCCTTCTAGGAATTTCTTTTGC-3'（配列番号６６）；
LKP2のF-box領域（F）には5'-AGGATCCGTATATCTCGCTCATTTACTTCT-3'（配列番号６７）ならびに5'-TGGATCCTTACCTTTTTGCACCGGGAACAC-3'（配列番号６８）；
LKP2のケルヒ繰り返し領域（K）には5'-AGGATCCGTATTGGTTGGGTGCGACTGGCC-3'（配列番号６９）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７０）；
LKP2のLFには5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号７１）ならびに5'-TGGATCCTTACCTTTTTGCACCGGGAACAC-3'（配列番号７２）；
LKP2のFKには5'-AGGATCCGTATATCTCGCTCATTTACTTCT-3'（配列番号７３）ならびに5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７４）。
【００４８】
LKP2のLK（L+K）コンストラクトのためには、Lには5'-AGGATCCGTATGCAAATCAAATGGAGTGGG-3'（配列番号７５）と5'-AGATCTAGGCCTTCTAGGAATTTCTTTTGC-3'（配列番号７６）、Kには5'-AAGATCTATTGGTTGGGTGCGACTGGCCCG-3'（配列番号７７）と5'-TCTCGGATCCGATCAAGTACTTGCAGTGGT-3'（配列番号７８）のプライマセットを用いて、2種類のPCR断片を生成し、pCR-TOPO内にサブクローニングし、全体のシーケンス分析を行ってシーケンスを確認した。
【００４９】
次にL断片をBamHIとBglIIの二重消化により切り出し、pCR4サブクローン化K断片内部のBglII部位に結合させた。接合領域はシーケンス分析してフレーム内接合を確認した。サブクローン化断片は適切な制限酵素で切り出し、GAL4活性化ドメインを含むpGADT7、あるいはGAL4 DNA結合ドメインを含むpGBKT7のマルチクローニング部位内に導入した（Clontech）。接合領域はシーケンス分析してフレーム内接合を確認した。コンストラクトの適当な対をAH109酵母細胞内に導入した。
形質転換株の増殖は、ロイシンとトリプトファンが欠如した合成完全（SD）培地上で行い、アデニン（Ade）、ヒスチジン（His）、ロイシン（Leu）、トリプトファン（Trp）の欠如したSD培地上で、3-amino-1,2,4-triazole（3-AT）添加または非添加条件下にて、分析した。
【００５０】
相互作用試験は、Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3のユーザマニュアルと、Clontechから得たYeast Protocols Handbookの記述に従って、少なくとも3種類の独立した形質転換株を用いて実施した。この系においてレポーター遺伝子のADE2、HIS3、MEL1/LacZは、完全に異なる3種類のGAL4上流活性化シーケンスとTATAボックスエレメントの調節下にある。HIS3栄養マーカーを用いて弱陽性相互作用を同定することが可能である一方、ADE2マーカーは非常に厳密であり擬陽性の発生率を減少させる（James et al., 1996）。lacZレポーターの発現により2-ハイブリッド相互作用がさらに確認され、擬陽性が減少する。
【００５１】
スポット分析では、LeuとTrpの存在しないSD培地中での一晩の液体培養（OD600=1.5）を、Ade、His、Leu、Trpの存在しないSD寒天培地上に、3-ATの存在下または非存在下にてスポットした（5μL）。酵母コロニーの培養は30℃で、赤、遠赤外、青、緑、白色光（フォトン束密度40μmol s-1 m-2）（LED系：Sanyo、Osaka、Japan）または暗黒条件下で行った。β-ガラクトシダーゼ活性分析のために、それぞれの一晩培養から得た酵母細胞を遠心沈殿させ、凍結-融解を3回繰り返して透過化処理を行った。粗抽出物はO-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside存在下、30℃でインキュベートし、OD420を記録した。活性はMiller単位で示した。
【００５２】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析のために、酵母細胞を50ml YPD（酵母抽出物/ペプトン/ブドウ糖）培地中で4-8時間にわたり増殖させ（OD600=0.6）、遠心により沈殿させ、液体窒素中で凍結した。沈殿には400μlの抽出緩衝液（40mM Tris-HCl［pH6.8］、8M尿素、5% SDS、0.1mM EDTA、0.4mg/mlブロモフェノールブルー、0.8% 2-メルカプトエタノール、6.2μg/mlペプスタチンA、1.86μMロイペプチン、9.0mMベンズアミド、23.0μg/mlアプロチニン、0.77mg/mlフェニルメチルスルホニルフルオライド）を添加し、ホモジナイズした。細胞の粗抽出物（12μl）を各レーンに載せ、SDS-PAGEによりタンパク質の分離を行い、ニトロセルロース上に電気的に転写した。ここでは抗mycまたは抗HA抗体を用いて、試験対象のタンパク質を検出した。
【００５３】
［結果］
LKP2遺伝子のプロモータ活性
組織特異的なLKP2 mRNAレベルはこれまでに調査されており、それによるとLKP2のmRNAがロゼット葉、花、長角果に蓄積し、少量のmRNAが根、茎、茎葉、種子に検出されている（Shultz et al., 2001）。LKP2のプロモータ活性をモニターするため、本発明者らはLKP2プロモータであるGUSコンストラクトを含む、遺伝子組み換えシロイヌナズナ植物を作成した（図1）。GUSシグナルは、苗木では全部分に検出されたが、2週齢のロゼット植物ではロゼット葉と根端に限定されていた。花ではGUS活性はがく片に検出された。GUSシグナルは若い長角果に検出されたが、古い長角果には検出されなかった。これらの結果は、RT-PCRにより検出されたLKP2のmRNAレベルに一致しており（Schultz et al., 2001）、そのことから1.6kbのプロモータ領域がLKP2発現を調節するために十分な要素を有していると考えられる。
【００５４】
GFP-LKP2の細胞内局在
LKP2の細胞内局在を可視化するため、本発明者らはCaMV 35Sプロモータに由来するGFP-LKP2融合コンストラクトをシロイヌナズナに導入し、RNAゲルブロット分析により高発現株を選択した（データ示さず）。この遺伝子組み換え植物は、35S:LKP2植物に見られるのと同様の胚軸伸長と開花遅延の表現型を示しており（Schultz et al., 2001）、この遺伝子組み換え植物において導入されたLKP2-GFPタンパク質が機能していると考えられる（データ示さず）。これらの株ではGFP関連蛍光は核内に分布していたが核小体には見られず（図2H）、35S:GFP植物の細胞全体にわたり、非常に強いGFPシグナルが検出された（図2B）。これらのデータからLKP2は核タンパク質であると考えられる。
【００５５】
F-boxタンパク質としてのLKP2
シロイヌナズナでは、これまでに700種類を超えるF-boxタンパク質がゲノム分析により同定されている（Gagne et al., 2002; Kuroda et al., 2002; Risseuw et al., 2003）。しかし、これらの公表データは主にコンピュータプログラム分析に基づいているため、F-box活性のないタンパク質や、進化途上で活性を消失したタンパク質もその数に含まれているだろう。LKP2がF-boxタンパク質として機能することを確認するため、ここでは酵母2-ハイブリッド系で、シロイヌナズナSKP1様（ASK）タンパク質を用いた相互作用試験を行った（図3A）。試験対象となった19種類のASKタンパク質（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20A、ASK20B）のうち、LKP2が相互作用したのは9種類（ASK1-5、ASK11、ASK14、ASK20A、ASK20B）であった。LKP2のASKタンパク質との相互作用は、ASK3-5、ASK20A、ASK20B以外の2種類によるASKタンパク質との相互作用と類似していた。LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域のアミノ酸シーケンスは相互に類似しているため（LKP1とLKP2、68.1%；LKP2とLKP3、63.8%；LKP1とLKP3、66.0%の相同性）、これらのタンパク質のASK選択性（ASK1、ASK2、ASK11、ASK14）は意外ではない。さらにASK1、ASK2、ASK11は、シロイヌナズナ内の広範囲のF-boxタンパク質と相互作用する（Gagne et al., 2002; Risseeuw et al., 2003）。LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域はASKタンパク質の結合のためには十分である（図3B-D）。
【００５６】
ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質との相互作用
分裂酵母と哺乳類では、F-boxタンパク質はホモならびにヘテロダイマーとして機能すると報告されている（Kominami et al., 1998; Suzuki et al., 2000）。さらに、WC-1タンパク質は、アカパンカビの青色光センシングに関連するZnフィンガー転写因子を含むLOVドメインの一つであるが、このタンパク質について自己二量体化が報告されている（Ballario et al., 1998）。そのため本実施例では酵母2-ハイブリッド系を用いて、ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質に対するLKP2の相互作用を調べた。制限培地上での酵母増殖試験によれば、LKP2とLKP1、LKP2とLKP2、LKP2とFKF1の間には相互作用が観察されたが、LKP1とLKP1や、LKP1とFKF1の間には何も検出されなかった（図4A）。この相互作用はβ-ガラクトシダーゼ活性によっても確認された（図4B）。これらの結果から、LKP2はLKPファミリータンパク質と協同して機能するらしいと考えられる。本発明では異なる光条件下（赤、遠赤外、青、緑、白色）で、光の性質が制限培地上の酵母増殖に及ぼす影響を調べたが、増殖に違いは見られなかった（データ示さず）。
【００５７】
LKP2の概日時計成分に対する相互作用
35S:LKP2植物を用いた分析から、LKP2は概日オシレータの内部もしくはその非常に近くで機能していると考えられた（Schultz et al., 2001）。LKP2は核タンパク質であるため（図2）、本発明では核局在化時計関連因子に対するLKP2の相互作用分析を実施した。Ade、His、Leu、Trpを含まないSD培地上での増殖試験においては、LKP1とTOC1については強い相互作用が検出され、LKP1とTOC1については弱い相互作用が検出された（図5A）。これらの相互作用はベイト/プレイの配置を逆転させた場合にも観察された（データ示さず）。FKF1とTOC1の間には相互作用は見られなかった。CCA1またはLHYに対するLKP2の相互作用は検出されなかった。LKP1とFKF1も同じくCCA1やLHYとは相互作用しなかった。β-ガラクトシダーゼ活性を調べてこれらの相互作用を確認した。LKP2とTOC1コンストラクトを保有する酵母においては強いガラクトシダーゼ活性が検出され、LKP1とTOC1コンストラクトを保有する酵母では弱い活性が検出された（図5B）。分析対象となったその他のコンストラクトの組み合わせを保有する酵母においては、有意なガラクトシダーゼ活性は全く検出されなかった。これらの結果からも、TOC1はLKP1とLKP2の両方に対して相互作用可能であるが、FKF1とは相互作用できないと考えられる。いずれの相互作用も、本発明者らが実施した光品質処理による影響を一切受けなかった（データ示さず）。
TOC1に結合するLKP2ポリペプチドの一部についても、同様に酵母2-ハイブリッド系により局在化を調べた。LKP2のドメイン1個または2個を発現するコンストラクト6種類を調査対象とした（図6）。この2-ハイブリッド系では、LOVドメインを含むペプチドとTOC1の間に相互作用が検出されたが、TOC1とLOVドメインを含まないLKP2ペプチドの間には相互作用は検出されなかった。これらの結果から、LKP2のLOVドメインはTOC1を結合するために必要十分であることが示される。
【００５８】
TOC1パラログに対するLKP2の相互作用
TOC1はシロイヌナズナの中央オシレータの一成分であり、myb様のDNA結合タンパク質であるCCA1とLHYと共に、フィードバックループを形成する。一方ではシロイヌナズナには4種類のTOC1パラログ、すなわちAPRR3、APRR5、APRR7、APRR9が存在している。LKP2結合の特異性を分析するため、本発明ではAPRRファミリータンパク質を用いて2-ハイブリッド分析を行った（図7A、B）。TOC1の場合と同じく、LKP2とAPRR5の間には強い相互作用が検出され、LKP1とAPRR5の間には弱い相互作用が検出された。これらの相互作用はベイト/プレイの配置を逆転させた場合にも観察された（データ示さず）。LKPファミリータンパク質とその他のAPRRファミリータンパク質の間にその他の相互作用は検出されなかった。APRR5に結合するLKP2ポリペプチドの一部についても、同様に酵母2-ハイブリッド系により調査を行った。TOC1の場合と同じく、LKP2のLOVドメインはAPRR5を結合するために必要十分である（図8）。
【００５９】
［考察］
本実施例で本発明者らは、1.6-kbのプロモータ領域とGUSレポーター遺伝子を融合させることによる、LKP2遺伝子のプロモータ活性を示している。LKP2プロモータ-GUS融合体の高発現は、子葉とロゼット植物に観察されたが（図1A、B）、そこでは比較的高レベルのプロモータ活性、あるいはLKP1とFKF1のmRNA蓄積が報告されている（Kiyosue and Wada, 2000; Nelson et al., 2000）。またLKP2プロモータ-GUS活性が検出された部位は、LKP1とFKF1プロモータの活性が報告された（Nelson et al., 2000）部位であるがく片（図1C）、FKF1プロモータ-GUS活性が報告された（Nelson et al., 2000）部位である根端（図1B）、LKP1プロモータ-GUS植物においてGUS活性が検出されている（Kiyosue and Wada, 2000）若い長角果（図1D）等である。LKP2はLKP1とFKF1に相互作用しうるため（図4）、LKP1および/あるいはFKF1が共通して発現する場所で、LKP2はそれらに対して作用する可能性がある。また、本発明者らはLKP2がTOC1とAPRR5に相互作用しうることを示した（図5,7）。APRR5の器官特異的な発現についてはまだ調査が行われていないが、TOC1とAPRR5の発現がロゼット葉に検出されており（Makino et al., 2000; Sato et al., 2002）、これはLKP2プロモータ活性とLKP2発現がロゼット葉に存在する点と一致している（図1）（Schultz et al., 2001）。
35S:GFP-LKP2植物において、GFP関連シグナルは核内に分布しているが、核小体には分布していなかった（図2H）。この分布パターンは35S:GFP-LKP1植物のGFPシグナルの場合や（Kiyosue and Wada, 2000）、異なるシロイヌナズナ組織中のASK1に対するシグナルの免疫局在の場合と同一であるが（Farras et al., 2001）、これはLKP2がLKP1とASK1にタンパク質-タンパク質相互作用する点に一致している（図3、4）。TOC1はLKP2と相互作用可能であり（図7）、また核内に位置している（Makino et al., 2000）。一時的に形質移入されたタバコ細胞中のYFP-TOC1シグナルは、核内で小斑点状のパターンを示し、そこからTOC1はおそらくトランスクリプトーム、スプライセオソーム、プロテアソームで機能する可能性が考えられる。これはLKP2がおそらく標的タンパク質をユビキチン化するSCF複合体として機能している点に一致しており、この場合のユビキチン化は、標的タンパク質を分解のためにプロテアソームまで輸送する引き金になっている（Strayer et al., 2000）。APRR5の細胞内局在に関する報告はまだ存在しないが、APRR5はC末端領域にCCTドメインが存在することから核タンパク質であると思われる。CCTドメインはCONSTANS、CONSTANS様、ならびにAPRR/TOC1ファミリータンパク質に見られる共通モチーフであり、これらのタンパク質の核局在に重要であると考えられている（Makino et al., 2000; Robson et al., 2001）。
シロイヌナズナでは21種類のSkp1様ASK遺伝子が存在するが、ASK6とASK15はフレームシフトを有するため偽遺伝子であると考えられている（Risseeuw et al., 2003）。ASK20からは選択的スプライシングにより、同一遺伝子から2種類のタンパク質ASK20AとASK20Bが生成される（Risseeuw et al., 2003）。本発明での結果から、LKP2はLKP1やFKF1と同様に、ASK1、ASK2、ASK11、ASK14と相互作用することが示された（図3）。ASK1、ASK2、ASK11に対するLKP1の酵母2-ハイブリッド相互作用や、ASK1に対するFKF1の同じ相互作用についてもこれまでに報告されている（Kuroda et al., 2002; Risseeuw et al., 2003）。またRisseeuw et al.の報告によれば、ASK3、ASK4、ASK7、ASK8、ASK9、ASK12、ASK19に対してLKP1が相互作用するというが、本発明で本発明者らが行った2-ハイブリッド分析においては、ASK4を除きこれらは検出されなかった。これらの違いはおそらく培養条件やベクター系が原因だろう。本実施例では2-ハイブリッドアッセイを30℃の厳密な選択条件で実施したが、彼らのアッセイは20℃で実施された。本発明で使用した酵母2-ハイブリッドベクターのほうが信頼性が高いが、その理由は3種類のレポーター遺伝子（ADE2、HIS3、MEL1/lacZ）が、完全に異種である3種類のプロモータの調節下にあるためである。動物と酵母のSkp1タンパク質は、Cul1やRbx1に結合するのと同様に、F-boxタンパク質のF-box領域に結合してSCF複合体を形成し、この複合体はF-boxタンパク質により認識される標的タンパク質に対するE3ユビキチンリガーゼとして働くことが知られている（Skowyra et al., 1999; Kamura et al., 1999）。ADO/FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質のF-box領域が、シロイヌナズナSkp1様タンパク質と相互作用することから（図3B-D）、これらのタンパク質はSCF複合体の成分であり、E3ユビキチンリガーゼとして働くと考えられる。
図4には、LKP2がLKPファミリータンパク質と相互作用することが示されている。LKP2はLKP1、LKP2、またはFKF1と協働して異なる各種基質を認識する可能性もあり、またLKP2はこれらのファミリータンパク質が分解する場合に機能する可能性もある。Kim et al. (2003)の報告によれば、ZTL（LKP1）タンパク質レベルは、異なる概日フェーズに特異的なプロテアソーム依存性分解により調節されている。LKP2はZTL（LKP1）と相互作用しうるため、LKP2によりZTL（LKP1）がユビキチン化される可能性がある。
LKP2 LOVドメインコンストラクトは、APRR1/TOC1ならびにAPRR5と十分に相互作用した（図6、8）。LOVドメインを含む領域がタンパク質-タンパク質相互作用に関連していることは、PHOT1（NPH1）とNPH3の比較においても示されている（Motchoulski and Liscum, 1999）。アカパンカビの青色光センシング転写因子であるWC-1では、LOVドメインが自己二量体化に関与していることが示されている（Ballario et al., 1998）。LOVドメインはいずれの青色受容体にも見られるため、LKP2のLOVドメインの相互作用活性は光により調節されている可能性がある。しかし本実施例で実験した範囲では、LKP2 LOVドメイン含有領域を介して光の品質がタンパク質-タンパク質相互作用に影響することはなかった。だがLKP2 LOVドメインのN末端につながったGAL4活性化ドメインやDNA結合ドメインが光感受性に影響しているか、あるいは酵母に欠落しているある種の因子が光センシングに必要であるという可能性を除外することは出来ない。
酵母2-ハイブリッド系においてLKP1とLKP2はTOC1とAPRR5の両者に対して相互作用したが、FKF1とAPRR/TOC1ファミリータンパク質の間の相互作用は検出されなかった（図7）。LKP1、LKP2、FKF1のアミノ酸シーケンスは全体的に類似しており（LKP1とLKP2、74.1%；LKP2とFKF1、61.9%；LKP1とFKF1、66.1%）、全てにLOVドメイン、F-box、ケルヒ繰り返し領域があるにもかかわらず、FKF1の遺伝子発現プロファイルは、LKP1やLKP2の場合と異なっていた。1日を通して見るとFKF1のmRNAレベルは律動的であるが、これに対してLKP1とLKP2では一定にである（Kiyosue and Wada, 2000; Nelson et al., 2000; Schultz et al., 2001）。FKF1とLKP1やLKP2を隔てるこれらの違いが、FKF1と他のLKPファミリータンパク質の間の機能的区別を意味することになる。
LKP1とLKP2はいずれもTOC1とAPRR5に相互作用するという事実は、LKP1とLKP2に機能的重複性が見られる可能性を反映しているようだ。35S:LKP1と35S:LKP2植物に見られる、胚軸の伸長や長日条件下での開花遅延などといった発現型は類似しており、それらのアミノ酸シーケンスは類似している（73.0%同一性）ことから、それらの機能が重複していると考えるのはきわめて自然な成り行きである。しかし、ADO1/ZTL/LKP1中にT-DNAインサートを持ち、ADO1/ZTL/LKP1の発現をノックアウトした植物株では、CCR2発現のリズムが遅延し、子葉先端運動が見られることから（Jarillo et al., 2001）、LKP1とLKP2の重複性はごく一部であると考えられる。
TOC1とAPRR5に対するLKP2の相互作用について、少なくとも2種類の説明が可能である。一つはTOC1とAPRR5はSCFLKP2複合体のユビキチン化に対する標的であるというもの、あるいはLKP2はTOC1とAPRR5の安定性に関与しているというものである。TOC1は特徴がよく知られており、概日オシレータの成分である可能性がある（Schultz and Kay, 2003）。APRR5は時計に対する概日シグナルの増幅に影響し、概日出力を調節していることが報告されている。APRR5のT-DNA挿入個体では、時計媒介性の葉の運動期間が短縮され（Michael et al., 2003）、青色光条件下ではCCA1とCCR２の発現期間が短縮される（Eriksson et al., 2003）。APRR5を過剰発現する植物では、時計調節型遺伝子に対するmRNAレベルの規模は減少するが、そのリズム性は不変であるらしい（Sato et al., 2002）。そのため、35S:LKP2植物では大量のLKP2が、TOC1とAPRR5の両タンパク質レベルを減少させ、その結果リズム障害の表現型が生じる可能性がある。
もう一つの説明は、TOC1とAPRR5がLKP2へのシグナル伝達において作用し、標的タンパク質のユビキチン化を行っているというものである。ZTL（LKP1）のケルヒ繰り返し領域に点変異のある植物では、その変異の結果アミノ酸がAspからAsnに置換されており、概日リズム遅延の表現型が見られる（Somers et al., 2000）。ケルヒ繰り返しはベータプロペラ構造を形成すると予想され、概日時計関連のユビキチン化基質におけるタンパク質-タンパク質相互作用において機能すると考えられる。Steve Kayのグループは、DOF（ワンフィンガーによるDNA結合）転写因子を単離しており、これはLKP2のケルヒ繰り返し領域と相互作用するが、その変異体（AspをAsnに置換）とは相互作用しない。因子の一つが過剰発現する結果、リズム障害を有する表現型が生じる（Kay, 2002）。そのためTOC1および/あるいはAPRR5が、そのようなケルヒ繰り返し相互作用因子とLKP2の間の相互作用を調節し、LKP2の機能を調節する可能性がある。
本発明では酵母2-ハイブリッド分析により、TOC1とAPRR5に対するLKP1とLKP2の相互作用を示した。これらの相互作用を確認するためには、たとえば免疫共沈降、プルダウン分析、in vivo相互作用などから支持データを得る必要がある。本発明では予備的な免疫共沈降分析を実施したが、それにもかかわらずこれらのタンパク質の間には強い相互作用は観察されなかった（データ示さず）。ここでは、何らかの光受容性発色団が存在することによって相互作用が影響されうると考えたが、これはNPH3に対するPHOT1（NPH1）の相互作用において、フラビンモノヌクレオチド（FMN）がPHOT1のLOVドメインに結合しなければならないためである（Motchoulski and Liscum, 1999）。最近の報告によれば、FKF1のLOVドメインはFMNに結合し、またLKP1（ZTL1）とLKP2のLOVドメインはFKF1に類似した分光特性を有するという（Imaizumi et al., 2003）。そのため、LOVドメインを介したTOC1とAPRR5に対するLKP1とLKP2の相互作用のためには、適切なフラビン類がLOVドメインに結合しなければならない可能性がある。
本発明に係る草稿がレビューされている途中に、シロイヌナズナではZTLによるTOC1の標的化分解により概日機能が調節されることをMas et al.（2003）が示したが、彼らはZTL（LKP1）に対してTOC1が物理的相互作用し、それがztl変異により無効化され、その結果構成レベルのTOC1タンパク質発現が生じることを示している。また彼らは、暗黒に依存するTOC1タンパク質の分解には機能的ZTL（LKP1）が必要であり、プロテアソーム経路を阻害することによりこの分解が阻害されることを示した。2-ハイブリッド分析において、LKP2はZTL（LKP1）とTOC1を認識できるため（図4）、TOC1分解に際してLKP2はLKP1と協働している可能性がある。この可能性を調べるためにはさらに研究が必要である。Mas et al.によれば、ZTLとTOC1の間には比較的強い2-ハイブリッド相互作用が、またLKP2とTOC1の間には比較的弱い相互作用が示されたが、本稿ではLKP2とTOC1の間に比較的強い相互作用が見られた（図5）。これはおそらく、本稿ではGAL4系を使用し、彼らはLexA系を使用していることによる違いが原因であろう。ある種のタンパク質間相互作用はGAL4ベースの2-ハイブリッド系では検出されないがLexAベースの系では検出可能となり、その逆の場合もあるということはよく知られている（Gyuris et al., 1993; Golemis et al., 1996; Mendelsohn and Brent, 1994）。
【実施例２】
【００６０】
（各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用）
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、光子量41μmol/m-2/s-1の各種光条件下（暗条件下、白色光下、青色光下、赤色光下）にて酵母を生育させ解析を行った。
（各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用）
APRR1/TOC1、APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合タンパク質またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（−）、ならびにLKP1、LKP2、LKP1 C82A、LKP2 C82AGAL4転写活性化ドメイン融合タンパク質またはGAL4転写活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（−）を含む酵母AH109株をSD-Leu、Trp(SD-LW)（上）、SD-Ade、His、Leu、Trp(SD-AHLW)寒天培地上（右）で生育させた際のシングルコロニー。GAL4 DNA結合ドメインを有するマウスp53タンパク質、ならびにGAL4活性化ドメインを有するSV40-T抗原をコードする2種類プラスミドを陽性コントロールとした。それぞれ、30℃で4日間、暗条件下及び、光子量50μmol/m-2/s-1、100μmol/m-2/s-1、190μmol/m-2/s-1の青色光下にて酵母を生育させ解析を行った。
【００６１】
[結果]
シロイヌナズナphot1、phot2ではLOV domainが青色光に応答し、システイン残基を介してFMN（Flabin mononucleotide）と結合、遊離することが報告されている。このシステイン残基に変異を入れることによりFMNとの結合能力が失われ、また、自己リン酸化反応の消失や、光屈性の消失など様々な現象に変化が認められる。LKP1、LKP2のLOV domainにもこのシステイン残基は保存されており、FKF1のLOV domainについては実際にFMNと結合することが示されている（imaizumi et al.2003）。本発明では、LKP1、LKP2のシステイン（C）をアラニン（A）に置換したコンストラクト（LKP1 C82A、LKP2 C82A）を作製し、APRR1/TOC1、APRR5との相互作用に与える影響を解析した。これらのLKP変異体との相互作用は暗条件下、赤色光下において変化は認められないものの、白色光下ではやや相互作用が弱くなり、青色光下においては完全に相互作用が消失した（図9）。
次に、青色光下で光強度を50、100、190に振り分け光強度による相互作用に与える影響を解析した。光子量50の時点でLKP1 C82A、LKP2 C82AとAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用が完全に消失した。光子量190では変異体LKP1、LKP2のみでなく野生型LKP1とAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用との相互作用も消失していた。また、光強度を上昇させるにつれて変異体LKP1、LKP2を含むAH109株はSD-Leu、Trp培地（SD-LW）でも生育が阻害されていた（図10）。
【００６２】
[考察]
LKP1、LKP2のシステイン（C）をアラニン（A）に置換したコンストラクトを用いて、青色光下でAPRR1/TOC1、APRR5との相互作用を解析した際には野生型LKP1、LKP2との間で認められていた相互作用が消失していた。
酵母2-Hybrid用のベクターにはHA-tagや転写活性化領域等が含まれており、これらとLKP1、LKP2との融合タンパク質として発現させているためにLKP1、LKP2のタンパク質構造が変化し、青色光に対する反応が起こりにくくなっているが、変異体を用いることにより青色光に対する反応が認めらにくくなっているという可能性が考えられる。実際に、LKP1（ZTL）によるTOC1のプロテアソーム系に依存した分解は暗下で促進され、明下ではTOC1タンパク質が蓄積することが報告されている（Mas et al.2003）。この結果は、暗下でのみLKP1とTOC1が相互作用し、明下ではTOC1との相互作用が認められなくなるという仮説を支持するものであると考えられる。
強光下で、変異型LKP1、LKP2を含むAH109株がSD-Leu、Trp培地（SD-LW）でも生育が阻害されるという現象は酵母内で発現している変異型LKP1、LKP2のタンパク質が不安定になるために起こるという可能性が考えられる。強光下において変異型LKP1、LKP2のタンパク質が不安定になる原因と機構については、現時点では定かではないが、ウエスタンブロット等を実施し、タンパク質の安定性を評価する必要があるだろう。
【実施例３】
【００６３】
（LKP2を核小体へ取り込む能力を持つLKP2相互作用因子の同定）
LKP2はF-boxタンパク質であり、概日時計オシレータの中心部または近傍で機能すると考えられている。LKP2の基質として作用するタンパク質の種類を決定する第一段階として、LKP2をバイトに用いて酵母2-ハイブリッドスクリーニングを実施したところ、2種類の相互作用因子Di19とCOL1が単離された。一時的に発現したDi19-GUS融合タンパク質はシロイヌナズナ葉柄細胞の核内に局在した。同様にCOL1と他のCO/COLファミリータンパク質にもLKP1/ZTL、LKP2またはFKF1と相互作用する能力があった。COまたはCOL1のLKP2結合部位は各タンパク質の中心付近に存在していた。COまたはCOL1のCCTモチーフはLKP2と相互作用するための十分条件にはならない。LKP2はF-boxとkelch反復を有するCOを認識し、他方ではLOVドメインを有するCOL1を認識した。LKP2をシアン蛍光タンパク質（CFP）と融合させてタマネギ表皮細胞内で一時的に発現させた場合に、CFP-LKP2シグナルは核と細胞質ゾル内に局在した。黄色蛍光タンパク質（YFP）-COとYFP-COL1は一時的に発現する場合にはいずれも核内局在しており、核小体を形成していた。しかしCOまたはCOL1に融合させたYFPと同時にCFP-LKP2を発現させるとCFP-LKP2が核内に取り込まれる結果が生じた。さらにCFP-LKP2とYFP-COのシグナルはpU2B"-mRFPのシグナルと共に局在していたが、このうち後者はカハールボディのマーカーである。これらの結果から、LKP2はCO/COLファミリータンパク質と共に核小体内で機能している可能性が考えられる。
【００６４】
［はじめに］
ユビキチンは熱安定性の76アミノ酸ペプチドであり、2個のαへリックス構造と5個のβシートにより構成され、真核生物において保存性が高い。ユビキチンの著名な機能はプロテアソーム依存性のタンパク質分解に対するシグナルである。しかしユビキチン化、すなわち他のタンパク質に対するユビキチンの共有結合によって調節される多数の細胞過程、すなわちウイルス出芽、細胞周期調節、DNA修復、転写調節、キナーゼ活性調節、タンパク質間相互作用、ユビキチン化タンパク質の細胞内局在などが存在する。このような調節に関してはユビキチンのポリマー化部位と状態が非常に重要である。K48にリンクされたポリユビキチン化は26Sプロテアソームに対する標的シグナルであるという可能性があり、一方でモノユビキチン化ならびにK63にリンクされたポリユビキチン化は各種の細胞内過程に対するシグナルであるという可能性がある（Deng et al. 2000, Hicke 2001, Pickart 2001, Hicke and Dunn 2003, Muratani and Tansey 2003, Pickart and Eddins 2004, Sakai et al. 2004, Shcherbik and Haines 2004, Sun and Chen 2004, Vodermaier 2004）。
ユビキチン化は3種類の酵素、すなわちユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、ユビキチン-タンパク質リガーゼ（E3）により生じる。E1はATP依存性アデニル化を介して、ユビキチンとチオエステル結合を生じる。E2は活性化ユビキチンを受け取り、それを標的タンパク質に輸送する。E2はユビキチンと標的タンパク質の間のイソペプチド結合を触媒することが可能であるが、ほとんどの場合にE3が必要になる。E3はユビキチンの結合したE2からユビキチンを受け取ってそれを基質に輸送するか（HECT型）、あるいはユビキチンの結合したE2と基質を結合させる架橋因子として作用してから基質に対する活性化ユビキチンの結合反応を触媒する（RING、PHD、ならびにU-box型）。E3は基質特異性の決定に関係していることから真核生物ではこれらの酵素について大規模で多様なグループが存在する（Hedge 2004, Johnston and Madura 2004, Pickart and Eddins 2004）。
【００６５】
植物においてはゲノムシーケンスプロジェクトの結果として、多数の推定E3遺伝子が記録・同定されている。報告によれば、シロイヌナズナのゲノムは500種類以上のRINGドメインタンパク質と、600-700種類以上の潜在的なF-boxタンパク質をエンコードしている（Gagne et al. 2002, Kuroda et al. 2002）。これらのE3遺伝子は植物の発達、形態形成、ホルモン反応性などに関して機能することが示されている（Moon et al. 2004, Schwechheimer and Villalobos 2004）。
UFO（UNUSUAL FLORAL ORGANS）は植物について初めて同定されたF-boxタンパク質であり、花の分裂組織同一性や、花の組織発達に関して機能する（Levin and Meyerowitz 1995, Samach et al. 1999）。
COP1（Constitutive Photomorphogenesis 1）は光形態形成受容体であり、HY5（Long Hypocotyl 5）（Osterlund et al. 2000, Saijo et al. 2003）、phyA（phytochrome A）（Sco et al. 2004）ならびにLAF1（Long After Far Red Light 1）（Sco et al. 2003）の分解に関与する単一サブユニットのRING型E3である。
SINAT5（SEVEN IN ABSENTIA IN ARABIDOPSIS THALIANA 5）もやはり単一サブユニットのRING型E3であり、NAC1（NAM/CUC-like protein 1）のユビキチン化に関与しているが、このNAC1はオーキシンに反応する側根形成に対する転写活性化因子である（Xie et al. 2002）。
TIR1（TRANSPORT INHIBITOR RESPONSE 1）はAUX/IAAファミリータンパク質の安定性を調節するが、このタンパク質にはARFs（オーキシン反応因子）に対する機能的抑制因子として作用する能力がある（Gray et al. 2001, Tiwari et al. 2001, Tiwari et al. 2004）。
SLY1（SLEEPY 1）はDELLAファミリータンパク質の安定性を調節してジベレリンシグナル伝達に関与している（Dill et al. 2004, Fu et al. 2004）。
EBF1（EIN3-binding F-box 1）とEBF2はエチレン反応性の転写活性化因子EIN3（Ethylene Insensitive 3）レベルを調節する（Guo and Ecker 2003, Potuschak et al. 2003, Gagne et al. 2004）。
COI1（Coronatine Insensitive 1）はジャスモン酸シグナル伝達に関与している（Xu et al. 2002）。
FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質はF-boxタンパク質であり、シロイヌナズナの概日時計と開花期に影響を及ぼす。この小規模なファミリーはLKP1/ZTL、LKP2/FKL、FKF1の3種類により構成される（Kiyosue and Wada 2000, Nelson et al. 2000, Somers et al. 2000）。このタンパク質ファミリーの各成分にはF-boxであるLOVならびkelch反復ドメインが含まれる。これらのLOVドメイン構造はPHOT1ならびにPHOT2青色光受容体のドメイン構造に類似しており（Briggs et al. 2001, Briggs and Christie 2002, Cheng et al. 2003）、FMNに結合可能である（Imaizumi et al. 2003）。これらのF-boxドメインは、いくつかのASK（Arabidopsis SKP1）タンパク質と相互作用することが示されている（Kuroda et al. 2002, Risseeuw et al. 2003, Yasuhara et al. 2004）。Kelch反復はWD40反復に似たβプロペラ構造とタンパク質間相互作用モジュールを形成すると考えられる（Li et al. 2004）。ZTLは概日時計において機能しTOC1（Timing of CAB Expression 1）分解に関与することが示されているが、このTOC1は中心概日オシレータの成分であると見なされている（Mas et al. 2003, Somers et al. 2004）。FKF1（Flavin binding, KELCH repeat, F-box 1）の遺伝子発現は概日時計により調節されているが、このFKF1は青色光受容体であり、開花期遺伝子CO（CONSTANS）の発現を調節することが報告されている（Nelson et al. 2000, Imaizumi et al. 2003）。
【００６６】
LOV KELCH PROTEIN2（LKP2）に関してみるならば、LKP2遺伝子を過剰発現する植物を長日条件で育成する場合には遅延開花の表現型が現れ、連続光または遮光条件下では、いずれの場合もCAB2またはCCR2に対する時計調節性遺伝子について不規則なプロモーター活性が現れたが、これらの事実からLKP2は概日時計に近い場所で機能していると考えられる（Schltz et al. 2001）。LKP2タンパク質はLKP1/ZTL、TOC1、PRR5に対しても相互作用する能力があった（Yasuhara et al. 2004）。PRR5はPRR/TOC1ファミリータンパク質の一員であると考えられており、このファミリータンパク質は概日時計の調節に作用していると考えられている（Sato et al. 2002, Yamamoto et al. 2003）。概日時計調節ならびに開花期調節におけるLKP2の機能をより深く理解するため、本実施例では酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2に相互作用するタンパク質因子を単離した。本実施例ではLKP2と活性相互作用を示す因子について、単離、分子的相互作用、局在に関して報告を行う。
【００６７】
［材料と方法］
DNAシーケンス分析
シーケンス分析に用いるプラスミドDNAテンプレートの調製と、DNAシーケンスの決定は既出論文どおり実施した（Yasuhara et al. 2004）。GENETYX（Software Development, Tokyo, Japan）ならびにSequencher（Gene Codes Co., Ann Arbor, MI, USA）ソフトウェアシステムを用いてDNAシーケンス分析を行った。
【００６８】
cDNAライブラリ構築と酵母2-ハイブリッドアッセイ
2-ハイブリッドアッセイは既報の通り実施した（Yasuhara et al. 2004）。cDNAライブラリ構築とそれに続く2-ハイブリッドスクリーニングは製造元の指示（MATCH-MAKER Library Construction & Screening Kit, Clontech, Palo Alto, CA, USA）に従って行ったが、これには22℃にて16時間の明条件と8時間の暗条件というLD条件下生育し、照明開始後4時間間隔（0、4、8、12、16、20時間）で収穫したシロイヌナズナ（Columbia生態型）のロゼット葉から単離したRNAを用いた。GAL4活性化ドメインを有する全長LKP2 cDNAをバイトとして用いた。
【００６９】
cDNAクローン
Di19、CO、COL1-10、COL13-16に対するcDNAのColumbia版は、ReverTra Dash（Toyobo, Osaka, Japan）を用いたRT-PCRによって、あるいは理研バイオリソースセンター（Tsukuba, Japan）より取得した。クローンはPCR増幅して適切な制限酵素部位を生成し、pGEM-T Easyベクター（Promega, Madison, WI, USA）中にサブクローニングを行い、シーケンス分析により検証し、pGBK7とpGADT7の各ベクター中にサブクローニングした。
PCRに用いたプライマは以下の通りであった。
Di19については5'-GGATCCGAATTCATGGACGCTGATTCCAAG-3’（配列番号７９）と5'-GGATCCGAATTCGACTTCATCGAAAATGGC-3’ （配列番号８０）；
COについては5'-AGGATCCGTATGTTGAAACAAGAGAGTAAC-3’ （配列番号８１）と5'-AGGATCCTCAGAATGAAGGAACAATCCCAT-3’ （配列番号８２）；
COL1については5'-AGGATCCTTATGTTGAAAGTAGAGAGTAAC-3’ （配列番号８３）と5'-AGGATCCTCAGAATGATGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号８４）；
COL2については5'-AGGATCCGTGAGTACCTTGATCTTGTGGAT-3’ （配列番号８５）と5'-AGGATCCTTAGAAGGAAGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号８６）；
COL3については5'-AGGATCCGTGAAATCACTAATTTGTTTTCC-3’ （配列番号８７）と5'-AGGATCCTCAGAAACTCGGAACAACACCGA-3’ （配列番号８８）；
COL4については5'-AAGATCTGTTCAGCTGAGGAAGTTCCGGGA-3’ （配列番号８９）と5'-AAGATCTCTAAAATGTAGGTACAAGTCCGA-3’ （配列番号９０）；
COL5については5'-AGGATCCGTGGTTCTTCTGACTTTATGTTT-3’ （配列番号９１）と5'-AGGATCCTCAGAACGTTGGTACGACACCGT-3’ （配列番号９２）；
COL6については5'-ATGATCAGAGATCAAGATGAAGGTGATGAG-3’ （配列番号９３）と5'-AGAGCTCTTAGTGAGCAACACCAATTGAAG-3’ （配列番号９４）；
COL7については5'-AGGATCCGTAAGGAACCAAACGATGTTGGA-3’ （配列番号９５）と5'-AGGATCCTCACGTCAAAAGTGACGTCCTCT-3’ （配列番号９６）；
COL8については5'-AGGATCCGTTTGATGAGCTGCAAGAAAGAT-3’ （配列番号９７）と5'-AGGATCCCTAAGAGTCGATGGCTAAAGATC-3’ （配列番号９８）；
COL9については5'-AGGATCCGTATGTGTGAAGATGACTTCTAC-3’ （配列番号９９）と5'-AGAGCTCTCAATAACTTCTGGTTGGGGTGA-3’ （配列番号１００）；
COL10については5'-AGGATCCGTGTATGTGAGGATGACTTCAAT-3’ （配列番号１０１）と5'-AGGATCCTCAGTAGCTTCTTGTTGGGCTCA-3’ （配列番号１０２）；
COL13については5'-AGGATCCGTATCCGACAGCTCCGTGGACTA-3’ （配列番号１０３）と5'-AGGATCCTCATGGATCTGCTGCCTTGGCGA-5'（配列番号１０４）；
COL14については5'-AGGATCCGGACTAATCATAGCACTGGCCAG-3’ （配列番号１０５）と5'-AGGATCCCTAAGGATCTGTAGCTTTCACAA-3’ （配列番号１０６）；
COL15については5'-AGGATCCGTACTACTACTAATCCTAGTGGT-3’ （配列番号１０７）と5'-AGGATCCTTAAGGGTAAGGAGCTTCACTAG-3’ （配列番号１０８）；
COL16については5'-AGGATCCGTGATGATGATCGAAAAGACGTG-3’ （配列番号１０９）と5'-AGGATCCTCAGTAATTAACACCTAATGGTG-3’ （配列番号１１０）。
【００７０】
COL1欠失体を得るためには各コンストラクトをPCR増幅し、pGEM-T Easyベクター（Promega）中にサブクローニングを行い、シーケンス分析により検証し、2-ハイブリッドベクター中に連結した。
PCR用のフォワードプライマーは
5'-AGGATCCGTCCTAATTCAGGGAAAAACAGT-3’ （配列番号１１１）、
5'-AGGATCCGTTTTCTGAACCTTGTTGATTAT-3’ （配列番号１１２）、
5'-AGGATCCGTGGGGAAGATGGAGTTGTTCCA-3’ （配列番号１１３）、
5'-AGGATCCGTGCTCTTCGAAGCTCCAATGGT-3’ （配列番号１１４）、
5'-AGGATCCGTAGAGAAGCTAGAGTCCTGAGA-3’ （配列番号１１５）であり、
リバースプライマーは
5'-AGGATCCTCAGAATGATGGAACAATTCCAT-3’ （配列番号１１６）と
5'-AGGATCCCTTTGCAAACCGGCCCTTGATCC-3’ （配列番号１１７）であった。
【００７１】
CO欠失体を得るためには各コンストラクトをPCR増幅し、サブクローニングを行い、シーケンス分析し、2-ハイブリッドベクター中に連結した。
PCR用のフォワードプライマーは
5'-AGGATCCGTCTACCAATTTCTGGAAACTCT-3’ （配列番号１１８）、
5'-AGGATCCGTGAAGGTGAAGAAGGTGATAAG-3’ （配列番号１１９）、
5'-AGGATCCGTCCTAATTCAGACAAAAATAAC-3’ （配列番号１２０）、
5'-AGGATCCGTGAGTATCTAAACCTTGTGGAT-3’ （配列番号１２１）、
5'-AGGATCCGTTACGGGGGAGATAGAGTTGTT-3’ （配列番号１２２）、
5'-AGGATCCGTTCAGGGACTCACTACAACGAC-3’ （配列番号１２３）、
5'-AGGATCCGTGAGTATCTAAACCTTGTGGAT-3’ （配列番号１２４）、
5'-AGGATCCGTAGAGAAGCCAGGGTCCTGAGA-3’ （配列番号１２５）であり、
リバースプライマーは
5'-AGGATCCTCAGAATGAAGGAACAATCCCAA-3’ （配列番号１２６）、
5'-AGGATCCTATTGTCTTCTCAAATTTCCTTG-3’ （配列番号１２７）、
5'-AGGATCCGTCCATTGGACTGAGTTGTGTTA-3’ （配列番号１２８）、
5'-AGGATCCAGCTGTTGTGACACATGCTGTTG-3’ （配列番号１２９）、
5'-AGGATCCGCCATATTTGATATTGAACTGAA-3’ （配列番号１３０）、
5'-AGGATCCCGTCTGTGGTACGCTGCAGTTTT-3’ （配列番号１３１）、
5'-AGGATCCTCTCTTTGCGAACCGGCCATTGA-3’ （配列番号１３２）であった。
【００７２】
免疫ブロット分析
免疫ブロット分析のために、50mlのYPD（酵母抽出物/ペプトン/デキストロース）培地中で4-8時間にわたり酵母細胞を育成し（OD600=0.6）、遠心分離により沈殿させ、液体窒素中で凍結した。この沈殿を400μlの抽出緩衝液（40mM Tris-HCl、pH 6.8、8M 尿素、5% SDS、0.1mM EDTA、0.4mg ml-1ブロモフェノールブルー、0.8% 2-メルカプトエタノール、6.2μg ml-1 ペプシンA、1.86μM ロイペプチン、9.0mM ベンズアミジン、23.0μg ml-1 アプロチニン、0.77mg ml-1 フェニルメチルスルホニルフッ化物）中に再懸濁し、ホモジナイズした。細胞の粗抽出物（12μl）を各レーンに載せ、タンパク質の分離をSDS-PAGEにより行い、ナイロン膜上に電気的に転写した。タンパク質の検出は、抗cMycまたは抗血球凝集素抗体により行った。
【００７３】
ボンバードメント実験
全長のDi19 cDNAをBamHIで切断し、pB1221バイナリベクター（Clontech）において、CaMV 35Sプロモーターの調節下でGUS受容体遺伝子のフレーム内に融合させた。その結果得られたプラスミドDNAの1μgアリコートを、PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery System（BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA）を用いたボンバードメントにより、シロイヌナズナの葉柄に形質導入した。ボンバードメント処理された葉柄を12時間以上25℃条件下で維持し、その後顕微鏡観察によって形質転移成功の徴候を調べた。対照としてpB1221も同様に葉柄へボンバードメント処理した。GUS染色と4’,6-diamino-2-phenylindole（DAPl）観察は、既報どおり実施した（Yasuhara et al. 2004）。
CaMV 35S::CFP（pAVA574）とCaMV 35S::YFP（pAVA554）を保有するトランジェントな発現ベクターを用いて、同時ボンバードメント実験を行った（von Amim et al. 1998）。全長のLKP2、CO、COL1、Di19クローンをBamHIにより切り出し、T4 DNAポリメラーゼにより末端を埋め、pAVA574またはpAVA554の平滑化BglII部位に結合させてフレーム内融合遺伝子を形成し、これをシーケンス分析によって検証した。pU2B"-mRFPとpSCL28を、それぞれカハールボディならびに核スペックルのマーカーとして利用した（Lorkovie et al. 2004）。各プラスミドDNAの1μgアリコートを、ボンバードメントによりタマネギ表皮細胞内に導入した。CFP、YFP、RFPシグナルの検出は、CCDカメラRetiga Exi急冷型Mono12ビット（QimaginG, Burnaby, BC, Canada）と標準CFPまたはYFPフィルタ（Olympus）の付属したBX51顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）により行った。画像分析はMetaMprph Imaging Softwareバージョン6.1（Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA, USA）により行った。三次元デコンヴォリューション化画像の構築は、AutoDeblut/Auto Visualize（バージョン9.3）ソフトウェア（AutoQuant Imaging, New York, NY, USA）を用いて行った。
【００７４】
［結果］
酵母2-ハイブリッドスクリーニングによるDi19とCOL1の単離
酵母2-ハイブリッドスクリーニングを用いて、LKP2と相互作用するタンパク質を単離した。LKP2全長cDNAを保有するpGBKT7ベクターと、シロイヌナズナのロゼット葉から得たRNAを用いて調製したpGAD7ベクター中の2.5×105クローンcDNAライブラリを用いて、酵母細胞を同時形質転換した。220種類の候補クローンを選別したが、これには5mM 3-amino-1H-1,2,4-triazole（3-AT）を含有し、なおかつアデニン、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンを含まないSD培地における相補性を利用した。
二次スクリーニングでは候補クローンより得たプラスミドを単離し、再びpGBKT7-LKP2を用いて酵母細胞中に同時形質転換した。単離した220種類のプラスミドプールのうち、90種類が栄養要求性の相補性を示し、そのうち48種類のコロニーが5mM 3-AT存在下で生育可能であった。これらのコロニーのうち20種類が10mM 3-AT存在下で生育可能であり、14種類のコロニーが15mM 3-AT存在下で生育可能であった。
三次スクリーニングでは15mM 3-AT存在下で生育可能であった14種類のコロニーより得たpGADT7-cDNA単離物について、全てシーケンス解析を行った。
3段階のスクリーニングにより単離した同時形質転換済みのクローンはほとんどがrRNA、葉緑体または液胞タンパク質、ならびにフレーム外クローンであった。これはLKP2は主に細胞核内に存在すると考えられるため（Yasuhara et al. 2004）、葉緑体や液胞タンパク質のクローンは除外した。他のクローンはDnaJ様タンパク質、乾燥誘導性の未知タンパク質（異なるサイズのクローン2種類）、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼ、ジンク・フィンガータンパク質などであった。
四次スクリーニングでは酵母細胞に対して5種類のpGADT-cDNAプラスミドのうちそれぞれ1種類と、pGBKT7空ベクターを用いて同時形質転換を行った。その結果、pGBKT7-LKP2非存在下では2種類のクローンが2-ハイブリッド系を活性化した。そのため結果的に、乾燥誘導性の未知タンパク質であるDi19と、ジンク・フィンガータンパク質のCOL1がLKP2結合タンパク質である可能性が示された。
【００７５】
LKP2に対するDi19の相互作用とその細胞内局在
初めはDi19は乾燥誘導性cDNAクローンとして単離されたが（Gosti et al. 1995）、この遺伝子についてそれ以上の情報は存在しなかった。本実施例で得たDi19クローンはいずれも部分的であり、アミノ酸53-206または63-206より得られた切断ペプチドに対応していたので、ここでは全長Di19逆転写（RT）-PCR cDNAを用いて2-ハイブリッドアッセイを行った。全長Di19はLKP2や、LKP/ZTLタンパク質ファミリーの他のメンバーと相互作用した（図1１）。GAL4のDNA結合ドメインと活性化ドメインを交換した場合にもやはり相互作用が生じた（データ示さず）。40μmol m-2s-1条件で赤色光、遠赤外光、青色光、緑色光、白色光について2-ハイブリッド相互作用に対する光の影響は無かった（データ示さず）。
Di19の細胞内局在を可視化するため、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター誘導性βグルコシダーゼ（GUS）-Di19融合タンパク質コンストラクトとベクター対照をボンバードメント法によりシロイヌナズナ葉柄細胞内に導入した。Di19-GUS活性は核内に局在していたが（図１２の(A)、(B)）、ベクター対照GUS活性は何らかの細胞領域またはオルガネラに限定されていなかった（図１２の(C)）。従って細胞内Di19はLKP2と共在している（Yasuhara et al. 2004）。
【００７６】
LKP2に対するCO/COLファミリータンパク質の相互作用
COL1はCO/COL1ファミリータンパク質の一員であり、2個のB-box型ジンクフィンガーモチーフならびにCCTモチーフを保有している（Ledger et al. 2001）。このCCTモチーフは全てのCO/COLならびにPRR/TOC1ファミリータンパク質において保存されているが、CO/COLタンパク質には1個しかB-boxモチーフを保有しないものもある。酵母から単離したCOL1 cDNAは切断されているため、ここでは全長COL1 cDNAと一連の欠失体を用いて（図１３のA）、COL1とLKP2の分子的相互作用を調べた。全長COL1(1-355)はLKP2非存在下でレポーター遺伝子を活性化した。COL1のN末端欠失体(145-355)もやはりLKP2非存在下でこの系を活性化することが可能であった。しかしCOL1(163-355)とCOL1(195-355)はいずれもLKP2の存在に依存してレポーター遺伝子を活性化することが可能であった。COL1(195-355)は2-ハイブリッドスクリーニングで単離されたクローンに対応している。COL1(228-355)とCOL1(286-327)にはCCTモチーフを含む欠失があるが、いずれのタンパク質もレポーター遺伝子を活性化することができなかった。以上の結果からCOL1とLKP2の相互作用にはアミノ酸195-227を含むCOL1領域が必要であると考えられる。40μmol m-2s-1条件下の光に影響を受ける相互作用は存在しなかった（データ示さず）。
ここではまた、他のCO/COLファミリーメンバーに対するLKP/ZTLファミリーメンバーの2-ハイブリッド相互作用を調べた（図１３のB）。ジンクフィンガーモチーフを保有するCOL1の領域は、プレイ挿入無しでレポーター遺伝子を活性化するため、ここでは試験対象となる全てのCO/COLタンパク質からジンクフィンガーモチーフを除去した。CO/COLタンパク質に対するベクターpGBKT7またはpGADT7を用いてバックグラウンドの活性化レベルを低減させた。その結果COとCOL1-6、COL8とCOL13-15がLKP2と相互作用し、またLKP1/ZTLやFKF1と相互作用する事例も一部に存在した。Di19との相互作用と同じく、2-ハイブリッド相互作用に対する光の影響は観察できなかった（データ示さず）。
一連のN-末端ならびにC-末端欠失誘導体を用いて、COとLKP2の相互作用を調べた（図１３のC）。CO(1-373)ならびに一連のN-末端欠失変異体であるCO(106-373)、CO(140-373)、CO(157-373)は、LKP2非依存でレポーター遺伝子を活性化した。このアッセイではCO(175-373)、CO(208-373)、CO(241-373)は有意にLKP2と相互作用した。一連のC末端欠失変異体についてはCO(175-326)がLKP2と相互作用したが、CO(175-305)、CO(175-275)、CO(175-239)、CO(175-206)はLKP2非存在下で活性化を生じた。COL1 CCTにおいて観察された場合と同様に、CO(306-348)のCCTモチーフはLKP2と相互作用しなかった。
2-ハイブリッド系により、COまたはCOL1との相互作用に必要なLKP2のドメインを調べた（図１３のD）。F-boxまたはkelch反復の含有領域はCOに対する相互作用を生じる十分条件であったが、LOVドメイン含有領域はCOL1に対する相互作用を生じる必要十分条件であった。
【００７７】
COまたはCOL1存在下におけるLKP2の核小体形成
COは核内に局在することが報告されている（Robson et al. 2001）。COは転写因子タンパク質であり、核への分配化は転写活性のために重要であると考えられている（Robson et al. 2001）。LKP2もやはり核内に局在することが報告されている（Yasuhara et al. 2004）。これらのタンパク質が細胞内で同時に局在していることを調べるため、シアン蛍光タンパク質（CFP）-LKP2、黄色蛍光タンパク質（YFP）-COならびにYFP-COL1の融合体を構築した。
この蛍光検出系の信頼度を確認するため、ここではまずYFP-COを単独でボンバードメント法により導入し、CFPチャネルを介した画像を取得した。YFP-COタンパク質のYFPシグナルは曝露時間200msでYFPチャネルを介して検出された（第１８図のD）。しかし曝露時間700または1,500msであってもCFPチャネルを介したYFPシグナルは検出されなかった（第１８図のA、B）。曝露時間を4000msにした場合でも、CFPチャネルを介して検出されるYFPシグナルは非常に微弱であった（第１８図のC）。そのため今回の同時局在アッセイでは、曝露時間を1,000ms未満にするよう定めた。
それぞれの融合遺伝子はCaMV 35Sプロモーターの調節下におき、ボンバードメント法によってタマネギ表皮細胞中に導入した。YFP-COならびにYFP-COL1タンパク質は核内に局在し、これらがCFPと同時に発現する時点で核小体を形成していた（図１４のG、図１５のG）。CFP-LKP2はYFPと同時発現する時点で、核内と細胞質ゾル内に観察された（図１４のB、図１５のB）。CFP-LKP2と、YFP-COまたはYFP-COL1をボンバードメント法を用いて同時に導入した場合、CFP結合性蛍光の核-細胞質分配比は増加し、CFP-LKP2は核小体を形成した（図１４のJ、図１５のJ）。CFP-LKP2核小体の位置は、YFP-COまたはYFP-COL1の核小体と完全一致して発現していた（図１４のL、図１５のL）。CFP-LKP2とYFP-COの同時局在は、3次元画像による再現によっても確認された（図２１）。これらの同時局在パターンは、ここで試験したインキュベーション照明条件による影響を受けなかった（データ示さず）。
Di19についても同様に、タマネギ細胞内で同時発現させた時点でYFP-Di19とCFP-LKP2シグナルが同時局在していた。ここでは26個の細胞を調べた。21個の細胞内ではYFP-Di19シグナルは核内だけに検出されたが、CFP-LKP2シグナルは核内と細胞質ゾル内に検出された（図１９）。しかし調査対象の5個の細胞では、CFP-LKP2ならびにYFP-Di19シグナルはいずれも核小体内に局在していた（図２０）。
2種類のマーカーを採用することによって核小体の性質をさらに決定した。一つはカハールボディの分子マーカーであるU2B"［U2核内低分子リボ核タンパク質（snRNP）-特異的B"タンパク質］であり、もう一つはスプライシオソームのスペックルに対するマーカーのSCL28（Mr28のSC35様タンパク質）である（Lorkovic et al. 2004, Shaw and Brown 2004）。タマネギ細胞ではCFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFPのシグナルが同時局在していたが、SCL28-RFPシグナルはCFP-LKP2やYFP-COのシグナルと同時に存在していなかった（図１６）。
【００７８】
［考察］
今回の研究では、Di19ならびにCO/COLファミリータンパク質がFKF/LKP/ZTLタンパク質と相互作用する可能性のある因子であることを明らかにし、その特徴を調べた。Di19は最初に乾燥誘導性のクローンとして単離された（Gosti et al. 1995）。Di19遺伝子は進行性の乾燥途中でシロイヌナズナ植物の根と葉の両方に強く発現した。現在ではDi19ドメインを含む23種類のシーケンスがデータベースに登録されているが、Di19やDi19ドメインの正確な機能はいまだに不明である（Geer et al. 2002）。従ってLKPファミリータンパク質の相互作用がDi19に対して保有する生物学的な意味合いは不明であるが、ストレス反応における機能を示す可能性はある。
COL1タンパク質には、そのN末端に2個の付加ジンクフィンガーモチーフが、またC末端には塩基性領域のCCTモチーフがある（Putterill et al. 1995, Putterill et al. 1997）。CCTモチーフはCO、COL、PRR/TOC1ファミリータンパク質において保存されている（Robson et al. 2001）。ジンクフィンガー領域はB-boxに類似しているが、このB-boxは複数の動物性転写因子におけるタンパク質間相互作用を調節している（Bordon 1998, Torok and Elkin 2000）。COL1に関する遺伝子発現は概日時計により調節されており、その時間パターンはCCA1やLHYの場合に類似している（Schaffer et al. 1998, Wang and Tobin 1998）。シロイヌナズナでCOL1の異所性発現が生じることによってCAB2プロモーターの発現リズムが短縮することになり、フルエンス率に依存する概日リズム障害が現れるが、この事実からCOL1は光入力経路に影響を及ぼすと考えられる（Ledger et al. 2001）。COL1遺伝子発現が低減したアンチセンス植物には概日リズムに対する影響が現れないことから、COLファミリータンパク質には機能的な冗長性があると考えられる（Ledger et al. 2001）。LKP1/ZTLならびにLKP2はいずれもLOVドメインを保有する青色光受容体となり（Kiyosue and Wada 2000, Somers et al. 2000, Imaizumi et al. 2003）、また概日オシレータの非常に近傍で機能していることから（Schultz et al 2001, Somers et al. 2004）、COL1やその他のCOLファミリータンパク質のLKP1/ZTLならびにLKP2に対する相互作用は時計調節におけるこれらタンパク質の機能を反映している可能性がある。
COはシロイヌナズナの光周期経路において開花に関与する重要な調節因子である。光存在下での植物中COレベルは開花期を決定する重要因子であると考えられている（Schultz and Kay 2003, Yanovsky and Kay 2003）。長日型光周期（LD）条件下での開花遅延表現形からCO欠損変異体が単離され、その生物学的機能の特徴が遺伝子的に調べられている（Putterill et al. 1995, Kobayashi et al. 1999, Onouchi et al. 2000, Samach et al. 2000, Robson et al. 2001, Suarez-Lopez et al. 2001）。COタンパク質レベルについてはその転写調節だけでなく、タンパク質分解などの転写後メカニズムによっても調査を行った（Valverde et al. 2004）。LKP2-OX植物はLD条件下で開花遅延表現形を示すため、FKF/LKP/ZTLファミリータンパク質がCO分解に関与していたとしても意外ではないと思われる。実際にCOタンパク質がユビキチン-プロテアソーム系により分解されることが示されている（Valverde et al. 2004）。COとCOL1のアミノ酸シーケンスは全体的によく類似しているため（64.2%の同一性）、COLタンパク質と同様にLKPファミリータンパク質がCOを認識することは合理的といえるだろう。
CCTドメインはCO/COLならびにPRR/TOC1ファミリータンパク質の核内局在に関与していると思われるが（Makino et al. 2000, Strayer et al. 2000, Robson et al. 2001）、その他の役割もある。co-7変異体には、CCTドメインのR340Qに単一のアミノ酸変異がある。このco-7変異体は開花遅延を示すが、それにもかかわらず緑色蛍光タンパク質（GFP）-co-7融合タンパク質はタマネギ細胞の核内に正しく局在することが示されている（Robson et al. 2001）。LKP2はPRR/TOC1ならびにPRR5と相互作用し（Yasuhara et al. 2004）、COやCOL1とも相互作用することから（図１３のB）、CCTモチーフがこれらの相互作用を調節していると考えられる。しかしCCTモチーフはLKP2結合の十分条件ではない。COならびにCOL1に対するLKP2相互作用部位は明らかにCCTモチーフに隣接したN末端領域に位置している。COに対するLKP2の結合部位は、COL1に対する部位とは異なっていた（図１３のD）。この相互作用部位の違いは、これらのタンパク質の一次構造に見られる違いに起因する可能性があるが、その理由は保存領域であるCCTモチーフやB-boxと比較した場合にCOならびにCOL1に対する結合部位の類似性が比較的少ないためである。
GFP-LKP2融合タンパク質を過剰発現するシロイヌナズナ植物は開花遅延と胚軸の伸張を示し（Yasuhara et al. 2004）、これはLKP2過剰発現植物においても観察されることから（Schultz et al. 2001）、GFPはLKP2の機能に影響しないと考えられる。CFPはGFPの誘導体でありわずか数個のアミノ酸しか変更されていないことから、CFP-LKP2融合タンパク質もやはり生物学的活性を有すると考えられる。今回CFPに対する融合タンパク質としてLKP2を発現させた場合のタマネギ細胞内におけるCFP-LKP2局在は、遺伝子組み換えを行ったシロイヌナズナ植物におけるCFP-LKP2に完全には一致しなかった。タマネギ細胞内でのGFP-LKP2シグナルは細胞質ゾルと核の両方に局在しており、これは未処理CFPの蛍光に類似したパターンであったが（図１４、１５）、シロイヌナズナにおけるGFP-LKP2シグナルについては、核内には見られたが核小体には観察されていない（Yasuhara et al. 2004）。この不一致性はおそらくタンパク質融合体を発現する細胞の相互差異によるものだろう。シロイヌナズナ細胞はある種の付加因子を保有しており、それによってLKP2が核内に保持され、またLKP2が核小体に輸送されるという可能性もある。今回得られた同時発現の結果によれば前者の可能性が支持される。
COに対するGFPの融合体は生物学的活性を保持している。GFP-COの過剰発現はco-2変異を補完し、CO-過剰発現性植物と同様に植物は早期開花した（Robson et al. 2001）。シロイヌナズナならびにタマネギ細胞の両者において、融合タンパク質は核小体内部に局在した（Robson et al. 2001）。YFPもやはりGFPの誘導体であることから、YFP-CO融合タンパク質も同様に生物学的活性を有すると考えられる。現時点でGFP-またはYFP-COL1の生物学的活性に関する報告は発表されていない。COとCOL1の全体的な一次構造が類似しているため、COL1融合体もやはり生物学的活性を有する可能性がある。
CFP-LKP2はYFP-COまたはYFP-COL1と同時発現した場合に限り核小体を形成するが（図１４のJ、図１５のJ）、そのためにLKP2がCOならびにCOL1に対して相互作用するという可能性が支持される。いくつかの核構造やドメインが報告されている（Shaw and Brown 2004）。「スペックル」は核ドメインであり、スプライシング因子と小型RNP粒子が局在する場所である（Misteli 2000, Lamond and Spector 2003）。フィトクロムは光シグナルを受け取った場合に核内に蓄積してスペックル様構造を形成するが、この構造の生物学的機能はやはり未知である（Yamaguchi et al. 1999, Nagatani 2000, Kircher et al. 2002）。YFP-TOC1は特有のスペックル化パターンで核内分布していたが、このことはTOC1がトランスクリプトソーム、スプライシオソーム、またはプロテアソーム内で機能していることを示している（Strayer et al. 2000）。これらの可能性の中でも核小体中におけるプロテアソームの局在化は非常に魅力的であるが、その理由はLKP2がTOC1と相互作用することが可能なF-boxタンパク質であることである（Yasuhara et al. 2004）。しかし私たちはYFP-COまたはYFP-COL1について白色光または遮光条件下にてそれらをCFP-LKP2と同時発現させたが、それらに関連するシグナルの減少を観察することは無かった（データ示さず）。
本実施例でのボンバードメント法による同時形質導入の結果から、LKP2とCOはカハールボディに局在している可能性が考えられた。カハールボディは植物細胞内に存在する大きさ0.2-2.0μmの球形構造であり、しばしば核小体に結合している。カハールボディの機能は不明であるが、実験によってトランスクリプトソームの集合、snRNP集合、スプライシオソームのsnRNAの修飾、核小体内部におけるrRNA修飾に関与するsnRNPの輸送などについて機能しているという証拠が集積されている（Ogg and Lamond 2002, Gall 2000, Gall 2003, Lorkovie and Barta 2004）。
さらに調査を行い、LKP2がF-boxタンパク質としてDi19、CO、またはCOLタンパク質の修飾について機能しているのかどうかについて調べ、また核小体内部でLKP2を移転させるメカニズムを調べる必要がある。
【００７９】
［謝辞］
pAVA574とpAVA554のトランジェント発現ベクターを提供頂いたDr. von Amim、U2B"-mRFPとpSCL28-RFPを含むプラスミドを提供頂いたDr. Z. J. Lorkovic、技術的補助を受けたKayo Sato、Akihiro Komatsu、Shingo Takagi、ならびにcDNAクローンを提供頂いた理研BRCに感謝します。本研究の一部はT.K.に対する新技術・新分野創出のための基礎的研究推進事業（PROBRAIN）、日本文部科学省の科学研究補助金、東レ科学振興財団の補助金による援助を受けている。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の主要なデータである光による相互作用のオン／オフ（遺伝子発現のオン／オフ）には光の質と強さが影響を与えているので、分子生物学実験キット、酵母内での遺伝子発現制御などの分野で実用化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】遺伝子組み換えシロイヌナズナにおけるGUS活性の組織化学的局在化。（A）GUS活性は6日齢の苗木、（B）14日齢のロゼット植物、（C）花、（D）若い長角果、（E）47日齢植物の古い長角果。バーはA、C-Eでは1mm、Bでは5mmである。
【図２】GFP-LKP2融合タンパク質の細胞内局在。35S::GFP T3植物（A、B）と35S::GFP-LKP2 T3植物（C-G）の根を、25μg mL-1カナマイシンを含むGM寒天培地上、16時間光照射/8時間暗闇のサイクルで成長させ、これを光学顕微鏡（A、C、E）、蛍光顕微鏡（B、D、G）、共焦点レーザ操作顕微鏡（H）を用いて観察した。35S::GFP-LKP2 T3植物を4',6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）で染色し、蛍光顕微鏡（F）で観察した。バーはA-Dでは100μm、E-Hでは10μmである。
【図３】シロイヌナズナSkp1オーソログ（ASKs）とLKPファミリータンパク質の間の酵母2-ハイブリッド相互作用。 （A）ASKs（ASK1-5、ASK7-14、ASK16-19、ASK20a、ASK20b）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（上）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（下）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B-D）LKP1、LKP2、FKF1のF-box領域を用いて2-ハイブリッド相互作用試験を行った。
【図４】LKPファミリータンパク質間の2-ハイブリッド相互作用。 （A）LKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体およびGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図５】LKPファミリータンパク質に対する時計関連因子の相互作用。 （A）時計関連因子（TOC1、CCA1、LHY）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図６】LKP2ドメインに対するTOC1の相互作用。 TOC1のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。
【図７】酵母でのLKPファミリータンパク質に対するAPRR/TOC1ファミリータンパク質の相互作用。 （A）APRR/TOC1ファミリータンパク質（TOC1、APRR3、APRR5、APRR7、APRR9）のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKPファミリータンパク質（LKP1、LKP2、FKF1）のGAL4活性化ドメイン融合体またはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、酵母AH109の単一コロニー。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図８】LKP2ドメインに対するAPRR5の相互作用。 （A）APRR5のGAL4 DNA結合ドメイン融合体またはGAL4 DNA結合ドメイン発現ベクターpGBKT7（「Vector」）、ならびにLKP2ドメインまたはGAL4活性化ドメイン発現ベクターpGADT7（「Vector」）を含み、SD-Leu, Trp（SD-LW）（左）またはSD-Ade, His, Leu, Trp（SD-AHLW）寒天培地（右）上で生育した、AH109の単一コロニー。L：LOVドメイン；F：F-box；K：ケルヒ繰り返し領域；LF：LOVドメイン+F-box；LK：LOVドメイン+ケルヒ繰り返し領域；FK：F-box+ケルヒ繰り返し領域。 （B）Miller単位で測定した液体培地中のβ-ガラクトシダーゼ活性。
【図９】各種光条件下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用。
【図１０】各種光強度の青色光下におけるLKP1、LKP2変異体とTOC1/APRR1、APRR5との相互作用。
【図１１】酵母2-ハイブリッド系におけるAtDi19とFKF/LKP/ZTLファミリータンパク質の相互作用。
【図１２】ボンバードメント処理を行ったシロイヌナズナ葉柄細胞におけるGUS活性の組織化学的な局在。 Di19-GUSの核内局在（A）、ならびに空ベクターpBI221を用いてボンバードメント処理したGUS対照の全体的な細胞質染色(C)。DAPI染色は細胞核を示す（B）。スケールバー=0.05mm。
【図１３】CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用。 （A）COL1欠失体のLKP2に対する相互作用。 （B）CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する相互作用。 （C）CO欠失体のLKP2に対する相互作用。 （D）COまたはCOL1に対するLKP2の相互作用ドメイン。
【図１４】CFP-LKP2とYFP-COの細胞内局在。 タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-CO（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１５】CFP-LKP2とYFP-COL1の細胞内局在。 タマネギ表皮細胞の微分干渉（DIC）顕微鏡（A、E、I）、CFP-（B、F、J）ならびにYFP-関連（C、G、K）画像。CFP（F）、YFP（C）、CFP-LKP2（B、J）、YFP-COL1（G、K）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）、I-K（L）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１６】CFP-LKP2、YFP-CO、U2B"-mRFP、SCL28-RFPの核内局在。 CPP（A、E）、YFP（B、F）、RFP（C、G）に相当するシグナル。A-C（D）、E-G（H）のオーバーレイ像。スケールバーは0.1mmを示す。
【図１７】CO/COLファミリータンパク質のLKPファミリータンパク質に対する酵母2-ハイブリッド相互作用のイムノクロマトグラフィーによる検出。 A、B 酵母細胞内におけるLKP1/ZTL、LKP2、FKF1に融合したGAL4 DNA結合ドメイン、あるいはDi19に融合したGAL4活性化ドメインの確認（抗cMyc抗体または抗血液凝集素抗体をそれぞれ用いたイムノブロット）。 A、C アミノ酸145-355、163-355、195-355、228-355、または286-327に対応するCOL1に融合されたGAL4 DNA結合ドメイン、またはLKP2に融合されたGAL4活性化ドメインの発現。 A、D、E 2-ハイブリッドスポットアッセイにおけるGAL4 DNA結合ドメインまたはGAL4活性化ドメイン融合体の発現。 F 175-373、208-373、241-373、175-326、306-348に対応するCOに融合されたGAL4 DNA結合ドメインの発現。 G LKP2ドメインに融合されたGAL4活性化ドメインの発現。
【図１８】蛍光検出系の信頼度を確認するため、YFP-CO単独でボンバードメント法により導入し取得したCFPチャネルを介した画像。
【図１９】YFP-Di19シグナルは核内だけに検出されたが、CFP-LKP2シグナルは核内と細胞質ゾル内に検出された21個の細胞内を示す画像。
【図２０】CFP-LKP2ならびにYFP-Di19シグナルがいずれも核小体内に局在していた５個の細胞内を示す画像。
【図２１】CFP-LKP2とYFP-COの同時局在の3次元画像。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
青色光による遺伝子の発現制御に、LKP1、LKP2、変異型LKP1および／または変異型LKP2を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する請求項１の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
相互作用因子がTOC1および／またはAPRR５および／またはDi19および／またはCOおよび／またはCOLである請求項２の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
LKP2のＦ-box領域と、ASKとの相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する請求項１の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項５】
導入されたLKP1遺伝子、LKP2遺伝子、変異型LKP1遺伝子および／または変異型LKP2遺伝子の転写がオン／オフされる請求項１ないし４のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
LKP2遺伝子が、植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン及びケルヒ繰返しを有するLKP2遺伝子が連結されている発現ベクターにより導入された遺伝子である請求項５の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている遺伝子である請求項６の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項８】
LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いることを特徴とする請求項６または７の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法を用いることを特徴とする青色光による植物の生育制御方法。
【請求項１０】
植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するLKP2遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。
【請求項１１】
LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている請求項１０の合成遺伝子。
【請求項１２】
LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いる請求項１０または１１の合成遺伝子。
【請求項１３】
生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする請求項１０、１１または１２の合成遺伝子の使用。
【請求項１４】
生物が植物であるの請求項１３の使用。
【請求項１５】
生物が酵母であるの請求項１３の使用。
【請求項１６】
生物が動物であるの請求項１３の使用。
【請求項１７】
請求項１０、１１または１２の合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【請求項１】
青色光による遺伝子の発現制御に、LKP1、LKP2、変異型LKP1および／または変異型LKP2を用いることを特徴とする青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項２】
LKP1、LKP2のLOVドメインと相互作用因子とのタンパク質相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する請求項１の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項３】
相互作用因子がTOC1および／またはAPRR５および／またはDi19および／またはCOおよび／またはCOLである請求項２の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項４】
LKP2のＦ-box領域と、ASKとの相互作用が青色光に依存してオン／オフされる青色光スイッチを利用する請求項１の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項５】
導入されたLKP1遺伝子、LKP2遺伝子、変異型LKP1遺伝子および／または変異型LKP2遺伝子の転写がオン／オフされる請求項１ないし４のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項６】
LKP2遺伝子が、植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン及びケルヒ繰返しを有するLKP2遺伝子が連結されている発現ベクターにより導入された遺伝子である請求項５の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項７】
LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている遺伝子である請求項６の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項８】
LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いることを特徴とする請求項６または７の青色光による遺伝子発現制御方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれかの青色光による遺伝子発現制御方法を用いることを特徴とする青色光による植物の生育制御方法。
【請求項１０】
植物ウイルス由来のプロモータの下流に、LKP2のプロモータを介してLOVドメイン、F-boxおよびケルヒ繰り返しを有するLKP2遺伝子が発現ベクターに連結されている青色光による遺伝子発現制御に用いるための合成遺伝子。
【請求項１１】
LKP2のプロモータの下流に、β−グルクロニダーゼ遺伝子を介して、LKP2遺伝子が連結されている請求項１０の合成遺伝子。
【請求項１２】
LKP2のプロモータのプロモータとして、LKP2の１．６ｋｂの５′非コーディング領域を用いる請求項１０または１１の合成遺伝子。
【請求項１３】
生物の細胞、組織、もしくは器官または生物全体に対し、青色光による遺伝子転写のオン／オフによる遺伝子発現制御のためにする請求項１０、１１または１２の合成遺伝子の使用。
【請求項１４】
生物が植物であるの請求項１３の使用。
【請求項１５】
生物が酵母であるの請求項１３の使用。
【請求項１６】
生物が動物であるの請求項１３の使用。
【請求項１７】
請求項１０、１１または１２の合成遺伝子を含む細胞、組織、器官または生物全体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００７−７５０１９（Ｐ２００７−７５０１９Ａ）
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２６７７７２（Ｐ２００５−２６７７７２）
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年６月４日 インターネットアドレス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）にて発表
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００５年６月４日 インターネットアドレス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／）にて発表
【出願人】（３０４０２８３４６）国立大学法人 香川大学 (285)
【Ｆターム（参考）】
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