食品成分抽出液
【課題】 食品中のアレルゲンなどの蛋白質を測定する際に好適に使用される食品成分抽出液を提供する。
【解決手段】 本発明の食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなる抽出液である。本発明の抽出液によれば、食品中の未変性蛋白質は勿論のこと、強く加熱変性され難溶化した蛋白質を可溶化し、抽出することが可能となり、加工食品中のアレルゲンなどの蛋白質を見落とす危険性が著しく低減し、食物アレルギーを防止することができるという格別の効果を奏する。
【解決手段】 本発明の食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなる抽出液である。本発明の抽出液によれば、食品中の未変性蛋白質は勿論のこと、強く加熱変性され難溶化した蛋白質を可溶化し、抽出することが可能となり、加工食品中のアレルゲンなどの蛋白質を見落とす危険性が著しく低減し、食物アレルギーを防止することができるという格別の効果を奏する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品成分抽出液に関する。より詳細には、食品中のアレルゲンなどの蛋白質を測定する際に好適に使用される抽出液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物でアレルギーを発症する、所謂、食物アレルギーの患者が低年齢層を中心に増加してきている。食物アレルギーの症状は、皮膚の痒みや炎症を生じるアトピーや、ショック症状となり死に至るアナフィラキシーショック等、多岐にわたり危険性も高い。そこで、食品衛生法により、患者数の多い小麦・卵・乳、及び症状が重篤なそば・落花生については特定原材料として原材料表示が義務づけられた。そして、更に、上記の表記が義務づけられた５品目に次いで、食物アレルギーの原因食物となる可能性が高いとされた１９品目（あわび、いか、いくら、えび、オレンジ、かに、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏肉、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン）を特定原材料に準ずるものとして表示を推奨することとされた。
従って、特に表示が義務づけられた特定原材料について、その表示を検証する測定キットが必要となる。
係る問題点から、本願出願人は、特定原材料とされた食物に含まれる蛋白質全般を高感度で測定しうる測定キットの発明をなし、この発明をもとに定量性のあるエンザイムイムノアッセイ法（エライザ法）による特定原材料測定キットを作製した。
【特許文献１】特開２００３−１５５２９７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の特定原材料測定方法では、検体食品からの抽出液にリン酸バッファーやトリスバッファー等の蛋白質の可溶化、特にＳ−Ｓ結合を有する加熱変性した蛋白質の可溶化を促さない緩やかな抽出液を使用しており、加工食品からの蛋白質の抽出効率、特に強く加熱変性され難溶化した蛋白質の抽出効率は高くなく、加工食品中の特定原材料を見落とす危険性があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、本発明者らは、加工食品からの特定原材料由来の蛋白質の抽出方法をより強力なものとするために鋭意努力し、従来のように蛋白質を可溶化させずに抽出するのではなく、より強く可溶化、特にＳ−Ｓ結合を有する加熱変性した蛋白質を可溶化させた状態で抽出することで、加熱変性などで難溶化した蛋白質の強度な構造を溶解することが可能となり、抽出効率を上げることが出来ることを想起し、抽出液に蛋白構造を変化させる還元剤、及び界面活性剤、尿素等などからなる可溶化剤を含有させることにより、変性及び／又は未変性の蛋白質を従来より高い効率で抽出することが可能となることを見出した。
即ち、本発明に係る食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなり、特に還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを使用し、可溶化剤としてドデシル硫酸塩及び／又は尿素を使用するのが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の食品成分抽出液によれば、還元剤及び可溶化剤を含有するので、食品中の未変性蛋白質は勿論のこと、強く加熱変性され難溶化した蛋白質を可溶化し、抽出することが可能となり、加工食品中の特定原材料を見落とす危険性が著しく低減するという格別の効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は前述の構成からなり、本発明の食品成分抽出液は、還元剤と可溶化剤を含有することからなる。
上記の還元剤としては、食品成分検出に使用される方法に悪影響を与えない還元剤であれば何れの還元剤も使用し得るが、好ましくは２−メルカプトエタノール（2-Mercaptoethanol、以下２−ＭＥという）、ジチオスレイトール（Dithiothreitol、以下ＤＴＴという）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine、以下ＴＣＥＰという）などが使用され、これらの還元剤は２種以上を併用してもよい。
これらの還元剤のうち、２−ＭＥは異臭を有し毒性や引火性がある危険物であり、食品工場等の現場では使用しづらいため、望ましくは異臭、毒性及び引火性がなく危険物でないＤＴＴやＴＣＥＰが使用され、より望ましくは、異臭がより少なく、より還元性の高いＴＣＥＰが使用される。
還元剤の使用量は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する還元剤種などにより適宜調整することができる。例えば、検体の２０倍の抽出液を使用する場合（即ち、検体１ｇに対して１９ｍｌの抽出液を使用する場合等）は、抽出液において、還元剤として２−MEを使用した場合に、通常０．１〜７w/v%（以下、％は特に限定のない限り、w/v%であり、vは抽出液の容量である）、好ましくは０.２〜２％、より好ましくは０.３〜０.７％程度に調整される。DTTを使用した場合には、通常５〜３５ｍM、好ましくは１０〜３０ｍM、より好ましくは１５〜２５ｍM程度に調整される。TCEPを使用した場合には、通常１〜２０ｍM、好ましくは５〜１５ｍM、より好ましくは８〜１２ｍM程度に調整される。
還元剤が、上記範囲の下限未満であると、変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると臭気などで作業性が劣るおそれがある。
【０００７】
また、可溶化剤としては慣用の可溶化剤を使用することができ、例えばアルキル硫酸塩、尿素などが例示でき、係る可溶化剤は２種以上を併用してもよい。アルキル硫酸塩のアルキル基としては、蛋白質の可溶化作用を有する限り特に限定されないが、例えばオクチル、ノニル、デシル、ドデシルなどが例示される。また、塩としては水溶性塩であれば特に限定されず、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが例示される。もっとも好ましいアルキル硫酸塩としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSという）が挙げられる。
可溶化剤の使用量は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する可溶化剤種などにより適宜調整することができる。例えば、SDSを使用した場合には、通常０.１〜１.５％、好ましくは０.２〜１.０％、より好ましくは０．３〜０.６％程度に調整される。また尿素を使用した場合には、通常１〜１０ｍM、好ましくは２〜７ｍM、より好ましくは３〜５ｍM程度に調整される。
可溶化剤が、上記の範囲の下限未満であるときは蛋白質の可溶化が不足して変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると泡立ちなどで作業性が劣るおそれがある。
【０００８】
本発明の抽出液は水性媒体に、上記の還元剤及び可溶化剤を所定量溶解することにより調製することができる。水性媒体としては、例えば、水、緩衝液、食塩水などを例示することができる。緩衝液としては、慣用の緩衝液を使用することができ、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示することができる。
液性としては、蛋白質の抽出効率などを勘案して適宜調整することができるが、通常ｐH６〜８程度に調整される。
【０００９】
本発明の抽出液は、従来の抽出液と同様にして使用することができる。即ち、検体である食品に、本発明の抽出液を加え、攪拌などの適宜な方法で食品を分散させることにより、食品中の蛋白質を抽出する。
操作温度は通常室温程度で行われるが、加熱変性が著しい場合には加温（４０℃程度）又は加熱（８０〜１００℃程度）してもよい。操作時間は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する還元剤種及び可溶化剤種、操作温度などにより適宜調整し得るが、１０分〜２４時間程度で行うことができる。
なお、過度の操作条件を使用すると、蛋白質そのものがバラバラとなり、蛋白質がアミノ酸レベルに分解されるおそれがあり、由来蛋白質を特定することが困難になるので、係る問題点を生じない条件とすることが好ましい。
本発明の抽出液で抽出した液は、従来の蛋白質測定方法に適用することにより蛋白質含量の測定などに使用することができる。
【００１０】
また、本発明の抽出液で抽出した液には、食品中の未変性アレルゲンなどの蛋白質の他に変性したアレルゲンなどの蛋白質が含まれる。抽出した変性、未変性の蛋白質を抗原として抗体を産生することにより、より力価(titer)の高い抗体が得られるので、従来では得られなかった高い精度でアレルゲンなどの物質を測定することが可能となる。即ち、従来の抽出液では、過度に変性した蛋白質は抽出され得ないので、係る蛋白質に対する抗体を調製することができず、係る蛋白質を含有する食品をアレルゲン含有食品として判定することができなかった。しかし、本発明の抽出液では、係る変性蛋白質も抽出することができるので、変性蛋白質を含有する食品であっても検出できるという利点を有する。
上記の抽出液を使用した抗体の調製は常法に準じて行えばよい。
【実施例】
【００１１】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００１２】
実施例１
加工食品への抽出操作により、蛋白質がどれだけ抽出されたのかを検定した。試験の抽出操作は、以下のように行われた。
測定対象となるハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして蛋白質含有測定キット（2-D Quant Kit: Amersham Biosciences社製）で手順に従い、最終的には480nmの吸光度を読み、同時に準備した標準曲線をもとに抽出蛋白質の量を求めた。
尚、蛋白定量法としてＲＣ.DC.ProteinAssay(Bio-Rad社製)を使用した場合も同様の傾向であった。
【００１３】
実施例2
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例3
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例4
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１４】
実施例5
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例6
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例7
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１５】
実施例8
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例9
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１０
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１６】
実施例１１
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１２
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１３
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例1
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１７】
上記の結果を表１に示す。表１に示されるように、従来の抽出液である比較例１では、蛋白質の抽出量が0.13mg/mlと低かった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で１０〜６０倍程度高い抽出量が得られていることがわかる。
【００１８】
【００１９】
実施例１４
(1)抗体の調製
本抽出液を用いてのエライザ法での特定原材料蛋白質の定量に先立ち、まず本抽出法で抽出された変性蛋白質にも反応できる抗体を準備した。
この抗体の作製に使用する蛋白質抗原の準備は以下のように行われた。測定対象の食品1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
上記で得られた、抽出液を抗原としてウサギ又はマウスに、抗体を得る常法に従い免疫し、特定原材料由来蛋白質検出に用いる抗体を得、エライザ法による定量に使用した。
【００２０】
(2)特定原材料由来蛋白質の抽出
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。その具体的抽出操作は、以下のように行った。
添加回収試験はハードビスケットで行った。具体的には、小麦粉１３０ｇ、水１０ｇ、砂糖５０ｇ、サラダ油７０ｇに、一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質（卵：最終製品濃度10ppm）を添加し、１８０℃１２分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして、エライザ法による測定に使用した。
【００２１】
(3) エライザ法による特定原材料由来蛋白質の測定
卵蛋白質検出用エライザのプレートを準備するために、卵抗体(10μg/ml)の100μl をエライザプレート(Nunc 社製)に分注し、４℃で一晩コーティングし、洗浄液(150mM NaCl と0.05％Tween20 加20mM トリス塩酸緩衝液、pH7.4)で洗浄し、ブロッキング溶液（0.1％RSA(シグマ社製)加トリス塩酸緩衝液、pH7.4）で２５℃１時間ブロッキングした。
係るプレートに、試料として上記抽出液ならびに同様の抽出操作を施した標準液（0ng/ml〜50ng/ml）を各ウェルに100μｌずつ加え、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で１時間静置し反応させた。
反応後、上記で添加した液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、洗浄を行った。次いで、各ウェルにビオチン結合抗体液（抗卵抗体をビオチン化したもの）を、各ウェル100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で１時間静置し反応させた。反応後、ビオチン結合抗体液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、洗浄を行った。
各ウェルに、発色酵素（ペルオキシダーゼ）−ストレプトアビジン結合物（ペルオキシダーゼをストレプトアビジンと結合させたもの）溶液を、各ウェルに100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で、３０分間静置し反応させた。反応終了後、発色酵素−ストレプトアビジン結合物溶液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、同様に洗浄を行った。各ウェルに発色基質としてのTMBを100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で２０分間静置し遮光条件下で発色させた。各ウェルに反応停止液(1M H2SO4)を100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し発色を停止した。攪拌後プレートリーダーで、測定波長450nm の吸光度を測定した。
なお、検量線（吸光度と卵濃度の関係）を得るために、段階希釈により準備した数段階の卵蛋白質希釈液を同じプレートにて同時期に添加反応させ、吸光度を測定した。この検量線と試料の吸光度測定で得られた値より試料中の卵濃度（ｐｐｍ）を決定し、最初の添加量に対する回収％を求めた。
【００２２】
実施例15
実施例14において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例16
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例17
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２３】
実施例18
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例19
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例20
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２４】
実施例21
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例22
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例23
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２５】
実施例24
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例25
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例26
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例2
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２６】
上記の結果を表２に示す。表２の添加回収試験の結果に示されるより、従来の抽出液である比較例２では、回収率が３％と低かった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で１０〜３３倍程度の高い回収率が得られていることが明らかとなった。
【００２７】
【００２８】
また、実施例１４〜２６及び比較例２と同様に牛乳やそばや落花生を用いてそれぞれの添加物質量を測定するエライザ法で添加回収試験を行った場合も同様の結果を得た。
なお、卵検出用エライザ法に代えて、下記の蛋白質検出キットを使用した場合の発色酵素、発色基質、反応停止液、測定波長は以下の通りであった。
牛乳：（発色酵素としてホースラディッシュペルオキシダーゼ、発色基質としてＴＭＢを使用、反応停止液として1M H2SO4を使用、測定波長450nm）
落花生・そば：（発色酵素としてアルカリフォスファターゼ、発色基質としてｐＮＰＰを使用、反応停止液として1M ＮａＯＨを使用、測定波長405nm）
【００２９】
また、従来の還元剤等を含まない抽出液を用いて抽出した液（抗原）で免疫して得た抗体を使用し、還元剤を含有する本発明の抽出液で抽出したサンプルに対してエライザ法を行った場合は殆ど検出感度以下であった。
【００３０】
実施例27
ウェスタンブロット法による定性試験を行い、各抽出液による対象蛋白質の各バンドの有無を目視により調べた。
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。具体的抽出操作は、前記エライザ法と同様に以下のように行った。
即ち、小麦粉１３０ｇ、水１０ｇ、砂糖５０ｇ、サラダ油７０ｇに一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質（卵：最終製品濃度10ppm）を添加し、１８０℃１２分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。操作温度は室温程度とした。
【００３１】
ウェスタンブロットの方法は、常法に従ったが、簡略に述べれば以下の通りである。抽出サンプル及びマーカーをSDS-PAGEゲルの各々のレーンに載せ電気泳動後、泳動蛋白質をＰＶＤＦの膜に湿式の転写装置で転写した。この後、フィルターを軽く振とうさせ洗浄液で洗浄後、ブロッキング液と振とうさせてコーティングさせて、次いで、このフィルターに上記のエライザ法で用いた抗体と緩やかに振とうさせつつ室温で反応させた。更に洗浄後、抗ＩｇＧビオチン化抗体を２次抗体として反応させた。次いで更に、洗浄後、酵素―アビジン複合体を同様に反応させ、発色基質を最後に加えて発色させ各レーンにおける対象蛋白質（オボアルブミン及びオボムコイド）のバンドの有無を調べた。
なお、牛乳を測定対象にした添加回収試験も同様に行い各レーンにおける対象蛋白質（カゼイン及びベーターラクトグロブリン）のバンドの有無を調べ同様の結果を得た。
【００３２】
実施例28
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例29
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例30
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３３】
実施例31
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例32
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例33
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３４】
実施例34
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例35
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例36
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３５】
実施例37
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例38
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例39
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例3
実施例24において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３６】
上記の結果を表３に示す。表３の添加回収試験の結果に示されるように、従来の抽出液である比較例３では、対象バンドを認識できず卵含有製品を見逃す可能性があった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で高い回収率が得られ対象バンドが認識でき、卵含有製品を見逃す可能性が無くなったことがわかる。
【００３７】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品成分抽出液に関する。より詳細には、食品中のアレルゲンなどの蛋白質を測定する際に好適に使用される抽出液に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食物でアレルギーを発症する、所謂、食物アレルギーの患者が低年齢層を中心に増加してきている。食物アレルギーの症状は、皮膚の痒みや炎症を生じるアトピーや、ショック症状となり死に至るアナフィラキシーショック等、多岐にわたり危険性も高い。そこで、食品衛生法により、患者数の多い小麦・卵・乳、及び症状が重篤なそば・落花生については特定原材料として原材料表示が義務づけられた。そして、更に、上記の表記が義務づけられた５品目に次いで、食物アレルギーの原因食物となる可能性が高いとされた１９品目（あわび、いか、いくら、えび、オレンジ、かに、キウイフルーツ、牛肉、くるみ、さけ、さば、大豆、鶏肉、豚肉、まつたけ、もも、やまいも、りんご、ゼラチン）を特定原材料に準ずるものとして表示を推奨することとされた。
従って、特に表示が義務づけられた特定原材料について、その表示を検証する測定キットが必要となる。
係る問題点から、本願出願人は、特定原材料とされた食物に含まれる蛋白質全般を高感度で測定しうる測定キットの発明をなし、この発明をもとに定量性のあるエンザイムイムノアッセイ法（エライザ法）による特定原材料測定キットを作製した。
【特許文献１】特開２００３−１５５２９７公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の特定原材料測定方法では、検体食品からの抽出液にリン酸バッファーやトリスバッファー等の蛋白質の可溶化、特にＳ−Ｓ結合を有する加熱変性した蛋白質の可溶化を促さない緩やかな抽出液を使用しており、加工食品からの蛋白質の抽出効率、特に強く加熱変性され難溶化した蛋白質の抽出効率は高くなく、加工食品中の特定原材料を見落とす危険性があった。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
そこで、本発明者らは、加工食品からの特定原材料由来の蛋白質の抽出方法をより強力なものとするために鋭意努力し、従来のように蛋白質を可溶化させずに抽出するのではなく、より強く可溶化、特にＳ−Ｓ結合を有する加熱変性した蛋白質を可溶化させた状態で抽出することで、加熱変性などで難溶化した蛋白質の強度な構造を溶解することが可能となり、抽出効率を上げることが出来ることを想起し、抽出液に蛋白構造を変化させる還元剤、及び界面活性剤、尿素等などからなる可溶化剤を含有させることにより、変性及び／又は未変性の蛋白質を従来より高い効率で抽出することが可能となることを見出した。
即ち、本発明に係る食品成分抽出液は、還元剤及び可溶化剤を含有することからなり、特に還元剤としてトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを使用し、可溶化剤としてドデシル硫酸塩及び／又は尿素を使用するのが好ましい。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の食品成分抽出液によれば、還元剤及び可溶化剤を含有するので、食品中の未変性蛋白質は勿論のこと、強く加熱変性され難溶化した蛋白質を可溶化し、抽出することが可能となり、加工食品中の特定原材料を見落とす危険性が著しく低減するという格別の効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明は前述の構成からなり、本発明の食品成分抽出液は、還元剤と可溶化剤を含有することからなる。
上記の還元剤としては、食品成分検出に使用される方法に悪影響を与えない還元剤であれば何れの還元剤も使用し得るが、好ましくは２−メルカプトエタノール（2-Mercaptoethanol、以下２−ＭＥという）、ジチオスレイトール（Dithiothreitol、以下ＤＴＴという）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（Tris(2-carboxyethyl)phosphine、以下ＴＣＥＰという）などが使用され、これらの還元剤は２種以上を併用してもよい。
これらの還元剤のうち、２−ＭＥは異臭を有し毒性や引火性がある危険物であり、食品工場等の現場では使用しづらいため、望ましくは異臭、毒性及び引火性がなく危険物でないＤＴＴやＴＣＥＰが使用され、より望ましくは、異臭がより少なく、より還元性の高いＴＣＥＰが使用される。
還元剤の使用量は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する還元剤種などにより適宜調整することができる。例えば、検体の２０倍の抽出液を使用する場合（即ち、検体１ｇに対して１９ｍｌの抽出液を使用する場合等）は、抽出液において、還元剤として２−MEを使用した場合に、通常０．１〜７w/v%（以下、％は特に限定のない限り、w/v%であり、vは抽出液の容量である）、好ましくは０.２〜２％、より好ましくは０.３〜０.７％程度に調整される。DTTを使用した場合には、通常５〜３５ｍM、好ましくは１０〜３０ｍM、より好ましくは１５〜２５ｍM程度に調整される。TCEPを使用した場合には、通常１〜２０ｍM、好ましくは５〜１５ｍM、より好ましくは８〜１２ｍM程度に調整される。
還元剤が、上記範囲の下限未満であると、変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると臭気などで作業性が劣るおそれがある。
【０００７】
また、可溶化剤としては慣用の可溶化剤を使用することができ、例えばアルキル硫酸塩、尿素などが例示でき、係る可溶化剤は２種以上を併用してもよい。アルキル硫酸塩のアルキル基としては、蛋白質の可溶化作用を有する限り特に限定されないが、例えばオクチル、ノニル、デシル、ドデシルなどが例示される。また、塩としては水溶性塩であれば特に限定されず、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩などが例示される。もっとも好ましいアルキル硫酸塩としては、ドデシル硫酸ナトリウム（以下、SDSという）が挙げられる。
可溶化剤の使用量は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する可溶化剤種などにより適宜調整することができる。例えば、SDSを使用した場合には、通常０.１〜１.５％、好ましくは０.２〜１.０％、より好ましくは０．３〜０.６％程度に調整される。また尿素を使用した場合には、通常１〜１０ｍM、好ましくは２〜７ｍM、より好ましくは３〜５ｍM程度に調整される。
可溶化剤が、上記の範囲の下限未満であるときは蛋白質の可溶化が不足して変性した蛋白質の抽出効率が低下し、また上限を超えると泡立ちなどで作業性が劣るおそれがある。
【０００８】
本発明の抽出液は水性媒体に、上記の還元剤及び可溶化剤を所定量溶解することにより調製することができる。水性媒体としては、例えば、水、緩衝液、食塩水などを例示することができる。緩衝液としては、慣用の緩衝液を使用することができ、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などを例示することができる。
液性としては、蛋白質の抽出効率などを勘案して適宜調整することができるが、通常ｐH６〜８程度に調整される。
【０００９】
本発明の抽出液は、従来の抽出液と同様にして使用することができる。即ち、検体である食品に、本発明の抽出液を加え、攪拌などの適宜な方法で食品を分散させることにより、食品中の蛋白質を抽出する。
操作温度は通常室温程度で行われるが、加熱変性が著しい場合には加温（４０℃程度）又は加熱（８０〜１００℃程度）してもよい。操作時間は、検体である食品の態様（例えば、未変性であるか否か、加熱変性の程度など）、使用する還元剤種及び可溶化剤種、操作温度などにより適宜調整し得るが、１０分〜２４時間程度で行うことができる。
なお、過度の操作条件を使用すると、蛋白質そのものがバラバラとなり、蛋白質がアミノ酸レベルに分解されるおそれがあり、由来蛋白質を特定することが困難になるので、係る問題点を生じない条件とすることが好ましい。
本発明の抽出液で抽出した液は、従来の蛋白質測定方法に適用することにより蛋白質含量の測定などに使用することができる。
【００１０】
また、本発明の抽出液で抽出した液には、食品中の未変性アレルゲンなどの蛋白質の他に変性したアレルゲンなどの蛋白質が含まれる。抽出した変性、未変性の蛋白質を抗原として抗体を産生することにより、より力価(titer)の高い抗体が得られるので、従来では得られなかった高い精度でアレルゲンなどの物質を測定することが可能となる。即ち、従来の抽出液では、過度に変性した蛋白質は抽出され得ないので、係る蛋白質に対する抗体を調製することができず、係る蛋白質を含有する食品をアレルゲン含有食品として判定することができなかった。しかし、本発明の抽出液では、係る変性蛋白質も抽出することができるので、変性蛋白質を含有する食品であっても検出できるという利点を有する。
上記の抽出液を使用した抗体の調製は常法に準じて行えばよい。
【実施例】
【００１１】
以下、実施例に基づいて、本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【００１２】
実施例１
加工食品への抽出操作により、蛋白質がどれだけ抽出されたのかを検定した。試験の抽出操作は、以下のように行われた。
測定対象となるハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして蛋白質含有測定キット（2-D Quant Kit: Amersham Biosciences社製）で手順に従い、最終的には480nmの吸光度を読み、同時に準備した標準曲線をもとに抽出蛋白質の量を求めた。
尚、蛋白定量法としてＲＣ.DC.ProteinAssay(Bio-Rad社製)を使用した場合も同様の傾向であった。
【００１３】
実施例2
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例3
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例4
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１４】
実施例5
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例6
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例7
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１５】
実施例8
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例9
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１０
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１６】
実施例１１
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１２
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例１３
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例1
実施例1において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００１７】
上記の結果を表１に示す。表１に示されるように、従来の抽出液である比較例１では、蛋白質の抽出量が0.13mg/mlと低かった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で１０〜６０倍程度高い抽出量が得られていることがわかる。
【００１８】
【００１９】
実施例１４
(1)抗体の調製
本抽出液を用いてのエライザ法での特定原材料蛋白質の定量に先立ち、まず本抽出法で抽出された変性蛋白質にも反応できる抗体を準備した。
この抗体の作製に使用する蛋白質抗原の準備は以下のように行われた。測定対象の食品1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
上記で得られた、抽出液を抗原としてウサギ又はマウスに、抗体を得る常法に従い免疫し、特定原材料由来蛋白質検出に用いる抗体を得、エライザ法による定量に使用した。
【００２０】
(2)特定原材料由来蛋白質の抽出
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。その具体的抽出操作は、以下のように行った。
添加回収試験はハードビスケットで行った。具体的には、小麦粉１３０ｇ、水１０ｇ、砂糖５０ｇ、サラダ油７０ｇに、一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質（卵：最終製品濃度10ppm）を添加し、１８０℃１２分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに、食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。なお、操作温度は室温程度とした。
この抽出液をサンプルとして、エライザ法による測定に使用した。
【００２１】
(3) エライザ法による特定原材料由来蛋白質の測定
卵蛋白質検出用エライザのプレートを準備するために、卵抗体(10μg/ml)の100μl をエライザプレート(Nunc 社製)に分注し、４℃で一晩コーティングし、洗浄液(150mM NaCl と0.05％Tween20 加20mM トリス塩酸緩衝液、pH7.4)で洗浄し、ブロッキング溶液（0.1％RSA(シグマ社製)加トリス塩酸緩衝液、pH7.4）で２５℃１時間ブロッキングした。
係るプレートに、試料として上記抽出液ならびに同様の抽出操作を施した標準液（0ng/ml〜50ng/ml）を各ウェルに100μｌずつ加え、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で１時間静置し反応させた。
反応後、上記で添加した液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、洗浄を行った。次いで、各ウェルにビオチン結合抗体液（抗卵抗体をビオチン化したもの）を、各ウェル100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で１時間静置し反応させた。反応後、ビオチン結合抗体液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、洗浄を行った。
各ウェルに、発色酵素（ペルオキシダーゼ）−ストレプトアビジン結合物（ペルオキシダーゼをストレプトアビジンと結合させたもの）溶液を、各ウェルに100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で、３０分間静置し反応させた。反応終了後、発色酵素−ストレプトアビジン結合物溶液を捨て、各ウェルに洗浄液２５０μｌずつを入れ、これを捨てる操作を５回繰り返し、同様に洗浄を行った。各ウェルに発色基質としてのTMBを100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し、攪拌後、室温で（２０〜２５℃）で２０分間静置し遮光条件下で発色させた。各ウェルに反応停止液(1M H2SO4)を100μｌずつ添加し、マイクロプレート振とう機で軽く攪拌し発色を停止した。攪拌後プレートリーダーで、測定波長450nm の吸光度を測定した。
なお、検量線（吸光度と卵濃度の関係）を得るために、段階希釈により準備した数段階の卵蛋白質希釈液を同じプレートにて同時期に添加反応させ、吸光度を測定した。この検量線と試料の吸光度測定で得られた値より試料中の卵濃度（ｐｐｍ）を決定し、最初の添加量に対する回収％を求めた。
【００２２】
実施例15
実施例14において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例16
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例17
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２３】
実施例18
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例19
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例20
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２４】
実施例21
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例22
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例23
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２５】
実施例24
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例25
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例26
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例2
実施例１4において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００２６】
上記の結果を表２に示す。表２の添加回収試験の結果に示されるより、従来の抽出液である比較例２では、回収率が３％と低かった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で１０〜３３倍程度の高い回収率が得られていることが明らかとなった。
【００２７】
【００２８】
また、実施例１４〜２６及び比較例２と同様に牛乳やそばや落花生を用いてそれぞれの添加物質量を測定するエライザ法で添加回収試験を行った場合も同様の結果を得た。
なお、卵検出用エライザ法に代えて、下記の蛋白質検出キットを使用した場合の発色酵素、発色基質、反応停止液、測定波長は以下の通りであった。
牛乳：（発色酵素としてホースラディッシュペルオキシダーゼ、発色基質としてＴＭＢを使用、反応停止液として1M H2SO4を使用、測定波長450nm）
落花生・そば：（発色酵素としてアルカリフォスファターゼ、発色基質としてｐＮＰＰを使用、反応停止液として1M ＮａＯＨを使用、測定波長405nm）
【００２９】
また、従来の還元剤等を含まない抽出液を用いて抽出した液（抗原）で免疫して得た抗体を使用し、還元剤を含有する本発明の抽出液で抽出したサンプルに対してエライザ法を行った場合は殆ど検出感度以下であった。
【００３０】
実施例27
ウェスタンブロット法による定性試験を行い、各抽出液による対象蛋白質の各バンドの有無を目視により調べた。
加工食品に前もって一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質を添加し、抽出操作により、どれだけ抽出され測定されたのかを検定する添加回収試験を行った。具体的抽出操作は、前記エライザ法と同様に以下のように行った。
即ち、小麦粉１３０ｇ、水１０ｇ、砂糖５０ｇ、サラダ油７０ｇに一定量の測定対象となる特定原材料由来蛋白質（卵：最終製品濃度10ppm）を添加し、１８０℃１２分で焼き上げた。得られたハードビスケット1 gをプラスチック製遠心管に量りとり、そこに食品成分抽出液ＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：１％、2-ME：７％を含有）19mlを加えた。あまり泡立たせないよう注意しながら、よく振り混ぜて混合し、ボルテックスなどを用いて固形分を十分に均等に分散させた。振とう機に遠心管を横にして置き、室温で一晩（12時間以上）振とう（90〜110rpm、1往復を1回転とし、1分間に90から110往復）しながら抽出した。抽出液のpHを確認し、必要であれば、中性（pH 6.0〜8.0）となるように調整した。3000 x gの条件で20分間遠心し、遠心後に得られる上清を別の容器にとった（なるべく一定量の水層を分取した。沈査が得られない場合はろ過した。可能であれば油層は除いた）。操作温度は室温程度とした。
【００３１】
ウェスタンブロットの方法は、常法に従ったが、簡略に述べれば以下の通りである。抽出サンプル及びマーカーをSDS-PAGEゲルの各々のレーンに載せ電気泳動後、泳動蛋白質をＰＶＤＦの膜に湿式の転写装置で転写した。この後、フィルターを軽く振とうさせ洗浄液で洗浄後、ブロッキング液と振とうさせてコーティングさせて、次いで、このフィルターに上記のエライザ法で用いた抗体と緩やかに振とうさせつつ室温で反応させた。更に洗浄後、抗ＩｇＧビオチン化抗体を２次抗体として反応させた。次いで更に、洗浄後、酵素―アビジン複合体を同様に反応させ、発色基質を最後に加えて発色させ各レーンにおける対象蛋白質（オボアルブミン及びオボムコイド）のバンドの有無を調べた。
なお、牛乳を測定対象にした添加回収試験も同様に行い各レーンにおける対象蛋白質（カゼイン及びベーターラクトグロブリン）のバンドの有無を調べ同様の結果を得た。
【００３２】
実施例28
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例29
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例30
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、2-ME：0.5％を含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３３】
実施例31
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例32
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例33
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、DTT：20mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３４】
実施例34
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例35
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例36
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mMを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３５】
実施例37
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.5％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例38
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.3％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
実施例39
実施例27において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（ＳＤＳ：0.1％、TCEP：10mM、尿素４Ｍを含有）を使用した以外は、同様に測定した。
比較例3
実施例24において、食品成分抽出液としてＰＢＳ(pH7.0)（可溶化剤及び還元剤を非含有）を使用した以外は、同様に測定した。
【００３６】
上記の結果を表３に示す。表３の添加回収試験の結果に示されるように、従来の抽出液である比較例３では、対象バンドを認識できず卵含有製品を見逃す可能性があった。それに対して、還元剤とＳＤＳの相乗効果、更には、還元剤、ＳＤＳ及び尿素の相乗作用で高い回収率が得られ対象バンドが認識でき、卵含有製品を見逃す可能性が無くなったことがわかる。
【００３７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元剤及び可溶化剤を含有することを特徴とする食品成分抽出液。
【請求項２】
還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、可溶化剤がドデシル硫酸塩及び／又は尿素である請求項１記載の食品成分抽出液。
【請求項１】
還元剤及び可溶化剤を含有することを特徴とする食品成分抽出液。
【請求項２】
還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、可溶化剤がドデシル硫酸塩及び／又は尿素である請求項１記載の食品成分抽出液。
【公開番号】特開２００６−７１５０９（Ｐ２００６−７１５０９Ａ）
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２５６２５９（Ｐ２００４−２５６２５９）
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月１６日（２００６．３．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（０００２２９５１９）日本ハム株式会社 (57)
【Ｆターム（参考）】
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