骨芽細胞分化促進剤
【課題】本発明においては、骨芽細胞分化促進作用を有する成分を見出すことを課題とする。
【解決手段】ゲラニルゲラニオールに骨芽細胞分化促進作用を認め、本発明を完成した。
【解決手段】ゲラニルゲラニオールに骨芽細胞分化促進作用を認め、本発明を完成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨芽細胞分化促進作用を有する物質に関する。より詳細には、ゲラニルゲラニオールを有効成分とした骨芽細胞分化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲラニルゲラニオールは、今日、主に化学合成法により合成されている。化学合成法によると、炭素骨格が同じで1種あるいは2種以上の二重結合がシス体である混合物として得られるが、工業的に利用価値のあるのは、二重結合が全てトランス体であるゲラニルゲラニオールである（特開平8-133999号公報(特許文献１)）。また、近年、生物学的にトランス体のゲラニルゲラニオール及びその誘導体の生産法が開示されている（特開平9-238692号公報(特許文献２)、特開2005-137287号公報(特許文献３)）。一方、天然界において、ゲラニルゲラニオール及びゲラニルリナロールがマツ類の樹脂中に存在するほか、ゲラニルリナロールのニトリル置換体がサンゴの仲間から得られたことは知られている。
【０００３】
アナトー（ベニノキ科ベニノキ、Bixa orellana）は、中央〜南アメリカに自生する植物であるが、今日では、インド、アフリカ等全世界的に栽培されている。その種子は、赤色を帯び、色素抽出原料として数万トンが収穫されている。その内容成分は、カロチノイドであるビキシン、ノルビキシンが主であり、有機溶剤にてアナトー種子より抽出された抽出物は、油溶性、水溶性色素としてチーズ、バター等の乳製品、加工食品、菓子等の食品用着色に使用されている。
【０００４】
ところで、このアナトー色素を除去した抽出残渣からのゲラニルゲラニオールおよびトコトリエノールの分子蒸留による回収法が開示されている（米国特許第6,350,453号明細書(特許文献４)）。また、アナトー種子からの主要産物である赤色色素を製造した後の油状残渣を、アルカリ性水溶液を加え液液分配後、イオン交換樹脂で非吸着画分を得る方法については、本出願人が特許出願をしている(特願2006-63677)。
【０００５】
ゲラニルゲラニオールは、ビタミンE、ビタミンK2、胃炎薬ブラウノトール、制ガン剤であるゲラニルゲラニルアミン誘導体（特開平9-291030号公報(特許文献５)）の原料となる重要な物質である。
【０００６】
一方、ゲラニルゲラニオール自身が、生体内での何らかの役割を示唆する報告も存在する。HMG‐CoA還元酵素は、ゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド化合物生合成の律速酵素であるが、高脂血症に用いるスタチン系製剤は、このHMG‐CoA還元酵素を阻害する（薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396(非特許文献１)）。PDGFレセプターのチロシンリン酸化には、ゲラニルゲラニオールによるレセプターの修飾が必要である（J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407(非特許文献２)）。ゲラニルゲラニオールは、HL-60など、種々のがん細胞に対してアポトーシスを誘導する（Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745(非特許文献３)、日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202(非特許文献４)）。更には、ゲラニルゲラニオールを有効成分とする抗動脈硬化治療剤（特開平10-87480号公報(特許文献６)）についての開示がされている。
【０００７】
正常の細胞においては、骨吸収(骨盤の溶解)と骨形成が交互のバランスよく行われて、代謝回転しつつ、一定の骨量に保たれる。ところがこのバランスが崩れて、吸収が促進すると骨量が減少し、骨が細くなって骨折しやすくなり、また疼痛を伴う場合がある。このような状態を骨粗しょう症と呼んでおり、特に閉経後の女性に多いことが特徴である。骨粗しょう症の治療には長期間を要し、有用かつ安全性の高い有効成分が望まれる。
【０００８】
骨粗しょう症の発生のメカニズムはまだ完全には明らかになっていないが、治療にあたっては、骨吸収を抑制するか、または骨形成を促進することが必要と考えられる。
【０００９】
このような考えに基づき、これまで骨粗しょう症の治療には、女性ホルモン(エストロゲン)、カルシトニン、活性ビタミンD3、イプリフラボンが臨床導入されてきた。また、特定保健用食品の素材となる大豆イソフラボンも骨粗しょう症の予防に有効と考えられている。
【００１０】
しかしながら、女性ホルモン(エストロゲン)は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用をあわせ持ち、骨粗しょう症の進行を抑制する。しかし、長期投与にあたっては、腹部膨満・悪心などの消化器症状に加え、乳癌・子宮内膜癌の発生を始め、子宮内膜出血・帯下の増加・乳房痛など、女性ホルモンに特有の重篤な副作用が発生する恐れがある。
【００１１】
カルトシトニンは破骨細胞による骨吸収を抑制し、強力な治療効果を有する。また中枢神経系に他のホルモンとともに相互作用し、鎮痛作用を発現すると考えられ、骨粗しょう症の疼痛改善に効果がある。カルトシトニンはペプチドのため経口投与では効果がなく、筋肉内注射が必要となり、更には消化器および循環器症状に関して副作用を示す。
【００１２】
活性ビタミンD3は小腸でのカルシウム吸収および腎臓におけるカルシウム再吸収を促進し、骨形成バランスを改善すると考えられる。しかし前破骨細胞から破骨細胞に分化させる作用を有し、骨粗しょう症の治療においては逆に悪化させるケースも考えられる。
【００１３】
イプリフラボンの代謝産物であるダイゼイン、および、ゲニステインに代表される大豆イソフラボンは、エストロゲン・レセプターに弱い結合性を示し、女性ホルモンと同様の作用を示すと考えられる。イプリフラボンでは、破骨細胞形成抑制作用、間接的な破骨細胞活性抑制作用を有し、骨量減少抑制作用を発現する。しかし、長期投与した際の有効性・安全性に関しては十分に確認されていない。
【００１４】
ゲラニルゲラニオール自身に関しても、破骨細胞形成抑制作用のあることが見出されており、この作用に基づいた抗骨粗しょう剤に関する特許が提出されている（特開平7-215849号公報(特許文献７)）。
【００１５】
しかしながら、ゲラニルゲラニオールは、破骨細胞の形成を抑制する作用を有するため、破骨を抑制し骨粗しょう症の予防および治療に有効な成分と考えられるが、骨形成に関わる作用、骨芽細胞分化促進作用については知られていなかった。
【００１６】
【特許文献１】特開平8-133999号公報
【特許文献２】特開平9-238692号公報
【特許文献３】特開2005-137287号公報
【特許文献４】米国特許第6,350,453号明細書
【特許文献５】特開平9-291030号公報
【特許文献６】特開平10-87480号公報
【特許文献７】特開平7-215849号公報
【非特許文献１】薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396
【非特許文献２】J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745
【非特許文献４】日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明においては、骨芽細胞分化促進作用を有する成分を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ゲラニルゲラニオールに骨芽細胞分化促進作用を認め、本発明を完成した。
【００１９】
すなわち本発明は、
（１）ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する骨芽細胞分化促進剤に関するものである。
【００２０】
ゲラニルゲラニオールは非環状ジテルペンとして知られ、下記に示される構造式を有している。
【００２１】
【化１】
【００２２】
ゲラニルゲラニオールは、アナトー種子若しくはその色素抽出油状残渣より抽出することによって得られる。
【００２３】
アナトー種子からの抽出方法は、ベニノキ科ベニノキの種子の被覆物より、油脂又は有機溶剤で抽出若しくは加水分解を経る。有機溶剤での抽出は、油脂分が抽出される有機溶媒であれば限定されず、好ましくはアルコールの使用が良い。
【００２４】
アナトー種子からの抽出にて、ゲラニルゲラニオールの製造は可能であるが、経済的な観点から、アナトー色素抽出油状残渣(図１の「油状物」)を使用することが出来る。
【００２５】
種子抽出物、色素抽出油状残渣にはビキシン、ノルビキシンに代表される酸性成分が多く含有されている。この状態で、蒸留等の加熱操作が加わるとゲラニルゲラニオールのアルコール基とカルボン酸との縮合反応、ゲラニルゲラニオールの熱分解、異性化等が発生する。
【００２６】
また、ヘミエステル化反応、イオン交換樹脂による精製を行う上で、これらの成分は、反応不足、吸着力低下、分割不良、精製不足の原因となる。よって、酸性成分の除去を行うことが好ましい。方法として脱酸、低級アルコールとのエステル化、陰イオン交換樹脂等が挙げられる。
【００２７】
酸性成分が除去されたアナトー抽出物は、トコフェロール類の精製方法として既知のイオン交換樹脂による精製法、すなわち、抽出油を有機溶剤に溶解し、強塩基性陰イオン交換樹脂に通液し、その後、酸、アルカリ等を用いる方法により、更に微量に存在する酸性成分及びトコトリエノールとの分割を行う。この際、アルコールであるゲラニルゲラニオールは、イオン交換樹脂に吸着されない粗ゲラニルゲラニオールとして得る。
【００２８】
得られた粗ゲラニルゲラニオールを非極性溶媒中で二塩基酸無水物と反応させてゲラニルゲラニオールのヘミエステル化物とし、これを非極性溶媒とアルコール系溶媒との混合溶媒の存在下で陰イオン交換樹脂で吸着精製を行う。ヘミエステル化物は陰イオン交換樹脂に吸着されて不純物から分離され、吸着されたヘミエステル化物は混合溶媒アルカリ溶液で脱着、加水分解することにより容易にゲラニルゲラニオールを回収することが出来る。
以上のゲラニルゲラニオール取得フローを図示すると図１のようになる。
【００２９】
ヒトおよびマウスなどの骨芽細胞は骨細胞へと分化していくが、骨芽細胞分化促進作用とは、骨芽細胞の骨細胞への分化を促進する作用を言う。本発明においては、マウス骨芽細胞を用い、分化マーカーであるアルカリホスファターゼ活性を指標として分化促進活性を測定した。骨芽細胞の骨細胞への分化促進は骨粗しょう症の予防にとり有用な作用と考えられる。
【００３０】
本発明の骨芽細胞分化促進作用剤は、その剤形は限定されず、いずれの形態であっても
利用可能である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によって、ゲラニルゲラニオールが骨芽細胞分化促進作用剤として利用できることを示し、既に知られている破骨細胞形成抑制作用に加え、骨芽細胞分化促進作用を見出したことでゲラニルゲラニオールが更に有用な骨粗しょう症治療剤および予防剤であることが判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
[マウス骨芽細胞MC3T3‐E1の維持]
骨芽細胞分化促進作用の検出には、マウス骨芽細胞MC3T3‐E1を用いた。MC3T3‐E1は、CO2インキュベーター、5％CO2、37℃下で、10％ウシ胎児血清(FBS)含有α‐MEM培地(10%FBS/α‐MEM)で週2回培地の交換で培養して維持した。
【実施例２】
【００３４】
[骨芽細胞分化促進効果測定用培地の調製]
ゲラニルゲラニオールは、まず、エタノール(和光純薬)に溶解し、ゲラニルゲラニオール200mg/mlエタノール溶液を調製した。これを10%FBS/α‐MEMでゲラニルゲラニオールを0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063μg/mlに希釈した。
【実施例３】
【００３５】
[骨芽細胞分化促進効果測定用培地での培養]
実施例１で維持したMC3T3‐E1を2 x 105個/mlに調製し、500μlを24ウェルプレートに分注し、一晩培養後、培地を除き、実施例２でそれぞれの濃度に調製したゲラニルゲラニオールを含む10%FBS/α‐MEM及びゲラニルゲラニオールを含まない10%FBS/α‐MEMを各ウェルに加えた。各濃度で3ウェル培養し、5日間まで培養した。
【実施例４】
【００３６】
[骨芽細胞の分化の測定]
分化促進活性は、細胞はアルカリフォスファターゼ(ALP)活性で表した。まず、実施例３で培養した培養上清を除いて、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した。細胞に0.2％Triton X‐100を500μl加え、ピペッティングして1.5mlエッペンドルフチューブに移した。更に、13000rpmで5分間遠心後、上清100μlを1.5mlチューブに移し、それにAMP緩衝液を50μl加え、37℃に15分間してから、1NaOHを50μl加えた。その上清100μlを96ウェルプレートに分注し、マイクロプレートリーダーを用いて405nmで吸光度を測定した。
【００３７】
p‐nitrophenolの標準曲線を求めた結果を表１に示す。それをグラフ化したものが図２である。p‐nitrophenolの標準曲線は、Y=7925.1X-333.46であり、Yはp‐nitrophenolの濃度、XはODである。ALP活性は同じ濃度で3ウェル培養した平均値を求めた。ゲラニルゲラニオール無添加で625.9±36.8nmol、0.0125μg/ml添加、699.3±42.4nmolであり、10.5％増加しており、骨芽細胞分化促進作用を認めた。
【００３８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ゲラニルゲラニオールの製造フローを示す図。
【図２】本発明のp‐nitrophenolの標準曲線を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨芽細胞分化促進作用を有する物質に関する。より詳細には、ゲラニルゲラニオールを有効成分とした骨芽細胞分化促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲラニルゲラニオールは、今日、主に化学合成法により合成されている。化学合成法によると、炭素骨格が同じで1種あるいは2種以上の二重結合がシス体である混合物として得られるが、工業的に利用価値のあるのは、二重結合が全てトランス体であるゲラニルゲラニオールである（特開平8-133999号公報(特許文献１)）。また、近年、生物学的にトランス体のゲラニルゲラニオール及びその誘導体の生産法が開示されている（特開平9-238692号公報(特許文献２)、特開2005-137287号公報(特許文献３)）。一方、天然界において、ゲラニルゲラニオール及びゲラニルリナロールがマツ類の樹脂中に存在するほか、ゲラニルリナロールのニトリル置換体がサンゴの仲間から得られたことは知られている。
【０００３】
アナトー（ベニノキ科ベニノキ、Bixa orellana）は、中央〜南アメリカに自生する植物であるが、今日では、インド、アフリカ等全世界的に栽培されている。その種子は、赤色を帯び、色素抽出原料として数万トンが収穫されている。その内容成分は、カロチノイドであるビキシン、ノルビキシンが主であり、有機溶剤にてアナトー種子より抽出された抽出物は、油溶性、水溶性色素としてチーズ、バター等の乳製品、加工食品、菓子等の食品用着色に使用されている。
【０００４】
ところで、このアナトー色素を除去した抽出残渣からのゲラニルゲラニオールおよびトコトリエノールの分子蒸留による回収法が開示されている（米国特許第6,350,453号明細書(特許文献４)）。また、アナトー種子からの主要産物である赤色色素を製造した後の油状残渣を、アルカリ性水溶液を加え液液分配後、イオン交換樹脂で非吸着画分を得る方法については、本出願人が特許出願をしている(特願2006-63677)。
【０００５】
ゲラニルゲラニオールは、ビタミンE、ビタミンK2、胃炎薬ブラウノトール、制ガン剤であるゲラニルゲラニルアミン誘導体（特開平9-291030号公報(特許文献５)）の原料となる重要な物質である。
【０００６】
一方、ゲラニルゲラニオール自身が、生体内での何らかの役割を示唆する報告も存在する。HMG‐CoA還元酵素は、ゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド化合物生合成の律速酵素であるが、高脂血症に用いるスタチン系製剤は、このHMG‐CoA還元酵素を阻害する（薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396(非特許文献１)）。PDGFレセプターのチロシンリン酸化には、ゲラニルゲラニオールによるレセプターの修飾が必要である（J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407(非特許文献２)）。ゲラニルゲラニオールは、HL-60など、種々のがん細胞に対してアポトーシスを誘導する（Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745(非特許文献３)、日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202(非特許文献４)）。更には、ゲラニルゲラニオールを有効成分とする抗動脈硬化治療剤（特開平10-87480号公報(特許文献６)）についての開示がされている。
【０００７】
正常の細胞においては、骨吸収(骨盤の溶解)と骨形成が交互のバランスよく行われて、代謝回転しつつ、一定の骨量に保たれる。ところがこのバランスが崩れて、吸収が促進すると骨量が減少し、骨が細くなって骨折しやすくなり、また疼痛を伴う場合がある。このような状態を骨粗しょう症と呼んでおり、特に閉経後の女性に多いことが特徴である。骨粗しょう症の治療には長期間を要し、有用かつ安全性の高い有効成分が望まれる。
【０００８】
骨粗しょう症の発生のメカニズムはまだ完全には明らかになっていないが、治療にあたっては、骨吸収を抑制するか、または骨形成を促進することが必要と考えられる。
【０００９】
このような考えに基づき、これまで骨粗しょう症の治療には、女性ホルモン(エストロゲン)、カルシトニン、活性ビタミンD3、イプリフラボンが臨床導入されてきた。また、特定保健用食品の素材となる大豆イソフラボンも骨粗しょう症の予防に有効と考えられている。
【００１０】
しかしながら、女性ホルモン(エストロゲン)は、骨吸収抑制作用と骨形成促進作用をあわせ持ち、骨粗しょう症の進行を抑制する。しかし、長期投与にあたっては、腹部膨満・悪心などの消化器症状に加え、乳癌・子宮内膜癌の発生を始め、子宮内膜出血・帯下の増加・乳房痛など、女性ホルモンに特有の重篤な副作用が発生する恐れがある。
【００１１】
カルトシトニンは破骨細胞による骨吸収を抑制し、強力な治療効果を有する。また中枢神経系に他のホルモンとともに相互作用し、鎮痛作用を発現すると考えられ、骨粗しょう症の疼痛改善に効果がある。カルトシトニンはペプチドのため経口投与では効果がなく、筋肉内注射が必要となり、更には消化器および循環器症状に関して副作用を示す。
【００１２】
活性ビタミンD3は小腸でのカルシウム吸収および腎臓におけるカルシウム再吸収を促進し、骨形成バランスを改善すると考えられる。しかし前破骨細胞から破骨細胞に分化させる作用を有し、骨粗しょう症の治療においては逆に悪化させるケースも考えられる。
【００１３】
イプリフラボンの代謝産物であるダイゼイン、および、ゲニステインに代表される大豆イソフラボンは、エストロゲン・レセプターに弱い結合性を示し、女性ホルモンと同様の作用を示すと考えられる。イプリフラボンでは、破骨細胞形成抑制作用、間接的な破骨細胞活性抑制作用を有し、骨量減少抑制作用を発現する。しかし、長期投与した際の有効性・安全性に関しては十分に確認されていない。
【００１４】
ゲラニルゲラニオール自身に関しても、破骨細胞形成抑制作用のあることが見出されており、この作用に基づいた抗骨粗しょう剤に関する特許が提出されている（特開平7-215849号公報(特許文献７)）。
【００１５】
しかしながら、ゲラニルゲラニオールは、破骨細胞の形成を抑制する作用を有するため、破骨を抑制し骨粗しょう症の予防および治療に有効な成分と考えられるが、骨形成に関わる作用、骨芽細胞分化促進作用については知られていなかった。
【００１６】
【特許文献１】特開平8-133999号公報
【特許文献２】特開平9-238692号公報
【特許文献３】特開2005-137287号公報
【特許文献４】米国特許第6,350,453号明細書
【特許文献５】特開平9-291030号公報
【特許文献６】特開平10-87480号公報
【特許文献７】特開平7-215849号公報
【非特許文献１】薬学雑誌、2004 Jly; 124(7) : 371-396
【非特許文献２】J Biol. Chem.、1996 Nov 1; 271(44) : 27402-27407
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun.、1996 Sep24; 226(3): 741-745
【非特許文献４】日本ビタミン学会第58回大会プログラム・講演要旨、2006 Apl; 80(4) : 202
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明においては、骨芽細胞分化促進作用を有する成分を見出すことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ゲラニルゲラニオールに骨芽細胞分化促進作用を認め、本発明を完成した。
【００１９】
すなわち本発明は、
（１）ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する骨芽細胞分化促進剤に関するものである。
【００２０】
ゲラニルゲラニオールは非環状ジテルペンとして知られ、下記に示される構造式を有している。
【００２１】
【化１】
【００２２】
ゲラニルゲラニオールは、アナトー種子若しくはその色素抽出油状残渣より抽出することによって得られる。
【００２３】
アナトー種子からの抽出方法は、ベニノキ科ベニノキの種子の被覆物より、油脂又は有機溶剤で抽出若しくは加水分解を経る。有機溶剤での抽出は、油脂分が抽出される有機溶媒であれば限定されず、好ましくはアルコールの使用が良い。
【００２４】
アナトー種子からの抽出にて、ゲラニルゲラニオールの製造は可能であるが、経済的な観点から、アナトー色素抽出油状残渣(図１の「油状物」)を使用することが出来る。
【００２５】
種子抽出物、色素抽出油状残渣にはビキシン、ノルビキシンに代表される酸性成分が多く含有されている。この状態で、蒸留等の加熱操作が加わるとゲラニルゲラニオールのアルコール基とカルボン酸との縮合反応、ゲラニルゲラニオールの熱分解、異性化等が発生する。
【００２６】
また、ヘミエステル化反応、イオン交換樹脂による精製を行う上で、これらの成分は、反応不足、吸着力低下、分割不良、精製不足の原因となる。よって、酸性成分の除去を行うことが好ましい。方法として脱酸、低級アルコールとのエステル化、陰イオン交換樹脂等が挙げられる。
【００２７】
酸性成分が除去されたアナトー抽出物は、トコフェロール類の精製方法として既知のイオン交換樹脂による精製法、すなわち、抽出油を有機溶剤に溶解し、強塩基性陰イオン交換樹脂に通液し、その後、酸、アルカリ等を用いる方法により、更に微量に存在する酸性成分及びトコトリエノールとの分割を行う。この際、アルコールであるゲラニルゲラニオールは、イオン交換樹脂に吸着されない粗ゲラニルゲラニオールとして得る。
【００２８】
得られた粗ゲラニルゲラニオールを非極性溶媒中で二塩基酸無水物と反応させてゲラニルゲラニオールのヘミエステル化物とし、これを非極性溶媒とアルコール系溶媒との混合溶媒の存在下で陰イオン交換樹脂で吸着精製を行う。ヘミエステル化物は陰イオン交換樹脂に吸着されて不純物から分離され、吸着されたヘミエステル化物は混合溶媒アルカリ溶液で脱着、加水分解することにより容易にゲラニルゲラニオールを回収することが出来る。
以上のゲラニルゲラニオール取得フローを図示すると図１のようになる。
【００２９】
ヒトおよびマウスなどの骨芽細胞は骨細胞へと分化していくが、骨芽細胞分化促進作用とは、骨芽細胞の骨細胞への分化を促進する作用を言う。本発明においては、マウス骨芽細胞を用い、分化マーカーであるアルカリホスファターゼ活性を指標として分化促進活性を測定した。骨芽細胞の骨細胞への分化促進は骨粗しょう症の予防にとり有用な作用と考えられる。
【００３０】
本発明の骨芽細胞分化促進作用剤は、その剤形は限定されず、いずれの形態であっても
利用可能である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によって、ゲラニルゲラニオールが骨芽細胞分化促進作用剤として利用できることを示し、既に知られている破骨細胞形成抑制作用に加え、骨芽細胞分化促進作用を見出したことでゲラニルゲラニオールが更に有用な骨粗しょう症治療剤および予防剤であることが判明した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下に本発明の実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はそれらによって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
[マウス骨芽細胞MC3T3‐E1の維持]
骨芽細胞分化促進作用の検出には、マウス骨芽細胞MC3T3‐E1を用いた。MC3T3‐E1は、CO2インキュベーター、5％CO2、37℃下で、10％ウシ胎児血清(FBS)含有α‐MEM培地(10%FBS/α‐MEM)で週2回培地の交換で培養して維持した。
【実施例２】
【００３４】
[骨芽細胞分化促進効果測定用培地の調製]
ゲラニルゲラニオールは、まず、エタノール(和光純薬)に溶解し、ゲラニルゲラニオール200mg/mlエタノール溶液を調製した。これを10%FBS/α‐MEMでゲラニルゲラニオールを0.1、0.05、0.025、0.0125、0.0063μg/mlに希釈した。
【実施例３】
【００３５】
[骨芽細胞分化促進効果測定用培地での培養]
実施例１で維持したMC3T3‐E1を2 x 105個/mlに調製し、500μlを24ウェルプレートに分注し、一晩培養後、培地を除き、実施例２でそれぞれの濃度に調製したゲラニルゲラニオールを含む10%FBS/α‐MEM及びゲラニルゲラニオールを含まない10%FBS/α‐MEMを各ウェルに加えた。各濃度で3ウェル培養し、5日間まで培養した。
【実施例４】
【００３６】
[骨芽細胞の分化の測定]
分化促進活性は、細胞はアルカリフォスファターゼ(ALP)活性で表した。まず、実施例３で培養した培養上清を除いて、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄した。細胞に0.2％Triton X‐100を500μl加え、ピペッティングして1.5mlエッペンドルフチューブに移した。更に、13000rpmで5分間遠心後、上清100μlを1.5mlチューブに移し、それにAMP緩衝液を50μl加え、37℃に15分間してから、1NaOHを50μl加えた。その上清100μlを96ウェルプレートに分注し、マイクロプレートリーダーを用いて405nmで吸光度を測定した。
【００３７】
p‐nitrophenolの標準曲線を求めた結果を表１に示す。それをグラフ化したものが図２である。p‐nitrophenolの標準曲線は、Y=7925.1X-333.46であり、Yはp‐nitrophenolの濃度、XはODである。ALP活性は同じ濃度で3ウェル培養した平均値を求めた。ゲラニルゲラニオール無添加で625.9±36.8nmol、0.0125μg/ml添加、699.3±42.4nmolであり、10.5％増加しており、骨芽細胞分化促進作用を認めた。
【００３８】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ゲラニルゲラニオールの製造フローを示す図。
【図２】本発明のp‐nitrophenolの標準曲線を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する骨芽細胞分化促進剤。
【請求項１】
ゲラニルゲラニオールを有効成分として含有する骨芽細胞分化促進剤。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００８−１８９６０５（Ｐ２００８−１８９６０５Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２６４７３（Ｐ２００７−２６４７３）
【出願日】平成１９年２月６日（２００７．２．６）
【出願人】（０００１０８８１２）タマ生化学株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月６日（２００７．２．６）
【出願人】（０００１０８８１２）タマ生化学株式会社 (19)
【Ｆターム（参考）】
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