髄膜炎に対するデフェンシンの使用
本発明は、細菌性髄膜炎のような髄膜炎を、デフェンシンポリペプチドを用いて治療する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デフェンシンポリペプチドを用いた髄膜炎の治療に関する。
【０００２】
配列表に関する参照
本願は、コンピュータで読み取り可能な形式の配列表を含む。該コンピュータで読み取り可能な形式は、参照により本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００３】
髄膜炎は、総称して髄膜として知られる、中枢神経系を覆う保護膜の炎症である。髄膜炎は多くの要因、最も顕著なものとしてはバクテリアやウィルス、に対する応答として発症する場合がある。髄膜炎は、炎症が脳および脊髄に近接していることから、将来的に深刻な状態となりうる。深刻な神経障害、更には死の可能性すらあることから、速やかな治療および医学的評価が求められる。細菌性髄膜炎は通常抗生物質で治療し、十分な観察が必要である。数多くの微生物が細菌性髄膜炎の原因となる可能性があるが、ストレプトコッカス ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（肺炎球菌（pneumococcus））およびネイセリア メニジチジス（Neisseria meningitidis）（髄膜炎菌（meningococcus））は、免疫欠損のない患者に最も共通した病原体である。細菌性髄膜炎は、全世界で推計年１７１０００人の死者をもたらす、健康に対する地球規模の脅威である。
【０００４】
ストレプトコッカス ニューモニエは、幼児の侵襲性細菌感染の原因として広がりをみせている生物である。ニューモコッカル メニンジチス（pneumococcal meningitis）による子供の死亡率は、髄膜炎菌性髄膜炎（meningococcal meningitis）によるものの少なくとも2倍であり、生存者の後遺症発生率は高い。５歳未満の子供の肺炎球菌性髄膜炎発生率に関するヨーロッパ各国からのデータが、最近の研究で報告されている。報告によれば、全体で最も発生率が低いのはフィンランド（０．３／１０００００）で、最も高いのはフランス（１２．０／１０００００）である。ペニシリン耐性肺炎球菌はしばしば多剤耐性であるため、治療には深刻な問題が提起される。マクロライド類への耐性もまた広がっており、地中海地域においては特にその広がりは大きい。
【０００５】
本発明は、髄膜炎の治療にあたり、血液脳関門を通過できるポリペプチドおよびその使用法の提供を目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、合成デフェンシンが肺炎球菌性髄膜炎に対する活性に優れており、細菌性髄膜炎の治療に利用できることを見出した。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、髄膜炎治療用薬剤の製造にあたり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドの使用を提示する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、髄膜炎治療用の、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドを提示する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、治療有効量、例えば抗髄膜炎有効量の、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドを被験者に投与することを含む、髄膜炎の治療方法を提示する。
【００１０】
１の実施態様では、上記ポリペプチドはデフェンシンポリペプチド、好ましくは、ベータ−デフェンシンポリペプチドである。
【００１１】
本発明で言うところの髄膜炎は、細菌性髄膜炎であってよく、好ましくは肺炎球菌性髄膜炎、例えば連鎖球菌、特に好ましくはストレプトコッカス ニューモニエに起因する髄膜炎である。好ましい実施態様では、上記髄膜炎はペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエに起因する。
【００１２】
本発明の使用、または本発明の髄膜炎治療のためのポリペプチドは、以降、「本発明の（による）ポリペプチド」と称する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
抗菌活性：用語「抗菌活性」は、本明細書中では、微生物細胞を殺生、またはその増殖を阻害することのできる活性として定義される。本発明においては、用語「抗菌」は、殺菌の、および／または静菌性の、および／または殺真菌性の、および／または静真菌性の、および／または殺ウィルス性の効果を意味すように意図し、ここで、用語「殺菌の」は細菌細胞を殺すことができることとして理解される。用語「静菌性の」は細菌増殖を阻害することができること、すなわち、細菌細胞の増殖を阻害することとして理解される。用語「殺真菌性の」は真菌細胞を殺すことができることとして理解される。用語「静真菌性の」は真菌の増殖を阻害できること、すなわち、真菌細胞の増殖を阻害することとして理解される。用語「殺ウィルス性の」は、ウィルスを不活性化できることとして理解される。用語「微生物細胞」は、細菌のまたは真菌の細胞（酵母を含む）を示す。
【００１４】
本発明において、用語「微生物細胞の増殖阻害」は、細胞が非増殖状態にあること、すなわち、細胞が増殖できないことを意味するように意図したものである。
【００１５】
好ましい実施態様では、「抗菌活性」の語は、殺菌の、および／または静菌性の活性を意味する。より好ましくは、「抗菌活性」は、連鎖球菌、より好ましくはストレプトコッカス ニューモニエに対する殺菌の、および／または静菌性の活性として定義される。
【００１６】
本発明の目的には、抗菌活性はレーラーら（Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991 )）の記載した方法に従って測定してよい。あるいは、抗菌活性は、ＣＬＳＩ（臨床検査標準協会（Clinical and Laboratory Standards Institute）; 旧名称は米国臨床検査標準委員会（National Committee for Clinical and Laboratory Standards））からのＮＣＣＬＳガイドラインに従って測定してもよい。
【００１７】
抗菌活性を有するポリペプチドは、ストレプトコッカス ニューモニエ（ＡＴＣＣ ４９６１９）の生細胞数を、抗菌活性を有するポリペプチド濃度５００μｇ／ｍｌ；好ましくは２５０μｇ／ｍｌ；より好ましくは１００μｇ／ｍｌ；さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ；最も好ましくは２５μｇ／ｍｌ；特に好ましくは１０μｇ／ｍｌ、３７℃の関連微生物増殖基質中、８時間（好ましくは４時間、より好ましくは２時間、より好ましくは１時間、特に好ましくは３０分）のインキュベーション後に１／１００に減少させることができる場合がある。
【００１８】
抗菌活性を有するポリペプチドはまた、関連微生物増殖基質中、３７℃、８時間で、濃度５００μｇ／ｍｌ；好ましくは２５０μｇ／ｍｌ；より好ましくは１００μｇ／ｍｌ；さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ；最も好ましくは１０μｇ／ｍｌ；特に好ましくは５μｇ／ｍｌで加えた時、ストレプトコッカス ニューモニエ（ＡＴＣＣ ４９６１９）の増殖を阻害できる場合がある。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドの抗菌活性の少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、および、さらに好ましくは、少なくとも１００％を有する。
【００２０】
デフェンシン：用語「デフェンシン」は、本明細書中では、デフェンシンクラスの抗菌ペプチドに属するものとして当業者が認めるポリペプチドを指す。あるポリペプチドが本発明のデフェンシンであるかどうかの決定には、自由に入手できるＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて、アミノ酸配列を、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較することが好ましい（実施例１参照）。
【００２１】
ＰＦＡＭデフェンシンファミリーにはデフェンシン＿１、すなわち「哺乳類デフェンシン」（受託番号ＰＦ００８７９）、デフェンシン＿２、すなわち「節足動物デフェンシン」（受託番号ＰＦ０１０９７）、デフェンシン＿ベータ、すなわち「ベータデフェンシン」（受託番号ＰＦ００７１ １）、デフェンシン＿ｐｒｏｐｅｐ、すなわち「デフェンシンプロペプチド」（受託番号ＰＦ００８７９）、およびガンマ−チオニン、すなわち「ガンマ−チオニンファミリ」（受託番号ＰＦ００３０４）が含まれる。
【００２２】
上記デフェンシン類はアルファ−デフェンシンクラス、ベータ−デフェンシンクラス、シータ−デフェンシンクラス、昆虫または節足動物デフェンシンクラス、または植物デフェンシンクラスに属しうる。
【００２３】
１の実施態様では、本発明のデフェンシンのアミノ酸配列は、４、５、６、７、または８のシステイン残基、好ましくは、４、５、または６のシステイン残基、より好ましくは４または６のシステイン残基、最も好ましくは６のシステイン残基を含む。
【００２４】
上記デフェンシン類は、上記デフェンシンクラスのいずれの特徴を有する合成デフェンシンであってもよい。
【００２５】
こうしたデフェンシンには例えば、α−デフェンシンＨＮＰ−１（ヒト好中球ペプチド）ＨＮＰ−２およびＨＮＰ−３；β−デフェンシン−１２、ドロソマイシン（Drosomycin）、ヘリオマイシン（Heliomicin）、γ１−プロチオニン（purothionin）、昆虫デフェンシンＡ、およびＰＣＴ出願 ＷＯ ９９／５３０５３、ＷＯ ０２／０６３２４、ＷＯ ０２／０８５９３４、ＷＯ ０３／０４４０４９、ＷＯ ２００６／０５０７３７およびＷＯ ２００６／０５３５６５に開示されたデフェンシン類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
単離ポリペプチド：用語「単離変異体（isolated variant）」または「単離ポリペプチド」は、本明細書中では、ソースから単離した変異体またはポリペプチドを言う。１の態様では、上記変異体またはポリペプチドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定で、少なくとも１％、好ましくは、少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも６０％、さらに好ましくは、少なくとも８０％、そして、最も好ましくは、少なくとも９０％である。
【００２７】
実質的に純粋なポリペプチド：用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書中では、天然にまたは組み換え技術によって結合した他のポリペプチド物質を重量％で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、さらに好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、およびさらに好ましくは最大０．５％を含むポリペプチド標品をさす。よって、上記実質的に純粋なポリペプチドは、上記標品中に存在する全ポリペプチド物質に対し少なくとも９２重量％の純度、好ましくは少なくとも９４重量％の純度、より好ましくは少なくとも９５重量％の純度、より好ましくは少なくとも９６重量％の純度、より好ましくは少なくとも９６重量％の純度、より好ましくは少なくとも９７重量％の純度、より好ましくは少なくとも９８重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９重量％の純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％の純度、およびさらに好ましくは１００重量％の純度である。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形であることが望ましい。このことは、例えば、周知の組み換え方法や標準的な精製法でポリペプチドを調製することによって実現できる。
【００２８】
同一性：２のアミノ酸配列の関連性や２のヌクレオチド配列の関連性は「同一性」パラメータで記述される。
【００２９】
本発明の目的には、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６： ２７６−２７７； http://emboss.org）のＮｅｅｄｌｅプログラムで使用されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３）を用いて決定される。任意のパラメータとして、ギャップオープンペナルティ（gap open penalty）１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５（gap extension penalty）、および、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリクスが使用される。「最長同一性（longest identity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力（-ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性のパーセント（percent identity）として使用され、次のように計算される：
（同定残基×１００）／（アライメント長−アライメント中の全ギャップ数）
【００３０】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， 上記参照； http://emboss.org）のＮｅｅｄｌｅプログラムで使用されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， 上記参照）を用いて決定される。ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＥＭＢＯＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリクスが任意のパラメータとして使用される。「最長同一性」として標識されたＮｅｅｄｌｅの出力は、同一性のパーセントとして使用され、次のように計算される：
（同定デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメント長−アライメント中の全ギャップ数）
【００３１】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体（allelic variant）」は、本明細書中では、同じ染色体の座を占める遺伝子の、２以上の代替形状のいずれかを示す。対立遺伝子変異体は天然には突然変異を通じて発生し、集団内部での多様性をもたらす。遺伝子の突然変異は沈黙状態（コードされたポリペプチドの変化なし）のこともあり、また、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００３２】
修飾：用語「修飾」は、本明細書中では、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドの化学修飾を意味し、そのポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作も同様に意味する。修飾は、アミノ酸の置換、欠失、および／またはアミノ酸側鎖の挿入およびアミノ酸側鎖の置換；または、アミノ酸配列内における、類似の性質を持つ非天然アミノ酸の使用であってよい。特に、修飾はＣ末端のアミド化などのアミド化であってよい。
【００３３】
抗菌活性を有するポリペプチド
第1の態様では、本発明は、抗菌活性を有する、配列番号１との同一性の程度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、および、特に少なくとも97%のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド（以下、「同種ポリペプチド（homologous polypeptides）」）に関する。好ましい態様では、上記同種ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と最大６アミノ酸まで、好ましくは最大５アミノ酸まで、より好ましくは最大４アミノ酸まで、さらに好ましくは最大３アミノ酸まで、最も好ましくは最大２アミノ酸まで、および 特に１アミノ酸まで異なるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体を含む。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体から成る。他の好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００３５】
好ましくは、アミノ酸の変化はわずかなもの、すなわち、保存アミノ酸置換または挿入であって、ポリペプチドの折りたたみや活性に重大な影響を与えないもの；単一欠失；アミノ−またはカルボキシル−末端の小規模延長；最大２０−２５残基の小さなリンカーペプチド；または、正味の電荷や他の機能を変化させることで純化を促進させる、小規模の延長であって、例えばポリヒスチジンタグ、抗原エピトープ、または結合ドメインなどである。
【００３６】
保存置換の例としては、塩基性アミノ酸 （アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、 酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン）のグループ内部でのものがある。特定の活性を通常変化させないアミノ酸置換技術は既知であり、例えば、Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｈｉｌｌ， １９７９， Ｉｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的な変換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、および Ａｓｐ／Ｇｌｙである。
【００３７】
２０の標準アミノ酸に加え、非標準アミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブチル酸、イソバリン、および、アルファ−メチルセリンなど）が、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。限定数の非保存アミノ酸、遺伝子コードでコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸でアミノ酸残基を代替してよい。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に修飾され、および／またはその側鎖に標準アミノ酸とは異なる化学構造を有する。非天然アミノ酸は化学合成され、好ましくは商業的に入手できるものであり、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、および３，３−ジメチルプロリンが含まれる。
【００３８】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異やアラニンスキャン変異（alanine-scanning mutagenesis）など既知の手段で同定することがでる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５）。後者の技術では、単一のアラニン変異を分子内の残基毎に導入し、得られた変異分子の生物活性（例えば抗菌活性）を試験し、分子の活性に必須なアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−４７０８も参照。生物学的相互作用もまた、想定される接触部位アミノ酸の突然変異と関連し、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、または光親和性標識のような技術で測定できるのと同様に、構造の物理解析で求めることができる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓら， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２； Ｓｍｉｔｈら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４； Ｗｌｏｄａｖｅｒら， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９：５９−６４を参照。必須アミノ酸の同一性もまた、本発明のポリペプチドに関連したポリペプチドとの同一性解析から推定することができる。
【００３９】
突然変異、組み換え、および／またはシャッフリングの既知の方法を用いて単一のまたは複数のアミノ酸置換を行い、テストし、下記文献に開示されたスクリーニング法を適用した：Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７； Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２１５２−２１５６； ＷＯ ９５／１７４１３； またはＷＯ ９５／２２６２５。他に使用することのできる方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば，Ｌｏｗｍａｎら， １９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０８３２−１０８３７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２２３，４０９； ＷＯ ９２／０６２０４）、および領域特異的変異（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら， １９８６， Ｇｅｎｅ ４６：１４５； Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＤＮＡ ７：１２７）がある。
【００４０】
突然変異／シャッフリング法は、スループットの高い自動スクリーニング法と組合せ、ホスト細胞によって発現された突然変異ポリペプチドのクローンの活性を測定することができる。活性ポリペプチドをエンコードする突然変異ＤＮＡ分子をホスト細胞から回収し、従来技術を用いて速やかに配列を定めることができる。これらの方法によれば、興味あるポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を速やかに決定することができ、未知の構造を有するポリペプチドに適用することができる。
【００４１】
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドはデフェンシンポリペプチドであり、好ましくは、ベータ−デフェンシンポリペプチドである。
【００４２】
Ｎ−末端伸長
本発明のポリペプチドのＮ−末端伸長は、１−５０のアミノ酸から、好ましくは２−５０のアミノ酸から、特に３−１５のアミノ酸から成ってよい。１の実施態様では、Ｎ−末端ペプチド伸長には、Ａｒｇ（Ｒ）は含まれない。他の実施態様では、Ｎ−末端伸長は、以下で更に定義される、ｋｅｘ２またはｋｅｘ２類似の切断部位を含む。好ましい実施態様では、Ｎ−末端伸長はＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ、およびＤＤの配列の１つを含むＮ−末端伸長など、少なくとも２のGlu (E)および／または Asp (D)を含むペプチドである。
【００４３】
Ｋｅｘ２サイト
Ｋｅｘ２サイト（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８５， ｅｄ． Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． （１９９０）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， “Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”を参照）およびｋｅｘ２様部位は、二塩基認識部位（例えば切断部位）であって、いくつかのタンパク質のプロペプチドエンコード領域と成熟領域の間に見出される。
【００４４】
ｋｅｘ２またはｋｅｘ２様サイトの挿入により、場合によっては、プロペプチド切断部位におけるエンドペプチダーゼプロセッシングの正確さが向上することが示され、その結果、タンパク質分泌レベルが上昇する。
【００４５】
本発明においては、ｋｅｘ２またはｋｅｘ２様サイトの挿入によって、Ｎ末端伸長の特定の部位における切断が可能となり、その結果、配列番号１で示される成熟ポリペプチドと比較して伸長した抗菌ポリペプチドが得られることとなる。
【００４６】
融合ポリペプチド
さらに本発明のポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントのNまたはC末端に融合した、融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本発明のヌクレオチド配列（またはその部分）に融合させることで製造される。融合ポリペプチドの製造技術は公知であり、ポリペプチドをコードするコーディング配列のライゲーション（ligation）を含み、そうすることで、それらの骨格ができ、同じプロモータおよびターミネータの制御下に融合ポリペプチドが発現する。
【００４７】
方法と使用
本発明は、髄膜炎治療用のポリペプチドの使用に関する。従って、本発明のポリペプチドは、抗菌性の、動物またはヒトの治療または予防薬に使用することができる。すなわち、本発明のデフェンシン変異体は、髄膜炎治療のための、動物またはヒト用の治療または予防薬として使用することができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、連鎖球菌、例えばストレプトコッカス ニューモニエの成長を停止または阻害するに十分な量使用することができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドの製剤は髄膜炎、例えば細菌性髄膜炎に罹患した、または罹患しやすい宿主へ投与される。１の実施態様では、髄膜炎は、ペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエへの感染に起因する。
【００５０】
投与は局所または全身に行われる。通常、本発明の抗菌ポリペプチドの投与量は、微生物個体群を、少なくとも１ログまで、および２ログまたはそれ以上まで減少させるに十分な量であろう。本発明のポリペプチドは、副作用を最小に抑えながら、微生物個体群を減少させる量投与される。生体への使用に関し、内科医の指導のもとに得られた配合が使用されるものと考えられる。
【００５１】
様々な投与法が使用される。ポリペプチド製剤は経口で、または経脈管的に、筋肉に、皮下に、腹膜に、噴霧器で、眼胞に、膀胱に、経皮的に、等投与してよい。治療用製剤の投与量は、投与される殺菌ポリペプチド、投与頻度、投与方法、宿主からの剤のクリアランス等によって大きく変化する。初期投与量は多めに、以降の維持投与量は少なめにしてよい。多くの場合、経口投与では、静注より必要な投与量は多くなる。アミド結合のほかに、アミノ末端やカルボキシ末端もまた、経口投与の安定性を大きくするように修飾してよい。例えば、カルボキシ末端はアミド化してよい。
【００５２】
製剤
本発明のポリペプチドは、治療学的投与のために種々の製剤に導入することができる。より具体的には、本発明のポリペプチドは、適当な、医薬的に許容される担体や希釈剤と組合せて医薬組成物に製剤化することができ、また、錠剤、カプセル剤、散剤、ガス状、軟膏剤、水剤、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエーロゾル剤などの固体、半固体、液体、又はガス状の形態の調製物に製剤化することができる。 このようにして、薬剤の投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む種々の方法で行うことができる。本発明の抗菌ポリペプチドは、投与後全身性となり得、または局在化されうる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、単独で、互いに組み合わせて、または他の既知の化合物（例えば、パーフォリン、抗炎症剤、抗生物質、等）と組合せて使用される。薬学的剤型では、ポリペプチドはその薬学的に許容される塩の形で投与することができる。以下の方法及び賦形剤は単に代表例であり、何ら限定するものではない。
【００５４】
経口調製物としては、ポリペプチドを単独で、又はラクトース、マニトール、コーンスターチ又はポテトスターチなど従来の適当な添加物と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤と；コーンスターチ、ポテトスターチ、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と；また、必要な場合には希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び香味剤と組み合わせて、錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤を作ることができる。
【００５５】
ポリペプチドは、植物又は他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステルなど水性又は非水性溶媒中で、また、所望する場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤などの慣用的な添加剤などとともに溶解、懸濁、又は乳化することにより、注射用の調製物に製剤化することができる。
【００５６】
ポリペプチドはエアロゾル製剤として、吸入投与することができる。本発明のポリペプチドは、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、許容される噴射剤の加圧噴射剤に製剤化することができる。
【００５７】
さらに、ポリペプチドは、乳化基剤又は水溶性基剤などの種々の基剤と混合することにより、坐剤にすることができる。本発明のポリペプチドは坐剤により直腸投与することができる。坐剤にはビヒクルが含まれる。坐剤は、体温で溶け、かつ、さらに室温で固体化するカカオ脂、カーボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【００５８】
シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤などの経口又は直腸投与用の単位剤形を提供することができ、各投薬単位、例えば、ティースプーンフル、テーブルスプーンフル、錠剤、又は坐剤、は1つ以上の阻害剤を含有する所定量の組成物を含む。同様に、注射又は静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、又は別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中に本発明のポリペプチドを含む。
【００５９】
徐放性製剤用のインプラントは公知の技術である。インプラントは、生分解性または非生分解性ポリマーなどを用いて、マイクロスフェアやスラブなどとして製剤化される。例えば、乳酸および／またはグリコール酸は、宿主による忍容性良好な浸食性ポリマーを形成する。本発明の抗菌ポリペプチドを含むインプラントは、感染領域に隣接して配置することで、体の残りの部分と比較して、活性剤の局所濃度が上昇する。
【００６０】
本明細書に用いられる用語「単位剤形」は、ヒト及び動物被検体用の単位用量として好適な物理的に区別される単位をいい、各々の単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルに関連して所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規な単位剤形のための特定は、用いる特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主中での各化合物に関連する薬力学に依存する。
【００６１】
ビヒクル、補助剤、担体、又は希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般の人が容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般の人が容易に入手可能である。
【００６２】
全身投与に対する典型的な投薬量としては、患者の体重１ｋｇあたり投与毎に、０．１ｐｇから１００ｍｇである。典型的な投薬量は、１錠を１日に２〜６回、または比例して活性成分量の多いタイムリリースカプセルまたは錠剤を１日にひとつ、であってよい。タイムリリース効果は、種々のｐＨ値で溶解するカプセル材料によって、浸透圧によって徐々に放出するカプセルによって、または任意の既知の制御放出手段によって得ることができる。
【００６３】
投与量レベルは、特定の化合物、症状の重症度、及び副作用に対する被検体の感受性の関数として変動することができることを当業者は容易に理解するだろう。所定の化合物の好ましい投与量は、種々の手段により当業者が容易に決定できる。好ましい手段は、所定のポリペプチドの生理学的効力を測定することである。
【００６４】
輸送手段としてのリポソームの使用は、興味ある方法の１つである。リポソームは標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に移送する。リポソームと細胞との融合する時間が十分とれるように、単離、結合剤など、接触を維持する様々な方法を用いて、接触が維持される。本発明の１の態様では、リポソームは経肺投与用にエアロゾルとしてデザインされる。リポソームは、センダイウィルスやインフルエンザウィルスなど、膜融合を媒介する、精製タンパク質またはペプチドを用いて調製してよい。上記脂質は、既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組合せであってよく、ホスファチジルコリンなど、カチオンや両性イオン脂質が含まれる。残存脂質は通常中性または酸性脂質であり、例えば、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどである。
【００６５】
リポソームの調製には、Ｋａｔｏら、（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：３３６１に記載の手順を使用してよい。簡単にいえば、脂質とペプチドを含有する内腔組成物を適当な水性媒質中で混合する。水性媒質としては、全固形物が約１から１０重量％の範囲内にある生理食塩水が便利である。５−６０秒の短時間の強い撹拌の後、管を約２５−４５℃の温水槽中に配置し、このサイクルを５−１０回繰り返す。続いて、都合のよい時間、通常約１−１０秒間、上記組成物を超音波で分解し、さらに渦撹拌してよい。続いて水性媒体を加えて、通常約１−２倍に体積を増加させ、その後振盪し冷却を行う。上記方法によって、高分子量分子の内腔への取込みが可能になる。
【００６６】
他の活性薬剤との製剤
本方法に使用するために、本発明の抗菌ポリペプチドを薬学的に活性な他の薬剤、特に他の抗菌剤と製剤化してよい。興味のある他の薬剤として、広範囲の抗生物質がこの技術分野で知られている。抗生物質のクラスには、例えばペニシリンG、ペニシリンV、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなどのペニシリン類；ベータラクタマーゼ阻害剤であるセファクロア（cefaclor）、セファゾリン、セフロキシム、モクサラクタムなどのセファロスポリン類と組合せたペニシリン類；カルバペネム類；モノバクタム類；アミノグリコシド類；テトラサイクリン；マクロライド類；リンコマイシン類；ポリミキシン類；スルホンアミド類；キノロン類；クロラムフェニコール類;メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等が挙げられる。
【００６７】
抗真菌薬も有用でり、アムホテリシンＢ、ナイスタチン；５−フルコシンなどのポリエン類；および、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾールなどのアゾール類が含まれる。抗結核薬にはイソニアジド、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびリファンピンが含まれる。例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２などのサイトカインも、本発明の抗菌ポリペプチドの製剤に含まれてよい。
【００６８】
インビトロ合成
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知の一般的な方法を用いて、インビトロ合成により調製してよい。様々な市販の合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．やＢｅｃｋｍａｎなどの自動化された合成装置が利用できる。合成装置を用いて、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸、特に、例えばＤ−アラニンやＤ−イソロイシンなどのＤ−アイソマー（Ｄ−形）、ジアステレオマー、異なった長さや機能を有する側鎖などで置換してもよい。具体的な配列や調製方法は便宜性、経済性、必要な純度等によって決定される。
【００６９】
化学結合は、例えば還元的アミノ化など置換アミン生成のためのアミノ基、チオエーテルやジスルフィド生成のためのチオール基、アミド生成のためのカルボキシル基など、結合に便利な官能基を有する種々のペプチドやタンパク質に対して行われる。
【００７０】
必要な場合には、合成や発現の過程で種々の基がペプチドに導入されてよく、これによって、他の分子や表面に結合を形成することが可能となる。すなわち、システインを用いればチオエーテルができ、ヒスチジンを用いれば金属イオン錯体との結合ができ、カルボキシル基を用いればアミドやエステルが形成され、アミノ基を用いればアミドが形成される、などである。
【００７１】
ポリペプチドは、従来の組み換え合成法に従って、単離・精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製し、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、または他の精製技術を用いて精製してよい。主として、使用される組成物は、望みの生成物を、少なくとも２０重量％、より一般的には少なくとも７５重量％、好ましくは、少なくとも９％重量％含み、治療目的には、製品の製造と精製の方法に関連する混入物質に関連し、通常少なくとも約９９．５重量％含む。通常、パーセンテージは全タンパク質を基礎としている。
【００７２】
本発明は更に、以下の実施例で説明されるが、これによって本発明の範囲が限定されると解釈すべきではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１
ＰＦＡＭデータベースのＨＭＭファイルを用いたデフェンシンの同定
隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）を用いた配列解析は、インターネット上オンラインで行ってもよく、ローカルのコンピュータ上で、無料で利用できる周知のＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて行ってもよい。現在のバージョンは２００３年１０月からのＨＭＭＥＲ ２．３．２である。
【００７４】
ＨＭＭプロファイルは周知のＰＦＡＭデータベースから得ることができる。現在のバージョンは２００４年１１月からのＰＦＡＭ １６．０である。ＨＭＭＥＲとＰＦＡＭは両方とも、例えば、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ （ＵＳＡ）， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ およびｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）から、すべてのコンピュータプラットフォーム用に入手可能である。
【００７５】
質問アミノ酸配列またはそのフラグメントが以下の５ＰＦＡＭファミリーの１つに属するならば、該アミノ酸配列は、本発明のデフェンシンである：
−デフェンシン＿ベータまたは“ベータデフェンシン”、受託番号： ＰＦ００７１１；
−デフェンシン＿ｐｒｏｐｅｐまたは“デフェンシンプロペプチド”、受託番号： ＰＦ００８７９；
−デフェンシン＿１または“哺乳類デフェンシン”、受託番号： ＰＦ００３２３；
−デフェンシン＿２または“節足動物デフェンシン”、受託番号： ＰＦ０１０９７；
−ガンマ−チオニンまたは“ガンマ−チオニンファミリ”、受託番号： ＰＦ００３０４．
【００７６】
ＰＦＡＭデータベースをオンラインで使用し、またはｈｍｍｐｆａｍプログラム（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージから）をローカルで使用し、あるアミノ酸配列が０．１より大きなＥ値、およびゼロ以上のスコアを生成した時は、そのアミノ酸配列はＰＦＡＭファミリーに属する。
【００７７】
配列解析をｈｍｍｐｆａｍプログラムを用いてローカルで行った時、ＰＦＡＭデータベースからＨＭＭプロファイルを入手（ダウンロード）する必要がある。各ファミリーに対して２つのプロファイル、グローカルサーチ用のｘｘｘ＿ｌｓ．ｈｍｍ、およびローカルサーチ用のｘｘｘ＿ｆｓ．ｈｍｍが存在する。これによって上記５ファミリー用に全部で１０プロファイルができる。
【００７８】
この１０プロファイルは個別に使用してよく、また、（テキストエディタを用いて−プロファイルはＡＳＣＩＩファイルである）結合して（付加して）、例えばｄｅｆｅｎｓｉｎ．ｈｍｍといった名前の単一のプロファイルにしてもよい。質問アミノ酸配列は次のコマンドラインを用いて評価することができる：
ｈｍｍｐｆａｍ −Ｅ ０．１ ｄｅｆｅｎｓｉｎ．ｈｍｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｌｅ
−ここで、「ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｌｅ」は上記質問アミノ酸配列を有するファイルであって、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージで認識できる任意のフォーマットである。
【００７９】
スコアがゼロ（０．０）以上、Ｅ値が０．１より大の場合、質問アミノ酸配列は本発明のデフェンシンである。
【００８０】
ＰＦＡＭデータベースは更に、Ｂａｔｅｍａｎら （２００４） “Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ３２ （Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ） ｐｐ． Ｄ１３８−Ｄ１４１に記載されている。
【００８１】
実施例２
髄膜炎における合成デフェンシンのＣＳＦ浸透および殺菌効果
ペニシリン耐性の血清型９Ｖストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）の分離株は、髄膜炎に罹患した７８歳女性のＣＳＦから初めて分離されたものであり、髄膜炎モデルにおいて使用された。この菌株はかつてモキシフロキサシンによる髄膜炎治療効果の評価に用いられた（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、 “モキシフロキサシンの評価、新規な８−メトキシキノロン、ウサギのペニシリン耐性肺炎球菌に起因する髄膜炎の治療（Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits）”， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ｖｏｌ． ４２（７）， ｐｐ． １７０６−１７１２ （１９９８）を参照）。
【００８２】
上記菌株の毒性は、バクテリアをマウス腹膜炎モデルを通すことで強くなった。腹水からサンプリングしたバクテリアを血液寒天培地で成長させ、回収し、牛肉培養液中で１０％グリセロールで希釈し、−８０℃で凍結した。
【００８３】
バクテリアのアリコートを解凍し、血液寒天培地で成長させ、無菌の牛肉培養液に懸濁させ、５４０ｎｍでの光学濃度を３．５とし、希釈して最終濃度を１−２×１０6ＣＦＵ／ｍｌとした。
【００８４】
実験で使用した合成デフェンシンは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。実施例では、この合成デフェンシンは「Ｍｅｎｉｎｇｉｃｉｎ」と称する。ストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）に対するＭｅｎｉｎｇｉｃｉｎの最小発育阻止濃度は０．２５μｇ／ｍｌであった。
【００８５】
効果研究において、髄膜感染症の除去におけるＭｅｎｉｎｇｉｃｉｎの有効性を、ペニシリン耐性株を有する肺炎球菌性髄膜炎に罹患した患者の治療によく用いられる抗生物質であるセフトリアキソンのそれと比較し、また、治療薬を与えない（「ビヒクル」）場合の効果と比較した。セフトリアキソンのストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）に対するＭＩＣは０．５ μｇ／ｍｌであった。
【００８６】
Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓモデル
体重約２５００ｇの、オスのニュージーランド白ウサギを実験に使用した。上記ウサギは、順応のため、実験の１−２週間前に施設に到着した。これらは干し草で覆われたシングルケージに保管し、食物と水を自由に与えた。研究所では獣医の専門知識を得ることができ、実験計画は研究所の動物法制委員会に承認された。
【００８７】
定位固定装置中での固化の準備
上記ウサギの体重を量り、ドルミカム０．５ｍｌ／ｋｇ（ミダゾラム５ｍｇ／ｍｌ） ｓ．ｃ．、１０分後にヒプノルム（hypnorm） ０．３５ｍｌ／ｋｇ（フェンタニルクエン酸＋フルアニソン） ｉ．ｍ．で麻酔を行った。
【００８８】
耳、頭皮および首の毛をそり、皮膚を消毒した。前額部を約２ｃｍ切開し、鈍的切開により頭皮を露出した。４つの掘削孔をあけ四角形を画定し、４つのねじを表面に対し垂直に締め付けた（２．５から３回）。アクリル製ヘルメットを歯科用鋳造材料から直接ウサギの頭皮の上に成形し、流水で冷却した。ウサギをケージに戻し、餌と水を自由に与え、非感染ウサギの細菌接種の時間、または薬物動態治療研究の開始まで８−１０時間休ませた。ブプレノルフィン０．１ ｍｇ／ｋｇで鎮痛した。
【００８９】
細菌接種
メニンジシン（Meningicin）を用いた治療実験の前夜１０時に、上記ウサギに再度麻酔をかけた。ウサギの頭を定位固定フレームに固定し、脊髄カニューレを大槽に導入し、肺炎球菌を１×１０5ＣＦＵ接種した。細菌接種の後、ウサギはケージに戻し、さらに８時間、餌と水を与えた。ブプレノルフィン０．１ ｍｇ／ｋｇで鎮痛した（備考：非感染ウサギには細菌接種は行っていない）。
【００９０】
薬物動態研究および効果研究の手順
ウレタン３．５ ｍｌ／ｋｇ （ジメチルアクリル酸（dimethyl-acrylat） ５０％、１．７５ ｇ／ｋｇ） ｓ．ｃ．を用いて、上記ウサギに再度麻酔をかけた。静脈カテーテルを左耳静脈に適用し、メブマール約０．５−１ｍｌ（ペントバルビタール５０ｍｇ／ｍｌ） ｉ．ｖ．をゆっくりと、ウサギが眠り、深く麻酔状態になるまで注入した。三方活栓を静脈カテーテルおよび補助麻酔としてペントバルビタールを含むシリンジに取り付け、等張ＮａＣｌおよびヘパリン１ＵＩ／ｍｌをフラッシング用にタップに取り付けた。ウサギを半時間毎に観察した。補助麻酔が必要になったら、メブマール０．２ｍｌ（ペントバルビタール５０ｍｇ／ｍｌ）を追加した。実験の間、実験動物部門のスキームおよび実験動物査察の基準に基づき観察および麻酔を記録した。
【００９１】
動脈カニューレを右耳の動脈に適用し、実験中の血液のサンプリングに利用した。ボルトをアクリル製ヘルメットに組込まれたターンバックルに締め付け、ウサギの頭を定位固定フレームに固定した。ウサギは実験の間中固定されたままだった。
【００９２】
大槽を脊髄カニューレで穿刺し、定位固定フレームに固定した。実験中カニューレは所定の位置に残し、ＣＳＦサンプリングに利用した。
【００９３】
実験の適切な時点で、血液１ｍｌおよびＣＳＦ０．３ｍｌを動脈カニューレ／脊髄から吸引し、ＥＤＴＡ−チューブ／エッペンドルフ−チューブに移した。最後のサンプリングの後、実験を終了し、ウサギをメブマール（ペントバルビタール２００ｍｇ／ｍｌ）過剰投与で殺処分した。
【００９４】
解析
メニンジシンのＣＳＦおよび血漿濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。接種材料およびサンプル中の細菌濃度を評価するにあたっては、連続１０倍希釈物（試験物質２０μｌが必要）を、血液寒天培地上に５０μｌのスポットとして用いてＣＦＵ／ｍｌの計算を行った。
【００９５】
薬物動態研究の詳細
メニンジシン（投薬量は各２０、４０、および４０ｍｇ／ｋｇ）を上記三方活栓を通し、実験開始から１０分間かけて静脈内ボーラス投与した。
【００９６】
炎症を起こした髄膜のメニンジシン通過の研究に使用したウサギを上述の通り感染させ、細菌接種１０時間後にメニンジシン点滴投与を行った。２グループのウサギを用いて浸透研究を行い、炎症を起こした髄膜および炎症を起こしていない髄膜を通して３種の投与量で評価した。メニンジシンの投与から０、１／４、１／２、１、１・１／２、２、３、４、５および６時間後に血液およびＣＳＦをサンプリングし、メニンジシンの濃度を測定した（ＨＰＬＣ）。メニンジシンに関して観察されたＭＩＣおよび薬物動態に基づき、治療臨床試験の投与計画を確立した。
【００９７】
薬効研究の詳細
脊髄カニューレをつけ、ＣＳＦ０．５ｍｌをシリンジに吸引した。０．１ｍｌを使用して接種前に細菌を溶解し、その後０．２ｍｌを使用して、シリンジとカニューレを洗浄した。接種の連続１０倍希釈により、感染用量を確認した。
【００９８】
メニンジシンまたはセフトリアキソンを用いた治療を細菌接種の１０時間後に開始した。血液および脳脊髄液のサンプリングを、抗生物質の静脈投与の０、１、３、５、６および１０時間後に行った。抗生物質の濃度および細菌数を測定した。
【００９９】
薬物動態の結果
上述の通り、メニンジシンは２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇの量を投与した。感染したウサギの血清中のメニンジシン濃度を測定し、「曲線下の面積（area under the curve）」（ＡＵＣ血清）を計算した。同様に、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のメニンジシン濃度を測定し、「曲線下の面積」（ＡＵＣ ＣＳＦ）を計算した。
【表１】
【０１００】
有効性研究の結果
有効性研究を３連で行った。用量４０ｍｇ／ｋｇのメニンジシンを時間＝０で投与し（治療の開始）、５時間後にまた用量２０ｍｇ／ｋｇのメニンジシンを投与した。セフトリアキソン（１２５ｍｇ／ｋｇ、時間＝０の時）を陽性対照として使用した。下表は脳脊髄液中の細菌負荷を示す。
【表２】
【０１０１】
下表は、治療時の脳脊髄液中の細菌負荷（Δ log CFU）減少を示す。データは時間＝０で０．００から始まるように標準化されている。
【０１０２】
結果は、髄膜炎治療におけるメニンジシンの非常に高い有効性を実証している。メニンジシンの有効性は、少なくともセフトリアキソンの有効性と同等である。
【表３】
【表４】
【表５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デフェンシンポリペプチドを用いた髄膜炎の治療に関する。
【０００２】
配列表に関する参照
本願は、コンピュータで読み取り可能な形式の配列表を含む。該コンピュータで読み取り可能な形式は、参照により本明細書に組込まれる。
【背景技術】
【０００３】
髄膜炎は、総称して髄膜として知られる、中枢神経系を覆う保護膜の炎症である。髄膜炎は多くの要因、最も顕著なものとしてはバクテリアやウィルス、に対する応答として発症する場合がある。髄膜炎は、炎症が脳および脊髄に近接していることから、将来的に深刻な状態となりうる。深刻な神経障害、更には死の可能性すらあることから、速やかな治療および医学的評価が求められる。細菌性髄膜炎は通常抗生物質で治療し、十分な観察が必要である。数多くの微生物が細菌性髄膜炎の原因となる可能性があるが、ストレプトコッカス ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（肺炎球菌（pneumococcus））およびネイセリア メニジチジス（Neisseria meningitidis）（髄膜炎菌（meningococcus））は、免疫欠損のない患者に最も共通した病原体である。細菌性髄膜炎は、全世界で推計年１７１０００人の死者をもたらす、健康に対する地球規模の脅威である。
【０００４】
ストレプトコッカス ニューモニエは、幼児の侵襲性細菌感染の原因として広がりをみせている生物である。ニューモコッカル メニンジチス（pneumococcal meningitis）による子供の死亡率は、髄膜炎菌性髄膜炎（meningococcal meningitis）によるものの少なくとも2倍であり、生存者の後遺症発生率は高い。５歳未満の子供の肺炎球菌性髄膜炎発生率に関するヨーロッパ各国からのデータが、最近の研究で報告されている。報告によれば、全体で最も発生率が低いのはフィンランド（０．３／１０００００）で、最も高いのはフランス（１２．０／１０００００）である。ペニシリン耐性肺炎球菌はしばしば多剤耐性であるため、治療には深刻な問題が提起される。マクロライド類への耐性もまた広がっており、地中海地域においては特にその広がりは大きい。
【０００５】
本発明は、髄膜炎の治療にあたり、血液脳関門を通過できるポリペプチドおよびその使用法の提供を目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、合成デフェンシンが肺炎球菌性髄膜炎に対する活性に優れており、細菌性髄膜炎の治療に利用できることを見出した。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、髄膜炎治療用薬剤の製造にあたり、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドの使用を提示する。
【０００８】
第２の態様では、本発明は、髄膜炎治療用の、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドを提示する。
【０００９】
他の態様では、本発明は、治療有効量、例えば抗髄膜炎有効量の、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌活性ポリペプチドを被験者に投与することを含む、髄膜炎の治療方法を提示する。
【００１０】
１の実施態様では、上記ポリペプチドはデフェンシンポリペプチド、好ましくは、ベータ−デフェンシンポリペプチドである。
【００１１】
本発明で言うところの髄膜炎は、細菌性髄膜炎であってよく、好ましくは肺炎球菌性髄膜炎、例えば連鎖球菌、特に好ましくはストレプトコッカス ニューモニエに起因する髄膜炎である。好ましい実施態様では、上記髄膜炎はペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエに起因する。
【００１２】
本発明の使用、または本発明の髄膜炎治療のためのポリペプチドは、以降、「本発明の（による）ポリペプチド」と称する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
抗菌活性：用語「抗菌活性」は、本明細書中では、微生物細胞を殺生、またはその増殖を阻害することのできる活性として定義される。本発明においては、用語「抗菌」は、殺菌の、および／または静菌性の、および／または殺真菌性の、および／または静真菌性の、および／または殺ウィルス性の効果を意味すように意図し、ここで、用語「殺菌の」は細菌細胞を殺すことができることとして理解される。用語「静菌性の」は細菌増殖を阻害することができること、すなわち、細菌細胞の増殖を阻害することとして理解される。用語「殺真菌性の」は真菌細胞を殺すことができることとして理解される。用語「静真菌性の」は真菌の増殖を阻害できること、すなわち、真菌細胞の増殖を阻害することとして理解される。用語「殺ウィルス性の」は、ウィルスを不活性化できることとして理解される。用語「微生物細胞」は、細菌のまたは真菌の細胞（酵母を含む）を示す。
【００１４】
本発明において、用語「微生物細胞の増殖阻害」は、細胞が非増殖状態にあること、すなわち、細胞が増殖できないことを意味するように意図したものである。
【００１５】
好ましい実施態様では、「抗菌活性」の語は、殺菌の、および／または静菌性の活性を意味する。より好ましくは、「抗菌活性」は、連鎖球菌、より好ましくはストレプトコッカス ニューモニエに対する殺菌の、および／または静菌性の活性として定義される。
【００１６】
本発明の目的には、抗菌活性はレーラーら（Lehrer et al., Journal of Immunological Methods, Vol. 137 (2) pp. 167-174 (1991 )）の記載した方法に従って測定してよい。あるいは、抗菌活性は、ＣＬＳＩ（臨床検査標準協会（Clinical and Laboratory Standards Institute）; 旧名称は米国臨床検査標準委員会（National Committee for Clinical and Laboratory Standards））からのＮＣＣＬＳガイドラインに従って測定してもよい。
【００１７】
抗菌活性を有するポリペプチドは、ストレプトコッカス ニューモニエ（ＡＴＣＣ ４９６１９）の生細胞数を、抗菌活性を有するポリペプチド濃度５００μｇ／ｍｌ；好ましくは２５０μｇ／ｍｌ；より好ましくは１００μｇ／ｍｌ；さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ；最も好ましくは２５μｇ／ｍｌ；特に好ましくは１０μｇ／ｍｌ、３７℃の関連微生物増殖基質中、８時間（好ましくは４時間、より好ましくは２時間、より好ましくは１時間、特に好ましくは３０分）のインキュベーション後に１／１００に減少させることができる場合がある。
【００１８】
抗菌活性を有するポリペプチドはまた、関連微生物増殖基質中、３７℃、８時間で、濃度５００μｇ／ｍｌ；好ましくは２５０μｇ／ｍｌ；より好ましくは１００μｇ／ｍｌ；さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ；最も好ましくは１０μｇ／ｍｌ；特に好ましくは５μｇ／ｍｌで加えた時、ストレプトコッカス ニューモニエ（ＡＴＣＣ ４９６１９）の増殖を阻害できる場合がある。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドの抗菌活性の少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％、および、さらに好ましくは、少なくとも１００％を有する。
【００２０】
デフェンシン：用語「デフェンシン」は、本明細書中では、デフェンシンクラスの抗菌ペプチドに属するものとして当業者が認めるポリペプチドを指す。あるポリペプチドが本発明のデフェンシンであるかどうかの決定には、自由に入手できるＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて、アミノ酸配列を、ＰＦＡＭデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較することが好ましい（実施例１参照）。
【００２１】
ＰＦＡＭデフェンシンファミリーにはデフェンシン＿１、すなわち「哺乳類デフェンシン」（受託番号ＰＦ００８７９）、デフェンシン＿２、すなわち「節足動物デフェンシン」（受託番号ＰＦ０１０９７）、デフェンシン＿ベータ、すなわち「ベータデフェンシン」（受託番号ＰＦ００７１ １）、デフェンシン＿ｐｒｏｐｅｐ、すなわち「デフェンシンプロペプチド」（受託番号ＰＦ００８７９）、およびガンマ−チオニン、すなわち「ガンマ−チオニンファミリ」（受託番号ＰＦ００３０４）が含まれる。
【００２２】
上記デフェンシン類はアルファ−デフェンシンクラス、ベータ−デフェンシンクラス、シータ−デフェンシンクラス、昆虫または節足動物デフェンシンクラス、または植物デフェンシンクラスに属しうる。
【００２３】
１の実施態様では、本発明のデフェンシンのアミノ酸配列は、４、５、６、７、または８のシステイン残基、好ましくは、４、５、または６のシステイン残基、より好ましくは４または６のシステイン残基、最も好ましくは６のシステイン残基を含む。
【００２４】
上記デフェンシン類は、上記デフェンシンクラスのいずれの特徴を有する合成デフェンシンであってもよい。
【００２５】
こうしたデフェンシンには例えば、α−デフェンシンＨＮＰ−１（ヒト好中球ペプチド）ＨＮＰ−２およびＨＮＰ−３；β−デフェンシン−１２、ドロソマイシン（Drosomycin）、ヘリオマイシン（Heliomicin）、γ１−プロチオニン（purothionin）、昆虫デフェンシンＡ、およびＰＣＴ出願 ＷＯ ９９／５３０５３、ＷＯ ０２／０６３２４、ＷＯ ０２／０８５９３４、ＷＯ ０３／０４４０４９、ＷＯ ２００６／０５０７３７およびＷＯ ２００６／０５３５６５に開示されたデフェンシン類が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
単離ポリペプチド：用語「単離変異体（isolated variant）」または「単離ポリペプチド」は、本明細書中では、ソースから単離した変異体またはポリペプチドを言う。１の態様では、上記変異体またはポリペプチドの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定で、少なくとも１％、好ましくは、少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも６０％、さらに好ましくは、少なくとも８０％、そして、最も好ましくは、少なくとも９０％である。
【００２７】
実質的に純粋なポリペプチド：用語「実質的に純粋なポリペプチド」は、本明細書中では、天然にまたは組み換え技術によって結合した他のポリペプチド物質を重量％で最大１０％、好ましくは最大８％、より好ましくは最大６％、より好ましくは最大５％、より好ましくは最大４％、より好ましくは最大３％、さらに好ましくは最大２％、最も好ましくは最大１％、およびさらに好ましくは最大０．５％を含むポリペプチド標品をさす。よって、上記実質的に純粋なポリペプチドは、上記標品中に存在する全ポリペプチド物質に対し少なくとも９２重量％の純度、好ましくは少なくとも９４重量％の純度、より好ましくは少なくとも９５重量％の純度、より好ましくは少なくとも９６重量％の純度、より好ましくは少なくとも９６重量％の純度、より好ましくは少なくとも９７重量％の純度、より好ましくは少なくとも９８重量％の純度、さらに好ましくは少なくとも９９重量％の純度、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％の純度、およびさらに好ましくは１００重量％の純度である。本発明のポリペプチドは、実質的に純粋な形であることが望ましい。このことは、例えば、周知の組み換え方法や標準的な精製法でポリペプチドを調製することによって実現できる。
【００２８】
同一性：２のアミノ酸配列の関連性や２のヌクレオチド配列の関連性は「同一性」パラメータで記述される。
【００２９】
本発明の目的には、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６： ２７６−２７７； http://emboss.org）のＮｅｅｄｌｅプログラムで使用されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３）を用いて決定される。任意のパラメータとして、ギャップオープンペナルティ（gap open penalty）１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５（gap extension penalty）、および、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＥＭＢＯＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＢＬＯＳＵＭ６２）置換マトリクスが使用される。「最長同一性（longest identity）」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力（-ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）は、同一性のパーセント（percent identity）として使用され、次のように計算される：
（同定残基×１００）／（アライメント長−アライメント中の全ギャップ数）
【００３０】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， 上記参照； http://emboss.org）のＮｅｅｄｌｅプログラムで使用されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， 上記参照）を用いて決定される。ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＥＭＢＯＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４）置換マトリクスが任意のパラメータとして使用される。「最長同一性」として標識されたＮｅｅｄｌｅの出力は、同一性のパーセントとして使用され、次のように計算される：
（同定デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アライメント長−アライメント中の全ギャップ数）
【００３１】
対立遺伝子変異体：用語「対立遺伝子変異体（allelic variant）」は、本明細書中では、同じ染色体の座を占める遺伝子の、２以上の代替形状のいずれかを示す。対立遺伝子変異体は天然には突然変異を通じて発生し、集団内部での多様性をもたらす。遺伝子の突然変異は沈黙状態（コードされたポリペプチドの変化なし）のこともあり、また、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合もある。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされたポリペプチドである。
【００３２】
修飾：用語「修飾」は、本明細書中では、配列番号１のアミノ酸配列から成るポリペプチドの化学修飾を意味し、そのポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作も同様に意味する。修飾は、アミノ酸の置換、欠失、および／またはアミノ酸側鎖の挿入およびアミノ酸側鎖の置換；または、アミノ酸配列内における、類似の性質を持つ非天然アミノ酸の使用であってよい。特に、修飾はＣ末端のアミド化などのアミド化であってよい。
【００３３】
抗菌活性を有するポリペプチド
第1の態様では、本発明は、抗菌活性を有する、配列番号１との同一性の程度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、および、特に少なくとも97%のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド（以下、「同種ポリペプチド（homologous polypeptides）」）に関する。好ましい態様では、上記同種ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と最大６アミノ酸まで、好ましくは最大５アミノ酸まで、より好ましくは最大４アミノ酸まで、さらに好ましくは最大３アミノ酸まで、最も好ましくは最大２アミノ酸まで、および 特に１アミノ酸まで異なるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本発明のポリペプチドは、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体を含む。好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含む。他の好ましい態様では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列またはその対立遺伝子変異体から成る。他の好ましい態様では、ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００３５】
好ましくは、アミノ酸の変化はわずかなもの、すなわち、保存アミノ酸置換または挿入であって、ポリペプチドの折りたたみや活性に重大な影響を与えないもの；単一欠失；アミノ−またはカルボキシル−末端の小規模延長；最大２０−２５残基の小さなリンカーペプチド；または、正味の電荷や他の機能を変化させることで純化を促進させる、小規模の延長であって、例えばポリヒスチジンタグ、抗原エピトープ、または結合ドメインなどである。
【００３６】
保存置換の例としては、塩基性アミノ酸 （アルギニン、リジン、およびヒスチジン）、 酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、およびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシン）、および小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、およびメチオニン）のグループ内部でのものがある。特定の活性を通常変化させないアミノ酸置換技術は既知であり、例えば、Ｈ． Ｎｅｕｒａｔｈ ａｎｄ Ｒ．Ｌ． Ｈｉｌｌ， １９７９， Ｉｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的な変換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、および Ａｓｐ／Ｇｌｙである。
【００３７】
２０の標準アミノ酸に加え、非標準アミノ酸（４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリジン、２−アミノイソブチル酸、イソバリン、および、アルファ−メチルセリンなど）が、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基を置換してもよい。限定数の非保存アミノ酸、遺伝子コードでコードされないアミノ酸、および非天然アミノ酸でアミノ酸残基を代替してよい。「非天然アミノ酸」はタンパク質合成後に修飾され、および／またはその側鎖に標準アミノ酸とは異なる化学構造を有する。非天然アミノ酸は化学合成され、好ましくは商業的に入手できるものであり、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−および４−メチルプロリン、および３，３−ジメチルプロリンが含まれる。
【００３８】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異やアラニンスキャン変異（alanine-scanning mutagenesis）など既知の手段で同定することがでる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５）。後者の技術では、単一のアラニン変異を分子内の残基毎に導入し、得られた変異分子の生物活性（例えば抗菌活性）を試験し、分子の活性に必須なアミノ酸残基を特定する。Ｈｉｌｔｏｎら， １９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１： ４６９９−４７０８も参照。生物学的相互作用もまた、想定される接触部位アミノ酸の突然変異と関連し、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、または光親和性標識のような技術で測定できるのと同様に、構造の物理解析で求めることができる。例えば、ｄｅ Ｖｏｓら， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２； Ｓｍｉｔｈら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４： ８９９−９０４； Ｗｌｏｄａｖｅｒら， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３０９：５９−６４を参照。必須アミノ酸の同一性もまた、本発明のポリペプチドに関連したポリペプチドとの同一性解析から推定することができる。
【００３９】
突然変異、組み換え、および／またはシャッフリングの既知の方法を用いて単一のまたは複数のアミノ酸置換を行い、テストし、下記文献に開示されたスクリーニング法を適用した：Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ５３−５７； Ｂｏｗｉｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２１５２−２１５６； ＷＯ ９５／１７４１３； またはＷＯ ９５／２２６２５。他に使用することのできる方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば，Ｌｏｗｍａｎら， １９９１， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０８３２−１０８３７； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２２３，４０９； ＷＯ ９２／０６２０４）、および領域特異的変異（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら， １９８６， Ｇｅｎｅ ４６：１４５； Ｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＤＮＡ ７：１２７）がある。
【００４０】
突然変異／シャッフリング法は、スループットの高い自動スクリーニング法と組合せ、ホスト細胞によって発現された突然変異ポリペプチドのクローンの活性を測定することができる。活性ポリペプチドをエンコードする突然変異ＤＮＡ分子をホスト細胞から回収し、従来技術を用いて速やかに配列を定めることができる。これらの方法によれば、興味あるポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を速やかに決定することができ、未知の構造を有するポリペプチドに適用することができる。
【００４１】
好ましい実施態様では、本発明のポリペプチドはデフェンシンポリペプチドであり、好ましくは、ベータ−デフェンシンポリペプチドである。
【００４２】
Ｎ−末端伸長
本発明のポリペプチドのＮ−末端伸長は、１−５０のアミノ酸から、好ましくは２−５０のアミノ酸から、特に３−１５のアミノ酸から成ってよい。１の実施態様では、Ｎ−末端ペプチド伸長には、Ａｒｇ（Ｒ）は含まれない。他の実施態様では、Ｎ−末端伸長は、以下で更に定義される、ｋｅｘ２またはｋｅｘ２類似の切断部位を含む。好ましい実施態様では、Ｎ−末端伸長はＥＡＥ、ＥＥ、ＤＥ、およびＤＤの配列の１つを含むＮ−末端伸長など、少なくとも２のGlu (E)および／または Asp (D)を含むペプチドである。
【００４３】
Ｋｅｘ２サイト
Ｋｅｘ２サイト（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ １８５， ｅｄ． Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． （１９９０）， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， “Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”を参照）およびｋｅｘ２様部位は、二塩基認識部位（例えば切断部位）であって、いくつかのタンパク質のプロペプチドエンコード領域と成熟領域の間に見出される。
【００４４】
ｋｅｘ２またはｋｅｘ２様サイトの挿入により、場合によっては、プロペプチド切断部位におけるエンドペプチダーゼプロセッシングの正確さが向上することが示され、その結果、タンパク質分泌レベルが上昇する。
【００４５】
本発明においては、ｋｅｘ２またはｋｅｘ２様サイトの挿入によって、Ｎ末端伸長の特定の部位における切断が可能となり、その結果、配列番号１で示される成熟ポリペプチドと比較して伸長した抗菌ポリペプチドが得られることとなる。
【００４６】
融合ポリペプチド
さらに本発明のポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントのNまたはC末端に融合した、融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドを含む。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本発明のヌクレオチド配列（またはその部分）に融合させることで製造される。融合ポリペプチドの製造技術は公知であり、ポリペプチドをコードするコーディング配列のライゲーション（ligation）を含み、そうすることで、それらの骨格ができ、同じプロモータおよびターミネータの制御下に融合ポリペプチドが発現する。
【００４７】
方法と使用
本発明は、髄膜炎治療用のポリペプチドの使用に関する。従って、本発明のポリペプチドは、抗菌性の、動物またはヒトの治療または予防薬に使用することができる。すなわち、本発明のデフェンシン変異体は、髄膜炎治療のための、動物またはヒト用の治療または予防薬として使用することができる。
【００４８】
本発明のポリペプチドは、連鎖球菌、例えばストレプトコッカス ニューモニエの成長を停止または阻害するに十分な量使用することができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドの製剤は髄膜炎、例えば細菌性髄膜炎に罹患した、または罹患しやすい宿主へ投与される。１の実施態様では、髄膜炎は、ペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエへの感染に起因する。
【００５０】
投与は局所または全身に行われる。通常、本発明の抗菌ポリペプチドの投与量は、微生物個体群を、少なくとも１ログまで、および２ログまたはそれ以上まで減少させるに十分な量であろう。本発明のポリペプチドは、副作用を最小に抑えながら、微生物個体群を減少させる量投与される。生体への使用に関し、内科医の指導のもとに得られた配合が使用されるものと考えられる。
【００５１】
様々な投与法が使用される。ポリペプチド製剤は経口で、または経脈管的に、筋肉に、皮下に、腹膜に、噴霧器で、眼胞に、膀胱に、経皮的に、等投与してよい。治療用製剤の投与量は、投与される殺菌ポリペプチド、投与頻度、投与方法、宿主からの剤のクリアランス等によって大きく変化する。初期投与量は多めに、以降の維持投与量は少なめにしてよい。多くの場合、経口投与では、静注より必要な投与量は多くなる。アミド結合のほかに、アミノ末端やカルボキシ末端もまた、経口投与の安定性を大きくするように修飾してよい。例えば、カルボキシ末端はアミド化してよい。
【００５２】
製剤
本発明のポリペプチドは、治療学的投与のために種々の製剤に導入することができる。より具体的には、本発明のポリペプチドは、適当な、医薬的に許容される担体や希釈剤と組合せて医薬組成物に製剤化することができ、また、錠剤、カプセル剤、散剤、ガス状、軟膏剤、水剤、坐剤、注射剤、吸入剤、及びエーロゾル剤などの固体、半固体、液体、又はガス状の形態の調製物に製剤化することができる。 このようにして、薬剤の投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む種々の方法で行うことができる。本発明の抗菌ポリペプチドは、投与後全身性となり得、または局在化されうる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、単独で、互いに組み合わせて、または他の既知の化合物（例えば、パーフォリン、抗炎症剤、抗生物質、等）と組合せて使用される。薬学的剤型では、ポリペプチドはその薬学的に許容される塩の形で投与することができる。以下の方法及び賦形剤は単に代表例であり、何ら限定するものではない。
【００５４】
経口調製物としては、ポリペプチドを単独で、又はラクトース、マニトール、コーンスターチ又はポテトスターチなど従来の適当な添加物と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤と；コーンスターチ、ポテトスターチ、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と；また、必要な場合には希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、及び香味剤と組み合わせて、錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤を作ることができる。
【００５５】
ポリペプチドは、植物又は他の同様のオイル、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸又はプロピレングリコールのエステルなど水性又は非水性溶媒中で、また、所望する場合には、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、及び保存剤などの慣用的な添加剤などとともに溶解、懸濁、又は乳化することにより、注射用の調製物に製剤化することができる。
【００５６】
ポリペプチドはエアロゾル製剤として、吸入投与することができる。本発明のポリペプチドは、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、許容される噴射剤の加圧噴射剤に製剤化することができる。
【００５７】
さらに、ポリペプチドは、乳化基剤又は水溶性基剤などの種々の基剤と混合することにより、坐剤にすることができる。本発明のポリペプチドは坐剤により直腸投与することができる。坐剤にはビヒクルが含まれる。坐剤は、体温で溶け、かつ、さらに室温で固体化するカカオ脂、カーボワックス、及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【００５８】
シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁剤などの経口又は直腸投与用の単位剤形を提供することができ、各投薬単位、例えば、ティースプーンフル、テーブルスプーンフル、錠剤、又は坐剤、は1つ以上の阻害剤を含有する所定量の組成物を含む。同様に、注射又は静脈内投与用の単位剤形は、滅菌水、通常の生理食塩水、又は別の薬学的に許容される担体中の溶液としての組成物中に本発明のポリペプチドを含む。
【００５９】
徐放性製剤用のインプラントは公知の技術である。インプラントは、生分解性または非生分解性ポリマーなどを用いて、マイクロスフェアやスラブなどとして製剤化される。例えば、乳酸および／またはグリコール酸は、宿主による忍容性良好な浸食性ポリマーを形成する。本発明の抗菌ポリペプチドを含むインプラントは、感染領域に隣接して配置することで、体の残りの部分と比較して、活性剤の局所濃度が上昇する。
【００６０】
本明細書に用いられる用語「単位剤形」は、ヒト及び動物被検体用の単位用量として好適な物理的に区別される単位をいい、各々の単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルに関連して所望の効果を生じるのに十分な量で計算された所定量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規な単位剤形のための特定は、用いる特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主中での各化合物に関連する薬力学に依存する。
【００６１】
ビヒクル、補助剤、担体、又は希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤は、一般の人が容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助物質は、一般の人が容易に入手可能である。
【００６２】
全身投与に対する典型的な投薬量としては、患者の体重１ｋｇあたり投与毎に、０．１ｐｇから１００ｍｇである。典型的な投薬量は、１錠を１日に２〜６回、または比例して活性成分量の多いタイムリリースカプセルまたは錠剤を１日にひとつ、であってよい。タイムリリース効果は、種々のｐＨ値で溶解するカプセル材料によって、浸透圧によって徐々に放出するカプセルによって、または任意の既知の制御放出手段によって得ることができる。
【００６３】
投与量レベルは、特定の化合物、症状の重症度、及び副作用に対する被検体の感受性の関数として変動することができることを当業者は容易に理解するだろう。所定の化合物の好ましい投与量は、種々の手段により当業者が容易に決定できる。好ましい手段は、所定のポリペプチドの生理学的効力を測定することである。
【００６４】
輸送手段としてのリポソームの使用は、興味ある方法の１つである。リポソームは標的部位の細胞と融合し、内腔の内容物を細胞内に移送する。リポソームと細胞との融合する時間が十分とれるように、単離、結合剤など、接触を維持する様々な方法を用いて、接触が維持される。本発明の１の態様では、リポソームは経肺投与用にエアロゾルとしてデザインされる。リポソームは、センダイウィルスやインフルエンザウィルスなど、膜融合を媒介する、精製タンパク質またはペプチドを用いて調製してよい。上記脂質は、既知のリポソーム形成脂質の任意の有用な組合せであってよく、ホスファチジルコリンなど、カチオンや両性イオン脂質が含まれる。残存脂質は通常中性または酸性脂質であり、例えば、コレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどである。
【００６５】
リポソームの調製には、Ｋａｔｏら、（１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：３３６１に記載の手順を使用してよい。簡単にいえば、脂質とペプチドを含有する内腔組成物を適当な水性媒質中で混合する。水性媒質としては、全固形物が約１から１０重量％の範囲内にある生理食塩水が便利である。５−６０秒の短時間の強い撹拌の後、管を約２５−４５℃の温水槽中に配置し、このサイクルを５−１０回繰り返す。続いて、都合のよい時間、通常約１−１０秒間、上記組成物を超音波で分解し、さらに渦撹拌してよい。続いて水性媒体を加えて、通常約１−２倍に体積を増加させ、その後振盪し冷却を行う。上記方法によって、高分子量分子の内腔への取込みが可能になる。
【００６６】
他の活性薬剤との製剤
本方法に使用するために、本発明の抗菌ポリペプチドを薬学的に活性な他の薬剤、特に他の抗菌剤と製剤化してよい。興味のある他の薬剤として、広範囲の抗生物質がこの技術分野で知られている。抗生物質のクラスには、例えばペニシリンG、ペニシリンV、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなどのペニシリン類；ベータラクタマーゼ阻害剤であるセファクロア（cefaclor）、セファゾリン、セフロキシム、モクサラクタムなどのセファロスポリン類と組合せたペニシリン類；カルバペネム類；モノバクタム類；アミノグリコシド類；テトラサイクリン；マクロライド類；リンコマイシン類；ポリミキシン類；スルホンアミド類；キノロン類；クロラムフェニコール類;メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等が挙げられる。
【００６７】
抗真菌薬も有用でり、アムホテリシンＢ、ナイスタチン；５−フルコシンなどのポリエン類；および、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾールなどのアゾール類が含まれる。抗結核薬にはイソニアジド、エタンブトール、ストレプトマイシンおよびリファンピンが含まれる。例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１２などのサイトカインも、本発明の抗菌ポリペプチドの製剤に含まれてよい。
【００６８】
インビトロ合成
本発明のポリペプチドは、当該技術分野で既知の一般的な方法を用いて、インビトロ合成により調製してよい。様々な市販の合成装置、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．やＢｅｃｋｍａｎなどの自動化された合成装置が利用できる。合成装置を用いて、天然に存在するアミノ酸を非天然アミノ酸、特に、例えばＤ−アラニンやＤ−イソロイシンなどのＤ−アイソマー（Ｄ−形）、ジアステレオマー、異なった長さや機能を有する側鎖などで置換してもよい。具体的な配列や調製方法は便宜性、経済性、必要な純度等によって決定される。
【００６９】
化学結合は、例えば還元的アミノ化など置換アミン生成のためのアミノ基、チオエーテルやジスルフィド生成のためのチオール基、アミド生成のためのカルボキシル基など、結合に便利な官能基を有する種々のペプチドやタンパク質に対して行われる。
【００７０】
必要な場合には、合成や発現の過程で種々の基がペプチドに導入されてよく、これによって、他の分子や表面に結合を形成することが可能となる。すなわち、システインを用いればチオエーテルができ、ヒスチジンを用いれば金属イオン錯体との結合ができ、カルボキシル基を用いればアミドやエステルが形成され、アミノ基を用いればアミドが形成される、などである。
【００７１】
ポリペプチドは、従来の組み換え合成法に従って、単離・精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製し、ＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィ、または他の精製技術を用いて精製してよい。主として、使用される組成物は、望みの生成物を、少なくとも２０重量％、より一般的には少なくとも７５重量％、好ましくは、少なくとも９％重量％含み、治療目的には、製品の製造と精製の方法に関連する混入物質に関連し、通常少なくとも約９９．５重量％含む。通常、パーセンテージは全タンパク質を基礎としている。
【００７２】
本発明は更に、以下の実施例で説明されるが、これによって本発明の範囲が限定されると解釈すべきではない。
【実施例】
【００７３】
実施例１
ＰＦＡＭデータベースのＨＭＭファイルを用いたデフェンシンの同定
隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）を用いた配列解析は、インターネット上オンラインで行ってもよく、ローカルのコンピュータ上で、無料で利用できる周知のＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージを用いて行ってもよい。現在のバージョンは２００３年１０月からのＨＭＭＥＲ ２．３．２である。
【００７４】
ＨＭＭプロファイルは周知のＰＦＡＭデータベースから得ることができる。現在のバージョンは２００４年１１月からのＰＦＡＭ １６．０である。ＨＭＭＥＲとＰＦＡＭは両方とも、例えば、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ （ＵＳＡ）， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ およびｈｔｔｐ：／／ｈｍｍｅｒ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）から、すべてのコンピュータプラットフォーム用に入手可能である。
【００７５】
質問アミノ酸配列またはそのフラグメントが以下の５ＰＦＡＭファミリーの１つに属するならば、該アミノ酸配列は、本発明のデフェンシンである：
−デフェンシン＿ベータまたは“ベータデフェンシン”、受託番号： ＰＦ００７１１；
−デフェンシン＿ｐｒｏｐｅｐまたは“デフェンシンプロペプチド”、受託番号： ＰＦ００８７９；
−デフェンシン＿１または“哺乳類デフェンシン”、受託番号： ＰＦ００３２３；
−デフェンシン＿２または“節足動物デフェンシン”、受託番号： ＰＦ０１０９７；
−ガンマ−チオニンまたは“ガンマ−チオニンファミリ”、受託番号： ＰＦ００３０４．
【００７６】
ＰＦＡＭデータベースをオンラインで使用し、またはｈｍｍｐｆａｍプログラム（ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージから）をローカルで使用し、あるアミノ酸配列が０．１より大きなＥ値、およびゼロ以上のスコアを生成した時は、そのアミノ酸配列はＰＦＡＭファミリーに属する。
【００７７】
配列解析をｈｍｍｐｆａｍプログラムを用いてローカルで行った時、ＰＦＡＭデータベースからＨＭＭプロファイルを入手（ダウンロード）する必要がある。各ファミリーに対して２つのプロファイル、グローカルサーチ用のｘｘｘ＿ｌｓ．ｈｍｍ、およびローカルサーチ用のｘｘｘ＿ｆｓ．ｈｍｍが存在する。これによって上記５ファミリー用に全部で１０プロファイルができる。
【００７８】
この１０プロファイルは個別に使用してよく、また、（テキストエディタを用いて−プロファイルはＡＳＣＩＩファイルである）結合して（付加して）、例えばｄｅｆｅｎｓｉｎ．ｈｍｍといった名前の単一のプロファイルにしてもよい。質問アミノ酸配列は次のコマンドラインを用いて評価することができる：
ｈｍｍｐｆａｍ −Ｅ ０．１ ｄｅｆｅｎｓｉｎ．ｈｍｍ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｌｅ
−ここで、「ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｆｉｌｅ」は上記質問アミノ酸配列を有するファイルであって、ＨＭＭＥＲソフトウェアパッケージで認識できる任意のフォーマットである。
【００７９】
スコアがゼロ（０．０）以上、Ｅ値が０．１より大の場合、質問アミノ酸配列は本発明のデフェンシンである。
【００８０】
ＰＦＡＭデータベースは更に、Ｂａｔｅｍａｎら （２００４） “Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｉｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｖｏｌ． ３２ （Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ） ｐｐ． Ｄ１３８−Ｄ１４１に記載されている。
【００８１】
実施例２
髄膜炎における合成デフェンシンのＣＳＦ浸透および殺菌効果
ペニシリン耐性の血清型９Ｖストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）の分離株は、髄膜炎に罹患した７８歳女性のＣＳＦから初めて分離されたものであり、髄膜炎モデルにおいて使用された。この菌株はかつてモキシフロキサシンによる髄膜炎治療効果の評価に用いられた（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら、 “モキシフロキサシンの評価、新規な８−メトキシキノロン、ウサギのペニシリン耐性肺炎球菌に起因する髄膜炎の治療（Evaluation of moxifloxacin, a new 8-methoxyquinolone, for treatment of meningitis caused by a penicillin-resistant pneumococcus in rabbits）”， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ｖｏｌ． ４２（７）， ｐｐ． １７０６−１７１２ （１９９８）を参照）。
【００８２】
上記菌株の毒性は、バクテリアをマウス腹膜炎モデルを通すことで強くなった。腹水からサンプリングしたバクテリアを血液寒天培地で成長させ、回収し、牛肉培養液中で１０％グリセロールで希釈し、−８０℃で凍結した。
【００８３】
バクテリアのアリコートを解凍し、血液寒天培地で成長させ、無菌の牛肉培養液に懸濁させ、５４０ｎｍでの光学濃度を３．５とし、希釈して最終濃度を１−２×１０6ＣＦＵ／ｍｌとした。
【００８４】
実験で使用した合成デフェンシンは配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。実施例では、この合成デフェンシンは「Ｍｅｎｉｎｇｉｃｉｎ」と称する。ストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）に対するＭｅｎｉｎｇｉｃｉｎの最小発育阻止濃度は０．２５μｇ／ｍｌであった。
【００８５】
効果研究において、髄膜感染症の除去におけるＭｅｎｉｎｇｉｃｉｎの有効性を、ペニシリン耐性株を有する肺炎球菌性髄膜炎に罹患した患者の治療によく用いられる抗生物質であるセフトリアキソンのそれと比較し、また、治療薬を与えない（「ビヒクル」）場合の効果と比較した。セフトリアキソンのストレプトコッカス ニューモニエ（１３９５）に対するＭＩＣは０．５ μｇ／ｍｌであった。
【００８６】
Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓモデル
体重約２５００ｇの、オスのニュージーランド白ウサギを実験に使用した。上記ウサギは、順応のため、実験の１−２週間前に施設に到着した。これらは干し草で覆われたシングルケージに保管し、食物と水を自由に与えた。研究所では獣医の専門知識を得ることができ、実験計画は研究所の動物法制委員会に承認された。
【００８７】
定位固定装置中での固化の準備
上記ウサギの体重を量り、ドルミカム０．５ｍｌ／ｋｇ（ミダゾラム５ｍｇ／ｍｌ） ｓ．ｃ．、１０分後にヒプノルム（hypnorm） ０．３５ｍｌ／ｋｇ（フェンタニルクエン酸＋フルアニソン） ｉ．ｍ．で麻酔を行った。
【００８８】
耳、頭皮および首の毛をそり、皮膚を消毒した。前額部を約２ｃｍ切開し、鈍的切開により頭皮を露出した。４つの掘削孔をあけ四角形を画定し、４つのねじを表面に対し垂直に締め付けた（２．５から３回）。アクリル製ヘルメットを歯科用鋳造材料から直接ウサギの頭皮の上に成形し、流水で冷却した。ウサギをケージに戻し、餌と水を自由に与え、非感染ウサギの細菌接種の時間、または薬物動態治療研究の開始まで８−１０時間休ませた。ブプレノルフィン０．１ ｍｇ／ｋｇで鎮痛した。
【００８９】
細菌接種
メニンジシン（Meningicin）を用いた治療実験の前夜１０時に、上記ウサギに再度麻酔をかけた。ウサギの頭を定位固定フレームに固定し、脊髄カニューレを大槽に導入し、肺炎球菌を１×１０5ＣＦＵ接種した。細菌接種の後、ウサギはケージに戻し、さらに８時間、餌と水を与えた。ブプレノルフィン０．１ ｍｇ／ｋｇで鎮痛した（備考：非感染ウサギには細菌接種は行っていない）。
【００９０】
薬物動態研究および効果研究の手順
ウレタン３．５ ｍｌ／ｋｇ （ジメチルアクリル酸（dimethyl-acrylat） ５０％、１．７５ ｇ／ｋｇ） ｓ．ｃ．を用いて、上記ウサギに再度麻酔をかけた。静脈カテーテルを左耳静脈に適用し、メブマール約０．５−１ｍｌ（ペントバルビタール５０ｍｇ／ｍｌ） ｉ．ｖ．をゆっくりと、ウサギが眠り、深く麻酔状態になるまで注入した。三方活栓を静脈カテーテルおよび補助麻酔としてペントバルビタールを含むシリンジに取り付け、等張ＮａＣｌおよびヘパリン１ＵＩ／ｍｌをフラッシング用にタップに取り付けた。ウサギを半時間毎に観察した。補助麻酔が必要になったら、メブマール０．２ｍｌ（ペントバルビタール５０ｍｇ／ｍｌ）を追加した。実験の間、実験動物部門のスキームおよび実験動物査察の基準に基づき観察および麻酔を記録した。
【００９１】
動脈カニューレを右耳の動脈に適用し、実験中の血液のサンプリングに利用した。ボルトをアクリル製ヘルメットに組込まれたターンバックルに締め付け、ウサギの頭を定位固定フレームに固定した。ウサギは実験の間中固定されたままだった。
【００９２】
大槽を脊髄カニューレで穿刺し、定位固定フレームに固定した。実験中カニューレは所定の位置に残し、ＣＳＦサンプリングに利用した。
【００９３】
実験の適切な時点で、血液１ｍｌおよびＣＳＦ０．３ｍｌを動脈カニューレ／脊髄から吸引し、ＥＤＴＡ−チューブ／エッペンドルフ−チューブに移した。最後のサンプリングの後、実験を終了し、ウサギをメブマール（ペントバルビタール２００ｍｇ／ｍｌ）過剰投与で殺処分した。
【００９４】
解析
メニンジシンのＣＳＦおよび血漿濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。接種材料およびサンプル中の細菌濃度を評価するにあたっては、連続１０倍希釈物（試験物質２０μｌが必要）を、血液寒天培地上に５０μｌのスポットとして用いてＣＦＵ／ｍｌの計算を行った。
【００９５】
薬物動態研究の詳細
メニンジシン（投薬量は各２０、４０、および４０ｍｇ／ｋｇ）を上記三方活栓を通し、実験開始から１０分間かけて静脈内ボーラス投与した。
【００９６】
炎症を起こした髄膜のメニンジシン通過の研究に使用したウサギを上述の通り感染させ、細菌接種１０時間後にメニンジシン点滴投与を行った。２グループのウサギを用いて浸透研究を行い、炎症を起こした髄膜および炎症を起こしていない髄膜を通して３種の投与量で評価した。メニンジシンの投与から０、１／４、１／２、１、１・１／２、２、３、４、５および６時間後に血液およびＣＳＦをサンプリングし、メニンジシンの濃度を測定した（ＨＰＬＣ）。メニンジシンに関して観察されたＭＩＣおよび薬物動態に基づき、治療臨床試験の投与計画を確立した。
【００９７】
薬効研究の詳細
脊髄カニューレをつけ、ＣＳＦ０．５ｍｌをシリンジに吸引した。０．１ｍｌを使用して接種前に細菌を溶解し、その後０．２ｍｌを使用して、シリンジとカニューレを洗浄した。接種の連続１０倍希釈により、感染用量を確認した。
【００９８】
メニンジシンまたはセフトリアキソンを用いた治療を細菌接種の１０時間後に開始した。血液および脳脊髄液のサンプリングを、抗生物質の静脈投与の０、１、３、５、６および１０時間後に行った。抗生物質の濃度および細菌数を測定した。
【００９９】
薬物動態の結果
上述の通り、メニンジシンは２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇおよび８０ｍｇ／ｋｇの量を投与した。感染したウサギの血清中のメニンジシン濃度を測定し、「曲線下の面積（area under the curve）」（ＡＵＣ血清）を計算した。同様に、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のメニンジシン濃度を測定し、「曲線下の面積」（ＡＵＣ ＣＳＦ）を計算した。
【表１】
【０１００】
有効性研究の結果
有効性研究を３連で行った。用量４０ｍｇ／ｋｇのメニンジシンを時間＝０で投与し（治療の開始）、５時間後にまた用量２０ｍｇ／ｋｇのメニンジシンを投与した。セフトリアキソン（１２５ｍｇ／ｋｇ、時間＝０の時）を陽性対照として使用した。下表は脳脊髄液中の細菌負荷を示す。
【表２】
【０１０１】
下表は、治療時の脳脊髄液中の細菌負荷（Δ log CFU）減少を示す。データは時間＝０で０．００から始まるように標準化されている。
【０１０２】
結果は、髄膜炎治療におけるメニンジシンの非常に高い有効性を実証している。メニンジシンの有効性は、少なくともセフトリアキソンの有効性と同等である。
【表３】
【表４】
【表５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
髄膜炎治療用の医薬の製造のための、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗菌活性を有するポリペプチドの使用。
【請求項２】
髄膜炎治療のための抗菌活性を有するポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項３】
髄膜炎を治療する方法であって、治療を必要とする被験者に治療有効量、例えば抗髄膜炎有効量の、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗菌活性を有するポリペプチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、当該ポリペプチドが、配列番号１のポリペプチドを含むか、または配列番号１のポリペプチドからなる、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、ポリペプチド、または方法。
【請求項５】
上記ポリペプチドがデフェンシンポリペプチド、好ましくはベータ−デフェンシンポリペプチドである、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項６】
髄膜炎が細菌性髄膜炎である、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項７】
細菌性髄膜炎が連鎖球菌属の感染に起因する、請求項６に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項８】
細菌性髄膜炎が肺炎球菌性髄膜炎である、請求項６に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項９】
肺炎球菌性髄膜炎がペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエの感染に起因する、請求項８の使用、変異体、または方法。
【請求項１】
髄膜炎治療用の医薬の製造のための、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗菌活性を有するポリペプチドの使用。
【請求項２】
髄膜炎治療のための抗菌活性を有するポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項３】
髄膜炎を治療する方法であって、治療を必要とする被験者に治療有効量、例えば抗髄膜炎有効量の、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗菌活性を有するポリペプチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、当該ポリペプチドが、配列番号１のポリペプチドを含むか、または配列番号１のポリペプチドからなる、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、ポリペプチド、または方法。
【請求項５】
上記ポリペプチドがデフェンシンポリペプチド、好ましくはベータ−デフェンシンポリペプチドである、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項６】
髄膜炎が細菌性髄膜炎である、請求項１〜３いずれか一項に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項７】
細菌性髄膜炎が連鎖球菌属の感染に起因する、請求項６に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項８】
細菌性髄膜炎が肺炎球菌性髄膜炎である、請求項６に記載の使用、変異体、または方法。
【請求項９】
肺炎球菌性髄膜炎がペニシリン耐性ストレプトコッカス ニューモニエの感染に起因する、請求項８の使用、変異体、または方法。
【公表番号】特表２０１１−５１６４５０（Ｐ２０１１−５１６４５０Ａ）
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０２３５９（Ｐ２０１１−５０２３５９）
【出願日】平成２１年３月３０日（２００９．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３７２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１８２８
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月２６日（２０１１．５．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３０日（２００９．３．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５３７２６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２１８２８
【国際公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【出願人】（５１００６２３９８）ノボザイムス アデニウム バイオテック アクティーゼルスカブ (8)
【Ｆターム（参考）】
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