髄膜炎菌性Ｂエピトープの分子模倣物
【課題】Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）の独特なエピトープの分子模倣物を提供すること。
【解決手段】本発明の、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）の独特なエピトープの分子模倣物は上記課題を解決することができる。すなわち、このような分子模倣物を含む組成物を使用して、ＭｅｎＢまたはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、自己抗体応答を惹起するリスクなく、予防し得る。
【解決手段】本発明の、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）の独特なエピトープの分子模倣物は上記課題を解決することができる。すなわち、このような分子模倣物を含む組成物を使用して、ＭｅｎＢまたはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、自己抗体応答を惹起するリスクなく、予防し得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して細菌病原体に関する。特に、本発明は、自己免疫活性を欠く
抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）エピトープの分子模倣物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性髄膜炎および敗血
症の原因因子である。髄膜炎菌は、莢膜および細胞壁の抗原の免疫学的特徴に基
づいて血清学的群に分けられる。現在認識されている血清型には、Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および２９Ｅが含まれる。血清型特異性を担うポ
リサッカライドは、いくつかのこれらの群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、およ
びＹを含む）から精製されている。
【０００３】
Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）は、合衆国および
ヨーロッパに居住する乳児および小児における細菌性髄膜炎の約５０パーセント
を占める。この生物はまた、若年成人に致死的な敗血症を引き起こす。青年にお
いて、外膜タンパク質（ＯＭＰ）粒子からなる実験的ＭｅｎＢワクチンが、約５
０％防御的であることが見出されている。しかし、防御は、ワクチン接種された
幼児および小児（疾患の最も大きな危険にある年齢群）において観察されていな
い。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型特異的かつサブタイプ特異的であり、そ
して優勢なＭｅｎＢ株は、地理的および時間的変化の両方を受け、このようなワ
クチンの有用性を制限する。
【０００４】
莢膜ポリサッカライドに基づく有効なワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、および
Ｗ１３５によって引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しか
し、ＭｅｎＢポリサッカライドワクチンを開発する類似の試みは、莢膜ＭｅｎＢ
ポリサッカライド（本明細書中で、「ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれる）の乏しい免
疫原性に起因して失敗している。ＭｅｎＢ ＰＳは、（Ｎ−アセチル（α２→８
）ノイラミン酸のホモポリマーである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
１は、同一の莢膜ポリサッカライドを有する。ＭｅｎＢ ＰＳによって惹起され
る抗体は、宿主のポリシアル酸（ＰＳＡ）と交叉反応する。ＰＳＡは、胎児およ
び新生児組織において豊富に、特に脳組織中に見出される神経細胞接着分子（「
ＮＣＡＭ」）上で発現される。ＰＳＡはまた、腎臓、心臓、および嗅神経を含む
成人組織においてより低い程度にまで見出される。従って、ほとんどの抗Ｍｅｎ
Ｂ ＰＳ抗体もまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎児発達
に有害に影響を与えるか、または自己免疫疾患を導く能力を有する。
【０００５】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ ＰＳの不良な免疫原性を回避するための
試みにおいて調製されている。例えば、Ｃ3〜Ｃ8 Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ誘導体が記載されている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対するＥＰ公開第５０４，２
０２Ｂを参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する米国特許第４，７２
７，１３６号は、Ｎ−プロピオン化ＭｅｎＢ ＰＳ分子（本明細書中で「ＮＰｒ
−ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれる）を記載する。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質
で免疫したマウスは、ＩｇＧ抗体の高力価を誘発すると報告された。Ｊｅｎｎｉ
ｎｇｓら（１９８６）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８。ウサギにおい
て、抗体の２つの異なる集団（２つの異なるエピトープに結合し、１つは天然の
ＭｅｎＢ ＰＳにより共有されていて、１つは共有されていないと報告されてい
る）が、誘導体を用いて産生された。殺菌活性が、ＭｅｎＢ ＰＳと交叉反応し
なかった抗体集団において見出された。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（１９８７）Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：１２０７。この結合体によって惹起された防御的
抗体と反応する細菌表面のエピトープの同一性は、未知なるままである。
【０００６】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体、および他のポリサッカライド結合
タンパク質に結合することによってポリサッカライドの模倣物として作用し得る
。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（これは、末端α連結マンノースまた
はグルコース残基を有するオリゴサッカライドに結合する）は、ｐＩＩＩコート
タンパク質のアミノ末端に短いペプチド配列を有する細菌性ファージのランダム
ライブラリー由来のペプチド模倣物を選択するために使用されている。Ｏｌｄｅ
ｎｂｅｒｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ８９：５３９３； Ｓｃｏｔｔら（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９８。同様に、モノクローナル抗
体は、ファージライブラリー由来の腺ガン細胞の表面上に存在する炭水化物のペ
プチド模倣物を同定した。Ｈｏｅｓｓら（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：４３。
【０００７】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体もまた惹起し得る。例えば、Ｗｅｓ
ｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５６：１１２０は
、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ（「ＭｅｎＣ」）莢膜ポリサッカラ
イドに対するモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使
用した。抗イディオタイプ抗体で免疫したマウスは、致死的用量のＭｅｎＣ細菌
での感染から防御された。これらの実験者らは、引き続き、ＭｅｎＣ抗イディオ
タイプ抗体のペプチドフラグメントが血清抗ＭｅｎＣ抗体を誘発し、そして動物
をＭｅｎＣ細菌での致死的抗原投与後の菌血症および死から防御することを示し
た。Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４０２１。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、現在までに、このようなアプローチはＭｅｎＢワクチンの開発に関し
て採用されていない。ＭｅｎＢに対する安全でかつ効果的なワクチンの産生が特
に望ましいことは、容易に明白である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
共有に係る米国特許出願第０８／９２５，００２（１９９７年８月２７日出願
）において、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向される、多数の機能的に活性な
抗体が記載されている。これらの抗体は、宿主組織とは交叉反応しないか、また
は最小限に交叉反応性であり、従って、自己免疫疾患を惹起するリスクを最小限
に提起し、そして本明細書において「非自己反応性」と称する。これらの非自己
反応性抗体を本明細書において使用して、ワクチン組成物において使用され得る
独特なＭｅｎＢ ＰＳエピトープの分子模倣物を同定する。したがって、本発明
は、以下をも提供する。
（項目１）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（
ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物であって、以下の式１：
【化１】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、該環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまでの
ヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【化２】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである、
分子模倣物。
（項目２）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化３】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
分子模倣物。
（項目３）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化４】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
分子模倣物。
（項目４）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり；Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり、そしてｐ＝０〜３である、
分子模倣物。
（項目５）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造からなる
群より選択される構造：
【化６】
および
【化７】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化８】
である、
分子模倣物。
（項目６）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造からなる
群より選択される構造：
【化９】
および
【化１０】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化１１】
である、
分子模倣物。
（項目７）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（
ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組
合せて含む組成物であって、該模倣物が以下の構造：
【化１２】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、該環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまでの
ヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【化１３】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである、
組成物。
（項目８）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１４】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目９）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目１０）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１６】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目１１）項目７に記載の組成物であって、以下の構造からなる群
より選択される構造：
【化１７】
および
【化１８】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化１９】
である、
組成物。
（項目１２）項目７に記載の組成物であって、以下の構造からなる群
より選択される構造：
【化２０】
および
【化２１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化２２】
である、
組成物。
（項目１３）前記分子模倣物がキャリア分子に共有結合している、請求
項７に記載の組成物。
（項目１４）前記分子模倣物がキャリア分子に非共有結合的に会合して
いる、項目７に記載の組成物。
（項目１５）さらに、免疫学的アジュバントを含む、項目７に記載の
組成物。
（項目１６）哺乳動物被験体においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、予防するた
めの組成物の製造における、項目１に記載の分子模倣物の使用。
（項目１７）前記組成物が免疫学的アジュバントをさらに含む、項目
１６に記載の使用。
（項目１８）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法であって、
該方法が：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供
する工程；
（ｂ）該集団を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ莢
膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性では
ない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、該接触させる工程を
、該抗体と存在する場合該分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供
する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、該結合していない分子から分離する工程、
を包含する、方法。
（項目１９）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
および／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体を、生物学的サンプル中で検出するため
の方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルと、項目１に記載の分子模倣物とを、Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
１抗体が、該生物学的サンプル中に存在するときに、該分子模倣物に結合して、
抗体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；な
らびに
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出し、それにより、該サンプル中での
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１抗体の存在または非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
および／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１感染を検出するための免疫診断試験キットで
あって、該試験キットが、項目１に記載の分子模倣物および該免疫診断試験を
行うための指示書を含む、キット。
【００１０】
従って、１つの実施態様において、本発明は、ＭｅｎＢ ＰＳの独特なエピト
ープの分子模倣物に関する。これらの分子模倣物は、宿主組織に対して、交叉反
応しないかまたは最小限に交叉反応性であるＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向
された、機能的に活性な抗体を用いて同定された、新規の化合物からなる。この
ような新規の分子模倣物は、以下の構造１に代表される：
【００１１】
【化２３】
【００１２】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、上記環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまで
のヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【００１３】
【化２４】
【００１４】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明の分子模倣物は、以下の構造に代表される
：
【００１６】
【化２５】
【００１７】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００１８】
【化２６】
【００１９】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００２０】
【化２７】
【００２１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００２２】
【化２８】
【００２３】
および
【００２４】
【化２９】
【００２５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００２６】
【化３０】
【００２７】
である；
【００２８】
【化３１】
【００２９】
および
【００３０】
【化３２】
【００３１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００３２】
【化３３】
【００３３】
である。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載のような、ＭｅｎＢの独特なエ
ピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む組成物に関す
る。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物被験体において、ＭｅｎＢおよび
／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、予防するための方法であって、上記組成物
の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する、方法に関する。
【００３６】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための
方法に関し、上記方法は：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供
する工程；
（ｂ）上記集団を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
莢膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性で
はない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、上記接触させる工
程を、上記抗体と、存在する場合上記分子との間の免疫学的結合を可能にして複
合体を提供する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、上記結合していない分子から分離する工程、
を包含する。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体を、生物学的サンプル中
で検出するための方法であって、上記方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）上記生物学的サンプルと、本発明の分子模倣物とを、Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体
が、上記生物学的サンプル中に存在するときに、上記分子模倣物に結合して、抗
体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；なら
びに
（ｃ）上記複合体の存在または非存在を検出し、それにより、上記サンプル中
でのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ
．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する方法に関
する。
【００３８】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書における開示を参照すれば、
当業者は容易に実施する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【図３】図３は、構造５Ａ（１）、構造５Ｂ（１）、構造６Ａ（１）、および構造６Ｂ（１）のＢＳＡ結合体とＳＥＡＭ抗体との交叉反応性を示す。特に、図３は、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術内の免疫学、微生物学、
および分子生物学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分
に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、
１９７３）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版、１９８５）；Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｂ．、Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８
４）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅ
ｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｓｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態「ａ」、「
ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他にその内容が明確にそうではないことを意味す
るものでないときは、複数の言及を含む。
【００４２】
（定義）
本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように
定義されることが意図される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合「ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体」とは、ＭｅｎＢの天然
の莢膜ポリサッカライドの化学的改変によって得られた分子をいう。このような
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、適切なアシル基（例えば、Ｃ3〜Ｃ8およびより高級な
アシル基（ここで用語「アシル基」は任意のアシル化された直鎖状分子、分枝状
分子、脂肪族分子、または芳香族分子を含む））との、天然の分子のシアル酸残
基Ｎ−アセチル基の置換によって改変されているＭｅｎＢ ＰＳ分子を含むが、
これらに限定されない。本明細書中での使用に対して特に好ましいＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ誘導体は、天然のＭｅｎＢ ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ−プロピオニ
ル基での置換を含む（本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ」と称する）。Ｎ
−アシル置換ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む）を合成す
るための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらの
米国特許第４，７２７，１３６号およびさらにＪｅｎｎｉｎｇｓらのＥＰ公開番
号第５０４，２０２ Ｂ号に記載される。
【００４４】
ＭｅｎＢ ＰＳまたはＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の「分子模倣物」とは、ＭｅｎＢ
細菌上に発現される少なくとも１つの「独特の」エピトープを機能的に模倣する
分子である。「独特のエピトープ」は、宿主組織のポリシアル酸と交叉反応しな
い（それゆえ自己免疫活性を欠く）か、または最少に交叉反応するかのいずれか
である機能的に活性な（例えば、オプソニン媒介性殺菌および／または補体媒介
性殺菌）抗ＭｅｎＢ抗体の形成を惹起し得るエピトープである。このような分子
模倣物は、ワクチン組成物において有用であり、そして以下でさらに記載される
診断的な適用または治療的適用のための抗体の惹起において有用である。分子模
倣物には、小有機化合物；核酸および核酸誘導体；サッカライドまたはオリゴサ
ッカライド；ペプチド、タンパク質、およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣
物（例えば、非ペプチド有機部分を含むペプチド、アミノ酸および／またはペプ
チド結合を含んでもよいし、含まなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特
徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド）；ピロリジン；Ｎ−置換グリシン
を含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド（例えば、Ｓｉｍｏｎら（
１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９
３６７に記載されるペプトイドおよびオリゴペプトイド））；ならびに抗体（こ
れは、抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
分子模倣物の同定および生成のための方法は、以下により十分に記載される。
【００４５】
用語「アルキル」とは、本明細書において使用される場合、１〜２４炭素原子
の、分枝もしくは分枝していない、飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル
、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）、な
らびに環式アルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）をいう
。本明細書において、好ましいアルキル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして
最も好ましいアルキル基は、１〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必
要に応じて、１以上のアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、
ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどに
より置換されている。
【００４６】
用語「アルケニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原
子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの二重結合を含む炭化水素
基（例えば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソ
ブテニル、ｔ−ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセ
ニル、エイコセニル、テトラコセニル）、ならびに３〜８、好ましくは５または
６の炭素原子の環式アルケニル基などをいう。本明細書において、好ましいアル
ケニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして最も好ましいアルケニル基は、１
〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、１以上のアルキル
、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カ
ルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている
。
【００４７】
用語「アルキニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原
子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの三重結合を含む炭化水素
基（例えば、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソ
ブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニル）などをいう。本明細書におい
て、好ましいアルキニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして好ましくは、１
〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換され
ている。
【００４８】
用語「アリール」とは、本明細書において使用される場合、必要に応じて１以
上のへテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳ）を含む、５員環、６員環または７
員環を含む、モノ、ビ、トリおよびテトラ環式芳香族種をいう。例は、以下を含
むがこれらに限定されない：フェニル、ベンジル、ナフチル、ピロール、フラン
、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジ
ン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン、カルバゾール、フェナント
レン、アントラセン、ベンゾピレン、アズレン、インドール、インダンなど。さ
らに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【００４９】
用語「アルキルアリール」とは、本明細書において使用される場合、アルキル
に結合したアリール環をいい、ここで用語アルキルおよびアリールは上記のとお
りである。
【００５０】
用語「炭素環式環」とは、本明細書において使用される場合、上記に記載のよ
うにシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルをいい、必要
に応じて、１以上のへテロ原子（例えば、Ｎ、ＯおよびＳ）を含む。さらに、こ
れらの基は、必要に応じて、上記のように置換されている。
【００５１】
用語「アルコキシ」とは、本明細書において使用される場合、単一の末端エー
テル結合を介して結合したアルキル基を意図する。すなわち、「アルコキシ」基
は、ＯＲとして規定され、ここでＲは上記に規定のようなアルキルである。好ま
しい実施態様において、アルコキシ基は、１〜６の、より好ましくは１〜４の炭
素原子を含有する。
【００５２】
用語「アシル」とは、分子置換基ＲＣＯ−をいうためにその従来の意味で用い
られ、ここでＲは上記に規定されるようなアルキルである。好ましい実施態様に
おいて、アシル基は、１〜６、より好ましくは１〜４の炭素原子を含むアルキル
を含む。
【００５３】
用語「ペプトイド」とは、本明細書において使用される場合、Ｎ置換されたグ
リシンのオリゴマーを含み、そして用語オリゴマーＮ置換グリシン（ＮＳＧ）と
交換可能に使用される。
【００５４】
用語「多価リンカー部分」とは、任意の適切なまたは結合可能な部分に結合さ
れ得る、任意の適切なリンカーを表し、これは、セラミドまたはタンパク質もし
くはペプチド（多重抗原ペプチドを含む）を含み、そして好ましくは、その上に
反応基を有する、他の分子（例えば、分子模倣物など）と共有結合を可能にする
基である。
【００５５】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物
ならびにハイブリッド抗体、変化された抗体、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆ
（ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可
変物（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、およびもとの抗体分子の免
疫学的結合特性を示すそれらの機能的なフラグメントを含む調製物を含む。
【００５６】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を
有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定され
ない。この用語は、免疫グロブリン分子全体ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）
2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント
可変物（ｓｃＦｖ）、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性
を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製す
る方法は当該分野で公知であり、そして下記により十分に記載される。
【００５７】
「抗原」は、本明細書において、抗体分子によって特異的に結合され得る任意
の物質を含むと規定される。「免疫原」は、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ
球活性化を開始し得る抗原である。
【００５８】
「エピトープ」とは、特定のＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位をい
う。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用
される。タンパク質、ポリサッカリドもしくは他の生体高分子上のＢ細胞エピト
ープ部位は、その高分子の異なる部分からの部分から構成され得、これらは折り
畳みによって一緒にされている。この種のエピトープは、立体配座的または不連
続エピトープといわれる。なぜなら、この部位は、線形な順序で不連続であるが
、折り畳まれた立体配座において連続であるポリマーのセグメントから構成され
るからである。生体高分子もしくは他の分子の単一のセグメントから構成される
エピトープは、連続もしくは線形的エピトープといわれる。Ｔ細胞エピトープは
一般的に線形ペプチドに限定される。ペプチドエピトープは、そのエピトープに
独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、
エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、より通常には少
なくとも８〜１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメ
ーションを決定する方法は当該分野で公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶学、
および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピ
トープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、
Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定
するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，
８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；
およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するた
めの技術）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体が、単純な免疫アッセ
イにおいて同定され得る。この単純な免疫アッセイは、ある抗体が標的抗原に対
する別の抗体の結合をブロックする能力を示す。
【００５９】
「独特のＭｅｎＢエピトープ」は、本明細書において、ＭｅｎＢ細菌上に存在
するエピトープと規定される。ここで、このエピトープを指向する抗体はＭｅｎ
Ｂに特異的に結合し得、そして宿主組織の表面上に存在するシアル酸残基と交叉
反応しないか、または最小限に交叉反応する。従って、１つ以上の「独特のＭｅ
ｎＢエピトープ」を含むか、または模倣する免疫原は、ＭｅｎＢ疾患の予防のた
めのワクチンにおいて有用であり、そして自己免疫応答を惹起しないか、または
自己免疫応答を惹起する最少の危険を与える。
【００６０】
本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定される、ＭｅｎＢに対する補
体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を抗体分子が示す場合、その抗
体はＭｅｎＢ生物に対する「機能的な活性」を示す。
【００６１】
本明細書中に記載される結合アッセイを使用して決定される、宿主組織中のポ
リシアル酸との交叉反応性免疫学的結合特性をその抗体が示さない場合、「独特
の」ＭｅｎＢエピトープに対して特異的な抗体は、「自己免疫活性を欠き」、そ
して／または「自己反応性ではない」。
【００６２】
本明細書中で記載される結合アッセイにおいてポジティブであるとみなされる
公知の交叉反応性自己抗体と比較して、宿主組織のポリシアル酸への結合を示す
のに約１０倍高い抗体濃度を、その抗体が必要とする場合、「独特の」ＭｅｎＢ
エピトープに対して特異的な抗体は「最小限に自己反応性」を示し、そして／ま
たは「最小限に自己反応性」である。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は
、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共
有結合的な相互作用の型をいう。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単
離された組織または液体のサンプルをいい、これらには、例えば、血液、血漿、
血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、
腸管および尿生殖管の外分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検を含むがこ
れらに限定されず、そしてまた、インビトロ細胞培養成分のサンプルは、培養培
地中の細胞および組織（例えば、組換え細胞）の増殖／成長から得られた馴化培
地および細胞成分を含む。
【００６５】
本明細書において使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」と
は、検出可能な分子をいい、これは、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素
、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、色素原、色素、金属イオン、金属
ゾル、リガンド（例えば、ビオチンもしくはハプテン）などを含むがこれらに限
定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲内で蛍光を示し得る物質もし
くはその一部をいう。本発明のもとで使用され得る標識の特定の例は、フルオレ
セイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ
ｅ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダー
ゼを含む。
【００６６】
（発明を実施する形態）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（Ｍｅｎ
Ｂ）の独特なエピトープの分子模倣物の発見（これは、ＭｅｎＢに対して指向さ
れた機能的抗体を用いて同定された）に基づく。抗体は、宿主組織中のポリシア
ル酸と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、それゆえ、この抗
体は、宿主組織と高度に交叉反応性である抗体よりも自己免疫活性を惹起する危
険性が低い。この模倣物を診断試薬として使用し、そして／または、ＭｅｎＢお
よびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を予防するための組成物に使用し得る。
【００６７】
上記で説明されるように、ＭｅｎＢの天然の莢膜ポリサッカライド（本明細書
中で「ＭｅｎＢ ＰＳ」という）は、ヒトおよび他の哺乳動物被験体において不
免疫原性に乏しい。さらに、天然のＭｅｎＢ ＰＳは、自己抗体の産生を惹起し
得、それゆえ、ワクチン組成物における使用には不適切であり得る。従って、本
発明は、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して調製された抗体を使用する。これらの抗
体は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能活性（ここで、この機能活性はＭｅｎＢ疾患に
対する防御を付与することにおいて重要である）を示すそれらの能力に基づいて
選択される。この抗体はまた、最小限または検出不可能な自己免疫活性を示すこ
とに基づいて選択された。
【００６８】
より詳細には、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、本発明の分子模倣物を同定するため
に使用される抗体分子を得るために調製された。この誘導体は、一般に、天然の
分子のシアル酸残基Ｎ−アセチル基のＣ3〜Ｃ8アシル置換体を含む。特に好まし
いＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、天然ＭｅｎＢ ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ
−プロピオニル基の置換を含み、これは、本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ」という。Ｍｅｎ ＰＳ誘導体を合成するためのこのような誘導体および方法
は、例えば、米国特許第４，７２７，１３６号およびＥＰ公報第５０４，２０２
Ｂ号（両者ともＪｅｎｎｉｎｇｓら）に記載される。
【００６９】
Ｃ3〜Ｃ8アシル誘導体は、まず天然のＭｅｎＢ（例えば、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ培養物から得られる）を強塩基の存在下で処置して定量的にＮ−ア
セチル基を除去し、そしてこの分子のシアル酸残基部分内の反応性アミン基を提
供することにより作製され得る。次いで、脱アシル化ＭｅｎＢ ＰＳフラグメン
トはＮ−アセチル化される。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの場合、脱アシル
化分子は、米国特許第４，７２７，１３６号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら）に記載され
るように、無水プロピオン酸または塩化プロピオニルのようなプロピオニル基の
供給源を用いてＮ−プロピオニル化される。Ｎ−アセチル化の程度は、例えば、
ＮＭＲ分光学を用いて決定され得る。一般に、反応条件は、Ｎ−アセチル化の程
度が少なくとも約８０％であるように選択される。
【００７０】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の免疫原性を増大させるために、誘導体を適切なキャリ
ア分子に結合させて複合糖質を提供し得る。詳細には、十分に規定されそして制
御された構造的立体配置を有するＮ−アセチル化ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質調製物
は、以下に記載のように、中間サイズのＮ−アセチル化ＭｅｎＢオリゴサッカラ
イドから形成され得る。
【００７１】
従って、Ｎ−アセチル化ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質の一群（その一例は、本明細
書中で「ＣＯＮＪ−２」といわれる）は、以下のように調製され得る。例えば、
ＮＭＲ分析により決定される場合、実質的に１００％のＮ−アシル化シアル酸残
基を有するＮ−アシル化ＭｅｎＢ ＰＳ調製物は、緩和な酸性条件下で断片化さ
れ、種々の大きさのオリゴサッカライド分子の集団を提供し得る。断片化産物は
、例えば、標準的なイオン交換クロマトグラフィー技術を、例えば段階的塩濃度
勾配と組合せて使用してサイズ分画され、同質のサイズのＮ−アシル化ＭｅｎＢ
分子の画分を提供する。中間サイズのオリゴサッカライドを含む画分（例えば、
約５〜約２２、好ましくは１０〜約２０、そしてより好ましくは約１２〜約１８
の平均Ｄｐを有する）は、非還元末端において化学的に末端活性化され、そして
還元的アミノ化技術によりタンパク質キャリアに結合され、ＣＯＮＪ−２複合糖
質を提供する。首尾良い複合体化は、例えば、ゲル濾過により決定され得、そし
て最終のサッカライドのタンパク質に対する比率（ｗ／ｗ）は、呈色アッセイに
より評価され得る。
【００７２】
次いで、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体（例えば、ＣＯＮＪ−２）から形成される複合
糖質を、本明細書中で使用して免疫化宿主における抗サッカライド抗体の形成を
惹起する。このような抗体のサブセットは、本明細書中に記載される結合アッセ
イを用いて決定される場合、ＭｅｎＢ細菌に結合するはずであるか、宿主組織シ
アル酸残基と交叉反応しないはずであるか、または最小限に交叉反応性であるは
ずである。抗体は、アイソタイプ、精緻な抗原特異性、機能活性、および宿主組
織との交叉反応性に関して十分に特徴づけられ得る。
【００７３】
例えば、哺乳動物被験体（簡便には、齧歯類およびウサギのような標準的な実
験動物）は、複合糖質を含む組成物を、適切なアジュバントと共に免疫してポリ
クローナル血清の産生を惹起し得る。動物の群は、一般に、その組成物で免疫化
され、そして何回か追加免疫される。免疫化された動物由来の抗血清が得られ得
、そして宿主組織と交叉反応しないポリクローナル血清は、インサイチュ吸着ま
たは従来のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて得られ得る。首尾良
い複合糖質抗原は、Ｔ細胞依存性抗原の特徴である、実質的なＩｇＧ抗ＭｅｎＢ
ＰＳ誘導体−抗体応答を惹起するそれらの能力により同定され得る。高度に免
疫原性であり、そして主にＩｇＧ抗体を産生することが見い出されている複合体
は、本発明の方法における使用について特に好ましい。
【００７４】
細菌性抗血清の形成を惹起し得るＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、モノクローナル抗
体の産生における使用に適している。より詳細には、種々のＭｅｎＢ ＰＳ誘導
体結合体を提供するために使用されるプロセスは、ＭｅｎＢ生物の表面に見い出
されるエピトープを模倣し、そして宿主において最小限に発現される独特のサッ
カライド関連エピトープを提示する優れた免疫原を産生するために設計される。
従って、本明細書中に記載されるＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、抗ＭｅｎＢワクチン
についての独特のエピトープを提供するＭｅｎＢポリサッカライド抗原の模倣物
について検索するのに使用されるＭｅｎＢ特異的な抗体の産生を惹起し得る。
【００７５】
従って、本発明の実施において、選択されたＭｅｎＢ誘導体を使用して、モノ
クローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。本明細書中において使用さ
れる、特定のモノクローナル抗体に関する用語「機能的等価物」は、以下である
分子を意味する：（ａ）例示的なモノクローナル抗体を交叉ブロックする；（ｂ
）問題のＭｅｎＢ ＰＳ誘導体または複合糖質に選択的に結合する；（ｃ）本明
細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、宿主ＰＳＡ（および
、必要に応じて、以下に記載される標準的なアッセイにより決定される場合、Ｍ
ｅｎＢ細菌性細胞に対する活性（例えば、補体媒介性殺菌活性および／またはオ
プソニン活性））とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。さらに
、本発明の特定のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細
書中において使用される場合、用語「子孫」は、世代または核型の同一性に係わ
らず、親により産生されるモノクローナル抗体を産生する、親のハイブリドーマ
のすべての誘導体、子孫（ｉｓｓｕｅ）、子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を含むこ
とが意図される。
【００７６】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、Ｋｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）の方
法によって、またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ １８：３７７により記載される））を使用して調製される。代表的には、マ
ウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合しているＭｅｎＢ ＰＳ誘導体
で免疫し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリン
パ節）を取り出し、そして単一細胞に解離する。所望であれば、脾臓細胞は、細
胞懸濁液を抗原でコートされたプレートまたはウェルに適用することにより、ス
クリーニングされ得る（非特異的接着細胞の除去後）。抗原に特異的な膜結合型
イムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣と
ともにはリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞、またはすべての剥離し
た脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合を誘発さ
せる。ハイブリドーマ形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）における使用のため
の代表的なマウスミエローマ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ）から入手可能なミエローマ株を含む。
【００７７】
より詳細には、体細胞ハイブリッドは、Ｂｕｃｋら（前出）の方法により、ア
ザグアニン耐性非分泌マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ａ
ＴＣＣから入手可能）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に
限界希釈法によりクローン化され、そして免疫抗原に特異的に結合し、そして無
関係の抗原に結合しない抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択され
たモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶
または中空繊維反応器中）、またはインビボ（例えば、マウスの腹水）のいずれ
でも培養される。
【００７８】
ハイブリドーマ上清は、例えば、免疫化ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体または天然のＭ
ｅｎＢ ＰＳ（ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳ）を用いる固相ＥＬＩＳＡまたは間接免
疫蛍光アッセイのいずれかを用いて、抗ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体反応性抗体につい
てアッセイされ得る。ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の選
択性は、競合的特異的結合アッセイ（例えば、阻害ＥＬＩＳＡなど）を用いて評
価され得る。例えば、緩衝液か、または可溶性ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体もしくはＮ
Ａｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む緩衝液のいずれか中に希釈されている抗体分子は、
結合したＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の存在下でＥＬＩＳＡ容器中で反応される。洗浄
後、結合抗体は、二次抗体としての標識抗Ｉｇ（抗ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ
）により検出される。可溶性ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体により阻害される抗体は、特
異的であると考慮され得、従ってさらなる研究（アイソタイプ決定および交叉反
応性、機能活性および自己反応性についてのさらなるスクリーニングを含む）の
ために選択され得る。
【００７９】
特に、部分精製したモノクローナル抗体分子は、その細胞表面上にポリシアル
酸残基を発現する宿主細胞に結合するその能力について個々に評価され得る。こ
のような細胞は、自己免疫活性を示す抗体の検出についての代理標的を代表する
。１つの標的は、ヒト神経芽腫細胞株ＣＨＰ−１３４（これは、Ｌｉｖｉｎｇｓ
ｔｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４４３に記載される
ように、長鎖α２−８ポリシアル酸（ＮＣＡＭ）をその細胞表面上に発現する）
を含む。また、Ｇｒａｎｏｆｆ、Ｄ．Ｍ．ら（１９８８）Ｔｈｅ Ｊ．ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：５０２８−５０３６は、ヒトポリシアル酸とは交
叉反応しない独特のＭｅｎＢ ＰＳエピトープを規定する殺菌性モノクローナル
抗体を記載する。他の適切な標的は、以下を含むがそれらに限定されない：新生
児脳細胞、例えば腎臓、心臓および嗅覚神経由来の組織、培養伏在静脈内皮細胞
、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。例えば、Ｂｒａ
ｎｄｏｎら（１９９３）、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６：７７を参照のこと。ハイブリドーマから
得られるモノクローナル抗体分子は、培養物中の適切な試験細胞集団に添加され
得、そしてそのモノクローナル抗体の細胞標的に対する潜在的結合が、標識モノ
クローナルを用いて直接、または各々のモノクローナル抗体と特異的に反応する
適切な標識二次試薬（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡおよ
びＧならびに抗マウス抗体分子）を用いて間接的に、検出および定量され得る。
試験宿主組織ＰＳＡと交叉反応しないか、または最小限の反応性を示す抗体は、
本発明の目的について自己反応性とはみなされない。従って、これらの抗体は、
さらなる使用に適切である。さらに、試験組織との結合（この結合は試験細胞の
ノイラミニダーゼでの前処理によっては影響されない）を示すいくつかの抗体も
また、さらなる使用に適切であり得る。このような抗体の自己反応性は、本明細
書中で「不定な」と呼ぶ。
【００８０】
機能活性は、補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を評価するこ
とにより測定され得る。詳細には、抗体の補体媒介性殺菌活性は、Ｇｏｌｄら（
１９７０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． １：４７９、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（
１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５６：１１２０、Ｍａｎｄｒｅｌｌら
（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７９、およびＧｒａｎｏ
ｆｆら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． ２：５７４により記載されるような標準的なアッセイを使用して評価さ
れ得る。これらのアッセイにおいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを、補体供
給源とともに、および試験される抗体とともに反応させる。細菌計数を、種々の
試料採取時間で行う。補体媒介性殺菌活性を実証するこれらの抗体は、０時間で
のコロニー数と比較した場合、抗体および補体との６０分間のインキュベーショ
ンの後に測定される生存細菌細胞数において最小５０％の減少が実証される場合
、本発明の目的上、細菌活性を示すとみなされ、そしてさらなる使用に適切であ
る。
【００８１】
補体媒介性溶菌は、浸潤性の髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機
構であると考えられる。しかし、証拠は、オプソニン作用の重要な保護役割もま
た支持する（例えば、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ． ６３：１６０を参照のこと）。従って、本明細書中で産生される抗体のオ
プソニン活性は、機能活性を評価するための第二の手段として、または別の手段
として、評価され得る。オプソニンアッセイからの結果は、殺菌性データを補充
するために、および保護を与え得る抗体の選択を助けるために、使用され得る。
オプソニン活性の評価はまた、本明細書中で、ＩｇＧ１アイソタイプを有する本
発明のマウスモノクローナル抗体の評価のために特に有用である。マウスＩｇＧ
１は（ヒトＩｇＧ１と比較して）、補体の活性化に有効ではない。従って、マウ
スＩｇＧ１抗体は、上記のアッセイにおいて、ＭｅｎＢの補体媒介性溶菌を活性
化しない。しかし、ＩｇＧ１抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体の機
能活性は、補体の非存在下でのオプソニン作用により評価され得る。
【００８２】
種々のオプソニンアッセイ方法が、当該分野で公知であり、そして本発明のモ
ノクローナル抗体の機能活性を評価するために使用され得る。このような標準的
なアッセイには、Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｃａｎｄ．，Ｃ節 ９５：２８３、Ｈａ
ｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ
． ２１：２６７、Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ ９９：７６９、
Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌｓ １４：１５７、
Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９、Ｇｕｔｔｏｒｍ
ｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：２７７７、Ｇｕｔ
ｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １６７：１３１
４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６３：１
６０、Ｈａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７
１：１４８１、ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄ
ｉｓ． １７２：２６２、およびＶｅｒｈｅｕｌ， Ａ．Ｆ．Ｍ．（１９９１）
「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ＬＰＳ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃ
ｔｓ」，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ Ｎｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １１２−１３５頁、によって記載されるものが含まれる
。
【００８３】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用の組織培養方法を用いてインビ
トロで、または哺乳動物被験体を用いてインビボで拡大され得る。例えば、プリ
スタン初回刺激マウスは、腹水生成のためにＰＢＳ中の対数期ハイブリドーマ細
胞を、接種され得る。腹水液は、さらなる精製の前に、−７０℃で貯蔵され得る
。
【００８４】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗体分子フラグメ
ント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ分子）は、公知の技術を
使用して生成され得る。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １５：２７０６；Ｅｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ
１９：４０９１；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９；ならびにＨｕｓｔｏｎら、米
国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄ
ｎｅｒら、第４，９４６，７７８号。
【００８５】
あるいは、インビトロでモノクローナル抗体分子集団を拡大するために、ファ
ージ表示系が使用され得る。Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：
１６３；Ｓｃｈａｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６；米国
特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｙａｎｇら（１９
９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５４：３９２；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９
９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ８：９４；Ｂ
ａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ ８８：７９７８。
【００８６】
一旦生成すると、ファージ表示ライブラリーは、公知の技術を使用して、Ｆａ
ｂ分子の免疫学的結合親和性を改良するために使用され得る。例えば、Ｆｉｇｉ
ｎｉら（１９９４）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３９：６８を参照のこと。
【００８７】
ファージ表示ライブラリーから選択されたＦａｂ分子の重鎖および軽鎖部分の
コード配列は、単離または合成され得、そして発現のために任意の適切なベクタ
ーまたはレプリコンにクローン化され得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類
、および哺乳動物系を含む任意の適切な発現系が使用され得る。細菌における発
現系は、Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８
０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７、欧州出願第ＥＰ
３６，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３
）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２１−２５
、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９に記載さ
れるものを含む。
【００８８】
酵母における発現系は、以下に記載されるものを含む：
【００８９】
【数１】
【００９０】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米
国特許第４，７４５，０５１号、欧州出願ＥＰ１２７，８３９およびＥＰ１５５
，４７６、Ｖｌａｋら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７
７６、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２
：１７７，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：４０９、Ｍａｅ
ｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖ
ｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９、
Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３および
Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９。多数のバキュロウイルス株およ
び改変体、ならびに宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞は、以下に記載され
る：Ｌｕｃｋｏｗら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５
，Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）ＧＥＮＥＲＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｓｅ
ｔｌｏｗ、Ｊ．Ｋ．ら（編），第８巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、
２７７−２７９頁、およびＭａｅｄａら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５：５
９２−５９４。
【００９１】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら、
（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら（
１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１、および米国特許第４，３９９，２１６号。
哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る：Ｈａｍら
（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同
第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５
号および米国再発行特許第ＲＥ３０，９８５号および国際公開ＷＯ９０／１０３
４３０、ＷＯ８７／００１９５。
【００９２】
上記の本発明の抗ＭｅｎＢ抗体は、ＭｅｎＢからの独特のエピトープの分子模
倣物を同定するために、多様な分子ライブラリーをスクリーニングするためのレ
セプターとして簡便に使用される。分子ライブラリーにおいて模倣物を同定する
ための方法は、一般に１つ以上の以下の手順の使用を含む：（１）固定化標的レ
セプターでのアフィニティー精製；（２）可溶性レセプターの繋留リガンドへの
結合；および（３）溶解性化合物を、抗原競合アッセイにおいて直接的に試験す
る工程、または生物学的活性について試験する工程。分子模倣物についてスクリ
ーニングされた分子には、小さな有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルラ
イブラリー、核酸、核酸誘導体、糖類またはオリゴ糖、ペプトイド、溶解性ペプ
チド、固相上に繋留されたペプチド、細菌性ファージ表面タンパク質上に提示さ
れるペプチド、細菌性表面タンパク質または抗体、および／または非ペプチド有
機部分を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
例えば、多様な分子種のライブラリーは、コンビナトリアル有機合成を用いて
作製され得る。例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ
． ３７：１３３５を参照のこと。例えば、ピロリジン、オリゴカルバメート（
Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）；Ｎ−置換グリシン
ポリマーのようなペプトイド（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７）；およびビニル性のポリ
ペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ
． １１４：６５６８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
当該分野で公知の種々のアプローチが、合成の間にビルディングブロックが加
えられる際に、ビルディングブロックを探知するために使用され得、その結果個
々のライブラリーメンバーの動作記録が測定され得る。これらのアプローチには
、写真平板チップ上のアドレス可能な部位（オリゴカルバメート）、逆重畳積分
ストラテジー（ここで、「ヒット」は、部分的な合成ライブラリー（ペプトイド
、ペプチド）へのモノマーの再帰性付加を介して同定される）、およびヌクレオ
チド（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １
１５：９８１２）または他の有機部分（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２）（「タ
グ」）の別々の合成によりコンビナトリアルライブラリーをコードすることが含
まれる。次いで、各ライブラリーメンバーと結合したコード化タグは、模倣物が
選択された後に解読（デコード）され得る。例えば、核酸タグは、ＤＮＡ配列決
定により解読され得る。
【００９５】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、独特なＭｅｎＢエピトープの分
子模倣物を同定するために特に有用である。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンの
オリゴマーであり（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７）、そして新規の分子の化学的に多様
なライブラリーを作製するために使用され得る。モノマーは、ｔ−ブチル−ベー
ス側鎖および９−フルオレニル−メトキシ−カルボニルα−アミン保護を組み込
み得る。ペプトイドオリゴマーへのモノマーの集合は、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍ
ａｎｎら（１９９２）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１０６４
６の「サブモノマー法」を用いて、固相上で行われ得る。この方法において、合
成は、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂を用いて行われる（Ｒｉｎｋら（１９８
７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２８：３７８７）。樹脂結合アミン
は、ジイソプロピルカルボジイミドでのブロモ酢酸のインサイチュ活性化によっ
てブロモアセチル化される。続いて、樹脂結合ブロモアセトアミドはアミンの付
加により置換される。このアミンは、さらなる反応基のｔ−ブチルベース保護を
組み込み得る。この２工程サイクルは、所望の数のモノマーが付加されるまで、
繰り返される。次いで、オリゴペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸／５％水で
の処理により樹脂から遊離される。好ましくは、合成は、ロボットの合成機を用
いて行われる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｐｅｐｔ． Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４０：４９８およびＺｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９６）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６７：４３７を参照のこと。代
替において、ペプトイドモノマーのオリゴマー化は、ベンゾトリアゾール−１−
イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスフェートまた
はブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのいず
れかにより、インサイチュ活性化によって行われ得る。この代替方法において、
他の工程は、α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を用いる従
来のペプチド合成と同一である（例えば、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）前出、を参
照のこと）。
【００９６】
一旦ペプトイドライブラリーが作製されると、それらは、例えば、本発明のモ
ノクローナル抗体を、コンビナトリアルペプトイドの種々のプールとともに、Ｍ
ｅｎＢ ＰＳ誘導体またはＭｅｎＢ細菌（単独または複合糖質としてのいずれか
）でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに添加することによってスク
リーニングされ得る。インキュベーション期間および非結合抗体を除去するため
の洗浄の後に、結合抗体の存在は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって決定さ
れる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８８）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， ＮＹ， ５５３を参照のこと。結合抗体を含まないウェルは、その抗体
に結合するペプトイド模倣物の存在を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定
の詳細な正体は、モノマーユニットを部分的に合成されたライブラリーのメンバ
ーに再帰的に添加することによって決定される。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、（１
９９４） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８。低分子のプールにおける
活性化合物を同定するための他の方法は、逆相ＨＰＬＣまたはアフィニティー選
択／質量分析によるプールの分画を含む（Ｎｅｄｖｅｄ Ｍ．Ｌ．ら、（１９９
６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：４２２８）。
【００９７】
一旦、推定される分子模倣物が同定され、これらは、上記のように自己反応性
を欠落しているかまたは最小限の自己反応性を有する機能的に活性（例えば、細
菌性および／またはオポソニンの）である抗体を誘発するそれらの能力について
試験される。これらの特性を有する分子模倣物は、さらなる使用（例えばワクチ
ン組成物）において適している。
【００９８】
本発明の機能的に活性な抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された分子模倣物は、診
断アッセイにおける使用のための抗体試薬を産生するために使用され得る。例え
ば、分子模倣物と反応性である抗体は、免疫診断技術（例えば、競合、直接反応
、またはサンドイッチタイプのアッセイ）を用いて、生物学的サンプル中の細菌
抗原を検出するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ウエスタン
ブロット；凝集試験；酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ
）；ビオチン／アビジンタイプアッセイ；ラジオイムノアッセイ；イムノ電気泳
動；免疫沈降などが挙げられる。この反応は、一般には標識（例えば、蛍光標識
、化学発光標識、放射活性標識、酵素標識）または色素分子の暴露、または模倣
物と抗体またはこの模倣物と反応する抗体との複合体の形成を検出するための他
の方法を含む。
【００９９】
上述のアッセイは、一般に、模倣物−抗体複合体が結合している固相支持体か
らの液相中の結合していない抗体の分離を含む。本発明の実施において使用され
得る固相支持体は以下のものを含む、ニトロセルロースのような基材（例えば、
メンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリ塩化ビニル（例えば
、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、
ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙
；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁力応答性ビーズなど。
【０１００】
代表的には、固体支持体は、適切な結合条件下で固相成分（例えば、１つ以上
のＭｅｎＢ分子模倣物）と最初に反応し、その結果、この成分はこの支持体に十
分に固定される。時々、支持体への模倣物の固定は、良好な結合特性を有するタ
ンパク質へ、まずこの模倣物が結合されることにより増強され得る。適切な共役
タンパク質は以下を含むがこれらに限定されない、ウシ血清アルブミンを含む（
ＢＳＡ）を含む血清アルブミンのような高分子、キーホールリンペットヘモシア
ニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリイン、オボアルブミン、および当業
者に周知である他のタンパク質。模倣物を支持体に結合させるために使用され得
るたの分子は、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸
、アミノ酸コポリマーなどを含む。これらの分子を抗原と共役させるこのような
分子および方法は当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、Ｍ．Ａ．
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；Ｈａｓｈｉ
ｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；および
ＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ（１９８７）３０：１
１７−１２４を参照のこと。
【０１０１】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の固定された固相化合物が支持体
から洗浄により除去され、次いでこの支持体結合成分を、適切な結合条件下でリ
ガンド部分（例えば、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体）を含む
と思われる生物学的試料と接触させる。いくらかの結合していないリガンドを除
去するための洗浄後、二次結合物部分を適切な結合条件下で添加し、ここで、こ
の二次結合物は結合リガンドと選択的に結合し得る。次いで、この二次結合物の
存在は、当該分野で周知の技術を使用して検出され得る。
【０１０２】
より詳細には、ＥＬＩＳＡ法が使用され得、ここで、マイクロタイタープレー
トのウェルは、本発明に従う模倣物でコートされる。次いで、抗ＭｅｎＢまたは
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと思われる生物学的
試料がコートされたウェルに添加される。抗体を固定された模倣物に結合させる
ために十分なインキュベーション時間の後に、このプレートは洗浄されて結合し
ていない部分を除去し、そして検出可能に標識された二次抗体が添加される。こ
の二次結合分子を任意の捕捉試料抗体と反応させ、このプレートを洗浄し、そし
て二次結合分子の存在を当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【０１０３】
従って、１つの特定の実施態様において、生物学的試料由来の結合したＭｅｎ
Ｂ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗原リガンドは、抗体リガンドに対して指向される抗体
を含む二次結合物を使用して容易に検出し得る。多くの数の抗ウシ免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）分子が当該分野で公知であり、これらは検出可能な酵素標識（例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼ）に
対して当業者に公知の方法を使用して容易に結合し得る。次いで、適切な酵素基
質を使用して検出可能なシグナルを生成する。他の関連する実施態様では、競合
型ＥＬＩＳＡ技術は、当業者に公知の方法を使用して実施され得る。
【０１０４】
アッセイはまた溶液中で行われ得、この結果、模倣物およびこれらの模倣物に
特異的な抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。１つの特定の実施態様におい
て、この模倣物は、固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に対して当該分
野で公知の結合技術（例えば、化学的に直接の結合、または間接的な結合）を使
用して付着され得る。次いで、この模倣物コート粒子を、ＭｅｎＢおよび／また
はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１に対する抗体を含むことが予測される生物学的試料と適切
な結合条件下で接触させる。結合抗体間の架橋は沈降され得、そして洗浄および
／または遠心分離を使用してこの試料から分離され得る粒子−模倣物−抗体複合
体凝集体の形成を生じる。この反応混合物を、抗体−模倣物複合体の存在または
非存在を決定するために多数の標準的な方法のいずれか（例えば、上記のそれら
の免疫診断方法）を使用して分析し得る。
【０１０５】
なおさらなる実施態様では、免疫親和性マトリクスが提供され得、ここで、Ｍ
ｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１の抗体を含むことが予測される生物学
的試料由来の抗体のポリクローナル集団が基材に固定される。これに関しては、
試料の最初のアフィニティー精製は、固定された抗体を使用して実施され得る。
従って、得られた試料調製物は、抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１
部分のみを含み、そのアフィニティー支持体における潜在的な非特異的結合特性
を避ける。高収量および抗原結合活性の良好な保持における多くの数の運動抑制
免疫グロブリン（インタクトであるかまたは特異的フラグメントのいずれかであ
る）は当該分野で公知である。任意の特定の方法により制限されないが、固定さ
れたプロテインＡまたはプロテインＧが免疫グロブリンを固定するために使用さ
れ得る。
【０１０６】
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリクスを提供するために
固定されると、標識分子は、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の
非特異的結合模倣物が免疫親和性支持体から洗浄された後、結合抗体の存在が、
当該分野で公知の方法を使用する標識のためのアッセイにより決定され得る。
【０１０７】
本発明を使用するＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１感染を診断する
ために特に好ましい方法は、ストリップイムノブロットアッセイ（ＳＩＡ）技術
（例えば、当業者に公知である、伝統的なウェスタンブロッティング技術とドッ
トブロッティングを組み合わせる当業者に公知の方法（例えば、ＲＩＢＡ（商標
）（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）試験）の使用
を含む。これらのアッセイにおいて、１つ以上の本発明に従う模倣物が、メンブ
レン支持体試験ストリップ上の個々の分離したバンドとして固定される。生物学
的試料における抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１反応の可視化は，
比色分析酵素基質とともに抗ヒトＩｇＧ酵素結合物を使用して達成される。内部
コントロール（例えば、抗ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧもまた、このストリップ
上に存在し得る。このアッセイは手動で実施され得るかまたは自動化フォーマッ
トにおいて使用され得る。
【０１０８】
上記に記載のアッセイ試薬（本発明の模倣物またはそれらに対する抗体を含む
）は、上記のイムノアッセイを行うための、適切な説明書および他に必要とされ
る試薬と共にキット中で提供され得る。このキットはまた、使用される特定のイ
ムノアッセイに依存して、適切な標識および他のパッケージ試薬および物質（す
なわち、洗浄緩衝液など）を含む。上記のような標準的なイムノアッセイは、こ
れらのキットを使用して実施され得る。
【０１０９】
さらに、分子模倣物組成物、分子模倣物を用いて同定された独特な（例えば、
非自己反応性）ＭｅｎＢエピトープは、哺乳動物被験体におけるＭｅｎＢ疾患の
診断および予防のために本明細書中で使用され得る。特に、分子模倣体のワクチ
ン組成物は、ワクチン接種した被験者のＭｅｎＢ疾患の予防のために使用され得
る。
【０１１０】
このワクチン組成物は、ＭｅｎＢの分子模倣物、または非自己免疫エピトープ
の１つ以上を含み得る。ワクチンはまた、他の抗原および免疫調節剤（例えば、
免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン：（これらは
、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、およびＲＡＮＴＥ
Ｓを含むがこれらに限定されない））と共に投与され得る。
【０１１１】
このワクチンは、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒ
クル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さ
らに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのよう
なビヒクル中に存在し得る。
【０１１２】
アジュバントもまた、ワクチンの有効性を増強するために用いられ得る。アジ
ュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別々に（ワクチン投
与と同時または直後のいずれかで）投与され得る。このようなアジュバントとし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミ
ョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニ
ウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例え
ば、ムラミルペプチド（下述）または細菌細胞壁成分）を有するまたは有さない
）：例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ ９０／１４８３７号）：５％ス
クワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５を含む（
必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下述）を含むが、必要とされるわけで
はない）、微小流動機（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ
１１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎ
ｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に処方された、（ｂ）ＳＡＦ：１
０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、０．５％プルロニックブロックポ
リマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下述）を含む、サブミクロンエマルジ
ョンに微小流動されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成する
ようにボルテックスされるかのいずれかである、（ｃ）ＲｉｂｉTMアジュバント
システム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍ
Ｔ）：２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、および１つ以上の細菌細胞
壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤ
Ｍ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群に由来、好ましくは、ＭＰＬ＋Ｃ
ＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含む；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉ
ｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅ
ｒ、ＭＡ）が用いられ得るか、またはそれから生成された粒子であり得る（例え
ば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（Ｆ
ＣＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）；（５）サイトカイン
（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロ
ニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）コ
レラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（
ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンは部位６３での野生型アミノ酸と置
換される）ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンは部位７２での野生型アミノ酸と
置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンは部位１０９の野生型アミノ酸と
置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンは部位９の野生型ア
ミノ酸と置換され、そしてグリシンが部位１２９で置換される）（例えば、国際
公開ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）のような
細菌のＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体、；ならびに（７）免疫刺激剤として
作用して組成物の効果を増強する他の物質。
【０１１３】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−
イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴ
Ｐ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
分子模倣物から形成されたワクチン組成物の有効性を増強するために、模倣物
をキャリア分子に結合体化させることが必要であり得る。このようなキャリア分
子は、それ自身、有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的に
は、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカラ
イド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー
、脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）、不活性ウイルス粒子、ＣＲＭ
197（無毒変異ジフテリア毒素）など）である。このようなキャリアは、当業者
に周知である。模倣物結合体は、ＭｅｎＢ細菌細胞の表面に見られるものに密接
に類似するエピトープを発現するそれらの能力について選択される。従って、適
切な結合体は、細菌に対して機能活性を有する抗体の形成を惹起し、かつ本明細
書中に記載の結合アッセイを用いて決定されるように宿主組織においてポリシア
ル酸と交差反応しないか、または最小限で交差反応性である。
【０１１５】
代表的には、ワクチン組成物は、注射用（液体溶液または懸濁液のいずれか）
として調製される；注射前に液体ビヒクルに入れて溶液または懸濁液とするのに
適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、上述のように、アジュバ
ント効果の増強のために、リポソーム中に乳化またはカプセル化され得るか、あ
るいは粒子に吸着され得る。
【０１１６】
このワクチンは、有効量のタンパク質の分子模倣物、および必要に応じて任意
の他の上述の成分を含む。「有効量」とは、投与される個体において免疫応答を
誘導し、かつ個体において自己免疫応答を刺激する危険性を最小限にとどめる分
子の量を意味する。一般に、このような応答は、被験体において、このワクチン
に対して分泌性、細胞性、および／または抗体媒介性免疫応答の発達を生じる。
通常、このような応答は、以下の効果の１つ以上を含むがこれらに限定されない
：免疫クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）のいずれかか
らの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増
殖、および分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならび
に／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはγδＴ細胞集団の拡大。
【０１１７】
一旦処方されると、ワクチンは、非経口（例えば、注射により、皮下、または
筋内のいずれか）に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方
物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる
。投与処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【実施例】
【０１１８】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。本実施例は、例
示の目的にのみ提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図
しない。
【０１１９】
用いた数字（例えば、量、温度など）に関して正確に記載するよう試みたが、
幾分かの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【０１２０】
（実施例１）
（「サイズ化」複合糖質の調製）
例示のＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライド破傷風トキソイド結合体ワクチン
（本明細書中、以後ＣＯＮＪ−２と称する）を以下のように調製した。ＭｅｎＢ
ＢポリサッカライドのＮ−アセチル基を、ポリサッカライドをＮａＢＨ4の存
在下で２Ｍ ＮａＯＨ中で６時間、１１０℃に加熱することにより除去した。脱
アセチル化ポリサッカライドを飽和炭酸水素ナトリウム緩衝液中で十分に透析し
、次いで過剰のプロピオン酸無水物と共に、室温で１２時間、撹拌した。溶液を
水中で十分に透析し、Ｎ−プロピオニル化髄膜炎菌Ｂ（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
）ポリサッカライドを凍結乾燥により回収した。
【０１２１】
結合体ワクチンの調製のために、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ポリサッカライドを、１
０ｍＭ酢酸ナトリウム中でｐＨ５．５で５０℃で２時間、部分的に加水分解した
。得られたオリゴサッカライド混合物をＱ−セファロース上で分画した。２〜６
の平均重合度（Ｄｐ）を有するオリゴサッカライドを、１００ｍＭ ＮａＣｌを
用いてまず溶出し、そして廃棄した。中間サイズのオリゴサッカライドを５００
ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した。続いて、Ｍｏｎｏ Ｑカラムを用いる分析用
イオン交換クロマトグラフィーにより、中間サイズのオリゴサッカライドがＤｐ
１３〜２０の大きさの範囲であることを決定した（平均＝Ｄｐ １３）。
【０１２２】
末端アルデヒド基を、暗所において室温で１５〜３０分間、これらを１００ｍ
Ｍ 過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、中間サイズのオリゴサッカ
ライドの非還元末端で生成した。過剰のエチレングリコールを用いて酸化反応を
停止させ、そしてその生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上で脱塩した
。オリゴサッカライド−タンパク質結合体を、４０ｍｇ／ｍｌのシアノホウ素化
水素ナトリウムを有する０．７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ９．０）中で
末端アルデヒド含有ＮＰｒ−ＭｅｎＢ オリゴサッカライドと破傷風トキソイド
との混合物（それぞれモル比２００：１）を、４０℃で１日および室温で２日撹
拌することにより調製した。得られたＮＰｒ−ＭｅｎＢ オリゴサッカライド−
破傷風トキソイド結合体（ＣＯＮＪ−２）を、溶出緩衝液として５０ｍＭ リン
酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを用いてＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００におけるゲル濾過クロマトグラフィーにより最終的に精製
した。結合体ワクチンのシアル酸組成およびタンパク質組成をそれぞれ、Ｓｖｅ
ｎｎｅｒｈｏｌｍレゾルシノール反応（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， Ｌ． （１
９５７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２４：６０４）
およびＬｏｗｒｙアッセイにより測定した。重量基準で、ＣＯＮＪ−２結合体の
最終的な糖対タンパク質比は、０．１０〜０．２５の範囲であった。
【０１２３】
（実施例２）
（複合糖質の特徴付け）
ＣＯＮＪ−２複合糖質を以下のように特徴付けた。共有結合性（例えば、ＮＰ
ｒ−ＭｅｎＢ ＯＳとタンパク質キャリアとの間の共有結合を確立する）を示す
ために、以下を含む多くの物理化学的技術を使用し得る：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ウ
ェスタンブロット；Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル濾過；など。本研究の目
的のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、キャリアタンパク質バンド自体と比
較した場合、結合体バンドについてより高い分子量へのシフトを示すことによっ
て、ＮＰＲ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ ＣＯＮＪ−２複合糖質の共有結合を確立し
た。ＣＯＮＪ−２複合糖質のウェスタンブロット分析は、ＴＴおよびＮＰｒ−Ｍ
ｅｎＢ ＰＳについてのポジティブ免疫反応性シグナルの、特異的な抗ＴＴおよ
び抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ抗血清との一致によって共有結合性を示した。
【０１２４】
立体因子に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質の調製における大きな分子量のポ
リサッカライドの代わりのオリゴサッカライドの使用は、タンパク質キャリア分
子上へのサッカライド抗原のより高いカップリング効率を可能にする。これらの
ＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライドに基づく複合体の最終的なサッカライド対
タンパク質比は、タンパク質キャリア１個当たり共有結合する約３〜５のＮＰｒ
−ＭｅｎＢオリゴサッカライド鎖に対応する、約０．１０〜０．２５に及ぶ。毎
重量に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質は、以前に報告されたＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ポリサッカライドに基づく結合体（米国特許第４，７２７，１３６号）（ここで
、ＣＯＮＪ−２は平均して約７．５〜１８．８倍多いサッカライドを含む）より
高いサッカライドローディングを有するようである（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの
分子量として１０，０００ダルトンを用いる）。
【０１２５】
さらに、十分に規定された中間体の鎖長（例えば、平均１０〜２０ Ｄｐ）の
実質的に均一なサイズのサッカライド部分を有するＣＯＮＪ−２複合糖質を構築
することは、より一貫した免疫学的挙動を呈する複合糖質を生じることが予期さ
れる。さらに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製ＮＰｒ−Ｍｅｎ
Ｂオリゴサッカライドの選択的末端活性化（例えば、非還元性末端でのアルデヒ
ド基の選択的導入）は、両方の末端で誘導される「活性な」アルデヒド基を有す
るＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ分子の使用から生じ得る架橋不均一構造の可能性を回
避する。この点において、両末端活性化ＰＳ（両方の末端にアルデヒド基を有す
る）は、Ｎ−脱アセチル化手順の間に、予めＮａＢＨ4に曝露されたＮ−アセチ
ル化ＭｅｎＢ ＰＳの過ヨウ素酸酸化から誘導され得るようである。
【０１２６】
（実施例３）
（モノクローナル抗体の調製）
４〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （ＣＯＮ
Ｊ−２）複合糖質抗原および（最後の追加免疫注射を除いて）ＦＣＡを含む組成
物を用いて、腹腔内注射によってワクチン接種した。ワクチン接種を、１ヶ月間
隔で合計２または３投薬量で投与した（追加免疫を含む）。融合の３日前、初回
刺激した動物を、アジュバントの非存在下でＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （
ＣＯＮＪ−２）複合糖質抗原で追加免疫した。各用量の最終容量は０．１ｍｌで
あり、これは２．５μｇのシアル酸を含んだ。追加免疫注射後、動物を脾臓摘出
し、そして脾臓細胞をミエローマ細胞との融合用に調製した。
【０１２７】
融合の約１週間前、非分泌マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞
（ＡＴＣＣ受託番号第ＡＴＣＣ−１５８０−ＣＲＬ号から入手可能）を、２５ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液およびＬ−グルタミンを有する完全なＲＰＭＩ−１６４０
培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ０４１−０２４００）で拡大した。細胞培養物を、
細胞増殖、細胞数をモニターするため、およびコンタミネーションをスクリーニ
ングするために定期的に評価した。
【０１２８】
融合の１日目、脾臓細胞、およびパートナーのＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミ
エローマ細胞（Ａｇ８細胞）を洗浄し、収集し、そして５：１（脾臓細胞：ミエ
ローマ細胞）の比で混合した。細胞融合を、５０％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）の存在下で３７℃にて実施した。生じた細胞ペレットを収集し、そして９
６ウェル平底細胞培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ ３５９６）中に置き、そして適
切な条件下で（例えば、５％ＣＯ2中３７℃にて）インキュベートした。インキ
ュベーションの１日後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（Ｈ
ＡＴ）を含む選択培地を、各ウェルに添加した。
【０１２９】
増殖し、そして約１０〜２５％のコンフルエンスを示す細胞を含むウェルから
のハイブリドーマを、ＨＡＴ選択培地中でのインキュベーションの約２週間後に
スクリーニングのために選択した。選択したハイブリドーマ上清を、固相アビジ
ン−ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに基づくＥＬＩＳＡアッセイを用いてス
クリーニングした。上清における抗体結合の特異性を、インヒビターとして可溶
性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを用いて決定した。ネガティブコントロールは、ＲＰ
ＭＩ培地、Ａｇ８ミエローマ上清、および無関連のモノクローナル抗体調製物を
含んだ。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （ＣＯＮＪ−２）複合糖質で免疫した
マウス由来のプールしたポリクローナル血清を、ポジティブコントロールとして
使用した。上清との一晩のインキュベーション後、反応ウェルを洗浄し、そして
結合した免疫グロブリンを、アルカリホスファターゼ標識多価抗マウス免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）を用いて検出した。
【０１３０】
候補ハイブリドーマを、上記のＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ＰＳについてのそれらの示された結合親和性に基づいて同定した。高度に反応
性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを、限界希釈によってクローニングした
。詳細には、候補ハイブリドーマ細胞株を、２０μｌのクローニング／拡大培地
（ＩＬ６を有する完全 ＲＰＭＩ−１６４０）中に、Ｔｅｒａｓａｋｉプレート
（ＮＵＮＣ）中０．３、１．０、および３．０細胞／ウェルでプレートした。２
週間後、培養物を増殖について視覚的に検査した。頻度分析を、Ｌｅｆｋｏｖｉ
ｔｓら（１９８４） Ｉｍｍｕｎ． Ｔｏｄａｙ ５ （９）： ２６５によっ
て記載される最小二乗法を用いて実施した。マスターウェル中の反応性上清を同
定するために使用されるＥＬＩＳＡアッセイを繰り返し、７および１４日目の抗
体活性を評価した。次いで、選択したクローンを、組織培養および腹水生成にお
けるその後の使用のために拡大および凍結した。このようにして、３９のハイブ
リドーマのパネルを生成し、そしてそれから得た分泌したモノクローナル抗体分
子（「ＳＥＡＭモノクローナル抗体」、詳細にはモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−
１〜ＳＥＡＭ−２４、ＳＥＡＭ−２６、ＳＥＡＭ−２８〜ＳＥＡＭ−３１、ＳＥ
ＡＭ−３３〜ＳＥＡＭ−３６、ＳＥＡＭ−３８〜ＳＥＡＭ−４２、およびＳＥＡ
Ｍ−４８と命名した）を、さらなる評価のために調製した。
【０１３１】
より詳細には、選択したモノクローナル抗体を、組織培養においてか、または
腹水液においてのいずれかで、Ｐｒｉｓｔａｎｅで初回刺激した７〜８週齢の雄
性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて生成した。各動物被験体を、ハイブリドーマ細胞
での接種の１週間前に、０．５ｍｌのＰｒｉｓｔａｎｅでの腹腔内注射によって
初回刺激した。接種前、ハイブリドーマ細胞濃度を、滅菌したＰＢＳを用いて、
２．５×１０6〜３×１０6細胞／ｍｌに調整した。初回刺激した動物に、１ｍｌ
のハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した。ここで、各クローン細胞株を３匹の
異なるマウス中に接種した。接種の１〜２週間後、腹水液の回収を開始し、約１
週間継続した。回収した液体を、２７００ｒｐｍ（１５００×ｇ）にて室温で１
０分間遠心分離した。上清を収集し、そしてペレットを廃棄した。単離した腹水
液を、回収の過程にわたって４℃にて貯蔵し、そして異なる日に回収した液体を
プールし、一定分量に分け、そして−７０℃にて凍結した。
【０１３２】
（実施例４）
（モノクローナル抗体の特徴付け）
精製していないモノクローナル抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイおよび
放射状免疫拡散アッセイを用いて決定した。詳細には、捕捉ＥＬＩＳＡ手順を用
いて、各抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体の濃度を決定した。１０
ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において１μｇ／ｍｌに希釈した１００μＬ／ウェ
ルのアフィニティー精製ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ（Ｈおよ
びＬ、Ｚｙｍｅｄ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．から入手可能）を、４
℃で一晩インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄後、２５０μＬのブ
ロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナ
トリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で満たし、そして室温にて３０〜６０分間
インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。そのプレートを、洗浄緩
衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢ
Ｓ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。試験するべき抗体を、希釈緩衝液（１％ Ｂ
ＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰ
ＢＳ、ｐＨ７．４）に希釈し、次いで各ウェル当たり１００μｌで添加した。プ
レートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ
２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ免疫グロブリン標準（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手可能）を、５００ｎｇ／
ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度で使用して、抗体濃度を定量するための標準曲線
を構築した。
【０１３３】
一晩のインキュベーション後、ウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、そして希
釈緩衝液において１：２０００希釈した１００μｌ／ウェルのアルカリホスファ
ターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｈおよび
Ｌ、Ｚｙｍｅｄ）とともに、４℃で３時間インキュベートした。次いで、プレー
トを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液 （１．０Ｍ ジエタノールアミ
ン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した１００μ
ｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸、Ｓｉｇｍａ）を各ウェル
に添加した。約３０分後に４０５ｎｍでの吸光度値を測定した。モノクローナル
抗体調製物の免疫グロブリン濃度を、標準曲線から算出した。
【０１３４】
放射状免疫拡散アッセイを以下のように実施した。放射状免疫拡散プレートお
よび試薬を、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｂｉｒｍ
ｉｎｇｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。次いで、アッセイプロトコル
は、ＲＩＤキットとともに供給された製造業者の具体的な説明書に基づいた。簡
単には、キットに供給されたキャリブレーター抗体を、適切な量の蒸留水を用い
て再構成した。１：２および１：１０希釈のキャリブレーター抗体を調製した。
必要ならば、試験サンプルを１％ ＢＳＡに希釈し得る。キャリブレーター抗体
（適切な、１：２および１：１０希釈）について１０μｌのアリコート（ＩｇＡ
およびＩｇＧ２ａサブクラス抗体について２０μｌ）および試験サンプルを、プ
レート上の分離したウェルに適用し、そして室温にて１２０時間インキュベート
した。抗体の濃度を、沈殿物の環の直径を測定し、そしてこれらの値をＲＩＤキ
ットに含まれる参考の表と比較することによって決定した。
【０１３５】
次いで、組織培養物または腹水液由来のモノクローナル抗体を、以下のように
部分的に精製した。モノクローナルを含む組織培養上清または腹水（２００ｍｌ
または指示された容量）を、溶液を穏やかに撹拌しながら、等量の冷１００％飽
和硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）にゆっ
くりと添加した。このモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を、４
℃で一晩インキュベートした。翌朝に、混合物を、均質化のために穏やかに撹拌
し、そしてＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃
にて３０分間遠心分離した。上清をデカントした後、等容量の５０％硫酸アンモ
ニウム溶液（すなわち、１００％飽和硫酸アンモニウムと同じ容量）を使用して
、ペレットを洗浄し、そして再懸濁した。得られた混合物を、Ｓｏｒｖａｌｌ
ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃にて３０分間遠心分離した。
次いで、上清をデカントし、そして排出した。
【０１３６】
腹水について、ペレットをＰＢＳ 緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１
５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）において、０．３〜０．５容量の開始
容量に再構成した。組織培養上清について、このペレットを、ＰＢＳ 緩衝液の
０．１容量の開始容量に再構成した。再構成したモノクローナル抗体および硫酸
アンモニウム混合物を透析チューブ（分子量カットオフ１０，０００〜１２，０
００）に入れ、そして４ＬのＰＢＳ中で一晩透析させた。ＰＢＳ溶液を、後の２
日間にわたって３〜４回交換した。透析チューブからのモノクローナル抗体分子
をシリンジ中に移し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌
し、次いで−２０℃にて貯蔵した。
【０１３７】
次いで、部分精製したモノクローナル抗体調製物を（ａ）免疫グロブリンアイ
ソタイプ、（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの濃度依存性結合、（ｃ）種々のＮ
Ｐｒ−ＭｅｎＢオリゴマーの、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を阻害する能力
、（ｄ）天然のＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性、（ｅ）ＭｅｎＢの病原性株との
交差反応性、（ｆ）補体媒介性殺菌活性、（ｇ）オプソニン活性、および（ｈ）
細胞表面にて長鎖α２−８連結ポリシアル酸を発現する神経芽細胞腫細胞株への
結合によって示されるような自己反応性について特徴付けした。これらの実験に
おいて、モノクローナル抗体の濃度を、捕捉ＥＬＩＳＡおよび上記のＲＩＤアッ
セイによって測定した。
【０１３８】
（ａ）抗体のアイソタイプ分類：
モノクローナル抗体（重鎖および軽鎖）のアイソタイプを、二次アルカリホス
ファターゼ結合抗体がＩｇＧサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ならびにκ軽鎖およ
びλ軽鎖に特異的であるという唯一の差異を有する、上記の抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ＰＳ ＥＬＩＳＡについてのプロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡによって決定し
た。また、キットを使用して、この抗体分子をアイソタイプ分類した。このキッ
トは、異なる型の免疫グロブリンペプチド鎖について特異的なヤギ抗体でコート
した分類固着基質からなった。キットは、その基質に対するヤギ抗体に結合する
マウスモノクローナル抗体を検出するための、抗マウス免疫グロブリンに特異的
なペルオキシダーゼ標識種を提供する。
【０１３９】
以下で表１に記載するように、３９のモノクローナル抗体中のアイソタイプの
分布が、１つのＩｇＭ、および３８のＩｇＧ（８つのＩｇＧ１、５つのＩｇＧ２
ａ、１６のＩｇＧ２ｂ、および９つのＩｇＧ３）からなることを見出した。さら
に、すべての抗体分子は、κ軽鎖を有した。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの濃度依存性結合：
固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、緩衝液のみまたは２５μｇ／ｍｌの可溶性ＮＰ
ｒ−ＭｅｎＢ ＰＳインヒビターの存在下での抗体分子のＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓへの濃度依存的結合を評価した。ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ−ＡＤＨ
を、Ｓｕｔｔｏｎら（１９８５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８２
：２１５の方法を用いて調製した。１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中の１０
０μｌ／ウェルのアビジン（４μｇ／ｍｌ Ｅｘｔｒ Ａｖｉｄｉｎ， Ｓｉｇ
ｍａ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、 Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．より入手可能）を、４℃で一晩イ
ンキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄後、ＰＢＳ中の１００μｌのビオチン
化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュ
ベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、そしてこのウェルを２５０μ
ｌのブロッキング緩衝液で満たし、そして室温で３０〜６０分間インキュベート
して非特異的結合部位をブロックした。
【０１４４】
ブロッキング後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。モノクローナル
の種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液、または１ｍｌあ
たり５０μｇの可溶性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む（２５μｇ／ｍｌの最終イ
ンヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかで含む複製プレートの
ウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベ
ートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液に
おいて１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ
結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）
を用いて４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝
液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの
新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ
添加した。４０５ｎｍでの吸光値を約３０分後に測定した。
【０１４５】
表１は、３９のＳＥＡＭモノクローナル抗体の各々に対ついてＥＬＩＳＡにお
いて０．５のＯＤをもたらすに必要な抗体のそれぞれの濃度範囲を要約する。示
される値における大きな不均一性に対する最も可能性の高い説明は、ＮＰｒ−Ｍ
ｅｎＢ ＰＳへの抗体の結合活性の相違である。
【０１４６】
（ｃ）オリゴマーによるＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの抗体結合の阻害：
競合固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに対するモノ
クローナル抗体分子の結合を阻害するためのＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴマーインヒ
ビターの能力を評価した。アッセイを、モノクローナル抗体を、０．５〜１のＯ
Ｄをもたらす濃度まで予め希釈したことを除いては、抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
ＥＬＩＳＡについて上記のように実施した。モノクローナル抗体を、複製プレ
ートのウェル（各々は、２５μｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度をもたらす以下
の可溶性インヒビターの１つを含む：高分子量（ＨＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ；または低分子量（ＬＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ（３．８の平均Ｄｐを有
する））へ添加した。
【０１４７】
このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェ
ルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈
された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて４℃で３時間イン
キュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩
衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−
ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの
吸光値を約３０分後に測定した。阻害パーセントを、インヒビターの非存在下で
の結合と比較して計算した。
【０１４８】
ＨＭＷ ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳインヒビターは、試験された全てのモノクロ
ーナル抗体において、約７５％〜９５％の阻害を与えた。モノクローナル抗体に
おける微細な抗原特異性の差異は、試験されたＬＭＷインヒビターとの異なるそ
れぞれの阻害パターンから明白である。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへのＳ
ＥＡＭ−３およびＳＥＡＭ−１８の結合は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの可溶性Ｌ
ＭＷインヒビターによって完全に阻害される。対照的に、ＳＥＡＭ−２およびＳ
ＥＡＭ−１６は、オリゴマーによって顕著には阻害されない（２０％未満）。全
てのモノクローナル抗体についてのＬＭＷ ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ阻害の結果
を表１に示す。さらに、以下に記載のように、モノクローナルの微細な抗原特異
性における他の差異は、ＥＬＩＳＡにおけるＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳへの交差反
応性において観察された差異、および宿主のポリシアル酸への結合における差異
によって明白である。
【０１４９】
（ｄ）ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性：
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ形式において、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓの直接的結合によって示されたように、ＮＡｃ−ＭｅｎＢポリサッカライドへ
との交差反応するそれらの能力について評価した。使用された方法は、固相抗原
としてビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの代わりに、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳ
−ＡＤＨを使用したこと以外は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ ＥＬＩＳＡについて
の上記の方法と類似した。
【０１５０】
モノクローナルの種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液
、または１ｍｌあたり５０μｇの可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む（２５μ
ｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかを含
む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃
で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次
いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカ
リホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗
体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて、４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプ
レートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈
された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇ
ｍａ）を、各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの吸光値を、約３０分後に測定し
た。
【０１５１】
４６のモノクローナル抗体のそれぞれのＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応
性を、高い交差反応性（＋＋＋）から交差反応性でない（０）範囲にわたって得
点づけした。この結果を表１に示す。見られ得るように、１６のモノクローナル
抗体が、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応し、そして４つが最小で交差反応し
た（±）。これらの２０のポジティブまたは弱いポジティブなモノクローナル調
製物の交差反応性の特異性を、可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを用いた結合の阻
害によって確認した。２６の非交差反応性モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍ
ｌまでの抗体濃度で試験した場合、固相ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳへの顕著な結合
は示さなかった。
【０１５２】
（ｅ）細菌結合アッセイ：
抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体の、病原性細胞株Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓＢ群の表面に結合する能力を、間接的免疫蛍光アッセイのフロー
サイトメトリー検出を用いて決定した。２つの完全に莢膜された髄膜炎菌Ｂ試験
生物（８０４７株（殺菌活性の測定のために使用した株、以下を参照のこと）お
よびＮｍＢ株）を使用した。ＮｍＢのトランスポゾン含有変異体である第３の非
莢膜化株、Ｍ７（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら （１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍ
ｕｎ． ５９：４０９７−４１０２）を、莢膜ポリサッカライドへの抗体結合の
特異性についてのネガティブコントロールとして使用した。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈ
ｉｎｔｏｎ培地および０．２５％グルコース中において対数増殖中期へ増殖され
た細菌細胞を回収し、そして１ｍｌあたり約１０8細胞の密度でブロッキング緩
衝液において再懸濁した。次いで、モノクローナル抗体（１０または１００μｇ
／ｍｌの濃度）を添加し、そして氷上で２時間細胞へ結合させた。ブロッキング
緩衝液での２回の洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤ
ギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）とインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中の
０．２５％ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーによって分
析した。
【０１５３】
ポジティブコントロール抗体は、髄膜炎菌特異的血清型決定およびサブタイプ
決定モノクローナル抗体（ＭＮ２Ｃ３Ｂ、ＭＮ１６Ｃ１３Ｆ４、ＲＩＶＭ、Ｂｉ
ｌｔｈｏｖｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含んだ。ネガティブコン
トロールは、関連しない特異性を有するマウスＩｇＧモノクローナル抗体からな
った。
【０１５４】
表１に要約されるように、２４の抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体
は、１００μｇ／ｍｌで試験した場合、細菌結合の証拠を示した。２つのさらな
る抗体は、莢膜化株および非莢膜化変異株の両方に最小の結合の証拠を示した。
これらの抗体の細菌結合を、不定（ｉ）として得点づけした。
【０１５５】
（ｆ）補体媒介性殺菌活性：
殺菌アッセイを、Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉ
ｓ． １７２：１２７９に記載される方法を使用して、以下の改変を用いて行っ
た：生物を０．２５％グルコース；およびバルビトール緩衝液の代わりにＧｅｙ
緩衝液からなる血清希釈緩衝液を含有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で
増殖させた。いくつかの実験では、補体の異なる供給源を使用した：これらは２
つの異なるウサギの乳仔の血清プール（Ｒａｂ Ｃ ＩおよびＲａｂ Ｃ ＩＩ
と呼ばれる）ならびにヒト無ガンマグロブリン血症血清（Ｈｕ Ｃと呼ばれる）
を含んだ。
【０１５６】
補体媒介性細菌溶解を活性化する各モノクローナル抗体の能力を、表１に報告
する。ＥＬＩＳＡによるＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応性である殺菌性抗体
の例（例えば、ＳＥＡＭ−１８、ＳＥＡＭ−３０、およびＳＥＡＭ−３５）があ
る。ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性を示さない殺菌性抗体の例（例えば
、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、およびＳＥＡＭ−８）もまたあ
る。
【０１５７】
（ｇ）オプソニン活性：
モノクローナル抗体のオプソニン活性を、種々の確立された方法によって測定
し得る。Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｃａｎｄ．， Ｓｅｃ． Ｃ ９５：２８３，
Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄ
ｉｓ． ２１：２６７， Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ ９９：７
６９， Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌｓ １４：
１５７， Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９， Ｇ
ｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：２７
７７、Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １
６７：１３１４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ
． ６３：１６０、およびＨａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ
． Ｄｉｓ． １７１：１４８１。
【０１５８】
１つのオプソニン作用アッセイにおいて、ＧＮ寒天プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ
Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｅｋ， Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢＶ， Ａｌｐｈｅｎ ａ
／ｄ Ｒｉｊｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で３７℃で新たに増殖させたＮ
． ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓを使用して、０．１の初期ＯＤを得るように８ｍｌ
のＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地 （Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍ
Ｉ）に接種した。細菌を、激しく振盪しながら対数期（０．７５〜０．８５の６
６０ｎｍでの吸光度）まで増殖させた。細胞を、蓋付きの滅菌のプラスチックチ
ューブに移し、そして１０分間３５００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１５９】
細胞を、４ｍｌの７０％エタノールを添加し、そして４℃で少なくとも１時間
インキュベートすることによって固定した。固定した細胞を、３５００ｒｐｍで
１０分間の遠心分離によって再度ペレット化し、そして滅菌のリン酸緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ）中に１．０のＯＤになるように再懸濁した。細胞懸濁物（１．
３５ｍｌ）をエッペンドルフチューブに添加し、そして５分間１０，０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。上清を廃棄し、そして別の１．３５ｍｌを同じチューブに添
加し、続いて遠心分離して１チューブあたり１×１０9細胞を得た。フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の１．０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そして５分間超音
波処理し、次いで５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＦＩＴＣ−ＰＢＳ
溶液（５０μｌ）を各チューブの細菌に添加し、次いで軽度に攪拌しながら３７
℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ（９５０μｌ）を各チューブに添加し
、そして２分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１ｍｌのＰＢＳ
で１回、そして１ｍｌのＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ）
で１回洗浄した。ＦＩＴＣ標識した髄膜炎菌を１％のＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で再構
成し、そして１００μｌのアリコートに分けた。これを、アッセイでの使用まで
−２０℃で保存した。
【０１６０】
ヒト多型性核細胞（ＰＭＮ）をヘパリン含有チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）中の健常な成体の末梢
血から単離した。１０ｍｌの容量の血液を、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ； ｐＨ ７．４）で希釈し、そして１２ｍｌのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密
度１．１１９、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）の上部に１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅTM （Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ， Ｕｐｐｓａｉｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）からなるＦｉｃｏｌｌ ｈｉｓｔｏ
ｐａｑｕｅ勾配に載せた。室温で４００×ｇで２０分間の遠心分離後、ＰＭＮを
ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの上部から回収し、そして１％のゼラチンを含有する氷冷
ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ， ＮＹ）を添加した。細胞を２５０×ｇで遠心分離し、そして残りの赤血
球を９ｍｌの氷冷した蒸留水中に細胞を再懸濁することによって溶解させた。１
分後、濃縮したＰＢＳおよびＲＰＭＩ−ゼラチンを添加して細胞懸濁物を等張化
した。ＰＭＮを遠心分離し、そしてＲＰＭＩ培地に１×１０7／ｍｌの密度に再
懸濁した。ＰＭＮの純度および生存性は９５％以上であった。
【０１６１】
マイクロタイタープレートに、試験されるべきモノクローナル抗体の適切な希
釈物（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で希釈した）、５μｌの１０％ヒト補体（ＢＳＡ−Ｈ
ＢＢＳ中）、および２５μｌのＦＩＴＣ標識した細菌懸濁物を添加して、５０μ
ｌの全容量にした。選択した抗体を、補体を含まずに、そして３つまでの異なる
補体供給源：正常なプールしたヒト血清；無ガンマグロブリン血症血清；および
ウサギ乳仔血清を用いて、１〜１０％までで補体濃度を変化させて試験した。各
アッセイはポジティブおよびネガティブ抗体コントロール、ならびに補体、非オ
プソニン作用、および細胞のみのコントロールを含んだ。オプソニン作用反応を
、３０分間３７℃にて振盪機上で進行させ、その後、氷上にマイクロタイタープ
レートに置くことによって反応を停止した。
【０１６２】
食細胞懸濁物（５０μｌ）を５×１０6細胞／ｍｌの最終濃度で添加した。こ
れによって１０：１の細菌：食細胞の比が得られる。食細胞活動を、振盪機上で
３７℃で３０分間進行させ、その後、それを氷上に置いた。冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ
（１００μｌ）を各ウェルに添加した。プレートを１０分間１１００ｒｐｍで遠
心分離した。上清をウェルから吸引し、そして細胞をさらに２回１５０μｌの冷
ＢＳＡ−ＨＢＢＳで洗浄した。次いで、冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ（１５０μｌ）を添
加し、そして得られた細胞懸濁物を滅菌チューブに移した。２％のパラホルムア
ルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，
ＰＡ）を含有するＰＢＳの溶液を添加して細胞を固定した。次いでサンプルを
、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６３】
１６の代表的なＳＥＡＭモノクローナル抗体についてのオプソニン作用実験の
結果を、表１に報告する。オプソニンであることが見出されている全ての抗体は
また、この補体供給源の少なくとも１つを使用する上記のアッセイにおいて殺菌
性であった。しかし、表１に見られ得るように、殺菌性であるがオプソニン性で
はない抗体の例（例えば、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、ＳＥＡ
Ｍ−１６、およびＳＥＡＭ−４１を参照のこと）がある。
【０１６４】
（ｈ）自己反応性の評価：
３９ ＳＥＡＭモノクローナル抗体を含有する部分精製された組織培養上清を
、宿主のポリシアル酸に対する自己反応性について評価した。１つのアッセイに
おいて、モノクローナル抗体を、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＣＨＰ−１３４（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎら、（１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：
９４４３）と交差反応するその能力について、間接的免疫蛍光のフローサイトメ
トリー検出を用いて評価した。このアッセイにおいて、その表面の神経細胞接着
分子（ＮＣＡＭ）に結合した長鎖ポリシアル酸（ＰＳＡ）を発現するＣＨＰ−１
３４細胞は、ヒトＰＳＡ抗原についての細胞性マーカーとして作用する。コント
ロール実験において、ほぼコンフルエントな細胞培養物を５０ｍｌの遠心管に回
収し、そして１０００×ｇで遠心分離した。上清をデカントした後、５ｍｌのブ
ロッキング緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。次いで、細胞を血球計で計数し
、そして２つの等しいアリコートに分けた。１方のアリコートを、エキソノイラ
ミニダーゼ（１０ユニット／１０8細胞、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
．， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）とともに室温で２時間インキュベート
した；他方のアリコートを、同様に、しかし酵素なしで処理した。インキュベー
ションの後、各アリコートからの細胞を、個々の反応管間で、各管が１０6個の
細胞を含むよう分配した。細胞を洗浄するために、２ｍｌのブロッキング緩衝液
を各反応管に添加し、その管をＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、
１０００ｒｐｍで、６分間遠心分離し、そして上清を吸引除去した。洗浄した細
胞を、総容量２００μｌで、抗体を含まずに、または示された濃度（通常１０ま
たは１００μｇ／ｍｌ）の試験抗体（すなわち、ＳＥＡＭ ＭＡｂ）とともにの
いずれかで、氷上で２時間インキュベートした。
【０１６５】
アッセイにおけるコントロール抗体は、以下を含んでいた：（１）関連しない
特異性のＩｇＧモノクローナル抗体（ネガティブコントロールとしての、ＶＩＩ
Ｇ１０）；（２）ＩｇＭ抗ポリシアル酸モノクローナル抗体（ポジティブコント
ロールとしての、２−１Ｂ）；および（３）ＮＣＡＭのタンパク質骨格に特異的
な抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍａｒｓｅｉｌｌ
ｅ， Ｆｒａｎｃｅ）。ブロッキング緩衝液（２ｍｌ）を各反応管に添加し、そ
して管をＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、１０００ｒｐｍで、６
分間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を吸引除去し、そして細胞を室温で１
時間、１５０μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合体化
Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４μｇ／ｍｌに希
釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏ
ｖｅ， ＰＡ）とともにインキュベートした。ブロッキング緩衝液で洗浄した後
、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０、１５０ｍＭ塩化ナ
トリウム）中の４００μｌの０．２５％ホルムアミドを細胞に添加し、そして細
胞をＦＡＣＳＣＡＮTM細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーによっ
て分析した。
【０１６６】
全ての抗体を、複製において最終濃度１０および１００μｇ／ｍｌの抗体で、
未処理細胞、およびノイラミニダーゼで前処理した細胞を使用して試験した。こ
の処理によって、表面ポリシアル酸が切断され、そしてポリシアル酸への抗体結
合の特異性についてのアッセイにおけるコントロールを提供する。代表的な実験
において、一次抗体なしで、または関連しない抗原特異性を有するコントロール
モノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は、非常に小さい蛍光を示
す（約９８％の細胞が＜１０ユニットの蛍光を有する）。対照的に、抗ＮＡｃ
ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体である２−１Ｂで処理された実質的に全ての
細胞が、強く蛍光を発する。この蛍光は、抗体がノイラミニダーゼで前処理され
た細胞とともにインキュベートされる場合、コントロールレベルまで減少する。
同様に、抗ＣＤ５６で処理した細胞は、強く蛍光を発する。この抗体を用いて、
蛍光は、細胞をノイラミニダーゼで前処理することによって影響を受けない。な
ぜなら、ＣＤ５６決定基は、ＮＣＡＭのタンパク質骨格に位置し、そしてノイラ
ミニダーゼによるポリシアル酸の除去によって影響を受けないからである。
【０１６７】
ＳＥＡＭ−５抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験される場合、検出可能な結合を
与えず、このアッセイではネガティブであると考えられる。ＳＥＡＭ−３５抗体
は、１０または１００μｇ／ｍｌで試験した場合、強力なポリシアル酸特異的結
合を示し、ポジティブであると考えられる。少数個の抗ＮＰｒ ＭｅｎＢ ＰＳ
モノクローナル抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験された場合、結合を示すが、１
０μｇ／ｍｌで試験された場合、ネガティブであるようである（例えば、ＳＥＡ
Ｍ−１２）。このような抗体は、本出願の目的で、最小限に自己反応性であると
考えられる。稀少抗体は、細胞のノイラミニダーゼによる前処理によって影響を
受けなかった神経芽細胞株との弱い反応性を有するようであった（例えば、ＳＥ
ＡＭ−７）。このような抗体のポリシアル酸との自己反応性は、アッセイにおい
て不定として得点され、そしてこれらの抗体もまた、本出願の目的で、宿主ＰＳ
Ａに対して最小の自己反応性を有すると考えられる。
【０１６８】
表１は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて決定した場合
の、各抗体の自己抗体活性を要約する。ＣＨＰ−１３４細胞において発現したポ
リシアル酸抗原との交差反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体のＮＡｃ−
ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性と密接に相関した。表１に示すように、ＥＬＩＳ
ＡにおいてＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応しなかったモノクローナル抗体は
、ＣＨＰ−１３４細胞にも結合しなかったが、ＥＬＩＳＡにおいてＮＡｃ−Ｍｅ
ｎＢ ＰＳと交差反応した抗体の全てが、ＰＳＡともまた交差反応した。２つの
アッセイ間のこの相関は、予想されなかった。なぜなら、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓおよび宿主ＰＳＡのポリサッカライド共有結合構造は、同一であると報告され
ているからである。
【０１６９】
（実施例５ ＳＥＡＭモノクローナル抗体を用いたＭｅｎＢ抗原の分子模倣
物の同定）
以下の手順を、本発明のＳＥＡＭモノクローナル抗体と相互作用する分子模倣
物を同定するために実施した。コンビナトリアル合成分子を、上記のＺｕｃｋｅ
ｒｍａｎらの手順に従って合成した（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９６） Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７：４３７およびＺｕｃｋｅ
ｒｍａｎｎら（１９９２） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１４：１０６４
６を参照のこと）。分子模倣物を、逆相ＨＰＬＣによってプールを分画すること
により同定した。このプール（約２００μｌまたはＤＭＳＯ中１０μＭ／分子溶
液）を、Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ１８逆相カラム（Ｖａｒｉａｎ， Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）に注入し、そして０．１％トリフルオロ酢酸中０％〜８０％（ｖ／
ｖ）にアセトニトリルの６０分間にわたる直線勾配を用いて溶出した。この画分
を凍結乾燥し、そして４０μｌのＤＭＳＯまたはアセトニトリル／水（１：１）
に再懸濁した。次いで、各画分のアリコート（５μｌ）を、ＥＬＩＳＡにおいて
特定のＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮｐｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの結合を阻害する
ことによって試験した。次いで、阻害活性を有する画分中の分子を、ＬＣ／ＭＳ
（ＨＰ１１００ ＬＣ／ＭＳＤ， Ｈｅｗｌｗｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって同定した。
【０１７０】
上記の標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３０分でＯＤ405を与えるのに
必要な濃度とほぼ等しい濃度までＰＢＳ中に希釈したＳＥＡＭモノクローナル抗
体（１００μｌ）を、Ｎｐｒ−Ｍｅｎ ＰＳ被膜したプレートのウェルに添加し
た。ＤＭＳＯ中のコンビナトリアル合成分子の溶液（１〜２μｌ）を、モノクロ
ーナル抗体溶液に添加し（プール中１分子あたり１μＭの最終濃度）、そして４
℃にて一晩インキュベートした。コントロールを、（１）抗体のみ、（２）緩衝
液のみ、ならびに（３）抗体および緩衝液とともに、各々１〜２μｌのＤＭＳＯ
とインキュベートした。このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、そして以前に記載
したように発色させた。プールを、ＳＥＡＭモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−２、
ＳＥＡＭ−３、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−１２、ＳＥＡＭ−１６、ＳＥＡＭ−１
８、およびＳＥＡＭ−２８を用いてスクリーニングし、そしてＤＭＳＯを用いて
抗体と比較した阻害が、インヒビターの非存在下で観察された結合の８０％以上
である場合、ポジティブであると判断した。
【０１７１】
上記の構造１の分子模倣物を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて特定のＳＥＡＭモ
ノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を阻害するとして同定した
。ＩＣ50値（ＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を
５０％阻害するのに十分な個々の化合物の推定濃度）を、上記のＥＬＩＳＡにお
けるプールの連続希釈によって決定した。本発明の分子模倣物のＩＣ50濃度は、
このプール中で単一の活性分子と仮定して、約３ｎＭ〜７００ｎＭの範囲である
。
【０１７２】
（実施例６）
（分子模倣物ワクチン組成物の調製）
上記の模倣物に対応する低分子を含有するワクチン組成物を、その模倣物とキ
ャリアタンパク質との、非共有結合、または共有結合によって調製する。疎水基
または反応性基を模倣物に付加して、この模倣物のＥＬＩＳＡにおいてＮＰｒ−
ＭｅｎＢ ＰＳに対するＳＥＡＭモノクローナル抗体の結合を阻害する能力を保
持する様式において、低分子模倣物とキャリアタンパク質との会合を促進する。
【０１７３】
（ＯＭＰビヒクルの調製）ＯＭＰビヒクルを、Ｌｏｗｅｌｌら（１９８８）
（Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１６７：６５８〜６６３）およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒ
ら（１９７９）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：８３６〜８４８）に記載
の技術を組み合わせて用いて、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
Ｂ群の莢膜欠損変異株（Ｍ７株）から調製する。手短には、細菌をＭＨブロス
中で増殖し、遠心分離によってペレット化して、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む１
５ｍｌの緩衝液中に再懸濁して、次に３０分間、５６℃まで暖める。室温まで冷
却した後、懸濁液をＰｏｌｙｔｒｏｎ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＧｍｂＨ．、Ｌ
ｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、全速で３分間せん断し、次に１６
０００×ｇで１５分間遠心分離する。生じるペレットを、１０ｍｌの緩衝液（５
００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ リン酸ナトリウム）に再懸濁し、５ｍｌ
の界面活性剤溶液（１０％ デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、０．１５Ｍ グリシン（Ｂｉｏｒａ
ｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、および３０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）（ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を用いて処理する。
この懸濁液を１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。次に、上清を収集して
、１００，０００×ｇで２時間遠心分離する。外膜タンパク質調製物を含むペレ
ットを、１０ｍｌの水に再懸濁し、４℃で保存する。
【０１７４】
外膜タンパク質の１０ｍｌの懸濁液を、５ｍｌの界面活性剤溶液で再処理し、
次に３０分間、５６℃まで暖める。冷却後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を
、第２の界面活性剤溶液（１％ ＤＯＣ、０．０５Ｍ グリシン、および０．０
０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．８）中の、２ｃｍ×２０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用するクロマトグラフィーによって（１度に
２ｍｌ）、外膜タンパク質から除去する。ピーク画分を収集し、３０℃まで暖め
、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して、４容量の冷濾過滅菌エタノ
ール中に直接、滅菌濾過する。この混合液を4℃でオーバーナイトインキュベー
トする。生じる沈殿を１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、
１ｍｌの滅菌蒸留水中に再懸濁する。生じるＯＭＰ調製物を−６０℃で保存する
。
【０１７５】
ラウロイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ基を含有する分子模倣物を、等重量のラウロイル
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ誘導体と界面活性剤溶液（１％ ＤＯＣ、０．０５Ｍグリシン
、および０．００５Ｍ ＥＤＴＡ）中に可溶化したＯＭＰビヒクルとを合わせる
ことによる疎水的相互作用を介して、ＯＭＰビヒクルと複合体化する。この溶液
を、１０，０００ダルトンの分子量化カットオフを有する透析チューブ中に配置
し、３Ｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対して、各１Ｌの２４時間にわたる３回の
緩衝液交換において透析する。
【０１７６】
（分子模倣物−キャリアタンパク質結合体の調製）キーホールリンペットヘ
モシニアン（ＫＬＨ、例えば、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を２ｍｌの蒸留水に再懸濁し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに
する。２００μｌのこの溶液を、１．５ｍｌの微量遠心管に添加する。Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド活性化エステルおよびＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（登録商標）
（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のようなマレイミド基を含むヘテロ
二官能性架橋剤（２ｍｇ）を１ｍｌの結合緩衝液（０．０８３Ｍ リン酸ナトリ
ウム、０．９Ｍ 塩化ナトリウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に溶解
する。１００μｌのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を、直ちにＫＬＨ溶液と合わせ、
周囲温度において、１時間反応させる。この溶液を、結合緩衝液で平衡化した１
．５ｃｍ×１０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにアプライする。ボイ
ドボリュームに溶出するマレイミド活性化ＫＬＨを収集し、保持する。システイ
ンアミノ酸を含む上記の分子模倣物を、１００μｌのＤＭＳＯ中に再懸濁し、マ
レイミド活性化ＫＬＨの溶液に添加する。混合液を、周囲温度で１８時間反応さ
せる。この反応を、最終濃度５ｍＭのβメルカプトエタノールの添加により停止
する。最後に、ハプテンキャリア結合体を、ＰＢＳで平衡化した２ｃｍ×２５ｃ
ｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでの浸透ゲルクロマトグラフィーによっ
て、精製する。カラムを２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターする。
【０１７７】
（実施例７）
（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピトープの低分子模倣物による、ＮＰｒ−Ｍｅ
ｎＢ ＰＳへの抗体の結合の阻害）
ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピトープの低分子模倣物（構造５Ａ（１）、５Ｂ（
１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２））を上記のように合成した。これらの分子
模倣物は、以下の構造を有する：
【０１７８】
【化３４】
【０１７９】
【化３５】
【０１８０】
【化３６】
【０１８１】
【化３７】
【０１８２】
競合的固相ファージＥＬＩＳＡ手順を使用して、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
に対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピ
トープの低分子模倣物の能力について評価した。モノクローナル抗体を０．５〜
１のＯＤを生じるような濃度にまで、ＰＢＳ中で予め希釈したことを除いて、オ
リゴマーＥＬＩＳＡによって、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに対する抗体の阻害のア
ッセイを上記のように行った。次に、モノクローナル抗体を、レプリカプレート
のウェル（各々は７０μｌのＰＢＳおよびアセトニトリル／水（１：１）中に希
釈された５μｌのインヒビターを含み、これを５０μｌの抗体溶液の添加前に添
加した）に添加した。インヒビターおよび抗体を、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ Ｅ
ＬＩＳＡプレートとともに、周囲温度で、１時間インキュベートした。４つのＳ
ＥＡＭ抗体の４つの分子模倣物による阻害の結果を、図１Ａ〜Ｄのグラフに示す
。特に、図１は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）
による、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／
ｍｌ）、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、および（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（
１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度依存性阻害を示す。
【０１８３】
（（ａ）ＥＬＩＳＡプレート上に直接コートした分子模倣物との交差反応性
）
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ型式における分子模倣物に対する直接
的結合によって示される分子模倣物との交差反応するその能力について評価した
。使用した方法は、以下の例外を除き、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ ＥＬＩＳＡに
ついての上記の方法と類似の方法であった。抗体をＰＢＳ中に希釈し、そしてプ
レートを周囲温度で１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳで５回
洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、お
よびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）をＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡプ
レート上で周囲温度でインキュベートした。図２は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１
）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、
ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥ
ＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【０１８４】
（実施例８）
（構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のウシ血清
アルブミン結合体の調製）
ジメチルスルホキシド中の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、または
６Ｂ（２）の溶液（１５０μｌ、約５０ｍＭ）を、ジメチルスルホキシド中の５
０μｌの０．１７Ｍ ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と合わせた。約２０μｌの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｓｉ
ｇｍａ）、ｐＨ８．０を、反応から放出される酸を中和するために添加した。周
囲温度での１時間のインキュベーションの後、０．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。周囲温度での１８時間のイン
キュベーションの後、混合液を、ＰＢＳで平衡化した１０−ＤＧゲル濾過カラム
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に通すことにより精製した。画分
（０．５ｍｌ）を収集し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し
て、タンパク質の存在について試験した。タンパク質を含有する、カラムから溶
出する最初の３画分を合わせた。
【０１８５】
（（ａ）構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢ
ＳＡ結合体と、ＳＥＡＭ抗体との、交差反応性）
構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢＳＡ結合体
を、ＰＢＳ中に１：１０００で希釈し、各１００μｌを、マイクロタイタープレ
ート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃより入手可能）のウェルに添加した。このプレートを４℃で、オーバーナイト
インキュベーションした。このウェルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、２５０μｌ
のブロッキング緩衝液で満たし、非特異的結合部位をブロックするために周囲温
度で３０〜６０分間インキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で３回
洗浄した。試験する抗体を、ＰＢＳ中に希釈して、次に、各ウェルあたり１００
μｌ添加した。このプレートをカバーし、そして４℃でオーバーナイトインキュ
ベートした。
【０１８６】
オーバーナイトのインキュベーションの後、このウェルをＰＢＳで５回洗浄し
、そして、１ウェルあたり１００μｌの（ＰＢＳ中で１：２０００に希釈した）
アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリク
ローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）とともに、周囲温度で１時間インキュベートした。
次にプレートをＰＢＳで洗浄し、そして基質緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌに希釈した
新鮮に調製した基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｓｉｇｍａ）１００μ
ｌを、各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度の値を約３０分後に測定した
。図３は、上記の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）
に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｓ
ＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合
を示す。
【０１８７】
従って、ＭｅｎＢの独特なエピトープの新規分子模倣物、ならびにこれの取得
方法、および使用方法を開示する。本発明の好ましい実施態様は、ある程度詳細
に記載されているが、明白なバリエーションが、添付の請求の範囲によって規定
される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解さ
れる。
【０１８８】
（本発明の実施において有用な株の寄託）
以下のハイブリドーマ細胞株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２
３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ）に対して行った。示される受託番号が、生存率試験に成功し、そして必要な
手数料の支払い後に、割り当てられた。寄託は、特許手続上の目的のための微生
物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の条項およびその規則のもとにな
された（プタペスト条約）。これは、寄託の日より３０年間の期間生存可能な培
養物の維持を保証する。その寄託された生物は、ブタペスト条約の条文よって、
そしてＣｈｉｒｏｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとＡＴＣＣとの間の合意に従って
ＡＴＣＣより利用可能となる。このことは、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２およびそ
れに従う米国特許庁長官の規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１２を含む、特に８８
６ＯＧ６３８を参照）に従い、米国特許庁長官によってその生物に対する権利を
与えられると決定される者に対し、その子孫についての永久的かつ無制限の利用
可能性を保証する。特許の付与に際して、寄託された培養物に対する公衆の利用
可能性についての全ての制限は、取り消し不能に除去される。
【０１８９】
この寄託は、単に当業者の利便性のために提供され、そして３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．
§１１２のもとで要求される寄託の承認ではない。これらのハイブリドーマの核
酸配列、ならびにそれによってコードされる抗体分子のアミノ酸配列は、本明細
書において参考として援用され、そして本明細書における記載でのいかなる矛盾
の事象においても、支配的である。寄託された物質の製造、使用、または売却の
ためには、ライセンスが必要とされ得、そして本明細書においては、そのような
ライセンスは、全く付与されない。
ハイブリドーマ 寄託日 ＡＴＣＣ番号
ＳＥＡＭ−３ １９９６年８月１６日 ＨＢ−１２１７０
ＳＥＡＭ−１８ １９９６年８月１６日 ＨＢ−１２１６９
ＳＥＡＭ−２ １９９７年７月３０日 ＣＲＬ−１２３８０
ＳＥＡＭ−１２ １９９７年７月３０日 ＣＲＬ−１２３８１
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して細菌病原体に関する。特に、本発明は、自己免疫活性を欠く
抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）エピトープの分子模倣物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性髄膜炎および敗血
症の原因因子である。髄膜炎菌は、莢膜および細胞壁の抗原の免疫学的特徴に基
づいて血清学的群に分けられる。現在認識されている血清型には、Ａ、Ｂ、Ｃ、
Ｄ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚ、および２９Ｅが含まれる。血清型特異性を担うポ
リサッカライドは、いくつかのこれらの群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｗ−１３５、およ
びＹを含む）から精製されている。
【０００３】
Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（「ＭｅｎＢ」）は、合衆国および
ヨーロッパに居住する乳児および小児における細菌性髄膜炎の約５０パーセント
を占める。この生物はまた、若年成人に致死的な敗血症を引き起こす。青年にお
いて、外膜タンパク質（ＯＭＰ）粒子からなる実験的ＭｅｎＢワクチンが、約５
０％防御的であることが見出されている。しかし、防御は、ワクチン接種された
幼児および小児（疾患の最も大きな危険にある年齢群）において観察されていな
い。さらに、ＯＭＰワクチンは、血清型特異的かつサブタイプ特異的であり、そ
して優勢なＭｅｎＢ株は、地理的および時間的変化の両方を受け、このようなワ
クチンの有用性を制限する。
【０００４】
莢膜ポリサッカライドに基づく有効なワクチンは、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、および
Ｗ１３５によって引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対して開発されている。しか
し、ＭｅｎＢポリサッカライドワクチンを開発する類似の試みは、莢膜ＭｅｎＢ
ポリサッカライド（本明細書中で、「ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれる）の乏しい免
疫原性に起因して失敗している。ＭｅｎＢ ＰＳは、（Ｎ−アセチル（α２→８
）ノイラミン酸のホモポリマーである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ
１は、同一の莢膜ポリサッカライドを有する。ＭｅｎＢ ＰＳによって惹起され
る抗体は、宿主のポリシアル酸（ＰＳＡ）と交叉反応する。ＰＳＡは、胎児およ
び新生児組織において豊富に、特に脳組織中に見出される神経細胞接着分子（「
ＮＣＡＭ」）上で発現される。ＰＳＡはまた、腎臓、心臓、および嗅神経を含む
成人組織においてより低い程度にまで見出される。従って、ほとんどの抗Ｍｅｎ
Ｂ ＰＳ抗体もまた、自己抗体である。それゆえ、このような抗体は、胎児発達
に有害に影響を与えるか、または自己免疫疾患を導く能力を有する。
【０００５】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、ＭｅｎＢ ＰＳの不良な免疫原性を回避するための
試みにおいて調製されている。例えば、Ｃ3〜Ｃ8 Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ誘導体が記載されている。Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対するＥＰ公開第５０４，２
０２Ｂを参照のこと。同様に、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらに対する米国特許第４，７２
７，１３６号は、Ｎ−プロピオン化ＭｅｎＢ ＰＳ分子（本明細書中で「ＮＰｒ
−ＭｅｎＢ ＰＳ」と呼ばれる）を記載する。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質
で免疫したマウスは、ＩｇＧ抗体の高力価を誘発すると報告された。Ｊｅｎｎｉ
ｎｇｓら（１９８６）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１７０８。ウサギにおい
て、抗体の２つの異なる集団（２つの異なるエピトープに結合し、１つは天然の
ＭｅｎＢ ＰＳにより共有されていて、１つは共有されていないと報告されてい
る）が、誘導体を用いて産生された。殺菌活性が、ＭｅｎＢ ＰＳと交叉反応し
なかった抗体集団において見出された。Ｊｅｎｎｉｎｇｓら（１９８７）Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：１２０７。この結合体によって惹起された防御的
抗体と反応する細菌表面のエピトープの同一性は、未知なるままである。
【０００６】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体、および他のポリサッカライド結合
タンパク質に結合することによってポリサッカライドの模倣物として作用し得る
。例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（これは、末端α連結マンノースまた
はグルコース残基を有するオリゴサッカライドに結合する）は、ｐＩＩＩコート
タンパク質のアミノ末端に短いペプチド配列を有する細菌性ファージのランダム
ライブラリー由来のペプチド模倣物を選択するために使用されている。Ｏｌｄｅ
ｎｂｅｒｇら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ８９：５３９３； Ｓｃｏｔｔら（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９８。同様に、モノクローナル抗
体は、ファージライブラリー由来の腺ガン細胞の表面上に存在する炭水化物のペ
プチド模倣物を同定した。Ｈｏｅｓｓら（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８：４３。
【０００７】
ペプチドは、ポリサッカライド特異的抗体もまた惹起し得る。例えば、Ｗｅｓ
ｔｅｒｉｎｋら（１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５６：１１２０は
、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ（「ＭｅｎＣ」）莢膜ポリサッカラ
イドに対するモノクローナル抗体を、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使
用した。抗イディオタイプ抗体で免疫したマウスは、致死的用量のＭｅｎＣ細菌
での感染から防御された。これらの実験者らは、引き続き、ＭｅｎＣ抗イディオ
タイプ抗体のペプチドフラグメントが血清抗ＭｅｎＣ抗体を誘発し、そして動物
をＭｅｎＣ細菌での致死的抗原投与後の菌血症および死から防御することを示し
た。Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：４０２１。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、現在までに、このようなアプローチはＭｅｎＢワクチンの開発に関し
て採用されていない。ＭｅｎＢに対する安全でかつ効果的なワクチンの産生が特
に望ましいことは、容易に明白である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
共有に係る米国特許出願第０８／９２５，００２（１９９７年８月２７日出願
）において、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向される、多数の機能的に活性な
抗体が記載されている。これらの抗体は、宿主組織とは交叉反応しないか、また
は最小限に交叉反応性であり、従って、自己免疫疾患を惹起するリスクを最小限
に提起し、そして本明細書において「非自己反応性」と称する。これらの非自己
反応性抗体を本明細書において使用して、ワクチン組成物において使用され得る
独特なＭｅｎＢ ＰＳエピトープの分子模倣物を同定する。したがって、本発明
は、以下をも提供する。
（項目１）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（
ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物であって、以下の式１：
【化１】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、該環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまでの
ヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【化２】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである、
分子模倣物。
（項目２）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化３】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
分子模倣物。
（項目３）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化４】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
分子模倣物。
（項目４）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造：
【化５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり；Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり、そしてｐ＝０〜３である、
分子模倣物。
（項目５）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造からなる
群より選択される構造：
【化６】
および
【化７】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化８】
である、
分子模倣物。
（項目６）項目１に記載の分子模倣物であって、以下の構造からなる
群より選択される構造：
【化９】
および
【化１０】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化１１】
である、
分子模倣物。
（項目７）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（
ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤と組
合せて含む組成物であって、該模倣物が以下の構造：
【化１２】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、該環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまでの
ヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【化１３】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである、
組成物。
（項目８）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１４】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目９）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目１０）項目７に記載の組成物であって、以下の構造：
【化１６】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である、
組成物。
（項目１１）項目７に記載の組成物であって、以下の構造からなる群
より選択される構造：
【化１７】
および
【化１８】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化１９】
である、
組成物。
（項目１２）項目７に記載の組成物であって、以下の構造からなる群
より選択される構造：
【化２０】
および
【化２１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３であり；Ｒ8はＨまたはＣＯＣＨ3であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【化２２】
である、
組成物。
（項目１３）前記分子模倣物がキャリア分子に共有結合している、請求
項７に記載の組成物。
（項目１４）前記分子模倣物がキャリア分子に非共有結合的に会合して
いる、項目７に記載の組成物。
（項目１５）さらに、免疫学的アジュバントを含む、項目７に記載の
組成物。
（項目１６）哺乳動物被験体においてＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、予防するた
めの組成物の製造における、項目１に記載の分子模倣物の使用。
（項目１７）前記組成物が免疫学的アジュバントをさらに含む、項目
１６に記載の使用。
（項目１８）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための方法であって、
該方法が：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供
する工程；
（ｂ）該集団を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ莢
膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性では
ない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、該接触させる工程を
、該抗体と存在する場合該分子との間の免疫学的結合を可能にして複合体を提供
する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、該結合していない分子から分離する工程、
を包含する、方法。
（項目１９）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
および／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体を、生物学的サンプル中で検出するため
の方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）該生物学的サンプルと、項目１に記載の分子模倣物とを、Ｎｅｉｓｓ
ｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ
１抗体が、該生物学的サンプル中に存在するときに、該分子模倣物に結合して、
抗体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；な
らびに
（ｃ）該複合体の存在または非存在を検出し、それにより、該サンプル中での
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃ
ｏｌｉ Ｋ１抗体の存在または非存在を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目２０）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
および／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１感染を検出するための免疫診断試験キットで
あって、該試験キットが、項目１に記載の分子模倣物および該免疫診断試験を
行うための指示書を含む、キット。
【００１０】
従って、１つの実施態様において、本発明は、ＭｅｎＢ ＰＳの独特なエピト
ープの分子模倣物に関する。これらの分子模倣物は、宿主組織に対して、交叉反
応しないかまたは最小限に交叉反応性であるＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して指向
された、機能的に活性な抗体を用いて同定された、新規の化合物からなる。この
ような新規の分子模倣物は、以下の構造１に代表される：
【００１１】
【化２３】
【００１２】
を有し、ここで：
Ｒ1は−ＮＲ5Ｒ6であり；
Ｒ2は−（ＣＨ2）p−Ｒ11であり、ここでｐは０〜８の整数であり；
Ｒ3はＨ、１−６Ｃアルキル、アリール、アルキルアリール、１−６Ｃアルケ
ニル、および１−６Ｃアルキニルであり；
Ｒ4は、−ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨ、−ＳＨまたは以下から
なるアミンの群より選択される多価リンカー部分であり：アミノ酸、ペプトイド
、ペプチド、および−ＮＨ（ＣＨ2）qＳＨであり、ここでｑは１〜５の整数であ
り；
Ｒ5は、Ｒ2、Ｈであるか、またはＲ5およびＲ6は一緒になって炭素環式または
アリール環を形成し、上記環が必要に応じてＮ、Ｏ、およびＳからなる２つまで
のヘテロ原子を含み；
Ｒ6は、−ＣＯ−（ＣＨ2）m−Ｒ7であり、ここでｍは１〜６の整数であり；
Ｒ7は、
【００１３】
【化２４】
【００１４】
であり、ここで、ｎは０〜５の整数であり；
Ｒ8は、Ｈ，１−３Ｃアルキルおよびアシルであり；
Ｒ9は、−ＮＨ2、−ＮＨ−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、アシル、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ
；−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであって
、ここでｎ＝０のときＲ9は−ＮＨ−ＮＨ2ではなく；
Ｒ10は、Ｈ、１−６Ｃアルキル、ハロゲン、ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシ
ル、アミノ、１−５Ｃアルキルアミノ、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｓ−ア
ルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドであり；そして
Ｒ11は、必要に応じて置換されている炭素環式環もしくはアリール、−ＣＨ＝
ＣＨ−（ＣＨ2）p−ＣＨ3、−ＣＦ3、−ＯＨ、１−６Ｃアルコキシ、アシル、ア
ミノ、−Ｎ（ＣＨ3）2、−ＮＨ−ＮＨ2、アミド、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ；−Ｓ−
アルキル、−Ｓ−アリール、スルホン酸およびスルホンアミドである。
【００１５】
好ましい実施態様において、本発明の分子模倣物は、以下の構造に代表される
：
【００１６】
【化２５】
【００１７】
を有し、ここで
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００１８】
【化２６】
【００１９】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００２０】
【化２７】
【００２１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、そしてｐ＝０〜
３である；
【００２２】
【化２８】
【００２３】
および
【００２４】
【化２９】
【００２５】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００２６】
【化３０】
【００２７】
である；
【００２８】
【化３１】
【００２９】
および
【００３０】
【化３２】
【００３１】
を有し、ここで、
ＸはＯ、Ｎ、ＳまたはＣＨ2であり；Ｒ3はＨまたはアルキルであり；Ｒ4は−
ＮＨ2、−ＮＨＯＨ、−ＮＨＮＨ2、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ8はＨまたは
ＣＯＣＨ3であり；そしてｐ＝０〜３であり；そして
Ｒ9は−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＮＨ2または
【００３２】
【化３３】
【００３３】
である。
【００３４】
別の実施態様において、本発明は、上記に記載のような、ＭｅｎＢの独特なエ
ピトープの分子模倣物を、薬学的に受容可能な賦形剤とともに含む組成物に関す
る。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物被験体において、ＭｅｎＢおよび
／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を、予防するための方法であって、上記組成物
の有効量を上記被験体に投与する工程を包含する、方法に関する。
【００３６】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂ（ＭｅｎＢ）の独特なエピトープの分子模倣物を単離するための
方法に関し、上記方法は：
（ａ）ＭｅｎＢの独特なエピトープの推定分子模倣物を含む分子の集団を提供
する工程；
（ｂ）上記集団を、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ
莢膜ポリサッカリド（ＭｅｎＢ ＰＳ）に対して指向され、そして自己反応性で
はない抗体と、ＥＬＩＳＡにおいて接触させる工程であって、上記接触させる工
程を、上記抗体と、存在する場合上記分子との間の免疫学的結合を可能にして複
合体を提供する条件下で実施する、工程；ならびに
（ｃ）該複合体を、上記結合していない分子から分離する工程、
を包含する。
【００３７】
別の実施態様において、本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ
ｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体を、生物学的サンプル中
で検出するための方法であって、上記方法は以下の工程：
（ａ）生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）上記生物学的サンプルと、本発明の分子模倣物とを、Ｎｅｉｓｓｅｒｉ
ａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体
が、上記生物学的サンプル中に存在するときに、上記分子模倣物に結合して、抗
体／模倣物複合体を形成することを可能にする条件下で、反応させる工程；なら
びに
（ｃ）上記複合体の存在または非存在を検出し、それにより、上記サンプル中
でのＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂおよび／またはＥ
．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体の存在または非存在を検出する工程、を包含する方法に関
する。
【００３８】
本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書における開示を参照すれば、
当業者は容易に実施する。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒菱形）、構造５Ｂ（１）（黒四角）、構造６Ａ（１）（黒三角）、および構造６Ｂ（１）（黒丸）による、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの、（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合の濃度依存性阻害を示す。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ形式における、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【図３】図３は、構造５Ａ（１）、構造５Ｂ（１）、構造６Ａ（１）、および構造６Ｂ（１）のＢＳＡ結合体とＳＥＡＭ抗体との交叉反応性を示す。特に、図３は、構造５Ａ（１）（黒棒）、構造５Ｂ（１）（白棒）、構造６Ａ（１）（影棒）、および構造６Ｂ（１）（斜線棒）に対する、ＳＥＡＭ３（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０μｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（μｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０μｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さなければ、当該分野の技術内の免疫学、微生物学、
および分子生物学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分
に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｏ
ｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版、
１９７３）；ＣａｒｅｙおよびＳｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａ
ｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第２版、１９８５）；Ｓｍｉｔｈ、Ｍ．Ｂ．、Ｏ
ｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９４）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８
４）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ． ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ． Ｂｌａｃｋｗｅ
ｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｓｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎ）を参照のこと。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形態「ａ」、「
ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他にその内容が明確にそうではないことを意味す
るものでないときは、複数の言及を含む。
【００４２】
（定義）
本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように
定義されることが意図される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合「ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体」とは、ＭｅｎＢの天然
の莢膜ポリサッカライドの化学的改変によって得られた分子をいう。このような
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、適切なアシル基（例えば、Ｃ3〜Ｃ8およびより高級な
アシル基（ここで用語「アシル基」は任意のアシル化された直鎖状分子、分枝状
分子、脂肪族分子、または芳香族分子を含む））との、天然の分子のシアル酸残
基Ｎ−アセチル基の置換によって改変されているＭｅｎＢ ＰＳ分子を含むが、
これらに限定されない。本明細書中での使用に対して特に好ましいＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ誘導体は、天然のＭｅｎＢ ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ−プロピオニ
ル基での置換を含む（本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ」と称する）。Ｎ
−アシル置換ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む）を合成す
るための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓらの
米国特許第４，７２７，１３６号およびさらにＪｅｎｎｉｎｇｓらのＥＰ公開番
号第５０４，２０２ Ｂ号に記載される。
【００４４】
ＭｅｎＢ ＰＳまたはＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の「分子模倣物」とは、ＭｅｎＢ
細菌上に発現される少なくとも１つの「独特の」エピトープを機能的に模倣する
分子である。「独特のエピトープ」は、宿主組織のポリシアル酸と交叉反応しな
い（それゆえ自己免疫活性を欠く）か、または最少に交叉反応するかのいずれか
である機能的に活性な（例えば、オプソニン媒介性殺菌および／または補体媒介
性殺菌）抗ＭｅｎＢ抗体の形成を惹起し得るエピトープである。このような分子
模倣物は、ワクチン組成物において有用であり、そして以下でさらに記載される
診断的な適用または治療的適用のための抗体の惹起において有用である。分子模
倣物には、小有機化合物；核酸および核酸誘導体；サッカライドまたはオリゴサ
ッカライド；ペプチド、タンパク質、およびそれらの誘導体を含むペプチド模倣
物（例えば、非ペプチド有機部分を含むペプチド、アミノ酸および／またはペプ
チド結合を含んでもよいし、含まなくてもよいが、ペプチドリガンドの構造的特
徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド）；ピロリジン；Ｎ−置換グリシン
を含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド（例えば、Ｓｉｍｏｎら（
１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９
３６７に記載されるペプトイドおよびオリゴペプトイド））；ならびに抗体（こ
れは、抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
分子模倣物の同定および生成のための方法は、以下により十分に記載される。
【００４５】
用語「アルキル」とは、本明細書において使用される場合、１〜２４炭素原子
の、分枝もしくは分枝していない、飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル
、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）、な
らびに環式アルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）をいう
。本明細書において、好ましいアルキル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして
最も好ましいアルキル基は、１〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必
要に応じて、１以上のアルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、
ニトロ、アシル、カルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどに
より置換されている。
【００４６】
用語「アルケニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原
子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの二重結合を含む炭化水素
基（例えば、エテニル、ｎ−プロペニル、イソプロペニル、ｎ−ブテニル、イソ
ブテニル、ｔ−ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセ
ニル、エイコセニル、テトラコセニル）、ならびに３〜８、好ましくは５または
６の炭素原子の環式アルケニル基などをいう。本明細書において、好ましいアル
ケニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして最も好ましいアルケニル基は、１
〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は、必要に応じて、１以上のアルキル
、アルコキシ、ヒドロキシル、アミノ、アミド、ハロゲン、ニトロ、アシル、カ
ルボキシル、チオール、スルホン酸、スルホンアミドなどにより置換されている
。
【００４７】
用語「アルキニル」とは、本明細書において使用される場合、２〜２４炭素原
子の、分枝もしくは分枝していない、少なくとも１つの三重結合を含む炭化水素
基（例えば、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソ
ブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニル）などをいう。本明細書におい
て、好ましいアルキニル基は、１〜１２炭素原子を含み、そして好ましくは、１
〜６炭素原子を含む。さらに、これらの基は必要に応じて上記のように置換され
ている。
【００４８】
用語「アリール」とは、本明細書において使用される場合、必要に応じて１以
上のへテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、およびＳ）を含む、５員環、６員環または７
員環を含む、モノ、ビ、トリおよびテトラ環式芳香族種をいう。例は、以下を含
むがこれらに限定されない：フェニル、ベンジル、ナフチル、ピロール、フラン
、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジ
ン、ピリミジン、プリン、キノリン、イソキノリン、カルバゾール、フェナント
レン、アントラセン、ベンゾピレン、アズレン、インドール、インダンなど。さ
らに、これらの基は必要に応じて上記のように置換されている。
【００４９】
用語「アルキルアリール」とは、本明細書において使用される場合、アルキル
に結合したアリール環をいい、ここで用語アルキルおよびアリールは上記のとお
りである。
【００５０】
用語「炭素環式環」とは、本明細書において使用される場合、上記に記載のよ
うにシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルをいい、必要
に応じて、１以上のへテロ原子（例えば、Ｎ、ＯおよびＳ）を含む。さらに、こ
れらの基は、必要に応じて、上記のように置換されている。
【００５１】
用語「アルコキシ」とは、本明細書において使用される場合、単一の末端エー
テル結合を介して結合したアルキル基を意図する。すなわち、「アルコキシ」基
は、ＯＲとして規定され、ここでＲは上記に規定のようなアルキルである。好ま
しい実施態様において、アルコキシ基は、１〜６の、より好ましくは１〜４の炭
素原子を含有する。
【００５２】
用語「アシル」とは、分子置換基ＲＣＯ−をいうためにその従来の意味で用い
られ、ここでＲは上記に規定されるようなアルキルである。好ましい実施態様に
おいて、アシル基は、１〜６、より好ましくは１〜４の炭素原子を含むアルキル
を含む。
【００５３】
用語「ペプトイド」とは、本明細書において使用される場合、Ｎ置換されたグ
リシンのオリゴマーを含み、そして用語オリゴマーＮ置換グリシン（ＮＳＧ）と
交換可能に使用される。
【００５４】
用語「多価リンカー部分」とは、任意の適切なまたは結合可能な部分に結合さ
れ得る、任意の適切なリンカーを表し、これは、セラミドまたはタンパク質もし
くはペプチド（多重抗原ペプチドを含む）を含み、そして好ましくは、その上に
反応基を有する、他の分子（例えば、分子模倣物など）と共有結合を可能にする
基である。
【００５５】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体調製物およびモノクローナル抗体調製物
ならびにハイブリッド抗体、変化された抗体、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆ
（ａｂ）分子、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント可
変物（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、およびもとの抗体分子の免
疫学的結合特性を示すそれらの機能的なフラグメントを含む調製物を含む。
【００５６】
本明細書中で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均質な抗体集団を
有する抗体組成物をいう。この用語は、それが作製される様式によって限定され
ない。この用語は、免疫グロブリン分子全体ならびにＦａｂ分子、Ｆ（ａｂ’）
2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ファージ上に提示された単鎖フラグメント
可変物（ｓｃＦｖ）、およびもとのモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性
を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製す
る方法は当該分野で公知であり、そして下記により十分に記載される。
【００５７】
「抗原」は、本明細書において、抗体分子によって特異的に結合され得る任意
の物質を含むと規定される。「免疫原」は、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ
球活性化を開始し得る抗原である。
【００５８】
「エピトープ」とは、特定のＢ細胞およびＴ細胞が応答する抗原上の部位をい
う。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用
される。タンパク質、ポリサッカリドもしくは他の生体高分子上のＢ細胞エピト
ープ部位は、その高分子の異なる部分からの部分から構成され得、これらは折り
畳みによって一緒にされている。この種のエピトープは、立体配座的または不連
続エピトープといわれる。なぜなら、この部位は、線形な順序で不連続であるが
、折り畳まれた立体配座において連続であるポリマーのセグメントから構成され
るからである。生体高分子もしくは他の分子の単一のセグメントから構成される
エピトープは、連続もしくは線形的エピトープといわれる。Ｔ細胞エピトープは
一般的に線形ペプチドに限定される。ペプチドエピトープは、そのエピトープに
独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、
エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、より通常には少
なくとも８〜１０のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメ
ーションを決定する方法は当該分野で公知であり、そして例えば、Ｘ線結晶学、
および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピ
トープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、
Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定
するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，
８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；
およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するた
めの技術）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体が、単純な免疫アッセ
イにおいて同定され得る。この単純な免疫アッセイは、ある抗体が標的抗原に対
する別の抗体の結合をブロックする能力を示す。
【００５９】
「独特のＭｅｎＢエピトープ」は、本明細書において、ＭｅｎＢ細菌上に存在
するエピトープと規定される。ここで、このエピトープを指向する抗体はＭｅｎ
Ｂに特異的に結合し得、そして宿主組織の表面上に存在するシアル酸残基と交叉
反応しないか、または最小限に交叉反応する。従って、１つ以上の「独特のＭｅ
ｎＢエピトープ」を含むか、または模倣する免疫原は、ＭｅｎＢ疾患の予防のた
めのワクチンにおいて有用であり、そして自己免疫応答を惹起しないか、または
自己免疫応答を惹起する最少の危険を与える。
【００６０】
本明細書中に記載されるアッセイを使用して決定される、ＭｅｎＢに対する補
体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を抗体分子が示す場合、その抗
体はＭｅｎＢ生物に対する「機能的な活性」を示す。
【００６１】
本明細書中に記載される結合アッセイを使用して決定される、宿主組織中のポ
リシアル酸との交叉反応性免疫学的結合特性をその抗体が示さない場合、「独特
の」ＭｅｎＢエピトープに対して特異的な抗体は、「自己免疫活性を欠き」、そ
して／または「自己反応性ではない」。
【００６２】
本明細書中で記載される結合アッセイにおいてポジティブであるとみなされる
公知の交叉反応性自己抗体と比較して、宿主組織のポリシアル酸への結合を示す
のに約１０倍高い抗体濃度を、その抗体が必要とする場合、「独特の」ＭｅｎＢ
エピトープに対して特異的な抗体は「最小限に自己反応性」を示し、そして／ま
たは「最小限に自己反応性」である。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は
、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる非共
有結合的な相互作用の型をいう。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「生物学的サンプル」とは、被験体から単
離された組織または液体のサンプルをいい、これらには、例えば、血液、血漿、
血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚サンプル、皮膚、呼吸管、
腸管および尿生殖管の外分泌物、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検を含むがこ
れらに限定されず、そしてまた、インビトロ細胞培養成分のサンプルは、培養培
地中の細胞および組織（例えば、組換え細胞）の増殖／成長から得られた馴化培
地および細胞成分を含む。
【００６５】
本明細書において使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」と
は、検出可能な分子をいい、これは、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、酵素
、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、色素原、色素、金属イオン、金属
ゾル、リガンド（例えば、ビオチンもしくはハプテン）などを含むがこれらに限
定されない。用語「蛍光体」とは、検出可能な範囲内で蛍光を示し得る物質もし
くはその一部をいう。本発明のもとで使用され得る標識の特定の例は、フルオレ
セイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ
ｅ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシダー
ゼを含む。
【００６６】
（発明を実施する形態）
本発明は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ（Ｍｅｎ
Ｂ）の独特なエピトープの分子模倣物の発見（これは、ＭｅｎＢに対して指向さ
れた機能的抗体を用いて同定された）に基づく。抗体は、宿主組織中のポリシア
ル酸と交叉反応しないか、または最小限に交叉反応性であり、それゆえ、この抗
体は、宿主組織と高度に交叉反応性である抗体よりも自己免疫活性を惹起する危
険性が低い。この模倣物を診断試薬として使用し、そして／または、ＭｅｎＢお
よびＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１疾患を予防するための組成物に使用し得る。
【００６７】
上記で説明されるように、ＭｅｎＢの天然の莢膜ポリサッカライド（本明細書
中で「ＭｅｎＢ ＰＳ」という）は、ヒトおよび他の哺乳動物被験体において不
免疫原性に乏しい。さらに、天然のＭｅｎＢ ＰＳは、自己抗体の産生を惹起し
得、それゆえ、ワクチン組成物における使用には不適切であり得る。従って、本
発明は、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体に対して調製された抗体を使用する。これらの抗
体は、ＭｅｎＢ細菌に対する機能活性（ここで、この機能活性はＭｅｎＢ疾患に
対する防御を付与することにおいて重要である）を示すそれらの能力に基づいて
選択される。この抗体はまた、最小限または検出不可能な自己免疫活性を示すこ
とに基づいて選択された。
【００６８】
より詳細には、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、本発明の分子模倣物を同定するため
に使用される抗体分子を得るために調製された。この誘導体は、一般に、天然の
分子のシアル酸残基Ｎ−アセチル基のＣ3〜Ｃ8アシル置換体を含む。特に好まし
いＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、天然ＭｅｎＢ ＰＳのＮ−アセチル基についてのＮ
−プロピオニル基の置換を含み、これは、本明細書中で「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ」という。Ｍｅｎ ＰＳ誘導体を合成するためのこのような誘導体および方法
は、例えば、米国特許第４，７２７，１３６号およびＥＰ公報第５０４，２０２
Ｂ号（両者ともＪｅｎｎｉｎｇｓら）に記載される。
【００６９】
Ｃ3〜Ｃ8アシル誘導体は、まず天然のＭｅｎＢ（例えば、Ｎ． ｍｅｎｉｎｇ
ｉｔｉｄｉｓ培養物から得られる）を強塩基の存在下で処置して定量的にＮ−ア
セチル基を除去し、そしてこの分子のシアル酸残基部分内の反応性アミン基を提
供することにより作製され得る。次いで、脱アシル化ＭｅｎＢ ＰＳフラグメン
トはＮ−アセチル化される。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの場合、脱アシル
化分子は、米国特許第４，７２７，１３６号（Ｊｅｎｎｉｎｇｓら）に記載され
るように、無水プロピオン酸または塩化プロピオニルのようなプロピオニル基の
供給源を用いてＮ−プロピオニル化される。Ｎ−アセチル化の程度は、例えば、
ＮＭＲ分光学を用いて決定され得る。一般に、反応条件は、Ｎ−アセチル化の程
度が少なくとも約８０％であるように選択される。
【００７０】
ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の免疫原性を増大させるために、誘導体を適切なキャリ
ア分子に結合させて複合糖質を提供し得る。詳細には、十分に規定されそして制
御された構造的立体配置を有するＮ−アセチル化ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質調製物
は、以下に記載のように、中間サイズのＮ−アセチル化ＭｅｎＢオリゴサッカラ
イドから形成され得る。
【００７１】
従って、Ｎ−アセチル化ＭｅｎＢ ＰＳ複合糖質の一群（その一例は、本明細
書中で「ＣＯＮＪ−２」といわれる）は、以下のように調製され得る。例えば、
ＮＭＲ分析により決定される場合、実質的に１００％のＮ−アシル化シアル酸残
基を有するＮ−アシル化ＭｅｎＢ ＰＳ調製物は、緩和な酸性条件下で断片化さ
れ、種々の大きさのオリゴサッカライド分子の集団を提供し得る。断片化産物は
、例えば、標準的なイオン交換クロマトグラフィー技術を、例えば段階的塩濃度
勾配と組合せて使用してサイズ分画され、同質のサイズのＮ−アシル化ＭｅｎＢ
分子の画分を提供する。中間サイズのオリゴサッカライドを含む画分（例えば、
約５〜約２２、好ましくは１０〜約２０、そしてより好ましくは約１２〜約１８
の平均Ｄｐを有する）は、非還元末端において化学的に末端活性化され、そして
還元的アミノ化技術によりタンパク質キャリアに結合され、ＣＯＮＪ−２複合糖
質を提供する。首尾良い複合体化は、例えば、ゲル濾過により決定され得、そし
て最終のサッカライドのタンパク質に対する比率（ｗ／ｗ）は、呈色アッセイに
より評価され得る。
【００７２】
次いで、ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体（例えば、ＣＯＮＪ−２）から形成される複合
糖質を、本明細書中で使用して免疫化宿主における抗サッカライド抗体の形成を
惹起する。このような抗体のサブセットは、本明細書中に記載される結合アッセ
イを用いて決定される場合、ＭｅｎＢ細菌に結合するはずであるか、宿主組織シ
アル酸残基と交叉反応しないはずであるか、または最小限に交叉反応性であるは
ずである。抗体は、アイソタイプ、精緻な抗原特異性、機能活性、および宿主組
織との交叉反応性に関して十分に特徴づけられ得る。
【００７３】
例えば、哺乳動物被験体（簡便には、齧歯類およびウサギのような標準的な実
験動物）は、複合糖質を含む組成物を、適切なアジュバントと共に免疫してポリ
クローナル血清の産生を惹起し得る。動物の群は、一般に、その組成物で免疫化
され、そして何回か追加免疫される。免疫化された動物由来の抗血清が得られ得
、そして宿主組織と交叉反応しないポリクローナル血清は、インサイチュ吸着ま
たは従来のアフィニティークロマトグラフィー技術を用いて得られ得る。首尾良
い複合糖質抗原は、Ｔ細胞依存性抗原の特徴である、実質的なＩｇＧ抗ＭｅｎＢ
ＰＳ誘導体−抗体応答を惹起するそれらの能力により同定され得る。高度に免
疫原性であり、そして主にＩｇＧ抗体を産生することが見い出されている複合体
は、本発明の方法における使用について特に好ましい。
【００７４】
細菌性抗血清の形成を惹起し得るＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、モノクローナル抗
体の産生における使用に適している。より詳細には、種々のＭｅｎＢ ＰＳ誘導
体結合体を提供するために使用されるプロセスは、ＭｅｎＢ生物の表面に見い出
されるエピトープを模倣し、そして宿主において最小限に発現される独特のサッ
カライド関連エピトープを提示する優れた免疫原を産生するために設計される。
従って、本明細書中に記載されるＭｅｎＢ ＰＳ誘導体は、抗ＭｅｎＢワクチン
についての独特のエピトープを提供するＭｅｎＢポリサッカライド抗原の模倣物
について検索するのに使用されるＭｅｎＢ特異的な抗体の産生を惹起し得る。
【００７５】
従って、本発明の実施において、選択されたＭｅｎＢ誘導体を使用して、モノ
クローナル抗体およびその機能的等価物を提供する。本明細書中において使用さ
れる、特定のモノクローナル抗体に関する用語「機能的等価物」は、以下である
分子を意味する：（ａ）例示的なモノクローナル抗体を交叉ブロックする；（ｂ
）問題のＭｅｎＢ ＰＳ誘導体または複合糖質に選択的に結合する；（ｃ）本明
細書中に記載される結合アッセイを用いて決定される場合、宿主ＰＳＡ（および
、必要に応じて、以下に記載される標準的なアッセイにより決定される場合、Ｍ
ｅｎＢ細菌性細胞に対する活性（例えば、補体媒介性殺菌活性および／またはオ
プソニン活性））とは交叉反応しないか、または最小限に交叉反応する。さらに
、本発明の特定のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関して本明細
書中において使用される場合、用語「子孫」は、世代または核型の同一性に係わ
らず、親により産生されるモノクローナル抗体を産生する、親のハイブリドーマ
のすべての誘導体、子孫（ｉｓｓｕｅ）、子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）を含むこ
とが意図される。
【００７６】
モノクローナル抗体は、当該分野で周知の標準的な技術（例えば、Ｋｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５）の方
法によって、またはその改変（例えば、Ｂｕｃｋら（１９８２）Ｉｎ Ｖｉｔｒ
ｏ １８：３７７により記載される））を使用して調製される。代表的には、マ
ウスまたはラットを、タンパク質キャリアに結合しているＭｅｎＢ ＰＳ誘導体
で免疫し、追加免疫し、そして脾臓（および必要に応じていくつかの大きなリン
パ節）を取り出し、そして単一細胞に解離する。所望であれば、脾臓細胞は、細
胞懸濁液を抗原でコートされたプレートまたはウェルに適用することにより、ス
クリーニングされ得る（非特異的接着細胞の除去後）。抗原に特異的な膜結合型
イムノグロブリンを発現するＢ細胞がプレートに結合し、そして懸濁液の残渣と
ともにはリンス除去されない。次いで、得られたＢ細胞、またはすべての剥離し
た脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合を誘発さ
せる。ハイブリドーマ形成（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）における使用のため
の代表的なマウスミエローマ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（
ＡＴＣＣ）から入手可能なミエローマ株を含む。
【００７７】
より詳細には、体細胞ハイブリッドは、Ｂｕｃｋら（前出）の方法により、ア
ザグアニン耐性非分泌マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ａ
ＴＣＣから入手可能）を用いて調製され得る。ハイブリドーマ細胞株は、一般に
限界希釈法によりクローン化され、そして免疫抗原に特異的に結合し、そして無
関係の抗原に結合しない抗体の産生についてアッセイされる。次いで、選択され
たモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶
または中空繊維反応器中）、またはインビボ（例えば、マウスの腹水）のいずれ
でも培養される。
【００７８】
ハイブリドーマ上清は、例えば、免疫化ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体または天然のＭ
ｅｎＢ ＰＳ（ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳ）を用いる固相ＥＬＩＳＡまたは間接免
疫蛍光アッセイのいずれかを用いて、抗ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体反応性抗体につい
てアッセイされ得る。ハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体の選
択性は、競合的特異的結合アッセイ（例えば、阻害ＥＬＩＳＡなど）を用いて評
価され得る。例えば、緩衝液か、または可溶性ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体もしくはＮ
Ａｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む緩衝液のいずれか中に希釈されている抗体分子は、
結合したＭｅｎＢ ＰＳ誘導体の存在下でＥＬＩＳＡ容器中で反応される。洗浄
後、結合抗体は、二次抗体としての標識抗Ｉｇ（抗ＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ
）により検出される。可溶性ＭｅｎＢ ＰＳ誘導体により阻害される抗体は、特
異的であると考慮され得、従ってさらなる研究（アイソタイプ決定および交叉反
応性、機能活性および自己反応性についてのさらなるスクリーニングを含む）の
ために選択され得る。
【００７９】
特に、部分精製したモノクローナル抗体分子は、その細胞表面上にポリシアル
酸残基を発現する宿主細胞に結合するその能力について個々に評価され得る。こ
のような細胞は、自己免疫活性を示す抗体の検出についての代理標的を代表する
。１つの標的は、ヒト神経芽腫細胞株ＣＨＰ−１３４（これは、Ｌｉｖｉｎｇｓ
ｔｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：９４４３に記載される
ように、長鎖α２−８ポリシアル酸（ＮＣＡＭ）をその細胞表面上に発現する）
を含む。また、Ｇｒａｎｏｆｆ、Ｄ．Ｍ．ら（１９８８）Ｔｈｅ Ｊ．ｏｆ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：５０２８−５０３６は、ヒトポリシアル酸とは交
叉反応しない独特のＭｅｎＢ ＰＳエピトープを規定する殺菌性モノクローナル
抗体を記載する。他の適切な標的は、以下を含むがそれらに限定されない：新生
児脳細胞、例えば腎臓、心臓および嗅覚神経由来の組織、培養伏在静脈内皮細胞
、細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞。例えば、Ｂｒａ
ｎｄｏｎら（１９９３）、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａ
ｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６：７７を参照のこと。ハイブリドーマから
得られるモノクローナル抗体分子は、培養物中の適切な試験細胞集団に添加され
得、そしてそのモノクローナル抗体の細胞標的に対する潜在的結合が、標識モノ
クローナルを用いて直接、または各々のモノクローナル抗体と特異的に反応する
適切な標識二次試薬（例えば、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡおよ
びＧならびに抗マウス抗体分子）を用いて間接的に、検出および定量され得る。
試験宿主組織ＰＳＡと交叉反応しないか、または最小限の反応性を示す抗体は、
本発明の目的について自己反応性とはみなされない。従って、これらの抗体は、
さらなる使用に適切である。さらに、試験組織との結合（この結合は試験細胞の
ノイラミニダーゼでの前処理によっては影響されない）を示すいくつかの抗体も
また、さらなる使用に適切であり得る。このような抗体の自己反応性は、本明細
書中で「不定な」と呼ぶ。
【００８０】
機能活性は、補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン活性を評価するこ
とにより測定され得る。詳細には、抗体の補体媒介性殺菌活性は、Ｇｏｌｄら（
１９７０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． １：４７９、Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋら（
１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ５６：１１２０、Ｍａｎｄｒｅｌｌら
（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：１２７９、およびＧｒａｎｏ
ｆｆら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． ２：５７４により記載されるような標準的なアッセイを使用して評価さ
れ得る。これらのアッセイにおいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを、補体供
給源とともに、および試験される抗体とともに反応させる。細菌計数を、種々の
試料採取時間で行う。補体媒介性殺菌活性を実証するこれらの抗体は、０時間で
のコロニー数と比較した場合、抗体および補体との６０分間のインキュベーショ
ンの後に測定される生存細菌細胞数において最小５０％の減少が実証される場合
、本発明の目的上、細菌活性を示すとみなされ、そしてさらなる使用に適切であ
る。
【００８１】
補体媒介性溶菌は、浸潤性の髄膜炎菌性疾患に対する宿主保護を担う主要な機
構であると考えられる。しかし、証拠は、オプソニン作用の重要な保護役割もま
た支持する（例えば、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕ
ｎ． ６３：１６０を参照のこと）。従って、本明細書中で産生される抗体のオ
プソニン活性は、機能活性を評価するための第二の手段として、または別の手段
として、評価され得る。オプソニンアッセイからの結果は、殺菌性データを補充
するために、および保護を与え得る抗体の選択を助けるために、使用され得る。
オプソニン活性の評価はまた、本明細書中で、ＩｇＧ１アイソタイプを有する本
発明のマウスモノクローナル抗体の評価のために特に有用である。マウスＩｇＧ
１は（ヒトＩｇＧ１と比較して）、補体の活性化に有効ではない。従って、マウ
スＩｇＧ１抗体は、上記のアッセイにおいて、ＭｅｎＢの補体媒介性溶菌を活性
化しない。しかし、ＩｇＧ１抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体の機
能活性は、補体の非存在下でのオプソニン作用により評価され得る。
【００８２】
種々のオプソニンアッセイ方法が、当該分野で公知であり、そして本発明のモ
ノクローナル抗体の機能活性を評価するために使用され得る。このような標準的
なアッセイには、Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｃａｎｄ．，Ｃ節 ９５：２８３、Ｈａ
ｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ
． ２１：２６７、Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ ９９：７６９、
Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌｓ １４：１５７、
Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９、Ｇｕｔｔｏｒｍ
ｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：２７７７、Ｇｕｔ
ｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １６７：１３１
４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６３：１
６０、Ｈａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７
１：１４８１、ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄ
ｉｓ． １７２：２６２、およびＶｅｒｈｅｕｌ， Ａ．Ｆ．Ｍ．（１９９１）
「Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ ＬＰＳ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃ
ｔｓ」，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈｅ Ｎｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ， １１２−１３５頁、によって記載されるものが含まれる
。
【００８３】
目的の選択されたモノクローナル抗体は、慣用の組織培養方法を用いてインビ
トロで、または哺乳動物被験体を用いてインビボで拡大され得る。例えば、プリ
スタン初回刺激マウスは、腹水生成のためにＰＢＳ中の対数期ハイブリドーマ細
胞を、接種され得る。腹水液は、さらなる精製の前に、−７０℃で貯蔵され得る
。
【００８４】
親のモノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗体分子フラグメ
ント（例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ分子）は、公知の技術を
使用して生成され得る。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃ
ａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ １５：２７０６；Ｅｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ
１９：４０９１；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５（１６）：５８７９；ならびにＨｕｓｔｏｎら、米
国特許第５，０９１，５１３号および第５，１３２，４０５号；ならびにＬａｄ
ｎｅｒら、第４，９４６，７７８号。
【００８５】
あるいは、インビトロでモノクローナル抗体分子集団を拡大するために、ファ
ージ表示系が使用され得る。Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：
１６３；Ｓｃｈａｒｆら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１０７６；米国
特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号；Ｙａｎｇら（１９
９５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５４：３９２；Ｂａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９
９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ８：９４；Ｂ
ａｒｂａｓ，ＩＩＩら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ
ＳＡ ８８：７９７８。
【００８６】
一旦生成すると、ファージ表示ライブラリーは、公知の技術を使用して、Ｆａ
ｂ分子の免疫学的結合親和性を改良するために使用され得る。例えば、Ｆｉｇｉ
ｎｉら（１９９４）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３９：６８を参照のこと。
【００８７】
ファージ表示ライブラリーから選択されたＦａｂ分子の重鎖および軽鎖部分の
コード配列は、単離または合成され得、そして発現のために任意の適切なベクタ
ーまたはレプリコンにクローン化され得る。例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類
、および哺乳動物系を含む任意の適切な発現系が使用され得る。細菌における発
現系は、Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５、Ｇｏｅｄｄ
ｅｌら（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４、Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８
０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ８：４０５７、欧州出願第ＥＰ
３６，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、ｄｅＢｏｅｒら（１９８３
）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：２１−２５
、およびＳｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０）Ｃｅｌｌ ２０：２６９に記載さ
れるものを含む。
【００８８】
酵母における発現系は、以下に記載されるものを含む：
【００８９】
【数１】
【００９０】
昆虫における異種遺伝子の発現は、以下に記載されるように達成され得る：米
国特許第４，７４５，０５１号、欧州出願ＥＰ１２７，８３９およびＥＰ１５５
，４７６、Ｖｌａｋら（１９８８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７６５−７
７６、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２
：１７７，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：４０９、Ｍａｅ
ｄａら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１５：５９２−５９４、Ｌｅｂａｃｑ−Ｖ
ｅｒｈｅｙｄｅｎら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３１２９、
Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：８４０４、Ｍｉｙａｊｉｍａら（１９８７）Ｇｅｎｅ ５８：２７３および
Ｍａｒｔｉｎら（１９８８）ＤＮＡ ７：９９。多数のバキュロウイルス株およ
び改変体、ならびに宿主からの対応する許容性昆虫宿主細胞は、以下に記載され
る：Ｌｕｃｋｏｗら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５５
，Ｍｉｌｌｅｒら（１９８６）ＧＥＮＥＲＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ、Ｓｅ
ｔｌｏｗ、Ｊ．Ｋ．ら（編），第８巻、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、
２７７−２７９頁、およびＭａｅｄａら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５：５
９２−５９４。
【００９１】
哺乳動物発現は、以下に記載されるように達成され得る：Ｄｉｊｋｅｍａら、
（１９８５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１、Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６７７７、Ｂｏｓｈａｒｔら（
１９８５）Ｃｅｌｌ ４１：５２１、および米国特許第４，３９９，２１６号。
哺乳動物発現の他の特徴は、以下に記載されるように容易にされ得る：Ｈａｍら
（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４、Ｂａｒｎｅｓら（１９８０）Ａｎ
ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同
第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５
号および米国再発行特許第ＲＥ３０，９８５号および国際公開ＷＯ９０／１０３
４３０、ＷＯ８７／００１９５。
【００９２】
上記の本発明の抗ＭｅｎＢ抗体は、ＭｅｎＢからの独特のエピトープの分子模
倣物を同定するために、多様な分子ライブラリーをスクリーニングするためのレ
セプターとして簡便に使用される。分子ライブラリーにおいて模倣物を同定する
ための方法は、一般に１つ以上の以下の手順の使用を含む：（１）固定化標的レ
セプターでのアフィニティー精製；（２）可溶性レセプターの繋留リガンドへの
結合；および（３）溶解性化合物を、抗原競合アッセイにおいて直接的に試験す
る工程、または生物学的活性について試験する工程。分子模倣物についてスクリ
ーニングされた分子には、小さな有機化合物、有機化合物のコンビナトリアルラ
イブラリー、核酸、核酸誘導体、糖類またはオリゴ糖、ペプトイド、溶解性ペプ
チド、固相上に繋留されたペプチド、細菌性ファージ表面タンパク質上に提示さ
れるペプチド、細菌性表面タンパク質または抗体、および／または非ペプチド有
機部分を含むペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
例えば、多様な分子種のライブラリーは、コンビナトリアル有機合成を用いて
作製され得る。例えば、Ｇｏｒｄｏｎら（１９９４）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ
． ３７：１３３５を参照のこと。例えば、ピロリジン、オリゴカルバメート（
Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３）；Ｎ−置換グリシン
ポリマーのようなペプトイド（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７）；およびビニル性のポリ
ペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ
． １１４：６５６８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９４】
当該分野で公知の種々のアプローチが、合成の間にビルディングブロックが加
えられる際に、ビルディングブロックを探知するために使用され得、その結果個
々のライブラリーメンバーの動作記録が測定され得る。これらのアプローチには
、写真平板チップ上のアドレス可能な部位（オリゴカルバメート）、逆重畳積分
ストラテジー（ここで、「ヒット」は、部分的な合成ライブラリー（ペプトイド
、ペプチド）へのモノマーの再帰性付加を介して同定される）、およびヌクレオ
チド（Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １
１５：９８１２）または他の有機部分（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２）（「タ
グ」）の別々の合成によりコンビナトリアルライブラリーをコードすることが含
まれる。次いで、各ライブラリーメンバーと結合したコード化タグは、模倣物が
選択された後に解読（デコード）され得る。例えば、核酸タグは、ＤＮＡ配列決
定により解読され得る。
【００９５】
ペプトイドコンビナトリアルライブラリーは、独特なＭｅｎＢエピトープの分
子模倣物を同定するために特に有用である。ペプトイドは、Ｎ−置換グリシンの
オリゴマーであり（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７）、そして新規の分子の化学的に多様
なライブラリーを作製するために使用され得る。モノマーは、ｔ−ブチル−ベー
ス側鎖および９−フルオレニル−メトキシ−カルボニルα−アミン保護を組み込
み得る。ペプトイドオリゴマーへのモノマーの集合は、例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍ
ａｎｎら（１９９２）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４：１０６４
６の「サブモノマー法」を用いて、固相上で行われ得る。この方法において、合
成は、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂を用いて行われる（Ｒｉｎｋら（１９８
７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２８：３７８７）。樹脂結合アミン
は、ジイソプロピルカルボジイミドでのブロモ酢酸のインサイチュ活性化によっ
てブロモアセチル化される。続いて、樹脂結合ブロモアセトアミドはアミンの付
加により置換される。このアミンは、さらなる反応基のｔ−ブチルベース保護を
組み込み得る。この２工程サイクルは、所望の数のモノマーが付加されるまで、
繰り返される。次いで、オリゴペプチドは、９５％トリフルオロ酢酸／５％水で
の処理により樹脂から遊離される。好ましくは、合成は、ロボットの合成機を用
いて行われる。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｐｅｐｔ． Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ４０：４９８およびＺｕｃｋｅｒｍａｎら（１９９６）
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２６７：４３７を参照のこと。代
替において、ペプトイドモノマーのオリゴマー化は、ベンゾトリアゾール−１−
イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオルホスフェートまた
はブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェートのいず
れかにより、インサイチュ活性化によって行われ得る。この代替方法において、
他の工程は、α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノ酸を用いる従
来のペプチド合成と同一である（例えば、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）前出、を参
照のこと）。
【００９６】
一旦ペプトイドライブラリーが作製されると、それらは、例えば、本発明のモ
ノクローナル抗体を、コンビナトリアルペプトイドの種々のプールとともに、Ｍ
ｅｎＢ ＰＳ誘導体またはＭｅｎＢ細菌（単独または複合糖質としてのいずれか
）でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに添加することによってスク
リーニングされ得る。インキュベーション期間および非結合抗体を除去するため
の洗浄の後に、結合抗体の存在は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイによって決定さ
れる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８８）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ， ＮＹ， ５５３を参照のこと。結合抗体を含まないウェルは、その抗体
に結合するペプトイド模倣物の存在を示す。プール中のペプトイド模倣物の特定
の詳細な正体は、モノマーユニットを部分的に合成されたライブラリーのメンバ
ーに再帰的に添加することによって決定される。Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、（１
９９４） Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７：２６７８。低分子のプールにおける
活性化合物を同定するための他の方法は、逆相ＨＰＬＣまたはアフィニティー選
択／質量分析によるプールの分画を含む（Ｎｅｄｖｅｄ Ｍ．Ｌ．ら、（１９９
６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：４２２８）。
【００９７】
一旦、推定される分子模倣物が同定され、これらは、上記のように自己反応性
を欠落しているかまたは最小限の自己反応性を有する機能的に活性（例えば、細
菌性および／またはオポソニンの）である抗体を誘発するそれらの能力について
試験される。これらの特性を有する分子模倣物は、さらなる使用（例えばワクチ
ン組成物）において適している。
【００９８】
本発明の機能的に活性な抗ＭｅｎＢ抗体を用いて同定された分子模倣物は、診
断アッセイにおける使用のための抗体試薬を産生するために使用され得る。例え
ば、分子模倣物と反応性である抗体は、免疫診断技術（例えば、競合、直接反応
、またはサンドイッチタイプのアッセイ）を用いて、生物学的サンプル中の細菌
抗原を検出するために使用され得る。このようなアッセイとしては、ウエスタン
ブロット；凝集試験；酵素標識および媒介イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ
）；ビオチン／アビジンタイプアッセイ；ラジオイムノアッセイ；イムノ電気泳
動；免疫沈降などが挙げられる。この反応は、一般には標識（例えば、蛍光標識
、化学発光標識、放射活性標識、酵素標識）または色素分子の暴露、または模倣
物と抗体またはこの模倣物と反応する抗体との複合体の形成を検出するための他
の方法を含む。
【００９９】
上述のアッセイは、一般に、模倣物−抗体複合体が結合している固相支持体か
らの液相中の結合していない抗体の分離を含む。本発明の実施において使用され
得る固相支持体は以下のものを含む、ニトロセルロースのような基材（例えば、
メンブレンまたはマイクロタイターウェルの形態で）；ポリ塩化ビニル（例えば
、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、
ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙
；ナイロンメンブレン；活性化ビーズ、磁力応答性ビーズなど。
【０１００】
代表的には、固体支持体は、適切な結合条件下で固相成分（例えば、１つ以上
のＭｅｎＢ分子模倣物）と最初に反応し、その結果、この成分はこの支持体に十
分に固定される。時々、支持体への模倣物の固定は、良好な結合特性を有するタ
ンパク質へ、まずこの模倣物が結合されることにより増強され得る。適切な共役
タンパク質は以下を含むがこれらに限定されない、ウシ血清アルブミンを含む（
ＢＳＡ）を含む血清アルブミンのような高分子、キーホールリンペットヘモシア
ニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリイン、オボアルブミン、および当業
者に周知である他のタンパク質。模倣物を支持体に結合させるために使用され得
るたの分子は、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸
、アミノ酸コポリマーなどを含む。これらの分子を抗原と共役させるこのような
分子および方法は当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ、Ｍ．Ａ．
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（１９９２）３：２−１３；Ｈａｓｈｉ
ｄａら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）６：５６−６３；および
ＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．
ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ（１９８７）３０：１
１７−１２４を参照のこと。
【０１０１】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の固定された固相化合物が支持体
から洗浄により除去され、次いでこの支持体結合成分を、適切な結合条件下でリ
ガンド部分（例えば、ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗体）を含む
と思われる生物学的試料と接触させる。いくらかの結合していないリガンドを除
去するための洗浄後、二次結合物部分を適切な結合条件下で添加し、ここで、こ
の二次結合物は結合リガンドと選択的に結合し得る。次いで、この二次結合物の
存在は、当該分野で周知の技術を使用して検出され得る。
【０１０２】
より詳細には、ＥＬＩＳＡ法が使用され得、ここで、マイクロタイタープレー
トのウェルは、本発明に従う模倣物でコートされる。次いで、抗ＭｅｎＢまたは
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１免疫グロブリン分子を含むかまたは含むと思われる生物学的
試料がコートされたウェルに添加される。抗体を固定された模倣物に結合させる
ために十分なインキュベーション時間の後に、このプレートは洗浄されて結合し
ていない部分を除去し、そして検出可能に標識された二次抗体が添加される。こ
の二次結合分子を任意の捕捉試料抗体と反応させ、このプレートを洗浄し、そし
て二次結合分子の存在を当該分野で周知の方法を使用して検出する。
【０１０３】
従って、１つの特定の実施態様において、生物学的試料由来の結合したＭｅｎ
Ｂ／Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１抗原リガンドは、抗体リガンドに対して指向される抗体
を含む二次結合物を使用して容易に検出し得る。多くの数の抗ウシ免疫グロブリ
ン（Ｉｇ）分子が当該分野で公知であり、これらは検出可能な酵素標識（例えば
、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはウレアーゼ）に
対して当業者に公知の方法を使用して容易に結合し得る。次いで、適切な酵素基
質を使用して検出可能なシグナルを生成する。他の関連する実施態様では、競合
型ＥＬＩＳＡ技術は、当業者に公知の方法を使用して実施され得る。
【０１０４】
アッセイはまた溶液中で行われ得、この結果、模倣物およびこれらの模倣物に
特異的な抗体は、沈降条件下で複合体を形成する。１つの特定の実施態様におい
て、この模倣物は、固相粒子（例えば、アガロースビーズなど）に対して当該分
野で公知の結合技術（例えば、化学的に直接の結合、または間接的な結合）を使
用して付着され得る。次いで、この模倣物コート粒子を、ＭｅｎＢおよび／また
はＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１に対する抗体を含むことが予測される生物学的試料と適切
な結合条件下で接触させる。結合抗体間の架橋は沈降され得、そして洗浄および
／または遠心分離を使用してこの試料から分離され得る粒子−模倣物−抗体複合
体凝集体の形成を生じる。この反応混合物を、抗体−模倣物複合体の存在または
非存在を決定するために多数の標準的な方法のいずれか（例えば、上記のそれら
の免疫診断方法）を使用して分析し得る。
【０１０５】
なおさらなる実施態様では、免疫親和性マトリクスが提供され得、ここで、Ｍ
ｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１の抗体を含むことが予測される生物学
的試料由来の抗体のポリクローナル集団が基材に固定される。これに関しては、
試料の最初のアフィニティー精製は、固定された抗体を使用して実施され得る。
従って、得られた試料調製物は、抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１
部分のみを含み、そのアフィニティー支持体における潜在的な非特異的結合特性
を避ける。高収量および抗原結合活性の良好な保持における多くの数の運動抑制
免疫グロブリン（インタクトであるかまたは特異的フラグメントのいずれかであ
る）は当該分野で公知である。任意の特定の方法により制限されないが、固定さ
れたプロテインＡまたはプロテインＧが免疫グロブリンを固定するために使用さ
れ得る。
【０１０６】
従って、一旦、免疫グロブリン分子が免疫親和性マトリクスを提供するために
固定されると、標識分子は、適切な結合条件下で結合抗体と接触される。任意の
非特異的結合模倣物が免疫親和性支持体から洗浄された後、結合抗体の存在が、
当該分野で公知の方法を使用する標識のためのアッセイにより決定され得る。
【０１０７】
本発明を使用するＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１感染を診断する
ために特に好ましい方法は、ストリップイムノブロットアッセイ（ＳＩＡ）技術
（例えば、当業者に公知である、伝統的なウェスタンブロッティング技術とドッ
トブロッティングを組み合わせる当業者に公知の方法（例えば、ＲＩＢＡ（商標
）（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， ＣＡ）試験）の使用
を含む。これらのアッセイにおいて、１つ以上の本発明に従う模倣物が、メンブ
レン支持体試験ストリップ上の個々の分離したバンドとして固定される。生物学
的試料における抗ＭｅｎＢおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１反応の可視化は，
比色分析酵素基質とともに抗ヒトＩｇＧ酵素結合物を使用して達成される。内部
コントロール（例えば、抗ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧもまた、このストリップ
上に存在し得る。このアッセイは手動で実施され得るかまたは自動化フォーマッ
トにおいて使用され得る。
【０１０８】
上記に記載のアッセイ試薬（本発明の模倣物またはそれらに対する抗体を含む
）は、上記のイムノアッセイを行うための、適切な説明書および他に必要とされ
る試薬と共にキット中で提供され得る。このキットはまた、使用される特定のイ
ムノアッセイに依存して、適切な標識および他のパッケージ試薬および物質（す
なわち、洗浄緩衝液など）を含む。上記のような標準的なイムノアッセイは、こ
れらのキットを使用して実施され得る。
【０１０９】
さらに、分子模倣物組成物、分子模倣物を用いて同定された独特な（例えば、
非自己反応性）ＭｅｎＢエピトープは、哺乳動物被験体におけるＭｅｎＢ疾患の
診断および予防のために本明細書中で使用され得る。特に、分子模倣体のワクチ
ン組成物は、ワクチン接種した被験者のＭｅｎＢ疾患の予防のために使用され得
る。
【０１１０】
このワクチン組成物は、ＭｅｎＢの分子模倣物、または非自己免疫エピトープ
の１つ以上を含み得る。ワクチンはまた、他の抗原および免疫調節剤（例えば、
免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン：（これらは
、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、およびＲＡＮＴＥ
Ｓを含むがこれらに限定されない））と共に投与され得る。
【０１１１】
このワクチンは、一般に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒ
クル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含む。さ
らに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのよう
なビヒクル中に存在し得る。
【０１１２】
アジュバントもまた、ワクチンの有効性を増強するために用いられ得る。アジ
ュバントは、ワクチン組成物に直接添加され得るか、または別々に（ワクチン投
与と同時または直後のいずれかで）投与され得る。このようなアジュバントとし
ては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミ
ョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニ
ウムなど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例え
ば、ムラミルペプチド（下述）または細菌細胞壁成分）を有するまたは有さない
）：例えば、（ａ）ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ ９０／１４８３７号）：５％ス
クワレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％Ｓｐａｎ ８５を含む（
必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（下述）を含むが、必要とされるわけで
はない）、微小流動機（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ
１１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎ
ｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に処方された、（ｂ）ＳＡＦ：１
０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０、０．５％プルロニックブロックポ
リマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（下述）を含む、サブミクロンエマルジ
ョンに微小流動されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成する
ようにボルテックスされるかのいずれかである、（ｃ）ＲｉｂｉTMアジュバント
システム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍ
Ｔ）：２％スクワレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ ８０、および１つ以上の細菌細胞
壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤ
Ｍ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群に由来、好ましくは、ＭＰＬ＋Ｃ
ＷＳ（ＤｅｔｏｘTM））を含む；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉ
ｍｕｌｏｎTM（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅ
ｒ、ＭＡ）が用いられ得るか、またはそれから生成された粒子であり得る（例え
ば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））；（４）フロイント完全アジュバント（Ｆ
ＣＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＦＩＣＡ）；（５）サイトカイン
（例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロ
ニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など；ならびに（６）コ
レラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（
ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンは部位６３での野生型アミノ酸と置
換される）ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンは部位７２での野生型アミノ酸と
置換される）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンは部位１０９の野生型アミノ酸と
置換される）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンは部位９の野生型ア
ミノ酸と置換され、そしてグリシンが部位１２９で置換される）（例えば、国際
公開ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）のような
細菌のＡＤＰリボシル化毒素の解毒変異体、；ならびに（７）免疫刺激剤として
作用して組成物の効果を増強する他の物質。
【０１１３】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−
イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニ
ル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイ
ル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴ
Ｐ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
分子模倣物から形成されたワクチン組成物の有効性を増強するために、模倣物
をキャリア分子に結合体化させることが必要であり得る。このようなキャリア分
子は、それ自身、有害な抗体の産生を誘導しない。適切なキャリアは、代表的に
は、大きな、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカラ
イド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー
、脂質集合体（例えば、油滴またはリポソーム）、不活性ウイルス粒子、ＣＲＭ
197（無毒変異ジフテリア毒素）など）である。このようなキャリアは、当業者
に周知である。模倣物結合体は、ＭｅｎＢ細菌細胞の表面に見られるものに密接
に類似するエピトープを発現するそれらの能力について選択される。従って、適
切な結合体は、細菌に対して機能活性を有する抗体の形成を惹起し、かつ本明細
書中に記載の結合アッセイを用いて決定されるように宿主組織においてポリシア
ル酸と交差反応しないか、または最小限で交差反応性である。
【０１１５】
代表的には、ワクチン組成物は、注射用（液体溶液または懸濁液のいずれか）
として調製される；注射前に液体ビヒクルに入れて溶液または懸濁液とするのに
適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、上述のように、アジュバ
ント効果の増強のために、リポソーム中に乳化またはカプセル化され得るか、あ
るいは粒子に吸着され得る。
【０１１６】
このワクチンは、有効量のタンパク質の分子模倣物、および必要に応じて任意
の他の上述の成分を含む。「有効量」とは、投与される個体において免疫応答を
誘導し、かつ個体において自己免疫応答を刺激する危険性を最小限にとどめる分
子の量を意味する。一般に、このような応答は、被験体において、このワクチン
に対して分泌性、細胞性、および／または抗体媒介性免疫応答の発達を生じる。
通常、このような応答は、以下の効果の１つ以上を含むがこれらに限定されない
：免疫クラス（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）のいずれかか
らの抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増
殖、および分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならび
に／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはγδＴ細胞集団の拡大。
【０１１７】
一旦処方されると、ワクチンは、非経口（例えば、注射により、皮下、または
筋内のいずれか）に従来通りに投与される。他の投与様式に適切なさらなる処方
物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用剤が挙げられる
。投与処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
【実施例】
【０１１８】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。本実施例は、例
示の目的にのみ提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを意図
しない。
【０１１９】
用いた数字（例えば、量、温度など）に関して正確に記載するよう試みたが、
幾分かの実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【０１２０】
（実施例１）
（「サイズ化」複合糖質の調製）
例示のＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライド破傷風トキソイド結合体ワクチン
（本明細書中、以後ＣＯＮＪ−２と称する）を以下のように調製した。ＭｅｎＢ
ＢポリサッカライドのＮ−アセチル基を、ポリサッカライドをＮａＢＨ4の存
在下で２Ｍ ＮａＯＨ中で６時間、１１０℃に加熱することにより除去した。脱
アセチル化ポリサッカライドを飽和炭酸水素ナトリウム緩衝液中で十分に透析し
、次いで過剰のプロピオン酸無水物と共に、室温で１２時間、撹拌した。溶液を
水中で十分に透析し、Ｎ−プロピオニル化髄膜炎菌Ｂ（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
）ポリサッカライドを凍結乾燥により回収した。
【０１２１】
結合体ワクチンの調製のために、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ポリサッカライドを、１
０ｍＭ酢酸ナトリウム中でｐＨ５．５で５０℃で２時間、部分的に加水分解した
。得られたオリゴサッカライド混合物をＱ−セファロース上で分画した。２〜６
の平均重合度（Ｄｐ）を有するオリゴサッカライドを、１００ｍＭ ＮａＣｌを
用いてまず溶出し、そして廃棄した。中間サイズのオリゴサッカライドを５００
ｍＭ ＮａＣｌを用いて溶出した。続いて、Ｍｏｎｏ Ｑカラムを用いる分析用
イオン交換クロマトグラフィーにより、中間サイズのオリゴサッカライドがＤｐ
１３〜２０の大きさの範囲であることを決定した（平均＝Ｄｐ １３）。
【０１２２】
末端アルデヒド基を、暗所において室温で１５〜３０分間、これらを１００ｍ
Ｍ 過ヨウ素酸ナトリウムと反応させることにより、中間サイズのオリゴサッカ
ライドの非還元末端で生成した。過剰のエチレングリコールを用いて酸化反応を
停止させ、そしてその生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上で脱塩した
。オリゴサッカライド−タンパク質結合体を、４０ｍｇ／ｍｌのシアノホウ素化
水素ナトリウムを有する０．７５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ９．０）中で
末端アルデヒド含有ＮＰｒ−ＭｅｎＢ オリゴサッカライドと破傷風トキソイド
との混合物（それぞれモル比２００：１）を、４０℃で１日および室温で２日撹
拌することにより調製した。得られたＮＰｒ−ＭｅｎＢ オリゴサッカライド−
破傷風トキソイド結合体（ＣＯＮＪ−２）を、溶出緩衝液として５０ｍＭ リン
酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウムを用いてＳｅｐｈ
ａｄｅｘ Ｇ−１００におけるゲル濾過クロマトグラフィーにより最終的に精製
した。結合体ワクチンのシアル酸組成およびタンパク質組成をそれぞれ、Ｓｖｅ
ｎｎｅｒｈｏｌｍレゾルシノール反応（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ， Ｌ． （１
９５７） Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． ２４：６０４）
およびＬｏｗｒｙアッセイにより測定した。重量基準で、ＣＯＮＪ−２結合体の
最終的な糖対タンパク質比は、０．１０〜０．２５の範囲であった。
【０１２３】
（実施例２）
（複合糖質の特徴付け）
ＣＯＮＪ−２複合糖質を以下のように特徴付けた。共有結合性（例えば、ＮＰ
ｒ−ＭｅｎＢ ＯＳとタンパク質キャリアとの間の共有結合を確立する）を示す
ために、以下を含む多くの物理化学的技術を使用し得る：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ウ
ェスタンブロット；Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１００ゲル濾過；など。本研究の目
的のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、キャリアタンパク質バンド自体と比
較した場合、結合体バンドについてより高い分子量へのシフトを示すことによっ
て、ＮＰＲ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ ＣＯＮＪ−２複合糖質の共有結合を確立し
た。ＣＯＮＪ−２複合糖質のウェスタンブロット分析は、ＴＴおよびＮＰｒ−Ｍ
ｅｎＢ ＰＳについてのポジティブ免疫反応性シグナルの、特異的な抗ＴＴおよ
び抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ抗血清との一致によって共有結合性を示した。
【０１２４】
立体因子に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質の調製における大きな分子量のポ
リサッカライドの代わりのオリゴサッカライドの使用は、タンパク質キャリア分
子上へのサッカライド抗原のより高いカップリング効率を可能にする。これらの
ＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴサッカライドに基づく複合体の最終的なサッカライド対
タンパク質比は、タンパク質キャリア１個当たり共有結合する約３〜５のＮＰｒ
−ＭｅｎＢオリゴサッカライド鎖に対応する、約０．１０〜０．２５に及ぶ。毎
重量に基づいて、ＣＯＮＪ−２複合糖質は、以前に報告されたＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ポリサッカライドに基づく結合体（米国特許第４，７２７，１３６号）（ここで
、ＣＯＮＪ−２は平均して約７．５〜１８．８倍多いサッカライドを含む）より
高いサッカライドローディングを有するようである（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの
分子量として１０，０００ダルトンを用いる）。
【０１２５】
さらに、十分に規定された中間体の鎖長（例えば、平均１０〜２０ Ｄｐ）の
実質的に均一なサイズのサッカライド部分を有するＣＯＮＪ−２複合糖質を構築
することは、より一貫した免疫学的挙動を呈する複合糖質を生じることが予期さ
れる。さらに、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製ＮＰｒ−Ｍｅｎ
Ｂオリゴサッカライドの選択的末端活性化（例えば、非還元性末端でのアルデヒ
ド基の選択的導入）は、両方の末端で誘導される「活性な」アルデヒド基を有す
るＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ分子の使用から生じ得る架橋不均一構造の可能性を回
避する。この点において、両末端活性化ＰＳ（両方の末端にアルデヒド基を有す
る）は、Ｎ−脱アセチル化手順の間に、予めＮａＢＨ4に曝露されたＮ−アセチ
ル化ＭｅｎＢ ＰＳの過ヨウ素酸酸化から誘導され得るようである。
【０１２６】
（実施例３）
（モノクローナル抗体の調製）
４〜６週齢の雌性ＣＤ１マウスを、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （ＣＯＮ
Ｊ−２）複合糖質抗原および（最後の追加免疫注射を除いて）ＦＣＡを含む組成
物を用いて、腹腔内注射によってワクチン接種した。ワクチン接種を、１ヶ月間
隔で合計２または３投薬量で投与した（追加免疫を含む）。融合の３日前、初回
刺激した動物を、アジュバントの非存在下でＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （
ＣＯＮＪ−２）複合糖質抗原で追加免疫した。各用量の最終容量は０．１ｍｌで
あり、これは２．５μｇのシアル酸を含んだ。追加免疫注射後、動物を脾臓摘出
し、そして脾臓細胞をミエローマ細胞との融合用に調製した。
【０１２７】
融合の約１週間前、非分泌マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞
（ＡＴＣＣ受託番号第ＡＴＣＣ−１５８０−ＣＲＬ号から入手可能）を、２５ｍ
ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液およびＬ−グルタミンを有する完全なＲＰＭＩ−１６４０
培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ ０４１−０２４００）で拡大した。細胞培養物を、
細胞増殖、細胞数をモニターするため、およびコンタミネーションをスクリーニ
ングするために定期的に評価した。
【０１２８】
融合の１日目、脾臓細胞、およびパートナーのＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３ミ
エローマ細胞（Ａｇ８細胞）を洗浄し、収集し、そして５：１（脾臓細胞：ミエ
ローマ細胞）の比で混合した。細胞融合を、５０％ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）の存在下で３７℃にて実施した。生じた細胞ペレットを収集し、そして９
６ウェル平底細胞培養プレート（ＣＯＳＴＡＲ ３５９６）中に置き、そして適
切な条件下で（例えば、５％ＣＯ2中３７℃にて）インキュベートした。インキ
ュベーションの１日後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（Ｈ
ＡＴ）を含む選択培地を、各ウェルに添加した。
【０１２９】
増殖し、そして約１０〜２５％のコンフルエンスを示す細胞を含むウェルから
のハイブリドーマを、ＨＡＴ選択培地中でのインキュベーションの約２週間後に
スクリーニングのために選択した。選択したハイブリドーマ上清を、固相アビジ
ン−ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに基づくＥＬＩＳＡアッセイを用いてス
クリーニングした。上清における抗体結合の特異性を、インヒビターとして可溶
性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを用いて決定した。ネガティブコントロールは、ＲＰ
ＭＩ培地、Ａｇ８ミエローマ上清、および無関連のモノクローナル抗体調製物を
含んだ。ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ／ＴＴ （ＣＯＮＪ−２）複合糖質で免疫した
マウス由来のプールしたポリクローナル血清を、ポジティブコントロールとして
使用した。上清との一晩のインキュベーション後、反応ウェルを洗浄し、そして
結合した免疫グロブリンを、アルカリホスファターゼ標識多価抗マウス免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ）を用いて検出した。
【０１３０】
候補ハイブリドーマを、上記のＥＬＩＳＡアッセイにおけるＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ＰＳについてのそれらの示された結合親和性に基づいて同定した。高度に反応
性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを、限界希釈によってクローニングした
。詳細には、候補ハイブリドーマ細胞株を、２０μｌのクローニング／拡大培地
（ＩＬ６を有する完全 ＲＰＭＩ−１６４０）中に、Ｔｅｒａｓａｋｉプレート
（ＮＵＮＣ）中０．３、１．０、および３．０細胞／ウェルでプレートした。２
週間後、培養物を増殖について視覚的に検査した。頻度分析を、Ｌｅｆｋｏｖｉ
ｔｓら（１９８４） Ｉｍｍｕｎ． Ｔｏｄａｙ ５ （９）： ２６５によっ
て記載される最小二乗法を用いて実施した。マスターウェル中の反応性上清を同
定するために使用されるＥＬＩＳＡアッセイを繰り返し、７および１４日目の抗
体活性を評価した。次いで、選択したクローンを、組織培養および腹水生成にお
けるその後の使用のために拡大および凍結した。このようにして、３９のハイブ
リドーマのパネルを生成し、そしてそれから得た分泌したモノクローナル抗体分
子（「ＳＥＡＭモノクローナル抗体」、詳細にはモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−
１〜ＳＥＡＭ−２４、ＳＥＡＭ−２６、ＳＥＡＭ−２８〜ＳＥＡＭ−３１、ＳＥ
ＡＭ−３３〜ＳＥＡＭ−３６、ＳＥＡＭ−３８〜ＳＥＡＭ−４２、およびＳＥＡ
Ｍ−４８と命名した）を、さらなる評価のために調製した。
【０１３１】
より詳細には、選択したモノクローナル抗体を、組織培養においてか、または
腹水液においてのいずれかで、Ｐｒｉｓｔａｎｅで初回刺激した７〜８週齢の雄
性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて生成した。各動物被験体を、ハイブリドーマ細胞
での接種の１週間前に、０．５ｍｌのＰｒｉｓｔａｎｅでの腹腔内注射によって
初回刺激した。接種前、ハイブリドーマ細胞濃度を、滅菌したＰＢＳを用いて、
２．５×１０6〜３×１０6細胞／ｍｌに調整した。初回刺激した動物に、１ｍｌ
のハイブリドーマ細胞を腹腔内に注射した。ここで、各クローン細胞株を３匹の
異なるマウス中に接種した。接種の１〜２週間後、腹水液の回収を開始し、約１
週間継続した。回収した液体を、２７００ｒｐｍ（１５００×ｇ）にて室温で１
０分間遠心分離した。上清を収集し、そしてペレットを廃棄した。単離した腹水
液を、回収の過程にわたって４℃にて貯蔵し、そして異なる日に回収した液体を
プールし、一定分量に分け、そして−７０℃にて凍結した。
【０１３２】
（実施例４）
（モノクローナル抗体の特徴付け）
精製していないモノクローナル抗体の濃度を、ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイおよび
放射状免疫拡散アッセイを用いて決定した。詳細には、捕捉ＥＬＩＳＡ手順を用
いて、各抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体の濃度を決定した。１０
ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において１μｇ／ｍｌに希釈した１００μＬ／ウェ
ルのアフィニティー精製ウサギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ（Ｈおよ
びＬ、Ｚｙｍｅｄ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．から入手可能）を、４
℃で一晩インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳで３回洗浄後、２５０μＬのブ
ロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナ
トリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で満たし、そして室温にて３０〜６０分間
インキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。そのプレートを、洗浄緩
衝液（０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢ
Ｓ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。試験するべき抗体を、希釈緩衝液（１％ Ｂ
ＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰ
ＢＳ、ｐＨ７．４）に希釈し、次いで各ウェル当たり１００μｌで添加した。プ
レートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ
２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭ免疫グロブリン標準（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから入手可能）を、５００ｎｇ／
ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度で使用して、抗体濃度を定量するための標準曲線
を構築した。
【０１３３】
一晩のインキュベーション後、ウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、そして希
釈緩衝液において１：２０００希釈した１００μｌ／ウェルのアルカリホスファ
ターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｈおよび
Ｌ、Ｚｙｍｅｄ）とともに、４℃で３時間インキュベートした。次いで、プレー
トを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液 （１．０Ｍ ジエタノールアミ
ン、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ９．８）で１ｍｇ／ｍｌに希釈した１００μ
ｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸、Ｓｉｇｍａ）を各ウェル
に添加した。約３０分後に４０５ｎｍでの吸光度値を測定した。モノクローナル
抗体調製物の免疫グロブリン濃度を、標準曲線から算出した。
【０１３４】
放射状免疫拡散アッセイを以下のように実施した。放射状免疫拡散プレートお
よび試薬を、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ （Ｂｉｒｍ
ｉｎｇｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ）から入手した。次いで、アッセイプロトコル
は、ＲＩＤキットとともに供給された製造業者の具体的な説明書に基づいた。簡
単には、キットに供給されたキャリブレーター抗体を、適切な量の蒸留水を用い
て再構成した。１：２および１：１０希釈のキャリブレーター抗体を調製した。
必要ならば、試験サンプルを１％ ＢＳＡに希釈し得る。キャリブレーター抗体
（適切な、１：２および１：１０希釈）について１０μｌのアリコート（ＩｇＡ
およびＩｇＧ２ａサブクラス抗体について２０μｌ）および試験サンプルを、プ
レート上の分離したウェルに適用し、そして室温にて１２０時間インキュベート
した。抗体の濃度を、沈殿物の環の直径を測定し、そしてこれらの値をＲＩＤキ
ットに含まれる参考の表と比較することによって決定した。
【０１３５】
次いで、組織培養物または腹水液由来のモノクローナル抗体を、以下のように
部分的に精製した。モノクローナルを含む組織培養上清または腹水（２００ｍｌ
または指示された容量）を、溶液を穏やかに撹拌しながら、等量の冷１００％飽
和硫酸アンモニウム（ＳＩＧＭＡ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）にゆっ
くりと添加した。このモノクローナル抗体および硫酸アンモニウム混合物を、４
℃で一晩インキュベートした。翌朝に、混合物を、均質化のために穏やかに撹拌
し、そしてＳｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃
にて３０分間遠心分離した。上清をデカントした後、等容量の５０％硫酸アンモ
ニウム溶液（すなわち、１００％飽和硫酸アンモニウムと同じ容量）を使用して
、ペレットを洗浄し、そして再懸濁した。得られた混合物を、Ｓｏｒｖａｌｌ
ＳＳ３４ローターにおいて５０００ｒｐｍで、４℃にて３０分間遠心分離した。
次いで、上清をデカントし、そして排出した。
【０１３６】
腹水について、ペレットをＰＢＳ 緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１
５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）において、０．３〜０．５容量の開始
容量に再構成した。組織培養上清について、このペレットを、ＰＢＳ 緩衝液の
０．１容量の開始容量に再構成した。再構成したモノクローナル抗体および硫酸
アンモニウム混合物を透析チューブ（分子量カットオフ１０，０００〜１２，０
００）に入れ、そして４ＬのＰＢＳ中で一晩透析させた。ＰＢＳ溶液を、後の２
日間にわたって３〜４回交換した。透析チューブからのモノクローナル抗体分子
をシリンジ中に移し、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過滅菌
し、次いで−２０℃にて貯蔵した。
【０１３７】
次いで、部分精製したモノクローナル抗体調製物を（ａ）免疫グロブリンアイ
ソタイプ、（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの濃度依存性結合、（ｃ）種々のＮ
Ｐｒ−ＭｅｎＢオリゴマーの、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を阻害する能力
、（ｄ）天然のＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性、（ｅ）ＭｅｎＢの病原性株との
交差反応性、（ｆ）補体媒介性殺菌活性、（ｇ）オプソニン活性、および（ｈ）
細胞表面にて長鎖α２−８連結ポリシアル酸を発現する神経芽細胞腫細胞株への
結合によって示されるような自己反応性について特徴付けした。これらの実験に
おいて、モノクローナル抗体の濃度を、捕捉ＥＬＩＳＡおよび上記のＲＩＤアッ
セイによって測定した。
【０１３８】
（ａ）抗体のアイソタイプ分類：
モノクローナル抗体（重鎖および軽鎖）のアイソタイプを、二次アルカリホス
ファターゼ結合抗体がＩｇＧサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ならびにκ軽鎖およ
びλ軽鎖に特異的であるという唯一の差異を有する、上記の抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ
ＰＳ ＥＬＩＳＡについてのプロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡによって決定し
た。また、キットを使用して、この抗体分子をアイソタイプ分類した。このキッ
トは、異なる型の免疫グロブリンペプチド鎖について特異的なヤギ抗体でコート
した分類固着基質からなった。キットは、その基質に対するヤギ抗体に結合する
マウスモノクローナル抗体を検出するための、抗マウス免疫グロブリンに特異的
なペルオキシダーゼ標識種を提供する。
【０１３９】
以下で表１に記載するように、３９のモノクローナル抗体中のアイソタイプの
分布が、１つのＩｇＭ、および３８のＩｇＧ（８つのＩｇＧ１、５つのＩｇＧ２
ａ、１６のＩｇＧ２ｂ、および９つのＩｇＧ３）からなることを見出した。さら
に、すべての抗体分子は、κ軽鎖を有した。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
【表３】
【０１４３】
（ｂ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの濃度依存性結合：
固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、緩衝液のみまたは２５μｇ／ｍｌの可溶性ＮＰ
ｒ−ＭｅｎＢ ＰＳインヒビターの存在下での抗体分子のＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓへの濃度依存的結合を評価した。ビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ−ＡＤＨ
を、Ｓｕｔｔｏｎら（１９８５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８２
：２１５の方法を用いて調製した。１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中の１０
０μｌ／ウェルのアビジン（４μｇ／ｍｌ Ｅｘｔｒ Ａｖｉｄｉｎ， Ｓｉｇ
ｍａ）を含むマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ２、 Ｄｙｎａｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．より入手可能）を、４℃で一晩イ
ンキュベートした。ＰＢＳでの３回の洗浄後、ＰＢＳ中の１００μｌのビオチン
化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを各ウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュ
ベートした。このプレートをＰＢＳで３回洗浄し、そしてこのウェルを２５０μ
ｌのブロッキング緩衝液で満たし、そして室温で３０〜６０分間インキュベート
して非特異的結合部位をブロックした。
【０１４４】
ブロッキング後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。モノクローナル
の種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液、または１ｍｌあ
たり５０μｇの可溶性ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む（２５μｇ／ｍｌの最終イ
ンヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかで含む複製プレートの
ウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベ
ートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液に
おいて１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ
結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）
を用いて４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝
液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの
新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ
添加した。４０５ｎｍでの吸光値を約３０分後に測定した。
【０１４５】
表１は、３９のＳＥＡＭモノクローナル抗体の各々に対ついてＥＬＩＳＡにお
いて０．５のＯＤをもたらすに必要な抗体のそれぞれの濃度範囲を要約する。示
される値における大きな不均一性に対する最も可能性の高い説明は、ＮＰｒ−Ｍ
ｅｎＢ ＰＳへの抗体の結合活性の相違である。
【０１４６】
（ｃ）オリゴマーによるＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの抗体結合の阻害：
競合固相ＥＬＩＳＡ手順を用いて、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに対するモノ
クローナル抗体分子の結合を阻害するためのＮＰｒ−ＭｅｎＢオリゴマーインヒ
ビターの能力を評価した。アッセイを、モノクローナル抗体を、０．５〜１のＯ
Ｄをもたらす濃度まで予め希釈したことを除いては、抗ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
ＥＬＩＳＡについて上記のように実施した。モノクローナル抗体を、複製プレ
ートのウェル（各々は、２５μｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度をもたらす以下
の可溶性インヒビターの１つを含む：高分子量（ＨＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓ；または低分子量（ＬＭＷ）ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ（３．８の平均Ｄｐを有
する））へ添加した。
【０１４７】
このプレートを覆い、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、このウェ
ルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈
された１００μｌ／ウェルのアルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、およびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて４℃で３時間イン
キュベートした。次いで、このプレートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩
衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−
ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇｍａ）を各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの
吸光値を約３０分後に測定した。阻害パーセントを、インヒビターの非存在下で
の結合と比較して計算した。
【０１４８】
ＨＭＷ ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳインヒビターは、試験された全てのモノクロ
ーナル抗体において、約７５％〜９５％の阻害を与えた。モノクローナル抗体に
おける微細な抗原特異性の差異は、試験されたＬＭＷインヒビターとの異なるそ
れぞれの阻害パターンから明白である。例えば、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへのＳ
ＥＡＭ−３およびＳＥＡＭ−１８の結合は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの可溶性Ｌ
ＭＷインヒビターによって完全に阻害される。対照的に、ＳＥＡＭ−２およびＳ
ＥＡＭ−１６は、オリゴマーによって顕著には阻害されない（２０％未満）。全
てのモノクローナル抗体についてのＬＭＷ ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＯＳ阻害の結果
を表１に示す。さらに、以下に記載のように、モノクローナルの微細な抗原特異
性における他の差異は、ＥＬＩＳＡにおけるＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳへの交差反
応性において観察された差異、および宿主のポリシアル酸への結合における差異
によって明白である。
【０１４９】
（ｄ）ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性：
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ形式において、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓの直接的結合によって示されたように、ＮＡｃ−ＭｅｎＢポリサッカライドへ
との交差反応するそれらの能力について評価した。使用された方法は、固相抗原
としてビオチン化ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの代わりに、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳ
−ＡＤＨを使用したこと以外は、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ ＥＬＩＳＡについて
の上記の方法と類似した。
【０１５０】
モノクローナルの種々の希釈の５０μｌアリコートを、５０μｌの希釈緩衝液
、または１ｍｌあたり５０μｇの可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを含む（２５μ
ｇ／ｍｌの最終インヒビター濃度として）５０μｌの希釈緩衝液のいずれかを含
む複製プレートのウェルへ添加した。次いで、このプレートを覆い、そして４℃
で一晩インキュベートした。翌日、このウェルを冷洗浄緩衝液で５回洗浄し、次
いで希釈緩衝液において１：２０００に希釈された１００μｌ／ウェルのアルカ
リホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリクローナル抗
体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて、４℃で３時間インキュベートした。次いで、このプ
レートを冷洗浄緩衝液で洗浄し、そして基質緩衝液において１ｍｇ／ｍｌに希釈
された１００μｌの新しく調製した基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸， Ｓｉｇ
ｍａ）を、各ウェルへ添加した。４０５ｎｍでの吸光値を、約３０分後に測定し
た。
【０１５１】
４６のモノクローナル抗体のそれぞれのＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応
性を、高い交差反応性（＋＋＋）から交差反応性でない（０）範囲にわたって得
点づけした。この結果を表１に示す。見られ得るように、１６のモノクローナル
抗体が、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応し、そして４つが最小で交差反応し
た（±）。これらの２０のポジティブまたは弱いポジティブなモノクローナル調
製物の交差反応性の特異性を、可溶性ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳを用いた結合の阻
害によって確認した。２６の非交差反応性モノクローナル抗体は、２５μｇ／ｍ
ｌまでの抗体濃度で試験した場合、固相ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳへの顕著な結合
は示さなかった。
【０１５２】
（ｅ）細菌結合アッセイ：
抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体の、病原性細胞株Ｎ．ｍｅｎｉｎ
ｇｉｔｉｄｉｓＢ群の表面に結合する能力を、間接的免疫蛍光アッセイのフロー
サイトメトリー検出を用いて決定した。２つの完全に莢膜された髄膜炎菌Ｂ試験
生物（８０４７株（殺菌活性の測定のために使用した株、以下を参照のこと）お
よびＮｍＢ株）を使用した。ＮｍＢのトランスポゾン含有変異体である第３の非
莢膜化株、Ｍ７（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら （１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．＆ Ｉｍｍ
ｕｎ． ５９：４０９７−４１０２）を、莢膜ポリサッカライドへの抗体結合の
特異性についてのネガティブコントロールとして使用した。Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈ
ｉｎｔｏｎ培地および０．２５％グルコース中において対数増殖中期へ増殖され
た細菌細胞を回収し、そして１ｍｌあたり約１０8細胞の密度でブロッキング緩
衝液において再懸濁した。次いで、モノクローナル抗体（１０または１００μｇ
／ｍｌの濃度）を添加し、そして氷上で２時間細胞へ結合させた。ブロッキング
緩衝液での２回の洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤ
ギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）とインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中の
０．２５％ホルムアルデヒドで固定し、そしてフローサイトメトリーによって分
析した。
【０１５３】
ポジティブコントロール抗体は、髄膜炎菌特異的血清型決定およびサブタイプ
決定モノクローナル抗体（ＭＮ２Ｃ３Ｂ、ＭＮ１６Ｃ１３Ｆ４、ＲＩＶＭ、Ｂｉ
ｌｔｈｏｖｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含んだ。ネガティブコン
トロールは、関連しない特異性を有するマウスＩｇＧモノクローナル抗体からな
った。
【０１５４】
表１に要約されるように、２４の抗Ｎ−Ｐｒ髄膜炎菌Ｂポリサッカライド抗体
は、１００μｇ／ｍｌで試験した場合、細菌結合の証拠を示した。２つのさらな
る抗体は、莢膜化株および非莢膜化変異株の両方に最小の結合の証拠を示した。
これらの抗体の細菌結合を、不定（ｉ）として得点づけした。
【０１５５】
（ｆ）補体媒介性殺菌活性：
殺菌アッセイを、Ｍａｎｄｒｅｌｌら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉ
ｓ． １７２：１２７９に記載される方法を使用して、以下の改変を用いて行っ
た：生物を０．２５％グルコース；およびバルビトール緩衝液の代わりにＧｅｙ
緩衝液からなる血清希釈緩衝液を含有するＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地で
増殖させた。いくつかの実験では、補体の異なる供給源を使用した：これらは２
つの異なるウサギの乳仔の血清プール（Ｒａｂ Ｃ ＩおよびＲａｂ Ｃ ＩＩ
と呼ばれる）ならびにヒト無ガンマグロブリン血症血清（Ｈｕ Ｃと呼ばれる）
を含んだ。
【０１５６】
補体媒介性細菌溶解を活性化する各モノクローナル抗体の能力を、表１に報告
する。ＥＬＩＳＡによるＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応性である殺菌性抗体
の例（例えば、ＳＥＡＭ−１８、ＳＥＡＭ−３０、およびＳＥＡＭ−３５）があ
る。ＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性を示さない殺菌性抗体の例（例えば
、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、およびＳＥＡＭ−８）もまたあ
る。
【０１５７】
（ｇ）オプソニン活性：
モノクローナル抗体のオプソニン活性を、種々の確立された方法によって測定
し得る。Ｓｊｕｒｓｅｎら（１９８７）Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｓｃａｎｄ．， Ｓｅｃ． Ｃ ９５：２８３，
Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９８９）Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄ
ｉｓ． ２１：２６７， Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９１）ＡＰＭＩＳ ９９：７
６９， Ｈａｌｓｔｅｎｓｅｎら（１９９１）ＮＩＰＨ Ａｎｎａｌｓ １４：
１５７， Ｆｒｅｄｌｕｎｄら（１９９２）ＡＰＭＩＳ １００：４４９， Ｇ
ｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９２）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ６０：２７
７７、Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎら（１９９３）Ｊ． Ｉｎｆｅｃ． Ｄｉｓ． １
６７：１３１４、Ｂｊｅｒｋｎｅｓら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ
． ６３：１６０、およびＨａｙｒｉｎｅｎら（１９９５）Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ
． Ｄｉｓ． １７１：１４８１。
【０１５８】
１つのオプソニン作用アッセイにおいて、ＧＮ寒天プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ
Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｅｋ， Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢＶ， Ａｌｐｈｅｎ ａ
／ｄ Ｒｉｊｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で３７℃で新たに増殖させたＮ
． ｍｅｎｉｇｉｔｉｄｉｓを使用して、０．１の初期ＯＤを得るように８ｍｌ
のＭｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地 （Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， Ｍ
Ｉ）に接種した。細菌を、激しく振盪しながら対数期（０．７５〜０．８５の６
６０ｎｍでの吸光度）まで増殖させた。細胞を、蓋付きの滅菌のプラスチックチ
ューブに移し、そして１０分間３５００ｒｐｍで遠心分離した。
【０１５９】
細胞を、４ｍｌの７０％エタノールを添加し、そして４℃で少なくとも１時間
インキュベートすることによって固定した。固定した細胞を、３５００ｒｐｍで
１０分間の遠心分離によって再度ペレット化し、そして滅菌のリン酸緩衝化生理
食塩水（ＰＢＳ）中に１．０のＯＤになるように再懸濁した。細胞懸濁物（１．
３５ｍｌ）をエッペンドルフチューブに添加し、そして５分間１０，０００ｒｐ
ｍで遠心分離した。上清を廃棄し、そして別の１．３５ｍｌを同じチューブに添
加し、続いて遠心分離して１チューブあたり１×１０9細胞を得た。フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の１．０ｍｇ／ｍｌの溶液を調製し、そして５分間超音
波処理し、次いで５分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ＦＩＴＣ−ＰＢＳ
溶液（５０μｌ）を各チューブの細菌に添加し、次いで軽度に攪拌しながら３７
℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ（９５０μｌ）を各チューブに添加し
、そして２分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１ｍｌのＰＢＳ
で１回、そして１ｍｌのＢＳＡ−Ｈａｎｋｓ平衡化塩溶液（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ）
で１回洗浄した。ＦＩＴＣ標識した髄膜炎菌を１％のＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で再構
成し、そして１００μｌのアリコートに分けた。これを、アッセイでの使用まで
−２０℃で保存した。
【０１６０】
ヒト多型性核細胞（ＰＭＮ）をヘパリン含有チューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）中の健常な成体の末梢
血から単離した。１０ｍｌの容量の血液を、等量のリン酸緩衝化生理食塩水（Ｐ
ＢＳ； ｐＨ ７．４）で希釈し、そして１２ｍｌのｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（密
度１．１１９、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，
ＭＯ）の上部に１０ｍｌのＦｉｃｏｌｌ ＰａｑｕｅTM （Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ， Ｕｐｐｓａｉｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）からなるＦｉｃｏｌｌ ｈｉｓｔｏ
ｐａｑｕｅ勾配に載せた。室温で４００×ｇで２０分間の遠心分離後、ＰＭＮを
ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅの上部から回収し、そして１％のゼラチンを含有する氷冷
ＲＰＭＩ培地（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ， ＮＹ）を添加した。細胞を２５０×ｇで遠心分離し、そして残りの赤血
球を９ｍｌの氷冷した蒸留水中に細胞を再懸濁することによって溶解させた。１
分後、濃縮したＰＢＳおよびＲＰＭＩ−ゼラチンを添加して細胞懸濁物を等張化
した。ＰＭＮを遠心分離し、そしてＲＰＭＩ培地に１×１０7／ｍｌの密度に再
懸濁した。ＰＭＮの純度および生存性は９５％以上であった。
【０１６１】
マイクロタイタープレートに、試験されるべきモノクローナル抗体の適切な希
釈物（ＢＳＡ−ＨＢＢＳ中で希釈した）、５μｌの１０％ヒト補体（ＢＳＡ−Ｈ
ＢＢＳ中）、および２５μｌのＦＩＴＣ標識した細菌懸濁物を添加して、５０μ
ｌの全容量にした。選択した抗体を、補体を含まずに、そして３つまでの異なる
補体供給源：正常なプールしたヒト血清；無ガンマグロブリン血症血清；および
ウサギ乳仔血清を用いて、１〜１０％までで補体濃度を変化させて試験した。各
アッセイはポジティブおよびネガティブ抗体コントロール、ならびに補体、非オ
プソニン作用、および細胞のみのコントロールを含んだ。オプソニン作用反応を
、３０分間３７℃にて振盪機上で進行させ、その後、氷上にマイクロタイタープ
レートに置くことによって反応を停止した。
【０１６２】
食細胞懸濁物（５０μｌ）を５×１０6細胞／ｍｌの最終濃度で添加した。こ
れによって１０：１の細菌：食細胞の比が得られる。食細胞活動を、振盪機上で
３７℃で３０分間進行させ、その後、それを氷上に置いた。冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ
（１００μｌ）を各ウェルに添加した。プレートを１０分間１１００ｒｐｍで遠
心分離した。上清をウェルから吸引し、そして細胞をさらに２回１５０μｌの冷
ＢＳＡ−ＨＢＢＳで洗浄した。次いで、冷ＢＳＡ−ＨＢＢＳ（１５０μｌ）を添
加し、そして得られた細胞懸濁物を滅菌チューブに移した。２％のパラホルムア
ルデヒド（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，
ＰＡ）を含有するＰＢＳの溶液を添加して細胞を固定した。次いでサンプルを
、間接的な蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６３】
１６の代表的なＳＥＡＭモノクローナル抗体についてのオプソニン作用実験の
結果を、表１に報告する。オプソニンであることが見出されている全ての抗体は
また、この補体供給源の少なくとも１つを使用する上記のアッセイにおいて殺菌
性であった。しかし、表１に見られ得るように、殺菌性であるがオプソニン性で
はない抗体の例（例えば、ＳＥＡＭ−２、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−７、ＳＥＡ
Ｍ−１６、およびＳＥＡＭ−４１を参照のこと）がある。
【０１６４】
（ｈ）自己反応性の評価：
３９ ＳＥＡＭモノクローナル抗体を含有する部分精製された組織培養上清を
、宿主のポリシアル酸に対する自己反応性について評価した。１つのアッセイに
おいて、モノクローナル抗体を、ヒト神経芽細胞腫細胞株ＣＨＰ−１３４（Ｌｉ
ｖｉｎｇｓｔｏｎら、（１９８８） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：
９４４３）と交差反応するその能力について、間接的免疫蛍光のフローサイトメ
トリー検出を用いて評価した。このアッセイにおいて、その表面の神経細胞接着
分子（ＮＣＡＭ）に結合した長鎖ポリシアル酸（ＰＳＡ）を発現するＣＨＰ−１
３４細胞は、ヒトＰＳＡ抗原についての細胞性マーカーとして作用する。コント
ロール実験において、ほぼコンフルエントな細胞培養物を５０ｍｌの遠心管に回
収し、そして１０００×ｇで遠心分離した。上清をデカントした後、５ｍｌのブ
ロッキング緩衝液を添加し、細胞を再懸濁した。次いで、細胞を血球計で計数し
、そして２つの等しいアリコートに分けた。１方のアリコートを、エキソノイラ
ミニダーゼ（１０ユニット／１０8細胞、ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
．， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）とともに室温で２時間インキュベート
した；他方のアリコートを、同様に、しかし酵素なしで処理した。インキュベー
ションの後、各アリコートからの細胞を、個々の反応管間で、各管が１０6個の
細胞を含むよう分配した。細胞を洗浄するために、２ｍｌのブロッキング緩衝液
を各反応管に添加し、その管をＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、
１０００ｒｐｍで、６分間遠心分離し、そして上清を吸引除去した。洗浄した細
胞を、総容量２００μｌで、抗体を含まずに、または示された濃度（通常１０ま
たは１００μｇ／ｍｌ）の試験抗体（すなわち、ＳＥＡＭ ＭＡｂ）とともにの
いずれかで、氷上で２時間インキュベートした。
【０１６５】
アッセイにおけるコントロール抗体は、以下を含んでいた：（１）関連しない
特異性のＩｇＧモノクローナル抗体（ネガティブコントロールとしての、ＶＩＩ
Ｇ１０）；（２）ＩｇＭ抗ポリシアル酸モノクローナル抗体（ポジティブコント
ロールとしての、２−１Ｂ）；および（３）ＮＣＡＭのタンパク質骨格に特異的
な抗ＣＤ５６モノクローナル抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ， Ｍａｒｓｅｉｌｌ
ｅ， Ｆｒａｎｃｅ）。ブロッキング緩衝液（２ｍｌ）を各反応管に添加し、そ
して管をＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ−６００Ｂ中で、２０℃、１０００ｒｐｍで、６
分間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を吸引除去し、そして細胞を室温で１
時間、１５０μｌのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−結合体化
Ｆ（ａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（４μｇ／ｍｌに希
釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏ
ｖｅ， ＰＡ）とともにインキュベートした。ブロッキング緩衝液で洗浄した後
、ＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０、１５０ｍＭ塩化ナ
トリウム）中の４００μｌの０．２５％ホルムアミドを細胞に添加し、そして細
胞をＦＡＣＳＣＡＮTM細胞ソーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｍ
ｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）を使用して、フローサイトメトリーによっ
て分析した。
【０１６６】
全ての抗体を、複製において最終濃度１０および１００μｇ／ｍｌの抗体で、
未処理細胞、およびノイラミニダーゼで前処理した細胞を使用して試験した。こ
の処理によって、表面ポリシアル酸が切断され、そしてポリシアル酸への抗体結
合の特異性についてのアッセイにおけるコントロールを提供する。代表的な実験
において、一次抗体なしで、または関連しない抗原特異性を有するコントロール
モノクローナル抗体とともにインキュベートした細胞は、非常に小さい蛍光を示
す（約９８％の細胞が＜１０ユニットの蛍光を有する）。対照的に、抗ＮＡｃ
ＭｅｎＢ ＰＳモノクローナル抗体である２−１Ｂで処理された実質的に全ての
細胞が、強く蛍光を発する。この蛍光は、抗体がノイラミニダーゼで前処理され
た細胞とともにインキュベートされる場合、コントロールレベルまで減少する。
同様に、抗ＣＤ５６で処理した細胞は、強く蛍光を発する。この抗体を用いて、
蛍光は、細胞をノイラミニダーゼで前処理することによって影響を受けない。な
ぜなら、ＣＤ５６決定基は、ＮＣＡＭのタンパク質骨格に位置し、そしてノイラ
ミニダーゼによるポリシアル酸の除去によって影響を受けないからである。
【０１６７】
ＳＥＡＭ−５抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験される場合、検出可能な結合を
与えず、このアッセイではネガティブであると考えられる。ＳＥＡＭ−３５抗体
は、１０または１００μｇ／ｍｌで試験した場合、強力なポリシアル酸特異的結
合を示し、ポジティブであると考えられる。少数個の抗ＮＰｒ ＭｅｎＢ ＰＳ
モノクローナル抗体は、１００μｇ／ｍｌで試験された場合、結合を示すが、１
０μｇ／ｍｌで試験された場合、ネガティブであるようである（例えば、ＳＥＡ
Ｍ−１２）。このような抗体は、本出願の目的で、最小限に自己反応性であると
考えられる。稀少抗体は、細胞のノイラミニダーゼによる前処理によって影響を
受けなかった神経芽細胞株との弱い反応性を有するようであった（例えば、ＳＥ
ＡＭ−７）。このような抗体のポリシアル酸との自己反応性は、アッセイにおい
て不定として得点され、そしてこれらの抗体もまた、本出願の目的で、宿主ＰＳ
Ａに対して最小の自己反応性を有すると考えられる。
【０１６８】
表１は、この間接的蛍光フローサイトメトリーアッセイにおいて決定した場合
の、各抗体の自己抗体活性を要約する。ＣＨＰ−１３４細胞において発現したポ
リシアル酸抗原との交差反応性は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体のＮＡｃ−
ＭｅｎＢ ＰＳとの交差反応性と密接に相関した。表１に示すように、ＥＬＩＳ
ＡにおいてＮＡｃ−ＭｅｎＢ ＰＳと交差反応しなかったモノクローナル抗体は
、ＣＨＰ−１３４細胞にも結合しなかったが、ＥＬＩＳＡにおいてＮＡｃ−Ｍｅ
ｎＢ ＰＳと交差反応した抗体の全てが、ＰＳＡともまた交差反応した。２つの
アッセイ間のこの相関は、予想されなかった。なぜなら、ＮＡｃ−ＭｅｎＢ Ｐ
Ｓおよび宿主ＰＳＡのポリサッカライド共有結合構造は、同一であると報告され
ているからである。
【０１６９】
（実施例５ ＳＥＡＭモノクローナル抗体を用いたＭｅｎＢ抗原の分子模倣
物の同定）
以下の手順を、本発明のＳＥＡＭモノクローナル抗体と相互作用する分子模倣
物を同定するために実施した。コンビナトリアル合成分子を、上記のＺｕｃｋｅ
ｒｍａｎらの手順に従って合成した（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９６） Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６７：４３７およびＺｕｃｋｅ
ｒｍａｎｎら（１９９２） Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１４：１０６４
６を参照のこと）。分子模倣物を、逆相ＨＰＬＣによってプールを分画すること
により同定した。このプール（約２００μｌまたはＤＭＳＯ中１０μＭ／分子溶
液）を、Ｄｙｎａｍａｘ Ｃ１８逆相カラム（Ｖａｒｉａｎ， Ｐａｌｏ Ａｌ
ｔｏ，ＣＡ）に注入し、そして０．１％トリフルオロ酢酸中０％〜８０％（ｖ／
ｖ）にアセトニトリルの６０分間にわたる直線勾配を用いて溶出した。この画分
を凍結乾燥し、そして４０μｌのＤＭＳＯまたはアセトニトリル／水（１：１）
に再懸濁した。次いで、各画分のアリコート（５μｌ）を、ＥＬＩＳＡにおいて
特定のＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮｐｒ−ＭｅｎＢ ＰＳの結合を阻害する
ことによって試験した。次いで、阻害活性を有する画分中の分子を、ＬＣ／ＭＳ
（ＨＰ１１００ ＬＣ／ＭＳＤ， Ｈｅｗｌｗｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）によって同定した。
【０１７０】
上記の標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて、３０分でＯＤ405を与えるのに
必要な濃度とほぼ等しい濃度までＰＢＳ中に希釈したＳＥＡＭモノクローナル抗
体（１００μｌ）を、Ｎｐｒ−Ｍｅｎ ＰＳ被膜したプレートのウェルに添加し
た。ＤＭＳＯ中のコンビナトリアル合成分子の溶液（１〜２μｌ）を、モノクロ
ーナル抗体溶液に添加し（プール中１分子あたり１μＭの最終濃度）、そして４
℃にて一晩インキュベートした。コントロールを、（１）抗体のみ、（２）緩衝
液のみ、ならびに（３）抗体および緩衝液とともに、各々１〜２μｌのＤＭＳＯ
とインキュベートした。このプレートをＰＢＳで４回洗浄し、そして以前に記載
したように発色させた。プールを、ＳＥＡＭモノクローナル抗体ＳＥＡＭ−２、
ＳＥＡＭ−３、ＳＥＡＭ−５、ＳＥＡＭ−１２、ＳＥＡＭ−１６、ＳＥＡＭ−１
８、およびＳＥＡＭ−２８を用いてスクリーニングし、そしてＤＭＳＯを用いて
抗体と比較した阻害が、インヒビターの非存在下で観察された結合の８０％以上
である場合、ポジティブであると判断した。
【０１７１】
上記の構造１の分子模倣物を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて特定のＳＥＡＭモ
ノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を阻害するとして同定した
。ＩＣ50値（ＳＥＡＭモノクローナル抗体のＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳへの結合を
５０％阻害するのに十分な個々の化合物の推定濃度）を、上記のＥＬＩＳＡにお
けるプールの連続希釈によって決定した。本発明の分子模倣物のＩＣ50濃度は、
このプール中で単一の活性分子と仮定して、約３ｎＭ〜７００ｎＭの範囲である
。
【０１７２】
（実施例６）
（分子模倣物ワクチン組成物の調製）
上記の模倣物に対応する低分子を含有するワクチン組成物を、その模倣物とキ
ャリアタンパク質との、非共有結合、または共有結合によって調製する。疎水基
または反応性基を模倣物に付加して、この模倣物のＥＬＩＳＡにおいてＮＰｒ−
ＭｅｎＢ ＰＳに対するＳＥＡＭモノクローナル抗体の結合を阻害する能力を保
持する様式において、低分子模倣物とキャリアタンパク質との会合を促進する。
【０１７３】
（ＯＭＰビヒクルの調製）ＯＭＰビヒクルを、Ｌｏｗｅｌｌら（１９８８）
（Ｊ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１６７：６５８〜６６３）およびＺｏｌｌｉｎｇｅｒ
ら（１９７９）（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６３：８３６〜８４８）に記載
の技術を組み合わせて用いて、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ
Ｂ群の莢膜欠損変異株（Ｍ７株）から調製する。手短には、細菌をＭＨブロス
中で増殖し、遠心分離によってペレット化して、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、および０．０１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）を含む１
５ｍｌの緩衝液中に再懸濁して、次に３０分間、５６℃まで暖める。室温まで冷
却した後、懸濁液をＰｏｌｙｔｒｏｎ（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ ＧｍｂＨ．、Ｌ
ｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、全速で３分間せん断し、次に１６
０００×ｇで１５分間遠心分離する。生じるペレットを、１０ｍｌの緩衝液（５
００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ リン酸ナトリウム）に再懸濁し、５ｍｌ
の界面活性剤溶液（１０％ デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、０．１５Ｍ グリシン（Ｂｉｏｒａ
ｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、および３０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（Ｅ
ＤＴＡ）（ＳＩＧＭＡ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））を用いて処理する。
この懸濁液を１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。次に、上清を収集して
、１００，０００×ｇで２時間遠心分離する。外膜タンパク質調製物を含むペレ
ットを、１０ｍｌの水に再懸濁し、４℃で保存する。
【０１７４】
外膜タンパク質の１０ｍｌの懸濁液を、５ｍｌの界面活性剤溶液で再処理し、
次に３０分間、５６℃まで暖める。冷却後、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を
、第２の界面活性剤溶液（１％ ＤＯＣ、０．０５Ｍ グリシン、および０．０
０５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．８）中の、２ｃｍ×２０ｃｍ Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−１００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用するクロマトグラフィーによって（１度に
２ｍｌ）、外膜タンパク質から除去する。ピーク画分を収集し、３０℃まで暖め
、そして０．２μｍメンブレンフィルターを通して、４容量の冷濾過滅菌エタノ
ール中に直接、滅菌濾過する。この混合液を4℃でオーバーナイトインキュベー
トする。生じる沈殿を１６，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、
１ｍｌの滅菌蒸留水中に再懸濁する。生じるＯＭＰ調製物を−６０℃で保存する
。
【０１７５】
ラウロイル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ基を含有する分子模倣物を、等重量のラウロイル
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ誘導体と界面活性剤溶液（１％ ＤＯＣ、０．０５Ｍグリシン
、および０．００５Ｍ ＥＤＴＡ）中に可溶化したＯＭＰビヒクルとを合わせる
ことによる疎水的相互作用を介して、ＯＭＰビヒクルと複合体化する。この溶液
を、１０，０００ダルトンの分子量化カットオフを有する透析チューブ中に配置
し、３Ｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に対して、各１Ｌの２４時間にわたる３回の
緩衝液交換において透析する。
【０１７６】
（分子模倣物−キャリアタンパク質結合体の調製）キーホールリンペットヘ
モシニアン（ＫＬＨ、例えば、Ｉｍｊｅｃｔ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を２ｍｌの蒸留水に再懸濁し、最終濃度１０ｍｇ／ｍｌに
する。２００μｌのこの溶液を、１．５ｍｌの微量遠心管に添加する。Ｎ−ヒド
ロキシスクシンイミド活性化エステルおよびＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（登録商標）
（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のようなマレイミド基を含むヘテロ
二官能性架橋剤（２ｍｇ）を１ｍｌの結合緩衝液（０．０８３Ｍ リン酸ナトリ
ウム、０．９Ｍ 塩化ナトリウム、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中に溶解
する。１００μｌのＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ溶液を、直ちにＫＬＨ溶液と合わせ、
周囲温度において、１時間反応させる。この溶液を、結合緩衝液で平衡化した１
．５ｃｍ×１０ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムにアプライする。ボイ
ドボリュームに溶出するマレイミド活性化ＫＬＨを収集し、保持する。システイ
ンアミノ酸を含む上記の分子模倣物を、１００μｌのＤＭＳＯ中に再懸濁し、マ
レイミド活性化ＫＬＨの溶液に添加する。混合液を、周囲温度で１８時間反応さ
せる。この反応を、最終濃度５ｍＭのβメルカプトエタノールの添加により停止
する。最後に、ハプテンキャリア結合体を、ＰＢＳで平衡化した２ｃｍ×２５ｃ
ｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでの浸透ゲルクロマトグラフィーによっ
て、精製する。カラムを２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によってモニターする。
【０１７７】
（実施例７）
（ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピトープの低分子模倣物による、ＮＰｒ−Ｍｅ
ｎＢ ＰＳへの抗体の結合の阻害）
ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピトープの低分子模倣物（構造５Ａ（１）、５Ｂ（
１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２））を上記のように合成した。これらの分子
模倣物は、以下の構造を有する：
【０１７８】
【化３４】
【０１７９】
【化３５】
【０１８０】
【化３６】
【０１８１】
【化３７】
【０１８２】
競合的固相ファージＥＬＩＳＡ手順を使用して、固相ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ
に対するモノクローナル抗体分子の結合を阻害するＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳエピ
トープの低分子模倣物の能力について評価した。モノクローナル抗体を０．５〜
１のＯＤを生じるような濃度にまで、ＰＢＳ中で予め希釈したことを除いて、オ
リゴマーＥＬＩＳＡによって、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳに対する抗体の阻害のア
ッセイを上記のように行った。次に、モノクローナル抗体を、レプリカプレート
のウェル（各々は７０μｌのＰＢＳおよびアセトニトリル／水（１：１）中に希
釈された５μｌのインヒビターを含み、これを５０μｌの抗体溶液の添加前に添
加した）に添加した。インヒビターおよび抗体を、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ Ｅ
ＬＩＳＡプレートとともに、周囲温度で、１時間インキュベートした。４つのＳ
ＥＡＭ抗体の４つの分子模倣物による阻害の結果を、図１Ａ〜Ｄのグラフに示す
。特に、図１は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）
による、（Ａ）ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、（Ｂ）ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／
ｍｌ）、（Ｃ）ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、および（Ｄ）ＳＥＡＭ３０（
１０ｍｇ／ｍｌ）の濃度依存性阻害を示す。
【０１８３】
（（ａ）ＥＬＩＳＡプレート上に直接コートした分子模倣物との交差反応性
）
モノクローナル抗体を、固相ＥＬＩＳＡ型式における分子模倣物に対する直接
的結合によって示される分子模倣物との交差反応するその能力について評価した
。使用した方法は、以下の例外を除き、ＮＰｒ−ＭｅｎＢ ＰＳ ＥＬＩＳＡに
ついての上記の方法と類似の方法であった。抗体をＰＢＳ中に希釈し、そしてプ
レートを周囲温度で１時間インキュベートした。このプレートを、ＰＢＳで５回
洗浄し、そして、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、お
よびＩｇＡポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）をＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡプ
レート上で周囲温度でインキュベートした。図２は、構造５Ａ（１）、５Ｂ（１
）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、
ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥ
ＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合を示す。
【０１８４】
（実施例８）
（構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のウシ血清
アルブミン結合体の調製）
ジメチルスルホキシド中の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、または
６Ｂ（２）の溶液（１５０μｌ、約５０ｍＭ）を、ジメチルスルホキシド中の５
０μｌの０．１７Ｍ ＭＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏ
ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と合わせた。約２０μｌの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ緩衝液（Ｓｉ
ｇｍａ）、ｐＨ８．０を、反応から放出される酸を中和するために添加した。周
囲温度での１時間のインキュベーションの後、０．５ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃｅ）を添加した。周囲温度での１８時間のイン
キュベーションの後、混合液を、ＰＢＳで平衡化した１０−ＤＧゲル濾過カラム
（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）に通すことにより精製した。画分
（０．５ｍｌ）を収集し、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し
て、タンパク質の存在について試験した。タンパク質を含有する、カラムから溶
出する最初の３画分を合わせた。
【０１８５】
（（ａ）構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢ
ＳＡ結合体と、ＳＥＡＭ抗体との、交差反応性）
構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（２）のＢＳＡ結合体
を、ＰＢＳ中に１：１０００で希釈し、各１００μｌを、マイクロタイタープレ
ート（Ｉｍｍｕｌｏｎ２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎ
ｃより入手可能）のウェルに添加した。このプレートを４℃で、オーバーナイト
インキュベーションした。このウェルをＰＢＳを用いて３回洗浄し、２５０μｌ
のブロッキング緩衝液で満たし、非特異的結合部位をブロックするために周囲温
度で３０〜６０分間インキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で３回
洗浄した。試験する抗体を、ＰＢＳ中に希釈して、次に、各ウェルあたり１００
μｌ添加した。このプレートをカバーし、そして４℃でオーバーナイトインキュ
ベートした。
【０１８６】
オーバーナイトのインキュベーションの後、このウェルをＰＢＳで５回洗浄し
、そして、１ウェルあたり１００μｌの（ＰＢＳ中で１：２０００に希釈した）
アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡポリク
ローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）とともに、周囲温度で１時間インキュベートした。
次にプレートをＰＢＳで洗浄し、そして基質緩衝液中に１ｍｇ／ｍｌに希釈した
新鮮に調製した基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Ｓｉｇｍａ）１００μ
ｌを、各ウェルに添加した。４０５ｎｍでの吸光度の値を約３０分後に測定した
。図３は、上記の構造５Ａ（１）、５Ｂ（１）、６Ａ（１）、および６Ｂ（１）
に対する、ＳＥＡＭ３（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＳＥＡＭ７（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｓ
ＥＡＭ１８（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＳＥＡＭ３０（１０ｍｇ／ｍｌ）の結合
を示す。
【０１８７】
従って、ＭｅｎＢの独特なエピトープの新規分子模倣物、ならびにこれの取得
方法、および使用方法を開示する。本発明の好ましい実施態様は、ある程度詳細
に記載されているが、明白なバリエーションが、添付の請求の範囲によって規定
される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解さ
れる。
【０１８８】
（本発明の実施において有用な株の寄託）
以下のハイブリドーマ細胞株の生物学的に純粋な培養物の寄託を、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１２
３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄ）に対して行った。示される受託番号が、生存率試験に成功し、そして必要な
手数料の支払い後に、割り当てられた。寄託は、特許手続上の目的のための微生
物の寄託の国際的承認に関するプタペスト条約の条項およびその規則のもとにな
された（プタペスト条約）。これは、寄託の日より３０年間の期間生存可能な培
養物の維持を保証する。その寄託された生物は、ブタペスト条約の条文よって、
そしてＣｈｉｒｏｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとＡＴＣＣとの間の合意に従って
ＡＴＣＣより利用可能となる。このことは、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２およびそ
れに従う米国特許庁長官の規則（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１２を含む、特に８８
６ＯＧ６３８を参照）に従い、米国特許庁長官によってその生物に対する権利を
与えられると決定される者に対し、その子孫についての永久的かつ無制限の利用
可能性を保証する。特許の付与に際して、寄託された培養物に対する公衆の利用
可能性についての全ての制限は、取り消し不能に除去される。
【０１８９】
この寄託は、単に当業者の利便性のために提供され、そして３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．
§１１２のもとで要求される寄託の承認ではない。これらのハイブリドーマの核
酸配列、ならびにそれによってコードされる抗体分子のアミノ酸配列は、本明細
書において参考として援用され、そして本明細書における記載でのいかなる矛盾
の事象においても、支配的である。寄託された物質の製造、使用、または売却の
ためには、ライセンスが必要とされ得、そして本明細書においては、そのような
ライセンスは、全く付与されない。
ハイブリドーマ 寄託日 ＡＴＣＣ番号
ＳＥＡＭ−３ １９９６年８月１６日 ＨＢ−１２１７０
ＳＥＡＭ−１８ １９９６年８月１６日 ＨＢ−１２１６９
ＳＥＡＭ−２ １９９７年７月３０日 ＣＲＬ−１２３８０
ＳＥＡＭ−１２ １９９７年７月３０日 ＣＲＬ−１２３８１
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１４３９４４（Ｐ２００９−１４３９４４Ａ）
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２５４３６（Ｐ２００９−２５４３６）
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【分割の表示】特願２０００−５０７６９８（Ｐ２０００−５０７６９８）の分割
【原出願日】平成１０年８月２６日（１９９８．８．２６）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（３９９００５０２４）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター オブ ノーザン カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【分割の表示】特願２０００−５０７６９８（Ｐ２０００−５０７６９８）の分割
【原出願日】平成１０年８月２６日（１９９８．８．２６）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【出願人】（３９９００５０２４）チルドレンズ ホスピタル メディカル センター オブ ノーザン カリフォルニア (1)
【Ｆターム（参考）】
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