高度に同位体標識された二次微生物代謝産物の生産および対応する代謝産物
本発明は、液体合成培地において菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産するための方法に関する。本方法によれば、該合成は、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の本質的にすべてが安定同位体に置き換えられた液体合成培地を添加しつつ、菌類または細菌類を不活性担体に固定化することによって実施する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体合成培地において菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産するための方法、および菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、同位体標識された物質は、特に、高製品処理能力で効率的な分光分析を可能とする質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）の技術において重要性が増している。この技術は、分子質量に関していかなる制限を課すことなく多くの様々な潜在的被検体に対して使用することができるが、個々の物質の検出において、分解スペクトルおよび個々の分子ピークの両方を適宜特定しなければならないという問題が生じる可能性がある。信頼性のあるＬＣＭＳの利用および方法を確実にするために、いわゆる内部標準物質の使用がますます重要になってきた。内部標準は、標的被検体そのものに極めて似ている、すなわち、特に、同じ分子構造を有する可能性があるが、分子量が異なる物質である。それゆえ、標的被検体の同位体標識した分子、すなわち、分子内の１個または数個の原子がこれらの同位体に置き換えられている分子は、理想的な内部標準であることがわかった。現在、このような物質は、例えば、水素または炭素を対応するより重い同位体で置換することによる有機合成によって生成されている。
【０００３】
しかし、この文脈において、内部標準として使用する同位体標識した物質は、標的被検体からの明確な分離を可能とするためには少なくとも３の分子量の差を有すること、および可能ならば、できるだけ少ないアイソトポマーを含有する物質を使用することが望ましいことがＬＣＭＳ分析において明らかとなった。
【０００４】
同位体標識した植物または微生物の代謝産物を生産する方法は、各植物および／または微生物の生合成経路を介している。そうすることにおいて、培地には放射性標識した栄養物を補い、培地成分は、微生物もしくは植物培養の同化サイクルおよび代謝サイクルに特定の割合まで組み入れられて、同位体が代謝産物に取り込まれる。この方法では不完全な標識しか実現可能でなく、種々のアイソトポマーの混合物が通常形成され、このため、このような物質の使用に関して１つの標準だけでなく、アイソトポマーの広いスペクトルが適用され、それはそれでＬＣＭＳ分光分析における標的物質の選択的検出をまったくできなくするか、または非常な困難を伴ってのみ可能にさせるので、このような同位体標識した物質、すなわち同位体標識された植物代謝産物もしくは微生物代謝産物を内部標準として使用するのにほとんど適さないものとするという欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、出発物質に含まれる炭素原子、窒素原子もしくは硫黄原子のすべて、またはほとんどすべてが、安定同位体によって置換され、その結果分光分析処理、特にＬＣＭＳにおいて容易に、信頼性を有して検出可能な、単一の同位体標識された最終生産物を提供する、菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産するための方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、分光分析プロセス、特にＬＣＭＳにおいて内部標準として安全に信頼性を有して使用することができる代謝産物を生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの目的を解決するために、本発明による方法は、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体によって置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類または細菌類を不活性担体に固定化することによって実施される仕方で、合成を行う。炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体で置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類もしくは細菌類を不活性担体に固定化することにより該合成を実現することによって、増殖による培地から得られる原子のすべて、または少なくとも９５％が、すなわち、炭素、窒素もしくは硫黄原子が、従来技術においてしばしば記載されたように、様々な数の同位体原子を有する異なるホモログの混合物ではなく、選択的で、同位体標識された産物の回収を可能にするために培地中に含まれる同位体標識された栄養物のさらに安定した同位体によって置換された、菌類および細菌類の同位体標識された代謝産物を生産することが可能となった。したがって、この生産方法によって、選択的に使用でき、任意の分析、特に代謝の研究において明確に、疑いなく検出することができる同位体標識された二次代謝産物を得ることが可能である。
【０００７】
さらなる展開によれば、本方法は、該液体合成培地において、糖もしくは糖アルコール、特にＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコース、１３Ｃ−スクロース、１３Ｃ−グリセロールおよび／または１３Ｃ−アセテートを炭素源として使用し、１５Ｎ−アミノ酸、１５Ｎ−硝酸塩、１５Ｎ−アンモニウム化合物または１５Ｎ−尿素を窒素源として使用し、３３Ｓもしくは３４Ｓ−硫酸塩、３３Ｓもしくは３４Ｓ−硫化物、３３Ｓもしくは３４Ｓ−アミノ酸を硫黄源として使用する仕方で行われる。菌類または細菌類の代謝産物を増加させる場合、該液体合成培地に含まれている完全に標識された炭素、窒素および／または硫黄源のために、菌類または細菌類は、それぞれ、菌類または細菌類の二次代謝産物がそれぞれの同位体で標識されるか、または完全ではないが、高度に、各同位体によって置換されることを確実にするように、それぞれ標識された同位体を、代謝産物中に強制的に取り込ませる。
【０００８】
菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物の収率を改善するために、さらなる展開による本方法は、該液体合成培地が、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−のイオンを有する無機塩類または、無機酸類および無機塩基類から選択される混合物をさらに含有する仕方で行われる。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−のイオンを有する塩または酸および塩基が該液体合成培地に含まれているため、炭素、水素、窒素および硫黄に加えて菌類または細菌類に場合によって存在する任意の外来イオンは、迅速な増殖の他に高収率を確保するために十分な量で安全に与えられることが保証される。
【０００９】
収率をさらに改善するために、大きな内部表面積を有する天然担体または合成担体、特にケイ酸塩、層状ケイ酸塩、ゼオライト、ベントナイト、焼成クレー、珪藻土、化学合成物などを該不活性担体として使用する。大きな内部表面積を有する不活性担体を使用することによって、大きな内部表面積を有する不活性担体を用いないで実施される従来の方法に対して、本発明による方法における収率を少なくとも５０％改善することが可能である。収率におけるこのような増加は、本方法をより経済的にするだけでなく、同位体標識された二次代謝産物が分析、またはさらに代謝研究において内部標準として好適な仕方で使用されることを可能とするための該同位体標識された二次代謝産物の所望の最終生産物の十分な量が生産されることを確実にする。
【００１０】
本発明によれば、特に、収率における最も大きな改善は、ケイ酸アルミニウム、例えば珪藻土、特にはｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ、ｉｓｏｌｕｔｅ ＨＭ−Ｎもしくはゼオライト、または層状ケイ酸塩、特には、雲母鉱物の群のバーミキュライトを該不活性担体として天然形態もしくは処理形態において使用することにおいて得られる。これらの物質に関して、表面張力、気孔率などの表面特性は、特に、担体表面上でとりわけ良好な回転速度を達成するために好適である。同様に、発泡材料、ポリアミド、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルなどから選択され得る不活性合成担体の使用によって、収率におけるそれ相応に大きな改善が可能とされ、それによって大きな内部表面積を有する天然担体の使用、または合成担体の使用により、生産される代謝産物に応じて同様に向上した収率がもたらされる。
【００１１】
高収率であると同時に、できる限り迅速な方法制御のために、本発明はさらに、生産を３℃から４５℃、特に１０℃から３５℃の範囲の温度で実現することに展開される。この文脈において、生産方法は常に一定温度で行われないことだけでなく、示された制限内の温度変化がまた、改善された収率や加速された反応速度、または高い代謝回転数をももたらし得ることが好ましいことが一部明らかになった。
【００１２】
できるだけ純粋な最終産物を得るために、本発明による方法は、同位体標識された二次代謝産物を、抽出および濃縮、例えば、固／液−液／液抽出、遠心分離、ろ過および蒸発のようなステップの組合せによって、該液体合成培地から回収する仕方で行われる。同位体標識された二次代謝産物の回収後、本発明によれば、クロマトグラフィー法、および特に、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーおよび／または分取高圧液体クロマトグラフィーが精製操作として好ましく使用される、さらなる精製操作にこれら産物を供することが有利であることがわかった。このような再処理方法および精製操作は、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の少なくとも９５％がそれぞれの安定同位体で置換され、このように、例えば質量分光分析検出を備えた液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）において、天然起源の、重い同位体から十分区別できるために、これらの天然被検体に比べて適当な質量の差を有する産物の回収を可能にさせ、およびそれゆえに、例えば、このような分析において安定した、明確に同定可能な内部標準の提供を可能にする、菌類および細菌類の同位体標識された二次代謝産物の回収を可能にさせる。
【００１３】
本発明は、安定同位体によって置換された、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべて、特に少なくとも９５％を含む、菌類および細菌類の同位体標識された二次代謝産物を提供することをさらに目的とする。
【００１４】
本発明のさらなる展開によれば、菌類または細菌類のこのような同位体標識された二次代謝産物は、動物摂食試験における代謝研究、代謝研究、代謝サイクル、分解経路および／または分解期間ならびにインターカレーションの解明のための分析における内部標準として使用できる。述べられた使用目的のすべてにとって、個々の方法もしくは処理ステップを正確に再現することができるためには、試験スキームもしくは分解スキームにおいて、安定して明確に検出可能な標準、または、明確に検出でき追跡可能な物質を得たことが最も重要である。
【００１５】
さらなる展開によれば、マイコトキシン類、特にニバレノール、デオキシニバレノール、３−アセチル−デオキシニバレノール、１５−アセチルデオキシニバレノール、フサレノン−Ｘ、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ＤＡＳなどのトリコテセン、フモニシンＢ１、Ｂ２もしくはＢ３などのフモニシン、オクラトキシンＡ、Ｂ、ＣもしくはＤなどのオクラトキシン、ゼアラレノン、モニリホルミンまたはアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１もしくはＧ２などのアフラトキシンを、分析方法または分解経路などの代謝研究において代謝産物として使用する。マイコトキシン類は、動物疾患の病因学において重要性が増しており、できるだけ明確に区別でき、純粋な化学物質を使用することによって、それぞれの毒物学的獣医試験をその後に実施することができるために、このような物質の十分な量を工業的に生産することが必要である。マイコトキシンはヒトおよび動物に対する深刻な健康リスクを構成するので、特に多くの国が既にこのような物質の許容範囲に対するガイド値および制限値を設定してきて以来、これらの分析論は、地球規模で重要なテーマである。正確に検出でき、それゆえ、それぞれの毒素の量的分析を可能にする内部標準の使用によるこのようなマイコトキシンの検出および定量は、このような有害物質の検出において重要な進歩を構成している。
【００１６】
同様にまた、毒素の定量的検出または追跡、および特に、本発明のさらなる展開に合致するように、内毒素および外毒素、特に大腸菌種、サルモネラ種、クロストリジウム種、バチルス種もしくはスタフィロコッカス種の細菌毒素が、公衆衛生ならびに食品および半高級食品における有害物質の検出のために非常に重要である。また、抗生物質などの代謝産物の使用および、特に、テトラサイクリン、ストレプトマイシンもしくはアミノグリコシドなどのアクチノマイセテスから作られる抗生物質、バシトラシンもしくはポリミキシンなどのバチルス種から作られる抗生物質、ペニシリンもしくはグリセオフルビンなどのペニシリウムから作られる抗生物質、またはセファロスポリウムから作られるセファロスポリン類が、特に疾患の事象において、または食品および半高級食品におけるこのような物質の検出のために重要性が増しており、ここでまた、抗生物質のような代謝産物の定量的検出を可能にさせる物質が一般社会にとって極めて重要であることが、これらの物質にとってあてはまる。
【００１７】
さらなる展開によれば、１３Ｃ、１５Ｎ、または３３Ｓもしくは３４Ｓの標識度を有する純物質が代謝産物として使用され、それゆえ、一方で、非標識物質もしくは代謝産物からの明確な区別を可能とし、他方でまた、天然同位体からの区別を安全に確実にし、および最後に、分析および検出処理において正確に追跡可能である物質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下において、高度に同位体標識された代謝産物の生産を説明する実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００１９】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−デオキシニバレノール（ＤＯＮ）の生成
完全に標識された１３Ｃ−ＤＯＮを生成するために、フサリウム菌類、すなわちＦｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを、不活性担体物質、すなわちバーミキュライトに接種し、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２０１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを唯一の炭素源として含む合成培地においてインキュベートする。約２８℃で５週間後に、毒素含有物質を酢酸エチルで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【００２０】
約４０ｍｌのインキュベーション培地を生成処方毎に用意する。この後、プールした毒素含有物質をさらに処理する。１０００ｍｌの処方またはバッチから、５から５０ｍｇ［７．５から１７．５ｍｇ］の完全に標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ＤＯＮが得られる。
【００２１】
精製された生成物を、以下の分析処理によって特徴付けした。
【００２２】
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ
１３Ｃ同位体部分を決定するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ Ｑトラップ
ＵＶ／ＶＩＳおよびＨＰＬＣ−ＤＡＤを使用する参照物質に対する純度および濃度の決定
濃度の調整
【００２３】
ＵＶ／ＶＩＳ、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ Ａトラップを使用する品質管理
このように高度に同位体標識した１３Ｃ１５−デオキシニバレノール（１３Ｃ１５−ＤＯＮ）は、例えば、内部標準として使用でき得る。このような内部標準は、厳密に１５ｇ／モルだけ重い分子質量を有し、質量スペクトルにおけるその信号（図１）は、その結果、被検体の信号より厳密に１５ａｍｕ高く現れる。１３Ｃ−標識されたＤＯＮの他の化学的および物理的特性はすべて、被検体のものと同一であるので、このような内部標準は、被検体と同じフラグメンテーションを正確に示し、また、該物質のイオン化も同一であり、それゆえ、さらにイオン化収率も同一である。これは、フラグメントもしくは物質イオンの信号高さが内部標準および被検体の間で同じになり、内部標準の濃度は分析において既知であるので、被検体の濃度に関して、直接の結論を導くことができ、このことがこのような高度に標識されたデオキシニバレノールがほとんど理想的な内部標準を構成する理由である。
【００２４】
図１は、収集された質量スペクトルにおける１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ−ＤＯＮを示す。それぞれ２９５．２および３１０．２での１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ１５−ＤＯＮの分子ピークに加えて、図１はまた、Ｃ原子のすべてが標識されておらず、それゆえ、１つの同位体種（アイソトポマー）から成っていない化合物の分布を示す。天然デオキシニバレノールの場合、これは、１２Ｃおよび１３Ｃ間の自然分布に相当する１３Ｃ１−ＤＯＮである。
【実施例２】
【００２５】
高度に同位体標識した１３Ｃ−フモニシンの生成
１３Ｃで完全に標識したフモニシンを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２０１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２０ｍｇからなり、唯一の炭素源としてＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを用いて、１×１×１ｃｍのフォーム立方体に塗布された液体培地１０００ｍｌにＦｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅを接種し、２８℃、相対湿度７０％のインキュベータにおいてインキュベートする。３週間後、毒素含有物質を１：１のアセトニトリル：水を含有する溶媒混合物で抽出し、その後、抽出ステップならびに、イオン交換クロマトグラフィー、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび分取ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーステップによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【００２６】
このように、１０００ｍｌ処方当たり、８０から２４０ｍｇの１３Ｃ−フモニシンを得る（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【実施例３】
【００２７】
高度に同位体標識した［Ｕ−１３Ｃ１７］−３−アセチルデオキシニバレノールの生成
［Ｕ−１３Ｃ１７］−３−アセチルデオキシニバレノールを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として完全に同位体標識した［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコースを含み、珪藻土、すなわちＩｓｏｌｕｔｅ ＨＭ−Ｎに塗布した合成液体培地１０００ｍｌに、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを接種し、インキュベータ中２８℃で９日間インキュベートする。９日後に、毒素含有物質を収集し、アセトニトリル／水共沸混合物で抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィー、結晶化、Ｂｕｃｈｉ−ＭＰＬＣおよび再結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。１バッチから、高純度最終生産物約１５〜５０ｍｇを得ることができる。純度の試験は、Ｃ１８−キャピラリーカラムを使用してＬＣ−ＵＶ分析によって行う。
【００２８】
このように生成された同位体標識した３−アセチルデオキシニバレノールは、非標識の、または完全には標識されていないもしくは不完全に標識された３−アセチルデオキシニバレノールの分子質量よりも１７ｇ／モル重い分子質量を有する。不完全に標識された３−アセチルデオキシニバレノールは、Ｍ／ｚ＝３３８の分子質量を有し、一方完全に同位体標識された生成物は、３５５の分子質量を有する。図２は、純１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールの質量スペクトルを示し、これから、生成物が７５％標識され、生成物の同位体分布が明らかであることがわかる。この事例における生成物および不完全に標識されたアイソトポマーの分布は、出発物質の１３Ｃ６−グルコースの同位体純度に依存し、完全に純粋な１３Ｃ６−グルコースを使用する場合は、完全に標識された生成物へ明らかになおシフトできる。しかし、図２から、１３個未満の１３Ｃ−原子を有するアイソトポマーが事実上存在せず、１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールはまた、内部標準として完全に使用できることが疑いなく明らかである。
【実施例４】
【００２９】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１７］−１５−アセチルデオキシニバレノールの生成
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１７］−１５−アセチルデオキシニバレノールを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなる培地に、粗い粒子のフィロケイ酸塩担体上のＦｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを接種し、インキュベータ中２８℃でインキュベートする。９日後に、毒素含有物質を収穫し、酢酸エチルで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。結晶化に代えて、分取ＨＰＬＣを使用するさらなる精製ステップもまた適用され得る。
【００３０】
約３０から６０ｍｇの高純度の標的生成物を１発酵バッチから得ることができる。
【実施例５】
【００３１】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ニバレノールまたは［Ｕ−１３Ｃ１７］−フサレノン−Ｘの生成
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ニバレノールまたは［Ｕ−１３Ｃ１７］−フサレノン−Ｘを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコースを用いた液体培地および不活性フィロケイ酸塩にＦｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅを接種し、２８℃で５週間インキュベートする。この後、毒素含有物質をメタノールおよびメチレンクロライドで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。結晶化に代えて、分取ＨＰＬＣを使用するさらなる精製ステップもまた適用され得る。
【実施例６】
【００３２】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ２０］−オクラトキシンＡの生成
該標的物質を得るために、不活性フィロケイ酸塩担体上の真菌Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｅｒｔｅｎｓｉｓを、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として完全に１３Ｃ標識されたグルコースを含む合成液体培地を用いて発酵する。次いで、フラスコを２８℃、７０％大気湿度で６週間インキュベータ中でインキュベートし、その後トルエンで抽出する。標的物質を、前述の実施例におけるようなカラムクロマトグラフィーおよび再結晶化によって精製する。
【実施例７】
【００３３】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１８］−ゼアラレノンの生成
高度の同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１８］−ゼアラレノンを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源としてＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを用いて、粒状形態における多孔性焼成クレー、いわゆるセラミス（Ｓｅｒａｍｉｓ）またはレッカ（Ｌｅｃｃａ）上に塗布された液体培地１０００ｍｌに、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｅｍｉｔｅｃｔｒｕｍを接種し、２８℃、７０％相対湿度で、インキュベータ中でインキュベートする。３週間後に、毒素含有物質を純石油エーテルおよび石油エーテル／酢酸エチル（４／１および２／１）の混合物を用いて抽出し、その後、抽出ステップ、ならびに、イオン交換クロマトグラフィー、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび分取ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーステップによって、標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【実施例８】
【００３４】
高度に同位体標識された１５Ｎ５−ロクェフォルチンＣの生成
窒素同位体１５Ｎで完全に標識されたロクェフォルチンＣを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ１．０ｇ、Ｄ−グルコース１７．５ｇ、１５ＮＨ４１５ＮＯ３１．０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の窒素源として１５ＮＨ４１５ＮＯ３を用いて、粗い珪藻土（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）上に塗布した液体培地１０００ｍｌに、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅを接種し、１２℃、７０％の大気湿度で、インキュベータ中でインキュベートする。４８日後に、毒素含有物質を９：１のクロロホルム：メタノールからなる有機溶媒で抽出し、その後、液−液抽出、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、および分取ＨＰＬＣによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。１０００ｍｌの処方当たり、３００ｍｇの１５Ｎ５−ロクェフォルチンＣが得られる（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【実施例９】
【００３５】
高度に同位体標識された１５Ｎ２−３３Ｓ−ペニシリンの生成
窒素同位体１５Ｎおよび硫黄同位体３３Ｓで完全に標識されたペニシリンを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ、ＭｇＣｌ２０．２ｇ、Ｄ−グルコース２０．０ｇ、１５ＮＨ４１５ＮＯ３１．０ｇ、Ｎａ２３３ＳＯ４０．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）Ｃｌ２５ｍｇ、ＺｎＣｌ２５ｍｇからなり、唯一の窒素源として１５ＮＨ４１５ＮＯ３、および唯一の硫黄源としてＮａ２３３ＳＯ４を用いて、小さな発泡体の立方体上に塗布した液体培地１０００ｍｌに、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍを接種し、インキュベータにおいて２８℃、７０％大気湿度でインキュベートした。３０日後、毒素含有物質を酢酸エチルで抽出し、その後、液−液抽出、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、および分取ＨＰＬＣによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。処方１０００ｍｌ当たり、５００ｍｇの１５Ｎ２−３３Ｓ−ペニシリンが得られる（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】収集スペクトルにおける１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ−ＤＯＮ
【図２】純１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールの質量スペクトル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体合成培地において菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産するための方法、および菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、同位体標識された物質は、特に、高製品処理能力で効率的な分光分析を可能とする質量分析検出を備えた液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）の技術において重要性が増している。この技術は、分子質量に関していかなる制限を課すことなく多くの様々な潜在的被検体に対して使用することができるが、個々の物質の検出において、分解スペクトルおよび個々の分子ピークの両方を適宜特定しなければならないという問題が生じる可能性がある。信頼性のあるＬＣＭＳの利用および方法を確実にするために、いわゆる内部標準物質の使用がますます重要になってきた。内部標準は、標的被検体そのものに極めて似ている、すなわち、特に、同じ分子構造を有する可能性があるが、分子量が異なる物質である。それゆえ、標的被検体の同位体標識した分子、すなわち、分子内の１個または数個の原子がこれらの同位体に置き換えられている分子は、理想的な内部標準であることがわかった。現在、このような物質は、例えば、水素または炭素を対応するより重い同位体で置換することによる有機合成によって生成されている。
【０００３】
しかし、この文脈において、内部標準として使用する同位体標識した物質は、標的被検体からの明確な分離を可能とするためには少なくとも３の分子量の差を有すること、および可能ならば、できるだけ少ないアイソトポマーを含有する物質を使用することが望ましいことがＬＣＭＳ分析において明らかとなった。
【０００４】
同位体標識した植物または微生物の代謝産物を生産する方法は、各植物および／または微生物の生合成経路を介している。そうすることにおいて、培地には放射性標識した栄養物を補い、培地成分は、微生物もしくは植物培養の同化サイクルおよび代謝サイクルに特定の割合まで組み入れられて、同位体が代謝産物に取り込まれる。この方法では不完全な標識しか実現可能でなく、種々のアイソトポマーの混合物が通常形成され、このため、このような物質の使用に関して１つの標準だけでなく、アイソトポマーの広いスペクトルが適用され、それはそれでＬＣＭＳ分光分析における標的物質の選択的検出をまったくできなくするか、または非常な困難を伴ってのみ可能にさせるので、このような同位体標識した物質、すなわち同位体標識された植物代謝産物もしくは微生物代謝産物を内部標準として使用するのにほとんど適さないものとするという欠点を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、出発物質に含まれる炭素原子、窒素原子もしくは硫黄原子のすべて、またはほとんどすべてが、安定同位体によって置換され、その結果分光分析処理、特にＬＣＭＳにおいて容易に、信頼性を有して検出可能な、単一の同位体標識された最終生産物を提供する、菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産するための方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、分光分析プロセス、特にＬＣＭＳにおいて内部標準として安全に信頼性を有して使用することができる代謝産物を生産することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの目的を解決するために、本発明による方法は、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体によって置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類または細菌類を不活性担体に固定化することによって実施される仕方で、合成を行う。炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体で置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類もしくは細菌類を不活性担体に固定化することにより該合成を実現することによって、増殖による培地から得られる原子のすべて、または少なくとも９５％が、すなわち、炭素、窒素もしくは硫黄原子が、従来技術においてしばしば記載されたように、様々な数の同位体原子を有する異なるホモログの混合物ではなく、選択的で、同位体標識された産物の回収を可能にするために培地中に含まれる同位体標識された栄養物のさらに安定した同位体によって置換された、菌類および細菌類の同位体標識された代謝産物を生産することが可能となった。したがって、この生産方法によって、選択的に使用でき、任意の分析、特に代謝の研究において明確に、疑いなく検出することができる同位体標識された二次代謝産物を得ることが可能である。
【０００７】
さらなる展開によれば、本方法は、該液体合成培地において、糖もしくは糖アルコール、特にＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコース、１３Ｃ−スクロース、１３Ｃ−グリセロールおよび／または１３Ｃ−アセテートを炭素源として使用し、１５Ｎ−アミノ酸、１５Ｎ−硝酸塩、１５Ｎ−アンモニウム化合物または１５Ｎ−尿素を窒素源として使用し、３３Ｓもしくは３４Ｓ−硫酸塩、３３Ｓもしくは３４Ｓ−硫化物、３３Ｓもしくは３４Ｓ−アミノ酸を硫黄源として使用する仕方で行われる。菌類または細菌類の代謝産物を増加させる場合、該液体合成培地に含まれている完全に標識された炭素、窒素および／または硫黄源のために、菌類または細菌類は、それぞれ、菌類または細菌類の二次代謝産物がそれぞれの同位体で標識されるか、または完全ではないが、高度に、各同位体によって置換されることを確実にするように、それぞれ標識された同位体を、代謝産物中に強制的に取り込ませる。
【０００８】
菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物の収率を改善するために、さらなる展開による本方法は、該液体合成培地が、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−のイオンを有する無機塩類または、無機酸類および無機塩基類から選択される混合物をさらに含有する仕方で行われる。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−のイオンを有する塩または酸および塩基が該液体合成培地に含まれているため、炭素、水素、窒素および硫黄に加えて菌類または細菌類に場合によって存在する任意の外来イオンは、迅速な増殖の他に高収率を確保するために十分な量で安全に与えられることが保証される。
【０００９】
収率をさらに改善するために、大きな内部表面積を有する天然担体または合成担体、特にケイ酸塩、層状ケイ酸塩、ゼオライト、ベントナイト、焼成クレー、珪藻土、化学合成物などを該不活性担体として使用する。大きな内部表面積を有する不活性担体を使用することによって、大きな内部表面積を有する不活性担体を用いないで実施される従来の方法に対して、本発明による方法における収率を少なくとも５０％改善することが可能である。収率におけるこのような増加は、本方法をより経済的にするだけでなく、同位体標識された二次代謝産物が分析、またはさらに代謝研究において内部標準として好適な仕方で使用されることを可能とするための該同位体標識された二次代謝産物の所望の最終生産物の十分な量が生産されることを確実にする。
【００１０】
本発明によれば、特に、収率における最も大きな改善は、ケイ酸アルミニウム、例えば珪藻土、特にはｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ、ｉｓｏｌｕｔｅ ＨＭ−Ｎもしくはゼオライト、または層状ケイ酸塩、特には、雲母鉱物の群のバーミキュライトを該不活性担体として天然形態もしくは処理形態において使用することにおいて得られる。これらの物質に関して、表面張力、気孔率などの表面特性は、特に、担体表面上でとりわけ良好な回転速度を達成するために好適である。同様に、発泡材料、ポリアミド、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルなどから選択され得る不活性合成担体の使用によって、収率におけるそれ相応に大きな改善が可能とされ、それによって大きな内部表面積を有する天然担体の使用、または合成担体の使用により、生産される代謝産物に応じて同様に向上した収率がもたらされる。
【００１１】
高収率であると同時に、できる限り迅速な方法制御のために、本発明はさらに、生産を３℃から４５℃、特に１０℃から３５℃の範囲の温度で実現することに展開される。この文脈において、生産方法は常に一定温度で行われないことだけでなく、示された制限内の温度変化がまた、改善された収率や加速された反応速度、または高い代謝回転数をももたらし得ることが好ましいことが一部明らかになった。
【００１２】
できるだけ純粋な最終産物を得るために、本発明による方法は、同位体標識された二次代謝産物を、抽出および濃縮、例えば、固／液−液／液抽出、遠心分離、ろ過および蒸発のようなステップの組合せによって、該液体合成培地から回収する仕方で行われる。同位体標識された二次代謝産物の回収後、本発明によれば、クロマトグラフィー法、および特に、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーおよび／または分取高圧液体クロマトグラフィーが精製操作として好ましく使用される、さらなる精製操作にこれら産物を供することが有利であることがわかった。このような再処理方法および精製操作は、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の少なくとも９５％がそれぞれの安定同位体で置換され、このように、例えば質量分光分析検出を備えた液体クロマトグラフィー（ＬＣＭＳ）において、天然起源の、重い同位体から十分区別できるために、これらの天然被検体に比べて適当な質量の差を有する産物の回収を可能にさせ、およびそれゆえに、例えば、このような分析において安定した、明確に同定可能な内部標準の提供を可能にする、菌類および細菌類の同位体標識された二次代謝産物の回収を可能にさせる。
【００１３】
本発明は、安定同位体によって置換された、炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべて、特に少なくとも９５％を含む、菌類および細菌類の同位体標識された二次代謝産物を提供することをさらに目的とする。
【００１４】
本発明のさらなる展開によれば、菌類または細菌類のこのような同位体標識された二次代謝産物は、動物摂食試験における代謝研究、代謝研究、代謝サイクル、分解経路および／または分解期間ならびにインターカレーションの解明のための分析における内部標準として使用できる。述べられた使用目的のすべてにとって、個々の方法もしくは処理ステップを正確に再現することができるためには、試験スキームもしくは分解スキームにおいて、安定して明確に検出可能な標準、または、明確に検出でき追跡可能な物質を得たことが最も重要である。
【００１５】
さらなる展開によれば、マイコトキシン類、特にニバレノール、デオキシニバレノール、３−アセチル−デオキシニバレノール、１５−アセチルデオキシニバレノール、フサレノン−Ｘ、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ＤＡＳなどのトリコテセン、フモニシンＢ１、Ｂ２もしくはＢ３などのフモニシン、オクラトキシンＡ、Ｂ、ＣもしくはＤなどのオクラトキシン、ゼアラレノン、モニリホルミンまたはアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１もしくはＧ２などのアフラトキシンを、分析方法または分解経路などの代謝研究において代謝産物として使用する。マイコトキシン類は、動物疾患の病因学において重要性が増しており、できるだけ明確に区別でき、純粋な化学物質を使用することによって、それぞれの毒物学的獣医試験をその後に実施することができるために、このような物質の十分な量を工業的に生産することが必要である。マイコトキシンはヒトおよび動物に対する深刻な健康リスクを構成するので、特に多くの国が既にこのような物質の許容範囲に対するガイド値および制限値を設定してきて以来、これらの分析論は、地球規模で重要なテーマである。正確に検出でき、それゆえ、それぞれの毒素の量的分析を可能にする内部標準の使用によるこのようなマイコトキシンの検出および定量は、このような有害物質の検出において重要な進歩を構成している。
【００１６】
同様にまた、毒素の定量的検出または追跡、および特に、本発明のさらなる展開に合致するように、内毒素および外毒素、特に大腸菌種、サルモネラ種、クロストリジウム種、バチルス種もしくはスタフィロコッカス種の細菌毒素が、公衆衛生ならびに食品および半高級食品における有害物質の検出のために非常に重要である。また、抗生物質などの代謝産物の使用および、特に、テトラサイクリン、ストレプトマイシンもしくはアミノグリコシドなどのアクチノマイセテスから作られる抗生物質、バシトラシンもしくはポリミキシンなどのバチルス種から作られる抗生物質、ペニシリンもしくはグリセオフルビンなどのペニシリウムから作られる抗生物質、またはセファロスポリウムから作られるセファロスポリン類が、特に疾患の事象において、または食品および半高級食品におけるこのような物質の検出のために重要性が増しており、ここでまた、抗生物質のような代謝産物の定量的検出を可能にさせる物質が一般社会にとって極めて重要であることが、これらの物質にとってあてはまる。
【００１７】
さらなる展開によれば、１３Ｃ、１５Ｎ、または３３Ｓもしくは３４Ｓの標識度を有する純物質が代謝産物として使用され、それゆえ、一方で、非標識物質もしくは代謝産物からの明確な区別を可能とし、他方でまた、天然同位体からの区別を安全に確実にし、および最後に、分析および検出処理において正確に追跡可能である物質を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下において、高度に同位体標識された代謝産物の生産を説明する実施例により本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００１９】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−デオキシニバレノール（ＤＯＮ）の生成
完全に標識された１３Ｃ−ＤＯＮを生成するために、フサリウム菌類、すなわちＦｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを、不活性担体物質、すなわちバーミキュライトに接種し、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２０１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを唯一の炭素源として含む合成培地においてインキュベートする。約２８℃で５週間後に、毒素含有物質を酢酸エチルで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【００２０】
約４０ｍｌのインキュベーション培地を生成処方毎に用意する。この後、プールした毒素含有物質をさらに処理する。１０００ｍｌの処方またはバッチから、５から５０ｍｇ［７．５から１７．５ｍｇ］の完全に標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ＤＯＮが得られる。
【００２１】
精製された生成物を、以下の分析処理によって特徴付けした。
【００２２】
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ
１３Ｃ同位体部分を決定するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ Ｑトラップ
ＵＶ／ＶＩＳおよびＨＰＬＣ−ＤＡＤを使用する参照物質に対する純度および濃度の決定
濃度の調整
【００２３】
ＵＶ／ＶＩＳ、ＨＰＬＣ−ＤＡＤ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ Ａトラップを使用する品質管理
このように高度に同位体標識した１３Ｃ１５−デオキシニバレノール（１３Ｃ１５−ＤＯＮ）は、例えば、内部標準として使用でき得る。このような内部標準は、厳密に１５ｇ／モルだけ重い分子質量を有し、質量スペクトルにおけるその信号（図１）は、その結果、被検体の信号より厳密に１５ａｍｕ高く現れる。１３Ｃ−標識されたＤＯＮの他の化学的および物理的特性はすべて、被検体のものと同一であるので、このような内部標準は、被検体と同じフラグメンテーションを正確に示し、また、該物質のイオン化も同一であり、それゆえ、さらにイオン化収率も同一である。これは、フラグメントもしくは物質イオンの信号高さが内部標準および被検体の間で同じになり、内部標準の濃度は分析において既知であるので、被検体の濃度に関して、直接の結論を導くことができ、このことがこのような高度に標識されたデオキシニバレノールがほとんど理想的な内部標準を構成する理由である。
【００２４】
図１は、収集された質量スペクトルにおける１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ−ＤＯＮを示す。それぞれ２９５．２および３１０．２での１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ１５−ＤＯＮの分子ピークに加えて、図１はまた、Ｃ原子のすべてが標識されておらず、それゆえ、１つの同位体種（アイソトポマー）から成っていない化合物の分布を示す。天然デオキシニバレノールの場合、これは、１２Ｃおよび１３Ｃ間の自然分布に相当する１３Ｃ１−ＤＯＮである。
【実施例２】
【００２５】
高度に同位体標識した１３Ｃ−フモニシンの生成
１３Ｃで完全に標識したフモニシンを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２０１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２０２０ｍｇからなり、唯一の炭素源としてＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを用いて、１×１×１ｃｍのフォーム立方体に塗布された液体培地１０００ｍｌにＦｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅを接種し、２８℃、相対湿度７０％のインキュベータにおいてインキュベートする。３週間後、毒素含有物質を１：１のアセトニトリル：水を含有する溶媒混合物で抽出し、その後、抽出ステップならびに、イオン交換クロマトグラフィー、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび分取ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーステップによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【００２６】
このように、１０００ｍｌ処方当たり、８０から２４０ｍｇの１３Ｃ−フモニシンを得る（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【実施例３】
【００２７】
高度に同位体標識した［Ｕ−１３Ｃ１７］−３−アセチルデオキシニバレノールの生成
［Ｕ−１３Ｃ１７］−３−アセチルデオキシニバレノールを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として完全に同位体標識した［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコースを含み、珪藻土、すなわちＩｓｏｌｕｔｅ ＨＭ−Ｎに塗布した合成液体培地１０００ｍｌに、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを接種し、インキュベータ中２８℃で９日間インキュベートする。９日後に、毒素含有物質を収集し、アセトニトリル／水共沸混合物で抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィー、結晶化、Ｂｕｃｈｉ−ＭＰＬＣおよび再結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。１バッチから、高純度最終生産物約１５〜５０ｍｇを得ることができる。純度の試験は、Ｃ１８−キャピラリーカラムを使用してＬＣ−ＵＶ分析によって行う。
【００２８】
このように生成された同位体標識した３−アセチルデオキシニバレノールは、非標識の、または完全には標識されていないもしくは不完全に標識された３−アセチルデオキシニバレノールの分子質量よりも１７ｇ／モル重い分子質量を有する。不完全に標識された３−アセチルデオキシニバレノールは、Ｍ／ｚ＝３３８の分子質量を有し、一方完全に同位体標識された生成物は、３５５の分子質量を有する。図２は、純１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールの質量スペクトルを示し、これから、生成物が７５％標識され、生成物の同位体分布が明らかであることがわかる。この事例における生成物および不完全に標識されたアイソトポマーの分布は、出発物質の１３Ｃ６−グルコースの同位体純度に依存し、完全に純粋な１３Ｃ６−グルコースを使用する場合は、完全に標識された生成物へ明らかになおシフトできる。しかし、図２から、１３個未満の１３Ｃ−原子を有するアイソトポマーが事実上存在せず、１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールはまた、内部標準として完全に使用できることが疑いなく明らかである。
【実施例４】
【００２９】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１７］−１５−アセチルデオキシニバレノールの生成
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１７］−１５−アセチルデオキシニバレノールを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなる培地に、粗い粒子のフィロケイ酸塩担体上のＦｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍを接種し、インキュベータ中２８℃でインキュベートする。９日後に、毒素含有物質を収穫し、酢酸エチルで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。結晶化に代えて、分取ＨＰＬＣを使用するさらなる精製ステップもまた適用され得る。
【００３０】
約３０から６０ｍｇの高純度の標的生成物を１発酵バッチから得ることができる。
【実施例５】
【００３１】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ニバレノールまたは［Ｕ−１３Ｃ１７］−フサレノン−Ｘの生成
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１５］−ニバレノールまたは［Ｕ−１３Ｃ１７］−フサレノン−Ｘを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコースを用いた液体培地および不活性フィロケイ酸塩にＦｕｓａｒｉｕｍ ｎｉｖａｌｅを接種し、２８℃で５週間インキュベートする。この後、毒素含有物質をメタノールおよびメチレンクロライドで抽出し、その後、抽出、クロマトグラフィーおよび結晶化によって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。結晶化に代えて、分取ＨＰＬＣを使用するさらなる精製ステップもまた適用され得る。
【実施例６】
【００３２】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ２０］−オクラトキシンＡの生成
該標的物質を得るために、不活性フィロケイ酸塩担体上の真菌Ｐｅｔｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｅｒｔｅｎｓｉｓを、Ｋ２ＨＰＯ４０．５ｇ、ＮａＮＯ３２．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇまたはＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源として完全に１３Ｃ標識されたグルコースを含む合成液体培地を用いて発酵する。次いで、フラスコを２８℃、７０％大気湿度で６週間インキュベータ中でインキュベートし、その後トルエンで抽出する。標的物質を、前述の実施例におけるようなカラムクロマトグラフィーおよび再結晶化によって精製する。
【実施例７】
【００３３】
高度に同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１８］−ゼアラレノンの生成
高度の同位体標識された［Ｕ−１３Ｃ１８］−ゼアラレノンを生成するために、ＫＨ２ＰＯ４０．５ｇ、ＫＮＯ３０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ２．０ｇ、Ｄ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコース１７．５ｇ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇおよびＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の炭素源としてＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］グルコースを用いて、粒状形態における多孔性焼成クレー、いわゆるセラミス（Ｓｅｒａｍｉｓ）またはレッカ（Ｌｅｃｃａ）上に塗布された液体培地１０００ｍｌに、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｅｍｉｔｅｃｔｒｕｍを接種し、２８℃、７０％相対湿度で、インキュベータ中でインキュベートする。３週間後に、毒素含有物質を純石油エーテルおよび石油エーテル／酢酸エチル（４／１および２／１）の混合物を用いて抽出し、その後、抽出ステップ、ならびに、イオン交換クロマトグラフィー、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよび分取ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーステップによって、標準品質（純度＞９８％）まで精製する。
【実施例８】
【００３４】
高度に同位体標識された１５Ｎ５−ロクェフォルチンＣの生成
窒素同位体１５Ｎで完全に標識されたロクェフォルチンＣを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４０．８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．７ｇ、ＫＣｌ１．０ｇ、Ｄ−グルコース１７．５ｇ、１５ＮＨ４１５ＮＯ３１．０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ１５ｍｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２０ｍｇからなり、唯一の窒素源として１５ＮＨ４１５ＮＯ３を用いて、粗い珪藻土（ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ）上に塗布した液体培地１０００ｍｌに、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅを接種し、１２℃、７０％の大気湿度で、インキュベータ中でインキュベートする。４８日後に、毒素含有物質を９：１のクロロホルム：メタノールからなる有機溶媒で抽出し、その後、液−液抽出、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、および分取ＨＰＬＣによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。１０００ｍｌの処方当たり、３００ｍｇの１５Ｎ５−ロクェフォルチンＣが得られる（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【実施例９】
【００３５】
高度に同位体標識された１５Ｎ２−３３Ｓ−ペニシリンの生成
窒素同位体１５Ｎおよび硫黄同位体３３Ｓで完全に標識されたペニシリンを生成するために、Ｋ２ＨＰＯ４１．０ｇ、ＭｇＣｌ２０．２ｇ、Ｄ−グルコース２０．０ｇ、１５ＮＨ４１５ＮＯ３１．０ｇ、Ｎａ２３３ＳＯ４０．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４１．５ｇ、Ｆｅ（ＩＩ）Ｃｌ２５ｍｇ、ＺｎＣｌ２５ｍｇからなり、唯一の窒素源として１５ＮＨ４１５ＮＯ３、および唯一の硫黄源としてＮａ２３３ＳＯ４を用いて、小さな発泡体の立方体上に塗布した液体培地１０００ｍｌに、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎｏｔａｔｕｍを接種し、インキュベータにおいて２８℃、７０％大気湿度でインキュベートした。３０日後、毒素含有物質を酢酸エチルで抽出し、その後、液−液抽出、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー、および分取ＨＰＬＣによって標準品質（純度＞９８％）まで精製する。処方１０００ｍｌ当たり、５００ｍｇの１５Ｎ２−３３Ｓ−ペニシリンが得られる（ＨＰＬＣ−ＦＬＤ）。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】収集スペクトルにおける１２Ｃ−ＤＯＮおよび１３Ｃ−ＤＯＮ
【図２】純１３Ｃ−３−アセチル−デオキシニバレノールの質量スペクトル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体によって置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類または細菌類を不活性担体上に固定化することによって合成を実施することを特徴とする、液体合成培地において菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産する方法。
【請求項２】
液体合成培地において、多糖または糖アルコール、特にはＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコース、１３Ｃ−スクロース、１３Ｃ−グリセロールおよび／または１３Ｃ−アセテートを炭素源として使用し、１５Ｎ−アミノ酸、−硝酸塩、−アンモニウム化合物または１５Ｎ−尿素を窒素源として使用し、３３Ｓ−もしくは３４Ｓ−硫酸塩、−硫化物、または−アミノ酸を硫黄源として使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体合成培地が、イオンＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−を有する無機塩または酸および塩基から選択される混合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記不活性担体として、大きい内部表面積を有する天然または合成担体、特にケイ酸塩、層状ケイ酸塩、ゼオライト、ベントナイト、焼成クレー、珪藻土、化学合成物などを使用することを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記不活性担体として、珪酸アルミニウム、例えば、ゼオライトもしくは層状ケイ酸塩、特に、雲母鉱物の群のバーミキュライトを、天然もしくは処理形態で使用することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不活性合成担体として、発泡材料、ポリアミド、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルなどが使用されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
生産を、３から４５℃、特に１０から３５℃の範囲の温度で実現することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
同位体標識された二次代謝産物を、抽出および濃縮、例えば、固／液−液／液抽出、遠心分離、ろ過および蒸発のようなステップの組合せによって液体合成培地から回収することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製プロセスとして、クロマトグラフィー法、ならびに特に、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーおよび／または分取高圧液体クロマトグラフィーを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分析における内部標準の生産と、動物飼育試験における代謝研究と、代謝研究と、代謝サイクル、分解経路および／または分解期間、ならびにインターカレーションを明らかにすることのための、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって生産される、菌および細菌の同位体標識された二次代謝産物。
【請求項１１】
代謝産物として、マイコトキシン、特に、ニバレノール、デオキシニバレノール、３−アセチル−デオキシニバレノール、１５−アセチルデオキシニバレノール、フサレノン−Ｘ、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ＤＡＳなどのトリコテセン、フモニシンＢ１、Ｂ２もしくはＢ３などのフモニシン、オクラトキシンＡ、Ｂ、ＣもしくはＤなどのオクラトキシン、ゼアラレノン、モニリホルミン、またはアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１もしくはＧ２などのアフラトキシンを使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１２】
代謝産物として、内毒素類および外毒素類などの毒素、特に大腸菌種、サルモネラ種、クロストリジウム種、バチルス種、またはスタフィロコッカス種の細菌毒素を使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１３】
代謝産物として、抗生物質、および特に、テトラサイクリン、ストレプトマイシンもしくはアミノグリコシドのようなアクチノマイセテスから作られる抗生物質、バシトラシンもしくはポリミキシンのようなバチルス種から作られる抗生物質、ペニシリンもしくはグリセオフルビンのようなペニシリウムから作られる抗生物質、またはセファロスポリウムから作られるセファロスポリンを使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１４】
少なくとも９５％の、１３Ｃ、１５Ｎ、または３３Ｓもしくは３４Ｓを用いた標識度を有する純物質としての、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の代謝産物。
【請求項１】
炭素原子、窒素原子および／または硫黄原子の実質的にすべてが安定同位体によって置換された液体合成培地を添加しつつ、菌類または細菌類を不活性担体上に固定化することによって合成を実施することを特徴とする、液体合成培地において菌類または細菌類の同位体標識された二次代謝産物を生産する方法。
【請求項２】
液体合成培地において、多糖または糖アルコール、特にはＤ−［Ｕ−１３Ｃ６］−グルコース、１３Ｃ−スクロース、１３Ｃ−グリセロールおよび／または１３Ｃ−アセテートを炭素源として使用し、１５Ｎ−アミノ酸、−硝酸塩、−アンモニウム化合物または１５Ｎ−尿素を窒素源として使用し、３３Ｓ−もしくは３４Ｓ−硫酸塩、−硫化物、または−アミノ酸を硫黄源として使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
液体合成培地が、イオンＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｆｅ＋＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｃｕ＋＋、Ｂ＋＋＋、およびＣＯ３−−、ＳＯ４−−、ＰＯ４−−−、ＮＯ３−を有する無機塩または酸および塩基から選択される混合物をさらに含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記不活性担体として、大きい内部表面積を有する天然または合成担体、特にケイ酸塩、層状ケイ酸塩、ゼオライト、ベントナイト、焼成クレー、珪藻土、化学合成物などを使用することを特徴とする、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記不活性担体として、珪酸アルミニウム、例えば、ゼオライトもしくは層状ケイ酸塩、特に、雲母鉱物の群のバーミキュライトを、天然もしくは処理形態で使用することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不活性合成担体として、発泡材料、ポリアミド、シリコーン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエステルなどが使用されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
生産を、３から４５℃、特に１０から３５℃の範囲の温度で実現することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
同位体標識された二次代謝産物を、抽出および濃縮、例えば、固／液−液／液抽出、遠心分離、ろ過および蒸発のようなステップの組合せによって液体合成培地から回収することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製プロセスとして、クロマトグラフィー法、ならびに特に、カラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーおよび／または分取高圧液体クロマトグラフィーを使用することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
分析における内部標準の生産と、動物飼育試験における代謝研究と、代謝研究と、代謝サイクル、分解経路および／または分解期間、ならびにインターカレーションを明らかにすることのための、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって生産される、菌および細菌の同位体標識された二次代謝産物。
【請求項１１】
代謝産物として、マイコトキシン、特に、ニバレノール、デオキシニバレノール、３−アセチル−デオキシニバレノール、１５−アセチルデオキシニバレノール、フサレノン−Ｘ、Ｔ−２毒素、ＨＴ−２毒素、ＤＡＳなどのトリコテセン、フモニシンＢ１、Ｂ２もしくはＢ３などのフモニシン、オクラトキシンＡ、Ｂ、ＣもしくはＤなどのオクラトキシン、ゼアラレノン、モニリホルミン、またはアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１もしくはＧ２などのアフラトキシンを使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１２】
代謝産物として、内毒素類および外毒素類などの毒素、特に大腸菌種、サルモネラ種、クロストリジウム種、バチルス種、またはスタフィロコッカス種の細菌毒素を使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１３】
代謝産物として、抗生物質、および特に、テトラサイクリン、ストレプトマイシンもしくはアミノグリコシドのようなアクチノマイセテスから作られる抗生物質、バシトラシンもしくはポリミキシンのようなバチルス種から作られる抗生物質、ペニシリンもしくはグリセオフルビンのようなペニシリウムから作られる抗生物質、またはセファロスポリウムから作られるセファロスポリンを使用することを特徴とする、請求項１０に記載の代謝産物。
【請求項１４】
少なくとも９５％の、１３Ｃ、１５Ｎ、または３３Ｓもしくは３４Ｓを用いた標識度を有する純物質としての、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の代謝産物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００８−５３４０２７（Ｐ２００８−５３４０２７Ａ）
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５０７６３１（Ｐ２００８−５０７６３１）
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００６／０００１２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５５６３
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５００３０３６９６）エルベル・アクチエンゲゼルシヤフト (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月３１日（２００６．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００６／０００１２９
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１０５５６３
【国際公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【出願人】（５００３０３６９６）エルベル・アクチエンゲゼルシヤフト (6)
【Ｆターム（参考）】
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