高立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼおよびそれをコードする遺伝子
【課題】高立体選択性のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を単離し、また、その遺伝子を導入・高発現した組換え微生物を作製し、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の安価な一段階酵素合成法を提供する。
【解決手段】（１）特定の塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子：（２）該特定のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：（３）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：（４）該特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【解決手段】（１）特定の塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子：（２）該特定のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：（３）特定のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：（４）該特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用な光学活性Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳと略記する）、Ｌ−スレオ−３−シクロヘキシルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳと略記する）およびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成するのに有利な酵素を発現する遺伝子および従来知られていない高立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼを遺伝子工学的手法により提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した合成反応によって、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳおよびＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成に有用な高立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子およびその組換えベクターと形質転換体を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による合成反応により、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一種であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳは、体内で芳香族アミノ酸脱炭酸酵素により天然型のノルアドレナリンとなり、すくみ足や起立性低血圧に有効なノルアドレナリンの前駆物質として、年間６０億円以上の市場があるパーキンソン病の治療薬である。これらは現在、化学合成法により合成されているが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの化学合成については多段階の面倒な保護・脱保護を必要とし、また、合成物質は４種類の異性体からなり、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程や分割工程を必要とし、非常に高価な医薬品である。即ち、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ−体を除く。次に、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ酸部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシンなどの光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去しなければならないなど非常に複雑なプロセスである。
一方、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳも非天然型のＬ型アミノ酸で、医薬品や農薬等の中間体として有用な化合物であり、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成法と同様に、化学合成法として、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンを得た後、スレオ／エリスロ体の煩雑な相互分離処理を行わなければならない。又、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを用いる酵素的分割法が知られている（特許第３２４００１１号公報；特許文献６）。即ち、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンにＤ−スレオニンアルドラーゼを作用させ、Ｄ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンをグリシンとシクロヘキシルアルデヒドに分解し、さらに、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを作用させ、Ｌ−エリスロ−３−シクロヘキシルセリンを分解し、Ｌ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを得る方法である。しかし、この方法は反応の基質の濃度が限定される上、得られる生成物の単離が難しく、これも工業的製法とは言い難い。
【０００３】
一方、酵素による一段階合成法は化学合成と比べ、面倒な保護・脱保護を必要としないなどメリットは大きく、さらに安価な基質を利用することにより安価に合成することができる。酵素による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成に利用されている。酵素による一段階合成法でβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成できる酵素としてスレオニンアルドラーゼが知られている。スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．５）は、β−ヒドロキシアミノ酸を分解して、グリシンとアルデヒドを生成する反応を触媒することが知られている酵素である。この酵素は二つの不斉炭素原子を有するスレオニンを基質とした場合、α−位の立体特異性によって、Ｌ−タイプとＤ−タイプに区別される。さらに、β−位の立体特異性によりＬ−スレオニンにのみ作用するＬ−スレオニンアルドラーゼ、Ｌ−アロスレオニンにのみ作用するＬ−アロスレオニンアルドラーゼ、さらにＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの両方に作用する低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼに分類されている。Ｄ−タイプでも同様に分けられる（非特許文献１〜３）。
【０００４】
酵素による一段階合成法は、エシェリヒア属に属す微生物などにより得られるＬ−スレオニンアルドラーゼや、バチルス属に属す微生物により得られるフェニルセリンアルドラーゼに様々なアルデヒド誘導体とグリシンを作用させＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている。しかし、これら公知の微生物による一段階合成に利用されているＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体比率に関する立体選択性に関する記載がなく、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン誘導体の合成量は不明であったり（特許文献１〜５）、又、エシェリヒア属に属する微生物由来のＬ−スレオニンアルドラーゼを用いた場合のベンズアルデヒド誘導体とグリシンからＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は−５０〜４６％ｄ．ｅ．（非特許文献１）、シュードモナス属に属する微生物により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は５７．５〜１００％ｄ．ｅ．（非特許文献２）、アエロモナス属に属する微生物により得られるＬ−アロ−スレオニンアルドラーゼにベンズアルデヒドとグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリンを合成する場合の選択性は７３．２％ｄ．ｅ．（非特許文献３）であることが知られているが、その他の微生物での報告はなかった。又、その他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成例も報告されているが収量が少なく、効率的な合成法と言えるものではなかった（特許文献１、２）。
【０００５】
特に、発明者らが目的とするＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの酵素縮合反応での立体選択性を示した例は非特許文献２のみであるが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量は少ないという欠点を有している。尚、選択性を表わす指標、Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）は次の計算式により算出される。Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）＝｛（Ｌ−スレオ体−Ｌ−エリスロ体）÷（Ｌ−スレオ体＋Ｌ−エリスロ体）｝×１００
一方、光学活性３−シクロヘキシルセリンの酵素による一段階合成法は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを用いて、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンから、Ｄ−３−シクロへキシルセリンを合成する方法が知られているがその合成量は０．１ｍＭと極わずかで（特許文献７）ある。又、Ｌ−３−シクロへキシルセリンの酵素による一段階合成法の報告はなかった。その他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成量も１．０〜１０ｇ／Ｌ（特許文献１）、０．６〜４．４ｇ／Ｌ（特許文献２）と低く、満足できるものではなかった。
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【特許文献６】特許第３２４００１１号公報
【特許文献７】特許第３００６６１５号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リュー・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ．）他５名、アプリード・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的とする合成反応を触媒する高立体選択性のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を単離し、また、その遺伝子を導入・高発現した組換え微生物を創製し、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の安価な一段階酵素合成法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、今までそのような性能を有することが知られていなかったエンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）に属するＮＢＲＣ１００３８３（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門生物資源カタログ番号）細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳおよびＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの高立体選択合成に適うものであることを見出した。更に、上記Ｌ−スレオニンアルドラーゼ組換え大腸菌を用いてその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体合成検討を行った結果、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを反応させると、反応液に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が沈殿し、平衡反応が合成方向に進み、高濃度のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が沈殿蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ 下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
［２］ 下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
［３］ 前項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター、
［４］ 前項３に記載の組換えベクターを含む微生物、
［５］ 宿主が大腸菌である前項４に記載の微生物、
［６］ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物、
［７］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
［８］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、シクロヘキシルアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンの製造法、および
［９］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド、およびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法からなる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを原料として光学活性を有するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを、また、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを原料として光学活性を有するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを高い比率で合成できるＬ−スレオ高選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が提供される。そして、これらのＬ−スレオ高選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を保有する菌体もしくはその調製物を用いて、高選択的にＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳあるいはＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを合成することができる。更に炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを原料としてＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を高収量で合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解する反応を触媒する酵素である。また、この酵素は分解反応以外にもその逆反応としてグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの合成反応をも触媒する酵素である。この逆（合成）反応を利用して、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを、グリシンとシクロヘキシルアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンから対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成するのが本発明の目的である。従って、このＬ−スレオニンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の生産に有効に使用できると考えられる。
【００１１】
本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼとしては、例えば配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が好ましく挙げられる。また、本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼには、前記配列番号５において１若しくは複数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質なども含まれる。
【００１２】
本発明で用いられるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子としては、好ましくは、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）に属する微生物由来の遺伝子、さらに好ましくは、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）由来の遺伝子、とりわけ好ましくはエンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来の遺伝子が挙げられる。エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部に保存されており、誰でも入手可能である。
【００１３】
エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子としては、例えば配列番号４で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
【００１４】
また、前記配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば配列番号４に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳなどにより計算され得る。
【００１５】
ただし、本発明における遺伝子は、上記当該の遺伝子に限定されず、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするすべての遺伝子を含む。
【００１６】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１７】
本発明において「相補的な配列」とは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１８】
エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株からのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の取得およびその配列決定は以下の方法により行うことができる。
【００１９】
まず、エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株を、例えばグルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％からなる栄養培地（ｐＨ７．０）で培養し菌体（微生物）を得る。なお前記栄養培地は、前記の外、通常の微生物の培養に使用される培地であればいずれも好ましく用いることができる。
【００２０】
菌体エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株からの染色体ＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
次に、エンシファー属細菌と染色体ＤＮＡの相同性が高いメソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌やシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌のＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子のＮ末端およびＣ末端配列の共通塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。
【００２２】
設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株から抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとしては、例えば配列番号１〜３の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、公知技術に従って行なわれてよく、例えばデナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度増幅するのが好ましい。ＰＣＲによって得られた遺伝子は適当なクローニングベクターへ導入し、サブクローニングする。
クローニングベクターとしては、商業的に入手可能なクローニングベクター例えばｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ社製）、ｐＣＩＴＥ−４ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ社製）などを好ましく挙げることができる。
【００２３】
次いで、ＰＣＲで得られた遺伝子のクローニングベクターを、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えば、アンピシリンやクロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００２４】
得られたＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークェンサー、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（アプライドバイオシステム社製）などを使用して自動的に分析して塩基配列を決定することもできる。
上記のようにして、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号４に示す塩基配列を決定し得る。次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析し、配列番号５に示すＬ−スレオニンアルドラーゼの全アミノ酸配列を決定することができる。
【００２５】
次に、組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製は、全アミノ酸配列が決定された該酵素をコードする遺伝子を適当な発現用ベクターに挿入することにより行なうことができる。
発現用ベクターとしては、例えば細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ １６ｂ、ｐＥＴ ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＳＰＯＲＴ １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ ２．３、ｐＩＶＥＸ ２．４ｂ Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ ２．４ａなど）、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、酵母プラスミド（ｐＧ−１など）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
【００２６】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位を特定の制限酵素によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００２７】
例えば、配列番号１に示した酵素遺伝子のＮ末端配列の上流に、例えば制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を追加したプライマーと、配列番号２に示した酵素遺伝子のＣ末端配列の下流に例えば制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を追加したプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲ法によりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅させる。この増幅した断片を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現用ベクター、例えばｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）と連結させることにより本発明の遺伝子を含む組換えベクター、すなわちＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターを得ることができる。
【００２８】
次いで、この発現ベクターを、宿主に挿入し、宿主（菌株）を形質転換する。
宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株等）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス、枯草菌など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。
具体的には、例えば本発明の遺伝子を含む組換えベクターとエシェリヒア・コリＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう。）のコンピテントセルとを混合することにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００２９】
上記方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５等）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００３０】
上述のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地等で、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００３１】
形質転換された微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを含有する液、あるいは炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを含有する液（以下、反応液と略記する。）と接触させ、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他の対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一段階合成反応を行い生成蓄積せしめる。
すなわち、本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法において、形質転換された微生物またはその調製物を用いて、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、シクロヘキシルアルデヒド、あるいは炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドから一段階で収率よくＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を得ることができる。
【００３２】
形質転換された微生物は、培養液中に存在する状態や培養液から該微生物を分離・濃縮等して使用することもできる。また、微生物の調製物としては、例えばアクリルアミドやカラギーナン等の担体上に固定化した固定化菌体、あるいは、凍結乾燥やアセトン処理等による乾燥菌体等の菌体調製物等が挙げられる。また、前記調製物には形質転換体に生成蓄積した酵素を抽出し、好ましくは精製等して樹脂担体等に固定化した固定化酵素も含まれる。酵素の精製法は、菌体を超音波やガラスビーズで破砕した後、硫安沈殿、イオン交換およびゲルろ過カラムクロマトといった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００３３】
又、形質転換された微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段で変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とするＬ−スレオニンアルドラーゼ生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。
【００３４】
反応液の基礎となる溶液としては、形質転換された微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素の働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液等が好ましく挙げられる。
【００３５】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００３６】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００３７】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
【００３８】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００３９】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地等が挙げられる。
【００４０】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００４１】
反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、シクロヘキシルアルデヒド、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒド（例えば、１−ヘプタナール、１−オクタナール、１−ノナナール、１−デカナール、１−ウンデカナール、１−ドデカナール等）、あるいはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド（例えば、テレフタルアルデヒド酸、ｍ−ブロムベンズアルデヒド等）は、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常、反応液の約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。またその供給方法としては分割添加や連続的に添加する方法などで行うことが出来る。
【００４２】
反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％（ｗｔ）程度を反応系に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドあるいはシクロヘキシルアルデヒド等に対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドあるいはシクロヘキシルアルデヒド等と同様に反応液に添加できる。
【００４３】
反応液と微生物との接触は、例えば培養した形質転換微生物を遠心分離機やろ過等で集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンあるいはシクロヘキシルアルデヒド等とグリシンを含有する反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズ等で破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を反応液と接触させても良い。
反応液と微生物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。
また、反応液と微生物をフィルターなどにより分離し、微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００４４】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめるのが好ましい。反応時間としては、通常１時間〜４８時間の範囲が好ましい。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、反応液と微生物の反応は、微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００４５】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸などを添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
【００４６】
かくして反応せしめた反応液中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳが、又シクロヘキシルアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜９５％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンから対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が高収量（反応条件により一概にはいえないが、約１５ｇ／Ｌ以上、好ましくは約２０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは約２０〜４０ｇ／Ｌ程度である。）に生成し得る。
【００４７】
合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳあるいはＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの精製は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲルなどのクロマト分離、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化などを組み合わせて行なうことができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示し、Ｗはアデニンまたはチミンを、Ｋはグアニンまたはチミンを、Ｙはチミンまたはシトシンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００４９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生株のゲノムＤＮＡの取得
まず、斜面培養したエンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）ＮＢＲＣ１００３８３（以下、ＮＢＲＣ１００３８３という。）のコロニーから白金耳を用いて採取した菌体を、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を含む培地１０ｍＬ（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２日間振騰培養した。この培養液５ｍＬを１５ｍＬのファルコンチューブへ移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ｍＬに懸濁した。８０℃、５分間の熱処理により細胞を溶菌させた。その後、１５μＬのＲＮａｓｅ Ａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を良く混合の後、３７℃、３０分間静置処理を行なった。次に１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を激しく混合した後、１５，０００×ｇ、３分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを含む溶液を上清として回収した。更に、回収した溶液に３ｍＬのイソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加し混合の後、１５，０００×ｇ、１分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを白いペレットとして回収した。得られたゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５００μＬに溶解し、１μＬをアガロース電気泳動して確認後、４℃または−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００５０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の増幅
取得したＮＢＲＣ１００３８３のゲノムＤＮＡよりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ反応より増幅するためのプライマーを合成した。現在、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は様々な細菌のゲノム解析の結果、様々な微生物にてその推定塩基配列が公開されている。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの分析の結果から、ＮＢＲＣ１００３８３と高い相同性を示すＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉやＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属（例えばＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１等）のゲノム解析もすでに公開され、それぞれＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が存在することも示されている。そこで、この遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端部分の共通塩基配列を利用し表１のＤＮＡプライマーを合成しＰＣＲによる増幅反応を行った。
なお、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉおよびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１のゲノムは、それぞれＧｅｎｅＢａｎｋに登録番号ＢＡ００００１２およびＡＬ５９１６８８として登録されている。
【００５１】
【表１】
【００５２】
ＰＣＲには、タカラバイオ株式会社のＬＡ−ＰＣＲキットを用い、２種類のＨｉｇｈ ＧＣバッファーで反応を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：１μＬ上記ＮＢＲＣ１００３８３ゲノムＤＮＡ（３５０．５ｎｇ／μＬ；鋳型ＤＮＡ）、０．５μＬ（５Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）または０．５μＬ プライマー（配列番号３）２５ｐｍｏｌ／ｍＬに水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で２分の条件で３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロース電気泳動を行った。その結果、２種類の遺伝子が増幅された（約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐ）。
【実施例３】
【００５３】
ＰＣＲ増幅断片のクローン化。
ＰＣＲにより増幅された約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐの遺伝子をＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎｅ製）に挿入することによりクローン化させた。即ち、ＰＣＲにより増幅された約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐの遺伝子を含むＰＣＲ溶液４μＬに塩溶液（Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０６Ｍ ＭｇＣｌ２）１ μＬとＴＯＰＯクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを１μＬ加え、室温で５分間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約３μｇのプラスミドＤＮＡを精製した（ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１とｐＣＲ−ｅｎｓｉ２）。
【実施例４】
【００５４】
塩基配列の解析
上記にて精製したＮＢＲＣ１００３８３のクローンｐＣＲ−ｅｎｓｉ１とｐＣＲ−ｅｎｓｉ２より挿入断片の塩基配列の決定を行った。シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム社製）、 Ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステム社製）を用い、９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分、２５サイクルで行った。反応生成物のシークエンスは全自動シークエンサー ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。その結果、ｐＣＲ−ｅｎｓｉ２に含まれている挿入断片の配列はｐＣＲ−ｅｎｓｉ１に含まれている挿入断片の一部分であることが明らかになった。ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１に含まれている挿入断片は、配列番号４に示す塩基配列の１番目から１０４７番目に相当する配列になっていることが分かった。
【実施例５】
【００５５】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製。
上記の塩基配列解析により確認されたＰＣＲにより増幅されたＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼ（ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１）を大腸菌内で発現させるために、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）にサブクローニングした。即ち、ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を鋳型として、該塩基配列の全長である１０４７ｋｂｐのＮ末端の前にＫｐｎＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列：
５’−AAAGGTACCATGATCTTTTCCTCCGACAAC−３’（配列番号６）、
Ｃ末端の後にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列：
５’−AGAATTCAAGCTTTCAGCAGGCGGCGACGAAACGG−３’（配列番号７）
を合成し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
【００５６】
ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ（３８７．５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ（５Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号６）２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、０．５μＬ ３’プライマー（配列番号７）２５ｐｍｏｌ／ｍＬに水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で１分２０秒の条件で２９サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロース電気泳動を行った。その結果、制限酵素部位を含むおよそ１ｋｂ前後の１種類のＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子が増幅された（１０９７ｂｐ）。ＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液を精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）し、各々１０Ｕの制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より分離し、１０８１ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。
【００５７】
次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）を各１０Ｕの制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で一晩中切断反応を行った。反応後の溶液を０．７％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）により溶解した。
【００５８】
制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得た１０８１ｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子断片８μＬとＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの２μＬに５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を混合し、１６℃で５時間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）および０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より１０４７ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。さらに挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐｌｔｈ−ＥＡとした。
【実施例６】
【００５９】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現および活性測定
挿入断片が確認されたｐｌｔｈ−ＥＡを含む大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬの液体培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．１ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液の菌体濃度（ＯＤ６００）が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１０，０００×ｇ，５分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させ、大腸菌形質転換体を得た。（この形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０）
【００６０】
この形質転換体を用いたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応は以下の方法で行った。
反応液の組成は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノ−ル（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウムおよび０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であって、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５に調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた前記菌体全量を加え１５℃で５時間酵素反応を開始させ、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／メタノール／１，４−ジオキサン＝［５００：５０：１５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２２０ｎｍの吸光で分析した。その結果、ＮＢＲＣ１００３８３のゲノムＤＮＡよりクローニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼ組換え大腸菌は１．５ｇ／ＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性能を有していることがわかった。ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体に対するスレオ体過剰率が７３％（％ｄ．ｅ．）であり（図１）、従来の酵素に比べ立体選択性が非常に高く、今まで問題になっていたＬ−エリスロ−ＤＯＰＳがほとんど合成されていないことが分かった。尚、ここで、スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）は以下の計算式により求めた。
【数１】
【実施例７】
【００６１】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成
実施例６と同様の方法で１００ｍＬのＬＢ培地より得られた形質転換体をＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成反応に用いた。すなわち、反応液の組成は７．５ｇのグリシン、１ｇのシクロヘキシルアルデヒドおよび０．１２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え全量を５０ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた１００ｍＬのＬＢ培地より得られた前記菌体全量を加え１０℃で酵素反応を行い、３２時間後に１ｇのシクロヘキシルアルデヒドを添加し、さらに酵素反応を行わせ５３時間で反応を１／４倍量の２Ｎ塩酸を加えることにより停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８５：１５（Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は１．０ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２１０ｎｍの吸光で分析した。その結果、３９ｇ／Ｌ（２０８ｍＭ）のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳが生成していることがわかった。ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体に対するスレオ体過剰率が９５％（％ｄ．ｅ．）であり、立体選択性が非常に高く、しかも高濃度のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳ合成されていることが分かった。
【実施例８】
【００６２】
２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の合成
反応液の組成は５０ｇのグリシン、１０ｇの１−ヘプタナールおよび１．２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に添加し全量を５００ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた１Ｌの培養液から集めた菌体全量を加え、１０℃で１５時間合成反応を行なった。合成産物である２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の合成量は、実施例７で、移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８０：２０（Ｖ／Ｖ）］に変えた以外は同様の方法で測定した。その結果、２９ｇ／Ｌの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸を合成していることがわかった。
【実施例９】
【００６３】
２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の分離
上記実施例８で得られた反応液５００ｍＬをヌッチェでろ過し、更に１００ｍＬの水で固形分を洗浄した。２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸は固形分として回収した。固形分を８００ｍＬの２Ｎ塩酸で溶解し、１５ｇのハイフロスーパーセルでプレコートしたヌッチェでろ過し、菌体を含む不溶物を除去した。更に、２Ｎ塩酸５０ｍＬで洗浄し、８５０ｍＬの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸を含む濾液を得た。濾液をスターラーで攪拌しながら２７％水酸化ナトリウム溶液２３０ｍＬを滴下し、ｐＨ６．３に中和した。溶解していた２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸は、中和することにより沈殿させることができる。４℃に冷却後３０分静置した後、ろ過を行い沈殿を回収した。沈殿を５０ｍＬの水で２回、１０ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られた沈殿を５０℃に加熱しながら真空乾燥を行った。７．９２ｇの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の結晶が得られた。収率は５４．８％であった。
【実施例１０】
【００６４】
２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の合成と分離
上記実施例８でアルデヒドを１−デカナールに代えて、５℃、３３時間合成反応を行った。合成産物である２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の分析は、実施例７で移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［７５：２５（Ｖ／Ｖ）］に代えた以外は同様の方法で行った。その結果、２５ｇ／Ｌの２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸が合成していることがわかった。この反応液から、実施例９記載の方法と同様の方法により、２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の結晶１１．５ｇを得た。収率は９０％であった。
【実施例１１】
【００６５】
ｐ−カルボキシフェニル−Ｌ−セリンの合成
反応液の組成は３．７５ｇのグリシン、０．５ｇのテレフタルアルデヒド酸および０．０６２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に添加し全量を２５ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた前記５０ｍＬの培養液から集めた菌体全量を加え１０℃で２２時間合成反応を行った。合成産物であるｐ−カルボキシフェニル−Ｌ−セリンの合成量は実施例６と同様のＨＰＬＣ法で測定した。その結果、３０ｇ／Ｌのｐ−カルボキシフェニルセリンが合成されていることがわかった。
【実施例１２】
【００６６】
ｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンの合成
実施例１１と同様の方法でアルデヒドをｍ−ブロムベンズアルデヒドに代えて０．６２５ｇを添加し、１０℃、２４時間酵素反応を行った。合成産物であるｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンの分析は、実施例７で移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８０：２０（Ｖ／Ｖ）］、移動相流速を０．７５ｍＬ／分、検出はＵＶ＝２２０ｎｍに代えた方法で行った。その結果、３４ｇ／Ｌのｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンを合成していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
医薬品や医薬品・農薬中間体として有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造を煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼのスレオ／エリスロに対する立体選択性を示すＨＰＬＣの図である。図中（１）はエリスロ体を、（２）はスレオ体を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業上有用な光学活性Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳと略記する）、Ｌ−スレオ−３−シクロヘキシルセリン（以下、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳと略記する）およびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成するのに有利な酵素を発現する遺伝子および従来知られていない高立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼを遺伝子工学的手法により提供するものであり、さらに、この遺伝子を導入した組換え微生物を利用した合成反応によって、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法を提供するものである。より具体的には、本発明は、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳおよびＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成に有用な高立体選択性を有するＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子およびその組換えベクターと形質転換体を提供し、この遺伝子を導入した組換え微生物による合成反応により、産業上有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一種であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳは、体内で芳香族アミノ酸脱炭酸酵素により天然型のノルアドレナリンとなり、すくみ足や起立性低血圧に有効なノルアドレナリンの前駆物質として、年間６０億円以上の市場があるパーキンソン病の治療薬である。これらは現在、化学合成法により合成されているが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの化学合成については多段階の面倒な保護・脱保護を必要とし、また、合成物質は４種類の異性体からなり、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程や分割工程を必要とし、非常に高価な医薬品である。即ち、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、エリスロ−体を除く。次に、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ酸部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシンなどの光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去しなければならないなど非常に複雑なプロセスである。
一方、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳも非天然型のＬ型アミノ酸で、医薬品や農薬等の中間体として有用な化合物であり、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成法と同様に、化学合成法として、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを強アルカリ存在下で縮合させ、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンを得た後、スレオ／エリスロ体の煩雑な相互分離処理を行わなければならない。又、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを用いる酵素的分割法が知られている（特許第３２４００１１号公報；特許文献６）。即ち、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンにＤ−スレオニンアルドラーゼを作用させ、Ｄ−スレオ／エリスロ−３−シクロヘキシルセリンをグリシンとシクロヘキシルアルデヒドに分解し、さらに、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを作用させ、Ｌ−エリスロ−３−シクロヘキシルセリンを分解し、Ｌ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを得る方法である。しかし、この方法は反応の基質の濃度が限定される上、得られる生成物の単離が難しく、これも工業的製法とは言い難い。
【０００３】
一方、酵素による一段階合成法は化学合成と比べ、面倒な保護・脱保護を必要としないなどメリットは大きく、さらに安価な基質を利用することにより安価に合成することができる。酵素による一段階合成法は最も簡単かつ効率的で、近年最も注目され、様々なβ−ヒドロキシアミノ酸の一段階合成に利用されている。酵素による一段階合成法でβ−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成できる酵素としてスレオニンアルドラーゼが知られている。スレオニンアルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．５）は、β−ヒドロキシアミノ酸を分解して、グリシンとアルデヒドを生成する反応を触媒することが知られている酵素である。この酵素は二つの不斉炭素原子を有するスレオニンを基質とした場合、α−位の立体特異性によって、Ｌ−タイプとＤ−タイプに区別される。さらに、β−位の立体特異性によりＬ−スレオニンにのみ作用するＬ−スレオニンアルドラーゼ、Ｌ−アロスレオニンにのみ作用するＬ−アロスレオニンアルドラーゼ、さらにＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの両方に作用する低立体選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼに分類されている。Ｄ−タイプでも同様に分けられる（非特許文献１〜３）。
【０００４】
酵素による一段階合成法は、エシェリヒア属に属す微生物などにより得られるＬ−スレオニンアルドラーゼや、バチルス属に属す微生物により得られるフェニルセリンアルドラーゼに様々なアルデヒド誘導体とグリシンを作用させＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている。しかし、これら公知の微生物による一段階合成に利用されているＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体比率に関する立体選択性に関する記載がなく、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン誘導体の合成量は不明であったり（特許文献１〜５）、又、エシェリヒア属に属する微生物由来のＬ−スレオニンアルドラーゼを用いた場合のベンズアルデヒド誘導体とグリシンからＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は−５０〜４６％ｄ．ｅ．（非特許文献１）、シュードモナス属に属する微生物により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は５７．５〜１００％ｄ．ｅ．（非特許文献２）、アエロモナス属に属する微生物により得られるＬ−アロ−スレオニンアルドラーゼにベンズアルデヒドとグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリンを合成する場合の選択性は７３．２％ｄ．ｅ．（非特許文献３）であることが知られているが、その他の微生物での報告はなかった。又、その他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成例も報告されているが収量が少なく、効率的な合成法と言えるものではなかった（特許文献１、２）。
【０００５】
特に、発明者らが目的とするＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの酵素縮合反応での立体選択性を示した例は非特許文献２のみであるが、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量は少ないという欠点を有している。尚、選択性を表わす指標、Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）は次の計算式により算出される。Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）＝｛（Ｌ−スレオ体−Ｌ−エリスロ体）÷（Ｌ−スレオ体＋Ｌ−エリスロ体）｝×１００
一方、光学活性３−シクロヘキシルセリンの酵素による一段階合成法は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを用いて、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンから、Ｄ−３−シクロへキシルセリンを合成する方法が知られているがその合成量は０．１ｍＭと極わずかで（特許文献７）ある。又、Ｌ−３−シクロへキシルセリンの酵素による一段階合成法の報告はなかった。その他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の合成量も１．０〜１０ｇ／Ｌ（特許文献１）、０．６〜４．４ｇ／Ｌ（特許文献２）と低く、満足できるものではなかった。
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【特許文献６】特許第３２４００１１号公報
【特許文献７】特許第３００６６１５号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リュー・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ．）他５名、アプリード・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的とする合成反応を触媒する高立体選択性のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を単離し、また、その遺伝子を導入・高発現した組換え微生物を創製し、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳおよびその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の安価な一段階酵素合成法を提供することが本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成に関与する遺伝子を取得するべく鋭意検討を行った。その結果、今までそのような性能を有することが知られていなかったエンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）に属するＮＢＲＣ１００３８３（独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門生物資源カタログ番号）細菌から取得したＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳおよびＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの高立体選択合成に適うものであることを見出した。更に、上記Ｌ−スレオニンアルドラーゼ組換え大腸菌を用いてその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体合成検討を行った結果、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを反応させると、反応液に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が沈殿し、平衡反応が合成方向に進み、高濃度のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が沈殿蓄積することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、
［１］ 下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
［２］ 下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質：
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質、
［３］ 前項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター、
［４］ 前項３に記載の組換えベクターを含む微生物、
［５］ 宿主が大腸菌である前項４に記載の微生物、
［６］ 受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物、
［７］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
［８］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、シクロヘキシルアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンの製造法、および
［９］ 前項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド、およびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法からなる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを原料として光学活性を有するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを、また、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを原料として光学活性を有するＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを高い比率で合成できるＬ−スレオ高選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が提供される。そして、これらのＬ−スレオ高選択性Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を保有する菌体もしくはその調製物を用いて、高選択的にＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳあるいはＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを合成することができる。更に炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを原料としてＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を高収量で合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンをグリシンとアセトアルデヒドに分解する反応を触媒する酵素である。また、この酵素は分解反応以外にもその逆反応としてグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンとＬ−アロスレオニンの合成反応をも触媒する酵素である。この逆（合成）反応を利用して、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳを、グリシンとシクロヘキシルアルデヒドからＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳを、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンから対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を合成するのが本発明の目的である。従って、このＬ−スレオニンアルドラーゼが細胞内で著量蓄積できれば、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の生産に有効に使用できると考えられる。
【００１１】
本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼとしては、例えば配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が好ましく挙げられる。また、本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼには、前記配列番号５において１若しくは複数個（約２〜２０個、好ましくは約２〜１０個程度）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質なども含まれる。
【００１２】
本発明で用いられるＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子としては、好ましくは、エンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）に属する微生物由来の遺伝子、さらに好ましくは、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）由来の遺伝子、とりわけ好ましくはエンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来の遺伝子が挙げられる。エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部に保存されており、誰でも入手可能である。
【００１３】
エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを含む遺伝子としては、例えば配列番号４で表される塩基配列のＤＮＡを含む遺伝子を挙げることができる。
【００１４】
また、前記配列番号４で示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子も、本発明に用いられる遺伝子である。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば配列番号４に示す塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法またはプラーク・ハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。なお、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、例えば相同性が高いＤＮＡ同士、少なくとも配列番号４で示される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）、温度約６５℃程度でのハイブリダイズ条件をいう。なお、相同性は塩基配列解析ソフト、例えばＥＭＢＯＳＳなどにより計算され得る。
【００１５】
ただし、本発明における遺伝子は、上記当該の遺伝子に限定されず、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含むＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするすべての遺伝子を含む。
【００１６】
また、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡおよびｃＤＮＡも含むものとする。したがって、本発明の遺伝子には、これらのＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの全てが含まれる。
【００１７】
本発明において「相補的な配列」とは、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする塩基配列に対して塩基対合則（アデニン／チミン、シトシン／グアニン）に従って形成される塩基配列をいう。
【００１８】
エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株からのＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の取得およびその配列決定は以下の方法により行うことができる。
【００１９】
まず、エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株を、例えばグルコース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％からなる栄養培地（ｐＨ７．０）で培養し菌体（微生物）を得る。なお前記栄養培地は、前記の外、通常の微生物の培養に使用される培地であればいずれも好ましく用いることができる。
【００２０】
菌体エンシフアー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株からの染色体ＤＮＡの抽出は公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行なうことができる。市販のＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＰｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ社製）、ＧＦＸ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ＭａｇＰｒｅｐ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
次に、エンシファー属細菌と染色体ＤＮＡの相同性が高いメソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌やシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌のＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子のＮ末端およびＣ末端配列の共通塩基配列をもとにオリゴヌクレオチドを設計する。
【００２２】
設計したオリゴヌクレオチドをプライマーとして、エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株から抽出したＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、エンシファー・アルボリスＮＢＲＣ１００３８３株由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを得る。このようなプライマーとしては、例えば配列番号１〜３の塩基配列で示されるプライマーが挙げられる。ＰＣＲ反応は公知のＰＣＲ増幅装置、例えばサーマルサイクラーなどを利用し得る。ＰＣＲのサイクルは、公知技術に従って行なわれてよく、例えばデナチュレーション→アニーリング→エクステンションを１サイクルとして、約１０〜１００サイクル、好ましくは約２０〜５０サイクル程度増幅するのが好ましい。ＰＣＲによって得られた遺伝子は適当なクローニングベクターへ導入し、サブクローニングする。
クローニングベクターとしては、商業的に入手可能なクローニングベクター例えばｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ社製）、ｐＣＩＴＥ−４ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅ社製）などを好ましく挙げることができる。
【００２３】
次いで、ＰＣＲで得られた遺伝子のクローニングベクターを、例えばエシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株などに導入し、該菌株を形質転換する。この形質転換された菌株を適当な抗生物質（例えば、アンピシリンやクロラムフェニコール等）を含む培地で培養し、培養物から菌体を回収する。回収された菌体からプラスミドＤＮＡを抽出する。プラスミドＤＮＡの抽出は、公知の方法で行なうことができ、また市販のＤＮＡ抽出キットを用いてプラスミドＤＮＡを簡便に抽出できる。市販のプラスミドＤＮＡ抽出キットとしては、例えばＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）などが挙げられる。この抽出されたプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定することにより、本発明のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする全ＤＮＡを決定することができる。
【００２４】
得られたＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えばジデオキシヌクレオチド酵素法などにより決定することができる。また、キャピラリー電気泳動システムを用い、検出には多色蛍光技術を使用して塩基配列を決定することもできる。また、ＤＮＡシークェンサー、例えばＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（アプライドバイオシステム社製）などを使用して自動的に分析して塩基配列を決定することもできる。
上記のようにして、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を決定し、配列番号４に示す塩基配列を決定し得る。次いで該塩基配列をアミノ酸配列に翻訳して解析し、配列番号５に示すＬ−スレオニンアルドラーゼの全アミノ酸配列を決定することができる。
【００２５】
次に、組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製は、全アミノ酸配列が決定された該酵素をコードする遺伝子を適当な発現用ベクターに挿入することにより行なうことができる。
発現用ベクターとしては、例えば細菌プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ １６ｂ、ｐＥＴ ３２ａ（＋）、ｐＣＩＴＥ ４ａ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＭＡＬ−ｃ２、ｐＢｒｉｄｇｅ Ｖｅｃｔｏ、ｐＫＦ１８ｋ ＤＮＡ、ｐＫＦ１９ｋ ＤＮＡ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＳＰＯＲＴ １、Ｃｈａｒｍｏｍｉｄ ９−３６ ＤＮＡ、ｐＥＵ−ＤＦＲ、ｐＩＶＥＸ ２．３−ＭＣＳ、ｐＩＶＥＸ ２．４ｃ、ｐＩＶＥＸ ２．３、ｐＩＶＥＸ ２．４ｂ Ｎｄｅ、ｐＩＶＥＸ ２．４ａなど）、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、酵母プラスミド（ｐＧ−１など）、哺乳類細胞用のベクターとしてのバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどのウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０とその誘導体などが挙げられ、宿主において複製可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。
【００２６】
ベクターは例えば複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルなどを含んでいてもよい。ベクターは、種々の制限酵素部位をその内部にもつポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限酵素部位を含んでいることが望ましい。制限酵素部位としては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、ＫｐｎＩサイトまたはＨｉｎｄＩＩＩサイトなどが挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩまたはＨｉｎｄＩＩＩなどで切断され得る。
ベクターへの遺伝子導入は、公知の手段で行なうことができる。具体的には、ベクター中の特定の制限酵素部位を特定の制限酵素によって切断し、その切断部位に本発明の遺伝子を挿入するのが好ましい。このようにして、本発明の遺伝子を含む組換えベクターを調製できる。
【００２７】
例えば、配列番号１に示した酵素遺伝子のＮ末端配列の上流に、例えば制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を追加したプライマーと、配列番号２に示した酵素遺伝子のＣ末端配列の下流に例えば制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を追加したプライマーを設計し、これを用いてＰＣＲ法によりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡを増幅させる。この増幅した断片を制限酵素ＫｐｎＩと制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで処理し、同じく両制限酵素で処理した発現用ベクター、例えばｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）と連結させることにより本発明の遺伝子を含む組換えベクター、すなわちＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターを得ることができる。
【００２８】
次いで、この発現ベクターを、宿主に挿入し、宿主（菌株）を形質転換する。
宿主としては、例えば細菌、例えば大腸菌（例えば、エシェリヒア・コリＪＭ１０９菌株等）、コリネバクテリウム属菌、バチルス属菌、ストレプトミセス、枯草菌など；真菌細胞、例えばアスペルギルス属菌株など；酵母細胞、例えばパン酵母、メタノール資化性酵母など；昆虫細胞、例えばドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９など；ヒト培養細胞を含む哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、３Ｔ３、Ｃ１２７など；あるいはこれらのコンピテントセルなどが挙げられ、好ましくは大腸菌のコンピテントセルである。
形質転換は、例えば塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。
具体的には、例えば本発明の遺伝子を含む組換えベクターとエシェリヒア・コリＪＭ１０９（以下、大腸菌ＪＭ１０９ともいう。）のコンピテントセルとを混合することにより、形質転換された微生物を得ることができる。
【００２９】
上記方法は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５等）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００３０】
上述のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子を含む組換えベクターにて形質転換された微生物（以下、単に形質転換された微生物または形質転換微生物という。）は下記する微生物培養培地等で、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のｐＨ約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００３１】
形質転換された微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液、シクロヘキシルアルデヒドとグリシンを含有する液、あるいは炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンを含有する液（以下、反応液と略記する。）と接触させ、目的のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他の対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の一段階合成反応を行い生成蓄積せしめる。
すなわち、本発明のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造方法において、形質転換された微生物またはその調製物を用いて、グリシンと３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、シクロヘキシルアルデヒド、あるいは炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドから一段階で収率よくＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を得ることができる。
【００３２】
形質転換された微生物は、培養液中に存在する状態や培養液から該微生物を分離・濃縮等して使用することもできる。また、微生物の調製物としては、例えばアクリルアミドやカラギーナン等の担体上に固定化した固定化菌体、あるいは、凍結乾燥やアセトン処理等による乾燥菌体等の菌体調製物等が挙げられる。また、前記調製物には形質転換体に生成蓄積した酵素を抽出し、好ましくは精製等して樹脂担体等に固定化した固定化酵素も含まれる。酵素の精製法は、菌体を超音波やガラスビーズで破砕した後、硫安沈殿、イオン交換およびゲルろ過カラムクロマトといった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００３３】
又、形質転換された微生物は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段で変異しうるが、このように得られるどのような変異株であっても本発明の対象とするＬ−スレオニンアルドラーゼ生産能を有するかぎり、本発明の形質転換された微生物として使用することができる。
【００３４】
反応液の基礎となる溶液としては、形質転換された微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素の働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液等が好ましく挙げられる。
【００３５】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００３６】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００３７】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
【００３８】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００３９】
好ましい微生物培養培地としては、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地）、ＮＺＹＭ培地、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ培地、２ｘＹＴ培地、ＡＨＣ培地、χ１７７６培地、Ｍ９培地、ＹＰＤ培地、ＳＤ培地、ＹＰＡＤ培地またはＳｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地等が挙げられる。
【００４０】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００４１】
反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、シクロヘキシルアルデヒド、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒド（例えば、１−ヘプタナール、１−オクタナール、１−ノナナール、１−デカナール、１−ウンデカナール、１−ドデカナール等）、あるいはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド（例えば、テレフタルアルデヒド酸、ｍ−ブロムベンズアルデヒド等）は、Ｌ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常、反応液の約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。またその供給方法としては分割添加や連続的に添加する方法などで行うことが出来る。
【００４２】
反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％（ｗｔ）程度を反応系に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドあるいはシクロヘキシルアルデヒド等に対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドあるいはシクロヘキシルアルデヒド等と同様に反応液に添加できる。
【００４３】
反応液と微生物との接触は、例えば培養した形質転換微生物を遠心分離機やろ過等で集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンあるいはシクロヘキシルアルデヒド等とグリシンを含有する反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた形質転換微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズ等で破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を反応液と接触させても良い。
反応液と微生物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。
また、反応液と微生物をフィルターなどにより分離し、微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００４４】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめるのが好ましい。反応時間としては、通常１時間〜４８時間の範囲が好ましい。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、反応液と微生物の反応は、微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００４５】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸などを添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
【００４６】
かくして反応せしめた反応液中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳが、又シクロヘキシルアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜９５％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒドとグリシンから対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体が高収量（反応条件により一概にはいえないが、約１５ｇ／Ｌ以上、好ましくは約２０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは約２０〜４０ｇ／Ｌ程度である。）に生成し得る。
【００４７】
合成されたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳあるいはＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの精製は、公知の方法、例えばイオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲルなどのクロマト分離、酢酸エチルやトルエンなどの有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化などを組み合わせて行なうことができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、本発明において配列中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示し、Ｗはアデニンまたはチミンを、Ｋはグアニンまたはチミンを、Ｙはチミンまたはシトシンを示す。本明細書において％は特に断らない限り質量％を意味する。
【実施例１】
【００４９】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼ産生株のゲノムＤＮＡの取得
まず、斜面培養したエンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）ＮＢＲＣ１００３８３（以下、ＮＢＲＣ１００３８３という。）のコロニーから白金耳を用いて採取した菌体を、ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％および硫酸マグネシウム０．１％を含む培地１０ｍＬ（ｐＨ７．０）に植菌し、３０℃、２日間振騰培養した。この培養液５ｍＬを１５ｍＬのファルコンチューブへ移し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、得られたペレットをキットに添付のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ３ｍＬに懸濁した。８０℃、５分間の熱処理により細胞を溶菌させた。その後、１５μＬのＲＮａｓｅ Ａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を良く混合の後、３７℃、３０分間静置処理を行なった。次に１ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、溶液を激しく混合した後、１５，０００×ｇ、３分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを含む溶液を上清として回収した。更に、回収した溶液に３ｍＬのイソプロパノール（Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加し混合の後、１５，０００×ｇ、１分間の遠心分離によりゲノムＤＮＡを白いペレットとして回収した。得られたゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５００μＬに溶解し、１μＬをアガロース電気泳動して確認後、４℃または−２０℃で保存した。
【実施例２】
【００５０】
Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の増幅
取得したＮＢＲＣ１００３８３のゲノムＤＮＡよりＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子をＰＣＲ反応より増幅するためのプライマーを合成した。現在、Ｌ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は様々な細菌のゲノム解析の結果、様々な微生物にてその推定塩基配列が公開されている。また、１６Ｓ ｒＤＮＡの分析の結果から、ＮＢＲＣ１００３８３と高い相同性を示すＭｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉやＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属（例えばＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１等）のゲノム解析もすでに公開され、それぞれＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子が存在することも示されている。そこで、この遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮ末端およびＣ末端部分の共通塩基配列を利用し表１のＤＮＡプライマーを合成しＰＣＲによる増幅反応を行った。
なお、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉおよびＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ １０２１のゲノムは、それぞれＧｅｎｅＢａｎｋに登録番号ＢＡ００００１２およびＡＬ５９１６８８として登録されている。
【００５１】
【表１】
【００５２】
ＰＣＲには、タカラバイオ株式会社のＬＡ−ＰＣＲキットを用い、２種類のＨｉｇｈ ＧＣバッファーで反応を行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
ＰＣＲ条件：１μＬ上記ＮＢＲＣ１００３８３ゲノムＤＮＡ（３５０．５ｎｇ／μＬ；鋳型ＤＮＡ）、０．５μＬ（５Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号１）２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、０．５μＬ ３’プライマー（配列番号２）または０．５μＬ プライマー（配列番号３）２５ｐｍｏｌ／ｍＬに水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で２分の条件で３０サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロース電気泳動を行った。その結果、２種類の遺伝子が増幅された（約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐ）。
【実施例３】
【００５３】
ＰＣＲ増幅断片のクローン化。
ＰＣＲにより増幅された約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐの遺伝子をＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｎｅ製）に挿入することによりクローン化させた。即ち、ＰＣＲにより増幅された約１ｋｂｐと約０．８ｋｂｐの遺伝子を含むＰＣＲ溶液４μＬに塩溶液（Ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．０６Ｍ ＭｇＣｌ２）１ μＬとＴＯＰＯクローニングベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯを１μＬ加え、室温で５分間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地（１％ Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、１％ ＮａＣｌ）に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約３μｇのプラスミドＤＮＡを精製した（ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１とｐＣＲ−ｅｎｓｉ２）。
【実施例４】
【００５４】
塩基配列の解析
上記にて精製したＮＢＲＣ１００３８３のクローンｐＣＲ−ｅｎｓｉ１とｐＣＲ−ｅｎｓｉ２より挿入断片の塩基配列の決定を行った。シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム社製）、 Ｄｙｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （アプライドバイオシステム社製）を用い、９６℃ １０秒、５０℃ ５秒、６０℃ ４分、２５サイクルで行った。反応生成物のシークエンスは全自動シークエンサー ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステム社製）にて解析することにより決定した。その結果、ｐＣＲ−ｅｎｓｉ２に含まれている挿入断片の配列はｐＣＲ−ｅｎｓｉ１に含まれている挿入断片の一部分であることが明らかになった。ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１に含まれている挿入断片は、配列番号４に示す塩基配列の１番目から１０４７番目に相当する配列になっていることが分かった。
【実施例５】
【００５５】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼ発現ベクターの作製。
上記の塩基配列解析により確認されたＰＣＲにより増幅されたＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼ（ｐＣＲ−ｅｎｓｉ１）を大腸菌内で発現させるために、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）にサブクローニングした。即ち、ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を鋳型として、該塩基配列の全長である１０４７ｋｂｐのＮ末端の前にＫｐｎＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列：
５’−AAAGGTACCATGATCTTTTCCTCCGACAAC−３’（配列番号６）、
Ｃ末端の後にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を追加したＤＮＡプライマー配列：
５’−AGAATTCAAGCTTTCAGCAGGCGGCGACGAAACGG−３’（配列番号７）
を合成し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである。
【００５６】
ＰＣＲ条件：１μＬ鋳型ゲノムＤＮＡ（３８７．５ｎｇ／μＬ）、０．５μＬ（５Ｕ／μＬ）ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５μＬ ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付のＨｉｇｈ ＧＣバッファー（Ｉ）（１Ｘ）、８μＬ ｄＮＴＰ（各２．５ｍＭ）、０．５μＬ ５’プライマー（配列番号６）２５ｐｍｏｌ／ｍＬ、０．５μＬ ３’プライマー（配列番号７）２５ｐｍｏｌ／ｍＬに水を加え、総量５０μＬの溶液を作製し、９４℃で２分間熱処理後、９４℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で１分２０秒の条件で２９サイクルのプログラムで増幅を行い、その後７２℃で５分間処理した。また、増幅の確認は１％のアガロース電気泳動を行った。その結果、制限酵素部位を含むおよそ１ｋｂ前後の１種類のＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子が増幅された（１０９７ｂｐ）。ＰＣＲにより増幅されたＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子断片を含むＰＣＲ溶液を精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社製）し、各々１０Ｕの制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で３時間切断反応を行った。反応後の溶液を１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より分離し、１０８１ｂｐに相当するバンドをゲルより切り出してＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製した。
【００５７】
次に１μｇのｐＴｒｃ９９Ａ（アマシャムバイオサイエンス製）を各１０Ｕの制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて３７℃で一晩中切断反応を行った。反応後の溶液を０．７％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より切断を確認し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により精製し、３０μＬのトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８．５）により溶解した。
【００５８】
制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得た１０８１ｂｐのＬ−スレオニンアルドラーゼ遺伝子断片８μＬとＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して得たｐＴｒｃ９９Ａの２μＬに５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を混合し、１６℃で５時間連結反応を行った。反応後の溶液５μＬを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換細胞を含む溶液を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）および０．００４％のＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上に塗布し、３７℃で一晩培養してコロニーを形成させた。それぞれについて白色の陽性コロニーを選択し、３ｍＬの１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩培養した。培養液を遠心分離して集菌後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）により約２μｇのプラスミドＤＮＡを精製した。そのうち約０．５μｇのプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、１％（Ｗ／Ｖ）濃度のアガロースゲル電気泳動より１０４７ｂｐに相当する挿入断片の存在を確認した。さらに挿入断片の塩基配列をシークエンス反応により確認したところ、変異は認められなかった。この発現プラスミドをｐｌｔｈ−ＥＡとした。
【実施例６】
【００５９】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現および活性測定
挿入断片が確認されたｐｌｔｈ−ＥＡを含む大腸菌ＪＭ１０９株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む３ｍＬの液体培地に植菌し、一晩３７℃で培養した。この培養液のうち、０．１ｍＬを１０ｍＬのＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に接種した。約３時間後、培養液の菌体濃度（ＯＤ６００）が０．４〜０．７に上昇したことを確認後、最終濃度で２ｍＭになるように１ＭのＩＰＴＧを添加し組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌での発現を誘導させた。その培養液をさらに、一晩３７℃で培養し、培養液を１０，０００×ｇ，５分間の遠心操作により細胞を沈殿させ、上清を除いた後、０．８５％のＮａＣｌで１回洗浄した。遠心操作により細胞を沈殿させ、大腸菌形質転換体を得た。（この形質転換体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。寄託番号：受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０）
【００６０】
この形質転換体を用いたＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ合成反応は以下の方法で行った。
反応液の組成は１ｇのグリシン、１００ｍｇの３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、１０μＬのメルカプトエタノ−ル（２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）、２５０μＬのピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ、０．６ｍｇ／ｍＬ）、４．７４ｍＬ ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０１５８ｇの亜硫酸ナトリウムおよび０．０３７５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００であって、１Ｎ塩酸で最終ｐＨを６．５に調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた前記菌体全量を加え１５℃で５時間酵素反応を開始させ、３倍量のメタノールを加えることにより反応を停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／メタノール／１，４−ジオキサン＝［５００：５０：１５（Ｖ／Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は０．７５ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２２０ｎｍの吸光で分析した。その結果、ＮＢＲＣ１００３８３のゲノムＤＮＡよりクローニングしたＬ−スレオニンアルドラーゼ組換え大腸菌は１．５ｇ／ＬのＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳの合成活性能を有していることがわかった。ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体に対するスレオ体過剰率が７３％（％ｄ．ｅ．）であり（図１）、従来の酵素に比べ立体選択性が非常に高く、今まで問題になっていたＬ−エリスロ−ＤＯＰＳがほとんど合成されていないことが分かった。尚、ここで、スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）は以下の計算式により求めた。
【数１】
【実施例７】
【００６１】
組換えＬ−スレオニンアルドラーゼの大腸菌によるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成
実施例６と同様の方法で１００ｍＬのＬＢ培地より得られた形質転換体をＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成反応に用いた。すなわち、反応液の組成は７．５ｇのグリシン、１ｇのシクロヘキシルアルデヒドおよび０．１２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加え全量を５０ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた１００ｍＬのＬＢ培地より得られた前記菌体全量を加え１０℃で酵素反応を行い、３２時間後に１ｇのシクロヘキシルアルデヒドを添加し、さらに酵素反応を行わせ５３時間で反応を１／４倍量の２Ｎ塩酸を加えることにより停止させた。合成産物であるＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳの合成量はＨＰＬＣ（日立Ｌ２０００シリーズ、日立製作所製）で測定した。ＨＰＬＣ分析は、ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ（Φ４．６×１５０ｍｍ）カラム、カラム温度３０℃、移動相は０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８５：１５（Ｖ／Ｖ）］で行った。ＨＰＬＣの移動相流速は１．０ｍＬ／分で、分離産物の検出はＵＶ＝２１０ｎｍの吸光で分析した。その結果、３９ｇ／Ｌ（２０８ｍＭ）のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳが生成していることがわかった。ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼはスレオ体／エリスロ体に対するスレオ体過剰率が９５％（％ｄ．ｅ．）であり、立体選択性が非常に高く、しかも高濃度のＬ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳ合成されていることが分かった。
【実施例８】
【００６２】
２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の合成
反応液の組成は５０ｇのグリシン、１０ｇの１−ヘプタナールおよび１．２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に添加し全量を５００ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた１Ｌの培養液から集めた菌体全量を加え、１０℃で１５時間合成反応を行なった。合成産物である２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の合成量は、実施例７で、移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８０：２０（Ｖ／Ｖ）］に変えた以外は同様の方法で測定した。その結果、２９ｇ／Ｌの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸を合成していることがわかった。
【実施例９】
【００６３】
２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の分離
上記実施例８で得られた反応液５００ｍＬをヌッチェでろ過し、更に１００ｍＬの水で固形分を洗浄した。２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸は固形分として回収した。固形分を８００ｍＬの２Ｎ塩酸で溶解し、１５ｇのハイフロスーパーセルでプレコートしたヌッチェでろ過し、菌体を含む不溶物を除去した。更に、２Ｎ塩酸５０ｍＬで洗浄し、８５０ｍＬの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸を含む濾液を得た。濾液をスターラーで攪拌しながら２７％水酸化ナトリウム溶液２３０ｍＬを滴下し、ｐＨ６．３に中和した。溶解していた２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸は、中和することにより沈殿させることができる。４℃に冷却後３０分静置した後、ろ過を行い沈殿を回収した。沈殿を５０ｍＬの水で２回、１０ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られた沈殿を５０℃に加熱しながら真空乾燥を行った。７．９２ｇの２−アミノ−３−ヒドロキシノナン酸の結晶が得られた。収率は５４．８％であった。
【実施例１０】
【００６４】
２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の合成と分離
上記実施例８でアルデヒドを１−デカナールに代えて、５℃、３３時間合成反応を行った。合成産物である２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の分析は、実施例７で移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［７５：２５（Ｖ／Ｖ）］に代えた以外は同様の方法で行った。その結果、２５ｇ／Ｌの２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸が合成していることがわかった。この反応液から、実施例９記載の方法と同様の方法により、２−アミノ−３−ヒドロキシドデカン酸の結晶１１．５ｇを得た。収率は９０％であった。
【実施例１１】
【００６５】
ｐ−カルボキシフェニル−Ｌ−セリンの合成
反応液の組成は３．７５ｇのグリシン、０．５ｇのテレフタルアルデヒド酸および０．０６２５ｇのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に添加し全量を２５ｍＬに調整した。この反応液に−８０℃で凍結保存しておいた前記５０ｍＬの培養液から集めた菌体全量を加え１０℃で２２時間合成反応を行った。合成産物であるｐ−カルボキシフェニル−Ｌ−セリンの合成量は実施例６と同様のＨＰＬＣ法で測定した。その結果、３０ｇ／Ｌのｐ−カルボキシフェニルセリンが合成されていることがわかった。
【実施例１２】
【００６６】
ｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンの合成
実施例１１と同様の方法でアルデヒドをｍ−ブロムベンズアルデヒドに代えて０．６２５ｇを添加し、１０℃、２４時間酵素反応を行った。合成産物であるｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンの分析は、実施例７で移動相を０．１％ １−ヘプタンスルホン酸Ｎａ（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝［８０：２０（Ｖ／Ｖ）］、移動相流速を０．７５ｍＬ／分、検出はＵＶ＝２２０ｎｍに代えた方法で行った。その結果、３４ｇ／Ｌのｍ−ブロムフェニル−Ｌ−セリンを合成していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
医薬品や医薬品・農薬中間体として有用なＬ−ｔｈｒｅｏ−ＤＯＰＳ、Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ＣＨＳあるいはその他のＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造を煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）ＮＢＲＣ１００３８３由来のＬ−スレオニンアルドラーゼのスレオ／エリスロに対する立体選択性を示すＨＰＬＣの図である。図中（１）はエリスロ体を、（２）はスレオ体を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む微生物。
【請求項５】
宿主が大腸菌である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項８】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、シクロヘキシルアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンの製造法。
【請求項９】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド、およびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法。
【請求項１】
下記の（１）、（２）、（３）または（４）に示す遺伝子：
（１）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡからなる遺伝子：
（２）配列番号４に示す塩基配列のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子：
（３）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子：
（４）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項２】
下記の（１）または（２）に示すタンパク質：
（１）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターを含む微生物。
【請求項５】
宿主が大腸菌である請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−１１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託された微生物。
【請求項７】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項８】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、シクロヘキシルアルデヒドおよびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３−シクロヘキシルセリンの製造法。
【請求項９】
請求項４、５または６に記載の微生物またはその調製物を、炭素数７以上の直鎖脂肪族アルデヒドまたはカルボキシ基もしくは臭素置換芳香族アルデヒド、およびグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中に対応するＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体の製造法。
【図１】
【公開番号】特開２００７−１９０００９（Ｐ２００７−１９０００９Ａ）
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１１９７０５（Ｐ２００６−１１９７０５）
【出願日】平成１８年４月２４日（２００６．４．２４）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２４日（２００６．４．２４）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
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