高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法
【課題】天然物由来のアンジオテンシン変換酵素阻害作用、血圧降下作用に優れたラクトフェリン由来ペプチドを有効成分として含む、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法を提供する。
【解決手段】ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得る工程を有することを特徴とする。
【解決手段】ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得る工程を有することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の三大死因の中で一部のがん（肺がん・胃がん・大腸がんなど）、心疾患（狭心症や脳卒中などの虚血性心疾患）、脳血管障害（脳卒中）や、そのリスクファクターである高血圧、肥満、高脂血症、糖尿病などは、加齢よりもむしろ食生活や運動習慣、職場や家庭などのストレスといった、普段の生活習慣が原因となることがわかってきている。そして、これらを総称する生活習慣病を改善する（リスクを軽減する）ための医薬品、食品の開発は、医薬品業界、食品業界の責務である。
【０００３】
とりわけ、高血圧や糖尿病のリスク軽減は、生活習慣病の予防、種々の疾病の併発を防止する目的で有効であると考えられるところ、高血圧を例にとった場合、その治療方法の主なものには、アンジオテンシン変換酵素を阻害する方法や動脈弛緩を弛緩させる方法があげられる。アンジオテンシン変換酵素を阻害する方法とは、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンIIへの変換酵素を阻害し、昇圧効果を示すアンジオテンシンIIの産生を抑えるというものである。
【０００４】
ところで、これまでに多くのアンジオテンシン変換酵素阻害薬（以下、ＡＣＥ阻害薬という）が開発されているが、優れたＡＣＥ阻害作用を有する物質の探索は、高血圧治療剤を開発する目的から、なおも続けられている。そして、天然物中に見出されるＡＣＥ阻害物質は極めて稀で、わずかにブラジル産や日本産蛇毒より得られたテプロタイドなどが知られているに過ぎない（特許文献１参照）が、近年その中で、牛乳由来タンパクであるラクトフェリンを由来とするペプチドにも、ＡＣＥ阻害作用が見出されている。例えば、特許文献２に記載されているように、ラクトフェリンをペプシンで分解しすることによりＡＣＥ阻害ペプチドを生成することが報告されているが、その活性は充分ではなく、現状では、優れた活性を示すＡＣＥ阻害ペプチドの製造方法については、いまだ確立された方法はない。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−１７７９２０号公報
【特許文献２】Chinese J. Physiology 49(2) 67-73(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、天然物由来のＡＣＥ阻害作用、血圧降下作用に優れたラクトフェリン由来ペプチドを有効成分として含む、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼ、特にはサーモライシンを用いて酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＡＣＥ阻害作用、動脈弛緩作用を有し、血圧降下作用に優れたラクトフェリン由来のペプチドを有効成分として含む、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼ、特にはサーモライシンを用いて酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法に関する。
【００１０】
なお、サーモライシンとは、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）が産生するプロテアーゼの１種であり、本発明の活性をもつ組成物は、当該サーモライシンを用いる場合に特に効果的に得られ、他の公知のプロテアーゼであるペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどでタンパクを分解しても本発明の如き強力な作用をもつ組成物は得られない。
【００１１】
本発明で用いるラクトフェリンは、牛乳やミルクホエータンパク質を陽イオンカラム樹脂を用いて得る。
【００１２】
得られたラクトフェリン１ｇに対し、サーモライシンを１０〜２００重量％となるよう添加し、温度１０〜６０℃、ｐＨ４〜８、反応時間１０分〜１０時間、好ましくは、１〜６時間の反応条件下で疎水性アミノ酸のペプチド結合が分解率５％以上になるまで静置または撹拌下、反応を続けて目的物を得る。
【００１３】
分解率は、全窒素に対するアミノ態窒素の％で表す。ただし、Journal of Agricultural and food Chemistry 24 No.6 1090〜1093（1976）に基づいて測定する。
【００１４】
得られたＡＣＥ阻害剤含有組成物は、各種のペプチドの混合物であり、そのまま使用してもよく、後処理加工して用いてもよい。
【００１５】
かくして得られたペプチドは、アンジオテンシン変換酵素作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であり、かかるペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。かかるペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。かかるペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１６】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等があげられる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等があげられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な媒体に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の方法で製造したペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１７】
これらの製剤は、本発明の製造法でペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００１８】
つぎに、実施例にもとづいて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１９】
実施例１、比較例１〜４
１０％ラクトフェリン（Tatua Nutritionals, Morrinsville, New Zealand）１ｇに水１００ｍＬを加え（以下、ラクトフェリン液という）、撹拌したのち、表１に示すプロテアーゼを作用させた後、１００℃で１０分間煮沸後放置して得た上清のＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００２０】
（プロテアーゼの作用条件）
サーモライシン、トリプシン、キモトリプシンを作用させる場合は、反応液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０とし、また、ペプシンを作用させる場合は、塩酸でｐＨ１．６として、反応温度３７℃で５時間静置反応を行った。
【００２１】
酵素量は、ラクトフェリン液に対してすべて１／１００重量部添加した。
【００２２】
（ＡＣＥ阻害活性の測定）
ＡＣＥ活性は、CheungとCushmanの方法（Biochemical Pharmacology ２０，１６３７（１９７１））に準じて以下の方法で行った。
【００２３】
酵素基質；Bz（ベンジル）-Gly-His-Leu（８６ｍｇと水８ｍｌに溶解した溶液）
酵素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）（１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した後、遠心分離した上清液）
【００２４】
上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌおよび本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
【００２５】
反応は、１ＮのＨＣｌを１２５０μｌ用いて終了させた。反応終了液も酢酸エチル１．５ｍｌを入れ、Ｖｏｌｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０ｍｌを取り出し、酢酸エチルを除去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外線吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ228）を測定した。
【００２６】
阻害率は、阻害剤なしで反応したときのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ228を０％として求め、阻害率５０％のときの阻害剤（本発明のペプチド）の濃度ＩＣ50（ｍｇ／ｍｌ）で活性を表示した。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示されるように、サーモライシンを用いた実施例１のみが、ＩＣ50の値が低くなり、高いＡＣＥ阻害活性が確認された。
【００２９】
本実施の形態では、ＡＣＥ阻害活性を例示して説明したが、本願発明は、高血圧治療剤のみならず、生活習慣病改善食品に応用することも可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の三大死因の中で一部のがん（肺がん・胃がん・大腸がんなど）、心疾患（狭心症や脳卒中などの虚血性心疾患）、脳血管障害（脳卒中）や、そのリスクファクターである高血圧、肥満、高脂血症、糖尿病などは、加齢よりもむしろ食生活や運動習慣、職場や家庭などのストレスといった、普段の生活習慣が原因となることがわかってきている。そして、これらを総称する生活習慣病を改善する（リスクを軽減する）ための医薬品、食品の開発は、医薬品業界、食品業界の責務である。
【０００３】
とりわけ、高血圧や糖尿病のリスク軽減は、生活習慣病の予防、種々の疾病の併発を防止する目的で有効であると考えられるところ、高血圧を例にとった場合、その治療方法の主なものには、アンジオテンシン変換酵素を阻害する方法や動脈弛緩を弛緩させる方法があげられる。アンジオテンシン変換酵素を阻害する方法とは、アンジオテンシンＩからアンジオテンシンIIへの変換酵素を阻害し、昇圧効果を示すアンジオテンシンIIの産生を抑えるというものである。
【０００４】
ところで、これまでに多くのアンジオテンシン変換酵素阻害薬（以下、ＡＣＥ阻害薬という）が開発されているが、優れたＡＣＥ阻害作用を有する物質の探索は、高血圧治療剤を開発する目的から、なおも続けられている。そして、天然物中に見出されるＡＣＥ阻害物質は極めて稀で、わずかにブラジル産や日本産蛇毒より得られたテプロタイドなどが知られているに過ぎない（特許文献１参照）が、近年その中で、牛乳由来タンパクであるラクトフェリンを由来とするペプチドにも、ＡＣＥ阻害作用が見出されている。例えば、特許文献２に記載されているように、ラクトフェリンをペプシンで分解しすることによりＡＣＥ阻害ペプチドを生成することが報告されているが、その活性は充分ではなく、現状では、優れた活性を示すＡＣＥ阻害ペプチドの製造方法については、いまだ確立された方法はない。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５８−１７７９２０号公報
【特許文献２】Chinese J. Physiology 49(2) 67-73(2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、天然物由来のＡＣＥ阻害作用、血圧降下作用に優れたラクトフェリン由来ペプチドを有効成分として含む、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼ、特にはサーモライシンを用いて酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＡＣＥ阻害作用、動脈弛緩作用を有し、血圧降下作用に優れたラクトフェリン由来のペプチドを有効成分として含む、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼ、特にはサーモライシンを用いて酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤および糖尿病治療剤の製造方法に関する。
【００１０】
なお、サーモライシンとは、バチルス・サーモプロテオリティカス（Bacillus thermoproteolyticus）が産生するプロテアーゼの１種であり、本発明の活性をもつ組成物は、当該サーモライシンを用いる場合に特に効果的に得られ、他の公知のプロテアーゼであるペプシン、トリプシン、キモトリプシンなどでタンパクを分解しても本発明の如き強力な作用をもつ組成物は得られない。
【００１１】
本発明で用いるラクトフェリンは、牛乳やミルクホエータンパク質を陽イオンカラム樹脂を用いて得る。
【００１２】
得られたラクトフェリン１ｇに対し、サーモライシンを１０〜２００重量％となるよう添加し、温度１０〜６０℃、ｐＨ４〜８、反応時間１０分〜１０時間、好ましくは、１〜６時間の反応条件下で疎水性アミノ酸のペプチド結合が分解率５％以上になるまで静置または撹拌下、反応を続けて目的物を得る。
【００１３】
分解率は、全窒素に対するアミノ態窒素の％で表す。ただし、Journal of Agricultural and food Chemistry 24 No.6 1090〜1093（1976）に基づいて測定する。
【００１４】
得られたＡＣＥ阻害剤含有組成物は、各種のペプチドの混合物であり、そのまま使用してもよく、後処理加工して用いてもよい。
【００１５】
かくして得られたペプチドは、アンジオテンシン変換酵素作用を有し、血圧降下作用、ブラジキニン不活化抑制作用を示し、本態性高血圧、腎性高血圧、副腎性高血圧などの高血圧症の予防、治療剤、これらの疾患の診断剤や各種の病態において用いられる血圧降下剤、狭心病発作の閾値上昇、心筋梗塞の減少、うっ血性心不全における病態の改善剤として有用であり、かかるペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。かかるペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状・年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇを１日当たり１〜３回である。かかるペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつペプチドと反応しない物質が用いられる。
【００１６】
具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等があげられる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等があげられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な媒体に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の方法で製造したペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００１７】
これらの製剤は、本発明の製造法でペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値ある他の成分を含有していてもよい。
【実施例】
【００１８】
つぎに、実施例にもとづいて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００１９】
実施例１、比較例１〜４
１０％ラクトフェリン（Tatua Nutritionals, Morrinsville, New Zealand）１ｇに水１００ｍＬを加え（以下、ラクトフェリン液という）、撹拌したのち、表１に示すプロテアーゼを作用させた後、１００℃で１０分間煮沸後放置して得た上清のＡＣＥ阻害活性を測定した。
【００２０】
（プロテアーゼの作用条件）
サーモライシン、トリプシン、キモトリプシンを作用させる場合は、反応液を水酸化ナトリウムでｐＨ７．０とし、また、ペプシンを作用させる場合は、塩酸でｐＨ１．６として、反応温度３７℃で５時間静置反応を行った。
【００２１】
酵素量は、ラクトフェリン液に対してすべて１／１００重量部添加した。
【００２２】
（ＡＣＥ阻害活性の測定）
ＡＣＥ活性は、CheungとCushmanの方法（Biochemical Pharmacology ２０，１６３７（１９７１））に準じて以下の方法で行った。
【００２３】
酵素基質；Bz（ベンジル）-Gly-His-Leu（８６ｍｇと水８ｍｌに溶解した溶液）
酵素；うさぎの肺のアセトンパウダー（シグマ社製）（１ｇを５０ｍＭのリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した後、遠心分離した上清液）
【００２４】
上記の酵素基質を１００μｌ、酵素溶液を１２μｌおよび本発明の所定濃度のペプチドを混合し、水で全体を２５０μｌとした後、３７℃で３０分間反応を行った。
【００２５】
反応は、１ＮのＨＣｌを１２５０μｌ用いて終了させた。反応終了液も酢酸エチル１．５ｍｌを入れ、Ｖｏｌｔｅｘで１５秒撹拌し、それを遠心分離した。酢酸エチル層から１．０ｍｌを取り出し、酢酸エチルを除去し、それに１ｍｌの蒸留水を入れて残渣を溶解し、抽出された馬尿酸の紫外線吸収２２８ｎｍの値（ＯＤ228）を測定した。
【００２６】
阻害率は、阻害剤なしで反応したときのＯＤ228を１００％とし、反応時間０分のときのＯＤ228を０％として求め、阻害率５０％のときの阻害剤（本発明のペプチド）の濃度ＩＣ50（ｍｇ／ｍｌ）で活性を表示した。結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
表１に示されるように、サーモライシンを用いた実施例１のみが、ＩＣ50の値が低くなり、高いＡＣＥ阻害活性が確認された。
【００２９】
本実施の形態では、ＡＣＥ阻害活性を例示して説明したが、本願発明は、高血圧治療剤のみならず、生活習慣病改善食品に応用することも可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤の製造方法。
【請求項２】
前記微生物由来のプロテアーゼがサーモライシンである、請求項１記載の高血圧治療剤の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトフェリン由来ペプチドが、ＡＣＥ阻害活性または動脈弛緩作用を有する、請求項１または２記載の高血圧治療剤の製造方法。
【請求項４】
ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、糖尿病治療剤の製造方法。
【請求項５】
前記微生物由来のプロテアーゼがサーモライシンである、請求項４記載の糖尿病治療剤の製造方法。
【請求項６】
前記ラクトフェリン由来ペプチドが、ＡＣＥ阻害活性または動脈弛緩作用を有する、請求項４または５記載の糖尿病治療剤の製造方法。
【請求項１】
ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、高血圧治療剤の製造方法。
【請求項２】
前記微生物由来のプロテアーゼがサーモライシンである、請求項１記載の高血圧治療剤の製造方法。
【請求項３】
前記ラクトフェリン由来ペプチドが、ＡＣＥ阻害活性または動脈弛緩作用を有する、請求項１または２記載の高血圧治療剤の製造方法。
【請求項４】
ラクトフェリンを微生物起源のプロテアーゼで酵素処理し、ラクトフェリン由来ペプチドを得ることを特徴とする、糖尿病治療剤の製造方法。
【請求項５】
前記微生物由来のプロテアーゼがサーモライシンである、請求項４記載の糖尿病治療剤の製造方法。
【請求項６】
前記ラクトフェリン由来ペプチドが、ＡＣＥ阻害活性または動脈弛緩作用を有する、請求項４または５記載の糖尿病治療剤の製造方法。
【公開番号】特開２００９−２３４９６６（Ｐ２００９−２３４９６６Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８１７３３（Ｐ２００８−８１７３３）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（５００３３３１３２）日本サプリメント株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（５００３３３１３２）日本サプリメント株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]