高速高分離能のゲル電気泳動のためのシステム
ユーザーが高電圧の条件下、泳動時間を短縮して電気泳動実験を実施できる、電気泳動システム、製剤、および方法を説明する。電気泳動システム、製剤、または方法は、当該分野において既に使用されている比較可能なシステムより５０％高い電界強度で泳動することができる。説明されるシステムおよび製剤では、２２５Ｖ超、２５０Ｖ超、２７５Ｖ超、３００Ｖ超、３２５Ｖ超、または３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。電気泳動実験を実施するために必要とされる時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満にまで短縮され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ゲル電気泳動に使用するための技法および製剤に関する。より具体的には、本発明は、実質的に中性のｐＨでの、高速で高分離能のゲル電気泳動のための新規のシステムおよび製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ポリペプチド、およびタンパク質等の生体分子を分離するための一般的な手順である。ゲル電気泳動では、分子は、印加した電場がフィルタリングゲルを通ってそれらを移動させる速度によってバンドに分離される。
【０００３】
この技法に使用される基本的な装置は、ガラス管に密閉された、またはガラスもしくはプラスチックプレートの間にスラブとして挟まれたゲルから成る。ゲルは、開放型分子ネットワーク構造を有し、導電性の塩の緩衝溶液で飽和された細孔を画定する。ゲルを通るこれらの細孔は、移動する巨大分子の通過を可能にするのに十分に大きい。
【０００４】
ゲルは、ゲルと電源のカソードまたはアノードとの間を電気的に接続する緩衝溶液と接触するチャンバーに設置される。巨大分子および追跡用色素を含有する試料は、ゲルの上部に設置される。電位をゲルに印加し、試料巨大分子および追跡用色素をゲルの底部に向かって移動させる。追跡用色素がゲルの端部に達する直前に電気泳動を停止する。その後、分離した巨大分子のバンドの位置を決定する。既知の大きさの追跡用色素および巨大分子と比較して特定のバンドにより移動した距離を比較することにより、他の巨大分子の大きさが決定される。
【０００５】
ゲルを通って巨大分子が移動する速度は、ゲルの多孔度、巨大分子の大きさおよび形状、巨大分子の電荷密度、ならびに印加される電界強度の４つの主要因に依存する。電気泳動システムは、一般に、ゲル間および試料間で再現可能であるように、これらの要因を制御する試みである。しかしながら、ゲル間の均一性を維持することは、これらの要因のそれぞれがゲルシステムの化学における多くの可変要素に敏感であるため、困難である。
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルは、一般に、電気泳動に使用される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＰＡＧＥは、ゲルが光学的に透明であり、電気的に中性であり、様々な細孔の大きさで作製することができるため、一般的である。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と共に、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとして使用される時、巨大分子の電荷密度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をシステムに添加することにより制御される。ＳＤＳ分子は巨大分子と会合し、それらに均一な電荷密度を付与し、実質的に、あらゆる自然分子電荷の作用を無効にする。
【０００７】
従来、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが通常注入され、塩基性ｐＨで泳動された。タンパク質の分離に利用される最も一般的なＰＡＧＥ緩衝液システムは、ＯｒｎｓｔｅｉｎおよびＤａｖｉｓにより開発され（Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：３２１（非特許文献１）およびＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：１２１：４０４（非特許文献２））、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８６（非特許文献３））によってＳＤＳと共に使用するために改変されたものである。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液システムは、０．３７５Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（トリス）から成り、分離ゲル中でＨＣｌを用いてｐＨ８．８に滴定される。濃縮用ゲルは０．１２５Ｍのトリスから成り、ｐＨ６．８に滴定される。アノードおよびカソード泳動緩衝液は、０．０２４Ｍのトリス、０．１９２Ｍのグリシン、０．１％のＳＤＳを含有する。別の緩衝液システムは、Ｓｃｈａｅｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗにより開示される（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９（非特許文献４））。
【０００８】
Ｕｐｄｙｋｅらによる米国特許第７，４２２，６７０号（特許文献１）、同第６，７８３，６５１号（特許文献２）、同第６，１４３，１５４号（特許文献３）、同第６，０５９，９４８号（特許文献４）、同第６，０９６，１８２号（特許文献５）、同第６，１６２，３３８号（特許文献６）、同第５，９２２，１８５号（特許文献７）、および同第５，５７８，１８０号（特許文献８）は、分離が中性のｐＨで生じ、タンパク質が実質的に還元状態に留まる、ゲルおよび不連続緩衝液システムを説明する。ゲルシステムは、５．５〜７．５の範囲のｐＫを有するゲルアミンを含み、ゲル緩衝液のｐＨは、中性の範囲（ｐＨ６〜８）である。ゲルシステムは、ゲルマトリクスおよび保存溶液の改善された安定性を示す。ゲルは、実質的な性能の損失なしに１年を超えて冷蔵下で保存することができる。ゲルシステムは、２〜２００ｋＤａの範囲の分離を網羅することができるタンパク質の高分離能を可能にする。しかしながら、ゲルシステムの分離速度は改善することができ、これらのゲル製剤の分離能は、電界強度が５０％増加する時、悪化する。
【０００９】
低コンダクタンスを生む中性ｐＨの不連続緩衝液システムでタンパク質分離能を維持しながら、または増加させながら、大幅に短縮された泳動時間で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質試料を泳動することができ、さらに現在の電気泳動ゲル製剤より約５０％大きい電界強度を使用して、そのような結果を達成するのに十分な緩衝能を維持する泳動ゲル製剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，４２２，６７０号
【特許文献２】米国特許第６，７８３，６５１号
【特許文献３】米国特許第６，１４３，１５４号
【特許文献４】米国特許第６，０５９，９４８号
【特許文献５】米国特許第６，０９６，１８２号
【特許文献６】米国特許第６，１６２，３３８号
【特許文献７】米国特許第５，９２２，１８５号
【特許文献８】米国特許第５，５７８，１８０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：３２１
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：１２１：４０４
【非特許文献３】Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８６
【非特許文献４】Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９
【発明の概要】
【００１２】
ここに記載される実施形態において、高電圧および短縮された泳動時間の条件下で、ユーザーが電気泳動実験を実施することを可能にする電気泳動システム、製剤、キット、および方法を説明する。システム、製剤、および方法は、当該分野において既に公知であるものを改良し、ユーザーが、現在の利用可能なシステムおよび製剤より高度の分離能および短縮された時間量で、電気泳動的に分離されたタンパク質試料を生成することを可能にする。今般開示される実施形態によって実践される電気泳動システム、製剤、または方法は、例えば、当該分野において既に使用される比較可能なシステムより５０％大きい電界強度で泳動され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステム、方法、および製剤によって調製される電気泳動ゲルは、２２５Ｖ超、２５０Ｖ超、２７５Ｖ超、３００Ｖ超、３２５Ｖ超、または３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステム、方法、および製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約１２ｖ／ｃｍ〜約２０ｖ／ｃｍ、または少なくとも１２．０〜１３．０Ｖ／ｃｍ、少なくとも１３．５〜１４Ｖ／ｃｍ、少なくとも１５．０〜１５．５Ｖ／ｃｍ、少なくとも１６．０〜１７．０Ｖ／ｃｍ、または少なくとも１７．５〜１８．５Ｖ／ｃｍの範囲の電界強度を使用することができる。
【００１３】
一部の実施形態において、電気泳動実験を実施するために必要とされる時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。
【００１４】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。
【００１５】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電力を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。
【００１６】
ここに記載される実施形態による電気泳動システムおよび方法は、不連続緩衝液システムの一部であり得る。
【００１７】
電気泳動システムは、ポリアクリルアミド電気泳動分離ゲルを含むことができる。一部の実施形態において、分離ゲルは、分離用ゲル部分、及び分離用部分の上に成型された任意の濃縮用ゲル部分を含む場合がある。一実施形態において、濃縮用部分に存在するポリアクリルアミド、架橋剤、またはポリアクリルアミドおよび架橋剤の双方の比率は、分離用部分に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤の比率とは異なる場合がある。
【００１８】
一実施形態において、分離用部分は、ビス−アクリルアミド等の約１％〜約６％の適切な架橋剤と組み合わせて、約３％〜約２５％のポリアクリルアミドを含むことができる。一実施形態において、分離用ゲル部分は、約２％〜約５％の架橋剤を使用して重合することができる。一実施形態において、分離用ゲルは、最大約２５％のポリアクリルアミド、最大約２０％のポリアクリルアミド、最大約１５％のポリアクリルアミド、最大約１２％のポリアクリルアミド、最大約１０％のポリアクリルアミド、最大約８％のポリアクリルアミド、最大約６％のポリアクリルアミド、最大約５％のポリアクリルアミドを含むことができる。
【００１９】
一実施形態において、電気泳動分離ゲルは、任意に、濃縮用部分、分離用部分、または濃縮用部分および分離用部分の双方に、例えば、スクロース、グリセロール等の稠密化剤（ｄｅｎｓｉｔｙ ａｇｅｎｔ）、または類似する非イオン性稠密化剤を含むことができる。製剤中の稠密化剤の量は、約０〜約１０容量％、約０．５〜約５容量％、約１．０容量％〜約３．５容量％、または約１．５容量％〜約２容量％の範囲であり得る。一実施形態において、ゲル製剤に存在する密度濃度は、最大約１０容量％、最大約８．５容量％、最大約５容量％、最大約４．５容量％、最大約４容量％、最大約３．５容量％、最大約３容量％、最大約２．５容量％、最大約２容量％、最大約１．５容量、または最大約１．０容量％であり得る。
【００２０】
一実施形態において、少なくとも分離用ゲル部分は、ゲル両性電解質と組み合わせてゲルアミン緩衝液を有する緩衝液システムを含むことができる。代替的な実施形態において、濃縮用ゲル部分および分離用ゲル部分の双方は、ゲル両性電解質と組み合わせてゲルアミン緩衝液を含むことができる。
【００２１】
種々のゲルアミン緩衝液を、本明細書に記載されるゲル組成物の調製に使用することができる。本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムに使用するのに特に適しているゲルアミン緩衝液は、一級有機アミンまたは置換アミンを含むことができる。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。本明細書に記載される電気泳動システムおよび方法に使用するのに適しているゲルアミン緩衝液の例としては、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（以後、「ビス−トリス」）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（以後、「ビス−トリスプロパン」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後、「トリス」）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｉｏｌａｍｉｎｅ）、または約５．５〜約７．５の範囲でｐＫａ値を有する任意のそれらの誘導体もしくは塩を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの範囲、または約１６５ｍＭ〜約３２５ｍＭの範囲であり得る。通常、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満であり得る。ある非限定的な実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲であり得る。一部の実施形態において、選択されるゲルアミン緩衝液は、アクリルアミド成分を重合してポリアクリルアミドマトリクスを形成した後、ゲルマトリクスに固定することができる。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムに使用するのに特に適しているゲル両性電解質は、アミン基を有し、水溶液中で双性イオンを形成することができるあらゆる生物学的緩衝液を含む。一部の実施形態において、本発明のゲル製剤に使用するのによく適したゲル両性電解質は、ゲルアミンのｐＫａより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫ値を有する。非限定的な例として、次の例示的なゲル両性電解質は、ここに記載される実施形態で使用されることが意図される：Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン（以後、「トリシン」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、ジエチルオールグリシン（以後、「ビシン」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（以後、「ＰＩＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＭＯＰＳＯ」」）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＡＣＥＳ」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＢＥＳ」）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＴＥＳ」）、−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＥＳ」）、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＰＳ」）、およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以後、「ＴＡＰＳ」）。当然のことながら、少なくとも１つのアミンまたは置換アミンを有し、ゲルに使用するために選択されるゲルアミンより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫａをさらに有するあらゆるゲル両性電解質が、ここに記載される実施形態の実践において、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。両性電解質は、約２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度でゲル製剤に存在し得る。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムは、電気泳動ゲルの所望のｐＨが達成されるように、適切な酸で滴定することができる。一実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが実質的に中性（すなわち、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲）であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲、約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲、または約ｐＨ６．２〜約ｐＨ６．８の範囲であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨを実質的に中性、例えば、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、または約７．２のｐＨに調節するために、十分な量の酸が使用され得る。通常、選択される酸は、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンの供給源を含むことができるが、これらに限定されない。ゲル製剤に存在する陰イオンは、部分的に、不連続ゲルシステムのリーディングイオン（ｌｅａｄｉｎｇ ｉｏｎ）として機能することができる。本実施形態のゲル緩衝液システムの滴定に使用するのに適した酸の例は、塩酸（ＨＣｌ）であるが、これに限定されない。一実施形態において、電気泳動ゲルは、一級アミンおよび／または両性電解質のおよそ半分程度のＨＣｌ（モル基準で）で滴定することができるため、緩衝液のｐＨはおよそ中性である。一部の実施形態において、電気泳動ゲルの滴定に使用される塩化物イオンの最終濃度は、約９５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭ、または約１４０ｍＭの範囲であり得る。
【００２４】
一実施形態において、電気泳動システムは、さらに、水性泳動緩衝液を含むことができる。水性泳動緩衝液は、泳動緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、泳動緩衝液は、ゲル両性電解質とは異なる両性電解質を含むことができる。一実施形態において、泳動緩衝両性電解質は、少なくとも１つのアミン基を有する少なくとも１つの有機緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法に使用するのに特に適している泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、ゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動システムに使用するために選択される水性泳動緩衝両性電解質は、不連続緩衝液システムの基礎となり得る。そのようなシステムにおいて、緩衝両性電解質は、部分的に、不連続緩衝液システムのトレーリングイオン（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｉｏｎ）の供給源として機能することができる。
【００２６】
ここに記載するシステムおよび方法で使用するのに適した水性泳動緩衝両性電解質の例としては、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＤＩＰＳＯ」）、Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）、ＨＥＰＰＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳＯ」）、もしくは３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）、またはそれらのあらゆる適切な塩が挙げられるが、これらに限定されない。通常、水性泳動緩衝液中に存在する両性電解質の量は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲である。泳動緩衝液は、任意に、ＳＤＳおよび／またはＥＤＴＡに加え、トリス等のさらなる緩衝剤を含むことができる。今般開示される実施形態で使用するのによく適した泳動緩衝液の例としては、２５〜１００ｍＭのＭＥＳ、２５〜１００ｍＭのトリス、約０．０５〜約０．５％のＳＤＳ、および約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
一部の実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法によって調製される不連続緩衝液電気泳動システムは、２５０Ｖを超える電圧で泳動され、３０分未満で試料の完全な分離を達成することができる。一部の実施形態において、ここに記載されるシステムおよび製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約２２５Ｖ超、約２５０Ｖ超、約２７５Ｖ超、約３００Ｖ超、約３２５Ｖ超、または約３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。一部の実施形態において、記載されるシステムおよび方法ならびにゲルを使用する電気泳動実験を実施するために必要な時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。
【００２８】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。例えば、一部の実施形態において、本発明のゲル製剤は、最大約２００ｍＡ、最大約１７５ｍＡ、最大約１５０ｍＡ、最大約１２５ｍＡ、または最大約１１５ｍＡの定電流を使用して電気泳動に供することができる。
【００２９】
そのような条件下で本発明の電気泳動分離システムおよび製剤を使用して電気泳動に供される試料は、実質的に、現在使用されているゲル製剤と同程度の分離を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
上記の簡単な説明ならびに本発明の方法および装置のさらなる目的、特色、および利点は、添付の図面と組み合わされる時、本発明による現時点で好ましいが、例示的である実施形態の以下の詳細な説明を参照することによって、より完全に理解されるであろう。
【図１】３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４重量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１５分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図２】３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４重量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝４１：５９）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図３】３５７ｍＭのビス−トリス、１５０ｍＭのＨ２ＳＯ４、ｐＨ６．１を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、１００ｍＭのトリシン、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝４１：５９）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを、ＭＥＳ緩衝液中で１８分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図４】図４Ａは、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、トリシンなし、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：３）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図４Ｂは、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、トリシンなし、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：３）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１０分間、３５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【図５】２２８ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、および４重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【図６】図６Ａは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮＯＶＥＸ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で３２分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｂは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２９分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。図６Ｃは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２０分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｄは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１９分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。図６Ｅは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｆは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。
【図７】図７Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．５％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１４分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図７Ｂは、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加され、ゲルはＭＥＳ緩衝液中で３５分間、２００Ｖで泳動され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。図７Ｃは、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加され、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２２分間、２５０Ｖで泳動され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。図７Ｄは、図７Ａ（灰色の棒）、図７Ｂ（黒色棒）、および図７Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図７Ｅは、示される非線形動態ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ｖ２００３．０２ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．７５％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１０％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｂは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で３６分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｃは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で２４分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｄは、図８Ａ（灰色の棒）、図８Ｂ（黒色棒）、および図８Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図８Ｅは、示されるＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．５〜２％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの４〜１２％の勾配ゲルの上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１７分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｂは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で３７分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｃは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で２５分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｄは、図９Ａ（灰色の棒）、図９Ｂ（黒色棒）、および図９Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図９Ｅは、示されるＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは、３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、２％重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１２％分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜１０に添加する。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１５分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。図１０Ｂは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％スクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１２％分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜１０に添加する。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２６分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。図１０Ｃは、図１０Ａ（黒色の棒）および図１０Ｂ（斜線棒）に記載されるゲル製剤を使用した、４つの独立した実験を平均したＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。
【００３１】
本発明は、種々の修正および変形形態が可能であるが、その特定の実施形態を図面において例として示し、本明細書で詳細に説明する。図面は原寸に比例しない場合がある。図面およびそれに対する詳細な説明は、本発明を開示される特定の形態に限定することを意図するものではなく、むしろ、添付の請求項により定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれる全ての修正、均等物、および変形を網羅することが意図されることを理解するべきである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施形態の詳細な説明
定義
本明細書全体を通して使用される用語は、一般に、各用語が使用される当該分野、本発明の内容内、および特定の内容において、通常の意味を有する。本発明のデバイスおよび方法、ならびにそれらをどのように作製し、使用するかを説明することによって、実施者にさらなる手引きを提供するために、特定の用語が以下、または本明細書の別の箇所で説明される。同様のことに対する言い方が一つではないことが理解されるだろう。ゆえに、代替的な用語および同義語が、本明細書で説明される用語のいずれか１つ以上について使用されてもよく、その用語が本明細書において詳記されているか、またはより詳細に説明されているかどうかに関わらず、いかなる特別な意味合いも課されるものではない。特定の用語について、同義語が提供される。１つ以上の同義語の説明が、他の同義語の使用を妨げることはないものとする。本明細書で説明されるいずれかの用語の例を含む、本明細書のいずれかの箇所での例の使用は、例示的であるに過ぎず、本明細書に記述される実施形態のいずれかの、またはいかなる例示的用語の範囲および意味をも決して制限するものではない。
【００３３】
本明細書に使用される、「不連続緩衝液」、「不連続システム」、および「不連続緩衝液システム」という用語は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動システムに使用される２つの水性緩衝液システムのうちの１つを指す。不連続緩衝液システムは、機能的および化学的に、連続緩衝液システムとは異なる。通常、連続システムは、単一の分離ゲルのみを有し、槽およびゲルで同じ緩衝液を使用する。不連続システムでは、濃縮用ゲルと呼ばれる非制限的な粗孔ゲルが、分離ゲル（時折、「分離用ゲル」とも呼ばれる）の上に重ねられる。各ゲルは、同じ、または異なる緩衝液で作製することができ、槽の緩衝液は、ゲルの緩衝液とは異なる。不連続性は、早く移動するリーディングイオン（例えば、塩化物）と、ゆっくり移動するトレーリングイオン（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、グリシン、またはトリシン）のイオン移動度の相違によって作り出される。分析物分子の明瞭な開始ゾーンを作り出す不連続システムの濃縮作用により、不連続システムで得られる分離能は、分析物の希釈溶液を含有する試料において、連続システムで得られる分離能より非常に高い。連続緩衝液システムと不連続緩衝液システムの相違は、本発明が属する分野の当業者に周知である。
【００３４】
「バンド鮮鋭度」という用語は、それらが種々のゲル製剤に現れる移動したバンドの鮮鋭度を比較するために使用される相対的用語である。本用語は、特に、種々のゲル製剤のうちの２つ以上の間の相対的バンド鮮鋭度を比較する時に使用される。バンド鮮鋭度を決定するために、種々の方法を使用することができる。例えば、得られる分離能の程度により、バンド鮮鋭度、またはバンド鮮鋭度が改善される程度が、視覚的検査により決定されてもよい。バンド鮮鋭度のより定量的推定を得るために、ユーザーは、ゲル撮像ソフトウェアを利用することができる。当該分野において通常使用されるゲル分析ソフトウェアの例としては、例えば、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）、ＧＥＬ−ＰＲＯ（商標）分析器（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＬＡＢＩＭＡＧＥ（登録商標）１Ｄ Ｌ３００ゲル分析ソフトウェア（ＬａｂＩｍａｇｅ，Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。バンド鮮鋭度は、ゲルの各分離されたバンドの領域を測定し、領域を各ウェルの幅（一般に、一定である）で割ることにより決定することができる。バンド鮮鋭度を決定する別の方法は、ゲル分析アルゴリズムにより検出される個別のピークの幅を直接測定することであってもよい。
【００３５】
ユーザーが、高電圧および短縮された泳動時間の条件下で電気泳動実験を実施できる、電気泳動システム、製剤、および方法を本明細書で説明する。システム、製剤、および方法は、当該分野において既に公知であるものを改良し、ユーザーが、現在の利用可能なシステムおよび製剤より高分離能および短縮された泳動時間量で、電気泳動的に分離されたタンパク質を生成することを可能にする。ここで開示される実施形態によって実践される電気泳動システム、製剤、または方法は、当該分野において既に使用される比較可能なシステムより５０％大きい電界強度で泳動することができる。例として、ここに記載されるシステムおよび製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約２２５Ｖ超、約２５０Ｖ超、約２７５Ｖ超、約３００Ｖ超、約３２５Ｖ超または約３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。電気泳動を実施するために必要とされる時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。例えば、一部の実施形態において、本発明のゲル製剤は、最大約２００ｍＡ、最大約１７５ｍＭ、最大約１５０ｍＭ、最大約１２５ｍＭ、または約１１５ｍＭの定電流を使用する電気泳動に供することができる。
【００３６】
実施形態において、電気泳動システムは、ゲルおよび緩衝液システムを含むことができ、分離は、実質的に中性のｐＨで生じる。いかなる特定の理論またはメカニズムにも拘束されることなく、ｐＨ中性の電気泳動システムの使用は、電気泳動に供される試料（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物等）内の生体分子が、完全に、または実質的に減少せず、加水分解されないままであることを確実にすると考えられている。好都合に、中性のｐＨでは、タンパク質の一級アミノ基は、非重合アクリルアミドとの反応が低く、それによって、より高い分離能および改善されたバンド鮮鋭度を可能にする。加えて、中性のｐＨでは、チオール基は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが従来実施されるよりアルカリ性の条件下よりも酸化しにくい。本開示の基礎となるゲル製剤は、一部の実施形態において、不連続緩衝液システムの一部として使用される時に最適に機能し得る。不連続緩衝液システムは、アノードチャンバー、カソードチャンバー、またはアノードおよびカソードチャンバーの双方において、ゲルに存在する緩衝液とは異なる水性緩衝液を使用するものである。水性泳動緩衝液の濃度は、電気泳動ゲルの緩衝液濃度とは異なっていてもよい。一部の実施形態において、本開示によるゲル製剤は、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルを含むことができる。
【００３７】
得られるゲル電気泳動システムは、高電圧でゲルマトリクスおよび緩衝溶液の改善された安定性を示し、それによって、バンド分離能を損なうことなく従来の電気泳動システムより高電圧でのゲル電気泳動の実施を可能にする。今般記載される製剤および方法によって調製されるゲルは、性能を損なうことなく、少なくとも最大約１６ヵ月間冷蔵下で保管することができる。加えて、重合開始剤を含まない保存緩衝液および保存ゲル溶液は、性能を損なうことなく、数週間以上室温で保管することができる。本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用することにより、例えば、８％のポリアクリルアミドゲルは、１５分未満で、約２〜２５０ｋＤａの分離範囲でタンパク質試料を分離することができる。
【００３８】
一部の実施形態において、ゲル製剤は、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルを含むことができる。分離用ゲルに対する濃縮用ゲルの割合（Ｓ：Ｒとも表示される）は、約０．５：９．５、約１：９、約１．５：８．５、約２：８、約２．５：７．５、約３：７、約３．５：６．５、約４：６、約４．５：５．５、または約１：１であることができる。濃縮用ゲルおよび分離用ゲルという用語の意味は、不連続ゲル電気泳動システムの内容について使用される時、当該分野の通常の技能を有する実施者に周知である。通常、濃縮用ゲル中に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤（例えば、ビス−アクリルアミド）の比率は、分離用ゲル中に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤の比率より低い場合がある。一部の実施形態において、濃縮用ゲル中に存在するポリアクリルアミドの比率は、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満である。
【００３９】
電気泳動システムおよび製剤の一実施形態において、約３％〜約２５％（％Ｔ）のアクリルアミドの分離用ポリアクリルアミドゲルは、ビスアクリルアミド等の、約１％〜約６％の適切な架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。実施形態において、ゲルは、ゲル緩衝液の存在下、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。実施形態において、ポリアクリルアミドゲルは、２５％のアクリルアミド、２４％のアクリルアミド、２３％のアクリルアミド、２２％のアクリルアミド、２１％のアクリルアミド、２０％のアクリルアミド、１９％のアクリルアミド、１８％のアクリルアミド、１７％のアクリルアミド、１６％のアクリルアミド、１５％のアクリルアミド、１４％のアクリルアミド、１３％のアクリルアミド、１２％のアクリルアミド、１１％のアクリルアミド、１０％のアクリルアミド、９％のアクリルアミド、８％のアクリルアミド、７％のアクリルアミド、６％のアクリルアミド、または５％のアクリルアミドを含むことができる。
【００４０】
電気泳動システムおよび製剤の実施形態において、化学的還元環境を維持するために、ゲル、緩衝液、または添加液のうちの１つ以上に還元剤を任意に含むことができる。種々の適切な還元剤が当該分野において公知であり、それらのいずれも本明細書に開示される実施形態で使用するのに適している。例として、チオグリコール酸（ＴＧＡ）または亜硫酸水素ナトリム等の還元剤が製剤に添加され得るが、これらに限定されない。そのような還元剤の適切な濃度範囲は、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約７．５ｍＭであり得る。任意の還元剤を含む一部の実施形態において、還元剤は、ゲル泳動緩衝液に添加することができる。
【００４１】
好ましくはあるが、ある非限定的な実施形態において、ＳＤＳは、実質的に電気泳動ゲルに含まれず、代わりに泳動緩衝液および／または添加液中に提供される。種々の適切な泳動緩衝液が、以下により詳細に記載される。
【００４２】
一部の実施形態において、ここに記載される実施形態によるポリアクリルアミドゲルは、一級有機アミン、または一もしくは二置換アミン緩衝液を含むことができる。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。本明細書に記載される電気泳動システムおよび方法に使用するのに適したゲルアミン緩衝液の例としては、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（以後、「ビス−トリス」）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（以後、「ビス−トリスプロパン」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後、「トリス」）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｉｏｌａｍｉｎｅ）、または約５．５〜約７．５の範囲でｐＫａ値を有するそれらの誘導体もしくは塩を含むが、これらに限定されない。当然のことながら、少なくとも１つの一級アミン、または置換アミンを有し、５．５〜７．５の範囲のｐＫａをさらに有するあらゆるゲルアミン緩衝液が、ここに記載される実施形態の実践中、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【００４３】
一部の実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの範囲、または約１６５ｍＭ〜約３２５ｍＭの範囲であり得る。通常、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満であり得る。ある非限定的な実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲であり得る。
【００４４】
一部の実施形態において、ゲルアミン緩衝液は、その他の水性成分が混合される時、および重合反応開始前に、水性溶液として、分離用ゲル、濃縮用ゲル、または分離用ゲルおよび濃縮用ゲルの双方に直接添加することができる。あるいは、ゲルアミン緩衝液は、所望の濃度のゲルアミン緩衝液を含有する水性溶液に重合したゲルを浸漬し、ゲルアミン緩衝液を重合したゲルマトリクスに浸透させることによりゲルマトリクスに組み込むことができる。
【００４５】
一部の実施形態において、電気泳動システムの基礎となるポリアクリルアミドゲルは、上述のゲルアミンと組み合わせてゲル両性電解質を含むことができる。本発明のゲル製剤と使用するのに適したゲル両性電解質は、アミン基を有し、水性溶液中で双性イオンを形成することができるあらゆる生物学的緩衝液を含み得るが、これに限定されない。一部の実施形態において、本発明のゲル製剤と使用するのによく適したゲル両性電解質は、ゲルアミンのｐＫａ値より約１．５ｐＨ単位大きいｐＫ値を有する。非限定的な例として、次の例示的なゲル両性電解質は、ここに記載される実施形態で使用されることが意図される：Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン（以後、「トリシン」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、ジエチルオールグリシン（以後、「ビシン」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（以後、「ＰＩＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＭＯＰＳＯ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＡＣＥＳ」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＢＥＳ」）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＴＥＳ」）、−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＥＳ」）、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＰＳ」）、およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以後、「ＴＡＰＳ」）。当然のことながら、少なくとも１つのアミンまたは置換アミンを有し、ゲルに使用するために選択されるゲルアミンより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫａをさらに有するあらゆるゲル両性電解質が、ここに記載される実施形態の実践において、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。両性電解質は、約２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度でゲル製剤に存在し得る。
【００４６】
一部の実施形態において、ゲル両性電解質は、その他の水性成分が混合される時、かつ重合反応開始前に、水性溶液として、分離用ゲル、濃縮用ゲル、または分離用ゲルと濃縮用ゲルの双方に直接添加することができる。あるいは、ゲル両性電解質は、所望の濃度のゲル両性電解質を含有する水性溶液に重合したゲルを浸漬し、ゲル両性電解質を重合したゲルマトリクスに浸透させることによりゲルマトリクスに組み込むことができる。
【００４７】
一部の実施形態において、本発明の緩衝液ゲルシステムおよび製剤は、電気泳動ゲルの所望のｐＨが達成されるように、適切な酸で滴定することができる。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが実質的に中性（すなわち、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲）であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲、約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲、または約ｐＨ６．２〜約ｐＨ６．８の範囲であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨを実質的に中性、例えば、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、または約７．２のｐＨに調節するために、十分な量の酸が使用され得る。排他的ではないが、通常、選択される酸は、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンの供給源を含むことができる。ゲル製剤に存在する陰イオンは、部分的に、不連続ゲルシステムのリーディングイオンとして機能することができる。本発明の実施形態のゲル緩衝液システムの滴定に使用するのに適した酸の例としては、塩酸（ＨＣｌ）であるが、これに限定されない。実施形態において、電気泳動ゲルは、一級アミンおよび／または両性電解質のおよそ半分程度のＨＣｌ（モル基準で）で滴定することができるため、緩衝液のｐＨはおよそ中性である。一部の実施形態において、電気泳動ゲルの滴定に使用される塩化物イオンの最終濃度は、約９５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭ、または約１４０ｍＭの範囲であり得る。
【００４８】
一部の実施形態において、不連続緩衝液システムでリーディングイオンとして機能する陰イオンは、濃縮用ゲル、分離用ゲル、または濃縮用ゲルと分離用ゲルの双方に存在することができる。ここに記載されるゲル製剤に使用するのに適したリーディングイオンの例としては、塩化物、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンを含むことができるが、これらに限定されない。そのような陰イオンの供給源は、ＨＣｌまたはあらゆる酸ハロゲン化物、リン酸、硫酸、または酢酸を含むことができる。
【００４９】
一実施形態において、リーディングイオンの濃度は、分離用ゲルより濃縮用ゲルにおいて高い場合がある。別の実施形態において、リーディングイオンの濃度は、実質的に、分離用ゲルと濃縮用ゲルにおいて同じであり得る。一部の実施形態において、濃縮用ゲル中のリーディングイオンの濃度は、最大約３５０ｍＭ、最大約３００ｍＭ、最大約２５０ｍＭ、最大約２００ｍＭ、最大約１５０ｍＭ、最大約１２５ｍＭ、最大約１１０ｍＭ、最大約１００ｍＭ、または最大約７５ｍＭであり得る。
【００５０】
一部の実施形態において、ここに記載される実施形態による電気泳動ゲルは、任意に、例えば、スクロース、グリセロール、または類似する剤等の稠密化剤を含むことができる。製剤に含まれる稠密化剤の量は、約０〜約８重量％、約０．５〜約５重量％、約１．０重量％〜約３．５重量％、または約１．５重量％〜約２重量％の範囲であり得る。実施形態において、ゲル製剤中に存在するスクロースの濃度は、最大約１０％、最大約８．５％、最大約５％、最大約４．５％、最大約４％、最大約３．５％、最大約３％、最大約２．５％、最大約２％、最大約１．５％、最大約１％、または最大約０．５％であり得る。一部の実施形態において、電気泳動ゲル中に存在する稠密化剤の量は、変動し得る。そのような実施形態は、例えば、米国特許第６，４７２，５０３号および同第６，１９７，１７３号に記載される方法等の、勾配ゲルの調製中に有利に使用することができる。
【００５１】
上に開示される製剤によって調製されるゲルは、水性泳動緩衝液システムを使用して電気泳動に供することができる。通常、水性泳動緩衝液システムは、少なくとも１つのアミン基を有する、少なくとも１つの緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、本発明の不連続電気泳動システムと使用するために選択される泳動緩衝両性電解質は、水性泳動緩衝液と使用される電気泳動ゲルに存在するゲル緩衝両性電解質とは異なる。一実施形態において、選択される泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、使用されるゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い場合がある。
【００５２】
ある特定の好ましい実施形態において、選択される水性泳動緩衝両性電解質は、好ましくは、不連続緩衝液システムの基礎となるだろう。そのようなシステムにおいて、泳動緩衝両性電解質は、部分的に、不連続緩衝液システムのトレーリングイオンの供給源として機能することができる。実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法で使用するのに特に適した泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、ゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い。
【００５３】
ここに記載するシステムおよび方法で使用するのに適した水性泳動緩衝両性電解質の例としては、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＤＩＰＳＯ」）、Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）、ＨＥＰＰＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳＯ」）、もしくは３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）、またはそれらのあらゆる適切な塩が挙げられるが、これらに限定されない。通常、水性泳動緩衝液中に存在する両性電解質の量は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲である。泳動緩衝液は、任意に、ＳＤＳおよびＥＤＴＡに加え、トリス等のさらなる緩衝剤を含むことができる。今般開示される実施形態で使用するのによく適した泳動緩衝液の例としては、２５〜１００ｍＭのＭＥＳ、２５〜１００ｍＭのトリス、約０．０５〜約０．５％のＳＤＳ、および約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
このゲルおよび緩衝液システムは、ゲルマトリクスおよび保存溶液の改善された安定性も有する。このシステムによって調製されるゲルは、アクリルアミド加水分解により性能を損なうことなく、１年を超えて冷蔵下で保管することができる。また、重合開始剤を含まない保存緩衝液および保存ゲル溶液は、性能を損なうことなく、少なくとも数週間、室温で保管することができる。
【００５５】
このゲル製剤の実施形態において、電気泳動ゲルは、中性に近いｐＫａを有する一級有機アミンまたは置換アミン、および上述のモル以下の酸または両性電解質緩衝液を含むゲル緩衝溶液で均一に飽和されるため、緩衝液のｐＨは、約ｐＨ６〜ｐＨ８、好ましくは約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、最も好ましくは６．５〜７．０である。電気泳動ゲルは、あらゆるアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル、またはアガロースとポリアクリルアミドの双方を含有する複合ゲルであり得る。好ましくは、電気泳動ゲルは、約１％〜約６％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される、３％〜２５％（％Ｔ）のアクリルアミドを含む。より好ましくは、このポリアクリルアミドゲルは、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。好ましくは、アミンは、ビス−トリスまたはＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン、最も好ましくはビス−トリスを含む。適切な酸および双性イオン化合物は、トリシン、ビシン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、および３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸である。
【００５６】
ゲルおよび緩衝液システムにおいて、ポリアクリルアミドマトリクスの加水分解によりゲルの性能が低下するにつれて、電流が増加し、移動速度が減少する。荷電種を生み出す、高濃度で存在する中性物質の任意の分解が、電気泳動を乱す傾向があるだろう。この乱れは、生み出された余分な電流から発生し、これは、次に、分離を補助することなくジュール加熱を増加させる。加えて、カソードおよびアノードの緩衝液中に存在しない、ゲル中に形成される陰イオンおよび陽イオンの加水分解産物から、不連続が生じる。ゲル緩衝種または添加物の加水分解は、独立して、ゲルマトリクス組成物から起こる。移動速度の減少は、ゲルのポリアクリルアミドのアルカリに触媒された加水分解により生じる、ゲル中の高い固定電荷に起因する場合がある。固定電荷は、著しい水の向流をもたらし、これは、巨大分子の移動速度を遅らせ得る。低分離能、電流の増加、移動速度の減少を生み出すゲルの不安定性の問題は、中性近くに緩衝したゲルを用い、且つ中性近くのｐＫａを有する緩衝物質を用いることによって解決することができることが分かっている。そのような緩衝液システムは、ゲルが塩基安定性ポリマーで作製されていても、新鮮な、または既製のポリアクリルアミドゲルの、及び尿素またはホルムアミド等のアルカリ不安定性の材料を含有する、新鮮な、または既製のゲルの性能を改善する。
【００５７】
いずれか１つの特定の理論または作用メカニズムに拘束されることなく、アノードおよびカソード緩衝液に対してゲル中に異なる緩衝物質を使用することが有利であることが決定している。一部の実施形態において、陰イオンはアノード緩衝液外に移動しないため、ゲルまたはカソード緩衝液に使用される陰イオン物質は、アノード緩衝液中に存在する必要がない。
【００５８】
これらの緩衝液システムは、保管および泳動中のｐＨ中性のゲル、最低限の費用、および最速の泳動時間の利益を提供する。
【００５９】
本発明の不連続電気泳動ゲルを調製するための種々の方法は、当業者に公知であり、いかなるそのような方法は、限定されることなく電気泳動ゲルを調製するために利用することができる。当業者が不連続電気泳動ゲルを調製するために使用することができる例示的な方法の１つを以下に説明する。しかしながら、本実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、不連続電気泳動ゲルを調製する他の方法が同様に利用され得ることは、容易に理解されるだろう。
【００６０】
実施形態において、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの保存水溶液が調製され得る。任意に、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの単一保存溶液を調製することができる。加えて、スクロース、ゲルアミン、ゲル両性電解質、および酸を含有する塩化物の分離保存水溶液を調製することができる。任意に、ＳＤＳおよび還元剤の分離保存溶液を調製することができる。最後に、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、通常１０重量％）およびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、通常４重量％〜１０％）の保存溶液が調製される。ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤを除く最終組成物が各構成物の正しい濃度が存在するように、各個別の成分の所望の濃度、および適切な希釈液（例えば、水）で調節された容量を有するように、適切な量の種々の保存溶液を混合することができる。この時点で、ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤは、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの重合が開始するように添加される。その後、混合物をガラスまたはプラスチックのプレートの間に成型することができる。ゲルが成型されるプレート間の空間が２ｍｍ〜０．５ｍｍ離れるように、プレートは相互に離され得る。加えて、プレート間の間隔は、少なくとも３方が密閉される。任意に、薄層のブタノールまたは水性緩衝液を重合ゲルの表面に添加して、重合ゲル組成物の表面張力を低減し、重合ゲルの上端が実質的に真っすぐであることを確実にすることができる。重合ゲル組成物をプレート間に成型した後、ゲル組成物を適切な量の時間静止させ、実質的に完全なアクリルアミドおよびビス−アクリルアミドモノマーの重合を達成する。
【００６１】
一部の実施形態において、濃縮用ゲル溶液は別々に調製され、重合した分離用ゲルの上に成型される。種々の他のＳ：Ｒ比も上述および以下に例示するように利用されるが、完全に重合した電気泳動ゲルのＳ：Ｒ比は、通常、約１：４または約１．９：７．５である。濃縮用ゲルが成型された後、しかし、重合反応が進行して完了する前に、１つ以上のくしが、２つのガラス、またはプラスチック製のくしの間の水性重合濃縮用ゲル組成物中に挿入され、これによって、試料が使用直前に添加され得る複数のウェルを画定することができる。あるいは、濃縮用ゲルが使用されない実施形態において、くしを上述の重合水性分離用ゲル混合物中に挿入することができる。通常、必須ではないが、電気泳動ゲルが使用可能になるまで、くしは所定の位置に保持され得、その後くしが取り外され、重合したポリアクリルアミドゲルマトリクスによって良好に画定されたウェルに試料が添加される。
【００６２】
一部の実施形態において、ポリアクリルアミドの比率は、電気泳動ゲルの長さによって変動し得る。種々のそのような勾配ゲルは、当該分野において広く知られており、そのいずれかをここに記載される製剤と使用するために適応させることができる。勾配ゲルは、約２％〜約３０％のポリアクリルアミド、約３％〜約２７％のポリアクリルアミド、約４％〜約２０％のポリアクリルアミド、または約５％〜約１５％のポリアクリルアミドであり得る。一部の実施形態において、勾配ゲルは、約３％〜約１２％のポリアクリルアミド、約３％〜約２０％のポリアクリルアミド、約３％〜約１５％のポリアクリルアミド、約４％〜約１２％のポリアクリルアミド、約４％〜約２０％のポリアクリルアミド、約４％〜約１５％のポリアクリルアミドであり得る。勾配ポリアクリルアミドゲルを調製するのに適したあらゆる方法が、制限なく本明細書の製剤を有する勾配ゲルを調製するために使用することができる。そのような方法は、本実施形態が属する当業者に広く知られている。そのような方法は、例えば、米国特許第６，４８８，８８０号、同第６，２６７，５７９号、同第４，５９４，０６４号、および同第５，０７１，５３１号に開示されている。実施形態において、勾配ゲルは、任意に、上に説明される方法により成型される濃縮用ゲルを含むことができ、本明細書に組み込まれる。
【００６３】
一部の実施形態において、電気泳動ゲルシステムおよび組成物は、ゲルの重合後、気密または水密パッケージに封入することができる。気密または水密パッケージを、成型されたゲルによる水分保持を最大にし、ゲルの脱水化を防ぐように特定的に適応させることができ、これは、その性能に不利に影響を及ぼす場合がある。一実施形態において、各ゲルは、気密または水密パッケージに個別に封入され、キットの一部として顧客に提供され得る。一実施形態において、キットは、複数のそのような個別に封入された電気泳動ゲルを含むことができる。一実施形態において、キットは、２〜１００個の個別に封入された電気泳動ゲル、５〜７５個の個別に封入された電気泳動ゲル、１０〜５０個の個別に封入された電気泳動ゲル、１５〜３５個の個別に封入された電気泳動ゲル、または２０〜２５個の個別に封入された電気泳動ゲルを含み得る。ゲル一式は、それ自体、エンドユーザーに配送され、個別に封入されたゲルを適切な環境で保管するのに適した適切な容器に封入することができる。ここに記載される組成物および方法により調製される電気泳動ゲルは、約１℃〜約２５℃、または約４℃〜約２２℃の範囲の温度で、最大６ヶ月間、最大５ヶ月間、最大４ヶ月間、最大３ヶ月間、最大２ヶ月間、または最大１カ月間、保管安定である。一部の実施形態において、複数の個別に封入された電気泳動分離ゲルを含有するキットは、任意に、１つ以上の適切な水性泳動緩衝液と組み合わせて顧客に提供することができる。水性泳動緩衝液は、使用可能な濃度で提供されるか、または代替的に、ユーザーが必要に応じて希釈することができる濃縮形態で提供することができる。水性泳動緩衝液は、例えば、２０Ｘ保存溶液、１５Ｘ保存溶液、１０Ｘ保存溶液、５Ｘ保存溶液、または２Ｘ保存溶液で提供することができる。
【００６４】
一実施形態において、電気泳動分離ゲルは、ゲルの長さに沿った電場の印加を促進する適切な槽システムの中に取り付けることができる。そのような槽システムは、水性泳動緩衝液が、上に詳細に開示され、本明細書に組み込まれる、ゲルと接触し、電圧がゲルの長手軸全体に沿って等しく印加されることを確実にするように構成される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の一部の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実践においてよく機能するように発明者により発見された技法を示し、よって、その実践の好ましい様式を構成すると考えられ得ることを、当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、１つ以上の変更が開示される特定の実施形態になされても、本発明に記載される実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様の、または類似した結果が得られることを理解するべきである。
【実施例】
【００６６】
以下の実験は、本明細書に具体化される高速泳動ゲル製剤の使用に適した種々の構成物の範囲を決定するために実施された。特に、ゲル緩衝液構成物および塩の種々の組合せを評価する。特に指示のない限り、以下に定義される組成物を有する分離用ポリアクリルアミドゲルは、８％のポリアクリルアミドおよび４．４％のビス−アクリルアミド架橋剤（８％Ｔ／４．４％Ｃ）であった。４％のポリアクリルアミドおよび３．８％のビス−アクリルアミド架橋剤（４％Ｔ／３．８％Ｃ）を有する濃縮用ゲルは、分離用ゲルの上に手動で成型された。特に明記しない限り、分離用ゲルに対する濃縮用ゲルの割合（Ｓ：Ｒ）は約１：４であり、ゲルの厚さは約１ｍｍであり、ゲルはミニゲルカセットに手動で成型された。
【００６７】
以下に記載する種々のゲル製剤を試験するために使用された試料は、示されるレーンで、次のＭａｒｋ１２（商標）、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ、および大腸菌可溶化液（全て、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）のうちの１つ以上から構成された。高処理量（１０μＬ）でのその高塩濃度、およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルを条件付けるための選択の標準としてのその過去の使用により、Ｍａｒｋ１２（商標）が選択された。インスリンのＢ鎖に対応する３．５ｋＤａのバンドの視覚的追跡を容易にするために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓが選択され、そのためゲル泳動の完了を容易に監視することができる。１９〜２２ｋＤａのローダミン標識されたミオグロビンバンドの移動は電圧量により変動できることが知られているため、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）が選択された。例えば、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）タンパク質標準は、ターボモード（すなわち、２５０Ｖ）で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で泳動され、ミオグロビンバンドは、ゲルが通常モード（すなわち、２００Ｖ）で泳動される時より低い見かけ分子量で泳動される。大腸菌可溶化液は、複雑なタンパク質試料の移動を観測するために選択された。
【００６８】
実施例１
検討された最初の試験ゲル製剤は、以下の組成を有する８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルであった：１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４容量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳ。濃縮用ゲルは、以下の組成を有した：分離用ゲルの上に成型される３５７ｍＭのビス−トリスおよび２１０ｍＭの塩化物、ｐＨ６．５。ゲルのＳ：Ｒ比は、１：４であった。
【００６９】
Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素を含む５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で１５分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、各試料に個別に添加されたＰｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定された。泳動の完了時、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）を使用して、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０で染色した。
【００７０】
図１は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。３．５ｋＤａのインスリンＢバンド（図１に示される）は、ゲルの長さの約２／３移動したのみであった。これは、（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ）追跡用色素がより低い分子量タンパク質より速く移動したことを示す。加えて、５５．４ｋＤａグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより速く移動するバンド（図１に示される）は、５５．４ｋＤａバンドよりゆっくり移動するものより拡散しているように見え、６ｋＤａのアプロチニンのバンドおよび３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドの外縁は、ゲルの底に向かって湾曲する。よって、１５分間のゲル泳動時間は改善されるが、このゲル製剤を使用したバンドの分離能は最適ではなかった。
【００７１】
実施例２
５５．４ｋＤａのグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより大きく移動するバンドの濃縮および分離を改善する試みで、Ｓ：Ｒ比を４１：５９に変更したことを除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、基本的に、実施例１に記載されるように成型した。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定され、ゲルは、上述のようにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。
【００７２】
得られたゲル（図２）は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。さらに１分間の泳動時間を必要としたが、３．５ｋＤａのインスリンＢバンドは、ゲルの全長を移動した。最外側レーンの２００ｋＤａのミオシンバンド（すなわち、レーン１、２、９、および１０、星印で示される）は、レーン３〜８に見られる対応するバンドより拡散した。加えて、５５．４ｋＤａグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより速く移動するバンド（図２に示される）は、５５．４ｋＤａバンドよりゆっくり移動するものより拡散し、６ｋＤａのアプロチニンのバンドおよび３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドの外縁は、ゲルの底に向かって湾曲した。
【００７３】
実施例３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、基本的に、実施例２に記載されるように成型し、以下のように変更した：８％（８％Ｔ／４．４％Ｃ）分離用ゲルは、１００ｍＭのビス−トリスおよび１００ｍＭのトリシンを使用して作製された。分離用ゲルの上に成型された４％（４％Ｔ／３．８％Ｃ）濃縮用ゲルは、６．１のｐＨであり、３５７ｍＭのビス−トリスおよび１５０ｍＭの硫酸を使用して作製された。この実施例において、硫酸は、Ｃｌ−よりゆっくり移動するリーディングイオン（ＳＯ４−２）を提供するために使用された。ゲルのＳ：Ｒ比は４１：５９であった。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１８分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、ゲルが上述のようにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された後、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定された。
【００７４】
図３は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。示されるように、濃縮用ゲルに硫酸を使用することは、不十分な結果をもたらし、ＭＥＳ緩衝液の緩衝能および分離能を上回るように思えた。
【００７５】
実施例４
２つの同一の８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルは、各ゲルのビス−トリス量を１７８ｍＭに減らし、塩化物を１０５ｍＭに減らし、トリシンを含まないことを除き、基本的に、実施例２に記載されるように成型された。１７８ｍＭのビス−トリス、ｐＨ６．５の１０５ｍＭの塩化物を含む４％の濃縮用ゲルを各分離用ゲルの上に成型した。ゲルのＳ：Ｒ比は１：３であった。
【００７６】
５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０の各ゲルに添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇ大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加した。ゲルのうちの１つ（図４Ａに示される）をＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、第２のゲル（図４Ｂに示される）をＭＥＳ泳動緩衝液中で１０分間、３５０Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、レーン８の染色済み３．５ｋＤａのバンドの移動を視覚化することにより決定された。上記のようにゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【００７７】
バンドはレーン４および８のバンドより広いが、図４Ａおよび４Ｂに見られる３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドは、図１〜３に示されるゲルより良好な移動特徴を示す。全体的に、３５０Ｖで泳動された図４Ｂに示されるゲルにおいて、より低い分子量に対応するバンドは、３００Ｖで泳動された図４Ａに示されるゲルの対応するバンドより広かった。加えて、３５０Ｖで泳動されたゲルの６６〜６ｋＤａ範囲のバンドで、いくらかのバンド分裂が見られた（図４Ｂ）。
【００７８】
実施例５
ビス−トリスの濃度を２２８ｍＭに増加し、塩化物の濃度を１４０ｍＭに調節し、トリシンの濃度を５０ｍＭに減らし、ＢＥＳを取り除き、分離用ゲルのｐＨが６．５であったことを除き、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルを、基本的に、実施例１に記載されるように成型した。２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、および０重量％のスクロースを含む４％の濃縮用ゲルを分離用ゲルの上に成型した。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加した。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、レーン８の３．５ｋＤａのバンドの移動を視覚化することにより決定された。図５に示されるゲルは、上記のＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。より低い分子量のバンドの拡張は減少し、バンドの鮮鋭度は、５０〜１００ｍＭのトリシンおよび１２０〜１６０ｍＭの塩化物を添加することにより改善された。
【００７９】
実施例６
図６は、市販のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル製剤（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスＭｉｄｉ ｇｅｌｓ、図６Ａ、６Ｃ、および６Ｅ）と、実施例５に記載される試験ゲル製剤、つまり、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭの塩化物、および４％のスクロースを含む５０ｍＭのトリシン、ならびに同じ緩衝組成だがスクロースを含まない４％の濃縮用ゲルを有する、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルとの間の電気泳動の特徴の相違を示し、ここで、Ｓ：Ｒ比は、１．９：５．６である（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆに示される試験ゲル）。以下の試料を調製し、ゲルのそれぞれの上に成型した：レーン１、２、５、６、９、および１０は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン７は、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン３は、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有し、レーン４は、１０μｇの大腸菌抽出物を含有し、レーン８は、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルおよび試験ゲル製剤は、それぞれ、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で３２分間および２９分間、２００Ｖ（図６Ａおよび６Ｂ）で、それぞれ、２０分間よび１９分間、２５０Ｖ（図６Ｃおよび６Ｄ）で、それぞれ、１６分間および１３分間、３００Ｖ（図６Ｅおよび６Ｆ）で泳動された。ゲル泳動の完了後、ゲルは、上述のように、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。
【００８０】
２５０Ｖおよび３００Ｖ（図６Ｃ〜６Ｆ）で、より低い分子量インスリンＢのバンド（矢印で示される）は、試験ゲル製剤（図６Ｄおよび６Ｆ）について、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス（図６Ｃおよび６Ｅ）より鮮鋭な分離能および短い泳動時間を示した。加えて、試験した全ての電圧で、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄの１４および１７ｋＤａのバンドは、試験ゲル製剤（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆ、レーン３、囲み領域）において、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス（図６Ａ、６Ｃ、および６Ｅ、レーン３、囲み領域）より良好な分離能および分離を示した。
【００８１】
実施例７
以下の実験において、試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、以下の記述を除き、基本的に、実施例５および６に記載されるように成型した。実験条件の各組において、合計７つの試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを成型した。試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥ製剤を示される時間の間、３００Ｖで泳動した。各実験において、２つのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘゲルを示される条件（２００Ｖまたは２５０Ｖ）のそれぞれについて試験した。全てのゲルは、示される時間の間、示される電圧において、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で泳動された。泳動の終わりに、各ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色し、撮像した。各バンドの鮮鋭度は、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して決定された。バンドの鮮鋭度は、各バンドの領域を測定し、その領域を各ウェルの幅（ウェルの幅は、一定の１０ウェル／ゲルに保持した）で割ることにより決定された。各バンドの移動（そのＲｆ値により決定される）は、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアおよびＱＣソフトウェアを使用して決定された。
【００８２】
図７において、実施例６に記載されるように８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを成型し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス製剤と比較した。図７Ａは、ＭＥＳ緩衝液中で１４分間、３００Ｖで泳動された、試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから得られた代表的な画像を示し、ここで、レーン１、２、４〜７、９、および１０は５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン３は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン８は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加された。図７Ｂは、ＭＥＳ緩衝液中で３５分間、２００Ｖで泳動された、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加された。図７Ｃは、ゲルがＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２２分間、２５０Ｖで泳動されたことを除き、図７Ｂに記載されるのと同じゲルの代表的な画像を示す。図７Ｄは、各実験条件について得られたＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーの各個別のバンドの相対的鮮鋭度（画素領域により測定される）を要約した棒グラフである。３００Ｖで泳動された試験ゲル製剤は、灰色の棒で示され、２００Ｖで泳動されたＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルは、黒色棒で示され、ターボプロトコルを使用して２５０Ｖで泳動されたＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスは、白色棒として示される。ｘ軸は、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーバンドのどれが分析されたかを示し、ｙ軸は画素領域を示す。図７Ｅは、示される非線形動態ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ｖ２００３．０２ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示す。
【００８３】
図８Ａ〜８Ｅに示される結果は、以下を除き、基本的に、図７Ａ〜７Ｅに記載されるように得られた。図８Ａに示される試験ゲルのポリアクリルアミドの濃度は、１０％に増加され、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動された。図８Ｂおよび８Ｃにおいて、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルを使用し、レーンは以下のように添加された：レーン１、２、５〜６、９、および１０は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン３は、１０μｇの大腸菌可溶化液を含有し、レーン８は、１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有した。図８Ｂにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で３６分間、２００Ｖで泳動され、図８Ｃにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２４分間、２５０Ｖで泳動された。図８Ｄおよび８Ｅに示されるゲルの分析は、図７Ｄおよび７Ｅにおいて記載されるように実施された。
【００８４】
図９Ａ〜９Ｅに示される結果は、以下を除き、基本的に、図８Ａ〜８Ｅに記載されるように得られた。９Ａに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、ＭＥＳ緩衝液中で１７分間、３００Ｖで泳動された４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルとして成型した。図９Ｂおよび９Ｃにおいて、１２ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルを使用し、レーンは、図８Ｂおよび８Ｃについて記載されるように添加された。図９Ｂにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で３７分間、２００Ｖで泳動され、図９Ｃにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２５分間、２５０Ｖで泳動された。図９Ｄおよび９Ｅに示されるゲルの分析は、図７Ｄおよび７Ｅにおいて記載されるように実施された。
【００８５】
実施例８
図１０に示される以下の実験において、２つの試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、図１０Ａに示される分離用ゲルのスクロースの濃度が２重量％に減少され、図１０Ｂに示される分離用ゲルのスクロースの濃度が４重量％に維持されることを除き、基本的に、実施例６から８に記載されるように成型された。図１０Ａにおいて、ゲルは、１５分間、３００Ｖで泳動された。図１０Ｂにおいて、ゲルは、２６分間、３００Ｖで泳動され、図１０Ｃは、図１０Ａおよび１０Ｂに示されるゲルについて得られた相対的なバンドの鮮鋭度を示す。
【００８６】
本特許において、ある米国特許、米国特許出願、および他の資料（例えば、論文）が、参照により組み込まれてきた。しかしながら、そのような米国特許、米国特許出願、および他の資料の本文は、そのような本文と本明細書に記述される他の説明および図面の間に矛盾が存在しない限り、単に参照により組み込まれるものとする。そのような矛盾がある場合、参照によりそのように組み込まれた米国特許、米国特許出願、および他の資料におけるいかなるそのような矛盾する本文は、特定的に、本特許に参照により組み込まれないものとする。
【００８７】
本発明の種々の態様のさらなる修正および代替実施形態は、この説明を考慮すれば当業者に明らかであろう。したがって、この説明は、単なる例示的なものであって、本発明を実行する一般的な様式を当業者に教示する目的のためであると解釈されるべきである。本明細書に示され、記載される本発明の形態は、現時点で好ましい実施形態として取られることを理解する。全てが、本発明に対するこの記述の利点を得た後で当業者に明らかであるように、要素および材料は、本明細書に図示され記載されるものと置換することができ、部分およびプロセスは、入れ替えることができ、本発明のある特色は独立して使用することができる。変更は、以下の請求項に記載される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される要素に行うことができる。加えて、本明細書に記載される特色は、ある実施形態において、独立して組み合わせることができることを理解する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ゲル電気泳動に使用するための技法および製剤に関する。より具体的には、本発明は、実質的に中性のｐＨでの、高速で高分離能のゲル電気泳動のための新規のシステムおよび製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ポリペプチド、およびタンパク質等の生体分子を分離するための一般的な手順である。ゲル電気泳動では、分子は、印加した電場がフィルタリングゲルを通ってそれらを移動させる速度によってバンドに分離される。
【０００３】
この技法に使用される基本的な装置は、ガラス管に密閉された、またはガラスもしくはプラスチックプレートの間にスラブとして挟まれたゲルから成る。ゲルは、開放型分子ネットワーク構造を有し、導電性の塩の緩衝溶液で飽和された細孔を画定する。ゲルを通るこれらの細孔は、移動する巨大分子の通過を可能にするのに十分に大きい。
【０００４】
ゲルは、ゲルと電源のカソードまたはアノードとの間を電気的に接続する緩衝溶液と接触するチャンバーに設置される。巨大分子および追跡用色素を含有する試料は、ゲルの上部に設置される。電位をゲルに印加し、試料巨大分子および追跡用色素をゲルの底部に向かって移動させる。追跡用色素がゲルの端部に達する直前に電気泳動を停止する。その後、分離した巨大分子のバンドの位置を決定する。既知の大きさの追跡用色素および巨大分子と比較して特定のバンドにより移動した距離を比較することにより、他の巨大分子の大きさが決定される。
【０００５】
ゲルを通って巨大分子が移動する速度は、ゲルの多孔度、巨大分子の大きさおよび形状、巨大分子の電荷密度、ならびに印加される電界強度の４つの主要因に依存する。電気泳動システムは、一般に、ゲル間および試料間で再現可能であるように、これらの要因を制御する試みである。しかしながら、ゲル間の均一性を維持することは、これらの要因のそれぞれがゲルシステムの化学における多くの可変要素に敏感であるため、困難である。
【０００６】
ポリアクリルアミドゲルは、一般に、電気泳動に使用される。ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＰＡＧＥは、ゲルが光学的に透明であり、電気的に中性であり、様々な細孔の大きさで作製することができるため、一般的である。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と共に、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとして使用される時、巨大分子の電荷密度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をシステムに添加することにより制御される。ＳＤＳ分子は巨大分子と会合し、それらに均一な電荷密度を付与し、実質的に、あらゆる自然分子電荷の作用を無効にする。
【０００７】
従来、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが通常注入され、塩基性ｐＨで泳動された。タンパク質の分離に利用される最も一般的なＰＡＧＥ緩衝液システムは、ＯｒｎｓｔｅｉｎおよびＤａｖｉｓにより開発され（Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：３２１（非特許文献１）およびＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：１２１：４０４（非特許文献２））、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８６（非特許文献３））によってＳＤＳと共に使用するために改変されたものである。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液システムは、０．３７５Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン（トリス）から成り、分離ゲル中でＨＣｌを用いてｐＨ８．８に滴定される。濃縮用ゲルは０．１２５Ｍのトリスから成り、ｐＨ６．８に滴定される。アノードおよびカソード泳動緩衝液は、０．０２４Ｍのトリス、０．１９２Ｍのグリシン、０．１％のＳＤＳを含有する。別の緩衝液システムは、Ｓｃｈａｅｇｇｅｒおよびｖｏｎ Ｊａｇｏｗにより開示される（Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９（非特許文献４））。
【０００８】
Ｕｐｄｙｋｅらによる米国特許第７，４２２，６７０号（特許文献１）、同第６，７８３，６５１号（特許文献２）、同第６，１４３，１５４号（特許文献３）、同第６，０５９，９４８号（特許文献４）、同第６，０９６，１８２号（特許文献５）、同第６，１６２，３３８号（特許文献６）、同第５，９２２，１８５号（特許文献７）、および同第５，５７８，１８０号（特許文献８）は、分離が中性のｐＨで生じ、タンパク質が実質的に還元状態に留まる、ゲルおよび不連続緩衝液システムを説明する。ゲルシステムは、５．５〜７．５の範囲のｐＫを有するゲルアミンを含み、ゲル緩衝液のｐＨは、中性の範囲（ｐＨ６〜８）である。ゲルシステムは、ゲルマトリクスおよび保存溶液の改善された安定性を示す。ゲルは、実質的な性能の損失なしに１年を超えて冷蔵下で保存することができる。ゲルシステムは、２〜２００ｋＤａの範囲の分離を網羅することができるタンパク質の高分離能を可能にする。しかしながら、ゲルシステムの分離速度は改善することができ、これらのゲル製剤の分離能は、電界強度が５０％増加する時、悪化する。
【０００９】
低コンダクタンスを生む中性ｐＨの不連続緩衝液システムでタンパク質分離能を維持しながら、または増加させながら、大幅に短縮された泳動時間で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質試料を泳動することができ、さらに現在の電気泳動ゲル製剤より約５０％大きい電界強度を使用して、そのような結果を達成するのに十分な緩衝能を維持する泳動ゲル製剤が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，４２２，６７０号
【特許文献２】米国特許第６，７８３，６５１号
【特許文献３】米国特許第６，１４３，１５４号
【特許文献４】米国特許第６，０５９，９４８号
【特許文献５】米国特許第６，０９６，１８２号
【特許文献６】米国特許第６，１６２，３３８号
【特許文献７】米国特許第５，９２２，１８５号
【特許文献８】米国特許第５，５７８，１８０号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１２１：３２１
【非特許文献２】Ｄａｖｉｓ，Ｂ．Ｊ．（１９６４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．：１２１：４０４
【非特許文献３】Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２７，６８０−６８６
【非特許文献４】Ｓｃｈａｅｇｇｅｒ，Ｈ．ａｎｄ ｖｏｎ Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７，１６６，３６８−３７９
【発明の概要】
【００１２】
ここに記載される実施形態において、高電圧および短縮された泳動時間の条件下で、ユーザーが電気泳動実験を実施することを可能にする電気泳動システム、製剤、キット、および方法を説明する。システム、製剤、および方法は、当該分野において既に公知であるものを改良し、ユーザーが、現在の利用可能なシステムおよび製剤より高度の分離能および短縮された時間量で、電気泳動的に分離されたタンパク質試料を生成することを可能にする。今般開示される実施形態によって実践される電気泳動システム、製剤、または方法は、例えば、当該分野において既に使用される比較可能なシステムより５０％大きい電界強度で泳動され得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステム、方法、および製剤によって調製される電気泳動ゲルは、２２５Ｖ超、２５０Ｖ超、２７５Ｖ超、３００Ｖ超、３２５Ｖ超、または３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステム、方法、および製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約１２ｖ／ｃｍ〜約２０ｖ／ｃｍ、または少なくとも１２．０〜１３．０Ｖ／ｃｍ、少なくとも１３．５〜１４Ｖ／ｃｍ、少なくとも１５．０〜１５．５Ｖ／ｃｍ、少なくとも１６．０〜１７．０Ｖ／ｃｍ、または少なくとも１７．５〜１８．５Ｖ／ｃｍの範囲の電界強度を使用することができる。
【００１３】
一部の実施形態において、電気泳動実験を実施するために必要とされる時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。
【００１４】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。
【００１５】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電力を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。
【００１６】
ここに記載される実施形態による電気泳動システムおよび方法は、不連続緩衝液システムの一部であり得る。
【００１７】
電気泳動システムは、ポリアクリルアミド電気泳動分離ゲルを含むことができる。一部の実施形態において、分離ゲルは、分離用ゲル部分、及び分離用部分の上に成型された任意の濃縮用ゲル部分を含む場合がある。一実施形態において、濃縮用部分に存在するポリアクリルアミド、架橋剤、またはポリアクリルアミドおよび架橋剤の双方の比率は、分離用部分に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤の比率とは異なる場合がある。
【００１８】
一実施形態において、分離用部分は、ビス−アクリルアミド等の約１％〜約６％の適切な架橋剤と組み合わせて、約３％〜約２５％のポリアクリルアミドを含むことができる。一実施形態において、分離用ゲル部分は、約２％〜約５％の架橋剤を使用して重合することができる。一実施形態において、分離用ゲルは、最大約２５％のポリアクリルアミド、最大約２０％のポリアクリルアミド、最大約１５％のポリアクリルアミド、最大約１２％のポリアクリルアミド、最大約１０％のポリアクリルアミド、最大約８％のポリアクリルアミド、最大約６％のポリアクリルアミド、最大約５％のポリアクリルアミドを含むことができる。
【００１９】
一実施形態において、電気泳動分離ゲルは、任意に、濃縮用部分、分離用部分、または濃縮用部分および分離用部分の双方に、例えば、スクロース、グリセロール等の稠密化剤（ｄｅｎｓｉｔｙ ａｇｅｎｔ）、または類似する非イオン性稠密化剤を含むことができる。製剤中の稠密化剤の量は、約０〜約１０容量％、約０．５〜約５容量％、約１．０容量％〜約３．５容量％、または約１．５容量％〜約２容量％の範囲であり得る。一実施形態において、ゲル製剤に存在する密度濃度は、最大約１０容量％、最大約８．５容量％、最大約５容量％、最大約４．５容量％、最大約４容量％、最大約３．５容量％、最大約３容量％、最大約２．５容量％、最大約２容量％、最大約１．５容量、または最大約１．０容量％であり得る。
【００２０】
一実施形態において、少なくとも分離用ゲル部分は、ゲル両性電解質と組み合わせてゲルアミン緩衝液を有する緩衝液システムを含むことができる。代替的な実施形態において、濃縮用ゲル部分および分離用ゲル部分の双方は、ゲル両性電解質と組み合わせてゲルアミン緩衝液を含むことができる。
【００２１】
種々のゲルアミン緩衝液を、本明細書に記載されるゲル組成物の調製に使用することができる。本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムに使用するのに特に適しているゲルアミン緩衝液は、一級有機アミンまたは置換アミンを含むことができる。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。本明細書に記載される電気泳動システムおよび方法に使用するのに適しているゲルアミン緩衝液の例としては、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（以後、「ビス−トリス」）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（以後、「ビス−トリスプロパン」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後、「トリス」）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｉｏｌａｍｉｎｅ）、または約５．５〜約７．５の範囲でｐＫａ値を有する任意のそれらの誘導体もしくは塩を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの範囲、または約１６５ｍＭ〜約３２５ｍＭの範囲であり得る。通常、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満であり得る。ある非限定的な実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲であり得る。一部の実施形態において、選択されるゲルアミン緩衝液は、アクリルアミド成分を重合してポリアクリルアミドマトリクスを形成した後、ゲルマトリクスに固定することができる。
【００２２】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムに使用するのに特に適しているゲル両性電解質は、アミン基を有し、水溶液中で双性イオンを形成することができるあらゆる生物学的緩衝液を含む。一部の実施形態において、本発明のゲル製剤に使用するのによく適したゲル両性電解質は、ゲルアミンのｐＫａより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫ値を有する。非限定的な例として、次の例示的なゲル両性電解質は、ここに記載される実施形態で使用されることが意図される：Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン（以後、「トリシン」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、ジエチルオールグリシン（以後、「ビシン」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（以後、「ＰＩＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＭＯＰＳＯ」」）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＡＣＥＳ」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＢＥＳ」）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＴＥＳ」）、−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＥＳ」）、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＰＳ」）、およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以後、「ＴＡＰＳ」）。当然のことながら、少なくとも１つのアミンまたは置換アミンを有し、ゲルに使用するために選択されるゲルアミンより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫａをさらに有するあらゆるゲル両性電解質が、ここに記載される実施形態の実践において、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。両性電解質は、約２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度でゲル製剤に存在し得る。
【００２３】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動分離ゲルおよびシステムは、電気泳動ゲルの所望のｐＨが達成されるように、適切な酸で滴定することができる。一実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが実質的に中性（すなわち、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲）であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲、約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲、または約ｐＨ６．２〜約ｐＨ６．８の範囲であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨを実質的に中性、例えば、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、または約７．２のｐＨに調節するために、十分な量の酸が使用され得る。通常、選択される酸は、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンの供給源を含むことができるが、これらに限定されない。ゲル製剤に存在する陰イオンは、部分的に、不連続ゲルシステムのリーディングイオン（ｌｅａｄｉｎｇ ｉｏｎ）として機能することができる。本実施形態のゲル緩衝液システムの滴定に使用するのに適した酸の例は、塩酸（ＨＣｌ）であるが、これに限定されない。一実施形態において、電気泳動ゲルは、一級アミンおよび／または両性電解質のおよそ半分程度のＨＣｌ（モル基準で）で滴定することができるため、緩衝液のｐＨはおよそ中性である。一部の実施形態において、電気泳動ゲルの滴定に使用される塩化物イオンの最終濃度は、約９５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭ、または約１４０ｍＭの範囲であり得る。
【００２４】
一実施形態において、電気泳動システムは、さらに、水性泳動緩衝液を含むことができる。水性泳動緩衝液は、泳動緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、泳動緩衝液は、ゲル両性電解質とは異なる両性電解質を含むことができる。一実施形態において、泳動緩衝両性電解質は、少なくとも１つのアミン基を有する少なくとも１つの有機緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法に使用するのに特に適している泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、ゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明の電気泳動システムに使用するために選択される水性泳動緩衝両性電解質は、不連続緩衝液システムの基礎となり得る。そのようなシステムにおいて、緩衝両性電解質は、部分的に、不連続緩衝液システムのトレーリングイオン（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｉｏｎ）の供給源として機能することができる。
【００２６】
ここに記載するシステムおよび方法で使用するのに適した水性泳動緩衝両性電解質の例としては、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＤＩＰＳＯ」）、Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）、ＨＥＰＰＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳＯ」）、もしくは３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）、またはそれらのあらゆる適切な塩が挙げられるが、これらに限定されない。通常、水性泳動緩衝液中に存在する両性電解質の量は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲である。泳動緩衝液は、任意に、ＳＤＳおよび／またはＥＤＴＡに加え、トリス等のさらなる緩衝剤を含むことができる。今般開示される実施形態で使用するのによく適した泳動緩衝液の例としては、２５〜１００ｍＭのＭＥＳ、２５〜１００ｍＭのトリス、約０．０５〜約０．５％のＳＤＳ、および約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
一部の実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法によって調製される不連続緩衝液電気泳動システムは、２５０Ｖを超える電圧で泳動され、３０分未満で試料の完全な分離を達成することができる。一部の実施形態において、ここに記載されるシステムおよび製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約２２５Ｖ超、約２５０Ｖ超、約２７５Ｖ超、約３００Ｖ超、約３２５Ｖ超、または約３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。一部の実施形態において、記載されるシステムおよび方法ならびにゲルを使用する電気泳動実験を実施するために必要な時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。
【００２８】
一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。例えば、一部の実施形態において、本発明のゲル製剤は、最大約２００ｍＡ、最大約１７５ｍＡ、最大約１５０ｍＡ、最大約１２５ｍＡ、または最大約１１５ｍＡの定電流を使用して電気泳動に供することができる。
【００２９】
そのような条件下で本発明の電気泳動分離システムおよび製剤を使用して電気泳動に供される試料は、実質的に、現在使用されているゲル製剤と同程度の分離を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
上記の簡単な説明ならびに本発明の方法および装置のさらなる目的、特色、および利点は、添付の図面と組み合わされる時、本発明による現時点で好ましいが、例示的である実施形態の以下の詳細な説明を参照することによって、より完全に理解されるであろう。
【図１】３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４重量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１５分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図２】３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４重量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝４１：５９）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図３】３５７ｍＭのビス−トリス、１５０ｍＭのＨ２ＳＯ４、ｐＨ６．１を有する４％の濃縮用ゲルを、１００ｍＭのビス−トリス、１００ｍＭのトリシン、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝４１：５９）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを、ＭＥＳ緩衝液中で１８分間、３００Ｖで分離し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。
【図４】図４Ａは、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、トリシンなし、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：３）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図４Ｂは、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、１７８ｍＭのビス−トリス、１０５ｍＭのＣｌ−、トリシンなし、および４重量％のスクロースを有する８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：３）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１０分間、３５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【図５】２２８ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、および４重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示す。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【図６】図６Ａは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮＯＶＥＸ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で３２分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｂは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２９分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。図６Ｃは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２０分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｄは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１９分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。図６Ｅは、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した、代表的なＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルを示す。図６Ｆは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜６、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン７に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色する。
【図７】図７Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．５％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの８％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１４分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図７Ｂは、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加され、ゲルはＭＥＳ緩衝液中で３５分間、２００Ｖで泳動され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。図７Ｃは、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加され、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２２分間、２５０Ｖで泳動され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。図７Ｄは、図７Ａ（灰色の棒）、図７Ｂ（黒色棒）、および図７Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図７Ｅは、示される非線形動態ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ｖ２００３．０２ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図８】図８Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．７５％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１０％の分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｂは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で３６分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｃは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で２４分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図８Ｄは、図８Ａ（灰色の棒）、図８Ｂ（黒色棒）、および図８Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図８Ｅは、示されるＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図８Ａ、図８Ｂ、および図８Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％のスクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、１．５〜２％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの４〜１２％の勾配ゲルの上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１７分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｂは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で３７分間、２００Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｃは、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルの代表的な画像を示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、４〜７、９、および１０に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン３に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加し、ゲルをＭＥＳ緩衝液中で２５分間、２５０Ｖで泳動し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。図９Ｄは、図９Ａ（灰色の棒）、図９Ｂ（黒色棒）、および図９Ｃ（白色棒）に記載されるゲル製剤を使用した、７つの独立した実験を平均した、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。図９Ｅは、示されるＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃに記載される各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは、３５７ｍＭのビス−トリス、２１０ｍＭのＣｌ−、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、２％重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１２％分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜１０に添加する。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１５分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。図１０Ｂは、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、０％スクロース、ｐＨ６．５を有する４％の濃縮用ゲルを、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、４％重量％のスクロースを有するが、ＢＥＳなしの１２％分離用ゲル（Ｓ：Ｒ＝１：４）の上に成型した、一実施形態による代表的な試験ゲルを示し、ここで、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜１０に添加する。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２６分間、３００Ｖで泳動し、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎでゲルを染色した。図１０Ｃは、図１０Ａ（黒色の棒）および図１０Ｂ（斜線棒）に記載されるゲル製剤を使用した、４つの独立した実験を平均したＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカー一式の各個別のバンド（画素領域により測定）の相対的な鮮鋭度を示す棒グラフである。Ｘ軸はバンド番号を示し、バンド番号１は、２００ｋＤａのＭａｒｋ１２（商標）のバンドであり、バンド１２は、２．５ｋＤａのバンドである。
【００３１】
本発明は、種々の修正および変形形態が可能であるが、その特定の実施形態を図面において例として示し、本明細書で詳細に説明する。図面は原寸に比例しない場合がある。図面およびそれに対する詳細な説明は、本発明を開示される特定の形態に限定することを意図するものではなく、むしろ、添付の請求項により定義される本発明の趣旨および範囲内に含まれる全ての修正、均等物、および変形を網羅することが意図されることを理解するべきである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施形態の詳細な説明
定義
本明細書全体を通して使用される用語は、一般に、各用語が使用される当該分野、本発明の内容内、および特定の内容において、通常の意味を有する。本発明のデバイスおよび方法、ならびにそれらをどのように作製し、使用するかを説明することによって、実施者にさらなる手引きを提供するために、特定の用語が以下、または本明細書の別の箇所で説明される。同様のことに対する言い方が一つではないことが理解されるだろう。ゆえに、代替的な用語および同義語が、本明細書で説明される用語のいずれか１つ以上について使用されてもよく、その用語が本明細書において詳記されているか、またはより詳細に説明されているかどうかに関わらず、いかなる特別な意味合いも課されるものではない。特定の用語について、同義語が提供される。１つ以上の同義語の説明が、他の同義語の使用を妨げることはないものとする。本明細書で説明されるいずれかの用語の例を含む、本明細書のいずれかの箇所での例の使用は、例示的であるに過ぎず、本明細書に記述される実施形態のいずれかの、またはいかなる例示的用語の範囲および意味をも決して制限するものではない。
【００３３】
本明細書に使用される、「不連続緩衝液」、「不連続システム」、および「不連続緩衝液システム」という用語は、一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動システムに使用される２つの水性緩衝液システムのうちの１つを指す。不連続緩衝液システムは、機能的および化学的に、連続緩衝液システムとは異なる。通常、連続システムは、単一の分離ゲルのみを有し、槽およびゲルで同じ緩衝液を使用する。不連続システムでは、濃縮用ゲルと呼ばれる非制限的な粗孔ゲルが、分離ゲル（時折、「分離用ゲル」とも呼ばれる）の上に重ねられる。各ゲルは、同じ、または異なる緩衝液で作製することができ、槽の緩衝液は、ゲルの緩衝液とは異なる。不連続性は、早く移動するリーディングイオン（例えば、塩化物）と、ゆっくり移動するトレーリングイオン（ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、グリシン、またはトリシン）のイオン移動度の相違によって作り出される。分析物分子の明瞭な開始ゾーンを作り出す不連続システムの濃縮作用により、不連続システムで得られる分離能は、分析物の希釈溶液を含有する試料において、連続システムで得られる分離能より非常に高い。連続緩衝液システムと不連続緩衝液システムの相違は、本発明が属する分野の当業者に周知である。
【００３４】
「バンド鮮鋭度」という用語は、それらが種々のゲル製剤に現れる移動したバンドの鮮鋭度を比較するために使用される相対的用語である。本用語は、特に、種々のゲル製剤のうちの２つ以上の間の相対的バンド鮮鋭度を比較する時に使用される。バンド鮮鋭度を決定するために、種々の方法を使用することができる。例えば、得られる分離能の程度により、バンド鮮鋭度、またはバンド鮮鋭度が改善される程度が、視覚的検査により決定されてもよい。バンド鮮鋭度のより定量的推定を得るために、ユーザーは、ゲル撮像ソフトウェアを利用することができる。当該分野において通常使用されるゲル分析ソフトウェアの例としては、例えば、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）、ＧＥＬ−ＰＲＯ（商標）分析器（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＬＡＢＩＭＡＧＥ（登録商標）１Ｄ Ｌ３００ゲル分析ソフトウェア（ＬａｂＩｍａｇｅ，Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。バンド鮮鋭度は、ゲルの各分離されたバンドの領域を測定し、領域を各ウェルの幅（一般に、一定である）で割ることにより決定することができる。バンド鮮鋭度を決定する別の方法は、ゲル分析アルゴリズムにより検出される個別のピークの幅を直接測定することであってもよい。
【００３５】
ユーザーが、高電圧および短縮された泳動時間の条件下で電気泳動実験を実施できる、電気泳動システム、製剤、および方法を本明細書で説明する。システム、製剤、および方法は、当該分野において既に公知であるものを改良し、ユーザーが、現在の利用可能なシステムおよび製剤より高分離能および短縮された泳動時間量で、電気泳動的に分離されたタンパク質を生成することを可能にする。ここで開示される実施形態によって実践される電気泳動システム、製剤、または方法は、当該分野において既に使用される比較可能なシステムより５０％大きい電界強度で泳動することができる。例として、ここに記載されるシステムおよび製剤によって調製される電気泳動ゲルは、約２２５Ｖ超、約２５０Ｖ超、約２７５Ｖ超、約３００Ｖ超、約３２５Ｖ超または約３５０Ｖ超の電圧で泳動することができる。電気泳動を実施するために必要とされる時間は、約３０分未満、約２０分未満、約１５分未満、または約１２分未満に短縮することができる。一部の実施形態において、電気泳動は、定電流を使用して、本開示の基礎となるゲル製剤を使用して実施することができる。例えば、一部の実施形態において、本発明のゲル製剤は、最大約２００ｍＡ、最大約１７５ｍＭ、最大約１５０ｍＭ、最大約１２５ｍＭ、または約１１５ｍＭの定電流を使用する電気泳動に供することができる。
【００３６】
実施形態において、電気泳動システムは、ゲルおよび緩衝液システムを含むことができ、分離は、実質的に中性のｐＨで生じる。いかなる特定の理論またはメカニズムにも拘束されることなく、ｐＨ中性の電気泳動システムの使用は、電気泳動に供される試料（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物等）内の生体分子が、完全に、または実質的に減少せず、加水分解されないままであることを確実にすると考えられている。好都合に、中性のｐＨでは、タンパク質の一級アミノ基は、非重合アクリルアミドとの反応が低く、それによって、より高い分離能および改善されたバンド鮮鋭度を可能にする。加えて、中性のｐＨでは、チオール基は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが従来実施されるよりアルカリ性の条件下よりも酸化しにくい。本開示の基礎となるゲル製剤は、一部の実施形態において、不連続緩衝液システムの一部として使用される時に最適に機能し得る。不連続緩衝液システムは、アノードチャンバー、カソードチャンバー、またはアノードおよびカソードチャンバーの双方において、ゲルに存在する緩衝液とは異なる水性緩衝液を使用するものである。水性泳動緩衝液の濃度は、電気泳動ゲルの緩衝液濃度とは異なっていてもよい。一部の実施形態において、本開示によるゲル製剤は、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルを含むことができる。
【００３７】
得られるゲル電気泳動システムは、高電圧でゲルマトリクスおよび緩衝溶液の改善された安定性を示し、それによって、バンド分離能を損なうことなく従来の電気泳動システムより高電圧でのゲル電気泳動の実施を可能にする。今般記載される製剤および方法によって調製されるゲルは、性能を損なうことなく、少なくとも最大約１６ヵ月間冷蔵下で保管することができる。加えて、重合開始剤を含まない保存緩衝液および保存ゲル溶液は、性能を損なうことなく、数週間以上室温で保管することができる。本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用することにより、例えば、８％のポリアクリルアミドゲルは、１５分未満で、約２〜２５０ｋＤａの分離範囲でタンパク質試料を分離することができる。
【００３８】
一部の実施形態において、ゲル製剤は、濃縮用ゲルおよび分離用ゲルを含むことができる。分離用ゲルに対する濃縮用ゲルの割合（Ｓ：Ｒとも表示される）は、約０．５：９．５、約１：９、約１．５：８．５、約２：８、約２．５：７．５、約３：７、約３．５：６．５、約４：６、約４．５：５．５、または約１：１であることができる。濃縮用ゲルおよび分離用ゲルという用語の意味は、不連続ゲル電気泳動システムの内容について使用される時、当該分野の通常の技能を有する実施者に周知である。通常、濃縮用ゲル中に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤（例えば、ビス−アクリルアミド）の比率は、分離用ゲル中に存在するポリアクリルアミドおよび／または架橋剤の比率より低い場合がある。一部の実施形態において、濃縮用ゲル中に存在するポリアクリルアミドの比率は、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満である。
【００３９】
電気泳動システムおよび製剤の一実施形態において、約３％〜約２５％（％Ｔ）のアクリルアミドの分離用ポリアクリルアミドゲルは、ビスアクリルアミド等の、約１％〜約６％の適切な架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。実施形態において、ゲルは、ゲル緩衝液の存在下、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。実施形態において、ポリアクリルアミドゲルは、２５％のアクリルアミド、２４％のアクリルアミド、２３％のアクリルアミド、２２％のアクリルアミド、２１％のアクリルアミド、２０％のアクリルアミド、１９％のアクリルアミド、１８％のアクリルアミド、１７％のアクリルアミド、１６％のアクリルアミド、１５％のアクリルアミド、１４％のアクリルアミド、１３％のアクリルアミド、１２％のアクリルアミド、１１％のアクリルアミド、１０％のアクリルアミド、９％のアクリルアミド、８％のアクリルアミド、７％のアクリルアミド、６％のアクリルアミド、または５％のアクリルアミドを含むことができる。
【００４０】
電気泳動システムおよび製剤の実施形態において、化学的還元環境を維持するために、ゲル、緩衝液、または添加液のうちの１つ以上に還元剤を任意に含むことができる。種々の適切な還元剤が当該分野において公知であり、それらのいずれも本明細書に開示される実施形態で使用するのに適している。例として、チオグリコール酸（ＴＧＡ）または亜硫酸水素ナトリム等の還元剤が製剤に添加され得るが、これらに限定されない。そのような還元剤の適切な濃度範囲は、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、または約５ｍＭ〜約７．５ｍＭであり得る。任意の還元剤を含む一部の実施形態において、還元剤は、ゲル泳動緩衝液に添加することができる。
【００４１】
好ましくはあるが、ある非限定的な実施形態において、ＳＤＳは、実質的に電気泳動ゲルに含まれず、代わりに泳動緩衝液および／または添加液中に提供される。種々の適切な泳動緩衝液が、以下により詳細に記載される。
【００４２】
一部の実施形態において、ここに記載される実施形態によるポリアクリルアミドゲルは、一級有機アミン、または一もしくは二置換アミン緩衝液を含むことができる。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。ゲルアミン緩衝液のｐＫａ範囲は、中性に近く、通常、約５〜約８の範囲、約５．５〜約７．５の範囲、約６〜約７の範囲、約６．２〜約６．８の範囲、または約６．５であり得る。本明細書に記載される電気泳動システムおよび方法に使用するのに適したゲルアミン緩衝液の例としては、ビス（２−ヒドロキシエチル）−イミノ−トリス（ヒドロキシメチル）−メタン（以後、「ビス−トリス」）、１，３−ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン（以後、「ビス−トリスプロパン」）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以後、「トリス」）、トリエタノールアミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｉｏｌａｍｉｎｅ）、または約５．５〜約７．５の範囲でｐＫａ値を有するそれらの誘導体もしくは塩を含むが、これらに限定されない。当然のことながら、少なくとも１つの一級アミン、または置換アミンを有し、５．５〜７．５の範囲のｐＫａをさらに有するあらゆるゲルアミン緩衝液が、ここに記載される実施形態の実践中、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。
【００４３】
一部の実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１５０ｍＭ〜約３５０ｍＭの範囲、または約１６５ｍＭ〜約３２５ｍＭの範囲であり得る。通常、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満であり得る。ある非限定的な実施形態において、ゲル中に存在するゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲であり得る。
【００４４】
一部の実施形態において、ゲルアミン緩衝液は、その他の水性成分が混合される時、および重合反応開始前に、水性溶液として、分離用ゲル、濃縮用ゲル、または分離用ゲルおよび濃縮用ゲルの双方に直接添加することができる。あるいは、ゲルアミン緩衝液は、所望の濃度のゲルアミン緩衝液を含有する水性溶液に重合したゲルを浸漬し、ゲルアミン緩衝液を重合したゲルマトリクスに浸透させることによりゲルマトリクスに組み込むことができる。
【００４５】
一部の実施形態において、電気泳動システムの基礎となるポリアクリルアミドゲルは、上述のゲルアミンと組み合わせてゲル両性電解質を含むことができる。本発明のゲル製剤と使用するのに適したゲル両性電解質は、アミン基を有し、水性溶液中で双性イオンを形成することができるあらゆる生物学的緩衝液を含み得るが、これに限定されない。一部の実施形態において、本発明のゲル製剤と使用するのによく適したゲル両性電解質は、ゲルアミンのｐＫａ値より約１．５ｐＨ単位大きいｐＫ値を有する。非限定的な例として、次の例示的なゲル両性電解質は、ここに記載される実施形態で使用されることが意図される：Ｎ−（トリ（ヒドロキシメチル）メチル）グリシン（以後、「トリシン」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、ジエチルオールグリシン（以後、「ビシン」）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）（以後、「ＰＩＰＥＳ」）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＭＯＰＳＯ」）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＡＣＥＳ」）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＢＥＳ」）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（以後、「ＴＥＳ」）、−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＥＳ」）、２−アミノ−メチル−１，３−プロパンジオール３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（以後、「ＨＥＰＰＳ」）、およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（以後、「ＴＡＰＳ」）。当然のことながら、少なくとも１つのアミンまたは置換アミンを有し、ゲルに使用するために選択されるゲルアミンより約１．５ｐＨ単位大きいｐＫａをさらに有するあらゆるゲル両性電解質が、ここに記載される実施形態の実践において、それらの趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることは、当業者には容易に明らかであろう。両性電解質は、約２５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約４５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲の濃度でゲル製剤に存在し得る。
【００４６】
一部の実施形態において、ゲル両性電解質は、その他の水性成分が混合される時、かつ重合反応開始前に、水性溶液として、分離用ゲル、濃縮用ゲル、または分離用ゲルと濃縮用ゲルの双方に直接添加することができる。あるいは、ゲル両性電解質は、所望の濃度のゲル両性電解質を含有する水性溶液に重合したゲルを浸漬し、ゲル両性電解質を重合したゲルマトリクスに浸透させることによりゲルマトリクスに組み込むことができる。
【００４７】
一部の実施形態において、本発明の緩衝液ゲルシステムおよび製剤は、電気泳動ゲルの所望のｐＨが達成されるように、適切な酸で滴定することができる。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが実質的に中性（すなわち、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲）であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨが約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．５の範囲、約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲、または約ｐＨ６．２〜約ｐＨ６．８の範囲であるように、十分な量の酸が使用され得る。実施形態において、電気泳動ゲルのｐＨを実質的に中性、例えば、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、または約７．２のｐＨに調節するために、十分な量の酸が使用され得る。排他的ではないが、通常、選択される酸は、塩化物イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンの供給源を含むことができる。ゲル製剤に存在する陰イオンは、部分的に、不連続ゲルシステムのリーディングイオンとして機能することができる。本発明の実施形態のゲル緩衝液システムの滴定に使用するのに適した酸の例としては、塩酸（ＨＣｌ）であるが、これに限定されない。実施形態において、電気泳動ゲルは、一級アミンおよび／または両性電解質のおよそ半分程度のＨＣｌ（モル基準で）で滴定することができるため、緩衝液のｐＨはおよそ中性である。一部の実施形態において、電気泳動ゲルの滴定に使用される塩化物イオンの最終濃度は、約９５ｍＭ〜約１７５ｍＭ、約１２０ｍＭ〜約１６０ｍＭ、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭ、または約１４０ｍＭの範囲であり得る。
【００４８】
一部の実施形態において、不連続緩衝液システムでリーディングイオンとして機能する陰イオンは、濃縮用ゲル、分離用ゲル、または濃縮用ゲルと分離用ゲルの双方に存在することができる。ここに記載されるゲル製剤に使用するのに適したリーディングイオンの例としては、塩化物、リン酸イオン、硫酸イオン、または酢酸イオン等の陰イオンを含むことができるが、これらに限定されない。そのような陰イオンの供給源は、ＨＣｌまたはあらゆる酸ハロゲン化物、リン酸、硫酸、または酢酸を含むことができる。
【００４９】
一実施形態において、リーディングイオンの濃度は、分離用ゲルより濃縮用ゲルにおいて高い場合がある。別の実施形態において、リーディングイオンの濃度は、実質的に、分離用ゲルと濃縮用ゲルにおいて同じであり得る。一部の実施形態において、濃縮用ゲル中のリーディングイオンの濃度は、最大約３５０ｍＭ、最大約３００ｍＭ、最大約２５０ｍＭ、最大約２００ｍＭ、最大約１５０ｍＭ、最大約１２５ｍＭ、最大約１１０ｍＭ、最大約１００ｍＭ、または最大約７５ｍＭであり得る。
【００５０】
一部の実施形態において、ここに記載される実施形態による電気泳動ゲルは、任意に、例えば、スクロース、グリセロール、または類似する剤等の稠密化剤を含むことができる。製剤に含まれる稠密化剤の量は、約０〜約８重量％、約０．５〜約５重量％、約１．０重量％〜約３．５重量％、または約１．５重量％〜約２重量％の範囲であり得る。実施形態において、ゲル製剤中に存在するスクロースの濃度は、最大約１０％、最大約８．５％、最大約５％、最大約４．５％、最大約４％、最大約３．５％、最大約３％、最大約２．５％、最大約２％、最大約１．５％、最大約１％、または最大約０．５％であり得る。一部の実施形態において、電気泳動ゲル中に存在する稠密化剤の量は、変動し得る。そのような実施形態は、例えば、米国特許第６，４７２，５０３号および同第６，１９７，１７３号に記載される方法等の、勾配ゲルの調製中に有利に使用することができる。
【００５１】
上に開示される製剤によって調製されるゲルは、水性泳動緩衝液システムを使用して電気泳動に供することができる。通常、水性泳動緩衝液システムは、少なくとも１つのアミン基を有する、少なくとも１つの緩衝両性電解質を含むことができる。一実施形態において、本発明の不連続電気泳動システムと使用するために選択される泳動緩衝両性電解質は、水性泳動緩衝液と使用される電気泳動ゲルに存在するゲル緩衝両性電解質とは異なる。一実施形態において、選択される泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、使用されるゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い場合がある。
【００５２】
ある特定の好ましい実施形態において、選択される水性泳動緩衝両性電解質は、好ましくは、不連続緩衝液システムの基礎となるだろう。そのようなシステムにおいて、泳動緩衝両性電解質は、部分的に、不連続緩衝液システムのトレーリングイオンの供給源として機能することができる。実施形態において、ここに記載されるシステムおよび方法で使用するのに特に適した泳動緩衝両性電解質のｐＫａは、ゲル緩衝両性電解質のｐＫａより低い。
【００５３】
ここに記載するシステムおよび方法で使用するのに適した水性泳動緩衝両性電解質の例としては、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（「ＭＯＰＳ」）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（以後、「ＤＩＰＳＯ」）、Ｎ'−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（「ＰＯＰＳＯ」）、ＨＥＰＰＳ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ′−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＨＥＰＰＳＯ」）、もしくは３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（「ＴＡＰＳＯ」）、またはそれらのあらゆる適切な塩が挙げられるが、これらに限定されない。通常、水性泳動緩衝液中に存在する両性電解質の量は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約４０ｍＭ〜約４５ｍＭの範囲である。泳動緩衝液は、任意に、ＳＤＳおよびＥＤＴＡに加え、トリス等のさらなる緩衝剤を含むことができる。今般開示される実施形態で使用するのによく適した泳動緩衝液の例としては、２５〜１００ｍＭのＭＥＳ、２５〜１００ｍＭのトリス、約０．０５〜約０．５％のＳＤＳ、および約０．５ｍＭ〜約２ｍＭのＥＤＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
このゲルおよび緩衝液システムは、ゲルマトリクスおよび保存溶液の改善された安定性も有する。このシステムによって調製されるゲルは、アクリルアミド加水分解により性能を損なうことなく、１年を超えて冷蔵下で保管することができる。また、重合開始剤を含まない保存緩衝液および保存ゲル溶液は、性能を損なうことなく、少なくとも数週間、室温で保管することができる。
【００５５】
このゲル製剤の実施形態において、電気泳動ゲルは、中性に近いｐＫａを有する一級有機アミンまたは置換アミン、および上述のモル以下の酸または両性電解質緩衝液を含むゲル緩衝溶液で均一に飽和されるため、緩衝液のｐＨは、約ｐＨ６〜ｐＨ８、好ましくは約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５、最も好ましくは６．５〜７．０である。電気泳動ゲルは、あらゆるアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル、またはアガロースとポリアクリルアミドの双方を含有する複合ゲルであり得る。好ましくは、電気泳動ゲルは、約１％〜約６％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される、３％〜２５％（％Ｔ）のアクリルアミドを含む。より好ましくは、このポリアクリルアミドゲルは、約２％〜約５％の架橋剤（％Ｃ）を使用して重合される。好ましくは、アミンは、ビス−トリスまたはＮ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン、最も好ましくはビス−トリスを含む。適切な酸および双性イオン化合物は、トリシン、ビシン、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、２−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）−２−エタンスルホン酸、Ｎ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス−（ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、および３−（Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸である。
【００５６】
ゲルおよび緩衝液システムにおいて、ポリアクリルアミドマトリクスの加水分解によりゲルの性能が低下するにつれて、電流が増加し、移動速度が減少する。荷電種を生み出す、高濃度で存在する中性物質の任意の分解が、電気泳動を乱す傾向があるだろう。この乱れは、生み出された余分な電流から発生し、これは、次に、分離を補助することなくジュール加熱を増加させる。加えて、カソードおよびアノードの緩衝液中に存在しない、ゲル中に形成される陰イオンおよび陽イオンの加水分解産物から、不連続が生じる。ゲル緩衝種または添加物の加水分解は、独立して、ゲルマトリクス組成物から起こる。移動速度の減少は、ゲルのポリアクリルアミドのアルカリに触媒された加水分解により生じる、ゲル中の高い固定電荷に起因する場合がある。固定電荷は、著しい水の向流をもたらし、これは、巨大分子の移動速度を遅らせ得る。低分離能、電流の増加、移動速度の減少を生み出すゲルの不安定性の問題は、中性近くに緩衝したゲルを用い、且つ中性近くのｐＫａを有する緩衝物質を用いることによって解決することができることが分かっている。そのような緩衝液システムは、ゲルが塩基安定性ポリマーで作製されていても、新鮮な、または既製のポリアクリルアミドゲルの、及び尿素またはホルムアミド等のアルカリ不安定性の材料を含有する、新鮮な、または既製のゲルの性能を改善する。
【００５７】
いずれか１つの特定の理論または作用メカニズムに拘束されることなく、アノードおよびカソード緩衝液に対してゲル中に異なる緩衝物質を使用することが有利であることが決定している。一部の実施形態において、陰イオンはアノード緩衝液外に移動しないため、ゲルまたはカソード緩衝液に使用される陰イオン物質は、アノード緩衝液中に存在する必要がない。
【００５８】
これらの緩衝液システムは、保管および泳動中のｐＨ中性のゲル、最低限の費用、および最速の泳動時間の利益を提供する。
【００５９】
本発明の不連続電気泳動ゲルを調製するための種々の方法は、当業者に公知であり、いかなるそのような方法は、限定されることなく電気泳動ゲルを調製するために利用することができる。当業者が不連続電気泳動ゲルを調製するために使用することができる例示的な方法の１つを以下に説明する。しかしながら、本実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、不連続電気泳動ゲルを調製する他の方法が同様に利用され得ることは、容易に理解されるだろう。
【００６０】
実施形態において、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの保存水溶液が調製され得る。任意に、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの単一保存溶液を調製することができる。加えて、スクロース、ゲルアミン、ゲル両性電解質、および酸を含有する塩化物の分離保存水溶液を調製することができる。任意に、ＳＤＳおよび還元剤の分離保存溶液を調製することができる。最後に、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、通常１０重量％）およびテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、通常４重量％〜１０％）の保存溶液が調製される。ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤを除く最終組成物が各構成物の正しい濃度が存在するように、各個別の成分の所望の濃度、および適切な希釈液（例えば、水）で調節された容量を有するように、適切な量の種々の保存溶液を混合することができる。この時点で、ＡＰＳおよびＴＥＭＥＤは、アクリルアミドおよびビス−アクリルアミドの重合が開始するように添加される。その後、混合物をガラスまたはプラスチックのプレートの間に成型することができる。ゲルが成型されるプレート間の空間が２ｍｍ〜０．５ｍｍ離れるように、プレートは相互に離され得る。加えて、プレート間の間隔は、少なくとも３方が密閉される。任意に、薄層のブタノールまたは水性緩衝液を重合ゲルの表面に添加して、重合ゲル組成物の表面張力を低減し、重合ゲルの上端が実質的に真っすぐであることを確実にすることができる。重合ゲル組成物をプレート間に成型した後、ゲル組成物を適切な量の時間静止させ、実質的に完全なアクリルアミドおよびビス−アクリルアミドモノマーの重合を達成する。
【００６１】
一部の実施形態において、濃縮用ゲル溶液は別々に調製され、重合した分離用ゲルの上に成型される。種々の他のＳ：Ｒ比も上述および以下に例示するように利用されるが、完全に重合した電気泳動ゲルのＳ：Ｒ比は、通常、約１：４または約１．９：７．５である。濃縮用ゲルが成型された後、しかし、重合反応が進行して完了する前に、１つ以上のくしが、２つのガラス、またはプラスチック製のくしの間の水性重合濃縮用ゲル組成物中に挿入され、これによって、試料が使用直前に添加され得る複数のウェルを画定することができる。あるいは、濃縮用ゲルが使用されない実施形態において、くしを上述の重合水性分離用ゲル混合物中に挿入することができる。通常、必須ではないが、電気泳動ゲルが使用可能になるまで、くしは所定の位置に保持され得、その後くしが取り外され、重合したポリアクリルアミドゲルマトリクスによって良好に画定されたウェルに試料が添加される。
【００６２】
一部の実施形態において、ポリアクリルアミドの比率は、電気泳動ゲルの長さによって変動し得る。種々のそのような勾配ゲルは、当該分野において広く知られており、そのいずれかをここに記載される製剤と使用するために適応させることができる。勾配ゲルは、約２％〜約３０％のポリアクリルアミド、約３％〜約２７％のポリアクリルアミド、約４％〜約２０％のポリアクリルアミド、または約５％〜約１５％のポリアクリルアミドであり得る。一部の実施形態において、勾配ゲルは、約３％〜約１２％のポリアクリルアミド、約３％〜約２０％のポリアクリルアミド、約３％〜約１５％のポリアクリルアミド、約４％〜約１２％のポリアクリルアミド、約４％〜約２０％のポリアクリルアミド、約４％〜約１５％のポリアクリルアミドであり得る。勾配ポリアクリルアミドゲルを調製するのに適したあらゆる方法が、制限なく本明細書の製剤を有する勾配ゲルを調製するために使用することができる。そのような方法は、本実施形態が属する当業者に広く知られている。そのような方法は、例えば、米国特許第６，４８８，８８０号、同第６，２６７，５７９号、同第４，５９４，０６４号、および同第５，０７１，５３１号に開示されている。実施形態において、勾配ゲルは、任意に、上に説明される方法により成型される濃縮用ゲルを含むことができ、本明細書に組み込まれる。
【００６３】
一部の実施形態において、電気泳動ゲルシステムおよび組成物は、ゲルの重合後、気密または水密パッケージに封入することができる。気密または水密パッケージを、成型されたゲルによる水分保持を最大にし、ゲルの脱水化を防ぐように特定的に適応させることができ、これは、その性能に不利に影響を及ぼす場合がある。一実施形態において、各ゲルは、気密または水密パッケージに個別に封入され、キットの一部として顧客に提供され得る。一実施形態において、キットは、複数のそのような個別に封入された電気泳動ゲルを含むことができる。一実施形態において、キットは、２〜１００個の個別に封入された電気泳動ゲル、５〜７５個の個別に封入された電気泳動ゲル、１０〜５０個の個別に封入された電気泳動ゲル、１５〜３５個の個別に封入された電気泳動ゲル、または２０〜２５個の個別に封入された電気泳動ゲルを含み得る。ゲル一式は、それ自体、エンドユーザーに配送され、個別に封入されたゲルを適切な環境で保管するのに適した適切な容器に封入することができる。ここに記載される組成物および方法により調製される電気泳動ゲルは、約１℃〜約２５℃、または約４℃〜約２２℃の範囲の温度で、最大６ヶ月間、最大５ヶ月間、最大４ヶ月間、最大３ヶ月間、最大２ヶ月間、または最大１カ月間、保管安定である。一部の実施形態において、複数の個別に封入された電気泳動分離ゲルを含有するキットは、任意に、１つ以上の適切な水性泳動緩衝液と組み合わせて顧客に提供することができる。水性泳動緩衝液は、使用可能な濃度で提供されるか、または代替的に、ユーザーが必要に応じて希釈することができる濃縮形態で提供することができる。水性泳動緩衝液は、例えば、２０Ｘ保存溶液、１５Ｘ保存溶液、１０Ｘ保存溶液、５Ｘ保存溶液、または２Ｘ保存溶液で提供することができる。
【００６４】
一実施形態において、電気泳動分離ゲルは、ゲルの長さに沿った電場の印加を促進する適切な槽システムの中に取り付けることができる。そのような槽システムは、水性泳動緩衝液が、上に詳細に開示され、本明細書に組み込まれる、ゲルと接触し、電圧がゲルの長手軸全体に沿って等しく印加されることを確実にするように構成される。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の一部の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実践においてよく機能するように発明者により発見された技法を示し、よって、その実践の好ましい様式を構成すると考えられ得ることを、当業者は理解するべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、１つ以上の変更が開示される特定の実施形態になされても、本発明に記載される実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様の、または類似した結果が得られることを理解するべきである。
【実施例】
【００６６】
以下の実験は、本明細書に具体化される高速泳動ゲル製剤の使用に適した種々の構成物の範囲を決定するために実施された。特に、ゲル緩衝液構成物および塩の種々の組合せを評価する。特に指示のない限り、以下に定義される組成物を有する分離用ポリアクリルアミドゲルは、８％のポリアクリルアミドおよび４．４％のビス−アクリルアミド架橋剤（８％Ｔ／４．４％Ｃ）であった。４％のポリアクリルアミドおよび３．８％のビス−アクリルアミド架橋剤（４％Ｔ／３．８％Ｃ）を有する濃縮用ゲルは、分離用ゲルの上に手動で成型された。特に明記しない限り、分離用ゲルに対する濃縮用ゲルの割合（Ｓ：Ｒ）は約１：４であり、ゲルの厚さは約１ｍｍであり、ゲルはミニゲルカセットに手動で成型された。
【００６７】
以下に記載する種々のゲル製剤を試験するために使用された試料は、示されるレーンで、次のＭａｒｋ１２（商標）、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄマーカー、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ、および大腸菌可溶化液（全て、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）のうちの１つ以上から構成された。高処理量（１０μＬ）でのその高塩濃度、およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲルを条件付けるための選択の標準としてのその過去の使用により、Ｍａｒｋ１２（商標）が選択された。インスリンのＢ鎖に対応する３．５ｋＤａのバンドの視覚的追跡を容易にするために、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓが選択され、そのためゲル泳動の完了を容易に監視することができる。１９〜２２ｋＤａのローダミン標識されたミオグロビンバンドの移動は電圧量により変動できることが知られているため、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）が選択された。例えば、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）タンパク質標準は、ターボモード（すなわち、２５０Ｖ）で、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル上で泳動され、ミオグロビンバンドは、ゲルが通常モード（すなわち、２００Ｖ）で泳動される時より低い見かけ分子量で泳動される。大腸菌可溶化液は、複雑なタンパク質試料の移動を観測するために選択された。
【００６８】
実施例１
検討された最初の試験ゲル製剤は、以下の組成を有する８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルであった：１００ｍＭのビス−トリス、７５ｍＭのトリシン、４容量％のスクロース、および２０ｍＭのＢＥＳ。濃縮用ゲルは、以下の組成を有した：分離用ゲルの上に成型される３５７ｍＭのビス−トリスおよび２１０ｍＭの塩化物、ｐＨ６．５。ゲルのＳ：Ｒ比は、１：４であった。
【００６９】
Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素を含む５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で１５分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、各試料に個別に添加されたＰｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定された。泳動の完了時、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手）を使用して、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）Ｇ−２５０で染色した。
【００７０】
図１は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。３．５ｋＤａのインスリンＢバンド（図１に示される）は、ゲルの長さの約２／３移動したのみであった。これは、（Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ）追跡用色素がより低い分子量タンパク質より速く移動したことを示す。加えて、５５．４ｋＤａグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより速く移動するバンド（図１に示される）は、５５．４ｋＤａバンドよりゆっくり移動するものより拡散しているように見え、６ｋＤａのアプロチニンのバンドおよび３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドの外縁は、ゲルの底に向かって湾曲する。よって、１５分間のゲル泳動時間は改善されるが、このゲル製剤を使用したバンドの分離能は最適ではなかった。
【００７１】
実施例２
５５．４ｋＤａのグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより大きく移動するバンドの濃縮および分離を改善する試みで、Ｓ：Ｒ比を４１：５９に変更したことを除き、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、基本的に、実施例１に記載されるように成型した。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定され、ゲルは、上述のようにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。
【００７２】
得られたゲル（図２）は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。さらに１分間の泳動時間を必要としたが、３．５ｋＤａのインスリンＢバンドは、ゲルの全長を移動した。最外側レーンの２００ｋＤａのミオシンバンド（すなわち、レーン１、２、９、および１０、星印で示される）は、レーン３〜８に見られる対応するバンドより拡散した。加えて、５５．４ｋＤａグルタミン酸デヒドロゲナーゼのバンドより速く移動するバンド（図２に示される）は、５５．４ｋＤａバンドよりゆっくり移動するものより拡散し、６ｋＤａのアプロチニンのバンドおよび３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドの外縁は、ゲルの底に向かって湾曲した。
【００７３】
実施例３
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、基本的に、実施例２に記載されるように成型し、以下のように変更した：８％（８％Ｔ／４．４％Ｃ）分離用ゲルは、１００ｍＭのビス−トリスおよび１００ｍＭのトリシンを使用して作製された。分離用ゲルの上に成型された４％（４％Ｔ／３．８％Ｃ）濃縮用ゲルは、６．１のｐＨであり、３５７ｍＭのビス−トリスおよび１５０ｍＭの硫酸を使用して作製された。この実施例において、硫酸は、Ｃｌ−よりゆっくり移動するリーディングイオン（ＳＯ４−２）を提供するために使用された。ゲルのＳ：Ｒ比は４１：５９であった。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを各レーンのゲルに添加し、ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１８分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、ゲルが上述のようにＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された後、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｓ追跡用色素のゲルの底への移動に基づき決定された。
【００７４】
図３は、このゲル製剤から得たマーカーバンドの移動パターンを示す。示されるように、濃縮用ゲルに硫酸を使用することは、不十分な結果をもたらし、ＭＥＳ緩衝液の緩衝能および分離能を上回るように思えた。
【００７５】
実施例４
２つの同一の８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルは、各ゲルのビス−トリス量を１７８ｍＭに減らし、塩化物を１０５ｍＭに減らし、トリシンを含まないことを除き、基本的に、実施例２に記載されるように成型された。１７８ｍＭのビス−トリス、ｐＨ６．５の１０５ｍＭの塩化物を含む４％の濃縮用ゲルを各分離用ゲルの上に成型した。ゲルのＳ：Ｒ比は１：３であった。
【００７６】
５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１〜３、５、７、９、および１０の各ゲルに添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン４に添加し、１０μｇ大腸菌可溶化液をレーン６に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加した。ゲルのうちの１つ（図４Ａに示される）をＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動し、第２のゲル（図４Ｂに示される）をＭＥＳ泳動緩衝液中で１０分間、３５０Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、レーン８の染色済み３．５ｋＤａのバンドの移動を視覚化することにより決定された。上記のようにゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色した。
【００７７】
バンドはレーン４および８のバンドより広いが、図４Ａおよび４Ｂに見られる３．５ｋＤａのインスリンＢのバンドは、図１〜３に示されるゲルより良好な移動特徴を示す。全体的に、３５０Ｖで泳動された図４Ｂに示されるゲルにおいて、より低い分子量に対応するバンドは、３００Ｖで泳動された図４Ａに示されるゲルの対応するバンドより広かった。加えて、３５０Ｖで泳動されたゲルの６６〜６ｋＤａ範囲のバンドで、いくらかのバンド分裂が見られた（図４Ｂ）。
【００７８】
実施例５
ビス−トリスの濃度を２２８ｍＭに増加し、塩化物の濃度を１４０ｍＭに調節し、トリシンの濃度を５０ｍＭに減らし、ＢＥＳを取り除き、分離用ゲルのｐＨが６．５であったことを除き、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルを、基本的に、実施例１に記載されるように成型した。２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭのＣｌ−、５０ｍＭのトリシン、および０重量％のスクロースを含む４％の濃縮用ゲルを分離用ゲルの上に成型した。５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーをレーン１、２、５〜７、９、および１０に添加し、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン３に添加し、１０μｇの大腸菌可溶化液をレーン４に添加し、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄをレーン８に添加した。ゲルをＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で１３分間、３００Ｖで泳動した。ゲル泳動の完了は、レーン８の３．５ｋＤａのバンドの移動を視覚化することにより決定された。図５に示されるゲルは、上記のＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。より低い分子量のバンドの拡張は減少し、バンドの鮮鋭度は、５０〜１００ｍＭのトリシンおよび１２０〜１６０ｍＭの塩化物を添加することにより改善された。
【００７９】
実施例６
図６は、市販のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル製剤（ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスＭｉｄｉ ｇｅｌｓ、図６Ａ、６Ｃ、および６Ｅ）と、実施例５に記載される試験ゲル製剤、つまり、２２８ｍＭのビス−トリス、１４０ｍＭの塩化物、および４％のスクロースを含む５０ｍＭのトリシン、ならびに同じ緩衝組成だがスクロースを含まない４％の濃縮用ゲルを有する、８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離用ゲルとの間の電気泳動の特徴の相違を示し、ここで、Ｓ：Ｒ比は、１．９：５．６である（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆに示される試験ゲル）。以下の試料を調製し、ゲルのそれぞれの上に成型した：レーン１、２、５、６、９、および１０は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン７は、１０μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン３は、５μＬのＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有し、レーン４は、１０μｇの大腸菌抽出物を含有し、レーン８は、５μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有した。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルおよび試験ゲル製剤は、それぞれ、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で３２分間および２９分間、２００Ｖ（図６Ａおよび６Ｂ）で、それぞれ、２０分間よび１９分間、２５０Ｖ（図６Ｃおよび６Ｄ）で、それぞれ、１６分間および１３分間、３００Ｖ（図６Ｅおよび６Ｆ）で泳動された。ゲル泳動の完了後、ゲルは、上述のように、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色された。
【００８０】
２５０Ｖおよび３００Ｖ（図６Ｃ〜６Ｆ）で、より低い分子量インスリンＢのバンド（矢印で示される）は、試験ゲル製剤（図６Ｄおよび６Ｆ）について、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス（図６Ｃおよび６Ｅ）より鮮鋭な分離能および短い泳動時間を示した。加えて、試験した全ての電圧で、ＳｅｅＢｌｕｅ Ｐｌｕｓ２（登録商標）Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄの１４および１７ｋＤａのバンドは、試験ゲル製剤（図６Ｂ、６Ｄ、および６Ｆ、レーン３、囲み領域）において、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス（図６Ａ、６Ｃ、および６Ｅ、レーン３、囲み領域）より良好な分離能および分離を示した。
【００８１】
実施例７
以下の実験において、試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、以下の記述を除き、基本的に、実施例５および６に記載されるように成型した。実験条件の各組において、合計７つの試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを成型した。試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥ製剤を示される時間の間、３００Ｖで泳動した。各実験において、２つのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘゲルを示される条件（２００Ｖまたは２５０Ｖ）のそれぞれについて試験した。全てのゲルは、示される時間の間、示される電圧において、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で泳動された。泳動の終わりに、各ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎで染色し、撮像した。各バンドの鮮鋭度は、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して決定された。バンドの鮮鋭度は、各バンドの領域を測定し、その領域を各ウェルの幅（ウェルの幅は、一定の１０ウェル／ゲルに保持した）で割ることにより決定された。各バンドの移動（そのＲｆ値により決定される）は、ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ソフトウェアおよびＱＣソフトウェアを使用して決定された。
【００８２】
図７において、実施例６に記載されるように８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを成型し、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリス製剤と比較した。図７Ａは、ＭＥＳ緩衝液中で１４分間、３００Ｖで泳動された、試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから得られた代表的な画像を示し、ここで、レーン１、２、４〜７、９、および１０は５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン３は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン８は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加された。図７Ｂは、ＭＥＳ緩衝液中で３５分間、２００Ｖで泳動された、２０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスの代表的な画像を示し、ここで、レーン１、３、８、１０、１１、１３、１８、および１９は５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを添加され、レーン５は１０μｇの大腸菌可溶化液を添加され、レーン１６は１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを添加された。図７Ｃは、ゲルがＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液中で２２分間、２５０Ｖで泳動されたことを除き、図７Ｂに記載されるのと同じゲルの代表的な画像を示す。図７Ｄは、各実験条件について得られたＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーの各個別のバンドの相対的鮮鋭度（画素領域により測定される）を要約した棒グラフである。３００Ｖで泳動された試験ゲル製剤は、灰色の棒で示され、２００Ｖで泳動されたＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスゲルは、黒色棒で示され、ターボプロトコルを使用して２５０Ｖで泳動されたＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの８％のビス−トリスは、白色棒として示される。ｘ軸は、Ｍａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーバンドのどれが分析されたかを示し、ｙ軸は画素領域を示す。図７Ｅは、示される非線形動態ＴＯＴＡＬＬＡＢ（商標）ｖ２００３．０２ソフトウェアまたはＱＣソフトウェアのいずれかを使用して、各ゲル製剤について得られた平均Ｒｆ値を示す。
【００８３】
図８Ａ〜８Ｅに示される結果は、以下を除き、基本的に、図７Ａ〜７Ｅに記載されるように得られた。図８Ａに示される試験ゲルのポリアクリルアミドの濃度は、１０％に増加され、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で１６分間、３００Ｖで泳動された。図８Ｂおよび８Ｃにおいて、１０ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの１０％のビス−トリスゲルを使用し、レーンは以下のように添加された：レーン１、２、５〜６、９、および１０は、５μＬのＭａｒｋ１２（商標）タンパク質マーカーを含有し、レーン３は、１０μｇの大腸菌可溶化液を含有し、レーン８は、１０μＬのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ−Ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄを含有した。図８Ｂにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で３６分間、２００Ｖで泳動され、図８Ｃにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２４分間、２５０Ｖで泳動された。図８Ｄおよび８Ｅに示されるゲルの分析は、図７Ｄおよび７Ｅにおいて記載されるように実施された。
【００８４】
図９Ａ〜９Ｅに示される結果は、以下を除き、基本的に、図８Ａ〜８Ｅに記載されるように得られた。９Ａに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験ゲルを、ＭＥＳ緩衝液中で１７分間、３００Ｖで泳動された４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲルとして成型した。図９Ｂおよび９Ｃにおいて、１２ウェルのＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘの４〜１２％のビス−トリスゲルを使用し、レーンは、図８Ｂおよび８Ｃについて記載されるように添加された。図９Ｂにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で３７分間、２００Ｖで泳動され、図９Ｃにおいて、ゲルは、ＭＥＳ緩衝液中で２５分間、２５０Ｖで泳動された。図９Ｄおよび９Ｅに示されるゲルの分析は、図７Ｄおよび７Ｅにおいて記載されるように実施された。
【００８５】
実施例８
図１０に示される以下の実験において、２つの試験ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、図１０Ａに示される分離用ゲルのスクロースの濃度が２重量％に減少され、図１０Ｂに示される分離用ゲルのスクロースの濃度が４重量％に維持されることを除き、基本的に、実施例６から８に記載されるように成型された。図１０Ａにおいて、ゲルは、１５分間、３００Ｖで泳動された。図１０Ｂにおいて、ゲルは、２６分間、３００Ｖで泳動され、図１０Ｃは、図１０Ａおよび１０Ｂに示されるゲルについて得られた相対的なバンドの鮮鋭度を示す。
【００８６】
本特許において、ある米国特許、米国特許出願、および他の資料（例えば、論文）が、参照により組み込まれてきた。しかしながら、そのような米国特許、米国特許出願、および他の資料の本文は、そのような本文と本明細書に記述される他の説明および図面の間に矛盾が存在しない限り、単に参照により組み込まれるものとする。そのような矛盾がある場合、参照によりそのように組み込まれた米国特許、米国特許出願、および他の資料におけるいかなるそのような矛盾する本文は、特定的に、本特許に参照により組み込まれないものとする。
【００８７】
本発明の種々の態様のさらなる修正および代替実施形態は、この説明を考慮すれば当業者に明らかであろう。したがって、この説明は、単なる例示的なものであって、本発明を実行する一般的な様式を当業者に教示する目的のためであると解釈されるべきである。本明細書に示され、記載される本発明の形態は、現時点で好ましい実施形態として取られることを理解する。全てが、本発明に対するこの記述の利点を得た後で当業者に明らかであるように、要素および材料は、本明細書に図示され記載されるものと置換することができ、部分およびプロセスは、入れ替えることができ、本発明のある特色は独立して使用することができる。変更は、以下の請求項に記載される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される要素に行うことができる。加えて、本明細書に記載される特色は、ある実施形態において、独立して組み合わせることができることを理解する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル緩衝液システムを含む電気泳動分離ゲルを含む、不連続緩衝液電気泳動システムであって、
前記緩衝液システムは、
ゲルアミン緩衝液と、
ゲル両性電解質と、
緩衝両性電解質を含む水性泳動緩衝液と
を含む、不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２】
前記分離ゲルは、アクリルアミド、アガロース、またはアクリルアミドおよびアガロースを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３】
前記分離ゲルは、アクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４】
前記分離ゲルは、約６〜約２５重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項５】
前記分離ゲルは、約８〜約２０重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項６】
前記分離ゲルは、約８〜約１５重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項７】
前記電気泳動分離ゲルは、その一端と連結された濃縮用ゲルをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項８】
前記濃縮用ゲルは、約４重量％のアクリルアミドを含む、請求項７に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項９】
前記ゲル両性電解質は、緩衝両性電解質とは異なる、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１０】
前記ゲルアミン緩衝液のｐＫは、約５．５〜約７．５の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１１】
前記ゲルアミン緩衝液は、ビス−トリスである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１２】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲である、請求項１０または請求項１１のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１３】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１４】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１５】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、前記ゲルアミンのｐＫより約１．５ｐＫ単位大きい、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１６】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約７〜約９である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１７】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約８〜約８．５である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１８】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約８．１〜約８．３である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１９】
前記ゲル両性電解質は、トリシン、ビシン、グリシンアミド、またはアセトアミドグリシンである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２０】
前記ゲル両性電解質は、トリシンまたはビシンである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２１】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約２５ｍＭ〜約１２５ｍＭの範囲である、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２２】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２３】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約５０ｍＭである、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２４】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６〜約８の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２５】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６．０〜約７．５の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２６】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６．５である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２７】
前記ｐＨは、酸の添加により調節される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２８】
前記酸はＨＣｌである、請求項２７に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２９】
前記ゲル緩衝液システムは、Ｃｌ−イオンの供給源をさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３０】
前記ゲル緩衝液システムは、約９５ｍＭ〜約１７０ｍＭのＣｌ−イオンをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３１】
前記ゲル緩衝液システムは、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭのＣｌ−イオンをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３２】
前記泳動緩衝液中の前記緩衝両性電解質のｐＫは、前記ゲル両性電解質のｐＫより低い、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３３】
前記緩衝両性電解質は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、それらの塩、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３４】
前記緩衝両性電解質は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、またはＤＩＰＳＯを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３５】
前記緩衝両性電解質はＭＥＳを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３６】
前記緩衝両性電解質はＭＯＰＳを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３７】
前記緩衝両性電解質はＤＩＰＳＯを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３８】
前記電気泳動分離ゲルは、スクロースをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３９】
前記スクロースの濃度は、約５重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４０】
前記スクロースの濃度は、約３重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４１】
前記スクロースの濃度は、約２重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４２】
前記スクロースの濃度は、約１．５重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４３】
少なくとも前記分離ゲルにＳＤＳをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４４】
前記分離ゲルおよび前記泳動緩衝液にＳＤＳをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４５】
前記分離ゲルはスラブゲルである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４６】
前記スラブゲルは、２枚のガラスまたはプラスチックプレートの間にある、請求項４５に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４７】
少なくとも第１の適切な容器に、
それぞれが、請求項１〜４７のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システムを含む、１つ以上のゲルカセットと、
請求項１〜４７のいずれかに記載の水性泳動緩衝液と
を含む、キット。
【請求項１】
ゲル緩衝液システムを含む電気泳動分離ゲルを含む、不連続緩衝液電気泳動システムであって、
前記緩衝液システムは、
ゲルアミン緩衝液と、
ゲル両性電解質と、
緩衝両性電解質を含む水性泳動緩衝液と
を含む、不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２】
前記分離ゲルは、アクリルアミド、アガロース、またはアクリルアミドおよびアガロースを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３】
前記分離ゲルは、アクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４】
前記分離ゲルは、約６〜約２５重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項５】
前記分離ゲルは、約８〜約２０重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項６】
前記分離ゲルは、約８〜約１５重量％のアクリルアミドを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項７】
前記電気泳動分離ゲルは、その一端と連結された濃縮用ゲルをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項８】
前記濃縮用ゲルは、約４重量％のアクリルアミドを含む、請求項７に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項９】
前記ゲル両性電解質は、緩衝両性電解質とは異なる、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１０】
前記ゲルアミン緩衝液のｐＫは、約５．５〜約７．５の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１１】
前記ゲルアミン緩衝液は、ビス−トリスである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１２】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約１９０ｍＭ〜約２９５ｍＭの範囲である、請求項１０または請求項１１のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１３】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約３００ｍＭ未満である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１４】
前記ゲルアミン緩衝液の濃度は、約１７５ｍＭ〜約３００ｍＭである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１５】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、前記ゲルアミンのｐＫより約１．５ｐＫ単位大きい、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１６】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約７〜約９である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１７】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約８〜約８．５である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１８】
前記ゲル両性電解質のｐＫは、約８．１〜約８．３である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項１９】
前記ゲル両性電解質は、トリシン、ビシン、グリシンアミド、またはアセトアミドグリシンである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２０】
前記ゲル両性電解質は、トリシンまたはビシンである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２１】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約２５ｍＭ〜約１２５ｍＭの範囲である、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２２】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２３】
前記ゲル両性電解質の濃度は、約５０ｍＭである、請求項１９または２０のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２４】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６〜約８の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２５】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６．０〜約７．５の範囲である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２６】
前記ゲル緩衝液システムのｐＨは、約６．５である、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２７】
前記ｐＨは、酸の添加により調節される、請求項２４〜２６のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２８】
前記酸はＨＣｌである、請求項２７に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項２９】
前記ゲル緩衝液システムは、Ｃｌ−イオンの供給源をさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３０】
前記ゲル緩衝液システムは、約９５ｍＭ〜約１７０ｍＭのＣｌ−イオンをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３１】
前記ゲル緩衝液システムは、約１３５ｍＭ〜約１４５ｍＭのＣｌ−イオンをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３２】
前記泳動緩衝液中の前記緩衝両性電解質のｐＫは、前記ゲル両性電解質のｐＫより低い、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３３】
前記緩衝両性電解質は、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＣＡＰＳＯ、ＤＩＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、それらの塩、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３４】
前記緩衝両性電解質は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、またはＤＩＰＳＯを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３５】
前記緩衝両性電解質はＭＥＳを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３６】
前記緩衝両性電解質はＭＯＰＳを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３７】
前記緩衝両性電解質はＤＩＰＳＯを含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３８】
前記電気泳動分離ゲルは、スクロースをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項３９】
前記スクロースの濃度は、約５重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４０】
前記スクロースの濃度は、約３重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４１】
前記スクロースの濃度は、約２重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４２】
前記スクロースの濃度は、約１．５重量％未満である、請求項３８に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４３】
少なくとも前記分離ゲルにＳＤＳをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４４】
前記分離ゲルおよび前記泳動緩衝液にＳＤＳをさらに含む、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４５】
前記分離ゲルはスラブゲルである、請求項１に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４６】
前記スラブゲルは、２枚のガラスまたはプラスチックプレートの間にある、請求項４５に記載の不連続緩衝液電気泳動システム。
【請求項４７】
少なくとも第１の適切な容器に、
それぞれが、請求項１〜４７のいずれかに記載の不連続緩衝液電気泳動システムを含む、１つ以上のゲルカセットと、
請求項１〜４７のいずれかに記載の水性泳動緩衝液と
を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１３−５０２５９９（Ｐ２０１３−５０２５９９Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２６９２１（Ｐ２０１２−５２６９２１）
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６５１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８５３５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【出願人】（３１２０１１２０２）
【出願人】（３１２０１１２１３）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２４日（２０１０．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６５１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２８５３５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０２２２１２８２）ライフ テクノロジーズ コーポレーション (113)
【出願人】（３１２０１１２０２）
【出願人】（３１２０１１２１３）
[ Back to top ]