１本鎖ＤＮＡの鋳型非依存性ライゲーション
本発明は、線状ｓｓＤＮＡの改善された鋳型非依存性分子内ライゲーション（環状化）用のライゲーション反応混合物、方法、及びキットを提供するものであり、この線状ｓｓＤＮＡは、変性ｇＤＮＡ断片又は熱変性ＲＮＡリガーゼなどを用いてＲＮＡを逆転写して生成した第１鎖ｃＤＮＡを含む。改善されたライゲーション反応混合物および方法を用いて得た環状ｓｓＤＮＡ分子を、逆ＰＣＲ、ローリングサークル複製、転写、又は超並列ＤＮＡシーケンシングによる増幅するための鋳型などとして使用することができる。本発明は、例えば、ｑＰＣＲによる遺伝子発現分析又はマイクロアレイを用いたｇＤＮＡのコピー数変化の分析、及びリサーチ、スクリーニング、医学診断、セラノスティクス、個人の医学的治療又はブリーディング、ヒトや動物の医薬、法医学、又は農業などの目的で特定の核酸配列の検出又は定量化に適用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年２月１６日に出願された米国暫定出願第６１／１５２，８６８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、改善されたライゲーション反応混合物、及び熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション（例えば、環状化）方法に関するもので、特に、未知の配列及び／又はサイズのｓｓＤＮＡ分子の集団中のｓｓＤＮＡ分子の環状化する方法、及びそのキットとその使用及びアプリケーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
当該分野では、大腸菌を感染させる、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼＩ（ＲｎＩ１）鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有することが知られている（ＧｕｍｐｏｒｔとＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，遺伝子の増幅と分析，２巻：酵素的方法による核酸構造の分析，ＣｈｉｒｉｋｊｉａｎとＰａｐａｓ，ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，１９８０；ＭｃＣｏｙ ａｎｄ Ｇｕｍｐｏｒｔ，生物化学 １９：６３５−６４２，１９８０；Ｓｕｇｉｎｏ，Ａら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５２：１７３２−１７３８，１９７７）が、線状ｓｓＤＮＡ分子からの環状ｓｓＤＮＡ分子の生成に実際に使用するには、この活性はあまりに低く不十分である。理論に拘束されることなく、このことは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼは、ｓｓＲＮＡ分子の５’リン酸化末端だけでなく、ｓｓＤＮＡ分子の５’リン酸化末端は「ライゲーションドナー」（又は「ドナー」）として使用できるが、ｓｓＤＮＡ分子 の３’水酸基末端を「ライゲーション受容体」（又は「受容体」）として使用するにはＲＮＡの３’末端 に比べて効率がかなり悪いという事実により、少なくとも部分的に説明できる。
【０００３】
米国特許第 ７，３０３，９０１号とＢｌｏｎｄａｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ ３３：１３５−１４２，２００５）は共に参照により本明細書に組み込まれており、好熱性細菌であるＴｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓを感染させるサーマスバクテリオファージＴＳ２１２６由来の熱安定性ＲＮＡリガーゼを開示している。本明細書で「バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ」若しくは「ファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ」又はより簡単に「ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ」と言うこの酵素は、５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＲＮＡ基質だけでなく、線状ｓｓＤＮＡにも高い鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有する。バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼなどの中温ＲＮＡリガーゼよりかなり熱安定であり、約７０℃まで安定である。ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ活性の温度の範囲は、例えば約５０℃から約７５℃までと、約４０℃以上高い。バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼの強化された熱安定性が、他の酵素では禁止される温度条件下での使用を可能にする。この熱安定性により、例えばｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡの好ましくない二次構造を減少させる、より高い温度でＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを使用することができる。この酵素は、約６年間（本特許出願の出願の時点で）Ｐｒｏｋａｒｉａ社（Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）からＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ＲＮＡ リガーゼＩＩ又は ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で市販されており、２００８年の１２月中旬より Ｍａｔｉｓ社（ｗｗｗ．ｍａｔｉｓ．ｉｓ；Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）やＰｒｏｋａｚｙｍｅ社（ｗｗｗ．ｐｒｏｋａｚｙｍｅ．ｃｏｍ；Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）からＰｒｏｋａｒｉａブランド 、ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡ リガーゼの商標で入手可能であった。更に、本発明の出願人を雇用する米国、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ州ＭａｄｉｓｏｎのＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、２００４年の１２月から ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標でバクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを販売し、その属性、反応条件、及び用途の研究で相当な努力をした。
【０００４】
Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｃら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：６２１８−６２２７，２００８）は、、好熱性始原細菌由来のＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１又は「ＭｔｈＲｎｌ」）が線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化する鋳型非依存的リガーゼ活性を有することを開示した。
【０００５】
ｓｓＤＮＡ分子の分子内鋳型非依存性ライゲーション（即ち、環状化）のために鋳型非依存的リガーゼを使用する方法は、当該技術分野で周知である。例えば米国特許出願第２００６０２４０４５１号は、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを用いてｍＲＮＡの５’末端断片から生成された線状第１鎖ｃＤＮＡ分子をライゲーションし、次いでローリングサークル複製（ＲＣＲ）又ローリングサークル転写（ＲＣＴ）により環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を増幅する方法を開示している。
【０００６】
米国特許出願第２００４０１９７８０２号は、５’末端部分が、センスＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を提示し、３’末端部分が、生体サンプル中の標的核酸内の配列に相補的な配列を提示する、５’末端部分と３’末端部分を具えるセンスプロモータープライマーを開示ている。それらはまた、ファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを用いた鋳型非依存性分子内ライゲーションによって第１鎖ｃＤＮＡ分子を含んだ線状センスプロモーターを環状化するステップを具える方法を開示している。いくつかの実施例では、この方法は更に、環状転写基質を生成するステップとその環状転写基質を転写するステップを具える。この方法は、生体サンプル中のｍＲＮＡ分子を増幅するのに有用である。
【０００７】
Ａ．Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４１：３５−３９，２００６）は、ｃＤＮＡ末端のランダム増幅（ＲＡＣＥ）用にｃＤＮＡ末端を増幅する方法のステップとして鋳型非依存性ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ （ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ，（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））の使用について述べている。
【０００８】
Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬとＳｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆの米国特許出願第２００８０２４２５６０号は、デジタルＤＮＡボール（例えば米国出願第２００８０２４２５６０号の図８）を作るステップ；及び／又は、複数置換増幅又は全ゲノム増幅（例えば上記の図１７）又は増殖された核酸配列（例えば ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＢｅａｄＡｒｒａｙｓ（商標）；ＩＬＬＵＭＩＮＡ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，ＵＳＡ）を生成する超分岐ＲＣＡ（例えば、上記の図１８）による増幅を含むゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを遺伝子座特異の切断及び増幅させるステップを具える方法におけるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の使用を開示している。
【０００９】
Ｄｒｍａｎａｃらの米国特許出願第２００９００１１９４３号；２００９０００５２５２号；２００８０３１８７９６号；２００８０２３４１３６号；２００８０２１３７７１号；２００７００９９２０８号；及び２００７００７２２０８号は、超並列ＤＮＡシーケンシング用の環状ｓｓＤＮＡ鋳型を生成するＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の使用を開示しており、例えば、米国特許出願第２００９００１１９４３号は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１マイクロリットルあたり１０ユニット、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ，７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５マイクロモル ＡＴＰ、１．２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０％ＰＥＧ４０００とｓｓＤＮＡ１マイクロリットルあたり０．５−１０ピコモルの最終濃度を含む鋳型非依存的ライゲーション（即ち、環状化）用のライゲーション反応混合物の使用を開示している。
【００１０】
Ｎｕｎｅｚ，ＡＮら（Ｎｕｎｅｚ，ＡＮ，Ｋａｖｌｉｃｋ，ＭＦ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＪＭ，とＢｕｄｏｗｌｅ，Ｂ，「少量の断片化されたＤＮＡのローリングサークル増幅用の鋳型を提供するための環状リガーゼのアプリケーション」、 ヒト同定第１９回国際シンポジウム、１０月１３−１６日、２００８、Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて作成したｓｓＤＮＡ分子の更なる別の使い方をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ１９ｐｒｏｃ／ｏｒａｌｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／Ｎｕｎｅｚ．ｐｄｆ．で述べている。連邦捜査局の調査員は、分解されたＤＮＡサンプルを変性させてｓｓＤＮＡ断片を得るステップと；ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて線状ｓｓＤＮＡ断片を連結して環状ｓｓＤＮＡ断片を得るステップと；次いで、縮重プライマーとＲＣＡによるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅するステップ；を具える方法を開示している。この方法によれば、欠陥のある生物学的証拠や他のアプリケーションの法医学的分析に著しい利益を提供するＲＣＡメカニズムにより、分解されたＤＮＡサンプルを全ゲノム増幅（ＷＧＡ）できる可能性がある。この調査員は、線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化する最適条件と考えられるものを開発し、以前は分類できなかった、分解されたＤＮＡサンプルを分類する基礎を築いた。しかし、同一条件下では、５’Ｇと３’Ｔのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、５’Ａと３’Ｃを有する相補的オリゴヌクレオチドより顕著に連結することが観察されたため、彼等が最適と考える反応条件でさえも、連結された生成物の量は変わり、その量は配列に依存するように見えることがわかった。
【００１１】
従って、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（アイスランド、レイキャビック所在のＰｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ、及びＰｒｏｋａｚｙｍｅ社よりＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ＲＮＡリガーゼＩＩ又はＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で、米国、ウィスコンシン州、マディソン所在のＥＰＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社よりＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で市販されている）が、ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーションとして知られている最も効果的なリガーゼである（本明細書で述べられた引例及び出願人や同僚の個人的な見解に基づく）が、数年間つづいており今も根強い解決困難な問題は、さまざまな配列とサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ分子用酵素の分子内ライゲーション可変効率である。従って、上記Ｎｕｎｅｚらなど他の研究者と同じく、本出願人と ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社の同僚も、ヌクレオチド配列がわずかに異なる同一又はほぼ同じサイズの、又は１００塩基未満から数キロ塩基に至るポリヌクレオチドさまざまなサイズの線状ｓｓＤＮＡ基質を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの全く異なるレベルの分子内ライゲーションを観察した。例えば、場合によっては、オリゴデオキシリボヌクレオチド配列中では１つのヌクレオチド違いでさえ分子内ライゲーション効率に大きな違いをもたらす。さまざまな線状ｓｓＤＮＡ分子が非常に高い割合で分子内で連結でき、比較的同じ低度に連結できれば、はるかに良い実験結果が得られ、はるかに良い結論が得られる。従って、それらの各ヌクレオチド配列又はサイズに関係なく、分子内で連結する線状ｓｓＤＮＡ分子レベルをもっと高くして、それらの全てを比較的同じ程度に分子内で連結させる改善された新しいライゲーション方法、ライゲーション反応混合物、及びキットが、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの発見以来当該技術分野において強く求められている。かかる改善されたライゲーション方法、ライゲーション反応混合物、及びキットを見出した場合に更に求められるのは、定量的エンドポイントＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析用の核酸分子を増幅する方法、又はアレイ又はマイクロアレイへのハイブリダイズ、又は超並列ＤＮＡシーケンシングを用いる配列（即ち、いわゆる「次世代」のＤＮＡ配列）により関連遺伝子発現分析する方法、又はＰｏｌｉｄｏｒｏｓらによるＲＡＣＥ法、又はＮｕｎｅｚらによる（上記）ＲＣＡ−ＷＧＡによるゲノムＤＮＡ増幅方法、又はＧｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬとＳｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ及びＤｒｍａｎａｃらによる（共に上記）ゲノムＤＮＡ増幅方法（遺伝子座特異の増幅を含む）及び／又は配列決定方法、又はｓｓＤＮＡの分子内ライゲーション又は結果として生じる環状ｓｓＤＮＡ分子を用いる任意の他のアプリケーション方法である。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを使用する他のアプリケーションと使用方法は、例えば、Ｓｈｒｏｆｆ，Ｈら（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５：１５０９，２００５；及び Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ９４：２１７９，２００８）；Ｌｉｎ，Ｃら（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１８：７６９９，２００６）；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１１７６，２００８）；ＭｃＡｒｔｈｕｒ，ＭとＢｉｂｂ，ＭＪ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１０２０，２００８）；及び Ｋｕｈｎ，ＨとＦｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，ＭＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６：ｅ４０，２００８）が示されている。 新しく改善されたライゲーション反応混合物、改善されたライゲーション反応条件及び各ヌクレオチドの配列又はサイズに関係なく、より効率的な分子内連結を可能にし、ほぼ同じ程度に全てのｓｓＤＮＡ分子を分子内連結させる方法が求められており、これらの方法の全てに有益であるだろう。
【００１２】
即ち、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼなど熱安定性リガーゼを用いて、高度かつ一定のレベルでさまざまな配列のｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを可能にする、改善されたライゲーション反応混合物及び方法が求められている。本出願は、この長年にわたる問題を解決する新規な改善されたライゲーション反応混合物及び方法、及び新規な改善された鋳型非依存性分子内反応混合物及び方法を採用した新しいプロセスを開示している。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一実施例は、線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存的分子内ライゲーションのライゲーション反応混合物であって、
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡと；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、大部分前記熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のこのアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等又はこれを上回る組成物と；
（ｃ）約ｐＨ６．５と約８．０の間に最終ｐＨを維持するバッファと；
（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度のマンガン塩であって、ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、０．５乃至１０ｍＭであり、非アデニル化型熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度でＡＴＰが反応バッファ中に存在する又は存在しないマンガン塩と；を具えるライゲーション反応混合物。
【００１４】
いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物にＡＴＰを添加しない。
【００１５】
いくつかの好ましい実施例では、このイゲーション反応混合物が更に、最終濃度が０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物中のベタインの濃度は、約１Ｍである。
【００１６】
いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物にＭｇ２＋陽イオンを添加しない。
【００１７】
本発明はまた、熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する、線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション用の改善されたライゲーション反応混合物の使用方法を具える。例えば、一の方法は、
１．ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子；（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、大部分の熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等か又はこれを上回る組成物；（ｃ）約ｐＨ６．５と約８．０の間に最終ｐＨを維持するバッファと；（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度におけるマンガン塩であって、ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、０．５乃至１０ｍＭであり、非アデニル化型熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度でＡＴＰが反応バッファ中に存在する又は存在しないマンガン塩と；を具えるライゲーション反応混合物を調整するステップと；
２．ライゲーション反応混合物中の線状ｓｓＤＮＡ分子を、反応温度約４０℃乃至約７０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間インキュベートするステップと；を具える。
【００１８】
いくつかの好ましい方法の実施例では、ライゲーション反応の混合物にＡＴＰを添加しない。
【００１９】
いくつかの好ましい方法の実施例では、ライゲーション反応の混合物が更に、最終濃度が０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物中のベタインの濃度が、約１Ｍである。
【００２０】
いくつかの好ましいこの方法の実施例では、ライゲーション反応混合物にＭｇ２＋陽イオンを添加しない。
【００２１】
この方法のいくつかの好ましい実施例では、鋳型非依存的熱安定性ＲＮＡリガーゼは、サーマスバクテリオファージＲＮＡリガーゼ：バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ；古細菌ＲＮＡリガーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１からなる群から選択される。
【００２２】
一の好ましい実施例でこの方法は、
１．ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子と；
（ｂ）ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの組成物あって、６０％以上の熱安定性リガーゼ分子がアデニル化され、当該分子が、ライゲーション反応混合物中のアデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子のモル濃度が、線状ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等か又はこれを上回る量で存在する（例えば、アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子の濃度が約１マイクロモルであるのに対し線状ｓｓＤＮＡ分子の濃度が約０．５モル）組成物；
（ｃ）バッファ剤（例えば、ライゲーション反応混合物中の最終ｐＨが約７．８のトリス酢酸)と；
（ｄ）最終濃度約０．５乃至１０ｍＭのＭｎ２＋陽イオンを提供するマンガン塩（例えば、最終濃度約２．５ｍＭのＭｎ２＋陽イオン）と；を具えるライゲーション反応混合物を調整するステップ；と
２．約４０℃乃至約７０℃（例えば、約５５℃乃至約６５℃；例えば約６０℃）の温度で、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間前記ライゲーション反応混合物をインキュベートするステップを具える方法。この方法のいくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物は更に、最終濃度約０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を含む。
【００２３】
上記のいずれかの方法のいくつかの実施例では、分子内ライゲーション用５’リン酸基及び３’水酸基を有する５’又は３’末端のヌクレオチド配列は、未知及び／又は線状ｓｓＤＮＡ分子のサイズが変化する線状ｓｓＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこれらからなる。
【００２４】
この方法のいくつかの好ましい実施例では、分子内ライゲーション法で用いる５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生体サンプル内の１又はそれ以上の標的核酸分子が提示する相補的配列にアニールする１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸長により生成した線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこの集団からなる。
【００２５】
いくつかの好ましい実施例では、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸長により生成した線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を更に、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではない標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを用いて標的核酸分子を取り除いて精製する、又は親和性標識を線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込んで、親和性結合物質が表面に付着する親和性標識が特異的結合対を形成する親和性結合物質を用いてそれらを取り出すことによって、標的核酸分子から線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を選択的に精製することにより精製する。
【００２６】
例えば、この方法で使用される線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が生体サンプル内のＲＮＡ分子から生成されるこの方法のいくつかの実施例では、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく、標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを、ＲＮアーゼＨとＲＮアーゼＩとＲＮアーゼＩＩＩの組み合わせから選択する。この方法で使用される線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が、生体サンプル内のＤＮＡ分子から生成されるいくつかの実施例では、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼが、例えば、ＤＮＡ標的核酸分子のみを特異的に分解する一本鎖特異的ＤＮアーゼである。
【００２７】
親和性標識を線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込むステップと、親和性結合物質を用いてプライマー伸長生成物を取り出すステップを具えるこの方法のいくつかの実施例では、親和性標識が、ビオチン部分（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ分子中の１又はそれ以上のヌクレオチドと結合した）を具え、親和性結合物質が、表面に付着したストレプトアビジンを具える。
【００２８】
１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを伸長させ分子内ライゲーション用の線状ｓｓＤＮＡ分子を調整するこの方法のいくつかの好ましい実施例では、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの各々が、標的核酸分子中の配列に実質的に相補的ではない配列を提示する標識を具えるか又はこの標識からなる５’末端部分と、生体サンプル由来の少なくとも１つの標的核酸分子によって提示された配列に相補的な配列を提示する３’末端部分とを具え、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子が合成される。「生体サンプル由来の少なくとも１の標的核酸分子によって提示された配列に相補的な配列を提示する３’末端部分」の記載によって、本明細書においては、３’末端が標的核酸分子自体により提示された配列又は、生体サンプル由来の標的核酸分子の３’末端に結合された配列のいずれに相補的であること意味する（インビトロでの核酸修飾反応、例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて標識核酸分子に添加されたポリ（Ａ）や他のホモポリマーテールなど）。 例えば、いくつかの実施例では、この方法で使用される分子内ライゲーション用線状ｓｓＤＮＡ分子を生体サンプル中の目的の核酸分子から調整し、ここでは目的の前記核酸分子が修飾されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許出願番号第２００５０１５３３３３号又は２００９０２２７００９号に開示された末端標識方法を用いた、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを有するＲＮＡのポリ（Ａ)テール、又はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるＤＮＡのテール、又は目的のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の３’末端へのアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション、又は目的のＤＮＡ又はＲＮＡ分子への３’末端配列の添加による）。従って、この方法は、修飾された生体サンプル由来の核酸から調整した線状ｓｓＤＮＡ分子のこの方法における使用も含む。
【００２９】
１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、５’末端部分に標識を具えるか又はこの標識からなるいくつかの好ましい実施例では、その標識が、センスプロモータ配列、切断部位標識領域、シーケンサー特異的配列標識領域、回収標識領域、増幅標識領域、検出標識領域、及びアドレス標識領域を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域からなる群から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はこの標識領域からなる。
【００３０】
第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’部分の標識は、所望の標識領域を具え、所望の目的のための所望の配列を示すことができる。例えば、いくつかの実施例では、５’部分が、１乃至それ以上の配列標識領域を具え、その領域がＲｏｃｈｅ ４ＦＬＸ ５４Ａと４５４Ｂ配列標識の配列を提示し、所望のサイズ範囲で断片を単離した後、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸシステムを用いて次世代の鋳型として使用される。同様に、その他実施例では、５’−及び３’−標識ＤＮＡ断片は、所望のサイズ範囲に単離後、別の配列プラットフォームを用いて（例えば、ＲＯＣＨＥ ４５４シーケンシングプラットホーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）ＳＯＬＥＸＡ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ／ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ’ ＳＯＬＩＤ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ’ＳＭＲＴ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＰＯＬＬＯＮＡＴＯＲ Ｐｏｌｏｎｙシーケンシングプラットホーム、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＧＥＮＯＭＩＣＳシーケンシングプラットホーム、ＩＮＴＥＬＬＩＧＥＮＴ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ’シーケンシングプラットホーム、又はＨＥＬＩＣＯＳシーケンシングプラットホームを用いて）次世代用の鋳型として使用される。いくつかの好ましい実施例では、この方法を用いて細胞又は微生物の全ゲノムを具える標的ＤＮＡから、５’と３’が標識されたＤＮＡ断片を生成する。
【００３１】
いくつかの好ましい実施例では、親和性結合分子（例えば、ビオチン）又は検出可能な分子（例えば、蛍光染料）で配列標識がラベルされており、これによって５’末端に親和性結合分子又は検出可能な分子がある標識を有する５’−と３’−標識ＤＮＡ断片の回収（例えば、ビオチン化分子の回収にストレプトビアジンが結合する表面を使用する）又は検出が可能である。
【００３２】
第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、さまざまな標識領域を具える標識を具える又はこの標識からなるこの方法のいくつかの好ましい実施例では、、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、各々標識領域間に切断部位を含んでおり、この方法が、更に切断部位において環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップを具え、この分子は、各々、その５’末端に第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を、その３’末端に第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分を提示している。
【００３３】
例えば、いくつかの実施例では、切断部位が２’−デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）部分又は８−オキソグアニン−２’−デオキシリボシル−一リン酸（８−オキソ−ｄＧＭＰ）を具える又はこれらからなり、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して、各々が５’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を又３’末端で第１鎖合成プライマーの５’末端部分を提示するステップが環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成し、環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）にそれぞれ接触させて、１又はそれ以上の脱塩基部位を含む環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成し、次いで、環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を脱塩基部位又はそれに近い部位で線状化するアルカリ溶液又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼを含む溶液中でインキュベートすることによるなどの条件下で１又はそれ以上の脱塩基部位を含む環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。
【００３４】
この方法のいくつかの好ましい実施例においては、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、２つのシーケンサー特異配列決定標識領域を具えるか又はこれらからなる５’末端部分の標識を具えるか又はこれからなり、切断部位で５’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分を、及び３’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分を提示する環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成するステップが、各５’末端と３’末端上で一の配列決定標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型（例えば、２重に標識された配列決定鋳型）を生成する。いくつかの好ましい実施例では、各５’と３’末端上に一の配列標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列鋳型を、配列標識領域に特異的な次世代のシーケンサー鋳型として使用する。
【００３５】
この方法は、切断部位で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化するステップを具えるこの方法のいくつかの好ましい実施例では、、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域を具える標識を具えるか又はこの標識からなり、このＲＮＡポリメラーゼ標識領域が、センスプロモータ配列とセンスプロモータ配列の３’である切断部位を提示し、切断部位で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化するステップの後に、この方法は更に（ｉ）線状化して転写基質を生成する前記ステップから生成された各線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端のセンスプロモータにアンチセンスプロモータ配列を提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングするサブステップと；次いで（ｉｉ）２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて転写基質を転写するサブステップと；を具える。この方法のいくつかの好ましい実施例では、転写基質を転写するサブステップの前に、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプロモータ配列を提示する前記オリゴデオキシリボヌクレオチドの伸長によって２本鎖ｃＤＮＡを生成するサブステップを更に具える。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
以下の図面は、本発明の説明の一部を形成し、更に本発明のある態様を示すためのものである。本明細書に提示する特定の実施例の詳細な説明と組み合わせて１又はそれ以上の図面を参照すると、本発明をより理解できる。
【００３７】
【図１】図１は、ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥともいう）の新しいクローンから得て精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示したものであり、古いクローンから得たＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼの精製品におけるアデニル化された酵素のレベル（推定約３０％）と比べて予想外の高いレベルの（推定約７０％）ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼのアデニル化型を示した。タンパク質のサンプルは１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで変性、減少、及び分解した。銀染色してタンパク質を視覚化した。レーン１は、分子量標準 （９７、６６、４５、３０、２０．１、１４．４ｋＤａ）を示す。レーン２は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを示す。白抜きの三角形は、アデニル化された酵素を示す。黒塗りの三角形は、アデニル化されなかった酵素を示す。
【図２】図２は、新しいクローンを用いて得た高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼとも呼ばれる）の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を、古いクローンを用いて得た低度にアデニル化された酵素と比較して示した。予想外に、高度にアデニル化された酵素は、低度にアデニル化された酵素よりも、標準ライゲーション反応混合物中で線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションにおける活性がずっと少なかった。各ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ酵素を１μｇ使用して、標準的なライゲーション反応条件下（５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２，と５０μＭ ＡＴＰを６０℃で１時間）で、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて、５５−ヌクレオチドコントロールオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅをライゲーションした。Ｓｔｏｐ／Ｌｏａｄバッファ（９５％ホルムアミド, １０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．０１％ キシレンシアノールブルー、０．０１％ブロモフェノールブルー）を添加して７０℃で５分間加熱することによって反応が停止した。反応生成物を、８Ｍの尿素を含んだ２０％のポリアクリルアミドゲル中に溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し視覚化した。レーンは：１，ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準（ヌクレオチド）（９７、７７、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５）；２，ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥのない、ネガティブコントロール；３，古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ；４，新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（ｌｏｔ１）；５，新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（ｌｏｔ２）；及び６，ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準である。
【図３】図３は、ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在する場合と存在しない場合の、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子間ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。驚くことに、ＡＴＰをライゲーション反応混合中に使用されていないときに、高度にアデニル化された酵素がより高い活性を示した。エキソヌクレアーゼＩは、線状ｓｓＤＮＡは分解するものの環状ｓｓＤＮＡを分解しない。６０℃で１時間インキュベートした後に反応が停止し、反応物を２０ＵのＥｘｏＩと３７℃で１５分インキュベートさせた。Ｓｔｏｐ／Ｌｏａｄバッファを添加し、７０℃で５分間加熱すると反応が停止した。８Ｍの尿素を含んだ２０％のＰＡＧＥゲル中で反応生成物を分解させて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色した。レーンは：１は、ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準（９７、７７、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５ヌクレオチド）；２−３は、酵素なしのコントロール；４−５は、高度にアデニル化された、ＡＴＰ５０μＭを添加したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ；６−７は、高度にアデニル化された、ＡＴＰを添加しないＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ；８は、ＬＭＷ ＤＮＡサイズ規格である。
【図４】図４は、ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在するときと存在しないときの両方における、さまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質の新しいクローンから得た高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性と、同じ線状ｓｓＤＮＡ基質の標準ライゲーション反応混合物中における古いクローンから得た低度にアデニル化された酵素の分子内ライゲーション活性とを比較したＰＡＧＥ分析の結果を示す。ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在しないとき、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは、標準ライゲーション反応混合物中の低度にアデニル化された酵素によって連結されない又は十分に連結されない多くの線状ｓｓＤＮＡ基質を効率的に環状化した。高度にアデニル化された酵素がもたらすこれらの改善された分子内ライゲーション反応は、以前は不十分な分子内ライゲーションあるいは全く分子内ライゲーションしなかった基質を連結させることができ、更に結果を改善すべく、追加のライゲーション反応条件の検査を継続することを出願人に促す結果となった。
【図５】図５は、ライゲーション反応混合物中でＭｎ２＋陽イオンを使用すると、ＡＴＰが存在しなくても、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））により線状ｓｓＤＮＡ基質を連結することが非常に困難な分子内ライゲーション活性を改善したことを示す。ここで留意すべきは、Ｍｎ２＋陽イオンを添加するときは、標準ライゲーション反応混合物中で使用するＭｇ２＋陽イオンを反応混合物に添加しないことである。高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１μｇを１０ｐｍｏｌｅの線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と共にｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び０、１、２、５、又は１０ｍＭ ＭｎＣｌ２又はＭｇ（ＯＡｃ）２中で６０℃で１時間インキュベートした。次いで、ライゲーション連結されない線状基質を分解すべく、反応混合物の一部を１８ＵのＥｘｏＩ及び２０ＵのＥｘｏＩＩＩで処理した。環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物を、８Ｍの尿素を含んだ２０％ポリアクリルアミドゲルで分解して、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し可視化した。エキソヌクレアーゼ耐性環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の量を目視検査により推定した。
【図６】図６は、Ｍｎ２＋陽イオン（２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２として）を含むがＡＴＰを欠きＭｇ２＋陽イオンを添加したライゲーション反応混合液に１Ｍの両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）添加したときの、連結が非常に困難な線状ｓｓＤＮＡ基質の環状化における、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。 驚くことに又、予期せぬことに、標準ライゲーション反応混合物中で低度にアデニル化された酵素によるこの基質の環状化が５％以下であるのに比較して、ライゲーション反応混合液にベタインを添加すると、連結が非常に困難な線状ｓｓＤＮＡ基質を約１００％環状化した。高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１μｇを、ｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び２．５ｍＭのＭｎＣｌ２中で、１０ｐｍｏｌｅの線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と共に、１Ｍのベタインと、又はベタインなしで６０℃で１６時間インキュベートした。次いで、ライゲーション反応混合物の一部を１８ＵのＥｘｏＩと２０ＵのＥｘｏＩＩＩ で処理して連結されない線状基質を分解させた（レーン１と４）。８Ｍの尿素を含んだ２０％ポリアクリルアミドゲルに、環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物を溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色して可視化した。エキソヌクレアーゼ耐性環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の量を目視検査で推定した。レーン：１−２は、酵素なしのネガティブコントロール；３−４は、１Ｍベタインを添加したもの；５は、ＬＭＷ ＤＮＡ標準サイズである。
【図７】図７は、１Ｍのベタインを含有する改善されたライゲーション反応混合物中のＡｌｕ Ｉで分解された仔ウシ胸腺のｓｓＤＮＡ断片を環状化における高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。 この分析結果は、最大約６０００ヌクレオチドまでの線状ｓｓＤＮＡ断片のサイズや配列構造に基づくグロス基板バイアスがないことを示した。ｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２．５ｍＭのＭｎＣ１２、１Ｍのベタインと、１、２又は４μｇの高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼからなる改善されたライゲーション反応混合物中に変性Ａｌｕ Ｉで分解させた２００ｎｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡを、６０℃で１６時間置いて、１８ＵのＥｘｏＩと２０ＵのＥｘｏＩＩＩで処置して線状ｓｓＤＮＡを分解させた。 反応生成物を、８Ｍの尿素を含有するポリアクリルアミド２０％中に溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色して視覚化した。レーンは：１、ＬＭＷＤＮＡサイズ標準；２−３、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用しないネガティブコントロール；４−５、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ１μｇ、６−７、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ２μｇ、８−９、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ４μｇ、１０、ＫｂラダーＤＮＡ標準サイズである。レーン３、５、７、及び９にはエキソヌクレアーゼを添加した。当然のことながらＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥは、ＡＴＰの非存在下で化学量論的に機能することが予期され、変性して断片化したｓｓＤＮＡが２２０ｎｇ投入したうちの１０％しか環状化しなくても驚くことではない。
【００３８】
〔定義〕
本明細書で特に定義していない又は異なる記述がない限り、以下の本発明に関する用語や記述は、以下の通り解釈するものとする。
【００３９】
用語「例えば」、「など」、「含む」、「含んだ」、又はこれらの変形を本明細書で使用するときは、これらの用語を用語の限定と見なすのではなく、「〜だが限定されるものではない」又は「限定されるものではない」ことを意味すると解釈する。
【００４０】
本発明を説明する文脈の中（特に、特許請求の範囲の文脈の中）において、用語「一つの」や「一」や「その」若しくは類似の指示対象の使用は、本明細書において他に指示がなく、文脈から明らかに矛盾しない限りは、単数と複数の両方を対象とすると解釈する
【００４１】
「親和結合物質」又は「親和結合分子」あるいは「親和性分子」若しくは「親和性標識」は、本明細書では「結合条件」と言われる、一定条件下で分子が互いに親和性を有し「結合」し、「特異的結合対」を形成することを意味する。例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、又はジゴキシゲニン、及びジゴキシゲニンに結合する特異抗体は、「親和結合分子」又は「親和結合物質」あるいは「親和性分子」を具える各特異的結合対の要素を有する「特異的結合対」の例である。親和結合分子（例えば、ビオチン及び／又はストレプトアビジン）は、当該技術分野で周知の方法を用いて（例えば、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｂｙ Ｄ．Ｓａｖａｇｅら，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２，及びｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰｒｏｂｅｓとＲｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｒ．Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ ｉｎ ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６に記載された薬剤や方法を用いて）、他の分子（例えば、ＲＮＡあるいはＤＮＡ）と、又は固体表面と共有結合で、共役、又は非共有結合で結合することができる。当該技術分野で周知の薬剤や方法を用いてＤＮＡあるいはＲＮＡに共役である親和性分子をオリゴヌクレオチド合成装置で合成することができる。
【００４２】
本発明によると、用語「結合」は、限定するものではないが、例えば、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス結合、及びイオン結合などの非共有結合の結果として親和性分子と親和結合物質の相互作用を意味する。理論に拘束されるものではないが、当該技術分野では、特異的結合対に関する分子の相補的な形状又は構造により、このような非共有結合が部分的に結合がもたらすものと考えられている。「結合」の定義に基づくと、他種多様な親和結合分子又は特異的結合対は、結合条件が 様々な特異的結合対によって異なることは明らかである。当業者は、サンプル内で、親和結合分子間で結合が発生する条件を容易に発見又は決定することができる。特に、当業者は、当該分野で「特異的結合」であると考えられる親和結合分子間に結合が生じる条件を容易に決定できる。当該技術分野で理解されているように、この特異性は一般に、親和結合分子間の親和性が、サンプル内の他の物質や成分（例えば、血管壁、固体担体）よりも高い親和性を有するからである。場合によっては、特異性はまた、サンプル内の他の物質や成分よりも親和結合分子の会合が著しく迅速であることに関与するか、又はその原因となる。
【００４３】
本明細書で、用語「核酸の増幅」は、核酸配列又はその相補体の複製の数を増やすことを意味する。増幅された核酸は、修飾されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの混合物を具える、これらからなる、又はこれらに由来するＤＮＡであってもよい。 開始核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方でも、核酸分子又は分子（即ち、「増幅生成物」）の増幅による生成物は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはＤＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びＲＮＡのヌクレオシドやヌクレオチドの混合物であり、又は生成物は、修飾されたＤＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチド又は修飾されたＲＮＡのヌクレオシド若しくはヌクオチドを具える場合がある。「コピー」は、標的配列に対して必ずしも完全な配列相補性又は配列同一性を意味するものではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似物、意図的な配列変異（例えば、標的配列に対して相補的ではないが、ハイブリダイズされた配列を具えるプライマーにより誘導された配列変異）、及び／又は増幅中に生じる配列エラーを含むことがある。
【００４４】
核酸又は核酸反応に関して本明細書で用いられる用語「増幅」又は「増幅された」、「増幅する」は、例えば本発明の一実施例により生成された標的核酸、又は標識核酸などの特定の核酸のコピーをインビトロで作る方法を言う。当該技術分野では、多数の核酸を増幅する方法が知られており、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号）など転写媒介増幅法、ループ媒介増幅法（ 例えば、米国特許第６，４１０，２７８号に記載されたループ形成配列を用いた「ＬＡＭＰ」増幅など）を含む。
【００４５】
用語「アニール」又は「ハイブリダイズ」及び「アニーリング」又は「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック塩基対により複合体を形成するのに十分に相補的なヌクレオチド配列間の複合体形成を意味する。本発明に関して、「〜に相補的な」又は「〜と相補的な」又は互いに若しくは互いと「ハイブリダイズ」又は「アニール」する核酸配列は、使用目的を果たすのに十分に安定である「ハイブリッド」又は「複合体」を形成ができるものでなくてはならない。ハイブリダイゼーション又はアニーリング及びハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸鎖間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、塩濃度などの条件に影響を受けた条件の切迫性、形成されたハイブリッドのＴｍ（融解温度）、他の成分（例えば、ポリエチレングルコール又はベタインの有無）の存在、ハイブリダイジング鎖のモル濃度、及び核酸鎖のＧ：Ｃ含有量を含む当該技術分野でよく知られた多くの要因による影響を受ける。
【００４６】
いくつかの実施例では、「ｃＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ分子」は、目的のＲＮＡ分子の少なくとも一部を鋳型として用いて、ＲＮＡ非依存的ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素で触媒し、１又はそれ以上の目的のＲＮＡ分子にアニールするプライマーの伸長により合成された「相補的ＤＮＡ」を意味する（この過程は「逆転写」と呼ばれる）。この方法のいくつかの実施例では、逆転写酵素とメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子など目的のＲＮＡ分子を用いて逆転写により第１鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、ｍＲＮＡは生体サンプルから鋳型として第１鎖ｃＤＮＡを得ており、第１鎖ｃＤＮＡ分子はｍＲＮＡと相補的である。いくつかの実施例において、第１鎖ｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡではなくても、目的の任意のＲＮＡ分子を逆転写して合成したｃＤＮＡ分子を意味する。いくつかの実施例では、用語「第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマー」と「第１鎖ｃＤＮＡ分子」は、第２鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを使用せず、第２鎖ｃＤＮＡ分子を合成しなくても使用される。従って、用語「第１鎖ｃＤＮＡ」又は「第１鎖ｃＤＮＡ分子」は、この方法によって、目的のＲＮＡ分子に相補的な１本鎖ｃＤＮＡのみが合成される場合に使用される。更に、いくつかの実施例では、用語「ｃＤＮＡ」は、目的のＤＮＡ分子の少なくとも一部を鋳型として用いて、１又はそれ以上の目的のＤＮＡ分子にアニールするＤＮＡポリメラーゼが触媒するプライマーの伸長により合成された相補型ＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡ分子は、鋳型の少なくとも一部と「相同」又は「塩基対合」するあるいは「複合体を形成する」。
【００４７】
本明細書で用いられている「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素を意味する。「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型にアニールされたプライマーが伸長することにより、相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）のコピーを合成する酵素である。いくつかのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からも相補的ＤＮＡコピーを合成する場合もあり、この過程を「逆転写」と言う。逆転写できるＤＮＡポリメラーゼを「逆転写酵素」とも言う。
【００４８】
ＤＮＡポリマーの合成に加えて、ＤＮＡポリメラーゼは、多くの他の特徴又は活性を具える。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ活性又は５’ヌクレアーゼ活性とも言う）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、鎖置換活性を有していたり、欠如していたりし、それらが前進する程度に対して特徴づけることができる。いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼが用いられている。例えば、いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ配列に使用している。 例えば、いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼ組成物を、全ゲノム増幅に使用している。
【００４９】
いくつかの ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼにより合成された新しいＤＮＡ鎖として、相補鎖を鋳型鎖へ置換することができる。この過程は、「鎖置換」と呼ばれ、この活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、本明細書では「鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ」と言う。鎖置換ＤＮＡ合成の鋳型は、線状又は環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）でもよい。ＤＮＡ鋳型が環状一本鎖の場合、複製鎖より前に継続的に鎖置換を行ってプライムドＤＮＡ合成体が環の周りをぐるぐる周り始め、この過程を「ローリングサークル複製」と言う。ローリングサークル複製は、環状鋳型のタンデムコピーを合成する。 一般に、本発明の方法に使用されるＤＮＡ鋳型特異的ＤＮＡポリメラーゼは、酵素の処理能力といわれる、鋳型を「抜け落ち」（又はＤＮＡ合成を終了）させることなく使用目的に適切な長さのＤＮＡを十分に合成することが望ましい。鎖置換を行うＤＮＡポリメラーゼ能力は、ＦｉｒｅとＸｕが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４６４１−４６４５，１９９５）で説明したように、ローリングサークル複製分析においてポリメラーゼを用いて容易に測定できる。鎖置換やＤＮＡポリメラーゼ処理能力は、Ｋｏｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５，１９９３）が説明した方法を用いても分析できる。
【００５０】
使用できる鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定されるものではないが、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標） ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＭＭＬＶ逆転写酵素（全てＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。いくつかの実施例では、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼなど３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠如するＤＮＡポリメラーゼと、この活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物を鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとして使用している。ＤＮＡを合成する間に、この酵素の混合物は、改善された忠実度を示すので、いくつかの実施例で有用である（即ち、その酵素の混合物は、より少ない鋳型に相補的でないヌクレオチドを有するＤＮＡを合成する）。忠実度を測定する方法があるので（例えば、配列決定により）、特定条件下での多くのＤＮＡポリメラーゼの忠実度及び／又はエラー率が既知である。
【００５１】
一般に、本発明の鎖置換増幅法においては、この方法で使用される鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの量は、反応を阻害することなく、反応に悪影響を及ぼさずに、できるだけ高いことが好ましい。例えば、ＲＥＰＬＩＰＨＩ（商標） ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を、２０マイクロリットルの反応液中に約１マイクロリットルのタンパク質で、ＤＩＳＰＬＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を、５０マイクロリットルの反応液中に約５０ユニット乃至３００ユニットで使用できる。ユニットの定義は、ポリメラーゼによって異なり、供給元又はソースが異なる類似のＤＮＡポリメラーゼでさえ異なり、各酵素の活性が、さまざまな温度やさまざまな反応条件によって異なるので、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの量と使用する各ＤＮＡ鋳型やプライマーの反応条件を最適化することが望ましい。
【００５２】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」とも呼ばれる一連の「モノヌクレオシド」を具える高分子を意味し、１のヌクレオシドの五単糖の３’位と隣のヌクレオシドの五炭糖の５’位は、リン酸ジエステル結合などのヌクレオシド間の結合により結び付けられるがこれに限定されない。リン酸基が結び付いてるヌクレオシドを、「ヌクレオチド」と呼ぶ。一連の隣のヌクレオチドの５’位に結び付くヌクレオチドを「５’の」又は「５’ヌクレオチド」と言い、５’ヌクレオチドの３’位に結び付くヌクレオチドを「３’の」又は「３’ヌクレオチド」と言う。本明細書で用いられる用語「５’の」及び「３’の」は、核酸の１本鎖内の別の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、又は遺伝的因子に関連する特定の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、又は遺伝的因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列）の位置又は方向を意味する。第１核酸配列が、１本鎖上における第２配列の３’にあれば、第１配列の相補体は、相補鎖上における第２配列の相補体の５’にある。ある特定の核酸鎖内の配列又は遺伝子的因子の相対的な５’又は３’の位置や方向に関する本発明の説明が理解される。
【００５３】
置換モノヌクレオチドの糖部分の５’炭素及び３’炭素に、核酸リン酸ジエステル結合が生じるので、線状核酸分子は、「５’終端」（５’末端）や「３’終端」（３’末端）を有すると言われている。新しい結合が５’炭素となる、ポリヌクレオチドの末端は、５’末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素となるときのポリヌクレオチドの末端は、３’末端ヌクレオチドである。本明細書で用いられる 末端ヌクレオチドは、３’又は５’末端の末端部位におけるヌクレオチドである。
【００５４】
核酸の五炭糖は、リボースでもよく、この場合は、核酸又はポリヌクレオチドを「ＲＮＡ」と呼び、あるいは２’デオキシリボースでもよく、この場合は、核酸又はポリヌクレオチドを「ＤＮＡ」と呼ぶ。代替として、特に、核酸を化学的に合成されている場合は、この核酸はＤＮＡ及びＲＮＡのモノヌクレオチドの両方を具えるがことある。ＲＮＡとＤＮＡの両方の各五炭糖は、４つの共通の又は「標準的な」核酸塩基（それぞれ「塩基」とも呼ばれる）のうちの１つと共有結合する。糖類に結合する天然に存在する３つの主要な塩基（アデニン、シチジン、及びグアニン）は、ＤＮＡとＲＮＡの両方に共通であるが１の塩基が異なっており、ＤＮＡは追加の塩基がチミンであるのに対しＲＮＡは追加の塩基はウリジンである。場合によっては、ウリジンがＤＮＡ中に塩基として存在しうる。当業者は、一般に小さいポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」とみなす。本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、２又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド（場合によっては、「オリゴデオキシリボヌクレオチド」とも言う）又はリボヌクレオチド、好ましくは約６乃至１００ヌクレオチドを具える分子と定義するが、オリゴヌクレオチドの長さは限定していない。正確なサイズは、多くの要因よって決まり、同様に基本的なオリゴヌクレオチドの機能又は使用によって決まる。
【００５５】
更に、いろいろな理由により、本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、１又はそれ以上の修飾核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間の結合を具える。例として、修飾塩基、糖部分、又はヌクレオシド間の結合を含む核酸又はポリヌクレオチドを使用するいくつかの理由には：（１）Ｔｍの修飾する；（２）１又はそれ以上のヌクレアーゼに対するポリヌクレオチドの感受性の変更；（３）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ プラス アルカリ性条件又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼで切断されたｄＵＭＰ残基など、又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆａｐｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ又はＦｐｇとしても知られる）プラスアルカリ条件又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼで切断された８−オキソ−ｄＧＭＰ残基などの切断部位の提供；（４）ラベル又は親和性標識を取り付ける部分の提供する；（５）ラベル又はラベルの抑制の提供する；又は（６）溶液中にある又は表面に結合した別の分子に取り付る親和性標識としてのビオチンなどの部分の提供；が含まれる。
【００５６】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドに関して、１又は２以上の糖部分は、２’−デオキシリボースを具えていてもよく、又は代替として、１又はそれ以上の糖部分が、例えばいくつかのヌクレアーゼに耐性を提供するリボース、又は２’−フルオロ−２’−デオキシリボースあるいは２’−Ｏ−メチル−リボースなどいくつかの糖部分でもよいが、これらに限定するものではない。この糖部分は、又は可視性の、蛍光性の、赤外蛍光性の、又は求電子性、光反応性、アルキニル、又は反応性化学部分を有するその他の検出可能な染料あるいは化学薬品と反応させてラベルできるいくつかのヌクレアーゼ又は２’−アミノ−２’−デオキシリボース又は２’−アジド−２’−デオキシリボースに対して抵抗する。
【００５７】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドのヌクレオシド間の結合は、ホスホジエステル結合でもよく、又は いくつかのヌクレアーゼに耐性を有するホスホロチオアート、ホスホロジチオリン酸、ホスホロセレン酸塩、又はホスホロジセレン酸塩結合など修飾された結合を具える１又はそれ以上のヌクレオチド間結合が代替となり得るが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「ランダム配列」を提示するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの一部を言うとき、我々は、ランダム配列部分内のまさにヌクレオチド部位に４つの標準的なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を、全て等量用いてオリゴヌクレオチド又はその一部を合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて）することを意味する。この方法は、（４のｎ乗）＋１の異なるオリゴヌクレオチドを具えるオリゴヌクレオチドの混合物を合成し、ここで、「ｎ」は、ランダム配列部分ないのヌクレオチドの部位の数である。従って、これらの実施例では、このオリゴヌクレオチドは、ランダム配列部分のあらゆる可能な配列を示す、多くの異なるオリゴヌクレオチドの混合物を具える。「セミランダム配列」を提示するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの部分を言うとき、我々は、合成されたセミランダムオリゴヌクレオチド又は部分が合成されること（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて）を意味し、ここでは、４つの標準的なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を全て等量用いて合成されたヌクレオチド部位（即ち、上述のようにこれらの部位は「ランダム」である）において、セミランダム部分内の１又はそれ以上の他の部位は、標準塩基ヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ又はＵ）を４つすべてではなく以外の１、２又は３つのみ使用して合成される。いくつかの実施例では、オリゴヌクレオチドは、「縮重塩基」を有する１又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、これは、ＡはＴ又はＵとＧはＣと塩基対を作るという標準の塩基対の規則によるものではなく、１又はそれ以上の塩基対を作ることができる核酸塩基を意味するもであり、「縮重ヌクレオチド」とは、縮重塩基を含んだヌクレオチドのことである。本明細書では、「部分」又は「領域」は同じ意味で用いられ、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（プライマーを含む）の「部分」又は「領域」は２又はそれ以上の塩基が連続した配列のことである。別の実施例では、領域又は部分は、少なくとも約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５のいずれか又はそれ以上の連続する配列のことである。ランダム配列又はセミランダム配列が、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを全て具える場合には、それぞれを「ランダムオリゴヌクレオチド」又は「セミランダムオリゴヌクレオチド」と言う。
【００５９】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチド（「オリゴ」）であり、一般に核酸ポリメラーゼによって伸長できる遊離の３’水酸基を有する。鋳型依存性ポリメラーゼのために、一般にプライマーオリゴの少なくとも３’部分は、鋳型核酸の部分と相補的であり、この部分にオリゴは水素結合や他の分子力で「結合」（又は「複合」「アニール」又は「ハイブリダイズ」）し、鋳型にＤＮＡポリメラーゼにより合成を開始するプライマー／鋳型複合体を与え、ＤＮＡ合成の過程で鋳型と相補的な３’末端に共有結合する塩基を添加して伸長（即ち、「伸長されたプライマー」）する。この結果物は、プライマー伸長生成物である。鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、一般に、１本鎖鋳型に対してＤＮＡ合成（「プライミング」）を開始するのにオリゴヌクレオチドプライマーの錯化剤を必要とするが、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡを合成するのに（転写）は、一般にＲＮＡポリメラーゼを必要としない。
【００６０】
本明細書の「熱安定性ＲＮＡリガーゼ」は、ポリヌクレオチドを意味し、前記ポリペプチドをアデニル化した形が、約０．５乃至１０ｍＭの濃度において、約ｐＨ６．５乃至ｐＨ８、Ｍｎ２＋陽イオンを維持するバッファを具える反応混合物中で約４０℃乃至約７０℃の反応温度において、環状ｓｓＤＮＡ分子に対して５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性の環状化を触媒し、ＡＴＰが反応バッファに存在しない又は、ポリペプチドの非アデニル化した形のモル濃度より低いモル濃度で存在する。本発明の好ましい熱安定性ＲＮＡリガーゼは、上述したようにバクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼであり、これは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７３０３９０１号に記載され、その特許請求の範囲によりカバーされている。しかし、この熱安定性ＲＮＡリガーゼは、本明細書に記載した反応条件下において、ライゲーション反応混合物中で線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するにあたり活性を有する任意のＲＮＡリガーゼを具えることができる。
【００６１】
熱安定性ＲＮＡリガーゼは、天然タンパク質又は組み換えタンパク質から得ることができる。本明細書で用語「天然タンパク質」は、自然発生的（即ち、組み換えではない）源から単離されたタンパク質を意味する。本明細書で用いられる用語「組み換えタンパク質」又は「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ分子から発現したタンパク質分子を意味する。分子生物学的手法は、天然型のタンパク質と比べて同一又は類似の性質を有する組み換え型のタンパク質を生成するのに使用される。天然配列の変異体を作って、例えば、発現、精製、又は望ましいポリペプチドの性質を改善することができる。
【００６２】
組み換えタンパク質である熱安定性ＲＮＡは、融合タンパク質でもよい。本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、外因性タンパク質断片（例えば、非ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼタンパク質を具える融合パートナー）に結合した目的のタンパク質（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ又はその断片）を含んだキメラタンパク質を意味する。融合パートナーは、宿主細胞で発現されている熱安定性ＲＮＡリガーゼのタンパク質の溶解度を高め、宿主細胞又は培養上澄、又はその両方から組み換え融合タンパク質を精製できる親和性標識を提供する。所望であれば、当該技術分野で知られたさまざまな酵素的又は化学的手段により、目的のタンパク質（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ又はその断片）から融合タンパク質を除去することができる。
【００６３】
本発明の好ましい実施例では、熱安定性組成物が、精製されたタンパク質を具える。本明細書で用いられる用語「精製された」又は「精製する」は、タンパク質などの目的の成分から汚染物質を除去することう言う。例えば、特に望ましいタンパク質（例えばＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）は、その他の汚染された望ましくないタンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び／又は生化学的小分子を除去することによってを精製される。汚染物質の除去により、組成物中の所望のタンパク質の割合が上昇する。例えば、好ましい実施例では、核酸に作用を及ぼす汚染核酸や酵素が無くなるよう熱安定性ＲＮＡリガーゼ組成物を精製されている。
【００６４】
いくつかの好ましい実施例では、大腸菌細胞中で複製及び発現するプラスミド又は他のベクター中での熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子（及び／又はそれの機能的変異体や相同体）の発現によって熱安定性ＲＮＡリガーゼが得られる。なぜならこうした組み換えソースから得た熱安定性ＲＮＡリガーゼは、非組み換えソース由来のものよりも、高度に精製され、酵素活性が汚染されておらず、一般に酵素濃度がより高いためである。本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、コードされたポリペプチド又はタンパク質の前駆体（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の生産に不可欠な制御配列とコード配列を具えるＤＮＡ配列を意味する。所望のタンパク質活性を保持する限り、全長コード配列又は部分的コード配列によってポリ ポリヌクレオチドをコードできる。
【００６５】
本発明の好ましい実施例では、熱安定性ＲＮＡリガーゼが「安定」しており、これは熱安定性ＲＮＡリガーゼが、酵素活性の分解や損失に寄与するプロテアーゼやその他の汚染物質に十分に純粋であることを意味し、−２０℃で保管しても少なくとも６ヶ月はさほど大きな酵素活性の損失のない酵素活性保存バッファの製剤を提供する。安定化した熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の提供に適した酵素保存バッファは、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．１％の非イオン洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだ５０％のグリセロール溶液を具える。本明細書で用いられる用語「熱安定性ＲＮＡリガーゼ」は、別のことを示していない限りは、タンパク質又は遺伝子の変形を意味する。
【００６６】
更に、熱安定性ＲＮＡリガーゼの異型は、本明細書により詳しく説明されているそれらのペプチドやＤＮＡ分子が相当すると考える。例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンに、アスパラギン酸塩をグルタミン酸塩に、トレオニンをセリンに単離置換する、又はアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸（即ち、保存的変異）に類似置換しても、得られる分子の生体活性へ大きな影響はないと考える。従って、本発明のいくつかの実施例は、保存的置換を含む熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の変異体を提供する。保存的置換は、側鎖と関連するアミノ酸のファミリー内で起こる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。同様に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン），（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン），セリンとトレオニンは、選択的に脂肪族ヒドロキシル基にグループが分離される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン），（５）アミド（アスパラギン、グルタミン），及び（６）硫黄含有（システインとメチオニン）（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｇ．１７−２１，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）にグループ分けされる。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、機能的ポリペプチドを引き起こすかどうかは、変異ペプチドが野生型タンパク質同様に機能するかどうかを評価することにより容易に決定できる。１より多い置換を有するペプチドも同様に、容易に検査できる。変異体が、「非保存的」変化を含むことはめったにない（例えば、グリシンをトリプトファンに置換）。類似する軽微な変異体は、アミノ酸の欠失又は挿入、又は両方を含んでいてもよい。生体活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基が、置換、挿入、又は欠失しうるかを決定するガイダンスは、コンピュータプログラムを使用して見つけられる（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【００６７】
指向性進化又は他の技術の技術などの変異体の組み合わせライブラリーの生成法によるだけでなく、切断型変異体によっても変異体を生成することができる。いくつかの実施例では、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で縮合遺伝子配列の化学合成により作られた縮重オリゴヌクレオチド配列から相同体と変異体を生成し、次いで発現に適した遺伝子を組み立てるために連結した。いくつかの実施例では、（例えば、所定のコード配列にランダムな突然変異を導入するエラープローンＰＣＲ法を利用して）ランダム突然変異誘発により人工進化を実行している。突然変異誘発後、望ましい活性用に得られたクローンを選択し（例えば、熱安定性ＲＮＡリガーゼ用スクリーニング）、次いで、突然変異や選択の連続するラウンドの過程において、有用な突然変異を次の突然変異の次のラウンドに持ち越す。本発明の他の実施例では、本発明のポリヌクレオチを、遺伝子シャフリング又は性的ＰＣＲ手順に用いている（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３２４，１９９４；米国特許第５８３７４５８号；第５８３０７２１号；第５８１１２３８号；第５７３３７３１号）。複数のサイクルの選択とシャフリングは、いくつかの酵素の機能的強化を導く（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３９８，１９９４；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７，１９９４；Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３１５，１９９６；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４５０４，１９９７；及びＣｒａｍｅｒｉら， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：４３６，１９９７）。断片が所望の酵素活性をコード又は保有する限り、 本発明の核酸やタンパク質の断片を使用できる。
【００６８】
「１本鎖特異的ＤＮアーゼ」は、特に１本鎖ＤＮＡを分解するＤＮアーゼを意味するが、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡが他の核酸分子の一部（例えば、分子間塩基対によって）である又は同一の核酸分子の一部分（例えば分子内塩基対によって）であっても、１本鎖ＲＮＡ又は相補的ＲＮＡあるいはＤＮＡにアニール若しくは複合されたＲＮＡ又はＤＮＡを分解しない。特に、１本鎖ＤＮＡをモノマー又は短いオリゴヌクレオチドに分解するときに活性である限り、１本鎖特異的ＤＮアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼでもよい。いくつかの好ましい実施例では、プライマーを含むデオキシリボヌクレオチドを、それらを使用する方法のステップ後、反応混合物から１本鎖特異的ＤＮアーゼを用いて分解することによって除去する。エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、及びＲｅｃ Ｊは、典型的な１本鎖特異的ＤＮアーゼである。
【００６９】
本明細書では「Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ」（ＲＮＡＰ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ，ＦＷら，ｐｐ．６０−８９ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄ．ｂｙ Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＤＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）、又はバクテリオファージに類似する遺伝的組織を有するバクテリオファージＴ７を意味する「Ｔ７型」由来のＲＮＡＰを意味する。いくつかの実施例では、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータは、シュードプロモータなど（例えば、Ｏｈｍｉｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５４−５９，２００２）など１本鎖である又はＮ４ｖＲＮＡＰプロモータであり、その場合は、Ｎ４ｖＲＮＡＰ（「ミニｖＲＮＡＰ」と表される；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）の転写的に活性な１１０６アミノ酸領域（アミノ酸９９８−２１０３に対応）を具える短縮タンパク質を使用する（Ｋａｚｍｉｅｒｃｚａｋ，Ｋ．Ｍら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：５８１５−５８２３，２００２）。
【００７０】
本明細書で用いられる「ＤＮＡ断片」は、長いＤＮＡ分子から切断、又は放出あるいは分離された長いＤＮＡ分子の部分又は一片又は切片を意味し、これはもはや親分子に付着しておらず、あるいは長いＤＮＡ分子の一部の相補的コピーであるｓｓＤＮＡ意味する。この場合、長いＤＮＡ分子にアニールする又はこれを鋳型として使用するプライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補的コピーを合成する。いくつかの好ましい実施例では、この方法を用いて標識されたＤＮＡ断片の集合又は集団を具える「ＤＮＡ断片ライブラリー」を生成する。
【００７１】
「鋳型」は、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼによりコピーされている核酸分子である。核酸分子が、２本の鎖（即ち、「２本鎖」）又は１本のみの鎖（即ち、「１本鎖」）を具えているか否かにかかわらず、合成された核酸により発現したヌクレオチドの配列に特異的に作用する前記核酸分子の鎖は、「鋳型」又は「鋳型鎖」である。核酸ポリメラーゼによって合成した核酸は、この鋳型に相補的である。 ＲＮＡもＤＮＡも常に通常５’→３’方向に合成され、 鋳型鎖の３’末端から開始して、核酸２本鎖の２本の鎖は常に、２本の鎖の５’末端が２本鎖の反対側の末端にとなるよう配置される（必然的に３’末端もそのようになる）。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより合成を開始するのにＲＮＡとＤＮＡ鋳型の両方に必要であるが、通常単に「ＲＮＡポリメラーゼ」と呼ばれるＤＮＡ非依存的ＲＮＡポリメラーゼにより合成を開始するときはプライマーは必要ではない。
【００７２】
本明細書で用いられる「標識」は、通常ＤＮＡである非ターゲット核酸成分を意味し、これは結合された核酸断片をアドレスする手段を提供する。例えば、好ましい実施例では、標識が付着した（例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長するプライマーが伸長するようにオリゴヌクレオチドをアニーリングする部位提供することによって又は回収又はライゲーション反応のオリゴヌクレオチドを提供することによる）ＤＮＡの識別、認識、及び／又は分子又は生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列を標識は具える。標識をＤＮＡ分子に結合する過程を、本明細書ではときどき「標識する」と言い、標識を受けたり、標識を含むＤＮＡを「標識された」（例えば、「標識されたＤＮＡ」）と言う。標識は、１又はそれ以上の標識部分又は標識領域を有する。
【００７３】
本明細書で用いられる「標識部分」又は「標識領域」は、所望の対象とする目的又はアプリケーションの配列を示す標識部分又は領域を意味する。第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、５’末端部分が標的核酸配列と相補的ではない１又はそれ以上のヌクレオチド配列を提示する実施例において、標識は、その５’部分に１又はそれ以上の「標識領域」を有し、標識領域の各々は所定の目的のために提供される。例えば、いくつかの実施例では、標識は、切断部位標識領域、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域、配列標識領域、回収標識領域、増幅標識領域、検出標識領域、対処標識領域、及びトランスポゾン末端領域から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はそれらからなる。
【００７４】
本明細書で用いられる「切断部位領域」は、切断を促進する目的の配列を提示する標識領域を意味する。いくつかの実施例では、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子から２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ分子を生成するために切断部位領域が用いられている。いくつかの実施例では、標識内の切断部位領域は、１又はそれ以上の２’−デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）部分又は１又はそれ以上の８−オキソグアニン−２’−デオキシリボジル−一リン酸（８−オキソ−ｄＧＭＰ）部分、を具える又はこれらからなり、この方法のステップ（ｃ）は、標識された第１鎖ｃＤＮＡ分子をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）と接触させて１又はそれ以上の脱塩基部位を含む標識された環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、、次いで、アルカリ溶液又は環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を脱塩基部位又はそれに近い部位で線状化して２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼを含む溶液中で、インキュベートするといった条件下で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。いくつかの実施例では、標識内の切断部位領域は、制限酵素認識部位の配列を提示する。いくつかの実施例では、制限部位は標的ＤＮＡ内に、存在するしたとしてもまれである（例えば、ＮｏｔＩ又はＡｓｃＩなどが、まれな切断の制限エンドヌクレアーゼの制限部位である）。いくつかの実施例では、切断部位領域内の制限部位は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼなどＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ用である。いくつかの実施例では、この方法は更に、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片の１本鎖の制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングするステップと；次いで制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位において標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を切断するステップとを具える。このように、いくつかの実施例で、この方法は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を線状化して２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成するステップを具える。いくつかの実施例では、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは、制限部位を具える２本鎖のヘアピンを具える又はこれからなる５’末端部分を有し、この方法は、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位において、標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を切断するステップを具える。（ｉ）１本鎖制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドのアニーリングにより又は２本鎖ヘアピンを具える転写鎖をを用いることにより、２本鎖制限部位を生成するステップと（ｉｉ）次いで２本鎖制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位を切断するステップを具えるいくつかの好ましい実施例では、この方法が更に、制限エンドヌクレアーゼで切断された標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を、適合する３’末端を有する別のＤＮＡ分子に連結するステップを具える。
【００７５】
本明細書で用いられる「ＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域」又は「プロモータ領域」は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータのセンスプロモータ配列又はアンチセンスプロモータ配列用の配列を提示する標識領域を意味する。本明細書で用いられる「センスプロモータ配列」又は「センスＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列」は、ＤＮＡ鎖に結合されたＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を意味し、そのＤＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、転写に適切な反応条件下でそこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼによる転写の鋳型として機能する。本明細書で、「アンチセンスプロモータ配列」又は「アンチセンスＲＮＡポリメラーゼプロモータ」は、センスプロモータ配列と相補的なＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を意味する。いくつかの実施例では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域により提示されたセンスプロモータ配列は、１本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼ用のものであり、この実施例ではセンスプロモータ配列はＲＮＡポリメラーゼプロモータとして十分に機能する（例えばバクテリオファージＮ４ＲＮＡポリメラーゼ）。センスプロモータ配列は、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合するＲＮＡポリメラーゼ用のもので、転写がそこから開始するいくつかの実施例では、この実施例では、この方法が、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いる転写に先立ち、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを２本鎖にするステップを具える（例えば、センスプロモータ配列に相補的なアンチセンスプロモータ配列を提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドをセンスプロモータ配列にアニーリングすること、又はセンスプロモータ配列を具えるか又はこれからなるｄｓＤＮＡを合成するための鋳型として標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を使用することによる ）。いくつかの実施例では、センスプロモータ配列は、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから選択された）用のためのものである。センスプロモータ配列を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域は、この方法を用いてセンスプロモータ配列が連結される１本鎖ＤＮＡと相補的なＲＮＡを合成できる。
【００７６】
本明細書で用いられる「配列決定標識領域」又は「配列決定標識」は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を合成する方法を用いて標識が結合される、ｓｓＤＮＡ断片の配列決定を促進する目的の配列を提示する標識領域を意味する（例えば、合成により配列決定のためのプライミング部位を提供する、又は、ライゲーションにより配列決定するアニーリング部位を提供し、あるいは、ハイブリダイゼーションにより配列決定するアニーリング部位を提供する)。 例えば、いくつかの実施例では、配列決定標識領域は、前記ｓｓＤＮＡ断片のＤＮＡ合成又は前記ｓｓＤＮＡ断片の相補体のプライミングの部位を提供する。
【００７７】
本明細書で用いられる「標識領域の回収」又は「標識の回収」は、標識領域が結合するｓｓＤＮＡ断片の回収を促進させる目的の配列を提示する標識領域を意味する（例えば、ビード又は他の表面上にある標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を回収するためにアニーリング部位又は親和性標識を提供する、例えば、ビード上又はマイクロチップあるいはマイクロアレイもしくは配列決定ビード上にあるプローブなど表面上にある特異的な配列にアニーリングすることによって標識領域配列のアニーリング部位が回収する）。この方法のいくつかの実施例では、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、表面上の相補的なプローブにアニーリングすることにより回収された後に回収標識領域が、前記標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は前記２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片（又は前記標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の相補体）を鋳型として用いてＤＮＡ合成をプライミングする部位を提供する。いくつかの実施例において、回収標識領域は、親和性結合分子を具える又はこれからなる化学基又は部分に結合する転写鎖の５’部分を含む（例えば、転写鎖の５’部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、抗原、又は抗原に結合する抗体などの第１親和性結合分子に結合し、第１親和性結合分子と特異的に結合対を形成する第２親和性結合分子が取り付けられている表面上の環状の標識されたｓｓＤＮＡ断片又は１重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を回収できる）。
【００７８】
本明細書で用いられる「標識領域の増幅」は、前記標識を付加した核酸の増幅を促進する配列を提示する標識領域を意味する。例えば、いくつかの実施例では、増幅標識領域が、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応又は鎖置換増幅反応、あるいはローリングサークル増幅反応）用のプライミング部位、又は核酸増幅反応（例えば、ライゲーションチェーン反応）における鋳型依存性のリガーゼを用いてプローブのライゲーション用のライゲーションの鋳型、を提供する。
【００７９】
本明細書で用いられる「標識領域の検出」又は「検出標識」は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の検出を促進する目的の配列又は検出可能な化学的もしくは生化学的部分を提示する標識領域（例えば、この配列又は化学部分は、ＢＣＩＰ又は適切な基質を有するペルオキシターゼを添加したＮＢＴを有するアルカリホスファターゼなどの基質の存在下で検出可能な酵素である可視的な、蛍光性の、化学発光性の、又は検出可能な染色から選択される検出可能な分子を具える又これらの分子に結合されている）；例えば、緑色蛍光タンパク質である親和性結合分子；及び検出可能な部分に結合した又は親和性結合対又は他の検出可能な親和性結合分子との親和性結合対を形成する親和性結合分子；あるいは当該技術分野で知られた多くの異なる検出可能な分子又はシステムを意味する。
【００８０】
本明細書で用いられる「標識領域にアドレスする」又は「標識にアドレスする」とは、特異的なサンプルの識別を可能にする配列を提示する標識領域を意味する（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分は、各サンプルのためにさまざまな配列を提示するさまざまなアドレス標識領域を有する）。
【００８１】
「トランスポゾン末端領域」は、転移トランスポゾン末端配列を提示する標識部分又は標識領域である。一般に、トランスポゾン末端配列を具える標識を有する線状ｓｓＤＮＡ分子は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能なＮｅｘｔｅｒａ（商標）サンプルプレップキット用いて生成する。
【００８２】
さまざまな標識領域の名称や説明は、さまざまな実施例において、標識のさまざまな部分又は領域の意図した目的や適用をより容易に理解及び議論するための便宜的なものである。しかし、これらの名称や説明は、標識又はいずれの標識領域の使用又は適用の制限を意図するものでは決してない。従って、特定の標識又は標識領域は、意図した又は主要な目的あるいは適用に加えて又は代わりに任意の目的で使用できる。更に、１つの標識領域は、２つ又はそれ以上の別の標識領域を具え（例えば、配列決定標識領域は、回収標識領域と増幅標識領域の両方を具える）、又は１つの標識領域は、２つ又はそれ以上のさまざまな標識領域の機能又は目的あるいは適用を提供できる（例えば、回収標識領域は更に、特定の適用のために配列決定標識領域及び／又は増幅標識領域の機能又は目的を提供することができる）。更にまた、任意の特定の目的又は機能に関して１又はそれ以上の異なる領域の観点から説明する必要はない。
【００８３】
〔発明の一般的な説明〕
鋳型依存性（又は相同体リガーゼ）又は鋳型非依存性（又は非相同体）リガーゼを用いて線状１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子をライゲーションさせて環状ｓｓＤＮＡ分子を作ることができる。
【００８４】
本明細書で用いられる「鋳型依存性リガーゼ」又は「相同リガーゼ」は、相補的なポリヌクレオチドにアニールする場合に、連結すべきｓｓＤＮＡの両方の末端が互いに隣接するときに線状ｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーション（即ち、環状化）を触媒するＤＮＡリガーゼを意味する。連結すべきｓｓＤＮＡ分子の両末端が隣接してアニールするポリヌクレオチドを、本明細書では「ライゲーション鋳型」と言い、ライゲーションを、「鋳型依存性ライゲーション」又は「相同ライゲーション」と呼ぶ。ライゲーション鋳型は、生体サンプル中のゲノム又は他のＤＮＡ中の相補的ＤＮＡ配列であってもよく、あるいはライゲーション鋳型は、合成され特異的又は特定の線状ｓｓＤＮＡ分子を提供する「架橋オリゴデオキシリボヌクレオチド」又は「ライゲーションスプリントオリゴデオキシリボヌクレオチド」（又は「ライゲーションスプリント」）であってもよい。各架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドは、一方が連結を望む線状ｓｓＤＮＡ分子の末端に相補的なヌクレオチド配列を提示するよう設計されており、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドにアニールするときに、線状ｓｓＤＮＡ分子の末端が隣接する。鋳型依存性ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション鋳型が存在するときのみｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを触媒する大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡリガーゼ、及びＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などのＮＡＤ型ＤＮＡリガーゼや、平滑末端ライゲーション用のライゲーション鋳型を必要としないが、鋳型非依存ライゲーションよりもずっと効率的に鋳型依存性ライゲーションを触媒するＴ４ＤＮＡリガーゼあるいはＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼを含む。
【００８５】
生体サンプル内に標的配列又は架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドからなる相補的ライゲーション鋳型が存在すると、線状ｓｓＤＮＡ鋳型依存性分子内ライゲーションは効果的かつ特異的であり、生体サンプル中の標的核酸配列の存在の検出又は定量化は当該技術分野で知られる多くの方法の基礎となる。しかし、サンプル中の全ｍＲＮＡ分子のオリゴ（ｄＴ）をプライマーとした逆転写により合成された全第一鎖ｃＤＮＡ分子などのさまざまなｓｓＤＮＡ分子の大きな集団を環状化することが目的であっても、連結される全てのｓｓＤＮＡ分子に適切な相補的架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計するのは非常に困難なので、鋳型依存的ライゲーションは、非常に非現実的である。特に、ｓｓＤＮＡ分子の末端の配列が未知であると、サイズやヌクレオチド配列が変化するｓｓＤＮＡ分子の大きな集団のｓｓＤＮＡ分子の全てを高い割合で環状化させるために相補的架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計又は提供することは非常に困難又不可能である。例えば、さまざまな鋳型依存的リガーゼや連結反応条件で架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて未知のあるいはランダムな５’及び／又は３’末端配列を提示した線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化しようとした本出願人の研究室での多くの実験では、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドがさまざまな長さのランダムヌクレオチド配列又は我々が連結することを希望した線状ｓｓＤＮＡ基質の一末端で既知の配列に相補的な配列を提示し、イノシンなどの普遍的塩基を具えるランダム配列のさまざまな長さ又は配列のさまざまな長さからなる配列のもう一端の配列の隣接分を提示しても、線状ｓｓＤＮＡ分子が連結される割合は、数パーセント未満である。理論に拘束されることなく、出願人は、連結される線状ｓｓＤＮＡ分子の一末端に架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドの既知の配列が正確に相補的配列にアニールしたと考えているが、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドのもう一末端のランダム配列は、しばしば線状ｓｓＤＮＡ分子のもう一末端に相補的ではない（そしてライゲーションがブロックされる）。このように、鋳型依存的リガーゼを用いる方法は、多くのアプリケーション（例えば、サンプル中の全てのｍＲＮＡ分子から調整された全ての第１鎖ｃＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成する（例えば、遺伝子発現分析用）に、又は変性ゲノムＤＮＡ断片から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに実用的ではない（例えば、ＣＮＶ分析）。
【００８６】
線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するには、相補的な標的核酸又は架橋オリゴヌクレオチドなどの、ライゲーション鋳型を必要としない分子内ライゲーション方法が当該技術分野で必要とされる。必要なのは、我々が本明細書で意味する「鋳型非依存的」または「非相同」リガーゼを用いた分子内ライゲーション方法であり、その末端が連結したい線状ｓｓＤＮＡの末端に標的ヌクレオチドまたは架橋オリゴヌクレオチドなどのライゲーション鋳型が無い所で、線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションさせて環状ｓｓＤＮＡを生成するリガーゼがアニールしてその末端が隣接する。
【００８７】
上記のように、線状ｓｓＤＮＡ分子の配列と長さによっては、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への分子内鋳型非依存ライゲーションの技術分野で行われており、知られている方法やライゲーション反応混合物は、不十分で変わりやすい結果をもたらす。従って、最高の分子内鋳型非依存ライゲーションの結果をもたらすファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼのような熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いても、分子間鋳型非依存ライゲーション方法の改善や改善された連結反応混合物やキットについては当該技術分野において、緊急の満たされていない必要性がある。当該技術分野で知られている最も入手可能なライゲーション反応混合物とライゲーション条件を使用した。本明細書で用いられる「標準ライゲーション反応混合物」とは、ここでは５’リン酸基と３’水酸基を有する０．５マイクロモルの線状ｓｓＤＮＡ基質、１マイクロモルの熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、マイクロリットルあたり５ユニットのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ）、５０ミリモルＭＯＰＳバッファ（ｐＨ７．５）、１０ミリモルのＫＣｌ、１ミリモルのＤＴＴ、５ミリモルのＭｇＣｌ２、２．５ミリモルのＭｎＣｌ２、及び５０マイックロモルのＡＴＰを含むライゲーション反応混合物を意味し、「標準ライゲーション反応条件」は、線状ｓｓＤＮＡ基質分子を標準連結反応混合物中において６０℃で１時間インキュベートすることを意味する。上記の標準ライゲーション反応混合物と標準ライゲーション反応条件は、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーション用に当該技術分野で共通で用いられるものと同一又は類似である。ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（例えば、ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ｌｉｔ．＃２２２を参照されたい）用のｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションの標準ライゲーション反応条件を推奨しており、Ｐｒｏｋａｒｉａ、及びそのパートナー会社、ＭａｔｉｓとＰｒｏｋａｚｙｍｅは、彼らが追加的に、ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準ライゲーション反応混合物（例えば、ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｈｅｅｔ ｖｅｒｓｉｏｎ４．２におけるＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（製品番号Ｒｌｉｇ １２２）用の「ｓｓＤＮＡライゲーション」（環状化）の指針を参照）に最終濃度マイクロリットルあたり２５ｎｇＢＳＡまで添加することを推奨したことを除き、標準ライゲーション反応条件を推奨する。これは、ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼは、２００４年４月２６日付でＰｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ又はＰｒｏｋａｚｙｍｅのディストリビュータから入手可能である。
【００８８】
上記標準ライゲーション反応条件を用いた線状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーション後に、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってその反応生成物を分析する。ゲル上に流す前に連結されないｓｓＤＮＡ分子を分解し、環状ｓｓＤＮＡ分子内ライゲーション生成物の識別を助けるエキソヌクレアーゼ（エキソＩ又はＩＩＩ又は、好ましくは両方の酵素の混合物）で、サンプルを処理する。
【００８９】
発明者と発明者の雇用者であるＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の従業者が共働し、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを販売した約５年間、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社の科学者達は、標準ライゲーション反応混合物や条件を用いてさまざま配列又は長さを有する、その他のものよりｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドが容易に環状化されることを観察した。生体サンプル由来のｍＲＮＡを逆転写して作られた第一鎖ｃＤＮＡなどの、大きい線状ｓｓＤＮＡ分子から酵素を使用して環状ｓｓＤＮＡ分子を高い収率で合成することは非常に困難である。多くのアプリケーションで最高のパフォーマンスが達成されるように全てのｓｓＤＮＡ分子が、同じ高効率で分子内連結するのが好ましい。
【００９０】
ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、扱いづらい又は連結しにくい基質のライゲーション収率を改善するガイドラインを提供している。これらの提案は、標準ライゲーション混合物と比較すると、ＭｎＣｌ２の濃度を変更させるステップやＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素を更に添加するステップを具えている。しかし、ある基質については、連結可能又は連結容易なｓｓＤＮＡ基質で達成できるよりも収率が更に低い。
【００９１】
ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを取り扱っていた数年間で、出願人は、この酵素の様々な調整法がある線状ｓｓＤＮＡ基質をともなう環状ｓｓＤＮＡ生成物を可変収率で生成することを観察した。
【００９２】
２００８年に、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の科学者は、従来のクローンから得られていたものよりもより良い大腸菌細胞中のタンパク質の発現又は収率を得るためにバクテイオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子の新しい組み換えプラスミドクローンを作成した。米国特許第７，３０３，９０１号に開示するように、新しい組み換えクローンは、ヘキサヒスチジン標識を有さないバクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を含有している。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は精製して、この精製した酵素調整をＳＤＳを含んだ１０％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分析したとき、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素が、良い収率で新しいクローンから発現され、期待の４３，８７６ダルトンの分子量であった。しかし、出願人は、この新しいクローンから調整したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）の大部分が、ＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化された形からなることを知って驚いた（約７０％のアデニル化と推定）（図１）。これに対して、従来のクローンから調整した酵素の同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分がＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル化された形からなることを示した（約３０％のみがアデニル化されていると推定される）。新しいクローンと古いクローンの両方から調整した酵素を、標準ライゲーション反応条件下で使用したとき（上述）、古いクローンから調整した酵素を用いて得た収率と比較すると、新しいクローンから調整した酵素を用いて得た環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の収率の方が低かった。この結果はやや意外であり、さまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質、さまざまなライゲーション反応混合物を用いて新しいクローンと古いクローンの両方から調整したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素の分子内ライゲーション活性を、出願人は体系的に比較した。ここで、ライゲーション反応混合物は、さまざまなレベルのＡＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２を有するライゲーション反応混物合を含み、新しいクローンと古いクローンから調整された異なるレベルのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）を含み、反応時間は様々であり、両性イオン化合物トリメチルグリシン（ベタイン）などのライゲーション反応混合物中の全く新しい成分を含む。
【００９３】
驚くべきかつ予期せぬことに、ＡＴＰ非存在下で、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ）酵素のアデニル化形式のモルが線状ｓｓＤＮＡ基質に対して過剰な状態でライゲーション反応を実行すると、特に新しいクローンから高度にアデニル化された酵素が、おおよそ定量的なさまざまなヌクレオチド及びサイズを有しさまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質を有する分子内ライゲーションを生成したことを観察した（特に、ライゲーション反応混合物やライゲーション反応条件を改善するためにライゲーション反応を更に修飾する方法を出願人が発見した後）。
【００９４】
得られた結果（実施例を参照されたい）により、出願人は、さまざまなヌクレオチド配列及び／サイズを有するはるかに効率的で一貫性のある線状ｓｓＤＮＡ基質を可能にする、改良されたライゲーション反応混合物と、改善されたライゲーション反応混合物を用いた改善された分子内ライゲーション方法の開発が可能になった。
【００９５】
したがって、本発明の一実施例は、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への分子内ライゲーション用の改善されたライゲーション反応混合物である。本明細書の「改善されたライゲーション反応混合物」は、
（ａ）線状ｓｓＤＮＡ分子；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、この熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化され、アデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が少なくともｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と等しい組成物；
（ｃ）ｐＨを維持するバッファ；及び
（ｄ）Ｍｎ２＋陽イオン；を具えるライゲーション反応混合物であって、
ＡＴＰが反応バッファ中に存在しないか、もしくは熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル形の濃度より低いモル濃度で存在する混合物を意味する。好ましい実施例では、連結反応混合物にＡＴＰは添加されない。
【００９６】
熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の高い割合がアデニル化され」との記載は、改善されたライゲーション反応混合物中の全てのリガーゼ分子の少なくとも約６０％がアデニル化されることを意味する。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約７０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約８０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約９０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約９５％以上がアデニル化されている。いくつかの好ましい実施例では、精製過程の間又は後に、ＡＴＰを有する酵素をインキュベートすることにより熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化された組成物を作成するために、熱安定性ＲＮＡリガーゼがアデニル化される。例えば、熱安定性ＲＮＡリガーゼをアデニル化するのに用いることができる一のプロトコルは、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリスＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５ｍＭのＡＴＰを含む溶液中５０℃で１５分間インキュベートし、次いで５ｍＭの最終濃度になるまでＥＤＴＡを添加し反応を停止させ、次いで透析又はゲルろ過により反応成分を除去する。熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化された割合は、実施例で説明したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により推定できる。いくつかの好ましい実施例では、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化されている熱安定性ＲＮＡリガーゼが、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、バッファがは、ｐＨをｐＨ６．５乃至８．０で維持されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、バッファがは、ｐＨをｐＨ７．０乃至８．０で維持されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、ｐＨがｐＨ７．０乃至８．０で維持されているバッファはトリスバッファである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、０．５乃至１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、１．０乃至１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、１乃至５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は２．５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンが、ＭｎＣｌ２として提供されている。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも２倍のモル濃度である。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも５倍のモル濃度である。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも１０倍のモル濃度である。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、塩化ナトリウム又は酢酸カリウムなどの塩を具える（例えば約５０ないし約１００ｍＭの濃度）。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物が更に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元試薬を具える（例えば約０．５又は約１ｍＭの濃度で）。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物は更に、約０．２５乃至５．２Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物が更に、約０．５乃至２Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、約１Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。
【００９７】
いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物は：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有するｓｓＤＮＡ分子（例えば、０．５マイクロモル）；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、７０％を超える熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が、アデニル化されており、改善された連結反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度が少なくともｓｓＤＮＡ分子の濃度と等しい、（例えば、０．５マイクロモルの線状ｓｓＤＮＡ分子に対して約１マイクロモルのアデニル化されたＲＮＡリガーゼ）組成物；
（ｃ）最終ｐＨが、約ｐＨ７．８である３３ｍＭのトリス酢酸；及び
（ｄ）最終濃度が約２．５ｍＭであるＭｎ２＋陽イオン；を具え、
ＡＴＰが、反応バッファ中に存在しないか、あるいは熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル化形の濃度より低いモル濃度で存在する。好ましい実施例では、ＡＴＰをライゲーション反応混合物に添加しない。
【００９８】
いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、６６ｍＭの酢酸カリウムと０．５ｍＭのＤＴＴを具える。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、１Ｍのベタインを具える。
【００９９】
本発明の別の実施例は、環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法であり、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度約４０℃乃至約７０℃で、環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度５５℃乃至７０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度５５℃乃至６５℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーションの方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で、反応温度６０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも２倍高い。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも５倍高い。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも１０倍高い。
【０１００】
上記の予期せぬ発見により、関連するメカニズムのより良い理解し、我々が、他の状況に対する研究成果、アプリケーション及び方法を適用及び広げることで、出願人は、改善されたライゲーション条件の基礎を考えるに至った。我々の研究成果とこの成果をより良く理解することで、線状ｓｓＤＮＡ分子をより効果的で一貫性のある分子内ライゲーションと、それらが有用である任意のアプリケーションに環状ｓｓＤＮＡ分子の合成における収率の最大化する結果になることを希望する。論理や推測に拘束されることなく、出願人は、本明細書に記載された本発明の基礎や潜在的な利益に関連する考えやアイディアを以下に示す。
【０１０１】
バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて、さまざまな配列とサイズのｓｓＤＮＡ分子の可変的な分子内ライゲーション効率の問題を解消すべく、出願人はこの酵素のライゲーションメカニズムに関連するさまざまな触媒ステップを慎重に検討した。この触媒ステップは、一般に実質上全てＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼに共通である。
【０１０２】
バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）又はＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標））ライゲーション反応のステップは以下の通りである：
反応１．リガーゼ＋ＡＴＰ→アデニル化されたリガーゼ＋ＰＰｉ
反応２．アデニル化されたリガーゼ＋線状５’−ｐＤＮＡ→ＡｐｐＤＮＡ＋リガーゼ
反応３．リガーゼ＋ＡｐｐＤＮＡ→環状ＤＮＡ＋ＡＭＰ＋リガーゼ
【０１０３】
従って、第１反応のステップは、ＡＴＰによるＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ活性部位であるリシンのイプシロンアミノ基をアデニル化してアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼを形成するステップを具える。次いで、第２反応のステップでは、熱安定性ＲＮＡリガーゼからＡＭＰ部分を５’リン酸基に転移させて５’アデニル化ｓｓＤＮＡを合成する。最後に、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼが、５’アデニル化末端（ライゲーション反応で「ドナー」と呼ばれる）上のｓｓＤＮＡの３’水酸基（ライゲーション反応で「受容体」と呼ばれる）の攻撃を促進し、それによりｓｓＤＮＡの３’末端を５’末端に結合させて環状ｓｓＤＮＡを合成し、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼとＡＭＰを放出させる。
【０１０４】
熱安定性ＲＮＡリガーゼの上記３ステップのライゲーション反応メカニズムに基づいて、当該技術分野で用いられる標準ライゲーション反応条件と比較して環状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションの効率と収率を改善させるいくつかの戦略を想像できる。
【０１０５】
例えば、当該技術分野で採用した一の戦略は、ＡＴＰ濃度を調整してより効率的でより高いレベルの分子内ライゲーションを与える濃度を見つけることである。この戦略は、ときには熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて容易に連結できる単一ｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションを最適化するのに効果的である。「容易に連結する」は、ｓｓＤＮＡ基質が熱安定性ＲＮＡリガーゼにより十分に分子内連結して高レベルで環状ｓｓＤＮＡ分子を形成できる配列とサイズを提示することを意味する。「高レベル」とは、標準ライゲーション反応条件下において熱安定性ＲＮＡリガーゼの存在下で１時間インキュベーションした後、線状ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも５０％が分子内で連結することを意味する。しかし、「発明の背景」の項で論じたように、この問題に取り組んでいた数年の間に、本発明の出願人やＮｕｎｅｚら（上記した）などの当業者は、さまざまなｓｓＤＮＡ分子用の分子内ライゲーション効果に大きな違いを観察した。そうした我々の努力にもかかわらず、容易に連結するｓｓＤＮＡ基質の信頼性のある予測及びどのｓｓＤＮＡ基質が効率的に連結することが困難又は不可能でさえあるということを予測するルールを作ることができなかった。従って、効率的でレベルの高い単一の連結が困難なｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーションのを達成することを望み、又は配列、サイズ、又はライゲーション効率が異なるｓｓＤＮＡ分子の集団における全てのｓｓＤＮＡ分子の効率的又はレベル高い分子間ライゲーションを達成することを望む状況で、分子間ライゲーション反応用のより優れたＡＴＰ濃度を見つける戦略は成功していなかった。
【０１０６】
我々は、まず「我々や他の者がこのような状況でＡＴＰ濃度を調整することで分子間ライゲーションのより効果的又は高いレベルを達成させることが不成功だった理由は何だろう？」と自身に尋ねた。これに答えるべく、我々は、配列、サイズ又はライゲーション効率が異なるｓｓＤＮＡ分子集団において、効果的なかつ高いレベルの全てのｓｓＤＮＡ分子の分子間内ライゲーションを達成しようとする一般的な状況を検討した（生体サンプル中の全てのｍＲＮＡ分子の逆転写により生成される全ての第１鎖ｃＤＮＡ分子を又は変性断片化されたゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡのような断片化されたｄｓＤＮＡの変性により得られた全てのｓｓＤＮＡフラグメントを分子間で連結するときに見られることなど）。このような集団の中で、容易に連結されｓｓＤＮＡ分子や連結が困難な他のｓｓＤＮＡ分子をいくつか発見した。ＡＴＰの存在下でライゲーション反応開始後のさまざまな時点で、連結が容易なｓｓＤＮＡ分子、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子、及びＲＮＡリガーゼに何が起こっているのだろう？
【０１０７】
第１反応のステップは、反応温度で（ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは通常は約６０℃）ライゲーション反応混合物をインキュベーションすると直ちに開始するＲＮＡリガーゼ分子のアデニル化するステップを具える。このステップが生じると、第２反応ステップにおいて、アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子を使用してｓｓＤＮＡ分子の５’リン酸末端をアデニル化する。ＲＮＡリガーゼにより急速に分子間で連結されるｓｓＤＮＡ基質を意味する、連結が容易なｓｓＤＮＡライゲーション基質には、ＡＴＰにより全てのＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化される前に、その基質が急速にアデニル化され、次いでこの第２反応ステップ後に非アデニル化リガーゼに結合しつづけているアデニル化されたｓｓＤＮＡ分子が、第３反応ステップで非アデニル化ＲＮＡリガーゼにより分子内で結合する。ＲＮＡリガーゼにより非常にゆっくり分子内で連結される基質を意味する連結が困難なｓｓＤＮＡライゲーション基質については、ライゲーション反応の第２又は第３のステップ、又は両方のステップがよりゆっくり生じる。従って、大部分又は全てのＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化されるまでＡＴＰによりＲＮＡリガーゼ分子が一層アデニル化されるので、いくらかのｓｓＤＮＡ分子もアデニル化される。しかし、アデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼは、アデニル化されたｓｓＤＮＡ分子を分子内ライゲーションすることできない。従って、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子がいくらかまだ分子内で連結されているが、アデニル化されていない後に、ＲＮＡリガーゼ分子の全てがアデニル化されると、アデニル化された連結が困難な線状ｓｓＤＮＡ分子を環状ｓｓＤＮＡ分子に変換するライゲーションステップ３を完了することが不可能である。特に、ライゲーション反応ステップ２の後に、ＲＮＡリガーゼ分子の全てがアデニル化され、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子がアデニル化されているが、非アデニル化ＲＮＡリガーゼに結合していない場合、これらのアデニル化されたｓｓＤＮＡ分子は連結されない。従って、ＡＴＰ存在下で分子内ライゲーション反応が、熱安定性ＲＮＡリガーゼの全てがアデニル化され、線状ｓｓＤＮＡ基質のいくらかがアデニル化された場合に、その反応を制限することがある。
【０１０８】
この問題に対する考えられる解決策の１つは、ライゲーション反応混合物におけるＡＴＰの濃度を下げることだろう。しかし、ＡＴＰ濃度があまり低いと、ライゲーション反応ステップ１が律速となって第２及び第３ライゲーション反応ステップの速度をも低下させてしまう。反応の過程では、ＡＴＰ濃度が減少すると全体の反応速度もまた時間とともに減速する。おそらく、ＡＴＰ再生システムを採用してリガーゼを完全にアデニル化させない定常状態レベルにＡＴＰ濃度を維持することができる。しかし、この反応におけるさまざまな線状ｓｓＤＮＡ分子の全てにとって、条件が最適ということではない。ｓｓＤＮＡ分子の全てのライゲーションを制御又は最適化するのがより困難になるので、他の反応成分を追加してより複雑さが増すことも好ましくない。
【０１０９】
要約すると、ライゲーション反応ステップ１が速く、ライゲーション反応ステップ２と３が律速であると、どれだけ長く反応を実行しても、環状の収率が低くなる。これは、［ＡＴＰ］＞＞［リガーゼ］である標準ライゲーション条件下で、リガーゼの全てがアデニル化形になるためである。ライゲーション反応ステップ１と２の両方が速く、ライゲーション反応ステップ３が律速であると、同じ理由で環状の収率が低くなる。このように、熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いてｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを行う当該技術分野で知られている標準ライゲーション混合物及び方法を使用すると、ＡＴＰにより酵素の全てがアデニル化される前に連結が容易なｓｓＤＮＡライゲーション基質はアデニル化され、ＲＮＡリガーゼにより急速に分子内ライゲーションが生じるのに対し、連結が困難なｓｓＤＮＡライゲーション基質は、ＡＴＰにより酵素の全てがアデニル化される前にアデニル化はされるが、連結はなされず、アデニル化された連結が困難なｓｓＤＮＡ基質を完全に分子内ライゲーションすることを不可能にする。
【０１１０】
これらの結果に基づいて、理論に拘束されることなく、このような条件下で、改善されたライゲーション反応混合物と線状ｓｓＤＮＡ分子と外因性でないＡＴＰに対してアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼを上回る過剰なモルを使用する改善されたライゲーション反応条件を用いて分子内ライゲーションで分子内ライゲーションが改善されると、出願人は仮定する。なぜなら、この条件下では、ライゲーション反応の第１ステップがバイアスされ、ライゲーション反応の第２ステップにおいて線状ｓｓＤＮＡ分子がアデニル化されるのと同時に非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼをアデニル化するのにＡＴＰを必要としないためである。従って、定常状態条件下では、ライゲーション反応の第２ステップにおいて、アデニル化ＲＮＡリガーゼを線状ｓｓＤＮＡ分子はアデニル化するためだけに使用される。更に、改善されたライゲーション反応条件下では、線状ｓｓＤＮＡのアデニル化が生じると、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼ濃度が反応中に時間とともに増加してこれが線状ｓｓＤＮＡ分子ライゲーションを促進して環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する。
【０１１１】
当業者は、ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを改善するためにライゲーション反応混合物中で提供される熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化のレベルに注意を払わなかった。出願人は、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物を含むライゲーション反応混合物を特定した又はｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーションのための改善されたライゲーション反応混合物などの使用方法を開示した当業者によるいかなる開示も見つけることができなかった。従って、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物を提供することによりＡＴＰが欠如している本発明の改善されたライゲーション反応混合物を用いて、分子内ライゲーション反応の動力学に対するより大きな制御が達成され、ここでは、この熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化され、連結すべき５’リン酸化ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じ又はこれを上回る濃度でアデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼがライゲーション反応混合物に存在する。
【０１１２】
更に、本発明の改善されたライゲーション反応混合物及び改善されたライゲーション反応条件により、他のライゲーション反応パラメータをより容易に最適化して多くのＤＮＡサンプルの環状ＤＮＡの速度と収率を改善できる。例えば、上記のように、マグネシウムを除去して反応中の二価陽イオンとしてマンガンのみを含めることにより分子内連結の収率を改善することを出願人は見出した。別の例として、ベタインを反応物に添加すると環状ＤＮＡの収率が改善した。ベタインは、高温で酵素の安定性を改善するだけでなく、核酸中のＧ−Ｃ塩基対を不安定にすることが知られている。長い期間のインキュベーション中に高い酵素活性を維持することによるだけでなく、ＤＮＡを分子内ライゲーション用によりアクセスできるようにすることにより、これらの効果の両方ともがより収率を上げた。
【実施例】
【０１１３】
本発明は、以下の実施例と特許請求の範囲において更に定義される。本発明の好ましい実施例が示されているが、当然のことながらこれらの実施例は例として挙げているにすぎない。上記の説明とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな用法と状況に適応させるために本発をさまざまに変更及び改良してもよい。
【実施例１】
【０１１４】
［バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子の新しいクローンから精製したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析］
アデニル化したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）は、アデニル化されていないＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）よりバンドが少し高いため、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動する。図１は、新しいクローンから得たＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色したものを示す。アデニル化の割合は、アデニル化されたバンドとアデニル化されないバンドの相対明度を比較して判断するが、ここに示した新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、約７０％アデニル化された形と約３０％アデニル化されない形を比較して判断する。
【実施例２】
【０１１５】
［高度にアデニル化された新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素と低度にアデニル化された古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素の分子内ライゲーション活性の比較］
標準ライゲーション反応条件下で分析すると、低度にアデニル化された古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを供給された線状ｓｓＤＮＡである５５ヌクレオチドコントロールオリゴヌクレオチドを、約９５％を超える環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図２）。これに対して、高度にアデニル化された新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、同じ線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの約５０％しか環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換しなかった。
【実施例３】
【０１１６】
［新しいクローンから精製した高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼによる線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションにおけるＡＴＰ濃度の影響］
標準ライゲーション反応混合物中に５０μＭのＡＴＰが存在すると、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを供給された５５ヌクレオチドｓｓＤＮＡコントロールオリゴヌクレオチドの約５０％を、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した。標準ライゲーション反応混合物にＡＴＰを含めないと、５５ヌクレオチドｓｓＤＮＡコントロールオリゴヌクレオチドの約９５％以上が、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換された（図３）。環状ｓｓＤＮＡ生成物は、遊離３’末端を必要とする１本鎖特異的エキソヌクレアーゼであるエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）２０ユニットによっては分解されにくかった。環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物は、ＥｘｏＩ分解に耐性があるが、連結されていない線状ｓｓＤＮＡ基質はＥｘｏＩによってを分解されなかった。
【実施例４】
【０１１７】
［さまざまなヌクレオチド配列とさまざまなサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ分子を用いた高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼと低度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの分子内ライゲーション活性の比較］
アデニル化形の酵素をほんの数パーセント具えるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）は、さまざまなヌクレオチド配列とサイズを示すさまざまな線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基質の分子内ライゲーションに可変効率を示す。しかし、アデニル化形の酵素を高い割合で具えるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰが標準ライゲーション反応混合物に含まれていない場合に、さまざまなヌクレオチド配列又はサイズを示すさまざまな線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基質の分子内ライゲーションはずっと高い効率を示した（図４の表）。標準ライゲーション反応混合物からＡＴＰを除去すると検査された線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのほとんどの分子内ライゲーションが上昇したが、４Ｎ４５４ＢやｐＹＲＴＰ．５などのいくつかの線状ｓｓＤＮＡ基質は、これらの条件下ではまだ少ししか連結しなかった。これらの基質を用いて、更にライゲーション反応条件を最適化した。
【実施例５】
【０１１８】
［高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーション反応条件の更なる最適化と改善されたライゲーション反応混合物の開発］
分子内ライゲーションにおいてマグネシウム及びマンガン二価陽イオンの効果を、実施例４で少ししか連結しなかった線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドｐＹＲＴＰ．５基質と高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（新しいクローンから精製されたもの）を用いて評価した。ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いてｐＨ７．６で３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び０、１、２．５、５、又は１０ｍＭのＭｎＣｌ２又はＭｇ（ＯＡｃ）２を含む新しいライゲーション反応混合物中で分子内ライゲーション実験を行った。図５に示すように、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の分子間ライゲーションの最適ライゲーション反応混合物は、マグネシウム陽イオンを有さない２．５ｍＭのＭｎＣｌ２である。これらのライゲーション条件下で、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の約３０％が分子内連結した。更に、標準ライゲーション反応混合物が最適ライゲーション反応条件であるという当該技術分野における従来の所見とは違い、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２にマグネシウム陽イオンを有するライゲーション反応混合物加えてもライゲーションは改善しなかった。２．５ｍＭのＭｎＣｌ２と５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を含んだ同じバッファ内で分子内ライゲーション反応を行ったところ、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の１０％未満が環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換された（データは示さず）。
【０１１９】
分子内ライゲーション反応を、線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドｐＹＲＴＰ．５基質、高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ、及び２．５ｍＭのＭｎＣｌ２を含んだ同じライゲーション反応混合物中で行ったところ、ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションにおける更なる改善は、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡあるいはＤＭＳＯ（５−２０％ ｖ／ｖ）のどちらを添加しても観察できなかった（データ示さず）。本発明は、トリスを含有する改善されたライゲーション反応混合物に限定するものではない。例えば、改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの異なる実施例では、ＭＯＰＳ ｐＨ７．５バッファ又は別のバッファを含んでいる。
【実施例６】
【０１２０】
［改善されたライゲーション反応混合物の更なる開発：連結が困難な基質の分子内ライゲーションのベタインの効果］
実施例５の改善されたライゲーション反応混合物であるｐＨ７．６で３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２、に１Ｍのベタインを追加し、この反応混合物を６０℃で１６時間インキュベートし、分子内ライゲーションにおける両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）の効果をｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて評価した。これらの改善されたライゲーション反応条件下では、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の１００％近くをエキソヌクレオチド耐性、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図５）。経時的分析で決定したところ、連結が容易な線状ｓｓＤＮＡ基質（例えば、線状ｐＹＧＴ．５ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド）の分子内ライゲーションの割合では、ベタインは、検出可能な効果を有しなかった（データは開示せず）。従って、ベタインは、連結が容易な線状ｓｓＤＮＡ基質に阻害的効果を与えることなく、連結が困難なｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションを増進するように見える。それ故、濃度０．２５乃至２．２Ｍのベタインは、改善されたライゲーション反応混合物及び改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例に記載され、約６０℃でより長い反応時間が用いられる。
【実施例７】
【０１２１】
［ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥｓｓＤＮＡリガーゼの基質のサイズの優先の評価］
多くの関連アプリケーションは、ｓｓＤＮＡ基質の多様な個体群の環状化が必要である。さまざまなヌクレオチド配列及びサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ基質の個体群の公平な分子間ライゲーションの可能性を評価するために、制限エンドヌクレアーゼで切断された及び変性されたゲノムＤＮＡを、高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて分子内ライゲーションの基質として検査した。仔ウシ胸腺のＤＮＡを、Ａｌｕ Ｉで完全に分解し、加熱して変性させ氷上で急速に冷却した。結果として生じる線状ｓｓＤＮＡ分子は、変性ＰＡＧＥゲル上で、再現可能で特異的なバンドパターンとサイズの分布を示した。
【０１２２】
実施例６の改善されたライゲーション反応条件下で、Ａｌｕ Ｉで分解され変性した仔ウシ胸腺ｓｓＤＮＡ断片を高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素と共にインキュベートしたところ、総ｓｓＤＮＡ基質２００ｎｇの約１０％がエキソヌクレアーゼ耐性の環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図７）。線状ｓｓＤＮＡ分子で観察される相対的なサイズ分布と特異的なバンドのパターンを、分子内ライゲーションの後に環状ｓｓＤＮＡ分子の形で保存したが、これは、証明するものではないが、ｓｓＤＮＡ断片のサイズ又は全ての配列組成物に基づいて、約６０００ヌクレオチドまでのサイズでは、総基質に偏りがないことを示す。ＲｓａＩで切断し、ゲノムＤＮＡで変性させたものも同様の結果を得た（データは示さず）。
【実施例８】
【０１２３】
［古細菌熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた線状ｓｓＤＮＡ分子の改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション反応条件の適用］
出願人は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（ＭｔｈＲｎｌ）をクローン化し、発現させ、及び精製した（Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｃら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：６２１８−６２２７，２００８）。実施例６に記載される改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション反応条件、含まれているＭｔｈＲｎｌ酵素が約５０％乃至６０％アデニル化されているが、分子内ライゲーション効果が改善され、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への合成が生じた。ＭｔｈＲｎｌ酵素を用いたライゲーション効率と収率は、同様のアデニル化レベルのＣＩＲＣＩＬＧＡＳＥ（ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）を用いたものほど高くない。改善されたライゲーション反応混合物は、さまざまな高度にアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼの混合物を含む（例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼとＭｔｈＲｎｌを含む）。
【実施例９】
【０１２４】
［次世代の配列決定の鋳型を作成するプロセスの一部として標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を生成する方法の使用］
いくつかの実施例では、５’標識ｓｓＤＮＡ断片を具える線状ｓｓＤＮＡ分子を、サンプル中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又は全てのＲＮＡ）又はＤＮＡを鋳型として用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して生成し、このとき、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは５’末端部分と３’末端部分を具え、この５’末端部分は鋳型と相補的ではない配列を提示する標識からなり、この３’末端部分は鋳型と相補的な配列を提示する。いくつかの実施例では、本発明の改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション方法を用いて、これらの５’標識ｓｓＤＮＡ断片を分子内ライゲーションした。これらのいくつかの実施例では、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーにある標識は、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンサーなど特定の次世代シーケンサーを用いて次世代配列決定するための配列決定標識領域を具える。例えば、いくつかの実施例では、本発明の方法のステップ（ｂ）を最初に線状ｓｓＤＮＡ分子を熱変性させ、次に以下の反応を行うことにより鋳型非依存型リガーゼを用いて、それらを環状化させることにより行った。
ｘ 最終容量が２０マイクロリッットルの水溶液
１マイクロリットル ｐＨ７．８の３３０ｍＭのトリス酢酸、６６０ｍＭのＫＯＡｃ
１マイクロリットル ５０ｍＭのＭｎＣｌ２
４マイクロリットル ５Ｍのベタイン
１０マイクロリットル ２０μｇ／ｍｌの変性５’標識断片ＤＮＡ
４マイクロリットル １００Ｕ／μｌのＴＳ２１２６リガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ＩＩ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）
２０マイクロリットル 最終反応物容量
反応物を６０℃で２時間インキュベートする。次いで、環状化されなかった線状ＤＮＡを取り除くために、反応生成物を１８ユニットのＥｘｏＩと２０ユニットのＥｘｏＩＩＩで３７℃で１時間処理した。環状化生成物は、分解されなかった。
【実施例１０】
【０１２５】
［実施例９の標識された環状ｓｓＤＮＡのＰＣＲ分析］
特異的な次世代シーケンサー用の配列を提示する配列決定標識領域を具える標識に、アニールするＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ分析を行う。連結されて、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子のみが増幅されて、環状ｓｓＤＮＡのサイズに対応して線状ｄｓＤＮＡ生成物を生成されるので、これらのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ生成物が環状化を示す。
ＰＣＲ反応を以下のように行う。
２１マイクロリットルの水
１マイクロリットル エキソヌクレアーゼ処理したＣｉｒｃリガーゼＩＩ反応（１：１０００希釈）
１マイクロリットル ５μＭのＰＣＲプライマー１（例えば、Ｒｏｃｈｅ ＦＬＸ４５４ 受容体Ａ）
１マイクロリットル ５μＭのＰＣＲプライマー２（例えば、Ｒｏｃｈｅ ＦＬＸ４５４ 受容体Ｂ）
１マイクロリットル ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ
２５マイクロリットル ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）２Ｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｃ
５０マイクロリットル 最終反応容量
ＰＣＲは、以下の条件下で、２９回サイクル行われる。
９４℃ １０秒
５０℃ １０秒
７２℃ １分
【０１２６】
ゲル分析は、生成したＰＣＲ生成物のサイズ範囲と５’標識の断片化されたｓｓＤＮＡが同程度であることを示している。
【０１２７】
コントロールの反応も行なわれた。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ＩＩｓｓＤＮＡリガーセをライゲーション反応から除去すると、ＰＣＲ生成物は５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片から生成されない。ＰＣＲプライマーもＰＣＲ反応から除去すると、生成物は生成されない。
【０１２８】
ＰＣＲ生成物が、５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片と同じサイズの分布を有する事実は、（１）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片は、鋳型非依存性ライゲーションの基質となる変性標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成するために熱変性され、及び（２）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片は、検出可能な偏り（エキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した後のＰＣＲ増幅により確認されたような）なく、ＰＣＲ増幅、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片に効率的に変換されることを示す。
【実施例１１】
【０１２９】
［Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）を用いて生成された標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の標識された環状ｓｓＤＮＡのＰＣＲ分析］
いくつかの実施例では、本発明の改善されたライゲーション方法において使用された標識された線状ｓｓＤＮＡ分子は、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）サンプルプレップキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて生成された５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を具えており、これらの実施例では、５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を具える標識された線状ｓｓＤＮＡ分子がゲノムｄｓＤＮＡ、ミトコンドリアｄｓＤＮＡ、又はＲＮＡから調整された２本鎖ｃＤＮＡなどのｄｓＤＮＡからＮｅｘｔｅｒａを用いて生成される。これらの実施例では、Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いて生成した標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、トランスポゾン末端標識領域及び配列決定標識領域を具える標識を有する。５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を得るためにＮｅｘｔｅｒａを用いて生成した標識されたｄｓＤＮＡ断片を変性した後に、実施例９で用いたプロトコルと同様のプロトコルを用いて、これらの標識された線状ｓｓＤＮＡ分子が環状化される。次いで、ＰＣＲプライマー１がトランスポゾン末端配列に（例えば、非転写トランスポゾン末端配列に）相補的であること及びＰＣＲプライマー２がＲｏｃｈｅ４５４シーケンサー受容体に（例えば、ＲｏｃｈｅＦＬＸ４５４Ｂに）相補的であることを除いて実施例１０で用いたプロトコルと同様のプロトコルを用いて環状生成物が分析される。ＰＣＲ後のＰＣＲ生成物が５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片と同じサイズ分布を有するという事実は、（１）トランスポゾン末端組成物は、標的ゲノムＤＮＡを効率的に５’標識又は断片化し、（２）アニールされた相補的な５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が熱変性して鋳型非依存性ライゲーションの基質である変性標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成し、（３）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、検出可能な偏り（エキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した後のＰＣＲ増幅により確認されたような）なく、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片に変換されることを示す。
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年２月１６日に出願された米国暫定出願第６１／１５２，８６８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本発明は、改善されたライゲーション反応混合物、及び熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション（例えば、環状化）方法に関するもので、特に、未知の配列及び／又はサイズのｓｓＤＮＡ分子の集団中のｓｓＤＮＡ分子の環状化する方法、及びそのキットとその使用及びアプリケーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
当該分野では、大腸菌を感染させる、バクテリオファージＴ４ＲＮＡリガーゼＩ（ＲｎＩ１）鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有することが知られている（ＧｕｍｐｏｒｔとＵｈｌｅｎｂｅｃｋ，遺伝子の増幅と分析，２巻：酵素的方法による核酸構造の分析，ＣｈｉｒｉｋｊｉａｎとＰａｐａｓ，ｅｄｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｉｎｃ．，１９８０；ＭｃＣｏｙ ａｎｄ Ｇｕｍｐｏｒｔ，生物化学 １９：６３５−６４２，１９８０；Ｓｕｇｉｎｏ，Ａら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５２：１７３２−１７３８，１９７７）が、線状ｓｓＤＮＡ分子からの環状ｓｓＤＮＡ分子の生成に実際に使用するには、この活性はあまりに低く不十分である。理論に拘束されることなく、このことは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼは、ｓｓＲＮＡ分子の５’リン酸化末端だけでなく、ｓｓＤＮＡ分子の５’リン酸化末端は「ライゲーションドナー」（又は「ドナー」）として使用できるが、ｓｓＤＮＡ分子 の３’水酸基末端を「ライゲーション受容体」（又は「受容体」）として使用するにはＲＮＡの３’末端 に比べて効率がかなり悪いという事実により、少なくとも部分的に説明できる。
【０００３】
米国特許第 ７，３０３，９０１号とＢｌｏｎｄａｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ ３３：１３５−１４２，２００５）は共に参照により本明細書に組み込まれており、好熱性細菌であるＴｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓを感染させるサーマスバクテリオファージＴＳ２１２６由来の熱安定性ＲＮＡリガーゼを開示している。本明細書で「バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ」若しくは「ファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ」又はより簡単に「ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ」と言うこの酵素は、５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＲＮＡ基質だけでなく、線状ｓｓＤＮＡにも高い鋳型非依存性分子内ライゲーション活性を有する。バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは、Ｔ４ＲＮＡリガーゼなどの中温ＲＮＡリガーゼよりかなり熱安定であり、約７０℃まで安定である。ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ活性の温度の範囲は、例えば約５０℃から約７５℃までと、約４０℃以上高い。バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼの強化された熱安定性が、他の酵素では禁止される温度条件下での使用を可能にする。この熱安定性により、例えばｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡの好ましくない二次構造を減少させる、より高い温度でＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを使用することができる。この酵素は、約６年間（本特許出願の出願の時点で）Ｐｒｏｋａｒｉａ社（Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）からＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ＲＮＡ リガーゼＩＩ又は ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で市販されており、２００８年の１２月中旬より Ｍａｔｉｓ社（ｗｗｗ．ｍａｔｉｓ．ｉｓ；Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）やＰｒｏｋａｚｙｍｅ社（ｗｗｗ．ｐｒｏｋａｚｙｍｅ．ｃｏｍ；Ｒｅｙｊｋａｖｉｋ，Ｉｃｅｌａｎｄ）からＰｒｏｋａｒｉａブランド 、ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡ リガーゼの商標で入手可能であった。更に、本発明の出願人を雇用する米国、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ州ＭａｄｉｓｏｎのＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、２００４年の１２月から ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標でバクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを販売し、その属性、反応条件、及び用途の研究で相当な努力をした。
【０００４】
Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｃら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：６２１８−６２２７，２００８）は、、好熱性始原細菌由来のＲＮＡリガーゼ（例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１又は「ＭｔｈＲｎｌ」）が線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化する鋳型非依存的リガーゼ活性を有することを開示した。
【０００５】
ｓｓＤＮＡ分子の分子内鋳型非依存性ライゲーション（即ち、環状化）のために鋳型非依存的リガーゼを使用する方法は、当該技術分野で周知である。例えば米国特許出願第２００６０２４０４５１号は、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを用いてｍＲＮＡの５’末端断片から生成された線状第１鎖ｃＤＮＡ分子をライゲーションし、次いでローリングサークル複製（ＲＣＲ）又ローリングサークル転写（ＲＣＴ）により環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を増幅する方法を開示している。
【０００６】
米国特許出願第２００４０１９７８０２号は、５’末端部分が、センスＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を提示し、３’末端部分が、生体サンプル中の標的核酸内の配列に相補的な配列を提示する、５’末端部分と３’末端部分を具えるセンスプロモータープライマーを開示ている。それらはまた、ファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼを用いた鋳型非依存性分子内ライゲーションによって第１鎖ｃＤＮＡ分子を含んだ線状センスプロモーターを環状化するステップを具える方法を開示している。いくつかの実施例では、この方法は更に、環状転写基質を生成するステップとその環状転写基質を転写するステップを具える。この方法は、生体サンプル中のｍＲＮＡ分子を増幅するのに有用である。
【０００７】
Ａ．Ｐｏｌｉｄｏｒｏｓら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４１：３５−３９，２００６）は、ｃＤＮＡ末端のランダム増幅（ＲＡＣＥ）用にｃＤＮＡ末端を増幅する方法のステップとして鋳型非依存性ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ （ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ，（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））の使用について述べている。
【０００８】
Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬとＳｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆの米国特許出願第２００８０２４２５６０号は、デジタルＤＮＡボール（例えば米国出願第２００８０２４２５６０号の図８）を作るステップ；及び／又は、複数置換増幅又は全ゲノム増幅（例えば上記の図１７）又は増殖された核酸配列（例えば ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＢｅａｄＡｒｒａｙｓ（商標）；ＩＬＬＵＭＩＮＡ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ，ＵＳＡ）を生成する超分岐ＲＣＡ（例えば、上記の図１８）による増幅を含むゲノムＤＮＡなどのＤＮＡを遺伝子座特異の切断及び増幅させるステップを具える方法におけるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の使用を開示している。
【０００９】
Ｄｒｍａｎａｃらの米国特許出願第２００９００１１９４３号；２００９０００５２５２号；２００８０３１８７９６号；２００８０２３４１３６号；２００８０２１３７７１号；２００７００９９２０８号；及び２００７００７２２０８号は、超並列ＤＮＡシーケンシング用の環状ｓｓＤＮＡ鋳型を生成するＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）の使用を開示しており、例えば、米国特許出願第２００９００１１９４３号は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１マイクロリットルあたり１０ユニット、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ，７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ ＤＴＴ、２５マイクロモル ＡＴＰ、１．２５ｍＭ ＭｎＣｌ２、１０％ＰＥＧ４０００とｓｓＤＮＡ１マイクロリットルあたり０．５−１０ピコモルの最終濃度を含む鋳型非依存的ライゲーション（即ち、環状化）用のライゲーション反応混合物の使用を開示している。
【００１０】
Ｎｕｎｅｚ，ＡＮら（Ｎｕｎｅｚ，ＡＮ，Ｋａｖｌｉｃｋ，ＭＦ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＪＭ，とＢｕｄｏｗｌｅ，Ｂ，「少量の断片化されたＤＮＡのローリングサークル増幅用の鋳型を提供するための環状リガーゼのアプリケーション」、 ヒト同定第１９回国際シンポジウム、１０月１３−１６日、２００８、Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて作成したｓｓＤＮＡ分子の更なる別の使い方をｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ１９ｐｒｏｃ／ｏｒａｌｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ／Ｎｕｎｅｚ．ｐｄｆ．で述べている。連邦捜査局の調査員は、分解されたＤＮＡサンプルを変性させてｓｓＤＮＡ断片を得るステップと；ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて線状ｓｓＤＮＡ断片を連結して環状ｓｓＤＮＡ断片を得るステップと；次いで、縮重プライマーとＲＣＡによるｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いて環状ｓｓＤＮＡ断片を増幅するステップ；を具える方法を開示している。この方法によれば、欠陥のある生物学的証拠や他のアプリケーションの法医学的分析に著しい利益を提供するＲＣＡメカニズムにより、分解されたＤＮＡサンプルを全ゲノム増幅（ＷＧＡ）できる可能性がある。この調査員は、線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化する最適条件と考えられるものを開発し、以前は分類できなかった、分解されたＤＮＡサンプルを分類する基礎を築いた。しかし、同一条件下では、５’Ｇと３’Ｔのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、５’Ａと３’Ｃを有する相補的オリゴヌクレオチドより顕著に連結することが観察されたため、彼等が最適と考える反応条件でさえも、連結された生成物の量は変わり、その量は配列に依存するように見えることがわかった。
【００１１】
従って、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（アイスランド、レイキャビック所在のＰｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ、及びＰｒｏｋａｚｙｍｅ社よりＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ＲＮＡリガーゼＩＩ又はＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で、米国、ウィスコンシン州、マディソン所在のＥＰＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社よりＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの商標で市販されている）が、ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーションとして知られている最も効果的なリガーゼである（本明細書で述べられた引例及び出願人や同僚の個人的な見解に基づく）が、数年間つづいており今も根強い解決困難な問題は、さまざまな配列とサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ分子用酵素の分子内ライゲーション可変効率である。従って、上記Ｎｕｎｅｚらなど他の研究者と同じく、本出願人と ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社の同僚も、ヌクレオチド配列がわずかに異なる同一又はほぼ同じサイズの、又は１００塩基未満から数キロ塩基に至るポリヌクレオチドさまざまなサイズの線状ｓｓＤＮＡ基質を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドの全く異なるレベルの分子内ライゲーションを観察した。例えば、場合によっては、オリゴデオキシリボヌクレオチド配列中では１つのヌクレオチド違いでさえ分子内ライゲーション効率に大きな違いをもたらす。さまざまな線状ｓｓＤＮＡ分子が非常に高い割合で分子内で連結でき、比較的同じ低度に連結できれば、はるかに良い実験結果が得られ、はるかに良い結論が得られる。従って、それらの各ヌクレオチド配列又はサイズに関係なく、分子内で連結する線状ｓｓＤＮＡ分子レベルをもっと高くして、それらの全てを比較的同じ程度に分子内で連結させる改善された新しいライゲーション方法、ライゲーション反応混合物、及びキットが、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの発見以来当該技術分野において強く求められている。かかる改善されたライゲーション方法、ライゲーション反応混合物、及びキットを見出した場合に更に求められるのは、定量的エンドポイントＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現分析用の核酸分子を増幅する方法、又はアレイ又はマイクロアレイへのハイブリダイズ、又は超並列ＤＮＡシーケンシングを用いる配列（即ち、いわゆる「次世代」のＤＮＡ配列）により関連遺伝子発現分析する方法、又はＰｏｌｉｄｏｒｏｓらによるＲＡＣＥ法、又はＮｕｎｅｚらによる（上記）ＲＣＡ−ＷＧＡによるゲノムＤＮＡ増幅方法、又はＧｕｎｄｅｒｓｏｎ ＫＬとＳｔｅｅｍｅｒｓ，Ｆ及びＤｒｍａｎａｃらによる（共に上記）ゲノムＤＮＡ増幅方法（遺伝子座特異の増幅を含む）及び／又は配列決定方法、又はｓｓＤＮＡの分子内ライゲーション又は結果として生じる環状ｓｓＤＮＡ分子を用いる任意の他のアプリケーション方法である。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを使用する他のアプリケーションと使用方法は、例えば、Ｓｈｒｏｆｆ，Ｈら（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５：１５０９，２００５；及び Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ９４：２１７９，２００８）；Ｌｉｎ，Ｃら（Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ １１８：７６９９，２００６）；Ｋｏｒｌａｃｈ，Ｊら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１１７６，２００８）；ＭｃＡｒｔｈｕｒ，ＭとＢｉｂｂ，ＭＪ （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１０２０，２００８）；及び Ｋｕｈｎ，ＨとＦｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｉｉ，ＭＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６：ｅ４０，２００８）が示されている。 新しく改善されたライゲーション反応混合物、改善されたライゲーション反応条件及び各ヌクレオチドの配列又はサイズに関係なく、より効率的な分子内連結を可能にし、ほぼ同じ程度に全てのｓｓＤＮＡ分子を分子内連結させる方法が求められており、これらの方法の全てに有益であるだろう。
【００１２】
即ち、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼなど熱安定性リガーゼを用いて、高度かつ一定のレベルでさまざまな配列のｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを可能にする、改善されたライゲーション反応混合物及び方法が求められている。本出願は、この長年にわたる問題を解決する新規な改善されたライゲーション反応混合物及び方法、及び新規な改善された鋳型非依存性分子内反応混合物及び方法を採用した新しいプロセスを開示している。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の一実施例は、線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存的分子内ライゲーションのライゲーション反応混合物であって、
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡと；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、大部分前記熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のこのアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等又はこれを上回る組成物と；
（ｃ）約ｐＨ６．５と約８．０の間に最終ｐＨを維持するバッファと；
（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度のマンガン塩であって、ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、０．５乃至１０ｍＭであり、非アデニル化型熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度でＡＴＰが反応バッファ中に存在する又は存在しないマンガン塩と；を具えるライゲーション反応混合物。
【００１４】
いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物にＡＴＰを添加しない。
【００１５】
いくつかの好ましい実施例では、このイゲーション反応混合物が更に、最終濃度が０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物中のベタインの濃度は、約１Ｍである。
【００１６】
いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物にＭｇ２＋陽イオンを添加しない。
【００１７】
本発明はまた、熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する、線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション用の改善されたライゲーション反応混合物の使用方法を具える。例えば、一の方法は、
１．ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子；（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、大部分の熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等か又はこれを上回る組成物；（ｃ）約ｐＨ６．５と約８．０の間に最終ｐＨを維持するバッファと；（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度におけるマンガン塩であって、ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、０．５乃至１０ｍＭであり、非アデニル化型熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度でＡＴＰが反応バッファ中に存在する又は存在しないマンガン塩と；を具えるライゲーション反応混合物を調整するステップと；
２．ライゲーション反応混合物中の線状ｓｓＤＮＡ分子を、反応温度約４０℃乃至約７０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間インキュベートするステップと；を具える。
【００１８】
いくつかの好ましい方法の実施例では、ライゲーション反応の混合物にＡＴＰを添加しない。
【００１９】
いくつかの好ましい方法の実施例では、ライゲーション反応の混合物が更に、最終濃度が０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物中のベタインの濃度が、約１Ｍである。
【００２０】
いくつかの好ましいこの方法の実施例では、ライゲーション反応混合物にＭｇ２＋陽イオンを添加しない。
【００２１】
この方法のいくつかの好ましい実施例では、鋳型非依存的熱安定性ＲＮＡリガーゼは、サーマスバクテリオファージＲＮＡリガーゼ：バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ；古細菌ＲＮＡリガーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１からなる群から選択される。
【００２２】
一の好ましい実施例でこの方法は、
１．ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子と；
（ｂ）ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの組成物あって、６０％以上の熱安定性リガーゼ分子がアデニル化され、当該分子が、ライゲーション反応混合物中のアデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子のモル濃度が、線状ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同等か又はこれを上回る量で存在する（例えば、アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子の濃度が約１マイクロモルであるのに対し線状ｓｓＤＮＡ分子の濃度が約０．５モル）組成物；
（ｃ）バッファ剤（例えば、ライゲーション反応混合物中の最終ｐＨが約７．８のトリス酢酸)と；
（ｄ）最終濃度約０．５乃至１０ｍＭのＭｎ２＋陽イオンを提供するマンガン塩（例えば、最終濃度約２．５ｍＭのＭｎ２＋陽イオン）と；を具えるライゲーション反応混合物を調整するステップ；と
２．約４０℃乃至約７０℃（例えば、約５５℃乃至約６５℃；例えば約６０℃）の温度で、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間前記ライゲーション反応混合物をインキュベートするステップを具える方法。この方法のいくつかの好ましい実施例では、ライゲーション反応混合物は更に、最終濃度約０．２５乃至２モルのベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を含む。
【００２３】
上記のいずれかの方法のいくつかの実施例では、分子内ライゲーション用５’リン酸基及び３’水酸基を有する５’又は３’末端のヌクレオチド配列は、未知及び／又は線状ｓｓＤＮＡ分子のサイズが変化する線状ｓｓＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこれらからなる。
【００２４】
この方法のいくつかの好ましい実施例では、分子内ライゲーション法で用いる５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生体サンプル内の１又はそれ以上の標的核酸分子が提示する相補的配列にアニールする１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸長により生成した線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこの集団からなる。
【００２５】
いくつかの好ましい実施例では、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸長により生成した線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を更に、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではない標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを用いて標的核酸分子を取り除いて精製する、又は親和性標識を線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込んで、親和性結合物質が表面に付着する親和性標識が特異的結合対を形成する親和性結合物質を用いてそれらを取り出すことによって、標的核酸分子から線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を選択的に精製することにより精製する。
【００２６】
例えば、この方法で使用される線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が生体サンプル内のＲＮＡ分子から生成されるこの方法のいくつかの実施例では、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく、標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを、ＲＮアーゼＨとＲＮアーゼＩとＲＮアーゼＩＩＩの組み合わせから選択する。この方法で使用される線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が、生体サンプル内のＤＮＡ分子から生成されるいくつかの実施例では、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼが、例えば、ＤＮＡ標的核酸分子のみを特異的に分解する一本鎖特異的ＤＮアーゼである。
【００２７】
親和性標識を線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込むステップと、親和性結合物質を用いてプライマー伸長生成物を取り出すステップを具えるこの方法のいくつかの実施例では、親和性標識が、ビオチン部分（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ分子中の１又はそれ以上のヌクレオチドと結合した）を具え、親和性結合物質が、表面に付着したストレプトアビジンを具える。
【００２８】
１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを伸長させ分子内ライゲーション用の線状ｓｓＤＮＡ分子を調整するこの方法のいくつかの好ましい実施例では、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの各々が、標的核酸分子中の配列に実質的に相補的ではない配列を提示する標識を具えるか又はこの標識からなる５’末端部分と、生体サンプル由来の少なくとも１つの標的核酸分子によって提示された配列に相補的な配列を提示する３’末端部分とを具え、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子が合成される。「生体サンプル由来の少なくとも１の標的核酸分子によって提示された配列に相補的な配列を提示する３’末端部分」の記載によって、本明細書においては、３’末端が標的核酸分子自体により提示された配列又は、生体サンプル由来の標的核酸分子の３’末端に結合された配列のいずれに相補的であること意味する（インビトロでの核酸修飾反応、例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて標識核酸分子に添加されたポリ（Ａ）や他のホモポリマーテールなど）。 例えば、いくつかの実施例では、この方法で使用される分子内ライゲーション用線状ｓｓＤＮＡ分子を生体サンプル中の目的の核酸分子から調整し、ここでは目的の前記核酸分子が修飾されている（例えば、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許出願番号第２００５０１５３３３３号又は２００９０２２７００９号に開示された末端標識方法を用いた、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを有するＲＮＡのポリ（Ａ)テール、又はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによるＤＮＡのテール、又は目的のＤＮＡ又はＲＮＡ分子の３’末端へのアダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション、又は目的のＤＮＡ又はＲＮＡ分子への３’末端配列の添加による）。従って、この方法は、修飾された生体サンプル由来の核酸から調整した線状ｓｓＤＮＡ分子のこの方法における使用も含む。
【００２９】
１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、５’末端部分に標識を具えるか又はこの標識からなるいくつかの好ましい実施例では、その標識が、センスプロモータ配列、切断部位標識領域、シーケンサー特異的配列標識領域、回収標識領域、増幅標識領域、検出標識領域、及びアドレス標識領域を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域からなる群から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はこの標識領域からなる。
【００３０】
第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’部分の標識は、所望の標識領域を具え、所望の目的のための所望の配列を示すことができる。例えば、いくつかの実施例では、５’部分が、１乃至それ以上の配列標識領域を具え、その領域がＲｏｃｈｅ ４ＦＬＸ ５４Ａと４５４Ｂ配列標識の配列を提示し、所望のサイズ範囲で断片を単離した後、Ｒｏｃｈｅ ４５４ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸシステムを用いて次世代の鋳型として使用される。同様に、その他実施例では、５’−及び３’−標識ＤＮＡ断片は、所望のサイズ範囲に単離後、別の配列プラットフォームを用いて（例えば、ＲＯＣＨＥ ４５４シーケンシングプラットホーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）ＳＯＬＥＸＡ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ／ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ’ ＳＯＬＩＤ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ’ＳＭＲＴ（商標）シーケンシングプラットホーム、ＰＯＬＬＯＮＡＴＯＲ Ｐｏｌｏｎｙシーケンシングプラットホーム、ＣＯＭＰＬＥＴＥ ＧＥＮＯＭＩＣＳシーケンシングプラットホーム、ＩＮＴＥＬＬＩＧＥＮＴ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ’シーケンシングプラットホーム、又はＨＥＬＩＣＯＳシーケンシングプラットホームを用いて）次世代用の鋳型として使用される。いくつかの好ましい実施例では、この方法を用いて細胞又は微生物の全ゲノムを具える標的ＤＮＡから、５’と３’が標識されたＤＮＡ断片を生成する。
【００３１】
いくつかの好ましい実施例では、親和性結合分子（例えば、ビオチン）又は検出可能な分子（例えば、蛍光染料）で配列標識がラベルされており、これによって５’末端に親和性結合分子又は検出可能な分子がある標識を有する５’−と３’−標識ＤＮＡ断片の回収（例えば、ビオチン化分子の回収にストレプトビアジンが結合する表面を使用する）又は検出が可能である。
【００３２】
第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、さまざまな標識領域を具える標識を具える又はこの標識からなるこの方法のいくつかの好ましい実施例では、、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、各々標識領域間に切断部位を含んでおり、この方法が、更に切断部位において環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップを具え、この分子は、各々、その５’末端に第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を、その３’末端に第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分を提示している。
【００３３】
例えば、いくつかの実施例では、切断部位が２’−デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）部分又は８−オキソグアニン−２’−デオキシリボシル−一リン酸（８−オキソ−ｄＧＭＰ）を具える又はこれらからなり、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して、各々が５’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を又３’末端で第１鎖合成プライマーの５’末端部分を提示するステップが環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成し、環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）にそれぞれ接触させて、１又はそれ以上の脱塩基部位を含む環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成し、次いで、環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を脱塩基部位又はそれに近い部位で線状化するアルカリ溶液又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼを含む溶液中でインキュベートすることによるなどの条件下で１又はそれ以上の脱塩基部位を含む環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。
【００３４】
この方法のいくつかの好ましい実施例においては、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、２つのシーケンサー特異配列決定標識領域を具えるか又はこれらからなる５’末端部分の標識を具えるか又はこれからなり、切断部位で５’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分を、及び３’末端で第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分を提示する環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成するステップが、各５’末端と３’末端上で一の配列決定標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型（例えば、２重に標識された配列決定鋳型）を生成する。いくつかの好ましい実施例では、各５’と３’末端上に一の配列標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列鋳型を、配列標識領域に特異的な次世代のシーケンサー鋳型として使用する。
【００３５】
この方法は、切断部位で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化するステップを具えるこの方法のいくつかの好ましい実施例では、、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域を具える標識を具えるか又はこの標識からなり、このＲＮＡポリメラーゼ標識領域が、センスプロモータ配列とセンスプロモータ配列の３’である切断部位を提示し、切断部位で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化するステップの後に、この方法は更に（ｉ）線状化して転写基質を生成する前記ステップから生成された各線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端のセンスプロモータにアンチセンスプロモータ配列を提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングするサブステップと；次いで（ｉｉ）２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて転写基質を転写するサブステップと；を具える。この方法のいくつかの好ましい実施例では、転写基質を転写するサブステップの前に、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプロモータ配列を提示する前記オリゴデオキシリボヌクレオチドの伸長によって２本鎖ｃＤＮＡを生成するサブステップを更に具える。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
以下の図面は、本発明の説明の一部を形成し、更に本発明のある態様を示すためのものである。本明細書に提示する特定の実施例の詳細な説明と組み合わせて１又はそれ以上の図面を参照すると、本発明をより理解できる。
【００３７】
【図１】図１は、ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥともいう）の新しいクローンから得て精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示したものであり、古いクローンから得たＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼの精製品におけるアデニル化された酵素のレベル（推定約３０％）と比べて予想外の高いレベルの（推定約７０％）ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼのアデニル化型を示した。タンパク質のサンプルは１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで変性、減少、及び分解した。銀染色してタンパク質を視覚化した。レーン１は、分子量標準 （９７、６６、４５、３０、２０．１、１４．４ｋＤａ）を示す。レーン２は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを示す。白抜きの三角形は、アデニル化された酵素を示す。黒塗りの三角形は、アデニル化されなかった酵素を示す。
【図２】図２は、新しいクローンを用いて得た高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼとも呼ばれる）の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を、古いクローンを用いて得た低度にアデニル化された酵素と比較して示した。予想外に、高度にアデニル化された酵素は、低度にアデニル化された酵素よりも、標準ライゲーション反応混合物中で線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションにおける活性がずっと少なかった。各ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ酵素を１μｇ使用して、標準的なライゲーション反応条件下（５０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．５，１０ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，１ｍＭ ＤＴＴ，２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２，と５０μＭ ＡＴＰを６０℃で１時間）で、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて、５５−ヌクレオチドコントロールオリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌｅをライゲーションした。Ｓｔｏｐ／Ｌｏａｄバッファ（９５％ホルムアミド, １０ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．０１％ キシレンシアノールブルー、０．０１％ブロモフェノールブルー）を添加して７０℃で５分間加熱することによって反応が停止した。反応生成物を、８Ｍの尿素を含んだ２０％のポリアクリルアミドゲル中に溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し視覚化した。レーンは：１，ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準（ヌクレオチド）（９７、７７、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５）；２，ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥのない、ネガティブコントロール；３，古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ；４，新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（ｌｏｔ１）；５，新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（ｌｏｔ２）；及び６，ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準である。
【図３】図３は、ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在する場合と存在しない場合の、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子間ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。驚くことに、ＡＴＰをライゲーション反応混合中に使用されていないときに、高度にアデニル化された酵素がより高い活性を示した。エキソヌクレアーゼＩは、線状ｓｓＤＮＡは分解するものの環状ｓｓＤＮＡを分解しない。６０℃で１時間インキュベートした後に反応が停止し、反応物を２０ＵのＥｘｏＩと３７℃で１５分インキュベートさせた。Ｓｔｏｐ／Ｌｏａｄバッファを添加し、７０℃で５分間加熱すると反応が停止した。８Ｍの尿素を含んだ２０％のＰＡＧＥゲル中で反応生成物を分解させて、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色した。レーンは：１は、ＬＭＷ ＤＮＡサイズ標準（９７、７７、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１５ヌクレオチド）；２−３は、酵素なしのコントロール；４−５は、高度にアデニル化された、ＡＴＰ５０μＭを添加したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ；６−７は、高度にアデニル化された、ＡＴＰを添加しないＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼ；８は、ＬＭＷ ＤＮＡサイズ規格である。
【図４】図４は、ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在するときと存在しないときの両方における、さまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質の新しいクローンから得た高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性と、同じ線状ｓｓＤＮＡ基質の標準ライゲーション反応混合物中における古いクローンから得た低度にアデニル化された酵素の分子内ライゲーション活性とを比較したＰＡＧＥ分析の結果を示す。ライゲーション反応混合物中にＡＴＰが存在しないとき、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは、標準ライゲーション反応混合物中の低度にアデニル化された酵素によって連結されない又は十分に連結されない多くの線状ｓｓＤＮＡ基質を効率的に環状化した。高度にアデニル化された酵素がもたらすこれらの改善された分子内ライゲーション反応は、以前は不十分な分子内ライゲーションあるいは全く分子内ライゲーションしなかった基質を連結させることができ、更に結果を改善すべく、追加のライゲーション反応条件の検査を継続することを出願人に促す結果となった。
【図５】図５は、ライゲーション反応混合物中でＭｎ２＋陽イオンを使用すると、ＡＴＰが存在しなくても、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））により線状ｓｓＤＮＡ基質を連結することが非常に困難な分子内ライゲーション活性を改善したことを示す。ここで留意すべきは、Ｍｎ２＋陽イオンを添加するときは、標準ライゲーション反応混合物中で使用するＭｇ２＋陽イオンを反応混合物に添加しないことである。高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１μｇを１０ｐｍｏｌｅの線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と共にｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び０、１、２、５、又は１０ｍＭ ＭｎＣｌ２又はＭｇ（ＯＡｃ）２中で６０℃で１時間インキュベートした。次いで、ライゲーション連結されない線状基質を分解すべく、反応混合物の一部を１８ＵのＥｘｏＩ及び２０ＵのＥｘｏＩＩＩで処理した。環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物を、８Ｍの尿素を含んだ２０％ポリアクリルアミドゲルで分解して、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色し可視化した。エキソヌクレアーゼ耐性環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の量を目視検査により推定した。
【図６】図６は、Ｍｎ２＋陽イオン（２．５ｍＭ ＭｎＣｌ２として）を含むがＡＴＰを欠きＭｇ２＋陽イオンを添加したライゲーション反応混合液に１Ｍの両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）添加したときの、連結が非常に困難な線状ｓｓＤＮＡ基質の環状化における、高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。 驚くことに又、予期せぬことに、標準ライゲーション反応混合物中で低度にアデニル化された酵素によるこの基質の環状化が５％以下であるのに比較して、ライゲーション反応混合液にベタインを添加すると、連結が非常に困難な線状ｓｓＤＮＡ基質を約１００％環状化した。高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ１μｇを、ｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び２．５ｍＭのＭｎＣｌ２中で、１０ｐｍｏｌｅの線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と共に、１Ｍのベタインと、又はベタインなしで６０℃で１６時間インキュベートした。次いで、ライゲーション反応混合物の一部を１８ＵのＥｘｏＩと２０ＵのＥｘｏＩＩＩ で処理して連結されない線状基質を分解させた（レーン１と４）。８Ｍの尿素を含んだ２０％ポリアクリルアミドゲルに、環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物を溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色して可視化した。エキソヌクレアーゼ耐性環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の量を目視検査で推定した。レーン：１−２は、酵素なしのネガティブコントロール；３−４は、１Ｍベタインを添加したもの；５は、ＬＭＷ ＤＮＡ標準サイズである。
【図７】図７は、１Ｍのベタインを含有する改善されたライゲーション反応混合物中のＡｌｕ Ｉで分解された仔ウシ胸腺のｓｓＤＮＡ断片を環状化における高度にアデニル化されたＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標））の分子内ライゲーション活性のＰＡＧＥ分析を示す。 この分析結果は、最大約６０００ヌクレオチドまでの線状ｓｓＤＮＡ断片のサイズや配列構造に基づくグロス基板バイアスがないことを示した。ｐＨ７．６の３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２．５ｍＭのＭｎＣ１２、１Ｍのベタインと、１、２又は４μｇの高度にアデニル化されたＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼからなる改善されたライゲーション反応混合物中に変性Ａｌｕ Ｉで分解させた２００ｎｇの仔ウシ胸腺ＤＮＡを、６０℃で１６時間置いて、１８ＵのＥｘｏＩと２０ＵのＥｘｏＩＩＩで処置して線状ｓｓＤＮＡを分解させた。 反応生成物を、８Ｍの尿素を含有するポリアクリルアミド２０％中に溶解させ、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄで染色して視覚化した。レーンは：１、ＬＭＷＤＮＡサイズ標準；２−３、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥを使用しないネガティブコントロール；４−５、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ１μｇ、６−７、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ２μｇ、８−９、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ４μｇ、１０、ＫｂラダーＤＮＡ標準サイズである。レーン３、５、７、及び９にはエキソヌクレアーゼを添加した。当然のことながらＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥは、ＡＴＰの非存在下で化学量論的に機能することが予期され、変性して断片化したｓｓＤＮＡが２２０ｎｇ投入したうちの１０％しか環状化しなくても驚くことではない。
【００３８】
〔定義〕
本明細書で特に定義していない又は異なる記述がない限り、以下の本発明に関する用語や記述は、以下の通り解釈するものとする。
【００３９】
用語「例えば」、「など」、「含む」、「含んだ」、又はこれらの変形を本明細書で使用するときは、これらの用語を用語の限定と見なすのではなく、「〜だが限定されるものではない」又は「限定されるものではない」ことを意味すると解釈する。
【００４０】
本発明を説明する文脈の中（特に、特許請求の範囲の文脈の中）において、用語「一つの」や「一」や「その」若しくは類似の指示対象の使用は、本明細書において他に指示がなく、文脈から明らかに矛盾しない限りは、単数と複数の両方を対象とすると解釈する
【００４１】
「親和結合物質」又は「親和結合分子」あるいは「親和性分子」若しくは「親和性標識」は、本明細書では「結合条件」と言われる、一定条件下で分子が互いに親和性を有し「結合」し、「特異的結合対」を形成することを意味する。例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、又はジゴキシゲニン、及びジゴキシゲニンに結合する特異抗体は、「親和結合分子」又は「親和結合物質」あるいは「親和性分子」を具える各特異的結合対の要素を有する「特異的結合対」の例である。親和結合分子（例えば、ビオチン及び／又はストレプトアビジン）は、当該技術分野で周知の方法を用いて（例えば、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｂｙ Ｄ．Ｓａｖａｇｅら，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２，及びｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰｒｏｂｅｓとＲｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｂｙ Ｒ．Ｐ．Ｈｏａｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ ｉｎ ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６に記載された薬剤や方法を用いて）、他の分子（例えば、ＲＮＡあるいはＤＮＡ）と、又は固体表面と共有結合で、共役、又は非共有結合で結合することができる。当該技術分野で周知の薬剤や方法を用いてＤＮＡあるいはＲＮＡに共役である親和性分子をオリゴヌクレオチド合成装置で合成することができる。
【００４２】
本発明によると、用語「結合」は、限定するものではないが、例えば、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス結合、及びイオン結合などの非共有結合の結果として親和性分子と親和結合物質の相互作用を意味する。理論に拘束されるものではないが、当該技術分野では、特異的結合対に関する分子の相補的な形状又は構造により、このような非共有結合が部分的に結合がもたらすものと考えられている。「結合」の定義に基づくと、他種多様な親和結合分子又は特異的結合対は、結合条件が 様々な特異的結合対によって異なることは明らかである。当業者は、サンプル内で、親和結合分子間で結合が発生する条件を容易に発見又は決定することができる。特に、当業者は、当該分野で「特異的結合」であると考えられる親和結合分子間に結合が生じる条件を容易に決定できる。当該技術分野で理解されているように、この特異性は一般に、親和結合分子間の親和性が、サンプル内の他の物質や成分（例えば、血管壁、固体担体）よりも高い親和性を有するからである。場合によっては、特異性はまた、サンプル内の他の物質や成分よりも親和結合分子の会合が著しく迅速であることに関与するか、又はその原因となる。
【００４３】
本明細書で、用語「核酸の増幅」は、核酸配列又はその相補体の複製の数を増やすことを意味する。増幅された核酸は、修飾されたＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡあるいはＤＮＡとＲＮＡの混合物を具える、これらからなる、又はこれらに由来するＤＮＡであってもよい。 開始核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はその両方でも、核酸分子又は分子（即ち、「増幅生成物」）の増幅による生成物は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、あるいはＤＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチド及びＲＮＡのヌクレオシドやヌクレオチドの混合物であり、又は生成物は、修飾されたＤＮＡのヌクレオシド若しくはヌクレオチド又は修飾されたＲＮＡのヌクレオシド若しくはヌクオチドを具える場合がある。「コピー」は、標的配列に対して必ずしも完全な配列相補性又は配列同一性を意味するものではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン又はデオキシウリジンなどのヌクレオチド類似物、意図的な配列変異（例えば、標的配列に対して相補的ではないが、ハイブリダイズされた配列を具えるプライマーにより誘導された配列変異）、及び／又は増幅中に生じる配列エラーを含むことがある。
【００４４】
核酸又は核酸反応に関して本明細書で用いられる用語「増幅」又は「増幅された」、「増幅する」は、例えば本発明の一実施例により生成された標的核酸、又は標識核酸などの特定の核酸のコピーをインビトロで作る方法を言う。当該技術分野では、多数の核酸を増幅する方法が知られており、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号）など転写媒介増幅法、ループ媒介増幅法（ 例えば、米国特許第６，４１０，２７８号に記載されたループ形成配列を用いた「ＬＡＭＰ」増幅など）を含む。
【００４５】
用語「アニール」又は「ハイブリダイズ」及び「アニーリング」又は「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック塩基対により複合体を形成するのに十分に相補的なヌクレオチド配列間の複合体形成を意味する。本発明に関して、「〜に相補的な」又は「〜と相補的な」又は互いに若しくは互いと「ハイブリダイズ」又は「アニール」する核酸配列は、使用目的を果たすのに十分に安定である「ハイブリッド」又は「複合体」を形成ができるものでなくてはならない。ハイブリダイゼーション又はアニーリング及びハイブリダイゼーションの強度（即ち、核酸鎖間の会合強度）は、核酸間の相補性の程度、塩濃度などの条件に影響を受けた条件の切迫性、形成されたハイブリッドのＴｍ（融解温度）、他の成分（例えば、ポリエチレングルコール又はベタインの有無）の存在、ハイブリダイジング鎖のモル濃度、及び核酸鎖のＧ：Ｃ含有量を含む当該技術分野でよく知られた多くの要因による影響を受ける。
【００４６】
いくつかの実施例では、「ｃＤＮＡ」又は「ｃＤＮＡ分子」は、目的のＲＮＡ分子の少なくとも一部を鋳型として用いて、ＲＮＡ非依存的ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素で触媒し、１又はそれ以上の目的のＲＮＡ分子にアニールするプライマーの伸長により合成された「相補的ＤＮＡ」を意味する（この過程は「逆転写」と呼ばれる）。この方法のいくつかの実施例では、逆転写酵素とメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子など目的のＲＮＡ分子を用いて逆転写により第１鎖ｃＤＮＡ分子を合成し、ｍＲＮＡは生体サンプルから鋳型として第１鎖ｃＤＮＡを得ており、第１鎖ｃＤＮＡ分子はｍＲＮＡと相補的である。いくつかの実施例において、第１鎖ｃＤＮＡ分子は、ｍＲＮＡではなくても、目的の任意のＲＮＡ分子を逆転写して合成したｃＤＮＡ分子を意味する。いくつかの実施例では、用語「第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマー」と「第１鎖ｃＤＮＡ分子」は、第２鎖ｃＤＮＡ合成プライマーを使用せず、第２鎖ｃＤＮＡ分子を合成しなくても使用される。従って、用語「第１鎖ｃＤＮＡ」又は「第１鎖ｃＤＮＡ分子」は、この方法によって、目的のＲＮＡ分子に相補的な１本鎖ｃＤＮＡのみが合成される場合に使用される。更に、いくつかの実施例では、用語「ｃＤＮＡ」は、目的のＤＮＡ分子の少なくとも一部を鋳型として用いて、１又はそれ以上の目的のＤＮＡ分子にアニールするＤＮＡポリメラーゼが触媒するプライマーの伸長により合成された相補型ＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡ分子は、鋳型の少なくとも一部と「相同」又は「塩基対合」するあるいは「複合体を形成する」。
【００４７】
本明細書で用いられている「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素を意味する。「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ鋳型にアニールされたプライマーが伸長することにより、相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）のコピーを合成する酵素である。いくつかのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ鋳型からも相補的ＤＮＡコピーを合成する場合もあり、この過程を「逆転写」と言う。逆転写できるＤＮＡポリメラーゼを「逆転写酵素」とも言う。
【００４８】
ＤＮＡポリマーの合成に加えて、ＤＮＡポリメラーゼは、多くの他の特徴又は活性を具える。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ活性又は５’ヌクレアーゼ活性とも言う）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、鎖置換活性を有していたり、欠如していたりし、それらが前進する程度に対して特徴づけることができる。いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼが用いられている。例えば、いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡ配列に使用している。 例えば、いくつかの実施例では、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が欠如したＤＮＡポリメラーゼ組成物を、全ゲノム増幅に使用している。
【００４９】
いくつかの ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼにより合成された新しいＤＮＡ鎖として、相補鎖を鋳型鎖へ置換することができる。この過程は、「鎖置換」と呼ばれ、この活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、本明細書では「鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ」と言う。鎖置換ＤＮＡ合成の鋳型は、線状又は環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）でもよい。ＤＮＡ鋳型が環状一本鎖の場合、複製鎖より前に継続的に鎖置換を行ってプライムドＤＮＡ合成体が環の周りをぐるぐる周り始め、この過程を「ローリングサークル複製」と言う。ローリングサークル複製は、環状鋳型のタンデムコピーを合成する。 一般に、本発明の方法に使用されるＤＮＡ鋳型特異的ＤＮＡポリメラーゼは、酵素の処理能力といわれる、鋳型を「抜け落ち」（又はＤＮＡ合成を終了）させることなく使用目的に適切な長さのＤＮＡを十分に合成することが望ましい。鎖置換を行うＤＮＡポリメラーゼ能力は、ＦｉｒｅとＸｕが（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４６４１−４６４５，１９９５）で説明したように、ローリングサークル複製分析においてポリメラーゼを用いて容易に測定できる。鎖置換やＤＮＡポリメラーゼ処理能力は、Ｋｏｎｇら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５−１９７５，１９９３）が説明した方法を用いても分析できる。
【００５０】
使用できる鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの例としては、限定されるものではないが、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標） ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＧｋａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、及びＭＭＬＶ逆転写酵素（全てＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）が挙げられる。いくつかの実施例では、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼなど３’→５’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠如するＤＮＡポリメラーゼと、この活性を有するＤＮＡポリメラーゼの混合物を鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとして使用している。ＤＮＡを合成する間に、この酵素の混合物は、改善された忠実度を示すので、いくつかの実施例で有用である（即ち、その酵素の混合物は、より少ない鋳型に相補的でないヌクレオチドを有するＤＮＡを合成する）。忠実度を測定する方法があるので（例えば、配列決定により）、特定条件下での多くのＤＮＡポリメラーゼの忠実度及び／又はエラー率が既知である。
【００５１】
一般に、本発明の鎖置換増幅法においては、この方法で使用される鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの量は、反応を阻害することなく、反応に悪影響を及ぼさずに、できるだけ高いことが好ましい。例えば、ＲＥＰＬＩＰＨＩ（商標） ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を、２０マイクロリットルの反応液中に約１マイクロリットルのタンパク質で、ＤＩＳＰＬＡＣＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を、５０マイクロリットルの反応液中に約５０ユニット乃至３００ユニットで使用できる。ユニットの定義は、ポリメラーゼによって異なり、供給元又はソースが異なる類似のＤＮＡポリメラーゼでさえ異なり、各酵素の活性が、さまざまな温度やさまざまな反応条件によって異なるので、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの量と使用する各ＤＮＡ鋳型やプライマーの反応条件を最適化することが望ましい。
【００５２】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」とも呼ばれる一連の「モノヌクレオシド」を具える高分子を意味し、１のヌクレオシドの五単糖の３’位と隣のヌクレオシドの五炭糖の５’位は、リン酸ジエステル結合などのヌクレオシド間の結合により結び付けられるがこれに限定されない。リン酸基が結び付いてるヌクレオシドを、「ヌクレオチド」と呼ぶ。一連の隣のヌクレオチドの５’位に結び付くヌクレオチドを「５’の」又は「５’ヌクレオチド」と言い、５’ヌクレオチドの３’位に結び付くヌクレオチドを「３’の」又は「３’ヌクレオチド」と言う。本明細書で用いられる用語「５’の」及び「３’の」は、核酸の１本鎖内の別の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、又は遺伝的因子に関連する特定の化学基、ヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、又は遺伝的因子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列）の位置又は方向を意味する。第１核酸配列が、１本鎖上における第２配列の３’にあれば、第１配列の相補体は、相補鎖上における第２配列の相補体の５’にある。ある特定の核酸鎖内の配列又は遺伝子的因子の相対的な５’又は３’の位置や方向に関する本発明の説明が理解される。
【００５３】
置換モノヌクレオチドの糖部分の５’炭素及び３’炭素に、核酸リン酸ジエステル結合が生じるので、線状核酸分子は、「５’終端」（５’末端）や「３’終端」（３’末端）を有すると言われている。新しい結合が５’炭素となる、ポリヌクレオチドの末端は、５’末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素となるときのポリヌクレオチドの末端は、３’末端ヌクレオチドである。本明細書で用いられる 末端ヌクレオチドは、３’又は５’末端の末端部位におけるヌクレオチドである。
【００５４】
核酸の五炭糖は、リボースでもよく、この場合は、核酸又はポリヌクレオチドを「ＲＮＡ」と呼び、あるいは２’デオキシリボースでもよく、この場合は、核酸又はポリヌクレオチドを「ＤＮＡ」と呼ぶ。代替として、特に、核酸を化学的に合成されている場合は、この核酸はＤＮＡ及びＲＮＡのモノヌクレオチドの両方を具えるがことある。ＲＮＡとＤＮＡの両方の各五炭糖は、４つの共通の又は「標準的な」核酸塩基（それぞれ「塩基」とも呼ばれる）のうちの１つと共有結合する。糖類に結合する天然に存在する３つの主要な塩基（アデニン、シチジン、及びグアニン）は、ＤＮＡとＲＮＡの両方に共通であるが１の塩基が異なっており、ＤＮＡは追加の塩基がチミンであるのに対しＲＮＡは追加の塩基はウリジンである。場合によっては、ウリジンがＤＮＡ中に塩基として存在しうる。当業者は、一般に小さいポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」とみなす。本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、２又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド（場合によっては、「オリゴデオキシリボヌクレオチド」とも言う）又はリボヌクレオチド、好ましくは約６乃至１００ヌクレオチドを具える分子と定義するが、オリゴヌクレオチドの長さは限定していない。正確なサイズは、多くの要因よって決まり、同様に基本的なオリゴヌクレオチドの機能又は使用によって決まる。
【００５５】
更に、いろいろな理由により、本発明の核酸又はポリヌクレオチドは、１又はそれ以上の修飾核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間の結合を具える。例として、修飾塩基、糖部分、又はヌクレオシド間の結合を含む核酸又はポリヌクレオチドを使用するいくつかの理由には：（１）Ｔｍの修飾する；（２）１又はそれ以上のヌクレアーゼに対するポリヌクレオチドの感受性の変更；（３）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ プラス アルカリ性条件又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼで切断されたｄＵＭＰ残基など、又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｆａｐｙ−ＤＮＡグリコシラーゼ又はＦｐｇとしても知られる）プラスアルカリ条件又はエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼで切断された８−オキソ−ｄＧＭＰ残基などの切断部位の提供；（４）ラベル又は親和性標識を取り付ける部分の提供する；（５）ラベル又はラベルの抑制の提供する；又は（６）溶液中にある又は表面に結合した別の分子に取り付る親和性標識としてのビオチンなどの部分の提供；が含まれる。
【００５６】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドに関して、１又は２以上の糖部分は、２’−デオキシリボースを具えていてもよく、又は代替として、１又はそれ以上の糖部分が、例えばいくつかのヌクレアーゼに耐性を提供するリボース、又は２’−フルオロ−２’−デオキシリボースあるいは２’−Ｏ−メチル−リボースなどいくつかの糖部分でもよいが、これらに限定するものではない。この糖部分は、又は可視性の、蛍光性の、赤外蛍光性の、又は求電子性、光反応性、アルキニル、又は反応性化学部分を有するその他の検出可能な染料あるいは化学薬品と反応させてラベルできるいくつかのヌクレアーゼ又は２’−アミノ−２’−デオキシリボース又は２’−アジド−２’−デオキシリボースに対して抵抗する。
【００５７】
本発明の核酸又はポリヌクレオチドのヌクレオシド間の結合は、ホスホジエステル結合でもよく、又は いくつかのヌクレアーゼに耐性を有するホスホロチオアート、ホスホロジチオリン酸、ホスホロセレン酸塩、又はホスホロジセレン酸塩結合など修飾された結合を具える１又はそれ以上のヌクレオチド間結合が代替となり得るが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
「ランダム配列」を提示するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの一部を言うとき、我々は、ランダム配列部分内のまさにヌクレオチド部位に４つの標準的なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を、全て等量用いてオリゴヌクレオチド又はその一部を合成（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて）することを意味する。この方法は、（４のｎ乗）＋１の異なるオリゴヌクレオチドを具えるオリゴヌクレオチドの混合物を合成し、ここで、「ｎ」は、ランダム配列部分ないのヌクレオチドの部位の数である。従って、これらの実施例では、このオリゴヌクレオチドは、ランダム配列部分のあらゆる可能な配列を示す、多くの異なるオリゴヌクレオチドの混合物を具える。「セミランダム配列」を提示するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの部分を言うとき、我々は、合成されたセミランダムオリゴヌクレオチド又は部分が合成されること（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて）を意味し、ここでは、４つの標準的なヌクレオチド塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ又はＵ）を全て等量用いて合成されたヌクレオチド部位（即ち、上述のようにこれらの部位は「ランダム」である）において、セミランダム部分内の１又はそれ以上の他の部位は、標準塩基ヌクレオチド（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ又はＵ）を４つすべてではなく以外の１、２又は３つのみ使用して合成される。いくつかの実施例では、オリゴヌクレオチドは、「縮重塩基」を有する１又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、これは、ＡはＴ又はＵとＧはＣと塩基対を作るという標準の塩基対の規則によるものではなく、１又はそれ以上の塩基対を作ることができる核酸塩基を意味するもであり、「縮重ヌクレオチド」とは、縮重塩基を含んだヌクレオチドのことである。本明細書では、「部分」又は「領域」は同じ意味で用いられ、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド（プライマーを含む）の「部分」又は「領域」は２又はそれ以上の塩基が連続した配列のことである。別の実施例では、領域又は部分は、少なくとも約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５のいずれか又はそれ以上の連続する配列のことである。ランダム配列又はセミランダム配列が、オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドを全て具える場合には、それぞれを「ランダムオリゴヌクレオチド」又は「セミランダムオリゴヌクレオチド」と言う。
【００５９】
「プライマー」は、オリゴヌクレオチド（「オリゴ」）であり、一般に核酸ポリメラーゼによって伸長できる遊離の３’水酸基を有する。鋳型依存性ポリメラーゼのために、一般にプライマーオリゴの少なくとも３’部分は、鋳型核酸の部分と相補的であり、この部分にオリゴは水素結合や他の分子力で「結合」（又は「複合」「アニール」又は「ハイブリダイズ」）し、鋳型にＤＮＡポリメラーゼにより合成を開始するプライマー／鋳型複合体を与え、ＤＮＡ合成の過程で鋳型と相補的な３’末端に共有結合する塩基を添加して伸長（即ち、「伸長されたプライマー」）する。この結果物は、プライマー伸長生成物である。鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素を含む）は、一般に、１本鎖鋳型に対してＤＮＡ合成（「プライミング」）を開始するのにオリゴヌクレオチドプライマーの錯化剤を必要とするが、ＤＮＡ鋳型に相補的なＲＮＡを合成するのに（転写）は、一般にＲＮＡポリメラーゼを必要としない。
【００６０】
本明細書の「熱安定性ＲＮＡリガーゼ」は、ポリヌクレオチドを意味し、前記ポリペプチドをアデニル化した形が、約０．５乃至１０ｍＭの濃度において、約ｐＨ６．５乃至ｐＨ８、Ｍｎ２＋陽イオンを維持するバッファを具える反応混合物中で約４０℃乃至約７０℃の反応温度において、環状ｓｓＤＮＡ分子に対して５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性の環状化を触媒し、ＡＴＰが反応バッファに存在しない又は、ポリペプチドの非アデニル化した形のモル濃度より低いモル濃度で存在する。本発明の好ましい熱安定性ＲＮＡリガーゼは、上述したようにバクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼであり、これは参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７３０３９０１号に記載され、その特許請求の範囲によりカバーされている。しかし、この熱安定性ＲＮＡリガーゼは、本明細書に記載した反応条件下において、ライゲーション反応混合物中で線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するにあたり活性を有する任意のＲＮＡリガーゼを具えることができる。
【００６１】
熱安定性ＲＮＡリガーゼは、天然タンパク質又は組み換えタンパク質から得ることができる。本明細書で用語「天然タンパク質」は、自然発生的（即ち、組み換えではない）源から単離されたタンパク質を意味する。本明細書で用いられる用語「組み換えタンパク質」又は「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ分子から発現したタンパク質分子を意味する。分子生物学的手法は、天然型のタンパク質と比べて同一又は類似の性質を有する組み換え型のタンパク質を生成するのに使用される。天然配列の変異体を作って、例えば、発現、精製、又は望ましいポリペプチドの性質を改善することができる。
【００６２】
組み換えタンパク質である熱安定性ＲＮＡは、融合タンパク質でもよい。本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、外因性タンパク質断片（例えば、非ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼタンパク質を具える融合パートナー）に結合した目的のタンパク質（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ又はその断片）を含んだキメラタンパク質を意味する。融合パートナーは、宿主細胞で発現されている熱安定性ＲＮＡリガーゼのタンパク質の溶解度を高め、宿主細胞又は培養上澄、又はその両方から組み換え融合タンパク質を精製できる親和性標識を提供する。所望であれば、当該技術分野で知られたさまざまな酵素的又は化学的手段により、目的のタンパク質（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ又はその断片）から融合タンパク質を除去することができる。
【００６３】
本発明の好ましい実施例では、熱安定性組成物が、精製されたタンパク質を具える。本明細書で用いられる用語「精製された」又は「精製する」は、タンパク質などの目的の成分から汚染物質を除去することう言う。例えば、特に望ましいタンパク質（例えばＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）は、その他の汚染された望ましくないタンパク質、核酸、炭水化物、脂質及び／又は生化学的小分子を除去することによってを精製される。汚染物質の除去により、組成物中の所望のタンパク質の割合が上昇する。例えば、好ましい実施例では、核酸に作用を及ぼす汚染核酸や酵素が無くなるよう熱安定性ＲＮＡリガーゼ組成物を精製されている。
【００６４】
いくつかの好ましい実施例では、大腸菌細胞中で複製及び発現するプラスミド又は他のベクター中での熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子（及び／又はそれの機能的変異体や相同体）の発現によって熱安定性ＲＮＡリガーゼが得られる。なぜならこうした組み換えソースから得た熱安定性ＲＮＡリガーゼは、非組み換えソース由来のものよりも、高度に精製され、酵素活性が汚染されておらず、一般に酵素濃度がより高いためである。本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、コードされたポリペプチド又はタンパク質の前駆体（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の生産に不可欠な制御配列とコード配列を具えるＤＮＡ配列を意味する。所望のタンパク質活性を保持する限り、全長コード配列又は部分的コード配列によってポリ ポリヌクレオチドをコードできる。
【００６５】
本発明の好ましい実施例では、熱安定性ＲＮＡリガーゼが「安定」しており、これは熱安定性ＲＮＡリガーゼが、酵素活性の分解や損失に寄与するプロテアーゼやその他の汚染物質に十分に純粋であることを意味し、−２０℃で保管しても少なくとも６ヶ月はさほど大きな酵素活性の損失のない酵素活性保存バッファの製剤を提供する。安定化した熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の提供に適した酵素保存バッファは、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．１％の非イオン洗剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだ５０％のグリセロール溶液を具える。本明細書で用いられる用語「熱安定性ＲＮＡリガーゼ」は、別のことを示していない限りは、タンパク質又は遺伝子の変形を意味する。
【００６６】
更に、熱安定性ＲＮＡリガーゼの異型は、本明細書により詳しく説明されているそれらのペプチドやＤＮＡ分子が相当すると考える。例えば、ロイシンをイソロイシン又はバリンに、アスパラギン酸塩をグルタミン酸塩に、トレオニンをセリンに単離置換する、又はアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸（即ち、保存的変異）に類似置換しても、得られる分子の生体活性へ大きな影響はないと考える。従って、本発明のいくつかの実施例は、保存的置換を含む熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）の変異体を提供する。保存的置換は、側鎖と関連するアミノ酸のファミリー内で起こる。遺伝的にコードされたアミノ酸は、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン）；（３）非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）；及び（４）非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることもある。同様に、アミノ酸レパートリーは、（１）酸性（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）；（２）塩基性（リシン、アルギニン、ヒスチジン），（３）脂肪族（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン），セリンとトレオニンは、選択的に脂肪族ヒドロキシル基にグループが分離される；（４）芳香族（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン），（５）アミド（アスパラギン、グルタミン），及び（６）硫黄含有（システインとメチオニン）（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ ｅｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｇ．１７−２１，２ｎｄ ｅｄ，ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９８１）にグループ分けされる。ペプチドのアミノ酸配列における変化が、機能的ポリペプチドを引き起こすかどうかは、変異ペプチドが野生型タンパク質同様に機能するかどうかを評価することにより容易に決定できる。１より多い置換を有するペプチドも同様に、容易に検査できる。変異体が、「非保存的」変化を含むことはめったにない（例えば、グリシンをトリプトファンに置換）。類似する軽微な変異体は、アミノ酸の欠失又は挿入、又は両方を含んでいてもよい。生体活性を消失させることなく、どのアミノ酸残基が、置換、挿入、又は欠失しうるかを決定するガイダンスは、コンピュータプログラムを使用して見つけられる（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。
【００６７】
指向性進化又は他の技術の技術などの変異体の組み合わせライブラリーの生成法によるだけでなく、切断型変異体によっても変異体を生成することができる。いくつかの実施例では、例えば、自動ＤＮＡ合成装置で縮合遺伝子配列の化学合成により作られた縮重オリゴヌクレオチド配列から相同体と変異体を生成し、次いで発現に適した遺伝子を組み立てるために連結した。いくつかの実施例では、（例えば、所定のコード配列にランダムな突然変異を導入するエラープローンＰＣＲ法を利用して）ランダム突然変異誘発により人工進化を実行している。突然変異誘発後、望ましい活性用に得られたクローンを選択し（例えば、熱安定性ＲＮＡリガーゼ用スクリーニング）、次いで、突然変異や選択の連続するラウンドの過程において、有用な突然変異を次の突然変異の次のラウンドに持ち越す。本発明の他の実施例では、本発明のポリヌクレオチを、遺伝子シャフリング又は性的ＰＣＲ手順に用いている（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３２４，１９９４；米国特許第５８３７４５８号；第５８３０７２１号；第５８１１２３８号；第５７３３７３１号）。複数のサイクルの選択とシャフリングは、いくつかの酵素の機能的強化を導く（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３９８，１９９４；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７，１９９４；Ｃｒａｍｅｒｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３１５，１９９６；Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：４５０４，１９９７；及びＣｒａｍｅｒｉら， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：４３６，１９９７）。断片が所望の酵素活性をコード又は保有する限り、 本発明の核酸やタンパク質の断片を使用できる。
【００６８】
「１本鎖特異的ＤＮアーゼ」は、特に１本鎖ＤＮＡを分解するＤＮアーゼを意味するが、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡが他の核酸分子の一部（例えば、分子間塩基対によって）である又は同一の核酸分子の一部分（例えば分子内塩基対によって）であっても、１本鎖ＲＮＡ又は相補的ＲＮＡあるいはＤＮＡにアニール若しくは複合されたＲＮＡ又はＤＮＡを分解しない。特に、１本鎖ＤＮＡをモノマー又は短いオリゴヌクレオチドに分解するときに活性である限り、１本鎖特異的ＤＮアーゼは、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼでもよい。いくつかの好ましい実施例では、プライマーを含むデオキシリボヌクレオチドを、それらを使用する方法のステップ後、反応混合物から１本鎖特異的ＤＮアーゼを用いて分解することによって除去する。エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、及びＲｅｃ Ｊは、典型的な１本鎖特異的ＤＮアーゼである。
【００６９】
本明細書では「Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ」（ＲＮＡＰ）は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ，ＦＷら，ｐｐ．６０−８９ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄ．ｂｙ Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＤＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）、又はバクテリオファージに類似する遺伝的組織を有するバクテリオファージＴ７を意味する「Ｔ７型」由来のＲＮＡＰを意味する。いくつかの実施例では、ＲＮＡポリメラーゼのプロモータは、シュードプロモータなど（例えば、Ｏｈｍｉｃｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５４−５９，２００２）など１本鎖である又はＮ４ｖＲＮＡＰプロモータであり、その場合は、Ｎ４ｖＲＮＡＰ（「ミニｖＲＮＡＰ」と表される；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）の転写的に活性な１１０６アミノ酸領域（アミノ酸９９８−２１０３に対応）を具える短縮タンパク質を使用する（Ｋａｚｍｉｅｒｃｚａｋ，Ｋ．Ｍら，ＥＭＢＯ Ｊ．，２１：５８１５−５８２３，２００２）。
【００７０】
本明細書で用いられる「ＤＮＡ断片」は、長いＤＮＡ分子から切断、又は放出あるいは分離された長いＤＮＡ分子の部分又は一片又は切片を意味し、これはもはや親分子に付着しておらず、あるいは長いＤＮＡ分子の一部の相補的コピーであるｓｓＤＮＡ意味する。この場合、長いＤＮＡ分子にアニールする又はこれを鋳型として使用するプライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼを使用して、相補的コピーを合成する。いくつかの好ましい実施例では、この方法を用いて標識されたＤＮＡ断片の集合又は集団を具える「ＤＮＡ断片ライブラリー」を生成する。
【００７１】
「鋳型」は、ＤＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼによりコピーされている核酸分子である。核酸分子が、２本の鎖（即ち、「２本鎖」）又は１本のみの鎖（即ち、「１本鎖」）を具えているか否かにかかわらず、合成された核酸により発現したヌクレオチドの配列に特異的に作用する前記核酸分子の鎖は、「鋳型」又は「鋳型鎖」である。核酸ポリメラーゼによって合成した核酸は、この鋳型に相補的である。 ＲＮＡもＤＮＡも常に通常５’→３’方向に合成され、 鋳型鎖の３’末端から開始して、核酸２本鎖の２本の鎖は常に、２本の鎖の５’末端が２本鎖の反対側の末端にとなるよう配置される（必然的に３’末端もそのようになる）。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより合成を開始するのにＲＮＡとＤＮＡ鋳型の両方に必要であるが、通常単に「ＲＮＡポリメラーゼ」と呼ばれるＤＮＡ非依存的ＲＮＡポリメラーゼにより合成を開始するときはプライマーは必要ではない。
【００７２】
本明細書で用いられる「標識」は、通常ＤＮＡである非ターゲット核酸成分を意味し、これは結合された核酸断片をアドレスする手段を提供する。例えば、好ましい実施例では、標識が付着した（例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長するプライマーが伸長するようにオリゴヌクレオチドをアニーリングする部位提供することによって又は回収又はライゲーション反応のオリゴヌクレオチドを提供することによる）ＤＮＡの識別、認識、及び／又は分子又は生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列を標識は具える。標識をＤＮＡ分子に結合する過程を、本明細書ではときどき「標識する」と言い、標識を受けたり、標識を含むＤＮＡを「標識された」（例えば、「標識されたＤＮＡ」）と言う。標識は、１又はそれ以上の標識部分又は標識領域を有する。
【００７３】
本明細書で用いられる「標識部分」又は「標識領域」は、所望の対象とする目的又はアプリケーションの配列を示す標識部分又は領域を意味する。第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、５’末端部分が標的核酸配列と相補的ではない１又はそれ以上のヌクレオチド配列を提示する実施例において、標識は、その５’部分に１又はそれ以上の「標識領域」を有し、標識領域の各々は所定の目的のために提供される。例えば、いくつかの実施例では、標識は、切断部位標識領域、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域、配列標識領域、回収標識領域、増幅標識領域、検出標識領域、対処標識領域、及びトランスポゾン末端領域から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はそれらからなる。
【００７４】
本明細書で用いられる「切断部位領域」は、切断を促進する目的の配列を提示する標識領域を意味する。いくつかの実施例では、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子から２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ分子を生成するために切断部位領域が用いられている。いくつかの実施例では、標識内の切断部位領域は、１又はそれ以上の２’−デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）部分又は１又はそれ以上の８−オキソグアニン−２’−デオキシリボジル−一リン酸（８−オキソ−ｄＧＭＰ）部分、を具える又はこれらからなり、この方法のステップ（ｃ）は、標識された第１鎖ｃＤＮＡ分子をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）又は８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）と接触させて１又はそれ以上の脱塩基部位を含む標識された環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を生成するステップと、、次いで、アルカリ溶液又は環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を脱塩基部位又はそれに近い部位で線状化して２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼＩＶなどのエンドヌクレアーゼを含む溶液中で、インキュベートするといった条件下で環状第１鎖ｃＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。いくつかの実施例では、標識内の切断部位領域は、制限酵素認識部位の配列を提示する。いくつかの実施例では、制限部位は標的ＤＮＡ内に、存在するしたとしてもまれである（例えば、ＮｏｔＩ又はＡｓｃＩなどが、まれな切断の制限エンドヌクレアーゼの制限部位である）。いくつかの実施例では、切断部位領域内の制限部位は、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼなどＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ用である。いくつかの実施例では、この方法は更に、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片の１本鎖の制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドをアニーリングするステップと；次いで制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位において標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を切断するステップとを具える。このように、いくつかの実施例で、この方法は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を線状化して２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成するステップを具える。いくつかの実施例では、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは、制限部位を具える２本鎖のヘアピンを具える又はこれからなる５’末端部分を有し、この方法は、制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位において、標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を切断するステップを具える。（ｉ）１本鎖制限部位に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチドのアニーリングにより又は２本鎖ヘアピンを具える転写鎖をを用いることにより、２本鎖制限部位を生成するステップと（ｉｉ）次いで２本鎖制限部位を認識する制限エンドヌクレアーゼを用いて制限部位を切断するステップを具えるいくつかの好ましい実施例では、この方法が更に、制限エンドヌクレアーゼで切断された標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を、適合する３’末端を有する別のＤＮＡ分子に連結するステップを具える。
【００７５】
本明細書で用いられる「ＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域」又は「プロモータ領域」は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータのセンスプロモータ配列又はアンチセンスプロモータ配列用の配列を提示する標識領域を意味する。本明細書で用いられる「センスプロモータ配列」又は「センスＲＮＡポリメラーゼプロモータ配列」は、ＤＮＡ鎖に結合されたＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を意味し、そのＤＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、転写に適切な反応条件下でそこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼによる転写の鋳型として機能する。本明細書で、「アンチセンスプロモータ配列」又は「アンチセンスＲＮＡポリメラーゼプロモータ」は、センスプロモータ配列と相補的なＲＮＡポリメラーゼプロモータの配列を意味する。いくつかの実施例では、ＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域により提示されたセンスプロモータ配列は、１本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写が開始するＲＮＡポリメラーゼ用のものであり、この実施例ではセンスプロモータ配列はＲＮＡポリメラーゼプロモータとして十分に機能する（例えばバクテリオファージＮ４ＲＮＡポリメラーゼ）。センスプロモータ配列は、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合するＲＮＡポリメラーゼ用のもので、転写がそこから開始するいくつかの実施例では、この実施例では、この方法が、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いる転写に先立ち、ＲＮＡポリメラーゼプロモータを２本鎖にするステップを具える（例えば、センスプロモータ配列に相補的なアンチセンスプロモータ配列を提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドをセンスプロモータ配列にアニーリングすること、又はセンスプロモータ配列を具えるか又はこれからなるｄｓＤＮＡを合成するための鋳型として標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を使用することによる ）。いくつかの実施例では、センスプロモータ配列は、Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及びＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼから選択された）用のためのものである。センスプロモータ配列を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ領域は、この方法を用いてセンスプロモータ配列が連結される１本鎖ＤＮＡと相補的なＲＮＡを合成できる。
【００７６】
本明細書で用いられる「配列決定標識領域」又は「配列決定標識」は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を合成する方法を用いて標識が結合される、ｓｓＤＮＡ断片の配列決定を促進する目的の配列を提示する標識領域を意味する（例えば、合成により配列決定のためのプライミング部位を提供する、又は、ライゲーションにより配列決定するアニーリング部位を提供し、あるいは、ハイブリダイゼーションにより配列決定するアニーリング部位を提供する)。 例えば、いくつかの実施例では、配列決定標識領域は、前記ｓｓＤＮＡ断片のＤＮＡ合成又は前記ｓｓＤＮＡ断片の相補体のプライミングの部位を提供する。
【００７７】
本明細書で用いられる「標識領域の回収」又は「標識の回収」は、標識領域が結合するｓｓＤＮＡ断片の回収を促進させる目的の配列を提示する標識領域を意味する（例えば、ビード又は他の表面上にある標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を回収するためにアニーリング部位又は親和性標識を提供する、例えば、ビード上又はマイクロチップあるいはマイクロアレイもしくは配列決定ビード上にあるプローブなど表面上にある特異的な配列にアニーリングすることによって標識領域配列のアニーリング部位が回収する）。この方法のいくつかの実施例では、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、表面上の相補的なプローブにアニーリングすることにより回収された後に回収標識領域が、前記標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は前記２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片（又は前記標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の相補体）を鋳型として用いてＤＮＡ合成をプライミングする部位を提供する。いくつかの実施例において、回収標識領域は、親和性結合分子を具える又はこれからなる化学基又は部分に結合する転写鎖の５’部分を含む（例えば、転写鎖の５’部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、抗原、又は抗原に結合する抗体などの第１親和性結合分子に結合し、第１親和性結合分子と特異的に結合対を形成する第２親和性結合分子が取り付けられている表面上の環状の標識されたｓｓＤＮＡ断片又は１重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を回収できる）。
【００７８】
本明細書で用いられる「標識領域の増幅」は、前記標識を付加した核酸の増幅を促進する配列を提示する標識領域を意味する。例えば、いくつかの実施例では、増幅標識領域が、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応又は鎖置換増幅反応、あるいはローリングサークル増幅反応）用のプライミング部位、又は核酸増幅反応（例えば、ライゲーションチェーン反応）における鋳型依存性のリガーゼを用いてプローブのライゲーション用のライゲーションの鋳型、を提供する。
【００７９】
本明細書で用いられる「標識領域の検出」又は「検出標識」は、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片又は２重に標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の検出を促進する目的の配列又は検出可能な化学的もしくは生化学的部分を提示する標識領域（例えば、この配列又は化学部分は、ＢＣＩＰ又は適切な基質を有するペルオキシターゼを添加したＮＢＴを有するアルカリホスファターゼなどの基質の存在下で検出可能な酵素である可視的な、蛍光性の、化学発光性の、又は検出可能な染色から選択される検出可能な分子を具える又これらの分子に結合されている）；例えば、緑色蛍光タンパク質である親和性結合分子；及び検出可能な部分に結合した又は親和性結合対又は他の検出可能な親和性結合分子との親和性結合対を形成する親和性結合分子；あるいは当該技術分野で知られた多くの異なる検出可能な分子又はシステムを意味する。
【００８０】
本明細書で用いられる「標識領域にアドレスする」又は「標識にアドレスする」とは、特異的なサンプルの識別を可能にする配列を提示する標識領域を意味する（例えば、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分は、各サンプルのためにさまざまな配列を提示するさまざまなアドレス標識領域を有する）。
【００８１】
「トランスポゾン末端領域」は、転移トランスポゾン末端配列を提示する標識部分又は標識領域である。一般に、トランスポゾン末端配列を具える標識を有する線状ｓｓＤＮＡ分子は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能なＮｅｘｔｅｒａ（商標）サンプルプレップキット用いて生成する。
【００８２】
さまざまな標識領域の名称や説明は、さまざまな実施例において、標識のさまざまな部分又は領域の意図した目的や適用をより容易に理解及び議論するための便宜的なものである。しかし、これらの名称や説明は、標識又はいずれの標識領域の使用又は適用の制限を意図するものでは決してない。従って、特定の標識又は標識領域は、意図した又は主要な目的あるいは適用に加えて又は代わりに任意の目的で使用できる。更に、１つの標識領域は、２つ又はそれ以上の別の標識領域を具え（例えば、配列決定標識領域は、回収標識領域と増幅標識領域の両方を具える）、又は１つの標識領域は、２つ又はそれ以上のさまざまな標識領域の機能又は目的あるいは適用を提供できる（例えば、回収標識領域は更に、特定の適用のために配列決定標識領域及び／又は増幅標識領域の機能又は目的を提供することができる）。更にまた、任意の特定の目的又は機能に関して１又はそれ以上の異なる領域の観点から説明する必要はない。
【００８３】
〔発明の一般的な説明〕
鋳型依存性（又は相同体リガーゼ）又は鋳型非依存性（又は非相同体）リガーゼを用いて線状１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子をライゲーションさせて環状ｓｓＤＮＡ分子を作ることができる。
【００８４】
本明細書で用いられる「鋳型依存性リガーゼ」又は「相同リガーゼ」は、相補的なポリヌクレオチドにアニールする場合に、連結すべきｓｓＤＮＡの両方の末端が互いに隣接するときに線状ｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーション（即ち、環状化）を触媒するＤＮＡリガーゼを意味する。連結すべきｓｓＤＮＡ分子の両末端が隣接してアニールするポリヌクレオチドを、本明細書では「ライゲーション鋳型」と言い、ライゲーションを、「鋳型依存性ライゲーション」又は「相同ライゲーション」と呼ぶ。ライゲーション鋳型は、生体サンプル中のゲノム又は他のＤＮＡ中の相補的ＤＮＡ配列であってもよく、あるいはライゲーション鋳型は、合成され特異的又は特定の線状ｓｓＤＮＡ分子を提供する「架橋オリゴデオキシリボヌクレオチド」又は「ライゲーションスプリントオリゴデオキシリボヌクレオチド」（又は「ライゲーションスプリント」）であってもよい。各架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドは、一方が連結を望む線状ｓｓＤＮＡ分子の末端に相補的なヌクレオチド配列を提示するよう設計されており、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドにアニールするときに、線状ｓｓＤＮＡ分子の末端が隣接する。鋳型依存性ＤＮＡリガーゼは、ライゲーション鋳型が存在するときのみｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを触媒する大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡリガーゼ、及びＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）などのＮＡＤ型ＤＮＡリガーゼや、平滑末端ライゲーション用のライゲーション鋳型を必要としないが、鋳型非依存ライゲーションよりもずっと効率的に鋳型依存性ライゲーションを触媒するＴ４ＤＮＡリガーゼあるいはＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼを含む。
【００８５】
生体サンプル内に標的配列又は架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドからなる相補的ライゲーション鋳型が存在すると、線状ｓｓＤＮＡ鋳型依存性分子内ライゲーションは効果的かつ特異的であり、生体サンプル中の標的核酸配列の存在の検出又は定量化は当該技術分野で知られる多くの方法の基礎となる。しかし、サンプル中の全ｍＲＮＡ分子のオリゴ（ｄＴ）をプライマーとした逆転写により合成された全第一鎖ｃＤＮＡ分子などのさまざまなｓｓＤＮＡ分子の大きな集団を環状化することが目的であっても、連結される全てのｓｓＤＮＡ分子に適切な相補的架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計するのは非常に困難なので、鋳型依存的ライゲーションは、非常に非現実的である。特に、ｓｓＤＮＡ分子の末端の配列が未知であると、サイズやヌクレオチド配列が変化するｓｓＤＮＡ分子の大きな集団のｓｓＤＮＡ分子の全てを高い割合で環状化させるために相補的架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを設計又は提供することは非常に困難又不可能である。例えば、さまざまな鋳型依存的リガーゼや連結反応条件で架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドを用いて未知のあるいはランダムな５’及び／又は３’末端配列を提示した線状ｓｓＤＮＡ分子を環状化しようとした本出願人の研究室での多くの実験では、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドがさまざまな長さのランダムヌクレオチド配列又は我々が連結することを希望した線状ｓｓＤＮＡ基質の一末端で既知の配列に相補的な配列を提示し、イノシンなどの普遍的塩基を具えるランダム配列のさまざまな長さ又は配列のさまざまな長さからなる配列のもう一端の配列の隣接分を提示しても、線状ｓｓＤＮＡ分子が連結される割合は、数パーセント未満である。理論に拘束されることなく、出願人は、連結される線状ｓｓＤＮＡ分子の一末端に架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドの既知の配列が正確に相補的配列にアニールしたと考えているが、架橋オリゴデオキシリボヌクレオチドのもう一末端のランダム配列は、しばしば線状ｓｓＤＮＡ分子のもう一末端に相補的ではない（そしてライゲーションがブロックされる）。このように、鋳型依存的リガーゼを用いる方法は、多くのアプリケーション（例えば、サンプル中の全てのｍＲＮＡ分子から調整された全ての第１鎖ｃＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成する（例えば、遺伝子発現分析用）に、又は変性ゲノムＤＮＡ断片から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに実用的ではない（例えば、ＣＮＶ分析）。
【００８６】
線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するには、相補的な標的核酸又は架橋オリゴヌクレオチドなどの、ライゲーション鋳型を必要としない分子内ライゲーション方法が当該技術分野で必要とされる。必要なのは、我々が本明細書で意味する「鋳型非依存的」または「非相同」リガーゼを用いた分子内ライゲーション方法であり、その末端が連結したい線状ｓｓＤＮＡの末端に標的ヌクレオチドまたは架橋オリゴヌクレオチドなどのライゲーション鋳型が無い所で、線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションさせて環状ｓｓＤＮＡを生成するリガーゼがアニールしてその末端が隣接する。
【００８７】
上記のように、線状ｓｓＤＮＡ分子の配列と長さによっては、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への分子内鋳型非依存ライゲーションの技術分野で行われており、知られている方法やライゲーション反応混合物は、不十分で変わりやすい結果をもたらす。従って、最高の分子内鋳型非依存ライゲーションの結果をもたらすファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼのような熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いても、分子間鋳型非依存ライゲーション方法の改善や改善された連結反応混合物やキットについては当該技術分野において、緊急の満たされていない必要性がある。当該技術分野で知られている最も入手可能なライゲーション反応混合物とライゲーション条件を使用した。本明細書で用いられる「標準ライゲーション反応混合物」とは、ここでは５’リン酸基と３’水酸基を有する０．５マイクロモルの線状ｓｓＤＮＡ基質、１マイクロモルの熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、マイクロリットルあたり５ユニットのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ）、５０ミリモルＭＯＰＳバッファ（ｐＨ７．５）、１０ミリモルのＫＣｌ、１ミリモルのＤＴＴ、５ミリモルのＭｇＣｌ２、２．５ミリモルのＭｎＣｌ２、及び５０マイックロモルのＡＴＰを含むライゲーション反応混合物を意味し、「標準ライゲーション反応条件」は、線状ｓｓＤＮＡ基質分子を標準連結反応混合物中において６０℃で１時間インキュベートすることを意味する。上記の標準ライゲーション反応混合物と標準ライゲーション反応条件は、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーション用に当該技術分野で共通で用いられるものと同一又は類似である。ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（例えば、ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ Ｌｉｔ．＃２２２を参照されたい）用のｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションの標準ライゲーション反応条件を推奨しており、Ｐｒｏｋａｒｉａ、及びそのパートナー会社、ＭａｔｉｓとＰｒｏｋａｚｙｍｅは、彼らが追加的に、ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準ライゲーション反応混合物（例えば、ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｈｅｅｔ ｖｅｒｓｉｏｎ４．２におけるＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（製品番号Ｒｌｉｇ １２２）用の「ｓｓＤＮＡライゲーション」（環状化）の指針を参照）に最終濃度マイクロリットルあたり２５ｎｇＢＳＡまで添加することを推奨したことを除き、標準ライゲーション反応条件を推奨する。これは、ＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼは、２００４年４月２６日付でＰｒｏｋａｒｉａ、Ｍａｔｉｓ又はＰｒｏｋａｚｙｍｅのディストリビュータから入手可能である。
【００８８】
上記標準ライゲーション反応条件を用いた線状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーション後に、変性条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってその反応生成物を分析する。ゲル上に流す前に連結されないｓｓＤＮＡ分子を分解し、環状ｓｓＤＮＡ分子内ライゲーション生成物の識別を助けるエキソヌクレアーゼ（エキソＩ又はＩＩＩ又は、好ましくは両方の酵素の混合物）で、サンプルを処理する。
【００８９】
発明者と発明者の雇用者であるＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の従業者が共働し、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを販売した約５年間、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社の科学者達は、標準ライゲーション反応混合物や条件を用いてさまざま配列又は長さを有する、その他のものよりｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドが容易に環状化されることを観察した。生体サンプル由来のｍＲＮＡを逆転写して作られた第一鎖ｃＤＮＡなどの、大きい線状ｓｓＤＮＡ分子から酵素を使用して環状ｓｓＤＮＡ分子を高い収率で合成することは非常に困難である。多くのアプリケーションで最高のパフォーマンスが達成されるように全てのｓｓＤＮＡ分子が、同じ高効率で分子内連結するのが好ましい。
【００９０】
ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は、扱いづらい又は連結しにくい基質のライゲーション収率を改善するガイドラインを提供している。これらの提案は、標準ライゲーション混合物と比較すると、ＭｎＣｌ２の濃度を変更させるステップやＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素を更に添加するステップを具えている。しかし、ある基質については、連結可能又は連結容易なｓｓＤＮＡ基質で達成できるよりも収率が更に低い。
【００９１】
ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを取り扱っていた数年間で、出願人は、この酵素の様々な調整法がある線状ｓｓＤＮＡ基質をともなう環状ｓｓＤＮＡ生成物を可変収率で生成することを観察した。
【００９２】
２００８年に、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の科学者は、従来のクローンから得られていたものよりもより良い大腸菌細胞中のタンパク質の発現又は収率を得るためにバクテイオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子の新しい組み換えプラスミドクローンを作成した。米国特許第７，３０３，９０１号に開示するように、新しい組み換えクローンは、ヘキサヒスチジン標識を有さないバクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を含有している。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は精製して、この精製した酵素調整をＳＤＳを含んだ１０％のポリアクリルアミドゲルの電気泳動で分析したとき、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素が、良い収率で新しいクローンから発現され、期待の４３，８７６ダルトンの分子量であった。しかし、出願人は、この新しいクローンから調整したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）の大部分が、ＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化された形からなることを知って驚いた（約７０％のアデニル化と推定）（図１）。これに対して、従来のクローンから調整した酵素の同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、大部分がＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル化された形からなることを示した（約３０％のみがアデニル化されていると推定される）。新しいクローンと古いクローンの両方から調整した酵素を、標準ライゲーション反応条件下で使用したとき（上述）、古いクローンから調整した酵素を用いて得た収率と比較すると、新しいクローンから調整した酵素を用いて得た環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物の収率の方が低かった。この結果はやや意外であり、さまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質、さまざまなライゲーション反応混合物を用いて新しいクローンと古いクローンの両方から調整したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素の分子内ライゲーション活性を、出願人は体系的に比較した。ここで、ライゲーション反応混合物は、さまざまなレベルのＡＴＰ、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２を有するライゲーション反応混物合を含み、新しいクローンと古いクローンから調整された異なるレベルのＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）を含み、反応時間は様々であり、両性イオン化合物トリメチルグリシン（ベタイン）などのライゲーション反応混合物中の全く新しい成分を含む。
【００９３】
驚くべきかつ予期せぬことに、ＡＴＰ非存在下で、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ）酵素のアデニル化形式のモルが線状ｓｓＤＮＡ基質に対して過剰な状態でライゲーション反応を実行すると、特に新しいクローンから高度にアデニル化された酵素が、おおよそ定量的なさまざまなヌクレオチド及びサイズを有しさまざまな線状ｓｓＤＮＡ基質を有する分子内ライゲーションを生成したことを観察した（特に、ライゲーション反応混合物やライゲーション反応条件を改善するためにライゲーション反応を更に修飾する方法を出願人が発見した後）。
【００９４】
得られた結果（実施例を参照されたい）により、出願人は、さまざまなヌクレオチド配列及び／サイズを有するはるかに効率的で一貫性のある線状ｓｓＤＮＡ基質を可能にする、改良されたライゲーション反応混合物と、改善されたライゲーション反応混合物を用いた改善された分子内ライゲーション方法の開発が可能になった。
【００９５】
したがって、本発明の一実施例は、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への分子内ライゲーション用の改善されたライゲーション反応混合物である。本明細書の「改善されたライゲーション反応混合物」は、
（ａ）線状ｓｓＤＮＡ分子；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、この熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化され、アデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が少なくともｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と等しい組成物；
（ｃ）ｐＨを維持するバッファ；及び
（ｄ）Ｍｎ２＋陽イオン；を具えるライゲーション反応混合物であって、
ＡＴＰが反応バッファ中に存在しないか、もしくは熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル形の濃度より低いモル濃度で存在する混合物を意味する。好ましい実施例では、連結反応混合物にＡＴＰは添加されない。
【００９６】
熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の高い割合がアデニル化され」との記載は、改善されたライゲーション反応混合物中の全てのリガーゼ分子の少なくとも約６０％がアデニル化されることを意味する。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約７０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約８０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約９０％以上がアデニル化されている。この改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、全ての熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の少なくとも約９５％以上がアデニル化されている。いくつかの好ましい実施例では、精製過程の間又は後に、ＡＴＰを有する酵素をインキュベートすることにより熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化された組成物を作成するために、熱安定性ＲＮＡリガーゼがアデニル化される。例えば、熱安定性ＲＮＡリガーゼをアデニル化するのに用いることができる一のプロトコルは、ｐＨ８．０で５０ｍＭのトリスＨＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５ｍＭのＡＴＰを含む溶液中５０℃で１５分間インキュベートし、次いで５ｍＭの最終濃度になるまでＥＤＴＡを添加し反応を停止させ、次いで透析又はゲルろ過により反応成分を除去する。熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化された割合は、実施例で説明したようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により推定できる。いくつかの好ましい実施例では、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化されている熱安定性ＲＮＡリガーゼが、バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、バッファがは、ｐＨをｐＨ６．５乃至８．０で維持されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、バッファがは、ｐＨをｐＨ７．０乃至８．０で維持されている。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、ｐＨがｐＨ７．０乃至８．０で維持されているバッファはトリスバッファである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、０．５乃至１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、１．０乃至１０ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は、１乃至５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンの濃度は２．５ｍＭである。改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例では、Ｍｎ２＋陽イオンが、ＭｎＣｌ２として提供されている。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも２倍のモル濃度である。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも５倍のモル濃度である。いくつかの実施例では、改善されたライゲーション反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも１０倍のモル濃度である。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、塩化ナトリウム又は酢酸カリウムなどの塩を具える（例えば約５０ないし約１００ｍＭの濃度）。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物が更に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元試薬を具える（例えば約０．５又は約１ｍＭの濃度で）。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物は更に、約０．２５乃至５．２Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、改善された連結反応混合物が更に、約０．５乃至２Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、約１Ｍの濃度で両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）を具える。
【００９７】
いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物は：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有するｓｓＤＮＡ分子（例えば、０．５マイクロモル）；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、７０％を超える熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が、アデニル化されており、改善された連結反応混合物中のアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度が少なくともｓｓＤＮＡ分子の濃度と等しい、（例えば、０．５マイクロモルの線状ｓｓＤＮＡ分子に対して約１マイクロモルのアデニル化されたＲＮＡリガーゼ）組成物；
（ｃ）最終ｐＨが、約ｐＨ７．８である３３ｍＭのトリス酢酸；及び
（ｄ）最終濃度が約２．５ｍＭであるＭｎ２＋陽イオン；を具え、
ＡＴＰが、反応バッファ中に存在しないか、あるいは熱安定性ＲＮＡリガーゼの非アデニル化形の濃度より低いモル濃度で存在する。好ましい実施例では、ＡＴＰをライゲーション反応混合物に添加しない。
【００９８】
いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、６６ｍＭの酢酸カリウムと０．５ｍＭのＤＴＴを具える。いくつかの好ましい実施例では、改善されたライゲーション反応混合物が更に、１Ｍのベタインを具える。
【００９９】
本発明の別の実施例は、環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法であり、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度約４０℃乃至約７０℃で、環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度５５℃乃至７０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で反応温度５５℃乃至６５℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーションの方法のいくつかの実施例では、この方法は、改善されたライゲーション反応混合物中で、反応温度６０℃で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップを具える。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも２倍高い。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも５倍高い。線状ｓｓＤＮＡ分子の改善された分子内ライゲーション方法を環状ｓｓＤＮＡ分子の合成に用いるいくつかの実施例では、合成した環状ｓｓＤＮＡ分子の収率が、本明細書で定義した標準ライゲーション条件を用いて同じ量の線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子の収率よりも少なくとも１０倍高い。
【０１００】
上記の予期せぬ発見により、関連するメカニズムのより良い理解し、我々が、他の状況に対する研究成果、アプリケーション及び方法を適用及び広げることで、出願人は、改善されたライゲーション条件の基礎を考えるに至った。我々の研究成果とこの成果をより良く理解することで、線状ｓｓＤＮＡ分子をより効果的で一貫性のある分子内ライゲーションと、それらが有用である任意のアプリケーションに環状ｓｓＤＮＡ分子の合成における収率の最大化する結果になることを希望する。論理や推測に拘束されることなく、出願人は、本明細書に記載された本発明の基礎や潜在的な利益に関連する考えやアイディアを以下に示す。
【０１０１】
バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて、さまざまな配列とサイズのｓｓＤＮＡ分子の可変的な分子内ライゲーション効率の問題を解消すべく、出願人はこの酵素のライゲーションメカニズムに関連するさまざまな触媒ステップを慎重に検討した。この触媒ステップは、一般に実質上全てＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼ及びＲＮＡリガーゼに共通である。
【０１０２】
バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）又はＴＨＥＲＭＯＰＨＡＧＥ（商標））ライゲーション反応のステップは以下の通りである：
反応１．リガーゼ＋ＡＴＰ→アデニル化されたリガーゼ＋ＰＰｉ
反応２．アデニル化されたリガーゼ＋線状５’−ｐＤＮＡ→ＡｐｐＤＮＡ＋リガーゼ
反応３．リガーゼ＋ＡｐｐＤＮＡ→環状ＤＮＡ＋ＡＭＰ＋リガーゼ
【０１０３】
従って、第１反応のステップは、ＡＴＰによるＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ活性部位であるリシンのイプシロンアミノ基をアデニル化してアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼを形成するステップを具える。次いで、第２反応のステップでは、熱安定性ＲＮＡリガーゼからＡＭＰ部分を５’リン酸基に転移させて５’アデニル化ｓｓＤＮＡを合成する。最後に、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼが、５’アデニル化末端（ライゲーション反応で「ドナー」と呼ばれる）上のｓｓＤＮＡの３’水酸基（ライゲーション反応で「受容体」と呼ばれる）の攻撃を促進し、それによりｓｓＤＮＡの３’末端を５’末端に結合させて環状ｓｓＤＮＡを合成し、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼとＡＭＰを放出させる。
【０１０４】
熱安定性ＲＮＡリガーゼの上記３ステップのライゲーション反応メカニズムに基づいて、当該技術分野で用いられる標準ライゲーション反応条件と比較して環状ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションの効率と収率を改善させるいくつかの戦略を想像できる。
【０１０５】
例えば、当該技術分野で採用した一の戦略は、ＡＴＰ濃度を調整してより効率的でより高いレベルの分子内ライゲーションを与える濃度を見つけることである。この戦略は、ときには熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いて容易に連結できる単一ｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションを最適化するのに効果的である。「容易に連結する」は、ｓｓＤＮＡ基質が熱安定性ＲＮＡリガーゼにより十分に分子内連結して高レベルで環状ｓｓＤＮＡ分子を形成できる配列とサイズを提示することを意味する。「高レベル」とは、標準ライゲーション反応条件下において熱安定性ＲＮＡリガーゼの存在下で１時間インキュベーションした後、線状ｓｓＤＮＡ分子の少なくとも５０％が分子内で連結することを意味する。しかし、「発明の背景」の項で論じたように、この問題に取り組んでいた数年の間に、本発明の出願人やＮｕｎｅｚら（上記した）などの当業者は、さまざまなｓｓＤＮＡ分子用の分子内ライゲーション効果に大きな違いを観察した。そうした我々の努力にもかかわらず、容易に連結するｓｓＤＮＡ基質の信頼性のある予測及びどのｓｓＤＮＡ基質が効率的に連結することが困難又は不可能でさえあるということを予測するルールを作ることができなかった。従って、効率的でレベルの高い単一の連結が困難なｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーションのを達成することを望み、又は配列、サイズ、又はライゲーション効率が異なるｓｓＤＮＡ分子の集団における全てのｓｓＤＮＡ分子の効率的又はレベル高い分子間ライゲーションを達成することを望む状況で、分子間ライゲーション反応用のより優れたＡＴＰ濃度を見つける戦略は成功していなかった。
【０１０６】
我々は、まず「我々や他の者がこのような状況でＡＴＰ濃度を調整することで分子間ライゲーションのより効果的又は高いレベルを達成させることが不成功だった理由は何だろう？」と自身に尋ねた。これに答えるべく、我々は、配列、サイズ又はライゲーション効率が異なるｓｓＤＮＡ分子集団において、効果的なかつ高いレベルの全てのｓｓＤＮＡ分子の分子間内ライゲーションを達成しようとする一般的な状況を検討した（生体サンプル中の全てのｍＲＮＡ分子の逆転写により生成される全ての第１鎖ｃＤＮＡ分子を又は変性断片化されたゲノム若しくはミトコンドリアＤＮＡのような断片化されたｄｓＤＮＡの変性により得られた全てのｓｓＤＮＡフラグメントを分子間で連結するときに見られることなど）。このような集団の中で、容易に連結されｓｓＤＮＡ分子や連結が困難な他のｓｓＤＮＡ分子をいくつか発見した。ＡＴＰの存在下でライゲーション反応開始後のさまざまな時点で、連結が容易なｓｓＤＮＡ分子、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子、及びＲＮＡリガーゼに何が起こっているのだろう？
【０１０７】
第１反応のステップは、反応温度で（ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼは通常は約６０℃）ライゲーション反応混合物をインキュベーションすると直ちに開始するＲＮＡリガーゼ分子のアデニル化するステップを具える。このステップが生じると、第２反応ステップにおいて、アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子を使用してｓｓＤＮＡ分子の５’リン酸末端をアデニル化する。ＲＮＡリガーゼにより急速に分子間で連結されるｓｓＤＮＡ基質を意味する、連結が容易なｓｓＤＮＡライゲーション基質には、ＡＴＰにより全てのＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化される前に、その基質が急速にアデニル化され、次いでこの第２反応ステップ後に非アデニル化リガーゼに結合しつづけているアデニル化されたｓｓＤＮＡ分子が、第３反応ステップで非アデニル化ＲＮＡリガーゼにより分子内で結合する。ＲＮＡリガーゼにより非常にゆっくり分子内で連結される基質を意味する連結が困難なｓｓＤＮＡライゲーション基質については、ライゲーション反応の第２又は第３のステップ、又は両方のステップがよりゆっくり生じる。従って、大部分又は全てのＲＮＡリガーゼ分子がアデニル化されるまでＡＴＰによりＲＮＡリガーゼ分子が一層アデニル化されるので、いくらかのｓｓＤＮＡ分子もアデニル化される。しかし、アデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼは、アデニル化されたｓｓＤＮＡ分子を分子内ライゲーションすることできない。従って、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子がいくらかまだ分子内で連結されているが、アデニル化されていない後に、ＲＮＡリガーゼ分子の全てがアデニル化されると、アデニル化された連結が困難な線状ｓｓＤＮＡ分子を環状ｓｓＤＮＡ分子に変換するライゲーションステップ３を完了することが不可能である。特に、ライゲーション反応ステップ２の後に、ＲＮＡリガーゼ分子の全てがアデニル化され、連結が困難なｓｓＤＮＡ分子がアデニル化されているが、非アデニル化ＲＮＡリガーゼに結合していない場合、これらのアデニル化されたｓｓＤＮＡ分子は連結されない。従って、ＡＴＰ存在下で分子内ライゲーション反応が、熱安定性ＲＮＡリガーゼの全てがアデニル化され、線状ｓｓＤＮＡ基質のいくらかがアデニル化された場合に、その反応を制限することがある。
【０１０８】
この問題に対する考えられる解決策の１つは、ライゲーション反応混合物におけるＡＴＰの濃度を下げることだろう。しかし、ＡＴＰ濃度があまり低いと、ライゲーション反応ステップ１が律速となって第２及び第３ライゲーション反応ステップの速度をも低下させてしまう。反応の過程では、ＡＴＰ濃度が減少すると全体の反応速度もまた時間とともに減速する。おそらく、ＡＴＰ再生システムを採用してリガーゼを完全にアデニル化させない定常状態レベルにＡＴＰ濃度を維持することができる。しかし、この反応におけるさまざまな線状ｓｓＤＮＡ分子の全てにとって、条件が最適ということではない。ｓｓＤＮＡ分子の全てのライゲーションを制御又は最適化するのがより困難になるので、他の反応成分を追加してより複雑さが増すことも好ましくない。
【０１０９】
要約すると、ライゲーション反応ステップ１が速く、ライゲーション反応ステップ２と３が律速であると、どれだけ長く反応を実行しても、環状の収率が低くなる。これは、［ＡＴＰ］＞＞［リガーゼ］である標準ライゲーション条件下で、リガーゼの全てがアデニル化形になるためである。ライゲーション反応ステップ１と２の両方が速く、ライゲーション反応ステップ３が律速であると、同じ理由で環状の収率が低くなる。このように、熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いてｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを行う当該技術分野で知られている標準ライゲーション混合物及び方法を使用すると、ＡＴＰにより酵素の全てがアデニル化される前に連結が容易なｓｓＤＮＡライゲーション基質はアデニル化され、ＲＮＡリガーゼにより急速に分子内ライゲーションが生じるのに対し、連結が困難なｓｓＤＮＡライゲーション基質は、ＡＴＰにより酵素の全てがアデニル化される前にアデニル化はされるが、連結はなされず、アデニル化された連結が困難なｓｓＤＮＡ基質を完全に分子内ライゲーションすることを不可能にする。
【０１１０】
これらの結果に基づいて、理論に拘束されることなく、このような条件下で、改善されたライゲーション反応混合物と線状ｓｓＤＮＡ分子と外因性でないＡＴＰに対してアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼを上回る過剰なモルを使用する改善されたライゲーション反応条件を用いて分子内ライゲーションで分子内ライゲーションが改善されると、出願人は仮定する。なぜなら、この条件下では、ライゲーション反応の第１ステップがバイアスされ、ライゲーション反応の第２ステップにおいて線状ｓｓＤＮＡ分子がアデニル化されるのと同時に非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼをアデニル化するのにＡＴＰを必要としないためである。従って、定常状態条件下では、ライゲーション反応の第２ステップにおいて、アデニル化ＲＮＡリガーゼを線状ｓｓＤＮＡ分子はアデニル化するためだけに使用される。更に、改善されたライゲーション反応条件下では、線状ｓｓＤＮＡのアデニル化が生じると、非アデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼ濃度が反応中に時間とともに増加してこれが線状ｓｓＤＮＡ分子ライゲーションを促進して環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する。
【０１１１】
当業者は、ｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションを改善するためにライゲーション反応混合物中で提供される熱安定性ＲＮＡリガーゼのアデニル化のレベルに注意を払わなかった。出願人は、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物を含むライゲーション反応混合物を特定した又はｓｓＤＮＡ分子の分子間ライゲーションのための改善されたライゲーション反応混合物などの使用方法を開示した当業者によるいかなる開示も見つけることができなかった。従って、熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物を提供することによりＡＴＰが欠如している本発明の改善されたライゲーション反応混合物を用いて、分子内ライゲーション反応の動力学に対するより大きな制御が達成され、ここでは、この熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子が高い割合でアデニル化され、連結すべき５’リン酸化ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じ又はこれを上回る濃度でアデニル化熱安定性ＲＮＡリガーゼがライゲーション反応混合物に存在する。
【０１１２】
更に、本発明の改善されたライゲーション反応混合物及び改善されたライゲーション反応条件により、他のライゲーション反応パラメータをより容易に最適化して多くのＤＮＡサンプルの環状ＤＮＡの速度と収率を改善できる。例えば、上記のように、マグネシウムを除去して反応中の二価陽イオンとしてマンガンのみを含めることにより分子内連結の収率を改善することを出願人は見出した。別の例として、ベタインを反応物に添加すると環状ＤＮＡの収率が改善した。ベタインは、高温で酵素の安定性を改善するだけでなく、核酸中のＧ−Ｃ塩基対を不安定にすることが知られている。長い期間のインキュベーション中に高い酵素活性を維持することによるだけでなく、ＤＮＡを分子内ライゲーション用によりアクセスできるようにすることにより、これらの効果の両方ともがより収率を上げた。
【実施例】
【０１１３】
本発明は、以下の実施例と特許請求の範囲において更に定義される。本発明の好ましい実施例が示されているが、当然のことながらこれらの実施例は例として挙げているにすぎない。上記の説明とこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな用法と状況に適応させるために本発をさまざまに変更及び改良してもよい。
【実施例１】
【０１１４】
［バクテリオファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼ遺伝子の新しいクローンから精製したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析］
アデニル化したＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）は、アデニル化されていないＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）よりバンドが少し高いため、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動する。図１は、新しいクローンから得たＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色したものを示す。アデニル化の割合は、アデニル化されたバンドとアデニル化されないバンドの相対明度を比較して判断するが、ここに示した新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、約７０％アデニル化された形と約３０％アデニル化されない形を比較して判断する。
【実施例２】
【０１１５】
［高度にアデニル化された新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素と低度にアデニル化された古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素の分子内ライゲーション活性の比較］
標準ライゲーション反応条件下で分析すると、低度にアデニル化された古いクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを供給された線状ｓｓＤＮＡである５５ヌクレオチドコントロールオリゴヌクレオチドを、約９５％を超える環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図２）。これに対して、高度にアデニル化された新しいクローン由来のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素は、同じ線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの約５０％しか環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換しなかった。
【実施例３】
【０１１６】
［新しいクローンから精製した高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼによる線状ｓｓＤＮＡの分子内ライゲーションにおけるＡＴＰ濃度の影響］
標準ライゲーション反応混合物中に５０μＭのＡＴＰが存在すると、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ ｓｓＤＮＡリガーゼを供給された５５ヌクレオチドｓｓＤＮＡコントロールオリゴヌクレオチドの約５０％を、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した。標準ライゲーション反応混合物にＡＴＰを含めないと、５５ヌクレオチドｓｓＤＮＡコントロールオリゴヌクレオチドの約９５％以上が、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換された（図３）。環状ｓｓＤＮＡ生成物は、遊離３’末端を必要とする１本鎖特異的エキソヌクレアーゼであるエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ；ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）２０ユニットによっては分解されにくかった。環状ｓｓＤＮＡライゲーション生成物は、ＥｘｏＩ分解に耐性があるが、連結されていない線状ｓｓＤＮＡ基質はＥｘｏＩによってを分解されなかった。
【実施例４】
【０１１７】
［さまざまなヌクレオチド配列とさまざまなサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ分子を用いた高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼと低度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼの分子内ライゲーション活性の比較］
アデニル化形の酵素をほんの数パーセント具えるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）は、さまざまなヌクレオチド配列とサイズを示すさまざまな線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基質の分子内ライゲーションに可変効率を示す。しかし、アデニル化形の酵素を高い割合で具えるＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＡＴＰが標準ライゲーション反応混合物に含まれていない場合に、さまざまなヌクレオチド配列又はサイズを示すさまざまな線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基質の分子内ライゲーションはずっと高い効率を示した（図４の表）。標準ライゲーション反応混合物からＡＴＰを除去すると検査された線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのほとんどの分子内ライゲーションが上昇したが、４Ｎ４５４ＢやｐＹＲＴＰ．５などのいくつかの線状ｓｓＤＮＡ基質は、これらの条件下ではまだ少ししか連結しなかった。これらの基質を用いて、更にライゲーション反応条件を最適化した。
【実施例５】
【０１１８】
［高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーション反応条件の更なる最適化と改善されたライゲーション反応混合物の開発］
分子内ライゲーションにおいてマグネシウム及びマンガン二価陽イオンの効果を、実施例４で少ししか連結しなかった線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドｐＹＲＴＰ．５基質と高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ（新しいクローンから精製されたもの）を用いて評価した。ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いてｐＨ７．６で３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、及び０、１、２．５、５、又は１０ｍＭのＭｎＣｌ２又はＭｇ（ＯＡｃ）２を含む新しいライゲーション反応混合物中で分子内ライゲーション実験を行った。図５に示すように、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の分子間ライゲーションの最適ライゲーション反応混合物は、マグネシウム陽イオンを有さない２．５ｍＭのＭｎＣｌ２である。これらのライゲーション条件下で、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の約３０％が分子内連結した。更に、標準ライゲーション反応混合物が最適ライゲーション反応条件であるという当該技術分野における従来の所見とは違い、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２にマグネシウム陽イオンを有するライゲーション反応混合物加えてもライゲーションは改善しなかった。２．５ｍＭのＭｎＣｌ２と５ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）２を含んだ同じバッファ内で分子内ライゲーション反応を行ったところ、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の１０％未満が環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換された（データは示さず）。
【０１１９】
分子内ライゲーション反応を、線状ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドｐＹＲＴＰ．５基質、高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼ、及び２．５ｍＭのＭｎＣｌ２を含んだ同じライゲーション反応混合物中で行ったところ、ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションにおける更なる改善は、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡあるいはＤＭＳＯ（５−２０％ ｖ／ｖ）のどちらを添加しても観察できなかった（データ示さず）。本発明は、トリスを含有する改善されたライゲーション反応混合物に限定するものではない。例えば、改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの異なる実施例では、ＭＯＰＳ ｐＨ７．５バッファ又は別のバッファを含んでいる。
【実施例６】
【０１２０】
［改善されたライゲーション反応混合物の更なる開発：連結が困難な基質の分子内ライゲーションのベタインの効果］
実施例５の改善されたライゲーション反応混合物であるｐＨ７．６で３３ｍＭのトリス酢酸、６６ｍＭのＫＯＡｃ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２．５ｍＭのＭｎＣｌ２、に１Ｍのベタインを追加し、この反応混合物を６０℃で１６時間インキュベートし、分子内ライゲーションにおける両性イオントリメチルグリシン（ベタイン）の効果をｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質と高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて評価した。これらの改善されたライゲーション反応条件下では、線状ｐＹＲＴＰ．５ｓｓＤＮＡ基質の１００％近くをエキソヌクレオチド耐性、環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図５）。経時的分析で決定したところ、連結が容易な線状ｓｓＤＮＡ基質（例えば、線状ｐＹＧＴ．５ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド）の分子内ライゲーションの割合では、ベタインは、検出可能な効果を有しなかった（データは開示せず）。従って、ベタインは、連結が容易な線状ｓｓＤＮＡ基質に阻害的効果を与えることなく、連結が困難なｓｓＤＮＡ基質の分子内ライゲーションを増進するように見える。それ故、濃度０．２５乃至２．２Ｍのベタインは、改善されたライゲーション反応混合物及び改善されたライゲーション反応混合物のいくつかの実施例に記載され、約６０℃でより長い反応時間が用いられる。
【実施例７】
【０１２１】
［ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥｓｓＤＮＡリガーゼの基質のサイズの優先の評価］
多くの関連アプリケーションは、ｓｓＤＮＡ基質の多様な個体群の環状化が必要である。さまざまなヌクレオチド配列及びサイズを有する線状ｓｓＤＮＡ基質の個体群の公平な分子間ライゲーションの可能性を評価するために、制限エンドヌクレアーゼで切断された及び変性されたゲノムＤＮＡを、高度にアデニル化された形式のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼを用いて分子内ライゲーションの基質として検査した。仔ウシ胸腺のＤＮＡを、Ａｌｕ Ｉで完全に分解し、加熱して変性させ氷上で急速に冷却した。結果として生じる線状ｓｓＤＮＡ分子は、変性ＰＡＧＥゲル上で、再現可能で特異的なバンドパターンとサイズの分布を示した。
【０１２２】
実施例６の改善されたライゲーション反応条件下で、Ａｌｕ Ｉで分解され変性した仔ウシ胸腺ｓｓＤＮＡ断片を高度にアデニル化された形のＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）酵素と共にインキュベートしたところ、総ｓｓＤＮＡ基質２００ｎｇの約１０％がエキソヌクレアーゼ耐性の環状ｓｓＤＮＡ生成物に変換した（図７）。線状ｓｓＤＮＡ分子で観察される相対的なサイズ分布と特異的なバンドのパターンを、分子内ライゲーションの後に環状ｓｓＤＮＡ分子の形で保存したが、これは、証明するものではないが、ｓｓＤＮＡ断片のサイズ又は全ての配列組成物に基づいて、約６０００ヌクレオチドまでのサイズでは、総基質に偏りがないことを示す。ＲｓａＩで切断し、ゲノムＤＮＡで変性させたものも同様の結果を得た（データは示さず）。
【実施例８】
【０１２３】
［古細菌熱安定性ＲＮＡリガーゼを用いた線状ｓｓＤＮＡ分子の改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション反応条件の適用］
出願人は、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ熱安定性ＲＮＡリガーゼ１（ＭｔｈＲｎｌ）をクローン化し、発現させ、及び精製した（Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｃら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ３６：６２１８−６２２７，２００８）。実施例６に記載される改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション反応条件、含まれているＭｔｈＲｎｌ酵素が約５０％乃至６０％アデニル化されているが、分子内ライゲーション効果が改善され、線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子への合成が生じた。ＭｔｈＲｎｌ酵素を用いたライゲーション効率と収率は、同様のアデニル化レベルのＣＩＲＣＩＬＧＡＳＥ（ＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ）を用いたものほど高くない。改善されたライゲーション反応混合物は、さまざまな高度にアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼの混合物を含む（例えば、バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼとＭｔｈＲｎｌを含む）。
【実施例９】
【０１２４】
［次世代の配列決定の鋳型を作成するプロセスの一部として標識された環状ｓｓＤＮＡ断片を生成する方法の使用］
いくつかの実施例では、５’標識ｓｓＤＮＡ断片を具える線状ｓｓＤＮＡ分子を、サンプル中のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又は全てのＲＮＡ）又はＤＮＡを鋳型として用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して生成し、このとき、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーは５’末端部分と３’末端部分を具え、この５’末端部分は鋳型と相補的ではない配列を提示する標識からなり、この３’末端部分は鋳型と相補的な配列を提示する。いくつかの実施例では、本発明の改善されたライゲーション反応混合物と改善されたライゲーション方法を用いて、これらの５’標識ｓｓＤＮＡ断片を分子内ライゲーションした。これらのいくつかの実施例では、第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーにある標識は、Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンサーなど特定の次世代シーケンサーを用いて次世代配列決定するための配列決定標識領域を具える。例えば、いくつかの実施例では、本発明の方法のステップ（ｂ）を最初に線状ｓｓＤＮＡ分子を熱変性させ、次に以下の反応を行うことにより鋳型非依存型リガーゼを用いて、それらを環状化させることにより行った。
ｘ 最終容量が２０マイクロリッットルの水溶液
１マイクロリットル ｐＨ７．８の３３０ｍＭのトリス酢酸、６６０ｍＭのＫＯＡｃ
１マイクロリットル ５０ｍＭのＭｎＣｌ２
４マイクロリットル ５Ｍのベタイン
１０マイクロリットル ２０μｇ／ｍｌの変性５’標識断片ＤＮＡ
４マイクロリットル １００Ｕ／μｌのＴＳ２１２６リガーゼ（ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ＩＩ，ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）
２０マイクロリットル 最終反応物容量
反応物を６０℃で２時間インキュベートする。次いで、環状化されなかった線状ＤＮＡを取り除くために、反応生成物を１８ユニットのＥｘｏＩと２０ユニットのＥｘｏＩＩＩで３７℃で１時間処理した。環状化生成物は、分解されなかった。
【実施例１０】
【０１２５】
［実施例９の標識された環状ｓｓＤＮＡのＰＣＲ分析］
特異的な次世代シーケンサー用の配列を提示する配列決定標識領域を具える標識に、アニールするＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ分析を行う。連結されて、標識された環状ｓｓＤＮＡ分子のみが増幅されて、環状ｓｓＤＮＡのサイズに対応して線状ｄｓＤＮＡ生成物を生成されるので、これらのＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ生成物が環状化を示す。
ＰＣＲ反応を以下のように行う。
２１マイクロリットルの水
１マイクロリットル エキソヌクレアーゼ処理したＣｉｒｃリガーゼＩＩ反応（１：１０００希釈）
１マイクロリットル ５μＭのＰＣＲプライマー１（例えば、Ｒｏｃｈｅ ＦＬＸ４５４ 受容体Ａ）
１マイクロリットル ５μＭのＰＣＲプライマー２（例えば、Ｒｏｃｈｅ ＦＬＸ４５４ 受容体Ｂ）
１マイクロリットル ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ
２５マイクロリットル ＦａｉｌＳａｆｅ（商標）２Ｘ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘ Ｃ
５０マイクロリットル 最終反応容量
ＰＣＲは、以下の条件下で、２９回サイクル行われる。
９４℃ １０秒
５０℃ １０秒
７２℃ １分
【０１２６】
ゲル分析は、生成したＰＣＲ生成物のサイズ範囲と５’標識の断片化されたｓｓＤＮＡが同程度であることを示している。
【０１２７】
コントロールの反応も行なわれた。ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）ＩＩｓｓＤＮＡリガーセをライゲーション反応から除去すると、ＰＣＲ生成物は５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片から生成されない。ＰＣＲプライマーもＰＣＲ反応から除去すると、生成物は生成されない。
【０１２８】
ＰＣＲ生成物が、５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片と同じサイズの分布を有する事実は、（１）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片は、鋳型非依存性ライゲーションの基質となる変性標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成するために熱変性され、及び（２）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片は、検出可能な偏り（エキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した後のＰＣＲ増幅により確認されたような）なく、ＰＣＲ増幅、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片に効率的に変換されることを示す。
【実施例１１】
【０１２９】
［Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）を用いて生成された標識された線状ｓｓＤＮＡ断片の標識された環状ｓｓＤＮＡのＰＣＲ分析］
いくつかの実施例では、本発明の改善されたライゲーション方法において使用された標識された線状ｓｓＤＮＡ分子は、Ｎｅｘｔｅｒａ（商標）サンプルプレップキット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて生成された５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を具えており、これらの実施例では、５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を具える標識された線状ｓｓＤＮＡ分子がゲノムｄｓＤＮＡ、ミトコンドリアｄｓＤＮＡ、又はＲＮＡから調整された２本鎖ｃＤＮＡなどのｄｓＤＮＡからＮｅｘｔｅｒａを用いて生成される。これらの実施例では、Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いて生成した標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、トランスポゾン末端標識領域及び配列決定標識領域を具える標識を有する。５’標識されたｓｓＤＮＡ断片を得るためにＮｅｘｔｅｒａを用いて生成した標識されたｄｓＤＮＡ断片を変性した後に、実施例９で用いたプロトコルと同様のプロトコルを用いて、これらの標識された線状ｓｓＤＮＡ分子が環状化される。次いで、ＰＣＲプライマー１がトランスポゾン末端配列に（例えば、非転写トランスポゾン末端配列に）相補的であること及びＰＣＲプライマー２がＲｏｃｈｅ４５４シーケンサー受容体に（例えば、ＲｏｃｈｅＦＬＸ４５４Ｂに）相補的であることを除いて実施例１０で用いたプロトコルと同様のプロトコルを用いて環状生成物が分析される。ＰＣＲ後のＰＣＲ生成物が５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片と同じサイズ分布を有するという事実は、（１）トランスポゾン末端組成物は、標的ゲノムＤＮＡを効率的に５’標識又は断片化し、（２）アニールされた相補的な５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が熱変性して鋳型非依存性ライゲーションの基質である変性標識された線状ｓｓＤＮＡ断片を生成し、（３）５’標識された線状ｓｓＤＮＡ断片が、検出可能な偏り（エキソヌクレアーゼＩとエキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した後のＰＣＲ増幅により確認されたような）なく、標識された環状ｓｓＤＮＡ断片に変換されることを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション用ライゲーション反応混合物であって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、当該熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のこのアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じか又はこれを上回る組成物；
（ｃ）最終ｐＨを約ｐＨ６．５乃至約８．０に維持するバッファ；及び
（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度のマンガン塩であって、前記ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、約０．５乃至約１０ｍＭであるマンガン塩；を具え、
ＡＴＰが、前記反応バッファ中に存在しないか、又は非アデニル化形の前記熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度で存在することを特徴とするライゲーション反応混合物。
【請求項２】
約０．２５乃至２モルの最終濃度でベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を更に具えることを特徴とする請求項１に記載のライゲーション反応混合物。
【請求項３】
５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する鋳型非依存性分子内ライゲーション方法であって：
（１）請求項１に記載のライゲーション反応混合物を調整するステップ；と
（２）前記ライゲーション反応混合物中で、約４０℃乃至約７０℃の反応温度で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間、前記線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップ；を具えることを特徴とする方法。
【請求項４】
前記鋳型非依存性熱安定性ＲＮＡリガーゼが、サーマスバクテリオファージＲＮＡリガーゼ；バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ；古細菌ＲＮＡリガーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１；からなる群から選択されるＲＮＡリガーゼであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法が更に
（１）前記ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する前記線状ｓｓＤＮＡ分子と；
（ｂ）ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの組成物であって、前記熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の６０％以上がアデニル化され、前記ライゲーション混合物中の該アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子のモル濃度が、前記線状ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じであるか又はこれを上回る組成物と；
（ｃ）前記バッファ剤と；
（ｄ）約０．５乃至１０ｍＭの最終濃度で前記Ｍｎ２＋陽イオンを提供する前記マンガン塩と；を具える混合物を調整するステップ：と
（２）約５５℃乃至約６５℃の温度で、前記線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間前記ライゲーション反応混合物をインキュベートするステップ：とを具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記ライゲーション反応混合物が更に、０．２５乃至２モルの最終濃度でベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３乃至６のいずれかに記載の方法であって、前記線状ｓｓＤＮＡ分子が、前記５’又は３’末端のヌクレオチド配列が未知である及び／又は、前記線状ｓｓＤＮＡ分子のサイズがさまざまである、線状ｓｓＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこれらからなる前記ヌクレオチド配列でることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３乃至７のいずれかに記載の方法であって、分子内ライゲーション方法で用いる５’リン酸基と３’水酸基を有する前記線状ｓｓＤＮＡ分子が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生体サンプル中の１又はそれ以上の標的核酸分子によって提示される、相補的配列にアニールする１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸張により生成される、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の集団を具える又はこれらからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸張により生成される前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が、前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく、前記標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを用いて前記標的核酸分子を除去することによって、又は親和性標識を前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込み、表面に付着した親和性結合物質であって、前記親和性標識が特異的結合対を形成する親和性結合物質を用いてそれらをひっぱることによって、前記標的核酸分子からの前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を選択的に精製することによって、更に精製されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーのそれぞれが、前記標的核酸分子中で配列に実質的に相補的でない配列を提示する標識を具えるか又はこの標識からなる５’末端部分と；生体サンプルから得た少なくとも１の標的核酸分子が提示する配列に相補的な配列を提示する３’末端部分とを具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの前記５’末端部分における前記標識が、センスプロモータ配列を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識；切断部位標識領域；配列特異的配列決定標識領域；回収標識領域；増幅標識領域；検出標識領域；及びアドレス標識意領域からなる群から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はこの標識領域からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、１又はそれ以上のさまざまな標識領域を具える標識を具えるか又はこの標識からなり、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、それぞれ前記第１鎖ｃＤＮＡの標識領域間又は前記第１鎖ｃＤＮＡの５’末端部分と３’末端部分間に切断部位を含み、前記方法が、前記切断部位において前記環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して、前記第１鎖ｃＤＮＡの５’末端に前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を及び前記第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分の配列を提示する線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（３）を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、センスプロモータ配列と前記センスプロモータ配列の３’である切断部位を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域を具えるか又はこの領域からなり、前記方法が更に、（ｉ）ステップ（３）から得た前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子のそれぞれの３’末端においてアンチセンスプロモータ配列を前記センスプロモータ配列に提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドアニールして転写基質を生成するサブステップと、次いで（ｉｉ）前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて前期転写基質を転写するサブステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、サブステップ（ｉｉ）の前に、前記方法が更に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプロモータ配列を提示する前記オリゴデオキシリボヌクレオチドを伸張して２本鎖ｃＤＮＡを生成するサブステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの前記の５’末端部分が、２つのシーケンサー特異的配列決定標識領域を具えるか又はこの領域からなる標識を具えるか又はこの標識からなり、ステップ（３）が、前記５’末端と３’末端（２重に標識された配列決定鋳型）のそれぞれに１の配列決定標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型を生成することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記５’末端と３’末端のそれぞれに１の配列決定標識領域を有する前記線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型が、次世代シーケンサーで前記配列決定標識領域に特異的な配列決定の鋳型として用いられることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項３乃至１１のいずれかに記載の方法であって、ローリングサークル複製、ローリングサークル転写、及びＰＣＲから選択される方法により、前記環状ｓｓＤＮＡ分子を精製するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項３乃至１１のいずれかに記載の方法であって、超並列シーケンシングの鋳型として前記環状ｓｓＤＮＡ分子を使用するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１】
線状ｓｓＤＮＡ分子の鋳型非依存性分子内ライゲーション用ライゲーション反応混合物であって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子；
（ｂ）熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の組成物であって、当該熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の大部分がアデニル化され、ライゲーション反応混合物中のこのアデニル化された熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の濃度が、ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じか又はこれを上回る組成物；
（ｃ）最終ｐＨを約ｐＨ６．５乃至約８．０に維持するバッファ；及び
（ｄ）熱安定性ＲＮＡリガーゼに最適な濃度のマンガン塩であって、前記ライゲーション反応混合物中のＭｎ２＋陽イオンの最終濃度が、約０．５乃至約１０ｍＭであるマンガン塩；を具え、
ＡＴＰが、前記反応バッファ中に存在しないか、又は非アデニル化形の前記熱安定性ＲＮＡリガーゼの濃度より低いモル濃度で存在することを特徴とするライゲーション反応混合物。
【請求項２】
約０．２５乃至２モルの最終濃度でベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を更に具えることを特徴とする請求項１に記載のライゲーション反応混合物。
【請求項３】
５’リン酸基と３’水酸基を有する線状ｓｓＤＮＡ分子の環状ｓｓＤＮＡ分子を合成する鋳型非依存性分子内ライゲーション方法であって：
（１）請求項１に記載のライゲーション反応混合物を調整するステップ；と
（２）前記ライゲーション反応混合物中で、約４０℃乃至約７０℃の反応温度で環状ｓｓＤＮＡ分子を合成するのに十分な時間、前記線状ｓｓＤＮＡ分子をインキュベートするステップ；を具えることを特徴とする方法。
【請求項４】
前記鋳型非依存性熱安定性ＲＮＡリガーゼが、サーマスバクテリオファージＲＮＡリガーゼ；バクテリオファージＴＳ２１２６ＲＮＡリガーゼ；古細菌ＲＮＡリガーゼ；Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ ＲＮＡリガーゼ１；からなる群から選択されるＲＮＡリガーゼであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法が更に
（１）前記ライゲーション反応混合物を調整するステップであって：
（ａ）５’リン酸基と３’水酸基を有する前記線状ｓｓＤＮＡ分子と；
（ｂ）ファージＴＳ２１２６熱安定性ＲＮＡリガーゼの組成物であって、前記熱安定性ＲＮＡリガーゼ分子の６０％以上がアデニル化され、前記ライゲーション混合物中の該アデニル化されたＲＮＡリガーゼ分子のモル濃度が、前記線状ｓｓＤＮＡ分子のモル濃度と同じであるか又はこれを上回る組成物と；
（ｃ）前記バッファ剤と；
（ｄ）約０．５乃至１０ｍＭの最終濃度で前記Ｍｎ２＋陽イオンを提供する前記マンガン塩と；を具える混合物を調整するステップ：と
（２）約５５℃乃至約６５℃の温度で、前記線状ｓｓＤＮＡ分子から環状ｓｓＤＮＡ分子を生成するのに十分な時間前記ライゲーション反応混合物をインキュベートするステップ：とを具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記ライゲーション反応混合物が更に、０．２５乃至２モルの最終濃度でベタイン（両性イオントリメチルグリシン）を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項３乃至６のいずれかに記載の方法であって、前記線状ｓｓＤＮＡ分子が、前記５’又は３’末端のヌクレオチド配列が未知である及び／又は、前記線状ｓｓＤＮＡ分子のサイズがさまざまである、線状ｓｓＤＮＡ分子の集団を具えるか又はこれらからなる前記ヌクレオチド配列でることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項３乃至７のいずれかに記載の方法であって、分子内ライゲーション方法で用いる５’リン酸基と３’水酸基を有する前記線状ｓｓＤＮＡ分子が、ＤＮＡポリメラーゼを用いて生体サンプル中の１又はそれ以上の標的核酸分子によって提示される、相補的配列にアニールする１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸張により生成される、線状第１鎖ｃＤＮＡ分子の集団を具える又はこれらからなることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの伸張により生成される前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子が、前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子ではなく、前記標的核酸分子を特異的に分解するヌクレアーゼを用いて前記標的核酸分子を除去することによって、又は親和性標識を前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子に組み込み、表面に付着した親和性結合物質であって、前記親和性標識が特異的結合対を形成する親和性結合物質を用いてそれらをひっぱることによって、前記標的核酸分子からの前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を選択的に精製することによって、更に精製されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーのそれぞれが、前記標的核酸分子中で配列に実質的に相補的でない配列を提示する標識を具えるか又はこの標識からなる５’末端部分と；生体サンプルから得た少なくとも１の標的核酸分子が提示する配列に相補的な配列を提示する３’末端部分とを具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの前記５’末端部分における前記標識が、センスプロモータ配列を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識；切断部位標識領域；配列特異的配列決定標識領域；回収標識領域；増幅標識領域；検出標識領域；及びアドレス標識意領域からなる群から選択される１又はそれ以上の標識領域を具えるか又はこの標識領域からなることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、１又はそれ以上のさまざまな標識領域を具える標識を具えるか又はこの標識からなり、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーが、それぞれ前記第１鎖ｃＤＮＡの標識領域間又は前記第１鎖ｃＤＮＡの５’末端部分と３’末端部分間に切断部位を含み、前記方法が、前記切断部位において前記環状第１鎖ｃＤＮＡ分子を線状化して、前記第１鎖ｃＤＮＡの５’末端に前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの３’末端部分の配列を及び前記第１鎖ｃＤＮＡの３’末端に前記第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分の配列を提示する線状第１鎖ｃＤＮＡ分子を得るステップ（３）を更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの５’末端部分が、センスプロモータ配列と前記センスプロモータ配列の３’である切断部位を提示するＲＮＡポリメラーゼプロモータ標識領域を具えるか又はこの領域からなり、前記方法が更に、（ｉ）ステップ（３）から得た前記線状第１鎖ｃＤＮＡ分子のそれぞれの３’末端においてアンチセンスプロモータ配列を前記センスプロモータ配列に提示するオリゴデオキシリボヌクレオチドアニールして転写基質を生成するサブステップと、次いで（ｉｉ）前記２本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモータに結合し、そこから転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを用いて前期転写基質を転写するサブステップとを具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、サブステップ（ｉｉ）の前に、前記方法が更に、ＤＮＡポリメラーゼを用いてアンチセンスプロモータ配列を提示する前記オリゴデオキシリボヌクレオチドを伸張して２本鎖ｃＤＮＡを生成するサブステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記１又はそれ以上の第１鎖ｃＤＮＡ合成プライマーの前記の５’末端部分が、２つのシーケンサー特異的配列決定標識領域を具えるか又はこの領域からなる標識を具えるか又はこの標識からなり、ステップ（３）が、前記５’末端と３’末端（２重に標識された配列決定鋳型）のそれぞれに１の配列決定標識領域を有する線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型を生成することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記５’末端と３’末端のそれぞれに１の配列決定標識領域を有する前記線状ｓｓＤＮＡ配列決定鋳型が、次世代シーケンサーで前記配列決定標識領域に特異的な配列決定の鋳型として用いられることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項３乃至１１のいずれかに記載の方法であって、ローリングサークル複製、ローリングサークル転写、及びＰＣＲから選択される方法により、前記環状ｓｓＤＮＡ分子を精製するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項３乃至１１のいずれかに記載の方法であって、超並列シーケンシングの鋳型として前記環状ｓｓＤＮＡ分子を使用するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１７８１３（Ｐ２０１２−５１７８１３Ａ）
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５０３１４（Ｐ２０１１−５５０３１４）
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４３１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４０４０
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５１１１０３６１６）エピセンター テクノロジーズ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月９日（２０１２．８．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１６日（２０１０．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２４３１９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９４０４０
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５１１１０３６１６）エピセンター テクノロジーズ コーポレイション (2)
【氏名又は名称原語表記】ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【Ｆターム（参考）】
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