２価二重特異性抗体
本発明は、新規なドメイン交換された、２価二重特異性抗体、それらの製造および使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な２価二重特異性抗体、それらの生産および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作されたタンパク質、例えば、２またはそれ以上の抗原に結合できる二重特異性または多重特異性抗体はこの分野において知られている。このような多重特異性結合性タンパク質は、細胞融合、化学的接合または組換えＤＮＡ技術を使用して発生させることができる。
【０００３】
広範な種類の組換え二重特異性抗体フォーマットは最近開発されてきている、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットおよび一本鎖ドメインの融合により、例えば、４価二重特異性抗体が開発された（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）１５９−１６３；ＷＯ２００１０７７３４２；およびＣｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２３３−１２３４）。
【０００４】
また、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの新しいフォーマット、例えば、２またはそれ以上の抗原に結合できる、ジ抗体、トリ抗体またはテトラ抗体、ミニ抗体、いくつかの一本鎖フォーマット （ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ）が開発された（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．他 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１２６−１１３６；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．およびＬｅｇｅｒ Ｏ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４；Ｓｈｅｎ Ｊ．他 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５−７４；Ｗｕ Ｃ．他 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０−１２９７）。
【０００５】
すべてのこのようなフォーマットはリンカーを使用して抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）をそれ以上の結合性タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合するか、あるいは、例えば、２つのＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖを融合する（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．およびＬｅｇｅｒ Ｏ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４）。リンカーは二重特異性抗体の操作のために利点を有することは明らかであるが、それらは治療的設定において問題を引き起こすこともある。事実、これらの外来ペプチドはリンカーそれ自体に対してまたはタンパク質とリンカーとの間の接合部に対して免疫応答を誘発することがある。
【０００６】
さらにいっそう、これらのペプチドの柔軟な特質はそれらのタンパク質分解的切断の傾向を高め、潜在的に抗体安定性の低下に導き、抗体を凝集させ、そして免疫原性を増加させる。さらに、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を保持することを必要とすることがあり、これらは天然に存在する抗体に対する高度の類似性を維持することによってＦｃ部分を通して伝達される。こうして、理想的には、一般構造が天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）に非常に類似し、ヒト配列からの逸脱が小さい、二重特異性抗体の開発を目的とすべきである。
【０００７】
１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体の所望の特異性をもつネズミモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ細胞系統の体融合に基づくクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）技術（参照、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．およびＡ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７−４０）を使用して、天然の抗体に非常に類似する二重特異性抗体が生産された。生ずるハイブリッド−ハイブリドーマ（またはクアドローマ）細胞系統内の２つの異なる抗体の重鎖および軽鎖の不規則な対合のために、１０までの異なる抗体種が発生し、それらの１つのみが所望の機能的二重特異性抗体である。対合違い副産物の存在および有意に減少した生産収量のために、複雑な精製手順を必要とする（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２３３−１２３４）。一般に、組換え発現技術を使用する場合、対合違い副産物という同一の問題が残る。
【０００８】
「ノブ−インツ−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」として知られている、対合違い副産物の問題を回避するアプローチは、ＣＨ３ドメイン中に突然変異を導入して接触インターフェイスを変更することによって、２つの異なる抗体重鎖の対合を強制することを目指す。１つの鎖上で嵩高アミノ酸が短い側鎖をもつアミノ酸と置換して、「ホール」をつくる。逆に、大きい側鎖をもつアミノ酸を他のＣＨ３ドメイン中に導入して、「ノブ」をつくる。これらの２つの重鎖（および２つの同一軽鎖、これらは両方の重鎖のために適当でなくてはならない）を共発現させることによって、ホモダイマー（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）の形成に比較してヘテロダイマー（ノブ−ホール） の形成の高い収量が観測された（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ファージ展示アプローチを使用して２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改造し、そしてジサルファイド架橋を導入してヘテロダイマーを安定化することによって、ヘテロダイマーの百分率をさらに増加することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１；Ａｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，ＣａｔｅｒＰ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）。ノブ−インツ−ホール技術についての新しいアプローチは、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている。このフォーマットは非常に魅力的であるが、臨床に向かう進歩を記載するデータは現在入手不可能である。この戦略の１つの重要な拘束は、２つの親抗体の軽鎖が同一であって対合違いおよび不活性分子の形成を防止しなくてはならないことである。こうして、第１および第２の抗原に対する２つの抗体から出発して２つの抗原に対して組換え２価二重特異性抗体を容易に発生させるたには、これらの抗体の重鎖および／または同一の軽鎖を最適化しなくてはならないので、この技術は不適当である。
【０００９】
Ｘｉｅ，Ｚ．他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８６（２００５）９５−１０１は、Ｆｃ部分に対するノブ−インツ−ホール技術を併用して、ｓｃＦｖを用いた二重特異性抗体の新規なフォーマットを言及している。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、下記を含んでなる、２価二重特異性抗体に関する：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１１】
本発明のそれ以上の態様は、下記の工程を含んでなる本発明による２価二重特異性抗体を生産する方法である：
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する。
【００１２】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１３】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物である。
【００１４】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００１５】
本発明のそれ以上の態様は、患者に治療的有効量の本発明による抗体を投与することを特徴とする、治療を必要する患者を治療する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はＩｇＧ、典型的な順序で可変性ドメインとコンスタントドメインとを含んでなる重鎖および軽鎖の２対をもつ１つの抗原に対して特異的な天然に存在する全抗体の略図。
【００１７】
【図２】図２はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１８】
【図３】図３はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして両方の重鎖のＣＨ３ドメインはノブ−インツ−ホール技術により変更されている。
【００１９】
【図４】図４はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして両方の重鎖のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３の一方はコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されている。
【００２０】
【図５】図５は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***のタンパク質配列のスキーム。
【００２１】
【図６】図６は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***のタンパク質配列のスキーム（カッパコンスタント軽鎖ドメインＣＬ）。
【００２２】
【図７】図７は重鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図。
【００２３】
【図８】図８は軽鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図。
【００２４】
【図９】図９は４７００−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰ発現ベクターのプラスミド地図。
【００２５】
【図１０】図１０は機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を検出するＩ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞のＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイのアッセイ原理。
【００２６】
【図１１】図１１はスキームＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合Ｂｉａｃｏｒｅ。
【００２７】
【図１２】図１２はＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の一時的トランスフェクション後の細胞培養物上清から単離されたＨＣ*およびＬＣを有する、精製された単一特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体（ＩｇＧ１*）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー。
【００２８】
【図１３】図１３はＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイにおけるＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに対する単一特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の結合。
【００２９】
【図１４】図１４は一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞からの細胞培養物上清から精製された＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体ミックスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【００３０】
【図１５】図１５は精製された抗体ミックス中の機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を検出するＩ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞のＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイの試料Ａ〜Ｆについての結果。精製されたタンパク質試料Ａ〜Ｆ：Ａ＝Ｉ２４未処理Ｂ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋ｈＩｇＧアイソタイプＤ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と、二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を含む＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の同時発現からのミックス。Ｅ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体Ｆ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＩＧＦ−１Ｒ＞野生型抗体
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、下記を含んでなる、２価二重特異性抗体に関する：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００３２】
したがって、二重特異性抗体は、下記を含んでなる：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の第１軽鎖および第１重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の第２軽鎖および第２重鎖
ここで、第２軽鎖および第２重鎖の可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００３３】
こうして、第２抗原に特異的に結合する前記抗体について、下記が適用される：
軽鎖内において、
可変性軽鎖ドメインＶＬは前記抗体の可変性重鎖ドメインＶＨにより置換されている； そして、重鎖内において、
可変性重鎖ドメインＶＨは前記抗体の可変性軽鎖ドメインＶＬにより置換されている。
【００３４】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は全モノクローナル抗体を意味する。このような全抗体は「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２対から成る（このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖（ＨＣ）の対は本明細書中でＬＣ／ＨＣと略されている）。このような抗体の軽鎖および重鎖はいくつかのドメインから成るポリペプチドである。全抗体において、各重鎖は重鎖可変性領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と、重鎖コンスタント領域とを含んでなる。重鎖コンスタント領域は重鎖コンスタントドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）と、必要に応じて重鎖コンスタントドメインＣＨ４（抗体クラスＩｇＥおよびＩｇＭ）とを含んでなる。各軽鎖は軽鎖可変性ドメインＶＬと、軽鎖コンスタントドメインＣＬとを含んでなる。１つの天然に存在する全抗体、ＩｇＧ抗体の構造は、例えば、第１図に示されている。可変性ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名する、超可変性領域にさらに再分割することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名する、いっそう保存された領域が介在する。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと、４つのＦＲとから構成され、それらは下記の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ．Ｊｒ．他、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＷｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）８９−９９）。２対の重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）は同一抗原に特異的に結合することができる。こうして、前記全抗体は２価単一特異性抗体である。このような「抗体」は、それらの特徴的特性が保持されるかぎり、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および遺伝子操作された抗体（変異型または突然変異抗体）を包含する。ヒトまたはヒト化抗体は、特に組換えヒトまたはヒト化抗体として、特に好ましい。
【００３５】
ギリシャ文字、α、δ、ε、γおよびμで表示される５つの型の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．Ｊｒ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１））。存在する重鎖の型は抗体のクラスを定義する；これらの鎖はそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体中に見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ ＲＧ（２００２）、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ 第４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。明確な重鎖は大きさと組成が異なる；αおよびγはほぼ４５０アミノ酸を含有するが、μおよびεはほぼ５５０アミノ酸を含有する。各重鎖は２つの領域、コンスタント領域および可変性領域を有する。コンスタント領域は同一アイソタイプのすべての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体において異なる。重鎖γ、αおよびδは３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（直線）から構成されたコンスタント領域、および付加された柔軟性のためのヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９−９９）；重鎖μおよびεは４つのコンスタントドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成されたコンスタント領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．Ｊｒ．他、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変性領域は異なるＢ細胞により産生された抗体において異なるが、単一のＢ細胞にまたはＢ細胞クローンにより産生されたすべての抗体について同一である。各重鎖の可変性領域はほぼ１１０アミノ酸長さであり、そして単一の抗体ドメインから構成されている。
【００３６】
哺乳動物において、わずかに２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）とよぶ軽鎖が存在する。軽鎖は２つの連続的ドメインを有する：１つのコンスタントドメインＣＬおよび１つの可変性ドメインＶＬ。軽鎖の概算長さは２１１〜２１７アミノ酸である。好ましくは軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、そしてコンスタントドメインＣＬは好ましくはカッパ（κ）軽鎖（コンスタントドメインＣκ）である。
【００３７】
本明細書において使用するとき、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００３８】
本発明による「抗体」は任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、好ましくはＩｇＧ１）であることができ、ここで本発明による２価二重特異性抗体が由来する両方の抗体は、同一サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびその他、好ましくはＩｇＧ１）のＦｃ部分、好ましくは同一アロタイプ（例えば、コーカソイド）のＦｃ部分を有する。
【００３９】
「抗体のＦｃ部分」は当業者に十分に知られている用語であり、そして抗体のパパイン切断に基づいて定義される。本発明による抗体はＦｃ部分として、好ましくはヒト起源に由来するＦｃ部分および好ましくはヒトコンスタント領域のすべての他の部分を含有する。抗体のＦｃ部分は補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化およびＦｃリポーター結合に直接関係する。補体系に対する抗体の影響はある種の条件に依存するが、Ｃ１ｑに対する結合はＦｃ部分中の規定された結合部位により引き起こされる。このような結合部位はこの分野において知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：Ｌｕｋａｓ Ｔ．Ｊ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１２７（１９８１）２５５５−２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ Ｒ．およびＣｅｂｒａ Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７−９１７；Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８−３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ Ｊ．Ｅ．他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５−１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ Ｅ．Ｅ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１６４（２０００）４１７８−４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ Ｍ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１−１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ Ａ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４；およびＥＰ０３０７４３４。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（カバットのＥＵインデックスに従うナンバリング、下を参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は通常補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合せず、そしてＣ３を活性化しない。好ましくは、Ｆｃ部分はヒトＦｃ部分である。
【００４０】
用語「キメラ抗体」は、可変性領域、すなわち、１つの源または種からの結合領域と、異なる源または種に由来するコンスタント領域の少なくとも一部分とを含んでなる抗体を意味し、通常組換えＤＮＡ技術により生産される。ネズミ可変性領域と、ヒトコンスタント領域とを含んでなるキメラ抗体は好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する特性を発生するように、コンスタント領域が本来の抗体のそれから修飾または変化されている形態である。また、このようなキメラ抗体は「クラススイッチド抗体」と呼ぶ。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変性領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリンコンスタント領域をコードするＤＮＡセグメントとを含んでなる、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を生産する方法は慣用の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を包含し、この分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５，２０２，２３８号および米国特許第５，２０４，２４４号。
【００４１】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が親免疫グロブリンのＣＤＲに比較して特異性が異なる免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるように修飾されている抗体を意味する。好ましい態様において、ネズミＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフト化して「ヒト抗体」を生産する。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８−２７０。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について前述した抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する特性を発生するように、コンスタント領域が本来の抗体のそれからさらに修飾または変化されている形態である。
【００４２】
用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用するとき、ヒト生殖細胞系統免疫グロブリン配列に由来する可変性領域およびコンスタント領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体はこの分野においてよく知られている（ｖａｎ Ｄｉｊｋ Ｍ．Ａ．およびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８−３７４）。また、ヒト抗体はトランスジーン動物（例えば、マウス）において産生することができ、これらの動物は、免疫化したとき、内因的免疫グロブリン産生の非存在下にヒト抗体の完全なレパートリーまたは選択物を産生することができる。このような生殖細胞系統の突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジのときヒト抗体を産生するであろう（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５−２５８；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ Ｍ．他、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３−４０）。また、ヒト抗体はファージ展示ライブラリー中で生産できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｊ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７（１９９２）３８１−３８８；Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１−５９７）。また、Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．Ｃ．他およびＢｏｅｒｎｅｒ 他の技術はヒトモノクローナル抗体の生産に利用可能である（Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．Ｃ．他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）、ｐｐ．７７−９６；およびＢｏｅｒｎｅｒ Ｐ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１４７（１９９１）８６−９５）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及したように、本明細書において使用するとき、用語「ヒト抗体」は、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ結合に関する、本発明に従う特性を発生するように、コンスタント領域が、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃ部分の変化または突然変異により、修飾されている（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４へおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）このような抗体をまた含んでなる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、用語「組換えヒト抗体」は組換え手段により生産され、発現され、つくられまたは単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞、例えば、ＮＳ０またはＣＨＯ細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体を包含することを意図する。このような組換えヒト抗体は再配列された形態で可変性領域およびコンスタント領域を有する。本発明による組換えヒト抗体はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞高突然変異に付されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系統ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれに関係するが、ｉｎ ｖｉｖｏヒト抗体生殖細胞系統レパートリー内に天然に存在しないことがある配列である。
【００４４】
本明細書において使用するとき、用語「可変性ドメイン」（軽鎖の可変性ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変性ドメイン（ＶＨ））は、抗原に対する抗体の結合に直接関係する軽鎖および重鎖の対の各々を意味する。可変性ヒト軽鎖および重鎖のドメインは同一の一般構造を有し、そして各ドメインは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなり、それらの配列は広く保存されており、３つの「高可変性領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションを採用し、そしてＣＤＲはβ−シート構造を接続するループを形成することができる。各鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によりそれらの三次元構造で保持されており、他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は本発明による抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて特に重要な役割を演じ、したがって本発明のそれ以上の目的を提供する。
【００４５】
本明細書において使用するとき、用語「高可変性領域」または「抗体の抗原結合部分」は抗原結合のために要求される抗体のアミノ酸残基を意味する。高可変性領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、本明細書中で定義する高可変性領域残基以外の可変性ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖はＮ末端からＣ末端に向かってドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各鎖上のＣＤＲはこのようなフレームワークアミノ酸により分離されている。ことに、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は下記の文献の標準定義に従い決定される：Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。
【００４６】
重鎖および軽鎖の「コンスタント領域」は抗原に対する抗体の結合に直接関係しないが、種々のエフェクター機能を示す。それらの重鎖のコンスタント領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンはクラスに分割される：
【００４７】
本明細書において使用するとき、用語「２価二重特異性抗体」は重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）の２対の各々が異なる抗原に特異的に結合し、すなわち、第１重鎖および第１軽鎖（第１抗原に対する抗体に由来する）が第１抗原に特異的に一緒に結合し、そして第２重鎖および第２軽鎖（第２抗原に対する抗体に由来する）が第２抗原に特異的に一緒に結合する前述の抗体を意味する（第２図に描写する）；このような２価二重特異性抗体は２つの異なる抗原に同時に特異的に結合することができるが、３以上の抗原に結合することができず、反対に、一方において、単一特異性抗体は１つの抗原にのみ結合することができ、そして他方において、例えば、４価四重特異性抗体は４つの抗原に同時に結合できる。
【００４８】
本発明によれば、望ましくない副産物と比較した所望の２価二重特異性抗体の比は、ただ１対の重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）中のある種のドメインの置換により改良できる。２ＨＣ／ＬＣ対の第１は第１抗原に特異的に結合する抗体に由来し、そして本質的に未変化のまま残るが、２ＨＣ／ＬＣ対の第２は第２抗原に特異的に結合する抗体に由来し、下記の置換により変更される：
−軽鎖：第２抗原に特異的に結合する前記抗体の可変性重鎖ドメインＶＨによる可変性軽鎖ドメインＶＬの置換、および
−重鎖：第２抗原に特異的に結合する前記抗体の可変性軽鎖ドメインＶＬによる可変性重鎖ドメインＶＨの置換。
【００４９】
こうして、生ずる２価二重特異性抗体は下記を含んでなる人工的抗体である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
ここで、前記軽鎖（第２抗原に特異的に結合する抗体の）はＶＬの代わりに可変性ドメインＶＨを含有し、そして
ここで前記重鎖（第２抗原に特異的に結合する抗体の）はＶＨの代わりに可変性ドメインＶＬを含有する。
【００５０】
本発明の追加の面において、望ましくない副産物と比較した所望の２価二重特異性抗体のこのような改良された比は、下記の２つの代替法の１つによりさらに改良することができる：
【００５１】
Ａ）第１代替法（図３参照）：
本発明による前記２価二重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、いくつかの例を使用して、例えば、下記の文献において、詳細に記載されている「ノブ−インツ−ホール」により変更することができる：ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７−６８１。この方法において、２つのＣＨ３の相互作用表面を変更して、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロダイマー化を増加させる。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々は「ノブ」であることができるが、他は「ホール」である。ジサルファイド架橋の導入はヘテロダイマーを安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１；Ａｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）、そして収量を増加させる。
【００５２】
したがって、好ましい態様において、第１ＣＨ３ドメインおよび第２ＣＨ３ドメインの各々が抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスおいて出会う、２価二重特異性抗体のＣＨ３ドメインを、ＣＨ３ドメインにおけるジサルファイド架橋の導入によるそれ以上の安定化を含む「ノブ−インツ−ホール」技術（下記の文献に記載されている：ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１； およびＡｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）により変更して、２価二重特異性抗体の形成を促進する。
【００５３】
こうして、本発明の１つの面において、前記２価二重特異性抗体は下記により特徴づけられる：
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会う；
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更され、ここで変更は下記により特徴づけられる：
ａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティイ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティイを第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されている。
【００５４】
好ましくは、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基はアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から成る群から選択される。
【００５５】
好ましくは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基はアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から成る群から選択される。
【００５６】
本発明の１つの面において、両方のＣＨ３ドメイン間のジサルファイド架橋を形成できるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによって、両方のＣＨ３ドメインはさらに変更される。
【００５７】
本発明の他の好ましい態様において、下記の文献に記載されているように、ノブ残基に残基Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ（Ｋ４０９Ｄ）を使用し、ホール残基に残基Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを使用して、両方のＣＨ３ドメインを変更する：ＥＰ１８７０４５９Ａ１。
【００５８】
または
Ｂ）第２代替法（第４図参照）：
一方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３をコンスタント重鎖ドメインＣＨ１で置換し、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３をコンスタント軽鎖ドメインＣＬで置換する。
【００５９】
重鎖ドメインＣＨ３を置換するコンスタント重鎖ドメインＣＨ１は、任意のＩｇクラス （例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であることができる。
【００６０】
重鎖ドメインＣＨ３を置換するコンスタント軽鎖ドメインＣＬは、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）型、好ましくはカッパ（κ）型であることができる。
【００６１】
こうして、本発明の１つの好ましい態様は、下記を含んでなる２価二重特異性抗体である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そしてコンスタントドメインはＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されている、
そして、ここで必要に応じて、
【００６２】
ｃ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会い、
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、ここで前記変更は下記を特徴とする：
ｃａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティイ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｃｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティイを第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されているか、あるいは
ｄ）一方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されている。
【００６３】
本明細書において使用するとき、用語「抗原」または「抗原分子」は、抗体が特異的に結合できるすべての分子を意味する。２価二重特異性抗体は第１抗原および第２の独特な抗原に特異的に結合する。本明細書において使用するとき、用語「抗原」は、例えば、タンパク質、タンパク質上の異なるエピトープ（本発明の意味内の異なる抗原として）および多糖類を包含する。これは主として細菌、ウイルスおよび他の微生物の部分（外皮、嚢、細胞壁、絨毛、房およびトキシン）を包含する。脂質および核酸は、タンパク質および多糖類と結合したときにのみ、抗原性である。非微生物の外因性（非自己）抗原は、花粉、卵白、および移植された組織および器官からのタンパク質または輸注された血球表面上のタンパク質を包含できる。好ましくは、抗原はサイトカイン、細胞表面のタンパク質、酵素およびレセプターのサイトカイン、細胞表面のタンパク質、酵素およびレセプターから成る群から選択される。
【００６４】
腫瘍抗原は腫瘍細胞表面上のＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ分子により提供される抗原である。これらの抗原は時々腫瘍細胞により提供されるが、正常細胞により決して提供されない。この場合において、それらは腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と呼ばれ、典型的には腫瘍特異的突然変異から生ずる。腫瘍細胞および正常細胞により提供される抗原はより普通であり、そしてそれらは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる。これらの抗原を認識する細胞障害性Ｔリンパ球は腫瘍細胞を破壊した後、増殖または転移することができる。また、腫瘍抗原は腫瘍表面上に、例えば、突然変異したレセプターの形態で存在することができ、この場合において、それらはＢ細胞により認識されるであろう。
【００６５】
１つの好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の少なくとも１つは腫瘍抗原である。
【００６６】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の両方は腫瘍抗原である；この場合において、第１および第２の抗原は同一腫瘍特異的タンパク質における２つの異なるエピトープであることもできる。
【００６７】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の一方は腫瘍抗原であり、そして他方はエフェクター細胞抗原、例えば、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ３、ＣＤ１６およびその他である。
【００６８】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の一方は腫瘍抗原であり、そして他方は抗癌物質、例えば、トキシンまたはキナーゼインヒビターである。
【００６９】
本明細書において使用するとき、用語「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」は抗原に特異的に結合する抗体を言及する。好ましくは、この抗原に特異的に結合する抗体の結合アフィニティーは１０-9モル／ｌまたはそれより小（例えば、１０-10モル／ｌ）のＫＤ値、好ましくは１０-10モル／ｌまたはそれより小（例えば、１０-12モル／ｌ）のＫＤ値を有する。結合アフィニティーは、標準結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））により決定される。
【００７０】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる、任意のポリペプチド決定因子を包含する。ある種の態様において、エピトープ決定因子は分子の化学的に活性な表面グループ、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルおよびスルホニルを包含し、そして、ある種の態様において、特別の三次元構造的特性および／または特別の電荷特性を有することがある。エピトープは抗体により結合された抗原の領域である。ある種の態様において、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物中のそのターゲット抗原を優先的に認識するとき、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７１】
本発明のそれ以上の態様は、下記の工程を含んでなる本発明による２価二重特異性抗体を生産する方法である：
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、および
−２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されており、
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し、
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する。
【００７２】
一般に、第１抗原に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターが存在し、そしてさらに第２抗原に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターが存在する。２つのベクターの一方はそれぞれの軽鎖をコードし、そして２つのベクターの他方はそれぞれの重鎖をコードする。しかしながら、本発明による２価二重特異性抗体を生産する別の方法において、第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第１ベクター、および第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第２ベクターを宿主細胞の形質転換に使用できる。
【００７３】
本発明は、例えば、下記を発現させることによって、前記抗体分子の合成を可能とする条件下に対応する宿主細胞を培養し、そして前記培養物から前記抗体を回収することを含んでなる抗体を生産する方法を包含する：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第１核酸配列；
−第１抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第２核酸配列；
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第３核酸配列、ここで可変性軽鎖ドメインＶＬは可変性重鎖ドメインＶＨにより置換されている；そして
−第２抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第４核酸配列、ここで可変性重鎖ドメインＶＨは可変性軽鎖ドメインＶＬにより置換されている。
【００７４】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、および
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されている。
【００７５】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸部分を含んでなるベクター、および前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸部分を含んでなるベクター、および前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００７６】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による２価二重特異性抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物である。
【００７７】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による２価二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００７８】
本発明のそれ以上の態様は、治療的有効量の本発明による２価二重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療を必要する患者を治療する方法である。
【００７９】
本明細書において使用するとき、用語「核酸または核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含することを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８０】
本明細書において使用するとき、表現「細胞」、「細胞系統」および「培養物」は互換的に使用し、そしてすべてのこのような指示は子孫を包含する。こうして、単語「形質転換体」および「形質転換された細胞」は一次的主題細胞および転移数に無関係にそれらに由来する培養物を包含する。また、すべての子孫は、計画的または不注意の突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一ではないことがあることが理解される。本来形質転換された細胞についてスクリーニングしたとき、同一の機能または生物学的活性を有する変異型子孫が包含される。明確な指示を意図する場合、それは前後関係から明らかとなるであろう。
【００８１】
本明細書において使用するとき、用語「形質転換」は、ベクター／核酸が宿主細胞に転移するプロセスを意味する。難しい細胞壁バリヤーをもたない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、下記の文献に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により実施される：Ｇｒａｈａｍ Ｆ．Ｊ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ Ａ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６ｆｆ。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核注入またはプロトプラスト融合を使用することもできる。原核細胞または実質的な細胞壁構築物を含有する細胞を使用する場合、例えば、１つのトランスフェクション法は下記の文献に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である：Ｃｏｈｅｎ Ｆ．Ｎ．他、ＰＮＡＳ ６９（１９７２）７１１０ｆｆ。
【００８２】
形質転換を使用する抗体の組換え生産はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：概観論文、Ｍａｋｒｉｄｅｓ Ｓ．Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３−２０２；Ｇｅｉｓｓｅ Ｓ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１−２８２；Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１−１６０；Ｗｅｒｎｅｒ Ｒ．Ｇ．他、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（１９９８）８７０−８８０ならびに米国特許第６，３３１，４１５号および米国特許第４，８１６，５６７号。
【００８３】
本明細書において使用するとき、用語「発現」は核酸をｍＲＮＡに転写するプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（また転写体と呼ぶ）を引き続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するプロセスを意味する。転写体およびコード化ポリペプチドを集合的に遺伝子産物と呼ぶ。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含する。
【００８４】
「ベクター」は核酸分子、特に自己スプライシング核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞の中におよび／または間に転移する。この用語は主としてＤＮＡまたはＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製に主として機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳に機能する発現ベクターを包含する。また、記載した機能の２以上を提供するベクターが包含される。
【００８５】
「発現ベクター」は、適当な宿主細胞中に導入されたとき、ポリペプチドに転写および翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現系」は、所望の発現産物を生ずるように機能することができる発現ベクターから構成された、適当な宿主細胞を意味する。
【００８６】
本発明による２価二重特異性抗体は、好ましくは組換え手段により生産される。このような方法はこの分野においてよく知られており、そして原核細胞および真核細胞中でタンパク質を発現させ、次いで抗体のポリペプチドを単離し、通常薬学上許容される純度に精製することを含んでなる。タンパク質を発現させるために、軽鎖および重鎖をコードする核酸またはそのフラグメントを標準法により発現ベクター中に挿入する。発現は適当な原核または真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｎ５０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で実施し、そして抗体を細胞（上清または溶菌後の細胞）から回収する。２価二重特異性抗体は全細胞中に、細胞ライゼイト中に、または部分的に精製したまたは実質的に純粋な形態で存在することができる。標準技術、例えば、アルカリ性／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィーおよび他のこの分野においてよく知られている技術により、精製を実施して、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質を排除する。下記の文献を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．他（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）。
【００８７】
ＮＳ０細胞中の発現は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｂａｒｎｅｓ Ｌ．Ｍ．他、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９−１２３；およびＢａｒｎｅｓ Ｌ．Ｍ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１−２７０。一時的発現は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９。可変性ドメインのクローニングは下記の文献に記載されている：Ｏｒｌａｎｄｉ Ｒ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３−３８３７；Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５−４２８９；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ Ｌ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７−７８。好ましい一時的発現系（ＨＥＫ２９３）は下記の文献に記載されている：Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（２９９９）７１−８３およびＳｃｈｌａｅｇｅｒ Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１−１９９。
【００８８】
例えば、原核生物のために適当な制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を包含する。真核細胞はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００８９】
核酸は他の核酸配列と機能的関係に配置されたとき、「作用可能に連鎖」される。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡはポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作用可能に連鎖される；プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作用可能に連鎖される；またはリボソーム結合部位は翻訳を促進するように位置決定される場合、コーディング配列に作用可能に連鎖される。一般に、「作用可能に連鎖される」は、連鎖されているＤＮＡ配列が隣接していること、そして、分泌リーダーの場合において、隣接しかつリーデイングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要がない。連鎖は好都合な制限部位における結合により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣例に従い使用する。
【００９０】
２価二重特異性抗体は、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から適当に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、慣用手順を使用して容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡ源として働くことができる。いったん単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次いでこれを宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生する骨髄腫細胞中にトランスフェクトして、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体を合成する。
【００９１】
２価二重特異性抗体のアミノ酸配列変異型（または突然変異体）は、適当なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡ中に導入するか、あるいはヌクレオチド合成により生産される。しかしながら、このような修飾は、例えば、上に記載したように、非常に制限された範囲においてのみ実行できる。例えば、修飾は前述の抗体の特性、例えば、ＩｇＧアイソタイプおよび抗原結合性を変更しないが、組換え産生の収量、タンパク質安定性を改良するか、あるいは精製を促進することができる。
【００９２】
本発明の理解を促進するために、下記の実施例、配列リストおよび図面を提供する。本発明の真の範囲は添付された特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱しないで、記載した手順の変更が可能であることが理解される。
【００９３】
配列表
配列番号１ 野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２ 野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***（ＨＣ***）のアミノ酸配列、ここで重鎖ドメインＶＨは軽鎖ドメインＶＬ−改変体Ａにより置換されている。
配列番号４ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***（ＬＣ***）のアミノ酸配列、ここで軽鎖ドメインＶＬは重鎖ドメインＶＨ−改変体Ａにより置換されている。
配列番号５ ＩＧＦ−１ＲエクトドメインＨｉｓ−ストレプトアビジン結合性ペプチド−タグ（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤ）のアミノ酸配列
配列番号６ 野生型アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号７ 野生型アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号８ ノブ−インツ−ホール技術において使用するＴ３６６Ｗ交換をもつＣＨ３ドメイン（ノブ）のアミノ酸配列
配列番号９ ノブ−インツ−ホール技術において使用するＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ交換をもつＣＨ３ドメイン（ホール）のアミノ酸配列
配列番号１０ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***（ＨＣ***）のアミノ酸配列、ここで重鎖ドメインＶＨは軽鎖ドメインＶＬ−改変体Ｂにより置換されている。
配列番号１１ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***（ＬＣ***）のアミノ酸配列、ここで軽鎖ドメインＶＬは重鎖ドメインＶＨ−改変体Ｂにより置換されている。
配列番号１２ ＩＧＦ−１ＲエクトドメインＨｉｓ−ストレプトアビジン結合性ペプチド−タグ（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤ）のアミノ酸配列
【実施例】
【００９４】
材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は下記の文献に記載されている：Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。ＥＵナンバリングに従い、抗体鎖のアミノ酸をナンバリングし、言及する （Ｅｄｅｌｍａｎ Ｇ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）７８−８５；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。
【００９５】
組換えＤＮＡ技術
下記の文献に記載されているように、標準法を使用してＤＮＡ操作した：Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９。微生物学的試薬は製造業者の使用説明書に従い使用した。
【００９６】
遺伝子合成
化学合成により作ったオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを生産した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位がフランクする、６００〜１８００ｂｐ長さの遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を包含するオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結により集合させ、引き続いて示した制限部位、例えば、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩまたはＡｓｃＩ／ＰａｃＩを経由してｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。ＤＮＡ配列決定により、サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。ジェネアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ドイツ、レーゲンスブルク）において所定の明細事項に従い、遺伝子合成フラグメントを配列した。
【００９７】
ＤＮＡ配列の決定
メディジェノミックス社（ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ、ドイツ、マルチンスリート）またはセクイサーブ社（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ、ドイツ、ファーターシュテッテン）において実施した二本鎖配列決定により、ＤＮＡ配列を決定した。
【００９８】
ＤＮＡおよびタンパク質配列の分析および配列データの管理
配列の創造、遺伝地図作製、分析、注解および図解のために、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン、マディソン）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２およびインフォマックス・ベクターＮＴ１アドバンス・スイートバージョン８．０を使用した。
【００９９】
発現ベクター
一時的発現のための発現プラスミドの記載した抗体変異型を発現させるために（例えば、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡまたはＨＥＫ２９３−Ｆ中で）、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを使用するｃＤＮＡ構成またはＣＭＶプロモーターを使用するゲノム構成に基づく細胞を適用した。
【０１００】
抗体発現カセットのほかに、ベクターは下記を含有した：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でこのプラスミドの複製を可能とする複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１０１】
抗体遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端における１または２以上のユニーク制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−引き続いてｃＤＮＡ構成の場合においてイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−免疫グロブリンエキソン−イントロン構成を伴うｃＤＮＡまたはゲノム構成としてヒト抗体鎖（野生型またはドメイン交換を伴う）、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端における１または２以上のユニーク制限部位。
【０１０２】
記載した抗体鎖を含んでなる融合遺伝子を後述するようにＰＣＲおよび／または遺伝子合成により発生させ、既知の組換えの方法および技術に従い、例えば、それぞれのベクター中のユニーク制限部位を使用して、一致した核酸配列の接続により組み合わせた。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的トランスフェクションのために、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産により、より多い量のプラスミドを生産した。
【０１０３】
細胞培養技術
標準細胞培養技術を下記の文献に記載されているように使用した：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ．およびＹａｍａｄａ Ｋ．Ｍ．（編者）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．。
【０１０４】
後述するように粘着成長するＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ中でまたは懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中でそれぞれの発現プラスミドを一時的に共トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発現させた。
【０１０５】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ系における一時的トランスフェクション
１０％のウルトラ・ロウ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ）ＩｇＧ ＦＣＳ（胎仔ウシ血清、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した、粘着成長するＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン−バール−ウイルス核抗原を発現するヒト胚腎細胞系統２９３；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１０８５２、ロット９５９ ２１８）中で、それぞれの発現プラスミド（例えば、重鎖および修飾した重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾した軽鎖をコードする）を一時的共トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥTM ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を４：１（３：１から６：１）のＦｕＧＥＮＥTM試薬（μｌ）対ＤＮＡ（μｇ）の比で使用した。それぞれ１：２から２：１までの範囲の１：１（等モル）の（修飾したおよび野生型）軽鎖および重鎖エンコーディングプラスミドのモル比を使用して、タンパク質をそれぞれのプラスミドから発現させた。第３日に、細胞に４ｍＭまでのＬ−グルタミン、グルコース（Ｓｉｇｍａ）およびＮＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）を供給した。トランスフェクション後第５日〜第１１日に二重特異性抗体を含有する細胞培養物上清を遠心により収集し、−２０℃において貯蔵した。例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は下記の文献に記載されている：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ｐ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７−２０３。
【０１０６】
ＨＥＫ２９３−Ｆ系における一時的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３−Ｆ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従い使用して、それぞれのプラスミド（例えば、重鎖および修飾した重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾した軽鎖をコードする）を一時的トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発生させた。簡単に述べると、震蘯フラスコまたは攪拌した発酵槽を使用して無血清フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３）発現媒質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、４つの発現プラスミドおよび２９３フェクチンまたはフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物でトランスフェクトした。２リットルの震蘯フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）について、１．０ Ｅ＊ ６細胞／ｍｌの密度の６００ｍｌのＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を接種し、８％ＣＯ2中で１２０ｒｐｍにおいてインキュベートした。次の日に、Ａ）２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および等モル比のそれぞれ重鎖および修飾した重鎖および対応する軽鎖をコードする６００μｇの全プラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）と、Ｂ）２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋１．２ｍｌの２９３フェクチンまたはフェクチン（２μｌ／ｍｌ）との約４２ｍｌの混合物で細胞を約１．５Ｅ＊６細胞／ｍｌの細胞密度においてトランスフェクトした。グルコース消費に従い、グルコース溶液を発酵過程間に添加した。５〜１０日後に分泌抗体を含有する上清を収集し、抗体を上清から直接精製するか、あるいは上清を凍結させ、貯蔵した。
【０１０７】
タンパク質の測定
下記の文献に従いアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することによって、精製した抗体および誘導体のタンパク質濃度を決定した：Ｐａｃｅ Ｃ．Ｎ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５、４、２４１１−１４２３。
【０１０８】
上清中の抗体濃度の測定
プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を使用する免疫沈降により、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を推定した。６０μｌのプロテインＡアガロースビーズをＴＢＳ−ＮＰ４０（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）中で３回洗浄する。引き続いて、１〜１５ｍｌの細胞培養物上清をＴＢＳ−ＮＰ４０中で前平衡化したプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温において１時間インキュベートした後、ビーズをウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ）−ＭＣフィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で０．５ｍｌのＴＢＳ−ＮＰ４０で１回、０．５ｍｌの２×リン酸塩緩衝液（２×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ）で２回、そして０．５ｍｌの１００ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で短時間４回洗浄した。３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、結合した抗体を溶離した。試料の半分をそれぞれＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤と組み合わせるか、あるいは還元しないで放置し、そして１０分間７０℃に加熱した。結局、５〜３０μｌを４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（商標）ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてＭＯＰＳ緩衝液を使用し、そして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてＭＥＳ緩衝液およびＮｕＰＡＧＥ（商標）酸化防止剤ランニング添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した）、そしてクーマッシーブルーで染色した。
【０１０９】
細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を、アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーにより定量的に測定した。簡単に述べると、プロテインＡに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中のアプライド・バイオシステムス・ポロス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ）Ａ／２０カラムに適用し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＨＰＬＣ １１００系上で２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５でマトリックスから溶離した。溶離したタンパク質をＵＶ吸収およびピーク面積の積分により定量した。精製した標準ＩｇＧ１を標準として使用した。
【０１１０】
選択的に、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度をサンドイッチＩｇＧ−ＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に述べると、ストレプタウェル・ハイ・バインド・ストレプトアビジン（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）Ａ−９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、１００μｌ／ウェルのビオチニル化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で０．１μｇ／ｍｌにおいて室温で１時間被膜するか、あるいは選択的に一夜４℃において被覆し、引き続いて２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％のツイーン（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。それぞれの抗体含有細胞培養物上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中の希釈系列の１００μｌ／ウェルをウェルに添加し、室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体として１００μｌの０．１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用して結合抗体を室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間検出した。結合しない検出抗体を２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄除去し、結合した検出抗体を１００μｌのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。テカン・フルオア（Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ）スペクトロメーターで４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）において、吸収を測定した。
【０１１１】
タンパク質の精製
標準プロトコルに従い、濾過した細胞培養物上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインＡセファローズカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体をｐＨ２．８において溶離し、次いで試料を直ちに中和した。ＰＢＳ中でまたは２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＨＣｌ ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、凝集したタンパク質をモノマーの抗体から分離した。モノマーの抗体の画分をプールし、必要に応じて、例えば、ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）アミコン・ウルトラ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮装置を使用して、濃縮し、凍結させ、−２０℃または−８０℃において貯蔵した。引き続いて、試料の一部分を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサイズ排除クロマトグラフィーまたは質量分析により、タンパク質分析し、分析的に特性決定した。
【０１１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（商標）前注型ゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従い使用した。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ビス−トリス前注型ゲル系（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ（還元したゲル、ＮｕＰＡＧＥ（商標）酸化防止剤ランニング緩衝液添加剤を使用する）またはＭＯＰＳ（還元してないゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０１１３】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマーの状態を決定するサイズ排除クロマトグラフィーを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。簡単に述べると、プロテインＡ精製抗体をアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＨＰＬＣ １１００系上の３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５中のトソ（Ｔｏｓｏｈ）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラムに適用するか、あるいはジオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＨＰＬＣ系上の２×ＰＢＳ中のスーパーデックス２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸収およびピーク面積の積分により定量した。バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）ゲル濾過標準１５１−１９０１を標準として使用した。
【０１１４】
質量分析
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、クロスオーバー抗体の全脱グリコシル化質量を測定し、確認した。簡単に述べると、１００μｇの精製した抗体を１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７中の５０ｍＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、ＰｒｏＺｙｍｅ）で３７℃において１２〜２４時間２ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度において脱グルコシル化し、引き続いてセファデックスＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣにより脱塩した。脱グルコシル化および還元後、それぞれの重鎖および軽鎖の質量をＥＳＩ−ＭＳにより測定した。簡単に述べると、１１５μｌ中の５０μｇの抗体を６０μｌの１Ｍ ＴＣＥＰおよび５０μｌの８Ｍ塩酸グアニジンとインキュベートし、引き続いて脱塩した。ナノメート（ＮａｎｏＭａｔｅ）源を装備したＱ−Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ ＭＳ系上のＥＳＩ−ＭＳにより、全質量および還元した重鎖および軽鎖の質量を測定した。
【０１１５】
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡ
ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、発生した抗体の結合特性を評価した。このために、天然のリーダー配列と、Ｎ末端のＨｉｓ−ストレプトアビジン結合ペプチド−タグ（Ｈｉｓ−ＳＢＰ）に融合したアルファ鎖のヒトＩＧＦ−１ＲエクトドメインのＬＩ−システインに富んだ１２ドメイン（ＭｃＫｅｒｎ他、１９９７；Ｗａｒｄ他、２００１に従う）とを含んでなるＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（残基１〜４６２）を、ｐｃＤＮＡ３ベクター誘導体中にクローニングし、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中で一時的に発現させた。ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤのタンパク質配列を配列番号５に記載する。可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＣＤ−ＳＢＰ融合タンパク質を含有する細胞培養物上清の１００μｌ／ウェルでストレプタウェル高結合ストレプトアビジンＡ−９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を４℃において一夜被覆し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ツイーン（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。引き続いて、１％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中のそれぞれの抗体および参照として野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の希釈系列の１００μｌ／ウェルをウェルに添加し、室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間インキュベートした。希釈系列について、参照として同一量の精製した抗体、または同一抗体濃度についてサンドイッチＩｇＧ−ＥＬＩＳＡにより正規化したＨＥＫ２９３Ｅ（ＨＥＫ２９３−Ｆ）中の一時的トランスフェクションからの上清をウェルに適用した。ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体として１００μｌ／ウェルの０．１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用して、マイクロタイタープレート震蘯器上で室温において結合抗体を１〜２時間検出した。結合しない検出抗体を２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄除去し、結合した検出抗体を１００μｌのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。テカン・フルオア・スペクトロメーターで４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）において、吸収を測定した。
【０１１６】
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤバイアコア
また、バイアコ（ＢＩＡＣＯＲＥ）Ｔ１００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して表面プラズモン共鳴により、発生した抗体のヒトＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに対する結合を研究した。簡単に述べると、アフィニティーの測定のために、ヒトＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ−Ｆｃタッグドに対する抗体の提示についてのアミンカップリングにより、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ１０９−００５−０９８抗体をＣＭ５チップ上に固定化した。ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ツイーン２０、ｐＨ７．４）中で２５℃において、結合を測定した。ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓまたはイン−ハウス精製した）を溶液に種々の濃度で添加した。会合を８０秒〜３分のＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ注入により測定した；チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３〜１０分間洗浄することによって解離を測定し、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用してＫＤ値を推定した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の負荷密度および捕捉レベルが低いために、１価のＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤの結合が得られた。陰性対照のデータ（例えば、緩衝液の曲線）を試料の曲線から減じて、系固有の基線ドリフトを補正し、そして雑音を減少させた。バイアコアＴ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１を使用して、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）を分析し、そしてアフィニティーのデータを計算した。図１１は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイのスキームを示す。
【０１１７】
実施例１
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の生産、発現、精製および特性決定、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている（ここにおいて＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と略す）。
【０１１８】
実施例１Ａ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のための発現プラスミドの生産
この実施例に記載するそれぞれのリーダー配列を含む単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖および軽鎖の可変性ドメインの配列は、ＷＯ２００５／００５６３５に記載されている野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体重鎖（配列番号１、プラスミド４８４３−ｐＵＣ−ＨＣ−ＩＧＦ−１Ｒ）および軽鎖（配列番号２、プラスミド４８４２−ｐＵＣ−ＬＣ−ＩＧＦ−１Ｒ）から誘導し、そして重鎖および軽鎖コンスタントドメインをヒト抗体（Ｃ−カッパおよびＩｇＧ１）から誘導する。
【０１１９】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体のリーダー配列、軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）および重鎖コンスタントドメイン（ＣＨ１）をコードする遺伝子セグメントを接合し、ヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃドメインの５’末端に融合した。ＶＬドメインによるＶＨドメインの交換から生ずるそれぞれの融合タンパク質（ＶＨ−ＶＬ交換）をコードするＤＮＡを遺伝子合成により発生させ、下記において＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***（配列番号１０）と表示する。最初に、ＶＬ−ＣＨ１ドメインは、僅かに異なる配列（配列番号３）と融合された；この接続の発現率の低下により、野生型抗体に匹敵する発現率を示す配列番号１０を選択した。
【０１２０】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体のリーダー配列、重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）およびヒト軽鎖コンスタントドメイン（ＣＬ）のための遺伝子セグメントを独立鎖として接合した。ＶＨドメインによるＶＬドメインの交換から生ずるそれぞれの融合タンパク質（ＶＨ−ＶＬ交換）をコードするＤＮＡを遺伝子合成により発生させ、下記において＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***（重鎖***）（配列番号１１）と表示する。最初に、ＶＬ−ＣＬドメインは、僅かに異なる配列（配列番号４）と融合された；この接続の発現率の低下により、野生型抗体に匹敵する発現率を示す配列番号１１を選択した。
【０１２１】
図５および図６は、修飾された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***重鎖および修飾された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***軽鎖＊のタンパク質配列の略図を示す。
【０１２２】
下記において、それぞれの発現ベクターを簡単に説明する：
ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒ
ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞重鎖＊ＨＣ***（ｃＤＮＡ構成発現カセット；ＣＭＶ−イントロンＡをもつ）ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞中の一時的発現のためのまたはＣＨＯ細胞中の安定な発現のための、発現プラスミドである。
【０１２３】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現カセットのほかに、このベクターは下記を含有する：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２４】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端におけるＡｓｃＩ制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−次いでイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン軽鎖シグナル配列
−ヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃドメインの５’末端に融合したヒト軽鎖可変性ドメイン（ＶＨ）およびヒトカッパ−軽鎖コンスタントドメイン（ＣＬ）の融合物をコードするヒト＜ＩＧＦ−１Ｒ＞成熟ＨＣ***鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端におけるユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【０１２５】
重鎖***ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図を図７に示す。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）を配列番号１０に記載する。
【０１２６】
ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒ
ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞軽鎖ＬＣ***（ｃＤＮＡ構成発現カセット；ＣＭＶ−イントロンＡをもつ）のＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞中の一時的発現のためのまたはＣＨＯ細胞中の安定な発現のための、発現プラスミドである。
【０１２７】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現カセットのほかに、このベクターは下記を含有する：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２８】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端における制限部位Ｓｓｅ８３８７Ｉ、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−次いでイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列
−ヒト軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）およびヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ＣＨ１）の融合物をコードするヒト＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体成熟ＬＣ***鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端における制限部位ＳａｌＩおよびＦｓｅＩ。
【０１２９】
軽鎖**ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図を図８に示す。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）を配列番号１１に記載する。
【０１３０】
プラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡまたはＣＨＯ細胞（２−ベクター系）中への、一時的または安定な共トランスフェクションに使用できる。比較の理由で、この実施例に記載するものと同様にして、野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体をプラスミド４８４２−ｐＵＣ−ＬＣ−ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号２）および４８４３−ｐＵＣ−ＨＣ−ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号１）から一時的に発現させた。
【０１３１】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中の一時的発現においてより高い発現レベルを達成するために、下記を含有する４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰ発現ベクター中に、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現カセットをＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ部位を通して、そして＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現カセットをＳｓｅ８３８７ＩおよびＦｓｅＩ部位を通して、サブクローニングすることができる：
−ＯｒｉＰ要素、および
−選択可能なマーカーとしてヒグロマイシン耐性遺伝子。
【０１３２】
重鎖および軽鎖の転写単位は共トランスフェクションのために２つの独立４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰベクター（２ベクター系）中にサブクローニングするか、あるいは生ずるベクターを使用する引き続く一時的または安定なトランスフェクションのために１つの共通の４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰベクター（１ベクター系）中にクローニングすることができる。基本的ベクター４７００−ｐＵＣ−ＯｒｉＰのプラスミド地図を図９に示す。
【０１３３】
実施例１Ｂ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の発現プラスミドの生産
既知の組換えの方法および技術を使用して、一致する核酸セグメント接続により、野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の交換されたＦａｂ配列を含んでなる＜ＩＧＦ−１Ｒ＞融合遺伝子（ＨＣ***およびＬＣ***融合遺伝子）を組立てた。
【０１３４】
ＩＧＦ−１Ｒ ＨＣ***およびＬＣ***をコードする核酸配列の各々を化学合成により合成し、引き続いてゲネアルト（Ｇｅｎｅａｒｔ）（レーゲンスブルク、ドイツ）においてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。ＩＧＦ−１Ｒ ＨＣ***をコードする発現カセットをＰｖｕＩＩおよびＢｍｇＢＩ制限部位を通してそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中に結合して、最終ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒを生成した；それぞれのＩＧＦ−１Ｒ ＬＣ***をコードする発現カセットをＰｖｕＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を通してそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中に結合して、最終ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒを生成した。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的および安定なトランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産により大量のプラスミドを生産した。
【０１３５】
実施例１Ｃ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の一時的発現、精製および質量分析による同定の確認
上記されるように、ＨＥＫ２９３−Ｆ懸濁細胞中で、プラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒの一時的共トランスフェクションにより、組換え＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を発現させた。
【０１３６】
上記されるように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、濾過した細胞培養物上清から、発現分泌された単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を精製した。簡単に述べると、一時的トランスフェクションからの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を含有する細胞培養物上清を遠心により清浄化し、濾過し、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４） と平衡化したプロテインＡ ハイトラップ・マブセレクト・エクストラカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合しないタンパク質をＰＢＳ平衡緩衝液、次いで０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄除去し、ＰＢＳで洗浄した。抗体を１００ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ２．８で溶離し、次いで試料を３００μｌの２Ｍ トリス ｐＨ９．０／２ｍｌの画分で直ちに中和した。２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０中のハイロード２６／６０スーパーデックス２００プレプ等級カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集したタンパク質をモノマー抗体から分離し、引き続いてモノマー抗体画分をミリポア・アミコン・ウルトラ−１５遠心濃縮装置で濃縮した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を凍結させ、−２０℃または−８０℃において貯蔵した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の完全性を還元剤の存在および非存在下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、引き続いて上記されるようにクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の一価状態は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された（図１２）。特性決定した試料を引き続きタンパク質分析および機能的特性決定のために使用した。完全に脱グルコシル化された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の理論分子量は、ＥＳＩ質量分析により確認された。
【０１３７】
実施例１Ｄ
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡにおけるおよびビアコアによる単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のＩＧＦ−１Ｒ結合特性の分析
前述したようにＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の結合特性を評価した。このために、天然のリーダー配列と、Ｎ末端のＨｉｓ−ストレプトアビジン結合ペプチド−タグ（Ｈｉｓ−ＳＢＰ）に融合したアルファ鎖のヒトＩＧＦ−１ＲエクトドメインのＬＩ−システインに富んだ１２ドメイン（ＭｃＫｅｒｎ他、１９９７；Ｗａｒｄ他、２００１に従う）とを含んでなるＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（残基１〜４６２）を、ｐｃＤＮＡ３ベクター誘導体中にクローニングし、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中で一時的に発現させた。ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤのタンパク質配列を上記に記載する。得られた滴定曲線は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体が機能的であり、この方法の誤差内にある野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体に匹敵する結合特徴及び動力学を示し、十分に機能的であるように考えられた（図１３）。
【０１３８】
これらの結果は、それぞれの精製した抗体を使用するビアコアによって確証されている。
【０１３９】
実施例１Ｇ
ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現するＩ２４細胞を使用するＦＡＣＳによる単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のＩＧＦ−１Ｒ結合特性の分析
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の結合活性を確認するために、Ｉ２４細胞（組換えヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｏｃｈｅ）の表面上で過剰発現されたＩＧＦ−１Ｒに対する結合性をＦＡＣＳにより研究する。簡単に述べると、精製した＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および参照として野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の希釈物と５×１０Ｅ５ Ｉ２４細胞／ＦＡＣＳをインキュベートし、氷上で１時間インキュベートする。結合しない抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄除去する。引き続いて、細胞を遠心（５分、４００ｇ）し、結合した抗体をＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＥコンジュゲイト（Ｄｉａｎｏｖａ）により氷上で１時間光から保護して検出する。結合しない検出抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ＋２％ ＦＣＳで洗浄除去する。引き続いて、細胞を遠心（５分、４００ｇ）し、３００〜５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、そして結合した検出抗体をＦＡＣＳカリブール（Ｃａｌｉｂｕｒ）またはＦＡＣＳカント（Ｃａｎｔｏ）（ＢＤ、ＦＬ２チャンネル、１０，０００細胞／獲得）上で定量する。実験の間、それぞれのアイソタイプ対照を含めて非特異的結合事象を排除する。Ｉ２４細胞上のＩＧＦ−１Ｒに対する＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ／ＣＬ−ＣＨ１交換抗体および野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞参照抗体の結合性を、平均蛍光強度の濃度依存的シフトによって比較する。
【０１４０】
実施例２
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の説明
実施例２Ａ
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体のための発現プラスミドの生産
この実施例に記載するそれぞれのリーダー配列を含む単一特異性２価アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の重鎖および軽鎖の可変性ドメインの配列を、ＷＯ２００６／０４５０４９に記載されているヒト＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体の重鎖（配列番号６）および軽鎖（配列番号７）から誘導し、そして重鎖および軽鎖のコンスタントドメインをヒト抗体（Ｃ−カッパおよびＩｇＧ１）から誘導する。
【０１４１】
前の実施例１Ａに記載するベクターに類似するプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２（配列番号６）およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２（配列番号７）中に野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体をクローニングした。比較の理由でかつ共発現実験のために（実施例３参照）、野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体をプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２から一時的に（共）発現させた。
【０１４２】
実施例２Ｂ
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体発現プラスミドの生産
＜ＡＮＧＰＴ２＞ＨＣおよびＬＣをコードする核酸配列の各々を化学合成により合成し、引き続いてゲネアルト（Ｇｅｎｅａｒｔ）（レーゲンスブルク、ドイツ）においてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。＜ＡＮＧＰＴ２＞ＨＣをコードする発現カセットをそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中にクローニングして、最終ベクターＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２を生成した；それぞれの＜ＡＮＧＰＴ２＞ＬＣをコードする発現カセットをそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中にクローニングして、最終ベクターＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２を生成した。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的および安定なトランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産によってより大量のプラスミドを生産した。
【０１４３】
実施例３
二重特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の発現、ここでＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する重鎖および軽鎖において、コンスタントドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている（ここにおいて＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と略す）
【０１４４】
実施例３Ａ
二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を生ずるＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の一時的共発現および精製
一方の側で＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を通してＩＧＦ−１Ｒを認識し、そして他方の側で＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型Ｆａｂ領域を通して＜ＡＮＧＰＴ２＞を認識する機能的二重特異性抗体を発生させるために、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体をコードする２つの発現プラスミド（実施例１Ａ）を＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体をコードする２つの発現プラスミド（実施例２Ａ）と共発現させた。野生型重鎖ＨＣおよびＶＬ−ＶＨ交換抗体鎖ＨＣ***の統計的会合を仮定すると、これにより二重特異性および２価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体が発生した。両方の抗体が等しく十分に発現されると仮定し、副産物を考慮しないとすると、これにより３つの主要な生成物、Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体が１：２：１の比で生じたであろう。いくつかの副産物を期待することができる。
しかしながら、ＶＬ−ＶＨドメインだけの交換により、副産物の頻度は、完全なＦａｂクロスオーバーに対して減少したであろう。
＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞野生型及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体よりも高い発現の一時的発現収量を示すので、＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体プラスミドおよび＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体プラスミドの比は、＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の発現に有利にシフトした。
【０１４５】
主要な産物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の混合物を発生させるために、４つのプラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２を、上記した懸濁ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞に一時的に共トランスフェクトした。収集した上清は主要な生成物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の混合物を含有し、「二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物」と表示する。遠心分離によって二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物を含有する細胞培養物上清を収集し、その後、上述されるように精製した。
【０１４６】
抗体混合物の完全性を還元剤の存在および非存在下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、引き続いて上記されるようにクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色し、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、期待したように、２種の重鎖および軽鎖が調製物中に存在することを示した（還元ゲル）（図１４）。特性決定した試料を引き続きタンパク質分析および機能的特性決定のために使用した。
【０１４７】
実施例３Ｂ
Ｉ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞ＦＡＣＳ架橋アッセイにおける機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の検出
実施例３Ａに記載する一時的共発現からの主要な生成物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の精製された二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物中の機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を確認するために、Ｉ２４細胞（組換えヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｏｃｈｅ）上で細胞ＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイを実施した。このアッセイを図１０に描写する。精製した抗体混合物中に存在する二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体は、ＩＧＦ−１ＲにＩ２４細胞中でおよび同時にＡＮＧＰＴ２に結合することができ、こうしてその２つのターゲット抗原を２つの対向するＦａｂ領域と架橋させるであろう。
【０１４８】
簡単に述べると、５×１０Ｅ５ Ｉ２４細胞／ＦＡＣＳ管を精製した抗体混合物の全部とインキュベートし、氷上で１時間インキュベートした（滴定１６０μｇ／ｍｌ混合物）。それぞれの精製した抗体の野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜ＡＮＧＰＴ２＞を対照としてＩ２４細胞に適用した。未結合の抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合した二重特異性抗体を５０μｌの２μｇ／ｍＬヒトＡＮＧＰＴ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間、氷上で検出した。その後、未結合のＡＮＧＰＴ２を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回または２回洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合したＡＮＧＰＴ２を５０μｌの５μｇ／ｍＬ＜ＡＮＧＰＴ２＞ｍＩｇＧ１−ビオチン抗体（ＢＡＭ０９８１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４５分間、氷上で検出した；あるいは、細胞を５０μｌの５μｌ／ｍＬ ｍＩｇＧ１−ビオチン−アイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともにインキュベートした。未結合の検出抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合した検出抗体を５０μｌの１：４００にしたストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｚｙｍｅｄ）を用いて、４５分間、遮光しながら氷上で検出した。未結合のストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出した。次に、細胞を遠心し（４００ｇで５分）し、３００〜５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、結合したストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ（ＦＬ２チャネル、１０，０００細胞／捕捉）上で定量した。実験中、それぞれのアイソタイプ対照は、いずれかの非特異的な結合事象を排除するために含められた。さらに、精製された単一特異性２価ＩｇＧ１抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜ＡＮＧＰＴ２＞を対照として含めた。
【０１４９】
図１５の結果は、野生型抗体（＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体）とともにクロスオーバー抗体（＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体）の共発現から精製した抗体クロスオーバー混合物（＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体）とのインキュベーションが、Ｉ２４細胞中のＩＧＦ−１Ｒ、およびＡＮＧＰＴ２に同時に結合することができる機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を指示する
蛍光の有意なシフトを生じ；こうしてその２つの抗原を２つの対向するＦａｂ領域と架橋させることができることを示す。これと対照的に、それぞれの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜Ａｎｇ−２＞対照抗体は、ＦＡＣＳ架橋アッセイでは蛍光のシフトを生じなかった。
【０１５０】
これらのデータを一緒にしてみると、それぞれの野生型およびクロスオーバープラスミドによって、機能的二重特異性抗体を生じ得ることを示す。正確な二重特異性抗体の収量は、例えば、ノブ−インツ−ホール技術ならびにジスルフィド安定化を用いて、野生型および修飾したクロスオーバー重鎖の正確なヘテロ二量体化を強いることによって増加し得る（実施例４を参照されたい）。
【０１５１】
実施例４
修飾されたＣＨ３ドメインを有する２価二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の発現（ノブ−インツ−ホール）
二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の収量をさらに改善するために、ノブ−インツ−ホール技術を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体に適用し、均一であり、機能的二重特異性抗体調製物を得る。このために、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖＊ＨＣ＊のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ交換を有する配列番号８のＣＨ３ドメイン（ノブ）で置換され、野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体の重鎖のＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ交換を有する配列番号９のＣＨ３ドメイン（ホール）で置換されるか、またはその反対である。さらに、ジスルフィドは、安定性及び収量を増加させるために含めることができ、イオン架橋を形成し、ヘテロ二量体化収量を増加させる更なる残基も同様である（ＥＰ１８７０４５９Ａ１）。
【０１５２】
一時的な共発現、および修飾されたＣＨ３ドメインを含む、得られた２価二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体（ノブ−インツ−ホール）の精製は、実施例３に記載されるように行われる。
【０１５３】
ヘテロ二量体化の最適化は、例えば、異なるノブ−インツ−ホール技術、例えば、追加のジサルファイド架橋をＣＨ３ドメイン中に導入する、例えば、Ｙ３４９Ｃを「ノブ鎖」中に導入し、そしてＤ３５６Ｃを「ホール鎖」中に導入することにより、および／またはノブ残基のために残基Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ（Ｋ４０９Ｄ）を使用し、そしてホール残基のために残基Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを使用する（ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている）ことを組合わせることによって達成することができることに留意すべきである。
【０１５４】
実施例４と同様にして、（上述のＡＮＧＰＴ２重鎖および軽鎖、および該他の標的に指向される抗体のＶＬ−ＶＨ交換重鎖および軽鎖***ＨＣ***およびＬＣ***を用いて、それにより両方の重鎖が「ノブ−インツ−ホール」によって修飾される）ＡＮＧＰＴ２および別の標的抗原に指向され、または（該他の標的及び上記のＩＧＦ−１Ｒ ＶＬ−Ｈ交換重鎖および軽鎖***ＨＣ***およびＬＣ***に指向される抗体の重鎖および軽鎖を用いて、それにより両方の重鎖が「ノブ−インツ−ホール」によって修飾される）ＩＧＦ−１Ｒおよび別の標的に指向される更なる２価二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換抗体が調製可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な２価二重特異性抗体、それらの生産および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
操作されたタンパク質、例えば、２またはそれ以上の抗原に結合できる二重特異性または多重特異性抗体はこの分野において知られている。このような多重特異性結合性タンパク質は、細胞融合、化学的接合または組換えＤＮＡ技術を使用して発生させることができる。
【０００３】
広範な種類の組換え二重特異性抗体フォーマットは最近開発されてきている、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットおよび一本鎖ドメインの融合により、例えば、４価二重特異性抗体が開発された（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５（１９９７）１５９−１６３；ＷＯ２００１０７７３４２；およびＣｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２３３−１２３４）。
【０００４】
また、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの新しいフォーマット、例えば、２またはそれ以上の抗原に結合できる、ジ抗体、トリ抗体またはテトラ抗体、ミニ抗体、いくつかの一本鎖フォーマット （ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ）が開発された（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．他 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（２００５）１１２６−１１３６；Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．およびＬｅｇｅｒ Ｏ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４；Ｓｈｅｎ Ｊ．他 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５−７４；Ｗｕ Ｃ．他 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０−１２９７）。
【０００５】
すべてのこのようなフォーマットはリンカーを使用して抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）をそれ以上の結合性タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合するか、あるいは、例えば、２つのＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖを融合する（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｎ．およびＬｅｇｅｒ Ｏ．Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３−１４）。リンカーは二重特異性抗体の操作のために利点を有することは明らかであるが、それらは治療的設定において問題を引き起こすこともある。事実、これらの外来ペプチドはリンカーそれ自体に対してまたはタンパク質とリンカーとの間の接合部に対して免疫応答を誘発することがある。
【０００６】
さらにいっそう、これらのペプチドの柔軟な特質はそれらのタンパク質分解的切断の傾向を高め、潜在的に抗体安定性の低下に導き、抗体を凝集させ、そして免疫原性を増加させる。さらに、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）を保持することを必要とすることがあり、これらは天然に存在する抗体に対する高度の類似性を維持することによってＦｃ部分を通して伝達される。こうして、理想的には、一般構造が天然に存在する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）に非常に類似し、ヒト配列からの逸脱が小さい、二重特異性抗体の開発を目的とすべきである。
【０００７】
１つのアプローチにおいて、二重特異性抗体の所望の特異性をもつネズミモノクローナル抗体を発現する２つの異なるハイブリドーマ細胞系統の体融合に基づくクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）技術（参照、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．およびＡ．Ｃ．Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５（１９８３）５３７−４０）を使用して、天然の抗体に非常に類似する二重特異性抗体が生産された。生ずるハイブリッド−ハイブリドーマ（またはクアドローマ）細胞系統内の２つの異なる抗体の重鎖および軽鎖の不規則な対合のために、１０までの異なる抗体種が発生し、それらの１つのみが所望の機能的二重特異性抗体である。対合違い副産物の存在および有意に減少した生産収量のために、複雑な精製手順を必要とする（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２３３−１２３４）。一般に、組換え発現技術を使用する場合、対合違い副産物という同一の問題が残る。
【０００８】
「ノブ−インツ−ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」として知られている、対合違い副産物の問題を回避するアプローチは、ＣＨ３ドメイン中に突然変異を導入して接触インターフェイスを変更することによって、２つの異なる抗体重鎖の対合を強制することを目指す。１つの鎖上で嵩高アミノ酸が短い側鎖をもつアミノ酸と置換して、「ホール」をつくる。逆に、大きい側鎖をもつアミノ酸を他のＣＨ３ドメイン中に導入して、「ノブ」をつくる。これらの２つの重鎖（および２つの同一軽鎖、これらは両方の重鎖のために適当でなくてはならない）を共発現させることによって、ホモダイマー（「ホール−ホール」または「ノブ−ノブ」）の形成に比較してヘテロダイマー（ノブ−ホール） の形成の高い収量が観測された（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｐｒｅｓｔａ ＬＧ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ；およびＷＯ１９９６０２７０１１）。ファージ展示アプローチを使用して２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改造し、そしてジサルファイド架橋を導入してヘテロダイマーを安定化することによって、ヘテロダイマーの百分率をさらに増加することができる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１；Ａｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，ＣａｔｅｒＰ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）。ノブ−インツ−ホール技術についての新しいアプローチは、例えば、ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている。このフォーマットは非常に魅力的であるが、臨床に向かう進歩を記載するデータは現在入手不可能である。この戦略の１つの重要な拘束は、２つの親抗体の軽鎖が同一であって対合違いおよび不活性分子の形成を防止しなくてはならないことである。こうして、第１および第２の抗原に対する２つの抗体から出発して２つの抗原に対して組換え２価二重特異性抗体を容易に発生させるたには、これらの抗体の重鎖および／または同一の軽鎖を最適化しなくてはならないので、この技術は不適当である。
【０００９】
Ｘｉｅ，Ｚ．他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８６（２００５）９５−１０１は、Ｆｃ部分に対するノブ−インツ−ホール技術を併用して、ｓｃＦｖを用いた二重特異性抗体の新規なフォーマットを言及している。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、下記を含んでなる、２価二重特異性抗体に関する：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１１】
本発明のそれ以上の態様は、下記の工程を含んでなる本発明による２価二重特異性抗体を生産する方法である：
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する。
【００１２】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１３】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物である。
【００１４】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００１５】
本発明のそれ以上の態様は、患者に治療的有効量の本発明による抗体を投与することを特徴とする、治療を必要する患者を治療する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１はＩｇＧ、典型的な順序で可変性ドメインとコンスタントドメインとを含んでなる重鎖および軽鎖の２対をもつ１つの抗原に対して特異的な天然に存在する全抗体の略図。
【００１７】
【図２】図２はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００１８】
【図３】図３はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして両方の重鎖のＣＨ３ドメインはノブ−インツ−ホール技術により変更されている。
【００１９】
【図４】図４はａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；およびｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含んでなる、２価二重特異性抗体の略図、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして両方の重鎖のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３の一方はコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されている。
【００２０】
【図５】図５は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***のタンパク質配列のスキーム。
【００２１】
【図６】図６は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***のタンパク質配列のスキーム（カッパコンスタント軽鎖ドメインＣＬ）。
【００２２】
【図７】図７は重鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図。
【００２３】
【図８】図８は軽鎖***＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図。
【００２４】
【図９】図９は４７００−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰ発現ベクターのプラスミド地図。
【００２５】
【図１０】図１０は機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を検出するＩ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞のＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイのアッセイ原理。
【００２６】
【図１１】図１１はスキームＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合Ｂｉａｃｏｒｅ。
【００２７】
【図１２】図１２はＨＥＫ２９３−Ｆ細胞の一時的トランスフェクション後の細胞培養物上清から単離されたＨＣ*およびＬＣを有する、精製された単一特異性二価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体（ＩｇＧ１*）のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー。
【００２８】
【図１３】図１３はＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイにおけるＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに対する単一特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の結合。
【００２９】
【図１４】図１４は一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３−Ｆ細胞からの細胞培養物上清から精製された＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体ミックスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【００３０】
【図１５】図１５は精製された抗体ミックス中の機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を検出するＩ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞のＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイの試料Ａ〜Ｆについての結果。精製されたタンパク質試料Ａ〜Ｆ：Ａ＝Ｉ２４未処理Ｂ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋ｈＩｇＧアイソタイプＤ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と、二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を含む＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の同時発現からのミックス。Ｅ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体Ｆ＝Ｉ２４＋２μｇ／ｍＬ ｈＡＮＧＰＴ２＋＜ＩＧＦ−１Ｒ＞野生型抗体
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、下記を含んでなる、２価二重特異性抗体に関する：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００３２】
したがって、二重特異性抗体は、下記を含んでなる：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の第１軽鎖および第１重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の第２軽鎖および第２重鎖
ここで、第２軽鎖および第２重鎖の可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００３３】
こうして、第２抗原に特異的に結合する前記抗体について、下記が適用される：
軽鎖内において、
可変性軽鎖ドメインＶＬは前記抗体の可変性重鎖ドメインＶＨにより置換されている； そして、重鎖内において、
可変性重鎖ドメインＶＨは前記抗体の可変性軽鎖ドメインＶＬにより置換されている。
【００３４】
本明細書において使用するとき、用語「抗体」は全モノクローナル抗体を意味する。このような全抗体は「軽鎖」（ＬＣ）および「重鎖」（ＨＣ）の２対から成る（このような軽鎖（ＬＣ）／重鎖（ＨＣ）の対は本明細書中でＬＣ／ＨＣと略されている）。このような抗体の軽鎖および重鎖はいくつかのドメインから成るポリペプチドである。全抗体において、各重鎖は重鎖可変性領域（本明細書中でＨＣＶＲまたはＶＨと略す）と、重鎖コンスタント領域とを含んでなる。重鎖コンスタント領域は重鎖コンスタントドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（抗体クラスＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）と、必要に応じて重鎖コンスタントドメインＣＨ４（抗体クラスＩｇＥおよびＩｇＭ）とを含んでなる。各軽鎖は軽鎖可変性ドメインＶＬと、軽鎖コンスタントドメインＣＬとを含んでなる。１つの天然に存在する全抗体、ＩｇＧ抗体の構造は、例えば、第１図に示されている。可変性ドメインＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名する、超可変性領域にさらに再分割することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名する、いっそう保存された領域が介在する。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと、４つのＦＲとから構成され、それらは下記の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ．Ｊｒ．他、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＷｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）８９−９９）。２対の重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）は同一抗原に特異的に結合することができる。こうして、前記全抗体は２価単一特異性抗体である。このような「抗体」は、それらの特徴的特性が保持されるかぎり、例えば、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および遺伝子操作された抗体（変異型または突然変異抗体）を包含する。ヒトまたはヒト化抗体は、特に組換えヒトまたはヒト化抗体として、特に好ましい。
【００３５】
ギリシャ文字、α、δ、ε、γおよびμで表示される５つの型の哺乳動物抗体重鎖が存在する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．Ｊｒ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２００１））。存在する重鎖の型は抗体のクラスを定義する；これらの鎖はそれぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体中に見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ ＲＡ、Ｐｆｌａｎｚｅｒ ＲＧ（２００２）、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ 第４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）。明確な重鎖は大きさと組成が異なる；αおよびγはほぼ４５０アミノ酸を含有するが、μおよびεはほぼ５５０アミノ酸を含有する。各重鎖は２つの領域、コンスタント領域および可変性領域を有する。コンスタント領域は同一アイソタイプのすべての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体において異なる。重鎖γ、αおよびδは３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（直線）から構成されたコンスタント領域、および付加された柔軟性のためのヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（２００４）８９−９９）；重鎖μおよびεは４つのコンスタントドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成されたコンスタント領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．Ｊｒ．他、（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ 第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。重鎖の可変性領域は異なるＢ細胞により産生された抗体において異なるが、単一のＢ細胞にまたはＢ細胞クローンにより産生されたすべての抗体について同一である。各重鎖の可変性領域はほぼ１１０アミノ酸長さであり、そして単一の抗体ドメインから構成されている。
【００３６】
哺乳動物において、わずかに２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）とよぶ軽鎖が存在する。軽鎖は２つの連続的ドメインを有する：１つのコンスタントドメインＣＬおよび１つの可変性ドメインＶＬ。軽鎖の概算長さは２１１〜２１７アミノ酸である。好ましくは軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、そしてコンスタントドメインＣＬは好ましくはカッパ（κ）軽鎖（コンスタントドメインＣκ）である。
【００３７】
本明細書において使用するとき、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を意味する。
【００３８】
本発明による「抗体」は任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＥ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２、好ましくはＩｇＧ１）であることができ、ここで本発明による２価二重特異性抗体が由来する両方の抗体は、同一サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４およびその他、好ましくはＩｇＧ１）のＦｃ部分、好ましくは同一アロタイプ（例えば、コーカソイド）のＦｃ部分を有する。
【００３９】
「抗体のＦｃ部分」は当業者に十分に知られている用語であり、そして抗体のパパイン切断に基づいて定義される。本発明による抗体はＦｃ部分として、好ましくはヒト起源に由来するＦｃ部分および好ましくはヒトコンスタント領域のすべての他の部分を含有する。抗体のＦｃ部分は補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化およびＦｃリポーター結合に直接関係する。補体系に対する抗体の影響はある種の条件に依存するが、Ｃ１ｑに対する結合はＦｃ部分中の規定された結合部位により引き起こされる。このような結合部位はこの分野において知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：Ｌｕｋａｓ Ｔ．Ｊ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１２７（１９８１）２５５５−２５６０；Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ Ｒ．およびＣｅｂｒａ Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７−９１７；Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８−３４４；Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ Ｊ．Ｅ．他、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５−１００４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ Ｅ．Ｅ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１６４（２０００）４１７８−４１８４；Ｈｅｚａｒｅｈ Ｍ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１−１２１６８；Ｍｏｒｇａｎ Ａ．他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９−３２４；およびＥＰ０３０７４３４。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（カバットのＥＵインデックスに従うナンバリング、下を参照）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ３の抗体は通常補体活性化、Ｃ１ｑ結合およびＣ３活性化を示すが、ＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑに結合せず、そしてＣ３を活性化しない。好ましくは、Ｆｃ部分はヒトＦｃ部分である。
【００４０】
用語「キメラ抗体」は、可変性領域、すなわち、１つの源または種からの結合領域と、異なる源または種に由来するコンスタント領域の少なくとも一部分とを含んでなる抗体を意味し、通常組換えＤＮＡ技術により生産される。ネズミ可変性領域と、ヒトコンスタント領域とを含んでなるキメラ抗体は好ましい。本発明に包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本発明に従う特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する特性を発生するように、コンスタント領域が本来の抗体のそれから修飾または変化されている形態である。また、このようなキメラ抗体は「クラススイッチド抗体」と呼ぶ。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変性領域をコードするＤＮＡセグメントと、免疫グロブリンコンスタント領域をコードするＤＮＡセグメントとを含んでなる、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を生産する方法は慣用の組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション技術を包含し、この分野においてよく知られている。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１（１９８４）６８５１−６８５５；米国特許第５，２０２，２３８号および米国特許第５，２０４，２４４号。
【００４１】
用語「ヒト化抗体」は、フレームワークまたは「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が親免疫グロブリンのＣＤＲに比較して特異性が異なる免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるように修飾されている抗体を意味する。好ましい態様において、ネズミＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域中にグラフト化して「ヒト抗体」を生産する。例えば、下記の文献を参照のこと：Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）３２３−３２７；およびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ．Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３１４（１９８５）２６８−２７０。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体について前述した抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明に従う特性、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃレセプター（ＦｃＲ）結合に関する特性を発生するように、コンスタント領域が本来の抗体のそれからさらに修飾または変化されている形態である。
【００４２】
用語「ヒト抗体」は、本明細書において使用するとき、ヒト生殖細胞系統免疫グロブリン配列に由来する可変性領域およびコンスタント領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体はこの分野においてよく知られている（ｖａｎ Ｄｉｊｋ Ｍ．Ａ．およびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ Ｊ．Ｇ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８−３７４）。また、ヒト抗体はトランスジーン動物（例えば、マウス）において産生することができ、これらの動物は、免疫化したとき、内因的免疫グロブリン産生の非存在下にヒト抗体の完全なレパートリーまたは選択物を産生することができる。このような生殖細胞系統の突然変異マウスにおけるヒト生殖細胞系統免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジのときヒト抗体を産生するであろう（例えば、下記の文献を参照のこと：Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ．他、Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５−２５８；Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ Ｍ．他、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３−４０）。また、ヒト抗体はファージ展示ライブラリー中で生産できる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｊ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７７（１９９２）３８１−３８８；Ｍａｒｋｓ Ｊ．Ｄ．他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１−５９７）。また、Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．Ｃ．他およびＢｏｅｒｎｅｒ 他の技術はヒトモノクローナル抗体の生産に利用可能である（Ｃｏｌｅ Ｓ．Ｐ．Ｃ．他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）、ｐｐ．７７−９６；およびＢｏｅｒｎｅｒ Ｐ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．１４７（１９９１）８６−９５）。本発明によるキメラ抗体およびヒト化抗体について既に言及したように、本明細書において使用するとき、用語「ヒト抗体」は、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ結合に関する、本発明に従う特性を発生するように、コンスタント領域が、例えば、「クラススイッチング」、すなわち、Ｆｃ部分の変化または突然変異により、修飾されている（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ４へおよび／またはＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）このような抗体をまた含んでなる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、用語「組換えヒト抗体」は組換え手段により生産され、発現され、つくられまたは単離されたすべてのヒト抗体、例えば、宿主細胞、例えば、ＮＳ０またはＣＨＯ細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、または宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体を包含することを意図する。このような組換えヒト抗体は再配列された形態で可変性領域およびコンスタント領域を有する。本発明による組換えヒト抗体はｉｎ ｖｉｖｏ体細胞高突然変異に付されている。こうして、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系統ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれに関係するが、ｉｎ ｖｉｖｏヒト抗体生殖細胞系統レパートリー内に天然に存在しないことがある配列である。
【００４４】
本明細書において使用するとき、用語「可変性ドメイン」（軽鎖の可変性ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変性ドメイン（ＶＨ））は、抗原に対する抗体の結合に直接関係する軽鎖および重鎖の対の各々を意味する。可変性ヒト軽鎖および重鎖のドメインは同一の一般構造を有し、そして各ドメインは４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含んでなり、それらの配列は広く保存されており、３つの「高可変性領域」（または相補性決定領域、ＣＤＲ）により接続されている。フレームワーク領域はβ−シートコンフォメーションを採用し、そしてＣＤＲはβ−シート構造を接続するループを形成することができる。各鎖中のＣＤＲはフレームワーク領域によりそれらの三次元構造で保持されており、他の鎖からのＣＤＲと一緒に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域は本発明による抗体の結合特異性／アフィニティーにおいて特に重要な役割を演じ、したがって本発明のそれ以上の目的を提供する。
【００４５】
本明細書において使用するとき、用語「高可変性領域」または「抗体の抗原結合部分」は抗原結合のために要求される抗体のアミノ酸残基を意味する。高可変性領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、本明細書中で定義する高可変性領域残基以外の可変性ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖はＮ末端からＣ末端に向かってドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各鎖上のＣＤＲはこのようなフレームワークアミノ酸により分離されている。ことに、重鎖のＣＤＲ３は抗原結合に最も寄与する領域である。ＣＤＲおよびＦＲ領域は下記の文献の標準定義に従い決定される：Ｋａｂａｔ他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。
【００４６】
重鎖および軽鎖の「コンスタント領域」は抗原に対する抗体の結合に直接関係しないが、種々のエフェクター機能を示す。それらの重鎖のコンスタント領域のアミノ酸配列に依存して、抗体または免疫グロブリンはクラスに分割される：
【００４７】
本明細書において使用するとき、用語「２価二重特異性抗体」は重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）の２対の各々が異なる抗原に特異的に結合し、すなわち、第１重鎖および第１軽鎖（第１抗原に対する抗体に由来する）が第１抗原に特異的に一緒に結合し、そして第２重鎖および第２軽鎖（第２抗原に対する抗体に由来する）が第２抗原に特異的に一緒に結合する前述の抗体を意味する（第２図に描写する）；このような２価二重特異性抗体は２つの異なる抗原に同時に特異的に結合することができるが、３以上の抗原に結合することができず、反対に、一方において、単一特異性抗体は１つの抗原にのみ結合することができ、そして他方において、例えば、４価四重特異性抗体は４つの抗原に同時に結合できる。
【００４８】
本発明によれば、望ましくない副産物と比較した所望の２価二重特異性抗体の比は、ただ１対の重鎖および軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）中のある種のドメインの置換により改良できる。２ＨＣ／ＬＣ対の第１は第１抗原に特異的に結合する抗体に由来し、そして本質的に未変化のまま残るが、２ＨＣ／ＬＣ対の第２は第２抗原に特異的に結合する抗体に由来し、下記の置換により変更される：
−軽鎖：第２抗原に特異的に結合する前記抗体の可変性重鎖ドメインＶＨによる可変性軽鎖ドメインＶＬの置換、および
−重鎖：第２抗原に特異的に結合する前記抗体の可変性軽鎖ドメインＶＬによる可変性重鎖ドメインＶＨの置換。
【００４９】
こうして、生ずる２価二重特異性抗体は下記を含んでなる人工的抗体である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
ここで、前記軽鎖（第２抗原に特異的に結合する抗体の）はＶＬの代わりに可変性ドメインＶＨを含有し、そして
ここで前記重鎖（第２抗原に特異的に結合する抗体の）はＶＨの代わりに可変性ドメインＶＬを含有する。
【００５０】
本発明の追加の面において、望ましくない副産物と比較した所望の２価二重特異性抗体のこのような改良された比は、下記の２つの代替法の１つによりさらに改良することができる：
【００５１】
Ａ）第１代替法（図３参照）：
本発明による前記２価二重特異性抗体のＣＨ３ドメインは、いくつかの例を使用して、例えば、下記の文献において、詳細に記載されている「ノブ−インツ−ホール」により変更することができる：ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７−６８１。この方法において、２つのＣＨ３の相互作用表面を変更して、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロダイマー化を増加させる。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）の各々は「ノブ」であることができるが、他は「ホール」である。ジサルファイド架橋の導入はヘテロダイマーを安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１；Ａｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）、そして収量を増加させる。
【００５２】
したがって、好ましい態様において、第１ＣＨ３ドメインおよび第２ＣＨ３ドメインの各々が抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスおいて出会う、２価二重特異性抗体のＣＨ３ドメインを、ＣＨ３ドメインにおけるジサルファイド架橋の導入によるそれ以上の安定化を含む「ノブ−インツ−ホール」技術（下記の文献に記載されている：ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７−６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ Ａ．Ｍ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７−６８１； およびＡｔｗｅｌｌ Ｓ，Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，，Ｗｅｌｌｓ ＪＡ，Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６−３５）により変更して、２価二重特異性抗体の形成を促進する。
【００５３】
こうして、本発明の１つの面において、前記２価二重特異性抗体は下記により特徴づけられる：
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会う；
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更され、ここで変更は下記により特徴づけられる：
ａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティイ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティイを第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されている。
【００５４】
好ましくは、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基はアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から成る群から選択される。
【００５５】
好ましくは、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基はアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から成る群から選択される。
【００５６】
本発明の１つの面において、両方のＣＨ３ドメイン間のジサルファイド架橋を形成できるように、各ＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによって、両方のＣＨ３ドメインはさらに変更される。
【００５７】
本発明の他の好ましい態様において、下記の文献に記載されているように、ノブ残基に残基Ｒ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ（Ｋ４０９Ｄ）を使用し、ホール残基に残基Ｄ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋを使用して、両方のＣＨ３ドメインを変更する：ＥＰ１８７０４５９Ａ１。
【００５８】
または
Ｂ）第２代替法（第４図参照）：
一方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３をコンスタント重鎖ドメインＣＨ１で置換し、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３をコンスタント軽鎖ドメインＣＬで置換する。
【００５９】
重鎖ドメインＣＨ３を置換するコンスタント重鎖ドメインＣＨ１は、任意のＩｇクラス （例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であることができる。
【００６０】
重鎖ドメインＣＨ３を置換するコンスタント軽鎖ドメインＣＬは、ラムダ（λ）またはカッパ（κ）型、好ましくはカッパ（κ）型であることができる。
【００６１】
こうして、本発明の１つの好ましい態様は、下記を含んでなる２価二重特異性抗体である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そしてコンスタントドメインはＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されている、
そして、ここで必要に応じて、
【００６２】
ｃ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会い、
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、ここで前記変更は下記を特徴とする：
ｃａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティイ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｃｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティイを第２のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されているか、あるいは
ｄ）一方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３はコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されている。
【００６３】
本明細書において使用するとき、用語「抗原」または「抗原分子」は、抗体が特異的に結合できるすべての分子を意味する。２価二重特異性抗体は第１抗原および第２の独特な抗原に特異的に結合する。本明細書において使用するとき、用語「抗原」は、例えば、タンパク質、タンパク質上の異なるエピトープ（本発明の意味内の異なる抗原として）および多糖類を包含する。これは主として細菌、ウイルスおよび他の微生物の部分（外皮、嚢、細胞壁、絨毛、房およびトキシン）を包含する。脂質および核酸は、タンパク質および多糖類と結合したときにのみ、抗原性である。非微生物の外因性（非自己）抗原は、花粉、卵白、および移植された組織および器官からのタンパク質または輸注された血球表面上のタンパク質を包含できる。好ましくは、抗原はサイトカイン、細胞表面のタンパク質、酵素およびレセプターのサイトカイン、細胞表面のタンパク質、酵素およびレセプターから成る群から選択される。
【００６４】
腫瘍抗原は腫瘍細胞表面上のＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩ分子により提供される抗原である。これらの抗原は時々腫瘍細胞により提供されるが、正常細胞により決して提供されない。この場合において、それらは腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）と呼ばれ、典型的には腫瘍特異的突然変異から生ずる。腫瘍細胞および正常細胞により提供される抗原はより普通であり、そしてそれらは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と呼ばれる。これらの抗原を認識する細胞障害性Ｔリンパ球は腫瘍細胞を破壊した後、増殖または転移することができる。また、腫瘍抗原は腫瘍表面上に、例えば、突然変異したレセプターの形態で存在することができ、この場合において、それらはＢ細胞により認識されるであろう。
【００６５】
１つの好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の少なくとも１つは腫瘍抗原である。
【００６６】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の両方は腫瘍抗原である；この場合において、第１および第２の抗原は同一腫瘍特異的タンパク質における２つの異なるエピトープであることもできる。
【００６７】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の一方は腫瘍抗原であり、そして他方はエフェクター細胞抗原、例えば、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ３、ＣＤ１６およびその他である。
【００６８】
他の好ましい態様において、２価二重特異性抗体が特異的に結合する２つの異なる抗原（第１および第２の抗原）の一方は腫瘍抗原であり、そして他方は抗癌物質、例えば、トキシンまたはキナーゼインヒビターである。
【００６９】
本明細書において使用するとき、用語「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」は抗原に特異的に結合する抗体を言及する。好ましくは、この抗原に特異的に結合する抗体の結合アフィニティーは１０-9モル／ｌまたはそれより小（例えば、１０-10モル／ｌ）のＫＤ値、好ましくは１０-10モル／ｌまたはそれより小（例えば、１０-12モル／ｌ）のＫＤ値を有する。結合アフィニティーは、標準結合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴技術（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））により決定される。
【００７０】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる、任意のポリペプチド決定因子を包含する。ある種の態様において、エピトープ決定因子は分子の化学的に活性な表面グループ、例えば、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルおよびスルホニルを包含し、そして、ある種の態様において、特別の三次元構造的特性および／または特別の電荷特性を有することがある。エピトープは抗体により結合された抗原の領域である。ある種の態様において、抗体がタンパク質および／または高分子の複雑な混合物中のそのターゲット抗原を優先的に認識するとき、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。
【００７１】
本発明のそれ以上の態様は、下記の工程を含んでなる本発明による２価二重特異性抗体を生産する方法である：
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、および
−２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されており、
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し、
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する。
【００７２】
一般に、第１抗原に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターが存在し、そしてさらに第２抗原に特異的に結合する前記抗体の軽鎖および重鎖をコードする２つのベクターが存在する。２つのベクターの一方はそれぞれの軽鎖をコードし、そして２つのベクターの他方はそれぞれの重鎖をコードする。しかしながら、本発明による２価二重特異性抗体を生産する別の方法において、第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第１ベクター、および第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードするただ１つの第２ベクターを宿主細胞の形質転換に使用できる。
【００７３】
本発明は、例えば、下記を発現させることによって、前記抗体分子の合成を可能とする条件下に対応する宿主細胞を培養し、そして前記培養物から前記抗体を回収することを含んでなる抗体を生産する方法を包含する：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第１核酸配列；
−第１抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第２核酸配列；
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする第３核酸配列、ここで可変性軽鎖ドメインＶＬは可変性重鎖ドメインＶＨにより置換されている；そして
−第２抗原に特異的に結合する抗体の重鎖をコードする第４核酸配列、ここで可変性重鎖ドメインＶＨは可変性軽鎖ドメインＶＬにより置換されている。
【００７４】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、および
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、そして
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されている。
【００７５】
本発明のそれ以上の態様は、下記を含んでなる宿主細胞である：
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸部分を含んでなるベクター、および前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖をコードする核酸部分を含んでなるベクター、および前記抗体の重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている。
【００７６】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による２価二重特異性抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物である。
【００７７】
本発明のそれ以上の態様は、本発明による２価二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物である。
【００７８】
本発明のそれ以上の態様は、治療的有効量の本発明による２価二重特異性抗体を患者に投与することを特徴とする、治療を必要する患者を治療する方法である。
【００７９】
本明細書において使用するとき、用語「核酸または核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を包含することを意図する。核酸分子は一本鎖または二本鎖であることができるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００８０】
本明細書において使用するとき、表現「細胞」、「細胞系統」および「培養物」は互換的に使用し、そしてすべてのこのような指示は子孫を包含する。こうして、単語「形質転換体」および「形質転換された細胞」は一次的主題細胞および転移数に無関係にそれらに由来する培養物を包含する。また、すべての子孫は、計画的または不注意の突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一ではないことがあることが理解される。本来形質転換された細胞についてスクリーニングしたとき、同一の機能または生物学的活性を有する変異型子孫が包含される。明確な指示を意図する場合、それは前後関係から明らかとなるであろう。
【００８１】
本明細書において使用するとき、用語「形質転換」は、ベクター／核酸が宿主細胞に転移するプロセスを意味する。難しい細胞壁バリヤーをもたない細胞を宿主細胞として使用する場合、トランスフェクションは、例えば、下記の文献に記載されているリン酸カルシウム沈殿法により実施される：Ｇｒａｈａｍ Ｆ．Ｊ．およびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ Ａ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７８）５４６ｆｆ。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核注入またはプロトプラスト融合を使用することもできる。原核細胞または実質的な細胞壁構築物を含有する細胞を使用する場合、例えば、１つのトランスフェクション法は下記の文献に記載されている塩化カルシウムを使用するカルシウム処理である：Ｃｏｈｅｎ Ｆ．Ｎ．他、ＰＮＡＳ ６９（１９７２）７１１０ｆｆ。
【００８２】
形質転換を使用する抗体の組換え生産はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている：概観論文、Ｍａｋｒｉｄｅｓ Ｓ．Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１７（１９９９）１８３−２０２；Ｇｅｉｓｓｅ Ｓ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．８（１９９６）２７１−２８２；Ｋａｕｆｍａｎ Ｒ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２０００）１５１−１６０；Ｗｅｒｎｅｒ Ｒ．Ｇ．他、Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ ４８（１９９８）８７０−８８０ならびに米国特許第６，３３１，４１５号および米国特許第４，８１６，５６７号。
【００８３】
本明細書において使用するとき、用語「発現」は核酸をｍＲＮＡに転写するプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡ（また転写体と呼ぶ）を引き続いてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳するプロセスを意味する。転写体およびコード化ポリペプチドを集合的に遺伝子産物と呼ぶ。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現はｍＲＮＡのスプライシングを包含する。
【００８４】
「ベクター」は核酸分子、特に自己スプライシング核酸分子であり、挿入された核酸分子を宿主細胞の中におよび／または間に転移する。この用語は主としてＤＮＡまたはＲＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体の組込み）のために機能するベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡの複製に主として機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳に機能する発現ベクターを包含する。また、記載した機能の２以上を提供するベクターが包含される。
【００８５】
「発現ベクター」は、適当な宿主細胞中に導入されたとき、ポリペプチドに転写および翻訳されることができるポリヌクレオチドである。「発現系」は、所望の発現産物を生ずるように機能することができる発現ベクターから構成された、適当な宿主細胞を意味する。
【００８６】
本発明による２価二重特異性抗体は、好ましくは組換え手段により生産される。このような方法はこの分野においてよく知られており、そして原核細胞および真核細胞中でタンパク質を発現させ、次いで抗体のポリペプチドを単離し、通常薬学上許容される純度に精製することを含んでなる。タンパク質を発現させるために、軽鎖および重鎖をコードする核酸またはそのフラグメントを標準法により発現ベクター中に挿入する。発現は適当な原核または真核宿主細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、Ｎ５０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中で実施し、そして抗体を細胞（上清または溶菌後の細胞）から回収する。２価二重特異性抗体は全細胞中に、細胞ライゼイト中に、または部分的に精製したまたは実質的に純粋な形態で存在することができる。標準技術、例えば、アルカリ性／ＳＤＳ処理、カラムクロマトグラフィーおよび他のこの分野においてよく知られている技術により、精製を実施して、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞の核酸またはタンパク質を排除する。下記の文献を参照のこと：Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．他（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）。
【００８７】
ＮＳ０細胞中の発現は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｂａｒｎｅｓ Ｌ．Ｍ．他、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（２０００）１０９−１２３；およびＢａｒｎｅｓ Ｌ．Ｍ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３（２００１）２６１−２７０。一時的発現は、例えば、下記の文献に記載されている：Ｄｕｒｏｃｈｅｒ Ｙ．他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（２００２）Ｅ９。可変性ドメインのクローニングは下記の文献に記載されている：Ｏｒｌａｎｄｉ Ｒ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６（１９８９）３８３３−３８３７；Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１９９２）４２８５−４２８９；およびＮｏｒｄｅｒｈａｕｇ Ｌ．他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０４（１９９７）７７−７８。好ましい一時的発現系（ＨＥＫ２９３）は下記の文献に記載されている：Ｓｃｈｌａｅｇｅｒ Ｅ．−Ｊ．およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｋ．、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（２９９９）７１−８３およびＳｃｈｌａｅｇｅｒ Ｅ．−Ｊ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９４（１９９６）１９１−１９９。
【００８８】
例えば、原核生物のために適当な制御配列は、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列およびリボソーム結合部位を包含する。真核細胞はプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。
【００８９】
核酸は他の核酸配列と機能的関係に配置されたとき、「作用可能に連鎖」される。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡはポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作用可能に連鎖される；プロモーターまたはエンハンサーは配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作用可能に連鎖される；またはリボソーム結合部位は翻訳を促進するように位置決定される場合、コーディング配列に作用可能に連鎖される。一般に、「作用可能に連鎖される」は、連鎖されているＤＮＡ配列が隣接していること、そして、分泌リーダーの場合において、隣接しかつリーデイングフレーム中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接する必要がない。連鎖は好都合な制限部位における結合により達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣例に従い使用する。
【００９０】
２価二重特異性抗体は、慣用の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−セファローズ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーにより、培地から適当に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡおよびＲＮＡは、慣用手順を使用して容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡおよびＲＮＡ源として働くことができる。いったん単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次いでこれを宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生する骨髄腫細胞中にトランスフェクトして、宿主細胞中で組換えモノクローナル抗体を合成する。
【００９１】
２価二重特異性抗体のアミノ酸配列変異型（または突然変異体）は、適当なヌクレオチド変化を抗体ＤＮＡ中に導入するか、あるいはヌクレオチド合成により生産される。しかしながら、このような修飾は、例えば、上に記載したように、非常に制限された範囲においてのみ実行できる。例えば、修飾は前述の抗体の特性、例えば、ＩｇＧアイソタイプおよび抗原結合性を変更しないが、組換え産生の収量、タンパク質安定性を改良するか、あるいは精製を促進することができる。
【００９２】
本発明の理解を促進するために、下記の実施例、配列リストおよび図面を提供する。本発明の真の範囲は添付された特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱しないで、記載した手順の変更が可能であることが理解される。
【００９３】
配列表
配列番号１ 野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２ 野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***（ＨＣ***）のアミノ酸配列、ここで重鎖ドメインＶＨは軽鎖ドメインＶＬ−改変体Ａにより置換されている。
配列番号４ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***（ＬＣ***）のアミノ酸配列、ここで軽鎖ドメインＶＬは重鎖ドメインＶＨ−改変体Ａにより置換されている。
配列番号５ ＩＧＦ−１ＲエクトドメインＨｉｓ−ストレプトアビジン結合性ペプチド−タグ（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤ）のアミノ酸配列
配列番号６ 野生型アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号７ 野生型アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号８ ノブ−インツ−ホール技術において使用するＴ３６６Ｗ交換をもつＣＨ３ドメイン（ノブ）のアミノ酸配列
配列番号９ ノブ−インツ−ホール技術において使用するＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ交換をもつＣＨ３ドメイン（ホール）のアミノ酸配列
配列番号１０ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖***（ＨＣ***）のアミノ酸配列、ここで重鎖ドメインＶＨは軽鎖ドメインＶＬ−改変体Ｂにより置換されている。
配列番号１１ ＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の軽鎖***（ＬＣ***）のアミノ酸配列、ここで軽鎖ドメインＶＬは重鎖ドメインＶＨ−改変体Ｂにより置換されている。
配列番号１２ ＩＧＦ−１ＲエクトドメインＨｉｓ−ストレプトアビジン結合性ペプチド−タグ（ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤ）のアミノ酸配列
【実施例】
【００９４】
材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は下記の文献に記載されている：Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）。ＥＵナンバリングに従い、抗体鎖のアミノ酸をナンバリングし、言及する （Ｅｄｅｌｍａｎ Ｇ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）７８−８５；Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．他、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。
【００９５】
組換えＤＮＡ技術
下記の文献に記載されているように、標準法を使用してＤＮＡ操作した：Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９。微生物学的試薬は製造業者の使用説明書に従い使用した。
【００９６】
遺伝子合成
化学合成により作ったオリゴヌクレオチドから、所望の遺伝子セグメントを生産した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位がフランクする、６００〜１８００ｂｐ長さの遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を包含するオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結により集合させ、引き続いて示した制限部位、例えば、ＫｐｎＩ／ＳａｃＩまたはＡｓｃＩ／ＰａｃＩを経由してｐＰＣＲｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。ＤＮＡ配列決定により、サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。ジェネアート（Ｇｅｎｅａｒｔ）（ドイツ、レーゲンスブルク）において所定の明細事項に従い、遺伝子合成フラグメントを配列した。
【００９７】
ＤＮＡ配列の決定
メディジェノミックス社（ＭｅｄｉＧｅｎｏｍｉｘ ＧｍｂＨ、ドイツ、マルチンスリート）またはセクイサーブ社（Ｓｅｑｕｉｓｅｒｖｅ ＧｍｂＨ、ドイツ、ファーターシュテッテン）において実施した二本鎖配列決定により、ＤＮＡ配列を決定した。
【００９８】
ＤＮＡおよびタンパク質配列の分析および配列データの管理
配列の創造、遺伝地図作製、分析、注解および図解のために、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン、マディソン）ソフトウェアパッケージバージョン１０．２およびインフォマックス・ベクターＮＴ１アドバンス・スイートバージョン８．０を使用した。
【００９９】
発現ベクター
一時的発現のための発現プラスミドの記載した抗体変異型を発現させるために（例えば、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡまたはＨＥＫ２９３−Ｆ中で）、ＣＭＶ−イントロンＡプロモーターを使用するｃＤＮＡ構成またはＣＭＶプロモーターを使用するゲノム構成に基づく細胞を適用した。
【０１００】
抗体発現カセットのほかに、ベクターは下記を含有した：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でこのプラスミドの複製を可能とする複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１０１】
抗体遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端における１または２以上のユニーク制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−引き続いてｃＤＮＡ構成の場合においてイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−免疫グロブリンエキソン−イントロン構成を伴うｃＤＮＡまたはゲノム構成としてヒト抗体鎖（野生型またはドメイン交換を伴う）、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端における１または２以上のユニーク制限部位。
【０１０２】
記載した抗体鎖を含んでなる融合遺伝子を後述するようにＰＣＲおよび／または遺伝子合成により発生させ、既知の組換えの方法および技術に従い、例えば、それぞれのベクター中のユニーク制限部位を使用して、一致した核酸配列の接続により組み合わせた。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的トランスフェクションのために、形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産により、より多い量のプラスミドを生産した。
【０１０３】
細胞培養技術
標準細胞培養技術を下記の文献に記載されているように使用した：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ Ｊ．Ｓ．、Ｄａｓｓｏ Ｍ．、Ｈａｒｆｏｒｄ Ｊ．Ｂ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ．およびＹａｍａｄａ Ｋ．Ｍ．（編者）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．。
【０１０４】
後述するように粘着成長するＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ中でまたは懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中でそれぞれの発現プラスミドを一時的に共トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発現させた。
【０１０５】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ系における一時的トランスフェクション
１０％のウルトラ・ロウ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ）ＩｇＧ ＦＣＳ（胎仔ウシ血清、Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）および２５０μｇ／ｍｌのジェネチシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ変性イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）中で培養した、粘着成長するＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞（エプスタイン−バール−ウイルス核抗原を発現するヒト胚腎細胞系統２９３；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ受託番号ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１０８５２、ロット９５９ ２１８）中で、それぞれの発現プラスミド（例えば、重鎖および修飾した重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾した軽鎖をコードする）を一時的共トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥTM ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を４：１（３：１から６：１）のＦｕＧＥＮＥTM試薬（μｌ）対ＤＮＡ（μｇ）の比で使用した。それぞれ１：２から２：１までの範囲の１：１（等モル）の（修飾したおよび野生型）軽鎖および重鎖エンコーディングプラスミドのモル比を使用して、タンパク質をそれぞれのプラスミドから発現させた。第３日に、細胞に４ｍＭまでのＬ−グルタミン、グルコース（Ｓｉｇｍａ）およびＮＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）を供給した。トランスフェクション後第５日〜第１１日に二重特異性抗体を含有する細胞培養物上清を遠心により収集し、−２０℃において貯蔵した。例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は下記の文献に記載されている：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ Ｐ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７−２０３。
【０１０６】
ＨＥＫ２９３−Ｆ系における一時的トランスフェクション
ＨＥＫ２９３−Ｆ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従い使用して、それぞれのプラスミド（例えば、重鎖および修飾した重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾した軽鎖をコードする）を一時的トランスフェクションすることによって、二重特異性抗体を発生させた。簡単に述べると、震蘯フラスコまたは攪拌した発酵槽を使用して無血清フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３）発現媒質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁液中で成長するＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、４つの発現プラスミドおよび２９３フェクチンまたはフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の混合物でトランスフェクトした。２リットルの震蘯フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）について、１．０ Ｅ＊ ６細胞／ｍｌの密度の６００ｍｌのＨＥＫ２９３−Ｆ細胞を接種し、８％ＣＯ2中で１２０ｒｐｍにおいてインキュベートした。次の日に、Ａ）２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および等モル比のそれぞれ重鎖および修飾した重鎖および対応する軽鎖をコードする６００μｇの全プラスミドＤＮＡ（１μｇ／ｍｌ）と、Ｂ）２０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ＋１．２ｍｌの２９３フェクチンまたはフェクチン（２μｌ／ｍｌ）との約４２ｍｌの混合物で細胞を約１．５Ｅ＊６細胞／ｍｌの細胞密度においてトランスフェクトした。グルコース消費に従い、グルコース溶液を発酵過程間に添加した。５〜１０日後に分泌抗体を含有する上清を収集し、抗体を上清から直接精製するか、あるいは上清を凍結させ、貯蔵した。
【０１０７】
タンパク質の測定
下記の文献に従いアミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）を測定することによって、精製した抗体および誘導体のタンパク質濃度を決定した：Ｐａｃｅ Ｃ．Ｎ．他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５、４、２４１１−１４２３。
【０１０８】
上清中の抗体濃度の測定
プロテインＡアガロースビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を使用する免疫沈降により、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を推定した。６０μｌのプロテインＡアガロースビーズをＴＢＳ−ＮＰ４０（５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０）中で３回洗浄する。引き続いて、１〜１５ｍｌの細胞培養物上清をＴＢＳ−ＮＰ４０中で前平衡化したプロテインＡアガロースビーズに適用した。室温において１時間インキュベートした後、ビーズをウルトラフリー（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ）−ＭＣフィルターカラム（Ａｍｉｃｏｎ）上で０．５ｍｌのＴＢＳ−ＮＰ４０で１回、０．５ｍｌの２×リン酸塩緩衝液（２×ＰＢＳ、Ｒｏｃｈｅ）で２回、そして０．５ｍｌの１００ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で短時間４回洗浄した。３５μｌのＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して、結合した抗体を溶離した。試料の半分をそれぞれＮｕＰＡＧＥ（商標）試料還元剤と組み合わせるか、あるいは還元しないで放置し、そして１０分間７０℃に加熱した。結局、５〜３０μｌを４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（商標）ビス−トリスＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に適用し（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてＭＯＰＳ緩衝液を使用し、そして還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてＭＥＳ緩衝液およびＮｕＰＡＧＥ（商標）酸化防止剤ランニング添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した）、そしてクーマッシーブルーで染色した。
【０１０９】
細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度を、アフィニティーＨＰＬＣクロマトグラフィーにより定量的に測定した。簡単に述べると、プロテインＡに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養物上清を、２００ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中のアプライド・バイオシステムス・ポロス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｏｒｏｓ）Ａ／２０カラムに適用し、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＨＰＬＣ １１００系上で２００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ２．５でマトリックスから溶離した。溶離したタンパク質をＵＶ吸収およびピーク面積の積分により定量した。精製した標準ＩｇＧ１を標準として使用した。
【０１１０】
選択的に、細胞培養物上清中の抗体および誘導体の濃度をサンドイッチＩｇＧ−ＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に述べると、ストレプタウェル・ハイ・バインド・ストレプトアビジン（ＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）Ａ−９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を、１００μｌ／ウェルのビオチニル化抗ヒトＩｇＧ捕捉分子Ｆ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＢＩ（Ｄｉａｎｏｖａ）で０．１μｇ／ｍｌにおいて室温で１時間被膜するか、あるいは選択的に一夜４℃において被覆し、引き続いて２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％のツイーン（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。それぞれの抗体含有細胞培養物上清のＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中の希釈系列の１００μｌ／ウェルをウェルに添加し、室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間インキュベートした。ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体として１００μｌの０．１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用して結合抗体を室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間検出した。結合しない検出抗体を２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄除去し、結合した検出抗体を１００μｌのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。テカン・フルオア（Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｏｒ）スペクトロメーターで４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）において、吸収を測定した。
【０１１１】
タンパク質の精製
標準プロトコルに従い、濾過した細胞培養物上清からタンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインＡセファローズカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体をｐＨ２．８において溶離し、次いで試料を直ちに中和した。ＰＢＳ中でまたは２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＨＣｌ ｐＨ６．０中でサイズ排除クロマトグラフィー（スーパーデックス２００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、凝集したタンパク質をモノマーの抗体から分離した。モノマーの抗体の画分をプールし、必要に応じて、例えば、ミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）アミコン・ウルトラ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮装置を使用して、濃縮し、凍結させ、−２０℃または−８０℃において貯蔵した。引き続いて、試料の一部分を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサイズ排除クロマトグラフィーまたは質量分析により、タンパク質分析し、分析的に特性決定した。
【０１１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（商標）前注型ゲル系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明書に従い使用した。特に、１０％または４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）ビス−トリス前注型ゲル系（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ（還元したゲル、ＮｕＰＡＧＥ（商標）酸化防止剤ランニング緩衝液添加剤を使用する）またはＭＯＰＳ（還元してないゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０１１３】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマーの状態を決定するサイズ排除クロマトグラフィーを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。簡単に述べると、プロテインＡ精製抗体をアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＨＰＬＣ １１００系上の３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５中のトソ（Ｔｏｓｏｈ）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷカラムに適用するか、あるいはジオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＨＰＬＣ系上の２×ＰＢＳ中のスーパーデックス２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。溶離したタンパク質をＵＶ吸収およびピーク面積の積分により定量した。バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）ゲル濾過標準１５１−１９０１を標準として使用した。
【０１１４】
質量分析
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、クロスオーバー抗体の全脱グリコシル化質量を測定し、確認した。簡単に述べると、１００μｇの精製した抗体を１００ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７中の５０ｍＵのＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ、ＰｒｏＺｙｍｅ）で３７℃において１２〜２４時間２ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度において脱グルコシル化し、引き続いてセファデックスＧ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＨＰＬＣにより脱塩した。脱グルコシル化および還元後、それぞれの重鎖および軽鎖の質量をＥＳＩ−ＭＳにより測定した。簡単に述べると、１１５μｌ中の５０μｇの抗体を６０μｌの１Ｍ ＴＣＥＰおよび５０μｌの８Ｍ塩酸グアニジンとインキュベートし、引き続いて脱塩した。ナノメート（ＮａｎｏＭａｔｅ）源を装備したＱ−Ｓｔａｒ Ｅｌｉｔｅ ＭＳ系上のＥＳＩ−ＭＳにより、全質量および還元した重鎖および軽鎖の質量を測定した。
【０１１５】
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡ
ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、発生した抗体の結合特性を評価した。このために、天然のリーダー配列と、Ｎ末端のＨｉｓ−ストレプトアビジン結合ペプチド−タグ（Ｈｉｓ−ＳＢＰ）に融合したアルファ鎖のヒトＩＧＦ−１ＲエクトドメインのＬＩ−システインに富んだ１２ドメイン（ＭｃＫｅｒｎ他、１９９７；Ｗａｒｄ他、２００１に従う）とを含んでなるＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（残基１〜４６２）を、ｐｃＤＮＡ３ベクター誘導体中にクローニングし、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中で一時的に発現させた。ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤのタンパク質配列を配列番号５に記載する。可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−ＥＣＤ−ＳＢＰ融合タンパク質を含有する細胞培養物上清の１００μｌ／ウェルでストレプタウェル高結合ストレプトアビジンＡ−９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を４℃において一夜被覆し、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ、０．０５％ツイーン（ＰＢＳＴ、Ｓｉｇｍａ）で３回洗浄した。引き続いて、１％ＢＳＡ（画分Ｖ、Ｒｏｃｈｅ）を含むＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中のそれぞれの抗体および参照として野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の希釈系列の１００μｌ／ウェルをウェルに添加し、室温においてマイクロタイタープレート震蘯器上で１〜２時間インキュベートした。希釈系列について、参照として同一量の精製した抗体、または同一抗体濃度についてサンドイッチＩｇＧ−ＥＬＩＳＡにより正規化したＨＥＫ２９３Ｅ（ＨＥＫ２９３−Ｆ）中の一時的トランスフェクションからの上清をウェルに適用した。ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄し、検出抗体として１００μｌ／ウェルの０．１μｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＯＤ（Ｄｉａｎｏｖａ）を使用して、マイクロタイタープレート震蘯器上で室温において結合抗体を１〜２時間検出した。結合しない検出抗体を２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄除去し、結合した検出抗体を１００μｌのＡＢＴＳ／ウェルの添加により検出した。テカン・フルオア・スペクトロメーターで４０５ｎｍの測定波長（参照波長４９２ｎｍ）において、吸収を測定した。
【０１１６】
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤバイアコア
また、バイアコ（ＢＩＡＣＯＲＥ）Ｔ１００計器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）を使用して表面プラズモン共鳴により、発生した抗体のヒトＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤに対する結合を研究した。簡単に述べると、アフィニティーの測定のために、ヒトＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ−Ｆｃタッグドに対する抗体の提示についてのアミンカップリングにより、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ１０９−００５−０９８抗体をＣＭ５チップ上に固定化した。ＨＢＳ緩衝液（ＨＢＳ−Ｐ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ツイーン２０、ｐＨ７．４）中で２５℃において、結合を測定した。ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓまたはイン−ハウス精製した）を溶液に種々の濃度で添加した。会合を８０秒〜３分のＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ注入により測定した；チップ表面をＨＢＳ緩衝液で３〜１０分間洗浄することによって解離を測定し、そして１：１ラングミュア結合モデルを使用してＫＤ値を推定した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の負荷密度および捕捉レベルが低いために、１価のＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤの結合が得られた。陰性対照のデータ（例えば、緩衝液の曲線）を試料の曲線から減じて、系固有の基線ドリフトを補正し、そして雑音を減少させた。バイアコアＴ１００評価ソフトウェアバージョン１．１．１を使用して、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）を分析し、そしてアフィニティーのデータを計算した。図１１は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイのスキームを示す。
【０１１７】
実施例１
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の生産、発現、精製および特性決定、ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている（ここにおいて＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と略す）。
【０１１８】
実施例１Ａ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のための発現プラスミドの生産
この実施例に記載するそれぞれのリーダー配列を含む単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖および軽鎖の可変性ドメインの配列は、ＷＯ２００５／００５６３５に記載されている野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体重鎖（配列番号１、プラスミド４８４３−ｐＵＣ−ＨＣ−ＩＧＦ−１Ｒ）および軽鎖（配列番号２、プラスミド４８４２−ｐＵＣ−ＬＣ−ＩＧＦ−１Ｒ）から誘導し、そして重鎖および軽鎖コンスタントドメインをヒト抗体（Ｃ−カッパおよびＩｇＧ１）から誘導する。
【０１１９】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体のリーダー配列、軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）および重鎖コンスタントドメイン（ＣＨ１）をコードする遺伝子セグメントを接合し、ヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃドメインの５’末端に融合した。ＶＬドメインによるＶＨドメインの交換から生ずるそれぞれの融合タンパク質（ＶＨ−ＶＬ交換）をコードするＤＮＡを遺伝子合成により発生させ、下記において＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***（配列番号１０）と表示する。最初に、ＶＬ−ＣＨ１ドメインは、僅かに異なる配列（配列番号３）と融合された；この接続の発現率の低下により、野生型抗体に匹敵する発現率を示す配列番号１０を選択した。
【０１２０】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体のリーダー配列、重鎖可変性ドメイン（ＶＨ）およびヒト軽鎖コンスタントドメイン（ＣＬ）のための遺伝子セグメントを独立鎖として接合した。ＶＨドメインによるＶＬドメインの交換から生ずるそれぞれの融合タンパク質（ＶＨ−ＶＬ交換）をコードするＤＮＡを遺伝子合成により発生させ、下記において＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***（重鎖***）（配列番号１１）と表示する。最初に、ＶＬ−ＣＬドメインは、僅かに異なる配列（配列番号４）と融合された；この接続の発現率の低下により、野生型抗体に匹敵する発現率を示す配列番号１１を選択した。
【０１２１】
図５および図６は、修飾された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***重鎖および修飾された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***軽鎖＊のタンパク質配列の略図を示す。
【０１２２】
下記において、それぞれの発現ベクターを簡単に説明する：
ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒ
ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞重鎖＊ＨＣ***（ｃＤＮＡ構成発現カセット；ＣＭＶ−イントロンＡをもつ）ＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞中の一時的発現のためのまたはＣＨＯ細胞中の安定な発現のための、発現プラスミドである。
【０１２３】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現カセットのほかに、このベクターは下記を含有する：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２４】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端におけるＡｓｃＩ制限部位、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−次いでイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン軽鎖シグナル配列
−ヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）のＦｃドメインの５’末端に融合したヒト軽鎖可変性ドメイン（ＶＨ）およびヒトカッパ−軽鎖コンスタントドメイン（ＣＬ）の融合物をコードするヒト＜ＩＧＦ−１Ｒ＞成熟ＨＣ***鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端におけるユニーク制限部位ＳｇｒＡＩ。
【０１２５】
重鎖***ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図を図７に示す。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）を配列番号１０に記載する。
【０１２６】
ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒ
ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞軽鎖ＬＣ***（ｃＤＮＡ構成発現カセット；ＣＭＶ−イントロンＡをもつ）のＨＥＫ２９３（ＥＢＮＡ）細胞中の一時的発現のためのまたはＣＨＯ細胞中の安定な発現のための、発現プラスミドである。
【０１２７】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現カセットのほかに、このベクターは下記を含有する：
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のこのプラスミドの複製を可能とするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
【０１２８】
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***遺伝子の転写単位は下記の要素から構成されている：
−５’末端における制限部位Ｓｓｅ８３８７Ｉ、
−ヒトサイトメガロウイルスからの前初期エンハンサーおよびプロモーター、
−次いでイントロンＡ配列、
−ヒト抗体遺伝子の５’非翻訳領域、
−免疫グロブリン重鎖シグナル配列
−ヒト軽鎖可変性ドメイン（ＶＬ）およびヒトγ１−重鎖コンスタントドメイン（ＣＨ１）の融合物をコードするヒト＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体成熟ＬＣ***鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列をもつ３’非翻訳領域、および
−３’末端における制限部位ＳａｌＩおよびＦｓｅＩ。
【０１２９】
軽鎖**ＶＬ−ＶＨ交換＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒのプラスミド地図を図８に示す。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）を配列番号１１に記載する。
【０１３０】
プラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒは、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡまたはＣＨＯ細胞（２−ベクター系）中への、一時的または安定な共トランスフェクションに使用できる。比較の理由で、この実施例に記載するものと同様にして、野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体をプラスミド４８４２−ｐＵＣ−ＬＣ−ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号２）および４８４３−ｐＵＣ−ＨＣ−ＩＧＦ−１Ｒ（配列番号１）から一時的に発現させた。
【０１３１】
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞中の一時的発現においてより高い発現レベルを達成するために、下記を含有する４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰ発現ベクター中に、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＨＣ***発現カセットをＡｓｃＩおよびＳｇｒＡＩ部位を通して、そして＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＬＣ***発現カセットをＳｓｅ８３８７ＩおよびＦｓｅＩ部位を通して、サブクローニングすることができる：
−ＯｒｉＰ要素、および
−選択可能なマーカーとしてヒグロマイシン耐性遺伝子。
【０１３２】
重鎖および軽鎖の転写単位は共トランスフェクションのために２つの独立４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰベクター（２ベクター系）中にサブクローニングするか、あるいは生ずるベクターを使用する引き続く一時的または安定なトランスフェクションのために１つの共通の４７００−ｐＵＣ−Ｈｙｇ−ＯｒｉＰベクター（１ベクター系）中にクローニングすることができる。基本的ベクター４７００−ｐＵＣ−ＯｒｉＰのプラスミド地図を図９に示す。
【０１３３】
実施例１Ｂ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の発現プラスミドの生産
既知の組換えの方法および技術を使用して、一致する核酸セグメント接続により、野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の交換されたＦａｂ配列を含んでなる＜ＩＧＦ−１Ｒ＞融合遺伝子（ＨＣ***およびＬＣ***融合遺伝子）を組立てた。
【０１３４】
ＩＧＦ−１Ｒ ＨＣ***およびＬＣ***をコードする核酸配列の各々を化学合成により合成し、引き続いてゲネアルト（Ｇｅｎｅａｒｔ）（レーゲンスブルク、ドイツ）においてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。ＩＧＦ−１Ｒ ＨＣ***をコードする発現カセットをＰｖｕＩＩおよびＢｍｇＢＩ制限部位を通してそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中に結合して、最終ベクターｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１Ｒを生成した；それぞれのＩＧＦ−１Ｒ ＬＣ***をコードする発現カセットをＰｖｕＩＩおよびＳａｌＩ制限部位を通してそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中に結合して、最終ベクターｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒを生成した。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的および安定なトランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産により大量のプラスミドを生産した。
【０１３５】
実施例１Ｃ
単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の一時的発現、精製および質量分析による同定の確認
上記されるように、ＨＥＫ２９３−Ｆ懸濁細胞中で、プラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１Ｒの一時的共トランスフェクションにより、組換え＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を発現させた。
【０１３６】
上記されるように、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより、濾過した細胞培養物上清から、発現分泌された単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を精製した。簡単に述べると、一時的トランスフェクションからの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を含有する細胞培養物上清を遠心により清浄化し、濾過し、ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４） と平衡化したプロテインＡ ハイトラップ・マブセレクト・エクストラカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。結合しないタンパク質をＰＢＳ平衡緩衝液、次いで０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．５で洗浄除去し、ＰＢＳで洗浄した。抗体を１００ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ２．８で溶離し、次いで試料を３００μｌの２Ｍ トリス ｐＨ９．０／２ｍｌの画分で直ちに中和した。２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０中のハイロード２６／６０スーパーデックス２００プレプ等級カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のサイズ排除クロマトグラフィーにより、凝集したタンパク質をモノマー抗体から分離し、引き続いてモノマー抗体画分をミリポア・アミコン・ウルトラ−１５遠心濃縮装置で濃縮した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を凍結させ、−２０℃または−８０℃において貯蔵した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の完全性を還元剤の存在および非存在下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、引き続いて上記されるようにクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色した。＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の一価状態は、分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって確認された（図１２）。特性決定した試料を引き続きタンパク質分析および機能的特性決定のために使用した。完全に脱グルコシル化された＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の理論分子量は、ＥＳＩ質量分析により確認された。
【０１３７】
実施例１Ｄ
ＩＧＦ−１Ｒ ＥＣＤ結合ＥＬＩＳＡにおけるおよびビアコアによる単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のＩＧＦ−１Ｒ結合特性の分析
前述したようにＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を使用するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の結合特性を評価した。このために、天然のリーダー配列と、Ｎ末端のＨｉｓ−ストレプトアビジン結合ペプチド−タグ（Ｈｉｓ−ＳＢＰ）に融合したアルファ鎖のヒトＩＧＦ−１ＲエクトドメインのＬＩ−システインに富んだ１２ドメイン（ＭｃＫｅｒｎ他、１９９７；Ｗａｒｄ他、２００１に従う）とを含んでなるＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメイン（残基１〜４６２）を、ｐｃＤＮＡ３ベクター誘導体中にクローニングし、ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞中で一時的に発現させた。ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ−ＳＢＰ ＥＣＤのタンパク質配列を上記に記載する。得られた滴定曲線は、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体が機能的であり、この方法の誤差内にある野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体に匹敵する結合特徴及び動力学を示し、十分に機能的であるように考えられた（図１３）。
【０１３８】
これらの結果は、それぞれの精製した抗体を使用するビアコアによって確証されている。
【０１３９】
実施例１Ｇ
ＩＧＦ−１Ｒを過剰発現するＩ２４細胞を使用するＦＡＣＳによる単一特異性２価＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体のＩＧＦ−１Ｒ結合特性の分析
＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の結合活性を確認するために、Ｉ２４細胞（組換えヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｏｃｈｅ）の表面上で過剰発現されたＩＧＦ−１Ｒに対する結合性をＦＡＣＳにより研究する。簡単に述べると、精製した＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および参照として野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の希釈物と５×１０Ｅ５ Ｉ２４細胞／ＦＡＣＳをインキュベートし、氷上で１時間インキュベートする。結合しない抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄除去する。引き続いて、細胞を遠心（５分、４００ｇ）し、結合した抗体をＦ（ａｂ’）2＜ｈＦｃγ＞ＰＥコンジュゲイト（Ｄｉａｎｏｖａ）により氷上で１時間光から保護して検出する。結合しない検出抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ＋２％ ＦＣＳで洗浄除去する。引き続いて、細胞を遠心（５分、４００ｇ）し、３００〜５００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、そして結合した検出抗体をＦＡＣＳカリブール（Ｃａｌｉｂｕｒ）またはＦＡＣＳカント（Ｃａｎｔｏ）（ＢＤ、ＦＬ２チャンネル、１０，０００細胞／獲得）上で定量する。実験の間、それぞれのアイソタイプ対照を含めて非特異的結合事象を排除する。Ｉ２４細胞上のＩＧＦ−１Ｒに対する＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ／ＣＬ−ＣＨ１交換抗体および野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞参照抗体の結合性を、平均蛍光強度の濃度依存的シフトによって比較する。
【０１４０】
実施例２
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の説明
実施例２Ａ
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体のための発現プラスミドの生産
この実施例に記載するそれぞれのリーダー配列を含む単一特異性２価アンギオポイエチン−２＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の重鎖および軽鎖の可変性ドメインの配列を、ＷＯ２００６／０４５０４９に記載されているヒト＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体の重鎖（配列番号６）および軽鎖（配列番号７）から誘導し、そして重鎖および軽鎖のコンスタントドメインをヒト抗体（Ｃ−カッパおよびＩｇＧ１）から誘導する。
【０１４１】
前の実施例１Ａに記載するベクターに類似するプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２（配列番号６）およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２（配列番号７）中に野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体をクローニングした。比較の理由でかつ共発現実験のために（実施例３参照）、野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体をプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２から一時的に（共）発現させた。
【０１４２】
実施例２Ｂ
単一特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体発現プラスミドの生産
＜ＡＮＧＰＴ２＞ＨＣおよびＬＣをコードする核酸配列の各々を化学合成により合成し、引き続いてゲネアルト（Ｇｅｎｅａｒｔ）（レーゲンスブルク、ドイツ）においてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に基づくｐＧＡ４クローニングベクター中にクローニングした。＜ＡＮＧＰＴ２＞ＨＣをコードする発現カセットをそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中にクローニングして、最終ベクターＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２を生成した；それぞれの＜ＡＮＧＰＴ２＞ＬＣをコードする発現カセットをそれぞれの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド中にクローニングして、最終ベクターＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２を生成した。サブクローニングした核酸配列をＤＮＡ配列決定により確認した。一時的および安定なトランスフェクションのために、形質転換された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ ＡＸ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）からプラスミド生産によってより大量のプラスミドを生産した。
【０１４３】
実施例３
二重特異性２価＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞抗体の発現、ここでＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する重鎖および軽鎖において、コンスタントドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている（ここにおいて＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体と略す）
【０１４４】
実施例３Ａ
二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を生ずるＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞における＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の一時的共発現および精製
一方の側で＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体を通してＩＧＦ−１Ｒを認識し、そして他方の側で＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型Ｆａｂ領域を通して＜ＡＮＧＰＴ２＞を認識する機能的二重特異性抗体を発生させるために、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体をコードする２つの発現プラスミド（実施例１Ａ）を＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体をコードする２つの発現プラスミド（実施例２Ａ）と共発現させた。野生型重鎖ＨＣおよびＶＬ−ＶＨ交換抗体鎖ＨＣ***の統計的会合を仮定すると、これにより二重特異性および２価＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体が発生した。両方の抗体が等しく十分に発現されると仮定し、副産物を考慮しないとすると、これにより３つの主要な生成物、Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体が１：２：１の比で生じたであろう。いくつかの副産物を期待することができる。
しかしながら、ＶＬ−ＶＨドメインだけの交換により、副産物の頻度は、完全なＦａｂクロスオーバーに対して減少したであろう。
＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体は＜ＩＧＦ−１Ｒ＞野生型及び＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体よりも高い発現の一時的発現収量を示すので、＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体プラスミドおよび＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体プラスミドの比は、＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の発現に有利にシフトした。
【０１４５】
主要な産物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の混合物を発生させるために、４つのプラスミドｐＵＣ−ＨＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびｐＵＣ−ＬＣ***−ＩＧＦ−１ＲおよびプラスミドＳＢ０４−ｐＵＣ−ＨＣ−ＡＮＧＰＴ２およびＳＢ０６−ｐＵＣ−ＬＣ−ＡＮＧＰＴ２を、上記した懸濁ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞に一時的に共トランスフェクトした。収集した上清は主要な生成物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の混合物を含有し、「二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物」と表示する。遠心分離によって二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物を含有する細胞培養物上清を収集し、その後、上述されるように精製した。
【０１４６】
抗体混合物の完全性を還元剤の存在および非存在下にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、引き続いて上記されるようにクーマッシー・ブリリアント・ブルーで染色し、サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、期待したように、２種の重鎖および軽鎖が調製物中に存在することを示した（還元ゲル）（図１４）。特性決定した試料を引き続きタンパク質分析および機能的特性決定のために使用した。
【０１４７】
実施例３Ｂ
Ｉ２４ ＩＧＦ−１Ｒ発現細胞上の細胞ＦＡＣＳ架橋アッセイにおける機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の検出
実施例３Ａに記載する一時的共発現からの主要な生成物Ａ）＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、Ｂ）二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体、およびＣ）＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体の精製された二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換混合物中の機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を確認するために、Ｉ２４細胞（組換えヒトＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｒｏｃｈｅ）上で細胞ＦＡＣＳ ＩＧＦ−１Ｒ−ＡＮＧＰＴ２架橋アッセイを実施した。このアッセイを図１０に描写する。精製した抗体混合物中に存在する二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体は、ＩＧＦ−１ＲにＩ２４細胞中でおよび同時にＡＮＧＰＴ２に結合することができ、こうしてその２つのターゲット抗原を２つの対向するＦａｂ領域と架橋させるであろう。
【０１４８】
簡単に述べると、５×１０Ｅ５ Ｉ２４細胞／ＦＡＣＳ管を精製した抗体混合物の全部とインキュベートし、氷上で１時間インキュベートした（滴定１６０μｇ／ｍｌ混合物）。それぞれの精製した抗体の野生型＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜ＡＮＧＰＴ２＞を対照としてＩ２４細胞に適用した。未結合の抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合した二重特異性抗体を５０μｌの２μｇ／ｍＬヒトＡＮＧＰＴ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１時間、氷上で検出した。その後、未結合のＡＮＧＰＴ２を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回または２回洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合したＡＮＧＰＴ２を５０μｌの５μｇ／ｍＬ＜ＡＮＧＰＴ２＞ｍＩｇＧ１−ビオチン抗体（ＢＡＭ０９８１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４５分間、氷上で検出した；あるいは、細胞を５０μｌの５μｌ／ｍＬ ｍＩｇＧ１−ビオチン−アイソタイプ対照（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とともにインキュベートした。未結合の検出抗体を４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出し、細胞を遠心し（４００ｇで５分）、結合した検出抗体を５０μｌの１：４００にしたストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｚｙｍｅｄ）を用いて、４５分間、遮光しながら氷上で検出した。未結合のストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートを４ｍｌの氷冷ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）＋２％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗い出した。次に、細胞を遠心し（４００ｇで５分）し、３００〜５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、結合したストレプトアビジン−ＰＥコンジュゲートをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ（ＦＬ２チャネル、１０，０００細胞／捕捉）上で定量した。実験中、それぞれのアイソタイプ対照は、いずれかの非特異的な結合事象を排除するために含められた。さらに、精製された単一特異性２価ＩｇＧ１抗体＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜ＡＮＧＰＴ２＞を対照として含めた。
【０１４９】
図１５の結果は、野生型抗体（＜ＡＮＧＰＴ２＞野生型抗体）とともにクロスオーバー抗体（＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体）の共発現から精製した抗体クロスオーバー混合物（＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体）とのインキュベーションが、Ｉ２４細胞中のＩＧＦ−１Ｒ、およびＡＮＧＰＴ２に同時に結合することができる機能的二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の存在を指示する
蛍光の有意なシフトを生じ；こうしてその２つの抗原を２つの対向するＦａｂ領域と架橋させることができることを示す。これと対照的に、それぞれの＜ＩＧＦ−１Ｒ＞および＜Ａｎｇ−２＞対照抗体は、ＦＡＣＳ架橋アッセイでは蛍光のシフトを生じなかった。
【０１５０】
これらのデータを一緒にしてみると、それぞれの野生型およびクロスオーバープラスミドによって、機能的二重特異性抗体を生じ得ることを示す。正確な二重特異性抗体の収量は、例えば、ノブ−インツ−ホール技術ならびにジスルフィド安定化を用いて、野生型および修飾したクロスオーバー重鎖の正確なヘテロ二量体化を強いることによって増加し得る（実施例４を参照されたい）。
【０１５１】
実施例４
修飾されたＣＨ３ドメインを有する２価二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の発現（ノブ−インツ−ホール）
二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の収量をさらに改善するために、ノブ−インツ−ホール技術を＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体および野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体に適用し、均一であり、機能的二重特異性抗体調製物を得る。このために、＜ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体の重鎖＊ＨＣ＊のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ交換を有する配列番号８のＣＨ３ドメイン（ノブ）で置換され、野生型＜ＡＮＧＰＴ２＞抗体の重鎖のＣＨ３ドメインはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ交換を有する配列番号９のＣＨ３ドメイン（ホール）で置換されるか、またはその反対である。さらに、ジスルフィドは、安定性及び収量を増加させるために含めることができ、イオン架橋を形成し、ヘテロ二量体化収量を増加させる更なる残基も同様である（ＥＰ１８７０４５９Ａ１）。
【０１５２】
一時的な共発現、および修飾されたＣＨ３ドメインを含む、得られた２価二重特異性＜ＡＮＧＰＴ２−ＩＧＦ−１Ｒ＞ＶＬ−ＶＨ交換抗体（ノブ−インツ−ホール）の精製は、実施例３に記載されるように行われる。
【０１５３】
ヘテロ二量体化の最適化は、例えば、異なるノブ−インツ−ホール技術、例えば、追加のジサルファイド架橋をＣＨ３ドメイン中に導入する、例えば、Ｙ３４９Ｃを「ノブ鎖」中に導入し、そしてＤ３５６Ｃを「ホール鎖」中に導入することにより、および／またはノブ残基のために残基Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ（Ｋ４０９Ｄ）を使用し、そしてホール残基のために残基Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを使用する（ＥＰ１８７０４５９Ａ１に記載されている）ことを組合わせることによって達成することができることに留意すべきである。
【０１５４】
実施例４と同様にして、（上述のＡＮＧＰＴ２重鎖および軽鎖、および該他の標的に指向される抗体のＶＬ−ＶＨ交換重鎖および軽鎖***ＨＣ***およびＬＣ***を用いて、それにより両方の重鎖が「ノブ−インツ−ホール」によって修飾される）ＡＮＧＰＴ２および別の標的抗原に指向され、または（該他の標的及び上記のＩＧＦ−１Ｒ ＶＬ−Ｈ交換重鎖および軽鎖***ＨＣ***およびＬＣ***に指向される抗体の重鎖および軽鎖を用いて、それにより両方の重鎖が「ノブ−インツ−ホール」によって修飾される）ＩＧＦ−１Ｒおよび別の標的に指向される更なる２価二重特異性ＶＬ−ＶＨ交換抗体が調製可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
を含んでなる２価二重特異性抗体であって、ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている２価二重特異性抗体。
【請求項２】
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会い、
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、ここで、変更は下記を特徴とする：
ａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティを第２ ＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されている
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２または３に記載の抗体。
【請求項５】
両方のＣＨ３ドメインが各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによって変更されていることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
両方の重鎖のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３の一方がコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３がコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されており；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する
工程を含んでなる、請求項１に記載の２価二重特異性抗体を生産する方法。
【請求項８】
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター；
−２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている
を含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜６に記載の２価二重特異性抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６に記載の２価二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１】
ａ）第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、および
ｂ）第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、
を含んでなる２価二重特異性抗体であって、ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている２価二重特異性抗体。
【請求項２】
一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインの各々は、抗体のＣＨ３ドメイン間の本来のインターフェイスを含んでなるインターフェイスにおいて出会い、
ここで前記インターフェイスは２価二重特異性抗体の形成を促進するように変更されており、ここで、変更は下記を特徴とする：
ａ）２価二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内のキャビティ中に位置可能な突起を一方の重鎖のＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
一方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されており、そして
ｂ）２価二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイスと出会う第２のＣＨ３ドメインの本来のインターフェイス内において、
アミノ酸残基はより小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換されており、これにより第１のＣＨ３ドメインのインターフェイス内の突起が位置可能であるキャビティを第２ ＣＨ３ドメインのインターフェイス内に発生させるように、
他方の重鎖のＣＨ３ドメインは変更されている
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基がアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）およびバリン（Ｖ）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２または３に記載の抗体。
【請求項５】
両方のＣＨ３ドメインが各ＣＨ３ドメインの対応する位置におけるアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによって変更されていることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
両方の重鎖のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３の一方がコンスタント重鎖ドメインＣＨ１により置換されており、そして他方のコンスタント重鎖ドメインＣＨ３がコンスタント軽鎖ドメインＣＬにより置換されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ａ）下記で宿主細胞を形質転換し、
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
−第２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで、可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されており、
コンスタントドメインＣＬおよびＣＨ１は互いにより置換されており；
ｂ）前記抗体分子の合成を可能とする条件下に宿主細胞を培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する
工程を含んでなる、請求項１に記載の２価二重特異性抗体を生産する方法。
【請求項８】
−第１抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター；
−２抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を含んでなるベクター、
ここで可変性ドメインＶＬおよびＶＨは互いにより置換されている
を含んでなる宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜６に記載の２価二重特異性抗体の組成物、好ましくは医薬組成物または診断組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６に記載の２価二重特異性抗体と、少なくとも１種の薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２０１１−５０６５１０（Ｐ２０１１−５０６５１０Ａ）
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３８４４１（Ｐ２０１０−５３８４４１）
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０７０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０２５２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１６日（２００８．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０７０３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０２５２
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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