Ｂ群連鎖球菌ワクチン
単離されたβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の完全に殺された細胞、及びβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養物の濃縮された抽出物から調合された混合物は、同じ及び他の毒性株のＢ群連鎖球菌による伝染から魚を保護するのに有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ群連鎖球菌による感染から魚をプロテクトする新規のワクチン、及びこれを製造する新規のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ群連鎖球菌は、養殖及び野生の魚の多くの種に厳しい経済的損失を引き起こすＢ群の連鎖球菌バクテリアである。
この伝染性の細菌は、新鮮な水域、塩けのある水域、あるいは海洋性水域で魚が集中的に培養される水産養殖設備において一般的である。
高密度の魚及び水のある環境により、連鎖球菌の疾病の迅速な伝染が促進される。
さらに、感染した養殖の魚は、野生の魚の個体群に病気を感染させるかもしれない。あるいは、感染した野生の魚が、養殖の魚にその病気を感染させるかもしれない。
【０００３】
従来、様々な連鎖球菌及び腸球菌種に対して、腹腔内あるいは筋肉注射のいずれかに基づいた戦略を利用したワクチンが開発されている。
いくつかの注射可能なワクチンが連鎖球菌感染症の予防のために開発されているが、これらのワクチンの多くは製剤として異なる。
ホルマリンでストレプトコッカス−イニエ（Ｓ．ｉｎｉａｅ）を殺菌したワクチンを腹腔内へ（ＩＰ）ワクチン接種した後のニジマスのプロテクトについては、エルダーらによって報告された（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ， Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９７； ５６： １７５−１８３）（非特許文献１を参照）。
クレシウスらは、殺菌したホール・セルと濃縮された細胞外組成物からなる、修正されたＳ．ｉｎｉａｅワクチンを開発した［Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ １９９９； １９（１ ）： ３８−４１ ； ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２０００； １８８（３−４）： ２３７−２４６］（非特許文献２、３を参照）。
免疫化された２５ｇのティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）の相対パーセント生存率（ＲＰＳ）は９５．３、１００ｇのティラピアのＲＰＳ値は８４．２から９４であった。
カレイ（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）は、トキソイドを豊富にした細菌を使用したワクチン接種により腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からプロテクトされた［Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ， Ｊ Ａｐｐｌ ｌｃｈｔｈｙｏｌ １９９９； １５： １５３−１５８； Ｌｏｎｇ− ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｒｂｏｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｏｘｏｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｎ， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ， １９９６； １６（５）： １６９−１７１ ； ａｎｄ Ｔｏｒａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ １９９５； １３４： １７−２７］（非特許文献４、５、６を参照）。
トキソイドを豊富にした細菌ワクチンは、ホルマリンで殺菌された２つの単離された腸球菌種及びそれらの培養液の組み合わせだった。
フロイント不完全アジュバント中のホルマリンで殺菌したストレプトコッカスで免疫化されたニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）はストレプトコッカスからプロテクトされたのにかかわらず、槽没入によって免疫化されたマスはプロテクトされなかった［Ａｋｈｌａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ （ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ １９９６年； １９： ２５１− ２５８］（非特許文献７を参照）。
最近、中西ら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｓｈ： Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， Ｖａｃｃｉｎｅ ２００２； ２０： ３７６４−３７６９）は、ホルマリンで殺菌したＳ．ｉｎｉａｅのワクチンに皮膚を刺した若いニジマスを浸すことでプロテクトされることを実証し、それはＩＰ注入によって得られたものに匹敵した（非特許文献８を参照）。
【０００４】
エルダーらは、ホルマリンで殺菌した連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から調整された注射可能なワクチンの調製について開示した。
このワクチンはティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ種）をＳ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してプロテクトするチャレンジとして報告された［Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ− ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｉｌａｐｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ １９９５； １３（９）： ８６７−８７０； ａｎｄ Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ： Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ； Ｆｉｓｈ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．， Ｖｏｌ． ９０ （Ｌｉｉｅｈａｕｇ， Ｇ．， Ｍｉｄｌｙｎｇ， ＰＪ ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｆ． ｅｄｓ．） Ｋａｒｇｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， ｐｐ． １５３−１６０， １９９７］（非特許文献９、１０を参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ”， Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，， １９９７， ５６，， Ｐ．１７５−１８３．
【非特許文献２】Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ ｛Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）”， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ，， １９９９， １９， １， ｐ． ３８−４１．
【非特許文献３】Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）”， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，， ２０００， １８８， ３−４， ｐ． ２３７−２４６．
【非特許文献４】Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ”， Ｊ Ａｐｐｌ ｌｃｈｔｈｙｏｌ，， １９９９， １５，， ｐ． １５３−１５８．
【非特許文献５】Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｒｂｏｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｏｘｏｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｎ”， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ，， １９９６， １６， ５， ｐ． １６９−１７１．
【非特許文献６】Ｔｏｒａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ”， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，， １９９５， １３４， ｐ． １７−２７．
【非特許文献７】Ａｋｈｌａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ （ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）”， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ，， １９９６， １９，， ｐ． ２５１−２５８．
【非特許文献８】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｓｈ： Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ”， Ｖａｃｃｉｎｅ，， ２００２， ２０，， ｐ． ３７６４−３７６９．
【非特許文献９】Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ− ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｉｌａｐｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ”， Ｖａｃｃｉｎｅ，， １９９５， １３， ９， ｐ． ８６７−８７０．
【非特許文献１０】Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ： Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”， Ｆｉｓｈ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．， Ｖｏｌ． ９０ （Ｌｉｉｅｈａｕｇ， Ｇ．， Ｍｉｄｌｙｎｇ， ＰＪ ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｆ． ｅｄｓ．） Ｋａｒｇｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， １９９７， ｐ． １５３−１６０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
その後の調査報告では、しかしながら、バンダムらは、エルダーらによって報告されたＳ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、実際には非溶血性の、Ｂ群連鎖球菌、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであったことを提案した（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｓ ａ ｎｏｎｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ Ｂ， ｔｙｐｅ Ｉｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， ｌｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １９９７； ４７（１）： ８１−８５）。
確かに、以前に報告された元々種が確認されていないか誤って分類された魚の単離された連鎖球菌の多くは、より最近、非溶血性のＢ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）であると特徴づけられた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は今、魚、特にティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）、及びＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に弱い魚の他の種について、Ｂ群連鎖球菌の抑制に効果的で安全な新規ワクチンを発見した。
ワクチンは、１つ以上のβ溶血性の単離されたＢ群連鎖球菌である完全な（ホール・セル）殺菌された細胞、及びβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの濃縮エキスを含む。
ワクチン組成物は、同じ又は他の毒性株のＢ群連鎖球菌（つまり、ワクチンを準備するために使用される単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅが異なる）による感染からの魚のプロテクトに有効である。
この発見に従って、本発明は、新規の非常にプロテクト効果の高い、魚用のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対するワクチンを提供することを対象とする。
本発明は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされた魚の集団の動物流行病を防ぐのに有効なワクチンを提供することをもう一つの対象とする。
さらに、本発明は、注射か槽没入によって処理されてもよいＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する効果的なワクチンを提供することをもう一つの対象とする。
さらに、本発明は、有効性を増加させた単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する単価及び多価ワクチンの両方を提供することをもう一つの対象とする。
本発明は、魚のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に対するワクチンの準備に使用されてもよい、魚からのβ溶血性の新規の単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅを提供することを追加の対象とする。
本発明のいっそうさらなる対象は、ティラピア、シマスズキ及び他の魚類の生存度及び生産力を改善し、その上にＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる経済的損失を縮小することである。
発明の他の対象及び利点は、確実な記述から容易に明白となるだろう。
【０００８】
（生体試料の寄託）
β溶血性で、莢膜を作る能力がある脳から単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＡＲＳ−ＫＵ−３ Ｂ及びＡＲＳ−ＫＵ−１１ Ｂ）は、２００２年７月１７日に、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５、ピオリア、イリノイ州 ６１６０４にある農業研究事業団微生物株保存機関にブダペスト条約の条件の下で預けられ、それぞれ、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７の寄託許可番号を割り当てられた。
ここに使用されるように、Ｂ群連鎖球菌は認められた種を指す。エヴァンスら（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔｕｓ Ｌ．， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００２； ２５：５０５−５１３。その目次は参照によってここに組込まれる）によって、これらの特数が記述され、他の参考菌株が米国培養菌保存施設（マナッサス、ヴァージニア州、アメリカ）に預けられた。
【０００９】
ここに使用されるように、「ワクチン」は、ワクチンを接種された動物の防御免疫応答を刺激することができる接種する形態の任意のタイプの生物学的因子を参照するために、その広い意味で定義されている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、１つ以上の単離されたβ溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅについて殺菌された完全な（ホール・セル）細胞形態と、β溶血性の同じか異なる単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの培養液からの濃縮エキスとの組み合わせからなる新規ワクチンを提供する。
このワクチンは、このワクチンの調製で使用されるものとは異なる株を含むＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの任意の株による魚の感染をコントロールすることに効果的である。
さらに、このワクチンは、莢膜を作る能力がある株と莢膜を作る能力がない株と同様に、β溶血性と非溶血性の株による感染をコントロールすることに効果的である。
しかしながら、このワクチンは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのβ溶血性の株による感染に対する魚のプロテクト反応を誘発するのに特に効果的である。
【００１１】
本発明のワクチンは、これで処理された場合、様々な魚のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染をコントロールするのに有効である。
また、ワクチン接種により、処理された魚の行動及び形態の異常は著しく減少する。
このワクチンは、それに制限されてはおらず、ゴールデンシャイナー、ヒメハヤ（ｂｕｌｌｍｉｎｎｏｗ）、アミキリ、ガルフ・メンハーデン（にしん科の魚、ｇｕｌｆ ｍｅｎｈａｄｅｎ）、ハマギギ、ボラ、ピンフィッシュ、アトランティック・クローカー（大西洋産のニベ科の魚、Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｒｏａｋｅｒ）、スポット、ニベ、ブチナマズ、ニジマス、ウナギ、シマスズキとそれらの雑種、ハタ、鯛、カレイ及びティラピアを含む国内または外来の魚の処理には特に有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ワクチンの調製に使用されたβ溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの特別の株は決定的ではく、莢膜を作る能力があるか莢膜を作る能力がない、どの単離されたβ溶血性のＢ群連鎖球菌でもここで適切に使用できる。
適切なＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、エヴァンスらによって記述されたもの（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔｕｓ Ｌ．， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００２； ２５：５０５− ５１３。その目次は参照によってここに組込まれる）に似ている従来技術と集積（豊富化する）技術を用いて、感染した魚のような環境又は自然のソースから、あるいは、以前に単離された実質上の純系の株から、単離されてもよい。
好適な株は、莢膜を作る能力があるもの、特に前述の株、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７を特に含んでいる。
単価・多価ワクチンの両方で有効性が示されているが、β溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの１つより多い株を使用して準備された多価のシステムは、種間に存在するかもしれない、提示される抗原の不均一性により好適である。
【００１３】
この独創的なワクチンは殺菌した細胞製剤か細菌ワクチンである。それはまた、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの培養液の細胞外の濾化された溶液（細胞の入っていない培養液）の濃縮された分画を含んでいる。
そのため、濃縮分画は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞、細胞壁断片及び細胞内のコンポーネントを実質上含んでいない。
細胞は濃縮分画から取り除かれるが、熟練した技術者は比較的少量の細胞内の生成物及び細胞壁断片が培養の最中に生じる正常な細胞の溶菌の結果存在してもよいことを認識するだろう。
特に好適な実施の形態において、低分子量の細胞外のコンポーネント（同様に、任意の低分子量の細胞内のコンポーネント）、好適なのは約１ ｋＤａ（キロ・ダルトン）未満の分子量があるもの、より好適なのは、２ｋＤａ未満の分子量があるもの、そして最も好適なのは、約３ ｋＤａ未満の 分子量があるものが、濃縮画分から取り除かれる。
理論に結び付けられていないが、殺されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞外生産物の様々な低分子量成分は、細菌ワクチン懸濁液の抗原性に際して妨害作用があると信じられている。
細胞外の濃縮水の濃度及びろ過は事実上これらの抑制コンポーネントを除去するので、したがってワクチンの有効性を向上させる。
加えて、細胞外生産物は、莢膜からの抗原あるいは分泌された／排泄された抗原、及び優れた免疫化応答を提供する他の有益な分子を含むと考えられる。
【００１４】
ワクチンの準備用の細菌の増殖は、任意の従来の条件の下で、及びその成長を促進する培地での培養によって達成されてもよい。
様々な従来の固体又は液体メディアはここで使用するのに対しふさわしいかもしれないが、液体培地での増殖は大規模生産のために特に好適である。
そのほかに制限されておらず、追加の栄養素は莢膜（多糖）生産を高めるために付け加えられてもよいが、従来のＴＳＢ培地（トリプシン大豆培養液、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）は好適である。
例えば、グルコースのような糖の追加は多糖生産を高めるかもしれない。
ワクチンの生産は、５〜７日間２５°Ｃで発酵中に培養ｐＨを調節せずに、選択された単離物の静置培養によって行なわれてもよい。
５〜７日の延長された発酵時間によって飢餓状態のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、また、結果として生ずるワクチンの効能を増強すると考えられており、したがって好適である。
この培地で準備されたワクチンの最終ｐＨ値は、ｐＨ６．５〜７．４まで変動してもよい。
ワクチン調製の塩分は、好ましくは塩（ＹＳＩ社、イエロースプリングズ、オハイオ州）１０００当たり３．６−４．０部（ｐｐｔ）の範囲にある。また、特に槽免疫化方法によって処理された場合に、この特性はまたワクチンの有効性を増強するかもしれないと信じられている。
そのほかに制限されておらず、臨床屈折計（Ａｔａｇｏ Ａ３００ＣＬ、ヴィー・ジー・サイエンティフィック社、カークランド、ワシントン州）で測定されたワクチン（例２に記述されるように製造された）は、血清蛋白質（ｇ／１００ｍｌ）スケールで１．３３８４〜１．３３８７であり；５８９ナノメーター（ｎｍ）の尿比重（ＵＧ）スケール及び屈折率（ｎＤ）で１．０１５〜１．０１６である、１．０〜１．２である。
５４０ｎｍ（可視−紫外分光光度計 、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｕｎｉｃａｍ、ケンブリッジ、英国）のワクチンの吸光度（ＯＤ）は、０．８８７〜０．９３９の範囲にある。
通気は一般に好適ではない。
それの使用が最終的なワクチン製品に、動物の生成物及び病原菌が存在する危険をなくすので、すべての、植物に基づいた発酵培地もここでは用いることが好適である。
それらの増殖と回収に続いて、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞は、化学的及び／または物理的に有効な殺菌処理（つまり、不活性化）にさらされる。
【００１５】
細胞を溶解せずに、及び細胞が動物の抗体反応を誘発する能力を保持したまま、生細胞の９９．９％以上を殺す、細胞を殺す有効な処理を以下で明らかにする。
このように、この処理では、事実上未処理の細胞に比べて殺された細胞表面抗原の特異性を変えるべきでない。
すべての生菌の１００％を死滅させる処理法は典型的には好適かもしれないが、熟練した技術者は１００％の細胞の死が必ずしも、容易に得られるとは限らないかもしれないことを認識するだろう。
好適な実施の形態において、死滅した、完全なＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、ホルマリンで生菌の処理を行うことで準備される。
あるいは、パーディらによってパスツレラｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ細菌ワクチンの調合のために記述されたようなＵＶ照射（米国特許６，３０３，１３０番公報）によって、細胞を死滅させてもよい。
また、様々な他の技術、殺菌した細胞のワクチン（つまり細菌ワクチン）の調製のための構想を描かれ記述されたものは、ここでに使用するのに好適である。および、これには、アルコール、特にエタノールまたはイソプロピルアルコールのような脂肪族アルコール、フェノール、トリクレゾール、ホルマリン、ホルムアルデヒド、アセトン、チメロサール（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）、β−ラクトン、または蛋白質変性（例えば１時間の５６°Ｃ）を引き起こさない温度で中熱を加える処理が含まれているが、これに制限されていない。
処理時間と条件は、もちろん選択された特定の方法に応じて変わり、日常の試験によって容易に決定されてもよい。
【００１６】
好適な実施の形態では、発酵容器のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、１００％の細胞を死滅させるために十分な時間、ホルマリンに晒される。
典型的には、ホルマリン濃度は、約１％から約５％（ｖ／ｖ）まで、好ましくは約１％から約３％（ｖ／ｖ）まで変動するだろう。
【００１７】
１００％の殺菌を達成する特定のホルマリン濃度に対しふさわしい暴露時間は、処理の時間とパーセント殺菌率の死の原因となる死滅曲線から容易に決定されてもよい。
発酵に続いて、細胞の高濃度懸濁液を得るために、細胞は、例えばろ過または遠心分離によって濃縮される。また、細胞のペレット及び発酵培養液が分離される。
分離された細胞は、ワクチンの最初のコンポーネントとして使用するために保持されてもよい。
その後、濃縮エキスを生産し、かつ前述の低い分子量の細胞外コンポーネントを好適に除去するために、濾液は、それ自体、無細胞の培養液の形で、もう一つの濃縮工程にさらされる。
様々な濾過システムは異なる分子量カットオフの下で、この好適な実施の形態で使用するにふさわしい。
好適なフィルタは、およそ分子量カットオフが１ ｋＤａ（キロ・ダルトン）であるものと、約１ｋＤａより大きな分子量がある培養液からの細胞外生産物を含む濃縮エキスを生産するものを含んでいる。
およそ２ｋＤａの分子量カットオフがあるフィルタに使用するのがより好適であり、特に好ましいのがおよそ３ｋＤａのカットオフがあるものと共に用いることである。これにより、培養液から、それぞれ、約２及び３ｋＤａより大きな分子量の細胞外生産物を含む濃縮された抽出物を生産する。
１つの好適な実施の形態では、無細胞の培養液はミリポア・ポロフラックスＭ１２（ビレリカ、マサチューセッツ）を使用した３ｋＤａアミコン・カラム（Ｓ３Ｙ３）の使用によって濃縮される。
どんな濾過システムにおいても、濃縮液を再懸濁するために水を加えて、分離を実行し完了してもよい。
特に好適な実施の形態では、濃縮液のボリューム（体積）において５倍の縮小があるまで、分離が行なわれてもよい。
これは濃縮液の中に適切な水を残すことで、以前に保持された細胞ペレットの懸濁液が濃縮液（つまり、濃縮エキス）と再配合で容易に生じるようにする。
便宜上、死滅した細胞及び濃縮エキスは、同じ培養液から典型的に準備されるだろうことを、それは予見させる。
しかしながら、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの同じか異なる株の異なる培養液からそれらが準備されていてもよいことが認識されている。
【００１８】
適切な比率は当業者によって決定されてもよいが、典型的な範囲として見られるのは５：１（体積／体積）から２０：１（体積／体積）で、好適なのはオリジナルの発酵された無細胞の培養液のうち１０：１（体積／体積）｛つまり、濃縮培養液（濃縮液）の体積と無細胞の培養液の原体積の比率｝である。
濃縮された無細胞の培養液は、０．２２ Ｆｍ １Ｉの微生物用のフィルタ（コーミング、コーニング、ニューヨーク）で滅菌される。
１６ｍｌのホルマリン殺菌した細胞に、１０００ｍｌの滅菌された無細胞の濃縮された発酵液を加える。
【００１９】
濃縮液の細胞ペレットの再懸濁液に続いて、殺菌されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、魚にとって免疫学的に有効な量の製剤あるいは投薬量によって投与のために準備される。
投与量は、単に再懸濁された殺菌された細胞を含んでいる濃縮液として与えられてもよいし、あるいは、薬学的に許容できるキャリアー及び、既知の技術であるアジュバントをさらに含んでいてもよい。
免疫学的に有効な量あるいは投薬量とは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの毒性株と後のチャレンジに対する処理された魚の完全な免疫、あるいは相対免疫（防御免疫応答を誘発する）を引き起こすその量であるとして、ここに定義される。
集団（感染した魚の数の減少あるいは感染の重症度の減少によって証拠づけられた）のためのプロテクトのレベルが、ワクチン接種をしていない対照群より著しく高い（少なくとも８０％の信頼水準で測定され、好適には９５％の信頼水準で測定された）ときに、処理された動物の集団に免疫が誘発されたと見なされる。
型通りの実験による技術に熟練している技術者は、適切な有効量を容易に決定することができる。
典型的には、ワクチンは、バス・メディウムの少なくとも１×１０8細胞のＳ．ａｇａｌａｃｃｔｉａｅ／ｍｌを含み、好適には、バス・メディウム用の溶液の４×１０9細胞のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ／ｍｌを含む。
ＩＰ注射ルーチンについては、魚の寸法によって、魚の中の好適な投与量は約０．１〜０．２ｍｌの上記の量になるだろう。
より大量の細胞で処理されてもよいが、そのような高いレベルを使用するのは、一般に非実用的であると考えられる。
【００２０】
殺菌された細胞は、水、生理食塩水、鉱油、植物油、水性のカルボキシルメチルセルロースナトリウムあるいは水性のポリビニルピロリドンのような薬学的に許容できるキャリアーの製剤によって投与のために調製される。
従来の技術のように、ワクチン製剤はまた任意のアジュバント、抗菌剤あるいは他の薬学的に活性のある薬剤を含んでいてもよい。
上述のものに制限されておらず、適切なアジュバントは、鉱油、植物油、ミョウバン、及びフロイント不完全アジュバントを含んでいるが、これに制限されていない。
なお、他の好適なアジュバントは、生物学的適合性のあるマトリクス物質の微粒子あるいはビーズを含んでいる。
従来の技術のように、微粒子は、アガーとポリアクリラートを含むが、これに限定されない任意の生物学的適合性のあるマトリクス物質から構成されていてもよい。
技術に熟練している技術者は、他のキャリアーあるいはアジュバントが同様に使用されてもよいことを認識するだろう。
例えば、使用されてもよい他のアジュバントはウェッブとウィンケルシュタインによって記述される［ｉｎ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， （ロスアルトス、カリフォルニア州）、１９８４年、２８２−２８５ページ］、その目次は、参照によってここに組込まれる。
【００２１】
好適な実施の形態に従って、対象動物に抗原原料の接触を延長し、かつ従って感染防御免疫の期間を増加させるために、殺菌した細胞は、微粒子かマイクロカプセルに組み入れられてもよい。
微粒子とカプセルは従来の技術によるテクニックを使用して、様々なよく知られている不活性の生物学的適合性のあるマトリクス物質から形成されてもよい。
そのほかに制限されておらず、適切なマトリクス物質は、自然か合成高分子を含んでおり、それらはアルギン、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、無水重合物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリ・オルソ・エステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、塩化スルホ化されたポリオレフィン、ポリエチレンオキシド及び特にアガランド・ポリアクリラートのようなものである。
ここに使用されてもよい微粒子あるいはカプセル化の中への原料の取り込みに対する技術の手本は、スパークス［Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ， Ｉｎ： Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８１）， ｖｏｌｕｍｅ １５， ｐａｇｅｓ ４７０−４９３］、キノニウス［［ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｔｈｅｏｒｉｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ， １９８０］、 ゴンボッツら［米国特許公報５，０１９，４００号］、ベック［米国特許公報４，９１９，９２９号］によって記述され、各々の中身は、参照によってここに組込まれる。
【００２２】
本発明の実施の形態に係るワクチンにより、細胞が腹腔内か筋肉注射、槽没入、経口投与あるいは鼻の投与によってのように免疫学的応答を誘発することを可能にするあらゆる都合のよいルートによって対象動物を処理してもよい。
しかしながら、腹腔内注射あるいは槽没入は主要な免疫化には好適である。その一方で、必要なとき、経口免疫は副次的または追加免疫には好適である。
また、魚の表面は、動物の免疫系にワクチンの接触を容易にするために槽没入に先立って、あるいはその没入中に、中西らによって記述されたように、刺されるか（２００２年、ｉｂｉｄ）、又擦りむくか、わずかに表面を洗われる。
ワクチンは単回投与、あるいは複数投与分の投与をされてもよい。
飼育する条件に依存するので、ワクチンは複数回投与で処理されてもよい。そのタイミングは、熟練した技工によって容易に決定されてもよい。
【００２３】
槽没入免疫化によるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染に対するワクチン接種には、他の免疫化のルートに比べていくつかの長所をファーする。
これらの利点の中には、免疫化した魚あたりのコストが低く、多くの魚の一斉ワクチン接種が可能、ストレスの削減、著しく高い魚の生存率、及びワクチン接種の副作用がないというものがある。
更に、槽没入ワクチン接種は、皮を刺すか注射ができない、より小さな魚の集団ワクチン接種のための有効な方法である。
あるいは、市販の魚ワクチンの腹腔内注射は、免疫化された魚あたりの高いコスト及び魚にストレスを与えるにもかかわらず、この信頼性及び高い有効性により鮮魚用か海洋性水産養殖の養殖場で一般的に使用されている。
【００２４】
以下で述べる実施例は、単により発明を説明するように意図され、請求項によって定義される発明の範囲を制限するように意図されることはない。
【００２５】
＜実施例１＞
クレシウスらによって以前に開発されたＳ．ｉｎｉａｅワクチンを、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する有効性のために評価した。
その結果、ワクチンはプロテクト効果がなかった。
【００２６】
（材料と方法）
ティラピアは、ＡＲＳ、ＵＳＤＡ、水生動物健康研究所（Ａｑｕａｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オーバーン、アラバマ州）で維持されていたストックを用いた。
５匹について平均重量３０ｇのティラピアが、実験に先立って１０日間、０．５ｌ／ｈのフローを通じて塩素を除かれた水が供給される、５７ Ｉガラス養魚器の環境に慣らされた。
明暗の間隔は１２時間である：
１２時間はメンテナンスされ、通気がエア・ストーンによって供給された。
魚には、飽満にＡＱＵＡＭＡＸ ＧＲＯＷＥＲ ４００（ブレントウッド、ミズーリ州）が毎日与えられた。
水質は、温度及び塩分と共に溶存酸素について、ＹＳＩ ８５酸素伝導性、塩分、及び温度メーター（イエロー・スプリング・インストルメント社、イエロースプリングズ、オハイオ州）を使用して毎日、測定された。
日々の水温は平均２６．３±０．０３℃となった。また、平均の日々の溶存酸素は５．９５±０．０６ｍｇ／ｌだった。
魚がＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ未感染である状態を確認するために、サンプルを取得し、脳と腎臓へイノキュレーション・ループを入れることにより細菌培養をした。
サンプルは、羊血液寒天培地上に直接ストリークされ、２４〜４８時間２７℃で培養された。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは５匹の無作為に選択された魚から単離されなかった。
【００２７】
（ワクチン調製）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチンの調製は以前に記述された（Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ， １９９９； １９（１ ）： ３８−４１．１９９９）。
手短かに言えば、ワクチンは、トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）でストレプトコッカス−イニエ単離物（ＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４及びＮＲＲＬ Ｂ−３０２３８）の別々の培養液として準備され、７２時間２７°Ｃで振盪機（７０ ＲＰＭ）ウォーターバスで培養された。
３％の最終的な濃度を得るために、培養液は１０％の中性緩衝ホルマリンにより２４時間２７°Ｃで処理された。
ホルマリンで処理された培養液は、３０分間７０００ ｘ ｇで遠心分離され、細胞ペレット及び培養液が分離した。
細胞が取り除かれた培養液は、より低い分子量のコンポーネントをすべて除去するために２ｋＤａの中空糸濃縮装置を使用し、２０倍に濃縮された。
その後、この２ｋＤａ培養液の濃縮液は１０：１のＶ／Ｖで細胞ペレットを再懸濁するために使用された。
ワクチンの最終的な濃度は４ ｘ １０9 ＣＦＵ／ｍｌだった。
バクテリアの濃度は、ホルマリンによって殺菌する前にワクチンの吸光度をとることにより推定した。
ＣＦＵ／ｍｌの実数は、スパイラル・オートプレーター・アンド・キューカウント（スパイラル・バイオテック社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用して測定された。
ワクチン化しないものは、濃縮トリプシンの大豆培養液（ＴＳＢ）のみ注入された。
ワクチン細胞は７２時間で羊血液寒天培地の栄養因子の不足によって死滅させられることがわかった。
【００２８】
（ワクチン接種プロトコル）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチンがＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（試験１）に対してプロテクト可能だったかどうか判断するために、平均重量３０ｇの２００匹のティラピアを、２０匹づつの１０個のタンクに、免疫にならなかったコントロール（表１）を含めて分割された。
５つのティラピアのレプリケート・タンク（重複測定用・複製漕）をコントロールとして用いた。
Ｓ．ｉｎｉａｅ ＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４、あるいはＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４とＮＲＲＬ Ｂ−３０２３８を組み合わせたワクチンは、ティラピアの腹腔内に０．１ｍｌのボリュームで注入された。
コントロールのティラピアは０．１ｍｌのＴＳＢを注入された。
免疫化されたものとコントロールのティラピアは、チャレンジの前に３０日間保持された。
ティラピアは、チャレンジ後１４日間、死亡率をモニタリングされた。
【００２９】
実験によるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジ及び細菌学的なサンプルコレクション、及び評価は、元々は野生のクランジンジェリ（Ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ）ボラ（ライザ・クランジンジェリ（デイ））の自然な連鎖球菌の疾病のものから単離されたＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７単離物のＢ群連鎖球菌を使用して魚を感染させて行った。
単離物は標準の分析法によってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された。
ＡＲＳ−ＫＵ−１１ Ｂ（ナショナル・アグリカルチュアル・リサーチ・コレクション、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７）と名付けられたボラ（ライザ・クランジンジェリ）から単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、２７°Ｃで２４時間トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ、ディフコ・ラボラトリーズ社、スパークス、メリーランド州）において培養され、次に、０．２ｍｌずつ分注し−７０℃で凍結された。
この研究で使用される伝染性の単離物は、冷凍の単離物のアリクォートを溶かしたものを入れたＴＳＢの接種を行うことにより準備された。
その後、魚は１００μｌの Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのＩＰ注射によって、２．６ ｘ １０5 ＣＦＵ／ｍｌでチャレンジされた。
死んだ魚は１日２回取り除かれ、また、死んだ魚の解剖では、標本は脳、前部の腎臓及び腸から無菌的に得られた。
標本は、２４〜４８時間、２７℃の羊血液寒天培地上に直接培養された。
ベータ溶血性で、カタラーゼ・ネガティブ、グラム染色でポジティブな球菌コロニーは、羊血液寒天培地上にサブカルチャー、その後細菌学上サブ培養され、エヴァンスらによって記述されたテストにより、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると生化学的に確認された（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｍｓ ａｕｒａｔｕｓ （Ｌ．） ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ， ２００２； ２５： ５０５−５１３）、ここに参照によって組込まれる。
テストはすべてレメル（登録商標）（レネクサ、カンザス州）から購入された培地を使用して、２７°Ｃで行なわれた。
【００３０】
各試験について、ワクチン接種したティラピアとワクチン接種しなかったものの平均パーセント死亡率及び平均パーセント累積死亡率を、１４日期間の間求めた。
ワクチンの有効性は、アメンドの手法（１９８１年）に従って相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）として計算された。
【００３１】
（統計分析）
処理タンクの無作為化はゴメスとゴメスによって記述されたブロック計画を使用して行なわれた。
データはすべて正規性の統計仮定が破られなかったことを保証するために検討された。
統計的分析はすべてスタチスティカル・アナリティカル・システムズ（ＳＡＳ）（登録商標）（ＳＡＳインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州、１９９７年）を使用して行われた。
レプリケート・タンクが使用された場合、処理グループ（ワクチン接種したものとコントロール）、及びこれらの処理グループのレプリケート（タンク）間の累積的な死亡率の有意差（Ｐ＜０．０５）を検出するために、一般的な線形モデル（ＧＬＭ）プロトコロルが使用された。
有意差はＰ＜０．０５の＿標準誤差で決定された。
【００３２】
（結果）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチン調合剤はＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染からティラピアをプロテクトしなかった。
ワクチン接種されたＳ．ｉｎｉａｅ及びワクチン接種されていないＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジに伴うティラピアの平均のパーセント死亡率およびＲＰＳは、表１に示される。
Ｓ．ｉｎｉａｅのＩＰで免疫になり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７単離物でチャレンジされたたティラピアは、ＲＰＳが０であった。すなわち、Ｓ．ｉｎｉａｅのワクチン接種されたティラピアは、１００％、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに感染するようになった。
ワクチン接種したものとワクチン接種しないものの間で、死亡率の有意差は示されなかった。
ワクチン接種したものの死亡率は、すぐに、ワクチン注射しないものの死亡率より高くなった（図１）。
それぞれ、１日と２日で、Ｓ．ｉｎｉａｅでワクチン接種されたものとワクチン接種されていないティラピアで死亡率が記録され始めた。
１００パーセントの累積的な死亡率に達したのは、ワクチン接種しなかったものは１１日であったのに比較して、Ｓ．ｉｎｉａｅワクチン接種したものは４日だった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
＜実施例２＞
本発明のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する有効性のために評価された。
実施例１のＳ．ｉｎｉａｅワクチンとは対照的に、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンはプロテクト可能である。
【００３５】
（材料と方法）
（ティラピア）
ティラピアは、ＡＲＳ、ＵＳＤＡ、水生動物健康研究所（Ａｑｕａｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オーバーン、アラバマ州）で維持されていたストックを用いた。
５匹について平均重量３０ｇのティラピアが、実験に先立って１０日間、０．５ｌ／ｈのフローを通じて塩素を除かれた水が供給される、５７ Ｉガラス養魚器の環境に慣らされた。
明暗の間隔は１２時間である： １２時間はメンテナンスされ、通気がエア・ストーンによって供給された。
魚には、飽満にＡＱＵＡＭＡＸ ＧＲＯＷＥＲ ４００（ブレントウッド、ミズーリ州）が毎日与えられた。
水質は、温度及び塩分と共に溶存酸素について、ＹＳＩ ８５酸素伝導性、塩分、及び温度メーター（イエロー・スプリング・インストルメント社、イエロースプリングズ、オハイオ州）を使用して毎日、測定された。
すべての試験で、日々の水温は平均３１．６８±０．０８℃または２６．３±０．０３℃となった。また、平均の日々の溶存酸素は５．９５±０．０６ｍｇ／ｌだった。
魚がＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ未感染である状態を確認するために、サンプルを取得し、脳と腎臓へイノキュレーション・ループを入れることにより細菌培養をした。
サンプルは、羊血液寒天培地上に直接ストリークされ、２４〜４８時間２７℃で培養された。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは５匹の無作為に選択された魚から単離されなかった。
【００３６】
（ワクチン調製）
ワクチンは、トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）で Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物（ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７）の別々の培養液として準備され、７２〜１２５時間２７°Ｃで振盪機（７０ ＲＰＭ）ウォーターバスで培養された。
３％の最終的な濃度を得るために、培養液は１０％の中性緩衝ホルマリンにより２４時間で処理された。
ホルマリンで処理された培養液は、３０分間７，０００ ｘ ｇで遠心分離機にかけられた。また、細胞ペレットおよび培養液は分離した。
無細胞の培養液はミリポア・プロフラックスＭ１２（ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して、３ ｋＤａアミコン・カラム（Ｓ３Ｙ３）で５倍に濃縮された。
濃縮された無細胞の培養液は、０．２２ Ｆｍ １Ｉの微生物用のフィルタ（コーミング、コーニング、ニューヨーク）で滅菌される。
１６ｍｌのホルマリンで殺菌された細胞は、濃縮され、滅菌された無細胞の培養液１ ｌに加えられた。
ワクチンの５４０ｎｍ光学濃度は１．９だった。
最終のワクチン調製でのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの数は４×１０9であると推測された。
バクテリアの濃度は、ホルマリンによって殺す前にワクチンの光学濃度をとることにより評価された。
ＣＦＵ／ｍｌの実数は、スパイラル・オートプレーター・アンド・キューカウント（スパイラル・バイオテック社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用して測定された。
ワクチン接種しなかったものは濃縮トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）のみ注入した。
ワクチン細胞は７２時間で羊血液寒天培地の栄養因子の不足によって死滅させられることがわかった。
【００３７】
（ワクチン接種プロトコル）
（腹腔内投与）
３つのＩＰ Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン試験（試験２−４）が行われた。
試験２のためには、４０匹の５ｇのティラピアが、２０匹づつの２つのグループに分割された。
試験３のためには、２００匹の３０ｇのティラピアが、２０匹づつ１０個のタンクに分割された。
ティラピアの５つのレプリケート・タンクがコントロールとして用いられた。
試験４のためには、１６０匹の３０ｇのティラピアが、１つのグループ当たり２６〜２７匹の魚の６つのグループ（免疫化しないコントロールおよびワクチン接種したものの３つのレプリケート・タンク）に分割された。
試験２および４は３２°Ｃで行われた。また、試験３は２６℃で行われた。
すべての試験について、ワクチンは０．１ｍｌのボリュームでティラピアにＩＰ注入された。
コントロールのティラピアは、同じボリュームの滅菌されたＴＳＢをＩＰ注入された。
【００３８】
（槽没入投与）
２つのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン没入試験（試験５−６）が３２°Ｃで行なわれた。
試験５のために、１３０匹の５ｇのティラピアが、６５匹（コントロール）及び６５匹（免疫化された）魚の２つのグループに分割された。
コントロールのティラピアは、５００ｍｌの滅菌水：５００ｍｌのＴＳＢ、１ ｌに２０分没入され、没入の後、２０−２５匹の魚が３つのレプリケート（複製）養魚器の中に置かれた。
免疫化した魚は、１６ｍｌの細菌ワクチン及び１０００ｍｌのトキソイドを含んでいる希釈していないワクチンに、２０分間、空気注入とともに浸され、没入の後、２−２５匹の魚が３つのレプリケート養魚器の中に置かれた。
５ｇのティラピアはストレートのワクチンをよく許容しなかった。また、３０匹はワクチン接種の後で死んだ。これは、ワクチンの稀釈の必要性が要求されていることを示していた。
さらに、３０匹の魚が薄められたワクチン（５００ｍｌのワクチン： ５００ｍｌの滅菌水）に浸され、ストレートのワクチン没入中に失われたものを交換するためにレプリケート・タンク中に分配された。
追加の魚の死は、ワクチン接種後３０日間はなかったことを示す。
試験６のためには、４５匹の３０ｇのティラピアが、１１〜１２匹づつの４つのグループに分割された。
６匹の魚の２つのグループが、各々、５００ｍｌの薄めていないワクチン（第１のディップ）で免疫化した。また、さらに６匹の魚の２つのグループが、各々、同じワクチン溶液（第２のディップ）と空気注入とで免疫化した。
第１のディップおよび第２のディップで免疫化した魚は別々の養魚器に入れられた。
コントロールの魚は同じ手順を使用して、ＴＳＢに没入された。
【００３９】
（実験としてのチャレンジおよび細菌学的なサンプル評価）
ワクチン接種後、３０〜６４日では、ワクチン接種したもののグループおよびワクチン接種しなかったものは計量された。そして、０．１ｍｌの同種（ＡＲＳ−ＫＵ−ＭＵ−１１ Ｂ）又は異種（ＡＲＳ−ＫＵ−ＭＵ−３Ｂ）のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物で、２．６×１０3から１．７×１０6 ＣＦＵ／ｆｉｓｈ（表２）の範囲の菌体濃度でＩＰチャレンジされた。次に、１４日間、臨床的症状および死亡率を毎日モニタリングされた。
感染したティラピアは、不安定な泳ぎの行動及び病的徴候を観察された。
死んでいる魚は１日２回取り除かれた。そして、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの存在を確認するために、２０％の病的か死んでいる魚の脳、腎臓の前部、及び腸から、バクテリアのサンプルを無菌的に得た。
サンプルは羊血液寒天培地（レメル社、レネクサ、カンザス州）上で培養された。
ベータ溶血性、オオシダーゼ・ネガティブ、及びグラム染色でポジティブな球菌コロニーは、ラピッド・アイディー・３２・ストレップ・テスト（バイオメリュー・バイテック社、ヘーゼルウッド、ミズーリ州）を使用して、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された。
各試験では、ワクチン接種されたものと、ワクチン接種されていないティラピアの平均のパーセント死亡率および平均の累積的なパーセント死亡率が、１４日間以上、求められた。
ワクチンの有効性は相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）（アメンド、１９８１年）として計算された。
【００４０】
（統計）
各試験について、免疫化した又は免疫化しなかったコントロール間のチャレンジ後の死亡率の有意差は、ＳＡＳインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州（１９９７年）の手順による、ｔ検定および寿命試験によって統計的に分析された。
有意差はＰ＜０．０５で求められた。
（上記を参照のこと）。
【００４１】
（結果）
（ワクチンの有効性）
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種されたもの及びワクチン接種されていないティラピアについて、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅチャレンジ後の平均パーセント死亡率およびＲＰＳは、表２に示される。
Ｓ．ｉｎｉａｅ ＩＰワクチン接種とＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでのチャレンジとは対照的に、ワクチン接種し２．６×１０３と１．５×１０４ ＣＦＵ／ｆｉｓｈでチャレンジされた、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンでＩＰワクチン接種された３０ｇのティラピアは、６４及び３０日後、試験３及び４で７０と８０の優れたＲＰＳ値をそれぞれ示した。
試験３と４の水温（２６対３２℃）は、ＲＰＳの結果に影響を及ぼすようには見えなかった。
図２は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅとチャレンジの後にＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのための累積的な死亡率がプロテクト注射をした日平均パーセント及びワクチン接種しなかった魚を示す。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種したものの平均の累積的なパーセント死亡率は、３〜１４日まで１５〜１６％残った。
免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の非常に顕著な有意差が、試験３及び４で見られた。
有意差は、試験３（Ｐ＝０．９１１７）及び４（Ｐ＝０．９５１０）での処理のレプリケート間では示されなかった。
ＩＰ Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種した及びワクチン接種しなかった、より小さな５ｇのティラピアでは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジされた際、２５のＲＰＳがあった（試験２（表２））。
【００４２】
５ｇ（試験５）と３０ｇ（試験６）のティラピアの槽没入ワクチン接種後、それぞれ、３．６×１０5及び１．７×１０6 ＣＦＵ／ｆｉｓｈでＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅチャレンジをした後では、類似した３４のＲＰＳを生じた（表２）。
免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の有意差は、試験５で見られた。
ワクチンの処理法（希釈していない対希釈された）に関わらず、試験５（Ｐ＝０．９７９８）では、処理のレプリケート間で有意差は示されなかった。
対照的に、免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の有意差は試験６では見られなかった。
試験６での処理のレプリケート（第１と第２のディップ）間では、死亡率の有意差（Ｐ＝０．７３２７）は示されなかった。
５及び３０ｇのワクチン接種したものは、５及び３０ｇのワクチン注射しないものより、日々の累積的な％死亡率が低かった。
５及び３０ｇのワクチン接種しないものは、３０ｇの魚は５ｇの魚より１０倍以上高い投与量でチャレンジされたのに関わらず、非常に類似した日々の累積的な死亡率になった。
ワクチン接種しなかったものの平均のパーセント死亡率は、平均８５であった。また、 ワクチン接種したものの平均のパーセント死亡率は、平均５５（表２）であった。
両方の試験において、ワクチン接種されていないコントロールの死亡率はチャレンジ後１日で５０％以上だった（図３）。
ワクチン接種したものは、５日後まで５０パーセントの死亡率に達しなかった。
【００４３】
【表２】
【００４４】
＜実施例３＞
本発明のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンは、伝染力の強いＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染を防ぐ効果をついて再び試験された。また、血糖レベルに対する影響も求められた。
材料及び方法、ワクチン調製及びワクチン接種プロトコルはすべて、上述の実施例２に記述されたものを用いた。
【００４５】
（血液のサンプリングおよび分析）
ワクチン接種（０時間）に先立って、１０匹の魚が、血糖をサンプリングされた。
魚は、ワクチン接種後、２、６、２４時間において、繰り返し血糖をサンプリングされた。
ワクチン接種後２８日で、チャレンジ（チャレンジ前、０時間で）に先立って、１０匹のワクチン接種したものおよび１０匹のコントロールで血糖が決定された。
これらの魚は、チャレンジ後、２、６、２４、４８、７２時間、及び３１２時間で、反復して血糖のサンプリングをされた。
血液サンプルは、尾静脈からツベルクリン注射器及び２７標準規格注射針を使用して得られた。
５〜１０のμＬの血液滴は清潔なスライド・ガラス上に置かれた。
血糖濃度は、ガラス面に対して１５〜３０°度で、ワンタッチ・ウルトラ・メーター（ライフスキャン社、ミプタス、カリフォルニア州）のテスト・ストリップのトップエッジを血液滴に接触させ、血液が確認ウィンドウを完全に満たすことを可能にすること（ジウフら、２０００年）により決定された。
グルコース濃度は約５秒でｍｇ／ｄＬで表示された。
従来の研究では、エヴァンスら（２００３年ｂ）は、許容できるＤＯレベルで、健康なティラピアからの血液サンプルの１０個のレプリケーションからイントラアッセイの分散３．２５％（平均２０．４±０．６６ｍｇ／ｄＬ）で、２０ｍｇ／ｄＬの感度を決定した。
更に、ブドウ糖モニターによって測定されたブドウ糖酸化酵素反応は、比色定量する商用検査手法と相関していた。
相関係数（ｒ）はＰ＜０．００１で０．９２８だった。
【００４６】
（実験としてのチャレンジ）
ワクチン接種後２８日で、ワクチン接種したものおよびワクチン接種しなかったものは重量を量られ、１．５×１０５ ＣＦＵ／ｍＬの菌体濃度のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物０．１ ｍＬでＩＰチャレンジされ、また、１３日間、臨床的症状および死亡率を毎日モニタリングされた。
感染したティラピアは、不安定な泳ぎの行動及び病的徴候を観察された。
死んでいる魚は１日２回取り除かれた。そして、バクテリアのサンプルは、脳、腎臓の前部、及び腸から無菌的に得られた。さらに、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの存在を確認するためにＳＢＡの上で培養された。
ベータ溶血性、オオシダーゼ・ネガティブ、及びグラム染色でポジティブな球菌コロニーは、ラピッド・アイディー・３２・ストレップ・テスト（バイオメリュー・バイテック社、ヘーゼルウッド、ミズーリ州）を使用して、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された（エヴァンスら、２００２年）。
累積的な処理死亡率は１３日間決定された。
ワクチンの有効性は相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）（アメンド、１９８１年）として計算された。
【００４７】
（統計）
データは、ＳＡＳインスティチュート社（ケアリー、ノースカロライナ州、１９９７年）の手順によるダンカンの多重範囲検定の後に続く分散分析手順によって統計的に分析された。
処理間での血糖レベルの有意差が、単一の期間と処理のためのすべての期間において、分散分析でｐ＜０．００１、ダンカンでｐ＜０．０５レベルで確立された。
血糖レベルと死亡率の間の相関の計算はＳＡＳの相関手順によって行なわれた。
上に記述されたように、重量が分析された。
標準誤差はすべての処理平均血糖値で報告された。
【００４８】
（結果）
ワクチン接種したものは、ワクチンの注射の２時間後にコントロールの魚（５２．１±５．３７ｍｇ／ｄＬ）より著しく高い血糖レベル（９７．９±９．９０ｍｇ／ｄＬ）になった（データは示さない）。
ワクチン接種したものの血糖レベルは注射後も６時間上がり続けた。しかし、２４時間で注射前のレベルに戻る前には、統計的には上がらなかった。
ワクチン接種の後、ワクチン接種（０時間）より前、又は６及び２４時間で、ワクチン接種したものとコントロールの間の血糖での有意差は示されなかった。
ＴＳＢをＩＰ注入されたコントロールの血糖レベルは、どの時間間隔でも有意差はなかった。
コントロールあるいはワクチン接種したものについて、ワクチン接種後２８日で、魚の死はなかった。
ＩＰ注射による１．５×１０ ４ ＣＦＵのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジおよび感染により、ワクチン接種したもの及びコントロールの両方で、２、２４、４８及び７２時間において０時間よりも著しく高い血糖レベルになった（図４）。
コントロールとワクチン接種したものの間では、著しく高い血糖レベルが、２４、４８および３１２時間で示された。
【００４９】
しかしながら、ワクチン接種したものの血糖レベルは、これらの期間のコントロールのものより低かった。
コントロールのグルコース値は、４８時間でピークに達した（１１７．０±１４．０９ｍｇ／ｄＬ）。
ワクチン接種したものの３１２時間での血糖値（４１．９±２．３９ｍｇ／ｄＬ）は、ワクチン接種とチャレンジに先立って０時間でワクチン接種したもののために得られたものと同一だった。
【００５０】
コントロールは、チャレンジの２４時間後に、感染した魚に典型的な行動異常を示した。
魚は、タンクの底に塊状になり、食物に対する無反応又は遅い反応、及び不活発さを示した。
コントロールでは、ワクチン接種したものよりかなり早く魚の死が起こった。
チャレンジの後、７２時間以内に、コントロールでは６０％の死亡率が示された（図４）。
チャレンジ後９６時間で、ワクチン注射された魚はわずか１匹だけが死んだが、感染又は行動異常のサインを示した魚は皆無だった。
相対パーセント生存率は３１２時間で８３．４だった。
図４は、チャレンジされたワクチン接種したものとコントロールについて、時間に対しての平均のグルコース値とパーセント累積死亡率の関係を示す。
血糖レベルおよび感染したコントロールの死亡率は著しく関連した（ｒ2＝０．９２３６、Ｐ＝０．０１３４）。
瀕死のコントロール（Ｎ＝４）は、脳、前腎、及び腸の培養でＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅポジティブだった。
【００５１】
前述の詳細な説明が、単に実例とその修正のために与えられることは了解される。また、発明の趣旨および範囲から外れない点において変形して行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】腹腔内（ＩＰ）注入及びＩＰによってＳ．ｉｎｉａｅワクチンを接種されたティラピアに、２．６×１０4 ＣＦＵのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ／魚でチャレンジした平均の累積的なパーセント死亡率（＿はワクチン接種したもの； ＿はワクチン接種しなかったもの）を示す図である。
【図２】腹腔内の（ＩＰ）注射及びＩＰによってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン（試験３及び４）を接種されたティラピアをＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジした、平均の累積的なパーセント死亡率を示す図である。Ｔ；試験３はチャレンジ投与量２．６×１０3 ＣＦＵ／魚（Δはワクチン接種したもの； ▽はワクチン接種しなかったもの）；試験４はチャレンジ投与量１．５×１０4 ＣＦＵ／魚（＿はワクチン接種したもの； ＿はワクチン接種しなかったもの）。
【図３】Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンの槽没入及びＩＰによって接種されたティラピアを、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジした、日々の死亡率（試験５及び６）を示す図である。試験５は、チャレンジ投与量３．６×１０5 ＣＦＵ／魚（Ｔ＝ワクチン接種しなかったもの； Ｂ＝ワクチン接種したもの）；試験６はチャレンジ投与量１．７×１０6 ＣＦＵ／魚（Ｃ＝はワクチン接種したもの； Ｄ＝ワクチン接種しないかったもの）。寿命試験手順（ＳＡＳインスティチュート、ケアリー、ノースカロライナ州）。
【図４】チャレンジした後の異なる時点での、ティラピアの平均のグルコース値（ｍｇ／ｄＬ）（線）と累積的なパーセント死亡率との関係を示す（バー）図である。ＩＰ注射によってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの１．５×１０4 ＣＦＵでチャレンジされたティラピアにおいて、ワクチン接種した１０匹（縞模様バー）及びコントロール（黒いバー）におけるティラピアの累積的なパーセント死亡率、及びワクチン接種した（縞模様ライン）及びコントロール（黒い線）における平均の血糖値。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ群連鎖球菌による感染から魚をプロテクトする新規のワクチン、及びこれを製造する新規のプロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ群連鎖球菌は、養殖及び野生の魚の多くの種に厳しい経済的損失を引き起こすＢ群の連鎖球菌バクテリアである。
この伝染性の細菌は、新鮮な水域、塩けのある水域、あるいは海洋性水域で魚が集中的に培養される水産養殖設備において一般的である。
高密度の魚及び水のある環境により、連鎖球菌の疾病の迅速な伝染が促進される。
さらに、感染した養殖の魚は、野生の魚の個体群に病気を感染させるかもしれない。あるいは、感染した野生の魚が、養殖の魚にその病気を感染させるかもしれない。
【０００３】
従来、様々な連鎖球菌及び腸球菌種に対して、腹腔内あるいは筋肉注射のいずれかに基づいた戦略を利用したワクチンが開発されている。
いくつかの注射可能なワクチンが連鎖球菌感染症の予防のために開発されているが、これらのワクチンの多くは製剤として異なる。
ホルマリンでストレプトコッカス−イニエ（Ｓ．ｉｎｉａｅ）を殺菌したワクチンを腹腔内へ（ＩＰ）ワクチン接種した後のニジマスのプロテクトについては、エルダーらによって報告された（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ， Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９７； ５６： １７５−１８３）（非特許文献１を参照）。
クレシウスらは、殺菌したホール・セルと濃縮された細胞外組成物からなる、修正されたＳ．ｉｎｉａｅワクチンを開発した［Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ １９９９； １９（１ ）： ３８−４１ ； ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２０００； １８８（３−４）： ２３７−２４６］（非特許文献２、３を参照）。
免疫化された２５ｇのティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）の相対パーセント生存率（ＲＰＳ）は９５．３、１００ｇのティラピアのＲＰＳ値は８４．２から９４であった。
カレイ（Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｍａｘｉｍｕｓ）は、トキソイドを豊富にした細菌を使用したワクチン接種により腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からプロテクトされた［Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ， Ｊ Ａｐｐｌ ｌｃｈｔｈｙｏｌ １９９９； １５： １５３−１５８； Ｌｏｎｇ− ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｒｂｏｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｏｘｏｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｎ， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ， １９９６； １６（５）： １６９−１７１ ； ａｎｄ Ｔｏｒａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ １９９５； １３４： １７−２７］（非特許文献４、５、６を参照）。
トキソイドを豊富にした細菌ワクチンは、ホルマリンで殺菌された２つの単離された腸球菌種及びそれらの培養液の組み合わせだった。
フロイント不完全アジュバント中のホルマリンで殺菌したストレプトコッカスで免疫化されたニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ）はストレプトコッカスからプロテクトされたのにかかわらず、槽没入によって免疫化されたマスはプロテクトされなかった［Ａｋｈｌａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ （ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ １９９６年； １９： ２５１− ２５８］（非特許文献７を参照）。
最近、中西ら（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｓｈ： Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ， Ｖａｃｃｉｎｅ ２００２； ２０： ３７６４−３７６９）は、ホルマリンで殺菌したＳ．ｉｎｉａｅのワクチンに皮膚を刺した若いニジマスを浸すことでプロテクトされることを実証し、それはＩＰ注入によって得られたものに匹敵した（非特許文献８を参照）。
【０００４】
エルダーらは、ホルマリンで殺菌した連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から調整された注射可能なワクチンの調製について開示した。
このワクチンはティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ種）をＳ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対してプロテクトするチャレンジとして報告された［Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ− ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｉｌａｐｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ １９９５； １３（９）： ８６７−８７０； ａｎｄ Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ： Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ； Ｆｉｓｈ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．， Ｖｏｌ． ９０ （Ｌｉｉｅｈａｕｇ， Ｇ．， Ｍｉｄｌｙｎｇ， ＰＪ ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｆ． ｅｄｓ．） Ｋａｒｇｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， ｐｐ． １５３−１６０， １９９７］（非特許文献９、１０を参照）。
【０００５】
【非特許文献１】Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆａｒｍｅｄ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ”， Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｌｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，， １９９７， ５６，， Ｐ．１７５−１８３．
【非特許文献２】Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ ｛Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）”， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ，， １９９９， １９， １， ｐ． ３８−４１．
【非特許文献３】Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）”， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，， ２０００， １８８， ３−４， ｐ． ２３７−２４６．
【非特許文献４】Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ ｂｙ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ”， Ｊ Ａｐｐｌ ｌｃｈｔｈｙｏｌ，， １９９９， １５，， ｐ． １５３−１５８．
【非特許文献５】Ｒｏｍａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｒｂｏｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｔｏｘｏｉｄ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｎ”， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ，， １９９６， １６， ５， ｐ． １６９−１７１．
【非特許文献６】Ｔｏｒａｎｚｏ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ａｎｄ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｒｂｏｔ”， Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，， １９９５， １３４， ｐ． １７−２７．
【非特許文献７】Ａｋｈｌａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， ”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｓｈ ａｇａｉｎｓｔ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ （ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）”， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ，， １９９６， １９，， ｐ． ２５１−２５８．
【非特許文献８】Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆｉｓｈ： Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｕｎｃｔｕｒｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ”， Ｖａｃｃｉｎｅ，， ２００２， ２０，， ｐ． ３７６４−３７６９．
【非特許文献９】Ｅｌｄａｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｗｈｏｌｅ− ｃｅｌｌ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｔｉｌａｐｉａ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ”， Ｖａｃｃｉｎｅ，， １９９５， １３， ９， ｐ． ８６７−８７０．
【非特許文献１０】Ｂｅｒｃｏｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， ”Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｎｔｉｇｅｎｓ： Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”， Ｆｉｓｈ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ．， Ｖｏｌ． ９０ （Ｌｉｉｅｈａｕｇ， Ｇ．， Ｍｉｄｌｙｎｇ， ＰＪ ＆ Ｂｒｏｗｎ， Ｆ． ｅｄｓ．） Ｋａｒｇｅｒ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ， １９９７， ｐ． １５３−１６０．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
その後の調査報告では、しかしながら、バンダムらは、エルダーらによって報告されたＳ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、実際には非溶血性の、Ｂ群連鎖球菌、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであったことを提案した（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ｉｓ ａ ｎｏｎｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ Ｂ， ｔｙｐｅ Ｉｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， ｌｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ， １９９７； ４７（１）： ８１−８５）。
確かに、以前に報告された元々種が確認されていないか誤って分類された魚の単離された連鎖球菌の多くは、より最近、非溶血性のＢ群連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）であると特徴づけられた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
我々は今、魚、特にティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）、及びＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に弱い魚の他の種について、Ｂ群連鎖球菌の抑制に効果的で安全な新規ワクチンを発見した。
ワクチンは、１つ以上のβ溶血性の単離されたＢ群連鎖球菌である完全な（ホール・セル）殺菌された細胞、及びβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの濃縮エキスを含む。
ワクチン組成物は、同じ又は他の毒性株のＢ群連鎖球菌（つまり、ワクチンを準備するために使用される単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅが異なる）による感染からの魚のプロテクトに有効である。
この発見に従って、本発明は、新規の非常にプロテクト効果の高い、魚用のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対するワクチンを提供することを対象とする。
本発明は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされた魚の集団の動物流行病を防ぐのに有効なワクチンを提供することをもう一つの対象とする。
さらに、本発明は、注射か槽没入によって処理されてもよいＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する効果的なワクチンを提供することをもう一つの対象とする。
さらに、本発明は、有効性を増加させた単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する単価及び多価ワクチンの両方を提供することをもう一つの対象とする。
本発明は、魚のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染に対するワクチンの準備に使用されてもよい、魚からのβ溶血性の新規の単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅを提供することを追加の対象とする。
本発明のいっそうさらなる対象は、ティラピア、シマスズキ及び他の魚類の生存度及び生産力を改善し、その上にＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによって引き起こされる経済的損失を縮小することである。
発明の他の対象及び利点は、確実な記述から容易に明白となるだろう。
【０００８】
（生体試料の寄託）
β溶血性で、莢膜を作る能力がある脳から単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＡＲＳ−ＫＵ−３ Ｂ及びＡＲＳ−ＫＵ−１１ Ｂ）は、２００２年７月１７日に、ノース・ユニバーシティ・ストリート１８１５、ピオリア、イリノイ州 ６１６０４にある農業研究事業団微生物株保存機関にブダペスト条約の条件の下で預けられ、それぞれ、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７の寄託許可番号を割り当てられた。
ここに使用されるように、Ｂ群連鎖球菌は認められた種を指す。エヴァンスら（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔｕｓ Ｌ．， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００２； ２５：５０５−５１３。その目次は参照によってここに組込まれる）によって、これらの特数が記述され、他の参考菌株が米国培養菌保存施設（マナッサス、ヴァージニア州、アメリカ）に預けられた。
【０００９】
ここに使用されるように、「ワクチン」は、ワクチンを接種された動物の防御免疫応答を刺激することができる接種する形態の任意のタイプの生物学的因子を参照するために、その広い意味で定義されている。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、１つ以上の単離されたβ溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅについて殺菌された完全な（ホール・セル）細胞形態と、β溶血性の同じか異なる単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの培養液からの濃縮エキスとの組み合わせからなる新規ワクチンを提供する。
このワクチンは、このワクチンの調製で使用されるものとは異なる株を含むＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの任意の株による魚の感染をコントロールすることに効果的である。
さらに、このワクチンは、莢膜を作る能力がある株と莢膜を作る能力がない株と同様に、β溶血性と非溶血性の株による感染をコントロールすることに効果的である。
しかしながら、このワクチンは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのβ溶血性の株による感染に対する魚のプロテクト反応を誘発するのに特に効果的である。
【００１１】
本発明のワクチンは、これで処理された場合、様々な魚のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染をコントロールするのに有効である。
また、ワクチン接種により、処理された魚の行動及び形態の異常は著しく減少する。
このワクチンは、それに制限されてはおらず、ゴールデンシャイナー、ヒメハヤ（ｂｕｌｌｍｉｎｎｏｗ）、アミキリ、ガルフ・メンハーデン（にしん科の魚、ｇｕｌｆ ｍｅｎｈａｄｅｎ）、ハマギギ、ボラ、ピンフィッシュ、アトランティック・クローカー（大西洋産のニベ科の魚、Ａｔｌａｎｔｉｃ ｃｒｏａｋｅｒ）、スポット、ニベ、ブチナマズ、ニジマス、ウナギ、シマスズキとそれらの雑種、ハタ、鯛、カレイ及びティラピアを含む国内または外来の魚の処理には特に有益である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ワクチンの調製に使用されたβ溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの特別の株は決定的ではく、莢膜を作る能力があるか莢膜を作る能力がない、どの単離されたβ溶血性のＢ群連鎖球菌でもここで適切に使用できる。
適切なＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、エヴァンスらによって記述されたもの（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｒｕｓ ａｕｒａｔｕｓ Ｌ．， ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２００２； ２５：５０５− ５１３。その目次は参照によってここに組込まれる）に似ている従来技術と集積（豊富化する）技術を用いて、感染した魚のような環境又は自然のソースから、あるいは、以前に単離された実質上の純系の株から、単離されてもよい。
好適な株は、莢膜を作る能力があるもの、特に前述の株、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７を特に含んでいる。
単価・多価ワクチンの両方で有効性が示されているが、β溶血性のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの１つより多い株を使用して準備された多価のシステムは、種間に存在するかもしれない、提示される抗原の不均一性により好適である。
【００１３】
この独創的なワクチンは殺菌した細胞製剤か細菌ワクチンである。それはまた、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの培養液の細胞外の濾化された溶液（細胞の入っていない培養液）の濃縮された分画を含んでいる。
そのため、濃縮分画は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞、細胞壁断片及び細胞内のコンポーネントを実質上含んでいない。
細胞は濃縮分画から取り除かれるが、熟練した技術者は比較的少量の細胞内の生成物及び細胞壁断片が培養の最中に生じる正常な細胞の溶菌の結果存在してもよいことを認識するだろう。
特に好適な実施の形態において、低分子量の細胞外のコンポーネント（同様に、任意の低分子量の細胞内のコンポーネント）、好適なのは約１ ｋＤａ（キロ・ダルトン）未満の分子量があるもの、より好適なのは、２ｋＤａ未満の分子量があるもの、そして最も好適なのは、約３ ｋＤａ未満の 分子量があるものが、濃縮画分から取り除かれる。
理論に結び付けられていないが、殺されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞外生産物の様々な低分子量成分は、細菌ワクチン懸濁液の抗原性に際して妨害作用があると信じられている。
細胞外の濃縮水の濃度及びろ過は事実上これらの抑制コンポーネントを除去するので、したがってワクチンの有効性を向上させる。
加えて、細胞外生産物は、莢膜からの抗原あるいは分泌された／排泄された抗原、及び優れた免疫化応答を提供する他の有益な分子を含むと考えられる。
【００１４】
ワクチンの準備用の細菌の増殖は、任意の従来の条件の下で、及びその成長を促進する培地での培養によって達成されてもよい。
様々な従来の固体又は液体メディアはここで使用するのに対しふさわしいかもしれないが、液体培地での増殖は大規模生産のために特に好適である。
そのほかに制限されておらず、追加の栄養素は莢膜（多糖）生産を高めるために付け加えられてもよいが、従来のＴＳＢ培地（トリプシン大豆培養液、ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）は好適である。
例えば、グルコースのような糖の追加は多糖生産を高めるかもしれない。
ワクチンの生産は、５〜７日間２５°Ｃで発酵中に培養ｐＨを調節せずに、選択された単離物の静置培養によって行なわれてもよい。
５〜７日の延長された発酵時間によって飢餓状態のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、また、結果として生ずるワクチンの効能を増強すると考えられており、したがって好適である。
この培地で準備されたワクチンの最終ｐＨ値は、ｐＨ６．５〜７．４まで変動してもよい。
ワクチン調製の塩分は、好ましくは塩（ＹＳＩ社、イエロースプリングズ、オハイオ州）１０００当たり３．６−４．０部（ｐｐｔ）の範囲にある。また、特に槽免疫化方法によって処理された場合に、この特性はまたワクチンの有効性を増強するかもしれないと信じられている。
そのほかに制限されておらず、臨床屈折計（Ａｔａｇｏ Ａ３００ＣＬ、ヴィー・ジー・サイエンティフィック社、カークランド、ワシントン州）で測定されたワクチン（例２に記述されるように製造された）は、血清蛋白質（ｇ／１００ｍｌ）スケールで１．３３８４〜１．３３８７であり；５８９ナノメーター（ｎｍ）の尿比重（ＵＧ）スケール及び屈折率（ｎＤ）で１．０１５〜１．０１６である、１．０〜１．２である。
５４０ｎｍ（可視−紫外分光光度計 、Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｕｎｉｃａｍ、ケンブリッジ、英国）のワクチンの吸光度（ＯＤ）は、０．８８７〜０．９３９の範囲にある。
通気は一般に好適ではない。
それの使用が最終的なワクチン製品に、動物の生成物及び病原菌が存在する危険をなくすので、すべての、植物に基づいた発酵培地もここでは用いることが好適である。
それらの増殖と回収に続いて、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの細胞は、化学的及び／または物理的に有効な殺菌処理（つまり、不活性化）にさらされる。
【００１５】
細胞を溶解せずに、及び細胞が動物の抗体反応を誘発する能力を保持したまま、生細胞の９９．９％以上を殺す、細胞を殺す有効な処理を以下で明らかにする。
このように、この処理では、事実上未処理の細胞に比べて殺された細胞表面抗原の特異性を変えるべきでない。
すべての生菌の１００％を死滅させる処理法は典型的には好適かもしれないが、熟練した技術者は１００％の細胞の死が必ずしも、容易に得られるとは限らないかもしれないことを認識するだろう。
好適な実施の形態において、死滅した、完全なＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、ホルマリンで生菌の処理を行うことで準備される。
あるいは、パーディらによってパスツレラｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ細菌ワクチンの調合のために記述されたようなＵＶ照射（米国特許６，３０３，１３０番公報）によって、細胞を死滅させてもよい。
また、様々な他の技術、殺菌した細胞のワクチン（つまり細菌ワクチン）の調製のための構想を描かれ記述されたものは、ここでに使用するのに好適である。および、これには、アルコール、特にエタノールまたはイソプロピルアルコールのような脂肪族アルコール、フェノール、トリクレゾール、ホルマリン、ホルムアルデヒド、アセトン、チメロサール（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）、β−ラクトン、または蛋白質変性（例えば１時間の５６°Ｃ）を引き起こさない温度で中熱を加える処理が含まれているが、これに制限されていない。
処理時間と条件は、もちろん選択された特定の方法に応じて変わり、日常の試験によって容易に決定されてもよい。
【００１６】
好適な実施の形態では、発酵容器のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、１００％の細胞を死滅させるために十分な時間、ホルマリンに晒される。
典型的には、ホルマリン濃度は、約１％から約５％（ｖ／ｖ）まで、好ましくは約１％から約３％（ｖ／ｖ）まで変動するだろう。
【００１７】
１００％の殺菌を達成する特定のホルマリン濃度に対しふさわしい暴露時間は、処理の時間とパーセント殺菌率の死の原因となる死滅曲線から容易に決定されてもよい。
発酵に続いて、細胞の高濃度懸濁液を得るために、細胞は、例えばろ過または遠心分離によって濃縮される。また、細胞のペレット及び発酵培養液が分離される。
分離された細胞は、ワクチンの最初のコンポーネントとして使用するために保持されてもよい。
その後、濃縮エキスを生産し、かつ前述の低い分子量の細胞外コンポーネントを好適に除去するために、濾液は、それ自体、無細胞の培養液の形で、もう一つの濃縮工程にさらされる。
様々な濾過システムは異なる分子量カットオフの下で、この好適な実施の形態で使用するにふさわしい。
好適なフィルタは、およそ分子量カットオフが１ ｋＤａ（キロ・ダルトン）であるものと、約１ｋＤａより大きな分子量がある培養液からの細胞外生産物を含む濃縮エキスを生産するものを含んでいる。
およそ２ｋＤａの分子量カットオフがあるフィルタに使用するのがより好適であり、特に好ましいのがおよそ３ｋＤａのカットオフがあるものと共に用いることである。これにより、培養液から、それぞれ、約２及び３ｋＤａより大きな分子量の細胞外生産物を含む濃縮された抽出物を生産する。
１つの好適な実施の形態では、無細胞の培養液はミリポア・ポロフラックスＭ１２（ビレリカ、マサチューセッツ）を使用した３ｋＤａアミコン・カラム（Ｓ３Ｙ３）の使用によって濃縮される。
どんな濾過システムにおいても、濃縮液を再懸濁するために水を加えて、分離を実行し完了してもよい。
特に好適な実施の形態では、濃縮液のボリューム（体積）において５倍の縮小があるまで、分離が行なわれてもよい。
これは濃縮液の中に適切な水を残すことで、以前に保持された細胞ペレットの懸濁液が濃縮液（つまり、濃縮エキス）と再配合で容易に生じるようにする。
便宜上、死滅した細胞及び濃縮エキスは、同じ培養液から典型的に準備されるだろうことを、それは予見させる。
しかしながら、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの同じか異なる株の異なる培養液からそれらが準備されていてもよいことが認識されている。
【００１８】
適切な比率は当業者によって決定されてもよいが、典型的な範囲として見られるのは５：１（体積／体積）から２０：１（体積／体積）で、好適なのはオリジナルの発酵された無細胞の培養液のうち１０：１（体積／体積）｛つまり、濃縮培養液（濃縮液）の体積と無細胞の培養液の原体積の比率｝である。
濃縮された無細胞の培養液は、０．２２ Ｆｍ １Ｉの微生物用のフィルタ（コーミング、コーニング、ニューヨーク）で滅菌される。
１６ｍｌのホルマリン殺菌した細胞に、１０００ｍｌの滅菌された無細胞の濃縮された発酵液を加える。
【００１９】
濃縮液の細胞ペレットの再懸濁液に続いて、殺菌されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ細胞は、魚にとって免疫学的に有効な量の製剤あるいは投薬量によって投与のために準備される。
投与量は、単に再懸濁された殺菌された細胞を含んでいる濃縮液として与えられてもよいし、あるいは、薬学的に許容できるキャリアー及び、既知の技術であるアジュバントをさらに含んでいてもよい。
免疫学的に有効な量あるいは投薬量とは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの毒性株と後のチャレンジに対する処理された魚の完全な免疫、あるいは相対免疫（防御免疫応答を誘発する）を引き起こすその量であるとして、ここに定義される。
集団（感染した魚の数の減少あるいは感染の重症度の減少によって証拠づけられた）のためのプロテクトのレベルが、ワクチン接種をしていない対照群より著しく高い（少なくとも８０％の信頼水準で測定され、好適には９５％の信頼水準で測定された）ときに、処理された動物の集団に免疫が誘発されたと見なされる。
型通りの実験による技術に熟練している技術者は、適切な有効量を容易に決定することができる。
典型的には、ワクチンは、バス・メディウムの少なくとも１×１０8細胞のＳ．ａｇａｌａｃｃｔｉａｅ／ｍｌを含み、好適には、バス・メディウム用の溶液の４×１０9細胞のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ／ｍｌを含む。
ＩＰ注射ルーチンについては、魚の寸法によって、魚の中の好適な投与量は約０．１〜０．２ｍｌの上記の量になるだろう。
より大量の細胞で処理されてもよいが、そのような高いレベルを使用するのは、一般に非実用的であると考えられる。
【００２０】
殺菌された細胞は、水、生理食塩水、鉱油、植物油、水性のカルボキシルメチルセルロースナトリウムあるいは水性のポリビニルピロリドンのような薬学的に許容できるキャリアーの製剤によって投与のために調製される。
従来の技術のように、ワクチン製剤はまた任意のアジュバント、抗菌剤あるいは他の薬学的に活性のある薬剤を含んでいてもよい。
上述のものに制限されておらず、適切なアジュバントは、鉱油、植物油、ミョウバン、及びフロイント不完全アジュバントを含んでいるが、これに制限されていない。
なお、他の好適なアジュバントは、生物学的適合性のあるマトリクス物質の微粒子あるいはビーズを含んでいる。
従来の技術のように、微粒子は、アガーとポリアクリラートを含むが、これに限定されない任意の生物学的適合性のあるマトリクス物質から構成されていてもよい。
技術に熟練している技術者は、他のキャリアーあるいはアジュバントが同様に使用されてもよいことを認識するだろう。
例えば、使用されてもよい他のアジュバントはウェッブとウィンケルシュタインによって記述される［ｉｎ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ． （ｅｄ．）， ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， （ロスアルトス、カリフォルニア州）、１９８４年、２８２−２８５ページ］、その目次は、参照によってここに組込まれる。
【００２１】
好適な実施の形態に従って、対象動物に抗原原料の接触を延長し、かつ従って感染防御免疫の期間を増加させるために、殺菌した細胞は、微粒子かマイクロカプセルに組み入れられてもよい。
微粒子とカプセルは従来の技術によるテクニックを使用して、様々なよく知られている不活性の生物学的適合性のあるマトリクス物質から形成されてもよい。
そのほかに制限されておらず、適切なマトリクス物質は、自然か合成高分子を含んでおり、それらはアルギン、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸／グリコール酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、無水重合物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅｓ）、ポリ・オルソ・エステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリビニルイミダゾール、塩化スルホ化されたポリオレフィン、ポリエチレンオキシド及び特にアガランド・ポリアクリラートのようなものである。
ここに使用されてもよい微粒子あるいはカプセル化の中への原料の取り込みに対する技術の手本は、スパークス［Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ， Ｉｎ： Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８１）， ｖｏｌｕｍｅ １５， ｐａｇｅｓ ４７０−４９３］、キノニウス［［ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｔｈｅｏｒｉｅｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ， ＯＨ， １９８０］、 ゴンボッツら［米国特許公報５，０１９，４００号］、ベック［米国特許公報４，９１９，９２９号］によって記述され、各々の中身は、参照によってここに組込まれる。
【００２２】
本発明の実施の形態に係るワクチンにより、細胞が腹腔内か筋肉注射、槽没入、経口投与あるいは鼻の投与によってのように免疫学的応答を誘発することを可能にするあらゆる都合のよいルートによって対象動物を処理してもよい。
しかしながら、腹腔内注射あるいは槽没入は主要な免疫化には好適である。その一方で、必要なとき、経口免疫は副次的または追加免疫には好適である。
また、魚の表面は、動物の免疫系にワクチンの接触を容易にするために槽没入に先立って、あるいはその没入中に、中西らによって記述されたように、刺されるか（２００２年、ｉｂｉｄ）、又擦りむくか、わずかに表面を洗われる。
ワクチンは単回投与、あるいは複数投与分の投与をされてもよい。
飼育する条件に依存するので、ワクチンは複数回投与で処理されてもよい。そのタイミングは、熟練した技工によって容易に決定されてもよい。
【００２３】
槽没入免疫化によるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染に対するワクチン接種には、他の免疫化のルートに比べていくつかの長所をファーする。
これらの利点の中には、免疫化した魚あたりのコストが低く、多くの魚の一斉ワクチン接種が可能、ストレスの削減、著しく高い魚の生存率、及びワクチン接種の副作用がないというものがある。
更に、槽没入ワクチン接種は、皮を刺すか注射ができない、より小さな魚の集団ワクチン接種のための有効な方法である。
あるいは、市販の魚ワクチンの腹腔内注射は、免疫化された魚あたりの高いコスト及び魚にストレスを与えるにもかかわらず、この信頼性及び高い有効性により鮮魚用か海洋性水産養殖の養殖場で一般的に使用されている。
【００２４】
以下で述べる実施例は、単により発明を説明するように意図され、請求項によって定義される発明の範囲を制限するように意図されることはない。
【００２５】
＜実施例１＞
クレシウスらによって以前に開発されたＳ．ｉｎｉａｅワクチンを、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する有効性のために評価した。
その結果、ワクチンはプロテクト効果がなかった。
【００２６】
（材料と方法）
ティラピアは、ＡＲＳ、ＵＳＤＡ、水生動物健康研究所（Ａｑｕａｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オーバーン、アラバマ州）で維持されていたストックを用いた。
５匹について平均重量３０ｇのティラピアが、実験に先立って１０日間、０．５ｌ／ｈのフローを通じて塩素を除かれた水が供給される、５７ Ｉガラス養魚器の環境に慣らされた。
明暗の間隔は１２時間である：
１２時間はメンテナンスされ、通気がエア・ストーンによって供給された。
魚には、飽満にＡＱＵＡＭＡＸ ＧＲＯＷＥＲ ４００（ブレントウッド、ミズーリ州）が毎日与えられた。
水質は、温度及び塩分と共に溶存酸素について、ＹＳＩ ８５酸素伝導性、塩分、及び温度メーター（イエロー・スプリング・インストルメント社、イエロースプリングズ、オハイオ州）を使用して毎日、測定された。
日々の水温は平均２６．３±０．０３℃となった。また、平均の日々の溶存酸素は５．９５±０．０６ｍｇ／ｌだった。
魚がＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ未感染である状態を確認するために、サンプルを取得し、脳と腎臓へイノキュレーション・ループを入れることにより細菌培養をした。
サンプルは、羊血液寒天培地上に直接ストリークされ、２４〜４８時間２７℃で培養された。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは５匹の無作為に選択された魚から単離されなかった。
【００２７】
（ワクチン調製）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチンの調製は以前に記述された（Ｋｌｅｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ｋｉｌｌｅｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｔｉｌａｐｉａ （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）， Ｂｕｌｌ Ｅｕｒ Ａｓｓ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌ， １９９９； １９（１ ）： ３８−４１．１９９９）。
手短かに言えば、ワクチンは、トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）でストレプトコッカス−イニエ単離物（ＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４及びＮＲＲＬ Ｂ−３０２３８）の別々の培養液として準備され、７２時間２７°Ｃで振盪機（７０ ＲＰＭ）ウォーターバスで培養された。
３％の最終的な濃度を得るために、培養液は１０％の中性緩衝ホルマリンにより２４時間２７°Ｃで処理された。
ホルマリンで処理された培養液は、３０分間７０００ ｘ ｇで遠心分離され、細胞ペレット及び培養液が分離した。
細胞が取り除かれた培養液は、より低い分子量のコンポーネントをすべて除去するために２ｋＤａの中空糸濃縮装置を使用し、２０倍に濃縮された。
その後、この２ｋＤａ培養液の濃縮液は１０：１のＶ／Ｖで細胞ペレットを再懸濁するために使用された。
ワクチンの最終的な濃度は４ ｘ １０9 ＣＦＵ／ｍｌだった。
バクテリアの濃度は、ホルマリンによって殺菌する前にワクチンの吸光度をとることにより推定した。
ＣＦＵ／ｍｌの実数は、スパイラル・オートプレーター・アンド・キューカウント（スパイラル・バイオテック社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用して測定された。
ワクチン化しないものは、濃縮トリプシンの大豆培養液（ＴＳＢ）のみ注入された。
ワクチン細胞は７２時間で羊血液寒天培地の栄養因子の不足によって死滅させられることがわかった。
【００２８】
（ワクチン接種プロトコル）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチンがＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ（試験１）に対してプロテクト可能だったかどうか判断するために、平均重量３０ｇの２００匹のティラピアを、２０匹づつの１０個のタンクに、免疫にならなかったコントロール（表１）を含めて分割された。
５つのティラピアのレプリケート・タンク（重複測定用・複製漕）をコントロールとして用いた。
Ｓ．ｉｎｉａｅ ＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４、あるいはＮＲＲＬ Ｂ−３０２６４とＮＲＲＬ Ｂ−３０２３８を組み合わせたワクチンは、ティラピアの腹腔内に０．１ｍｌのボリュームで注入された。
コントロールのティラピアは０．１ｍｌのＴＳＢを注入された。
免疫化されたものとコントロールのティラピアは、チャレンジの前に３０日間保持された。
ティラピアは、チャレンジ後１４日間、死亡率をモニタリングされた。
【００２９】
実験によるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジ及び細菌学的なサンプルコレクション、及び評価は、元々は野生のクランジンジェリ（Ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ）ボラ（ライザ・クランジンジェリ（デイ））の自然な連鎖球菌の疾病のものから単離されたＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７単離物のＢ群連鎖球菌を使用して魚を感染させて行った。
単離物は標準の分析法によってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された。
ＡＲＳ−ＫＵ−１１ Ｂ（ナショナル・アグリカルチュアル・リサーチ・コレクション、ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７）と名付けられたボラ（ライザ・クランジンジェリ）から単離されたＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、２７°Ｃで２４時間トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ、ディフコ・ラボラトリーズ社、スパークス、メリーランド州）において培養され、次に、０．２ｍｌずつ分注し−７０℃で凍結された。
この研究で使用される伝染性の単離物は、冷凍の単離物のアリクォートを溶かしたものを入れたＴＳＢの接種を行うことにより準備された。
その後、魚は１００μｌの Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのＩＰ注射によって、２．６ ｘ １０5 ＣＦＵ／ｍｌでチャレンジされた。
死んだ魚は１日２回取り除かれ、また、死んだ魚の解剖では、標本は脳、前部の腎臓及び腸から無菌的に得られた。
標本は、２４〜４８時間、２７℃の羊血液寒天培地上に直接培養された。
ベータ溶血性で、カタラーゼ・ネガティブ、グラム染色でポジティブな球菌コロニーは、羊血液寒天培地上にサブカルチャー、その後細菌学上サブ培養され、エヴァンスらによって記述されたテストにより、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると生化学的に確認された（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ−ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｓｅａｂｒｅａｍ， Ｓｐａｍｓ ａｕｒａｔｕｓ （Ｌ．） ａｎｄ ｗｉｌｄ ｍｕｌｌｅｔ， Ｌｉｚａ ｋｌｕｎｚｉｎｇｅｒｉ （Ｄａｙ）， ｉｎ Ｋｕｗａｉｔ， Ｊ Ｆｉｓｈ Ｄｉｓ， ２００２； ２５： ５０５−５１３）、ここに参照によって組込まれる。
テストはすべてレメル（登録商標）（レネクサ、カンザス州）から購入された培地を使用して、２７°Ｃで行なわれた。
【００３０】
各試験について、ワクチン接種したティラピアとワクチン接種しなかったものの平均パーセント死亡率及び平均パーセント累積死亡率を、１４日期間の間求めた。
ワクチンの有効性は、アメンドの手法（１９８１年）に従って相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）として計算された。
【００３１】
（統計分析）
処理タンクの無作為化はゴメスとゴメスによって記述されたブロック計画を使用して行なわれた。
データはすべて正規性の統計仮定が破られなかったことを保証するために検討された。
統計的分析はすべてスタチスティカル・アナリティカル・システムズ（ＳＡＳ）（登録商標）（ＳＡＳインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州、１９９７年）を使用して行われた。
レプリケート・タンクが使用された場合、処理グループ（ワクチン接種したものとコントロール）、及びこれらの処理グループのレプリケート（タンク）間の累積的な死亡率の有意差（Ｐ＜０．０５）を検出するために、一般的な線形モデル（ＧＬＭ）プロトコロルが使用された。
有意差はＰ＜０．０５の＿標準誤差で決定された。
【００３２】
（結果）
Ｓ．ｉｎｉａｅワクチン調合剤はＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染からティラピアをプロテクトしなかった。
ワクチン接種されたＳ．ｉｎｉａｅ及びワクチン接種されていないＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジに伴うティラピアの平均のパーセント死亡率およびＲＰＳは、表１に示される。
Ｓ．ｉｎｉａｅのＩＰで免疫になり、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７単離物でチャレンジされたたティラピアは、ＲＰＳが０であった。すなわち、Ｓ．ｉｎｉａｅのワクチン接種されたティラピアは、１００％、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに感染するようになった。
ワクチン接種したものとワクチン接種しないものの間で、死亡率の有意差は示されなかった。
ワクチン接種したものの死亡率は、すぐに、ワクチン注射しないものの死亡率より高くなった（図１）。
それぞれ、１日と２日で、Ｓ．ｉｎｉａｅでワクチン接種されたものとワクチン接種されていないティラピアで死亡率が記録され始めた。
１００パーセントの累積的な死亡率に達したのは、ワクチン接種しなかったものは１１日であったのに比較して、Ｓ．ｉｎｉａｅワクチン接種したものは４日だった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
＜実施例２＞
本発明のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンはＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに対する有効性のために評価された。
実施例１のＳ．ｉｎｉａｅワクチンとは対照的に、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンはプロテクト可能である。
【００３５】
（材料と方法）
（ティラピア）
ティラピアは、ＡＲＳ、ＵＳＤＡ、水生動物健康研究所（Ａｑｕａｔｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、オーバーン、アラバマ州）で維持されていたストックを用いた。
５匹について平均重量３０ｇのティラピアが、実験に先立って１０日間、０．５ｌ／ｈのフローを通じて塩素を除かれた水が供給される、５７ Ｉガラス養魚器の環境に慣らされた。
明暗の間隔は１２時間である： １２時間はメンテナンスされ、通気がエア・ストーンによって供給された。
魚には、飽満にＡＱＵＡＭＡＸ ＧＲＯＷＥＲ ４００（ブレントウッド、ミズーリ州）が毎日与えられた。
水質は、温度及び塩分と共に溶存酸素について、ＹＳＩ ８５酸素伝導性、塩分、及び温度メーター（イエロー・スプリング・インストルメント社、イエロースプリングズ、オハイオ州）を使用して毎日、測定された。
すべての試験で、日々の水温は平均３１．６８±０．０８℃または２６．３±０．０３℃となった。また、平均の日々の溶存酸素は５．９５±０．０６ｍｇ／ｌだった。
魚がＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ未感染である状態を確認するために、サンプルを取得し、脳と腎臓へイノキュレーション・ループを入れることにより細菌培養をした。
サンプルは、羊血液寒天培地上に直接ストリークされ、２４〜４８時間２７℃で培養された。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは５匹の無作為に選択された魚から単離されなかった。
【００３６】
（ワクチン調製）
ワクチンは、トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）で Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物（ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８及びＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７）の別々の培養液として準備され、７２〜１２５時間２７°Ｃで振盪機（７０ ＲＰＭ）ウォーターバスで培養された。
３％の最終的な濃度を得るために、培養液は１０％の中性緩衝ホルマリンにより２４時間で処理された。
ホルマリンで処理された培養液は、３０分間７，０００ ｘ ｇで遠心分離機にかけられた。また、細胞ペレットおよび培養液は分離した。
無細胞の培養液はミリポア・プロフラックスＭ１２（ビレリカ、マサチューセッツ州）を使用して、３ ｋＤａアミコン・カラム（Ｓ３Ｙ３）で５倍に濃縮された。
濃縮された無細胞の培養液は、０．２２ Ｆｍ １Ｉの微生物用のフィルタ（コーミング、コーニング、ニューヨーク）で滅菌される。
１６ｍｌのホルマリンで殺菌された細胞は、濃縮され、滅菌された無細胞の培養液１ ｌに加えられた。
ワクチンの５４０ｎｍ光学濃度は１．９だった。
最終のワクチン調製でのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの数は４×１０9であると推測された。
バクテリアの濃度は、ホルマリンによって殺す前にワクチンの光学濃度をとることにより評価された。
ＣＦＵ／ｍｌの実数は、スパイラル・オートプレーター・アンド・キューカウント（スパイラル・バイオテック社、ノーウッド、マサチューセッツ州）を使用して測定された。
ワクチン接種しなかったものは濃縮トリプシン大豆培養液（ＴＳＢ）のみ注入した。
ワクチン細胞は７２時間で羊血液寒天培地の栄養因子の不足によって死滅させられることがわかった。
【００３７】
（ワクチン接種プロトコル）
（腹腔内投与）
３つのＩＰ Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン試験（試験２−４）が行われた。
試験２のためには、４０匹の５ｇのティラピアが、２０匹づつの２つのグループに分割された。
試験３のためには、２００匹の３０ｇのティラピアが、２０匹づつ１０個のタンクに分割された。
ティラピアの５つのレプリケート・タンクがコントロールとして用いられた。
試験４のためには、１６０匹の３０ｇのティラピアが、１つのグループ当たり２６〜２７匹の魚の６つのグループ（免疫化しないコントロールおよびワクチン接種したものの３つのレプリケート・タンク）に分割された。
試験２および４は３２°Ｃで行われた。また、試験３は２６℃で行われた。
すべての試験について、ワクチンは０．１ｍｌのボリュームでティラピアにＩＰ注入された。
コントロールのティラピアは、同じボリュームの滅菌されたＴＳＢをＩＰ注入された。
【００３８】
（槽没入投与）
２つのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン没入試験（試験５−６）が３２°Ｃで行なわれた。
試験５のために、１３０匹の５ｇのティラピアが、６５匹（コントロール）及び６５匹（免疫化された）魚の２つのグループに分割された。
コントロールのティラピアは、５００ｍｌの滅菌水：５００ｍｌのＴＳＢ、１ ｌに２０分没入され、没入の後、２０−２５匹の魚が３つのレプリケート（複製）養魚器の中に置かれた。
免疫化した魚は、１６ｍｌの細菌ワクチン及び１０００ｍｌのトキソイドを含んでいる希釈していないワクチンに、２０分間、空気注入とともに浸され、没入の後、２−２５匹の魚が３つのレプリケート養魚器の中に置かれた。
５ｇのティラピアはストレートのワクチンをよく許容しなかった。また、３０匹はワクチン接種の後で死んだ。これは、ワクチンの稀釈の必要性が要求されていることを示していた。
さらに、３０匹の魚が薄められたワクチン（５００ｍｌのワクチン： ５００ｍｌの滅菌水）に浸され、ストレートのワクチン没入中に失われたものを交換するためにレプリケート・タンク中に分配された。
追加の魚の死は、ワクチン接種後３０日間はなかったことを示す。
試験６のためには、４５匹の３０ｇのティラピアが、１１〜１２匹づつの４つのグループに分割された。
６匹の魚の２つのグループが、各々、５００ｍｌの薄めていないワクチン（第１のディップ）で免疫化した。また、さらに６匹の魚の２つのグループが、各々、同じワクチン溶液（第２のディップ）と空気注入とで免疫化した。
第１のディップおよび第２のディップで免疫化した魚は別々の養魚器に入れられた。
コントロールの魚は同じ手順を使用して、ＴＳＢに没入された。
【００３９】
（実験としてのチャレンジおよび細菌学的なサンプル評価）
ワクチン接種後、３０〜６４日では、ワクチン接種したもののグループおよびワクチン接種しなかったものは計量された。そして、０．１ｍｌの同種（ＡＲＳ−ＫＵ−ＭＵ−１１ Ｂ）又は異種（ＡＲＳ−ＫＵ−ＭＵ−３Ｂ）のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物で、２．６×１０3から１．７×１０6 ＣＦＵ／ｆｉｓｈ（表２）の範囲の菌体濃度でＩＰチャレンジされた。次に、１４日間、臨床的症状および死亡率を毎日モニタリングされた。
感染したティラピアは、不安定な泳ぎの行動及び病的徴候を観察された。
死んでいる魚は１日２回取り除かれた。そして、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの存在を確認するために、２０％の病的か死んでいる魚の脳、腎臓の前部、及び腸から、バクテリアのサンプルを無菌的に得た。
サンプルは羊血液寒天培地（レメル社、レネクサ、カンザス州）上で培養された。
ベータ溶血性、オオシダーゼ・ネガティブ、及びグラム染色でポジティブな球菌コロニーは、ラピッド・アイディー・３２・ストレップ・テスト（バイオメリュー・バイテック社、ヘーゼルウッド、ミズーリ州）を使用して、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された。
各試験では、ワクチン接種されたものと、ワクチン接種されていないティラピアの平均のパーセント死亡率および平均の累積的なパーセント死亡率が、１４日間以上、求められた。
ワクチンの有効性は相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）（アメンド、１９８１年）として計算された。
【００４０】
（統計）
各試験について、免疫化した又は免疫化しなかったコントロール間のチャレンジ後の死亡率の有意差は、ＳＡＳインスティチュート社、ケアリー、ノースカロライナ州（１９９７年）の手順による、ｔ検定および寿命試験によって統計的に分析された。
有意差はＰ＜０．０５で求められた。
（上記を参照のこと）。
【００４１】
（結果）
（ワクチンの有効性）
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種されたもの及びワクチン接種されていないティラピアについて、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅチャレンジ後の平均パーセント死亡率およびＲＰＳは、表２に示される。
Ｓ．ｉｎｉａｅ ＩＰワクチン接種とＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでのチャレンジとは対照的に、ワクチン接種し２．６×１０３と１．５×１０４ ＣＦＵ／ｆｉｓｈでチャレンジされた、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンでＩＰワクチン接種された３０ｇのティラピアは、６４及び３０日後、試験３及び４で７０と８０の優れたＲＰＳ値をそれぞれ示した。
試験３と４の水温（２６対３２℃）は、ＲＰＳの結果に影響を及ぼすようには見えなかった。
図２は、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅとチャレンジの後にＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのための累積的な死亡率がプロテクト注射をした日平均パーセント及びワクチン接種しなかった魚を示す。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種したものの平均の累積的なパーセント死亡率は、３〜１４日まで１５〜１６％残った。
免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の非常に顕著な有意差が、試験３及び４で見られた。
有意差は、試験３（Ｐ＝０．９１１７）及び４（Ｐ＝０．９５１０）での処理のレプリケート間では示されなかった。
ＩＰ Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン接種した及びワクチン接種しなかった、より小さな５ｇのティラピアでは、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジされた際、２５のＲＰＳがあった（試験２（表２））。
【００４２】
５ｇ（試験５）と３０ｇ（試験６）のティラピアの槽没入ワクチン接種後、それぞれ、３．６×１０5及び１．７×１０6 ＣＦＵ／ｆｉｓｈでＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅチャレンジをした後では、類似した３４のＲＰＳを生じた（表２）。
免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の有意差は、試験５で見られた。
ワクチンの処理法（希釈していない対希釈された）に関わらず、試験５（Ｐ＝０．９７９８）では、処理のレプリケート間で有意差は示されなかった。
対照的に、免疫化したものと免疫化しなかったコントロール間の死亡率の有意差は試験６では見られなかった。
試験６での処理のレプリケート（第１と第２のディップ）間では、死亡率の有意差（Ｐ＝０．７３２７）は示されなかった。
５及び３０ｇのワクチン接種したものは、５及び３０ｇのワクチン注射しないものより、日々の累積的な％死亡率が低かった。
５及び３０ｇのワクチン接種しないものは、３０ｇの魚は５ｇの魚より１０倍以上高い投与量でチャレンジされたのに関わらず、非常に類似した日々の累積的な死亡率になった。
ワクチン接種しなかったものの平均のパーセント死亡率は、平均８５であった。また、 ワクチン接種したものの平均のパーセント死亡率は、平均５５（表２）であった。
両方の試験において、ワクチン接種されていないコントロールの死亡率はチャレンジ後１日で５０％以上だった（図３）。
ワクチン接種したものは、５日後まで５０パーセントの死亡率に達しなかった。
【００４３】
【表２】
【００４４】
＜実施例３＞
本発明のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンは、伝染力の強いＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅによる感染を防ぐ効果をついて再び試験された。また、血糖レベルに対する影響も求められた。
材料及び方法、ワクチン調製及びワクチン接種プロトコルはすべて、上述の実施例２に記述されたものを用いた。
【００４５】
（血液のサンプリングおよび分析）
ワクチン接種（０時間）に先立って、１０匹の魚が、血糖をサンプリングされた。
魚は、ワクチン接種後、２、６、２４時間において、繰り返し血糖をサンプリングされた。
ワクチン接種後２８日で、チャレンジ（チャレンジ前、０時間で）に先立って、１０匹のワクチン接種したものおよび１０匹のコントロールで血糖が決定された。
これらの魚は、チャレンジ後、２、６、２４、４８、７２時間、及び３１２時間で、反復して血糖のサンプリングをされた。
血液サンプルは、尾静脈からツベルクリン注射器及び２７標準規格注射針を使用して得られた。
５〜１０のμＬの血液滴は清潔なスライド・ガラス上に置かれた。
血糖濃度は、ガラス面に対して１５〜３０°度で、ワンタッチ・ウルトラ・メーター（ライフスキャン社、ミプタス、カリフォルニア州）のテスト・ストリップのトップエッジを血液滴に接触させ、血液が確認ウィンドウを完全に満たすことを可能にすること（ジウフら、２０００年）により決定された。
グルコース濃度は約５秒でｍｇ／ｄＬで表示された。
従来の研究では、エヴァンスら（２００３年ｂ）は、許容できるＤＯレベルで、健康なティラピアからの血液サンプルの１０個のレプリケーションからイントラアッセイの分散３．２５％（平均２０．４±０．６６ｍｇ／ｄＬ）で、２０ｍｇ／ｄＬの感度を決定した。
更に、ブドウ糖モニターによって測定されたブドウ糖酸化酵素反応は、比色定量する商用検査手法と相関していた。
相関係数（ｒ）はＰ＜０．００１で０．９２８だった。
【００４６】
（実験としてのチャレンジ）
ワクチン接種後２８日で、ワクチン接種したものおよびワクチン接種しなかったものは重量を量られ、１．５×１０５ ＣＦＵ／ｍＬの菌体濃度のＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ単離物０．１ ｍＬでＩＰチャレンジされ、また、１３日間、臨床的症状および死亡率を毎日モニタリングされた。
感染したティラピアは、不安定な泳ぎの行動及び病的徴候を観察された。
死んでいる魚は１日２回取り除かれた。そして、バクテリアのサンプルは、脳、腎臓の前部、及び腸から無菌的に得られた。さらに、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの存在を確認するためにＳＢＡの上で培養された。
ベータ溶血性、オオシダーゼ・ネガティブ、及びグラム染色でポジティブな球菌コロニーは、ラピッド・アイディー・３２・ストレップ・テスト（バイオメリュー・バイテック社、ヘーゼルウッド、ミズーリ州）を使用して、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅであると確認された（エヴァンスら、２００２年）。
累積的な処理死亡率は１３日間決定された。
ワクチンの有効性は相対的なパーセント生存率（ＲＰＳ）（アメンド、１９８１年）として計算された。
【００４７】
（統計）
データは、ＳＡＳインスティチュート社（ケアリー、ノースカロライナ州、１９９７年）の手順によるダンカンの多重範囲検定の後に続く分散分析手順によって統計的に分析された。
処理間での血糖レベルの有意差が、単一の期間と処理のためのすべての期間において、分散分析でｐ＜０．００１、ダンカンでｐ＜０．０５レベルで確立された。
血糖レベルと死亡率の間の相関の計算はＳＡＳの相関手順によって行なわれた。
上に記述されたように、重量が分析された。
標準誤差はすべての処理平均血糖値で報告された。
【００４８】
（結果）
ワクチン接種したものは、ワクチンの注射の２時間後にコントロールの魚（５２．１±５．３７ｍｇ／ｄＬ）より著しく高い血糖レベル（９７．９±９．９０ｍｇ／ｄＬ）になった（データは示さない）。
ワクチン接種したものの血糖レベルは注射後も６時間上がり続けた。しかし、２４時間で注射前のレベルに戻る前には、統計的には上がらなかった。
ワクチン接種の後、ワクチン接種（０時間）より前、又は６及び２４時間で、ワクチン接種したものとコントロールの間の血糖での有意差は示されなかった。
ＴＳＢをＩＰ注入されたコントロールの血糖レベルは、どの時間間隔でも有意差はなかった。
コントロールあるいはワクチン接種したものについて、ワクチン接種後２８日で、魚の死はなかった。
ＩＰ注射による１．５×１０ ４ ＣＦＵのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅのチャレンジおよび感染により、ワクチン接種したもの及びコントロールの両方で、２、２４、４８及び７２時間において０時間よりも著しく高い血糖レベルになった（図４）。
コントロールとワクチン接種したものの間では、著しく高い血糖レベルが、２４、４８および３１２時間で示された。
【００４９】
しかしながら、ワクチン接種したものの血糖レベルは、これらの期間のコントロールのものより低かった。
コントロールのグルコース値は、４８時間でピークに達した（１１７．０±１４．０９ｍｇ／ｄＬ）。
ワクチン接種したものの３１２時間での血糖値（４１．９±２．３９ｍｇ／ｄＬ）は、ワクチン接種とチャレンジに先立って０時間でワクチン接種したもののために得られたものと同一だった。
【００５０】
コントロールは、チャレンジの２４時間後に、感染した魚に典型的な行動異常を示した。
魚は、タンクの底に塊状になり、食物に対する無反応又は遅い反応、及び不活発さを示した。
コントロールでは、ワクチン接種したものよりかなり早く魚の死が起こった。
チャレンジの後、７２時間以内に、コントロールでは６０％の死亡率が示された（図４）。
チャレンジ後９６時間で、ワクチン注射された魚はわずか１匹だけが死んだが、感染又は行動異常のサインを示した魚は皆無だった。
相対パーセント生存率は３１２時間で８３．４だった。
図４は、チャレンジされたワクチン接種したものとコントロールについて、時間に対しての平均のグルコース値とパーセント累積死亡率の関係を示す。
血糖レベルおよび感染したコントロールの死亡率は著しく関連した（ｒ2＝０．９２３６、Ｐ＝０．０１３４）。
瀕死のコントロール（Ｎ＝４）は、脳、前腎、及び腸の培養でＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅポジティブだった。
【００５１】
前述の詳細な説明が、単に実例とその修正のために与えられることは了解される。また、発明の趣旨および範囲から外れない点において変形して行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】腹腔内（ＩＰ）注入及びＩＰによってＳ．ｉｎｉａｅワクチンを接種されたティラピアに、２．６×１０4 ＣＦＵのＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ／魚でチャレンジした平均の累積的なパーセント死亡率（＿はワクチン接種したもの； ＿はワクチン接種しなかったもの）を示す図である。
【図２】腹腔内の（ＩＰ）注射及びＩＰによってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチン（試験３及び４）を接種されたティラピアをＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジした、平均の累積的なパーセント死亡率を示す図である。Ｔ；試験３はチャレンジ投与量２．６×１０3 ＣＦＵ／魚（Δはワクチン接種したもの； ▽はワクチン接種しなかったもの）；試験４はチャレンジ投与量１．５×１０4 ＣＦＵ／魚（＿はワクチン接種したもの； ＿はワクチン接種しなかったもの）。
【図３】Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅワクチンの槽没入及びＩＰによって接種されたティラピアを、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅでチャレンジした、日々の死亡率（試験５及び６）を示す図である。試験５は、チャレンジ投与量３．６×１０5 ＣＦＵ／魚（Ｔ＝ワクチン接種しなかったもの； Ｂ＝ワクチン接種したもの）；試験６はチャレンジ投与量１．７×１０6 ＣＦＵ／魚（Ｃ＝はワクチン接種したもの； Ｄ＝ワクチン接種しないかったもの）。寿命試験手順（ＳＡＳインスティチュート、ケアリー、ノースカロライナ州）。
【図４】チャレンジした後の異なる時点での、ティラピアの平均のグルコース値（ｍｇ／ｄＬ）（線）と累積的なパーセント死亡率との関係を示す（バー）図である。ＩＰ注射によってＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの１．５×１０4 ＣＦＵでチャレンジされたティラピアにおいて、ワクチン接種した１０匹（縞模様バー）及びコントロール（黒いバー）におけるティラピアの累積的なパーセント死亡率、及びワクチン接種した（縞模様ライン）及びコントロール（黒い線）における平均の血糖値。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的に有効な量の、単離されたβ型溶血性のＢ群連鎖球菌連鎖球菌の完全に殺菌した細胞、及びβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液の濃縮エキスから構成されることを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌は莢膜を生成することを特徴とする請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌は、寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７を識別する特性がすべてある株、寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８を識別する特性がすべてある株、あるいはそれの混合を含むことを特徴とする請求項２に記載の配合物。
【請求項４】
前記濃縮エキスは、β型溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物から本質的に成ることを特徴とする請求項１に記載の配合物。
【請求項５】
前記濃縮エキスは、前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌の細胞、細胞壁断片及び細胞内のコンポーネントから実質上取り除くことを特徴とする請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
前記濃縮エキスは、約１キロ・ダルトンより大きな分子量があるβ溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物を含む請求項１に記載の配合物。
【請求項７】
前記細胞外生産物は、約２キロ・ダルトンより大きな分子量であることを特徴とする請求項６に記載の配合物。
【請求項８】
前記細胞外生産物は、約３キロ・ダルトンより大きな分子量であることを特徴とする請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
前記濃縮エキスは、β型溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物から本質的に成ることを特徴とする請求項６の配合物。
【請求項１０】
寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７及び寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８から成るグループから選ばれた株を識別する特性がすべてあることを特徴とする、生物学的な純粋培養物であるＢ群連鎖球菌。
【請求項１１】
請求項１の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１２】
前記魚は、ゴールデンシャイナー、ヒメハヤ、アミキリ、ガルフ・メンハーデン、ハマギギ、ボラ、ピンフィッシュ、アトランティック・クローカー、スポット、ニベ、ブチナマズ、ニジマス、ウナギ、シマスズキ及びそれらのハイブリッド、ハタ、鯛、カレイとティラピアを含むグループから選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記魚はティラピアであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記配合物は腹腔内注射か槽没入によって投与されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項３の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１６】
請求項４の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１７】
請求項６の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１８】
請求項９の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１９】
Ｂ群連鎖球菌から魚をプロテクトするのためのワクチンを生産する方法であって、
ａ）単離されたβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの殺菌ホール・セルを提供し、
ｂ）ベータ溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの細胞外生産物の濃縮エキスを提供し、
ｃ）免疫学的に有効な量の前記完全な殺菌した細胞及び前記濃縮エキスを合わせる
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記殺菌ホール・セルは、単離されたβ型のＢ群溶血連鎖球菌の培養液を本質的な程度の溶菌なしで細胞のおよそ１００％を死滅させることに対し有効な化学的又は物理的な処理法にさらすことにより生産されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項１】
免疫学的に有効な量の、単離されたβ型溶血性のＢ群連鎖球菌連鎖球菌の完全に殺菌した細胞、及びβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液の濃縮エキスから構成されることを特徴とする配合物。
【請求項２】
前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌は莢膜を生成することを特徴とする請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌は、寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７を識別する特性がすべてある株、寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８を識別する特性がすべてある株、あるいはそれの混合を含むことを特徴とする請求項２に記載の配合物。
【請求項４】
前記濃縮エキスは、β型溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物から本質的に成ることを特徴とする請求項１に記載の配合物。
【請求項５】
前記濃縮エキスは、前記β型溶血性のＢ群連鎖球菌の細胞、細胞壁断片及び細胞内のコンポーネントから実質上取り除くことを特徴とする請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
前記濃縮エキスは、約１キロ・ダルトンより大きな分子量があるβ溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物を含む請求項１に記載の配合物。
【請求項７】
前記細胞外生産物は、約２キロ・ダルトンより大きな分子量であることを特徴とする請求項６に記載の配合物。
【請求項８】
前記細胞外生産物は、約３キロ・ダルトンより大きな分子量であることを特徴とする請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
前記濃縮エキスは、β型溶血性のＢ群連鎖球菌の前記培養液の細胞外生産物から本質的に成ることを特徴とする請求項６の配合物。
【請求項１０】
寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０７及び寄託受入番号ＮＲＲＬ Ｂ−３０６０８から成るグループから選ばれた株を識別する特性がすべてあることを特徴とする、生物学的な純粋培養物であるＢ群連鎖球菌。
【請求項１１】
請求項１の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１２】
前記魚は、ゴールデンシャイナー、ヒメハヤ、アミキリ、ガルフ・メンハーデン、ハマギギ、ボラ、ピンフィッシュ、アトランティック・クローカー、スポット、ニベ、ブチナマズ、ニジマス、ウナギ、シマスズキ及びそれらのハイブリッド、ハタ、鯛、カレイとティラピアを含むグループから選ばれることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記魚はティラピアであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記配合物は腹腔内注射か槽没入によって投与されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項３の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１６】
請求項４の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１７】
請求項６の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１８】
請求項９の配合物を投与することを含む、Ｂ群連鎖球菌の感染から魚をプロテクトする方法。
【請求項１９】
Ｂ群連鎖球菌から魚をプロテクトするのためのワクチンを生産する方法であって、
ａ）単離されたβ型溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの殺菌ホール・セルを提供し、
ｂ）ベータ溶血性のＢ群連鎖球菌の培養液からの細胞外生産物の濃縮エキスを提供し、
ｃ）免疫学的に有効な量の前記完全な殺菌した細胞及び前記濃縮エキスを合わせる
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記殺菌ホール・セルは、単離されたβ型のＢ群溶血連鎖球菌の培養液を本質的な程度の溶菌なしで細胞のおよそ１００％を死滅させることに対し有効な化学的又は物理的な処理法にさらすことにより生産されることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５３２４８５（Ｐ２００７−５３２４８５Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４１２４（Ｐ２００７−５０４１２４）
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００８９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９４４７
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５００２２８１９３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月１８日（２００５．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００８９７２
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８９４４７
【国際公開日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５００２２８１９３）
【Ｆターム（参考）】
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