Ｃ型肝炎ウイルスの感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染は、慢性化の割合が高いことにより特徴付けられ、世界中で１億７千万人に影響している。慢性的に感染した患者は、肝脂肪症、線維形成、および様々な程度のインスリン耐性に関連する、免疫メカニズムおよび代謝障害により本質的に媒介される肝障害を示す（１、２）。長期にわたり感染している患者は肝硬変および肝細胞癌を発症するリスクが高いが、多大な尽力にもかかわらず、ＨＣＶ病理の分子的基盤は依然としてほとんど理解されていない。ＨＣＶのゲノムは、翻訳後に構造タンパク質（ＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７）ならびに非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）にプロセシングされるポリタンパク質をコードする、９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡである（３）。
【０００３】
現在の治療法は、ペグ化インターフェロン（ＩＦＮ）アルファおよびリバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の組み合わせにある。しかし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染の転帰は個体間で多様であり、抗ウイルス治療に対する応答が持続する可能性は、ウイルスおよび宿主の特徴に依存する。ＨＣＶの天然に存在する変異体は、６個の主要な遺伝子型に分類される。ウイルスの遺伝子型は、治療の応答に関連する主要な因子の１つである。実際、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）は、遺伝子型１に感染した患者の４５％のみで達成され、一方、遺伝子型２または３に感染した患者の最大８０％がＳＶＲに達する（Ｆｅｌｄ ＪＪ．ら、２００５年）。
【０００４】
したがって、ＨＣＶ感染の他の治療が必要とされており、ＨＣＶタンパク質と宿主（ヒト）タンパク質との間の相互作用に焦点を当てることが奨励されている。細胞タンパク質ネットワークについての、また現在ではウイルス−細胞インタラクトームについての、迅速に増大する知識は、実際、ネットワークに基づいた疾患モデルを提供し始めている。ネットワークアプローチにおいて、ウイルス感染は、細胞インタラクトームの摂動として見ることができる。ウイルスの病原性は、細胞インタラクトームに連結したときにウイルスにより課せられるタンパク質ネットワークに対する新たな制約の発現として現れる。「感染したネットワーク」において喪失しているか、脱調節されているか、または出現する位相的および機能的特性の同定は、感染の複雑な系の分析に対する主要な課題となる。しかし、ヒトタンパク質とウイルスタンパク質との間の相互作用は、依然として完全には記載されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）とウイルスＨＣＶタンパク質ＮＳ３またはＮＳ５Ａとの間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、
ｂ）前記ウイルスファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）と前記ウイルスタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００６】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、超生理学的レベルのファルネソールにより活性化される核受容体である（Ｆｏｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ、１９９５年、８１、６８７〜６９３）。ＦＸＲはまた、ＮＲ１Ｈ４、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ１４）、および胆汁酸受容体（ＢＡＲ）としても知られている。
【０００７】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と、ＡＧＲＮ、ＢＣＡＲ１、ＣＤ６８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＤＸ３Ｙ、ＥＧＦＬ７、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＮ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＸＤ８、ＬＰＸＮ、ＬＲＲＴＭ１、ＬＴＢＰ４、ＭＡＧＥＤ１、ＭＥＧＦ６、ＭＭＲＮ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＡＢＰＮ１、ＰＡＫ４、ＰＬＳＣＲ１、ＲＮＦ３１、ＳＥＴＤ２、ＳＬＣ３１Ａ２、ＶＴＮ、ＶＷＦ、およびＺＮＦ２７１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ１タンパク質と、ＪＵＮ、ＮＲ４Ａ１、ＰＦＮ１、ＳＥＴＤ２、およびＴＭＳＢ４Ｘからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ１タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ２タンパク質と、ＨＯＸＤ８、ＩＴＧＢ１、ＫＩＡＡ１４１１、ＬＯＣ７３０７６５、ＮＲ４Ａ１、ＰＳＭＡ６、ＳＥＴＤ２、およびＳＭＥＫ２からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ２タンパク質と、ＡＤＦＰ、ＡＰＯＡ１、Ｃ７、ＦＢＬＮ５、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＲＰＬ１１、ＲＰＮ１、ＳＥＴＤ２、ＳＭＵＲＦ２、およびＴＲＩＭ２７からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ３タンパク質と、ｓｅｐ−１０、Ａ１ＢＧ、ＡＢＣＣ３、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ２、ＡＥＢＰ１、ＡＨＣＹ、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＮＫＲＤ１２、ＡＮＫＲＤ２８、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＲＦＩＰ２、ＡＲＧ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＮＴ、ＡＲＳ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＺＧＰ１、Ｂ２Ｍ、ＢＣＡＮ、ＢＣＫＤＫ、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＺＲＡＰ１、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ１０ｏｒｆ６、Ｃ１２ｏｒｆ４１、Ｃ１４ｏｒｆ１７３、Ｃ１６ｏｒｆ７、Ｃ１ｏｒｆ１６５、Ｃ１ｏｒｆ９４、Ｃ１Ｓ、Ｃ９ｏｒｆ３０、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＴ、ＣＢＹ１、ＣＣＤＣ２１、ＣＣＤＣ３７、ＣＣＤＣ５２、ＣＣＤＣ６６、ＣＣＤＣ９５、ＣＣＨＣＲ１、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２３、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＮＰＣ１、ＣＥＰ１５２、ＣＥＰ１９２、ＣＥＳ１、ＣＦＰ、ＣＨＰＦ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＲＯ１Ｂ、ＣＯＸ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＸｏｒｆ４５、ＤＥＡＦ１、ＤＥＤＤ２、ＤＥＳ、ＤＬＡＴ、ＤＯＣＫ７、ＤＰＦ１、ＤＰＰ７、ＥＣＨＳ１、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２、ＥＩＦ１、ＥＩＦ４ＥＮＩＦ１、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＦＡＭ６２Ｂ、ＦＡＭ６５Ａ、ＦＡＭ９６Ｂ、ＦＢＦ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ３、ＦＥＳ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＩＧＮＬ１、ＦＬＡＤ１、ＦＬＪ１１２８６、ＦＮ１、ＦＲＭＰＤ４、ＦＲＳ３、ＦＴＨ１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＡ、ＧＢＰ２、ＧＣ、ＧＦＡＰ、ＧＮＢ２、ＧＯＮ４Ｌ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＭＥＲ３、ＨＰ、ＨＴＲＡ１、ＩＦＩ４４、ＩＱＷＤ１、ＩＴＣＨ、ＩＴＧＢ４、ＪＡＧ２、ＪＵＮ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＫＩＡＡ１０１２、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ１７、ＫＩＦ７、ＫＮＧ１、ＫＰＮＡ１、ＫＰＮＢ１、Ｌ３ＭＢＴＬ３、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＣ３、ＬＤＢ１、ＬＯＣ７２８３０２、ＬＲＲＣ７、ＬＲＲＣＣ１、ＬＴＢＰ４、ＬＺＴＳ２、ＭＡＧＥＤ１、ＭＡＰＫ７、ＭＡＲＣＯ、ＭＡＳＰ２、ＭＥＧＦ８、ＭＬＬＴ４、ＭＬＸＩＰ、ＭＯＲＣ４、ＭＯＲＦ４Ｌ１、ＭＰＤＺ、ＭＶＰ、ＭＹＬ６、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＣＡＮ、ＮＤＣ８０、ＮＥＦＬ、ＮＥＦＭ、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＩＤ１、ＮＩＤ２、ＮＯＴＣＨ１、Ｎ−ＰＡＣ、ＮＵＣＢ１、ＮＵＰ１３３、ＮＵＰ６２、ＯＢＳＣＮ、ＯＲＭ１、ＯＴＣ、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ４、ＰＣＹＴ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＧＭ１、ＰＩＣＫ１、ＰＫＮＯＸ１、ＰＬＥＫＨＧ４、ＰＮＰＬＡ８、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＤＩＰ２、ＰＲＧ４、ＰＲＲＣ１、ＰＳＭＡ６、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＥ３、ＰＴＰＲＦ、ＰＴＰＲＮ２、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＩ１４、ＲＡＳＡＬ２、ＲＢＭ４、ＲＣＮ３、ＲＧＮＥＦ、ＲＩＣＳ、ＲＩＮＧ１、ＲＩＮＴ１、ＲＬＦ、ＲＮＦ３１、ＲＯＧＤＩ、ＲＰ１１−１３０Ｎ２４．１、ＲＳＨＬ２、ＲＵＳＣ２、ＳＢＦ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＣＩＳＢＰ２、ＳＥＬＯ、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＥＳＴＤ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＧＣＢ、ＳＩＡＨ１、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＩＴ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＮＸ４、ＳＰＯＣＫ３、ＳＰＯＮ１、ＳＰＰ２、ＳＲＰＸ２、ＳＳＸ２ＩＰ、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＲＡＤ、ＳＶＥＰ１、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＰＯ２、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１５、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＴＢＮ、ＴＢＸＡＳ１、ＴＦ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＡＰ１、ＴＭＥＭ６３Ｂ、ＴＰＳＴ２、ＴＰＴ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＯ、ＴＲＩＰ１１、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＳＨＢＰ１、ＵＸＴ、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＷＤＴＣ１、ＸＡＢ２、ＸＲＮ２、ＹＹ１ＡＰ１、ＺＡＤＨ１、ＺＢＴＢ１、ＺＣＣＨＣ７、ＺＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ４１０、ＺＮＦ４４０、ＺＸＤＣ、およびＺＺＺ３、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ３タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＥＬＡＣ２、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ３、ＵＢＱＬＮ１、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＴＦ６、ＫＮＧ１、およびＮＲ４Ａ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質と、ＡＡＲＳ２、ＡＢＣＣ３、ＡＣＬＹ、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢ、ＡＲＦＩＰ１、ＡＳＸＬ１、ＡＸＩＮ１、Ｃ１０ｏｒｆ３０、Ｃ９ｏｒｆ２３、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＤＰＳ２、ＣＣＤＣ１００、ＣＣＤＣ９０Ａ、ＣＣＴ７、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６３、ＣＥＳ１、ＣＦＨ、ＣＯＬ３Ａ１、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＩＦ３Ｓ２、ＥＴＦＡ、ＦＧＢ、ＦＨＬ２、ＧＬＴＳＣＲ２、ＧＯＬＧＡ２、ＧＰＳ２、ＨＲＳＰ１２、ＩＧＬＬ１、ＩＴＧＡＬ、ＬＤＨＤ、ＬＩＭＳ２、ＬＯＣ３７４３９５、ＭＡＦ、ＭＢＤ４、ＭＫＲＮ２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＭＯＮ２、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＦＥ２、ＮＵＣＢ１、ＯＳ９、ＰＡＲＶＧ、ＰＭＶＫ、ＰＯＭＰ、ＰＰＰ１Ｒ１３Ｌ、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＲＬＦ、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＲＢＰ１、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＳＭＹＤ３、ＳＯＲＢＳ２、ＳＯＲＢＳ３、ＴＨＢＳ１、ＴＭＦ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＴ、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＢＣ、ＵＳＰ１９、ＶＰＳ５２、ＺＧＰＡＴ、ＺＨ２Ｃ２、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ６４６、ＺＮＨＩＴ１、およびＺＮＨＩＴ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６８、ＣＴＳＦ、ＨＯＸＤ８、ＭＧＣ２７５２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＯＳ９、ＯＴＣ、ＰＫＭ２、ＰＳＭＢ９、ＳＥＴＤ２、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＴＡＧＬＮ、およびＴＵＢＢ２Ｃからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＦＢＬＮ２、ＦＸＹＤ６、ＬＭＮＢ１、ＲＮＵＸＡ、ＳＬＣ３９Ａ８、ＳＬＩＴ２、ＵＢＱＬＮ１、およびＵＢＱＬＮ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」という用語は、本明細書において、その病原性株が非Ａ非Ｂ型肝炎としても知られているＣ型肝炎を生じさせるウイルス種を定義するために用いられる。
【００１８】
全てのヒトおよびＨＣＶの遺伝子およびタンパク質を表１に定義する。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
【表５】
【００２４】
【表６】
【００２５】
【表７】
【００２６】
【表８】
【００２７】
【表９】
【００２８】
スクリーニング方法：
本発明は、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）上記のウイルスＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００２９】
１つの実施形態において、ステップｂ）は、前記ＨＣＶタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の相互作用を阻害するための前記候補化合物の能力を明らかにするかまたはしない物理的値を得ること、および前記値を、前記候補化合物の不存在下で行った同一のアッセイにおいて得られた標準的な物理的値と比較することにある。上述した「物理的値」は、実施される結合アッセイに応じて様々な種類のものであり得るが、特に、吸光値、放射性シグナル、および蛍光シグナルの強度値を包含する。物理的値を標準的な物理的値と比較した後であれば、前記候補化合物が前記ＨＣＶタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の結合を阻害することが決定され、そしてその候補はステップｂ）で正の選択をされる。
【００３０】
ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物は、ＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質のいずれかに結合するそのような化合物を包含するが、それは、前記目的の化合物の結合がそれによりＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を妨害するという条件に限ったものである。
【００３１】
標識ポリペプチド：
１つの実施形態において、本発明の任意のタンパク質は、検出可能な分子で標識される。
【００３２】
本発明によれば、前記検出可能な分子は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な任意の化合物または物質からなり得る。例えば、有用な検出可能な分子には、放射性物質（３２Ｐ、２５Ｓ、３Ｈ、もしくは１２５Ｉを含むものを含む）、蛍光色素（５−ブロモデソシルジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、もしくはジゴキシゲニンを含む）、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＹＦＰを含む）、または検出可能なタンパク質もしくはペプチド（ビオチン、ポリヒスチジン尾部、もしくはＨＡ抗原、ＦＬＡＧ抗原、ｃ−ｍｙｃ抗原、およびＤＮＰ抗原などの他の抗原タグを含む）が含まれる。
【００３３】
本発明によれば、検出可能な分子は、目的の前記アミノ酸配列の外側に位置するアミノ酸残基に位置するか、または前記残基に結合し、それにより、前記ポリペプチド間の結合、または前記候補化合物および／もしくは前記ポリペプチドのいずれかの間の結合に対する任意の人為的影響を最小にするかまたは予防する。
【００３４】
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドはＧＳＴタグ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と融合される。この実施形態において、前記融合タンパク質のＧＳＴ部分を検出可能な分子として用いることができる。前記融合タンパク質において、ＧＳＴは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。検出可能なＧＳＴ分子は、標識抗ＧＳＴ抗体を含む抗ＧＳＴ抗体とその後に接触すると検出され得る。様々な検出可能な分子で標識された抗ＧＳＴ抗体は、容易に市場で入手することができる。
【００３５】
別の特定の実施形態において、本発明のタンパク質はポリヒスチジンタグと融合される。前記ポリヒスチジンタグは、通常は少なくとも４つの連続したヒスチジン残基を含み、ほとんどの場合、少なくとも６個の連続したヒスチジン残基を含む。このようなポリペプチドタグはまた、最大２０個の連続したヒスチジン残基を含み得る。前記ポリヒスチジンタグは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。この実施形態において、ポリヒスチジンタグは、標識抗ポリヒスチジン抗体を含む抗ポリヒスチジン抗体とその後に接触すると検出され得る。様々な検出可能な分子で標識された抗ポリヒスチジン抗体は、容易に市場で入手することができる。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明のタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたはアクチベータードメインのいずれかからなるタンパク質部分と融合される。転写の前記タンパク質部分ドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。このようなＤＮＡ結合ドメインは、大腸菌に由来するＬｅｘＡタンパク質の周知のＤＮＡ結合ドメインからなり得る。さらに、転写因子の前記アクチベータードメインは、酵母に由来する周知のＧａｌ４タンパク質のアクチベータードメインからなり得る。
【００３７】
ツーハイブリッドアッセイ：
本発明に従ったスクリーニング方法の１つの実施形態において、本発明のタンパク質は、転写因子の一部分を含む。前記アッセイにおいて、第１および第２の部分が共に結合することで、特異的な調節ＤＮＡ配列に結合する機能的な転写因子が生じ、それが次にレポーターＤＮＡ配列の発現を誘発し、前記発現がさらに検出および／または測定される。前記レポーターＤＮＡ配列の発現の正の検出は、前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質が共に結合することにより、活性な転写因子が形成されることを意味する。
【００３８】
通常、ツーハイブリッドアッセイにおいて、転写因子の第１および第２の部分はそれぞれ、（ｉ）転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）転写因子のアクチベータードメインからなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびアクチベータードメインは両方とも、同一の天然に存在する転写因子に由来する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびアクチベータードメインは異なる天然に存在する因子に由来するが、共に結合すると、これらの２つの部分は活性な転写因子を形成する。「部分」という用語は、転写因子について本明細書において用いられる場合、複数のタンパク質転写因子に関与する完全なタンパク質、ならびに完全な転写因子タンパク質の特定の機能的なタンパク質ドメインを包含する。
【００３９】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法のステップａ）は、
（１） − （ｉ）上記に定義したＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）転写因子の第１のタンパク質部分との間の第１の融合ポリペプチド、
− （ｉ）上記に定義したヒトタンパク質と（ｉｉ）転写因子の第２の部分との間の第２の融合ポリペプチド、
を発現する宿主細胞を提供するステップであって、
第１および第２のタンパク質部分が共に結合すると、前記転写因子がＤＮＡの標的調節配列に対して活性となり、
前記宿主細胞が、（ｉ）前記活性な転写因子によって活性化され得る調節ＤＮＡ配列と、（ｉｉ）前記調節配列に作動可能に連結しているＤＮＡレポート配列とを含む核酸も含む
ステップ、
（２）ステップ１）で得られた前記宿主細胞を試験される候補化合物と接触させるステップ、
（３）前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルを決定するステップ
を含む。
【００４０】
上記のステップ（３）で決定された前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルは、ステップ（２）が省略された場合の前記ＤＮＡレポーター配列の発現と比較される。候補化合物の存在下における前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルが低いことは、前記候補化合物がＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の結合を効果的に阻害すること、および前記候補化合物がスクリーニング方法のステップｂ）において正の選択をされ得ることを意味する。
【００４１】
適切な宿主細胞には、限定はしないが、原核細胞（細菌など）および真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれる。しかし、好ましい宿主細胞は酵母細胞であり、より好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ細胞である。
【００４２】
ツーハイブリッドアッセイの類似の系が当技術分野において周知であり、したがって、本発明に従ったスクリーニング方法を実施するために用いられ得る（Ｆｉｅｌｄｓら、１９８９年；Ｖａｓａｖａｄａら、１９９１年；Ｆｅａｒｏｎら、１９９２年；Ｄａｎｇら、１９９１年；Ｃｈｉｅｎら、１９９１年、ＵＳ５，２８３，１７３、ＵＳ５，６６７，９７３、ＵＳ５，４６８，６１４、ＵＳ５，５２５，４９０、およびＵＳ５，６３７，４６３を参照されたい）。例えば、これらの文献に記載されているように、Ｇａｌ４アクチベータードメインを、本発明に従ったスクリーニング方法を実施するために用いることができる。Ｇａｌ４は、２つの物理的に別のモジュールドメインからなり、その１つはＤＮＡ結合ドメインとして作用し、残りの１つは転写活性化ドメインとして機能する。前述の文献に記載されている酵母発現系は、この特性を利用したものである。Ｇａｌ４活性化プロモーターの制御下でのＧａｌ１−ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧａｌ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する発色基質を用いて検出される。タンパク質−タンパク質相互作用を同定するための競合キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ、商標）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。
【００４３】
したがって、１つの実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質はＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、上記で定義された第２のヒトタンパク質はＧａｌ４の活性化ドメインに融合される。
【００４４】
前記検出可能なマーカー遺伝子の発現は、産生される対応する特異的ｍＲＮＡの量を定量することにより評価することができる。しかし、通常は、検出可能なマーカー遺伝子の配列は検出可能なタンパク質をコードしており、その結果、前記検出可能なマーカー遺伝子の発現レベルは、産生される対応するタンパク質の量を定量することにより評価される。ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するための技術は、当技術分野において周知である。例えば、調節配列の制御下に置かれた検出可能なマーカー遺伝子は、上述のβ−ガラクトシダーゼからなり得る。
【００４５】
ウェスタンブロッティング：
別の１つの実施形態において、ステップａ）は、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質の混合物を、試験される候補化合物の存在下または不存在下でゲル移動アッセイに供し、その後、前記ポリペプチド間に形成された複合体の検出を行うことにより前記ポリペプチドの全ての結合を測定するステップを含む。ゲル移動アッセイは、当業者によって知られているようにして実施することができる。
【００４６】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法のステップａ）は、
（１）上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質を提供するステップ、
（２）試験される候補化合物を前記ポリペプチドに接触させるステップ、
（３）ステップ（２）で得られた前記ポリペプチドおよび前記候補化合物を有する適切な移動基質のゲル移動アッセイを実施するステップ、
（４）ステップ（３）で実施された移動アッセイにおいて前記ポリペプチド間で形成された複合体を検出および定量するステップ
を含む。
【００４７】
次に、タンパク質間で形成された複合体の存在または量を、試験される候補化合物の不存在下でアッセイを実施した場合に得られる結果と比較する。したがって、タンパク質間の複合体が検出されない場合、あるいは、これらの複合体が、候補化合物の不存在下で得られる量と比較して少ない量で存在する場合、候補化合物はスクリーニング方法のステップｂ）で正の選択をされ得る。
【００４８】
第１および第２のタンパク質の間で形成される複合体は特定の明らかな分子量を有するため、前記２つのタンパク質間で形成される複合体の検出は、移動ゲルを適切な色素で染色すること、そして分析されるタンパク質に対応するタンパク質バンドを決定することにより容易に実施することができる。ゲルにおけるタンパク質の染色は、標準的なクマシーブリリアントブルー（もしくはＰＡＧＥブルー）、アミドブラック、または様々な種類の銀染色試薬を用いて行うことができる。ドデシル（ラウリル）硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルなどの適切なゲルが、当技術分野において周知である。通常の様式において、ウェスタンブロッティングアッセイが当技術分野において周知であり、広く記載されている（Ｒｙｂｉｃｋｉら、１９８２年；Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９年；Ｋｕｒｉｅｎら、２００６年）。
【００４９】
特定の実施形態において、ゲル移動アッセイに供されるタンパク質に対応するタンパク質バンドは、特異的な抗体によって検出することができる。ＨＣＶタンパク質に対する抗体およびヒトタンパク質に対する特異的な抗体の両方を用いることができる。
【００５０】
別の実施形態において、前記２つのタンパク質は、上記の検出可能な抗原で標識される。したがって、タンパク質バンドは、前記検出可能な抗原に対する特異的な抗体によって検出することができる。好ましくは、ＨＣＶタンパク質に結合する検出可能な抗原は、ヒトタンパク質に結合する抗原とは異なる。例えば、第１のＨＣＶタンパク質は検出可能なＧＳＴ抗原に融合され得、第２のヒトタンパク質はＨＡ抗原と融合され得る。そして、２つのタンパク質間で形成されたタンパク質複合体は、それぞれＧＳＴ抗原およびＨＡ抗原に対する抗体で定量および決定され得る。
【００５１】
バイオセンサーアッセイ：
別の実施形態において、ステップａ）は、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９７年）およびＳｚａｂｏら（１９９５年）により記載されているような光バイオセンサーの使用を含んでいた。この技術により、標識された分子を必要とすることなく、分子間の相互作用をリアルタイムで検出することが可能になる。この技術は実際、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づくものである。簡潔に述べると、第１のタンパク質パートナーが表面（カルボキシメチルデキストランマトリクスなど）に付着する。次に、第２のタンパク質パートナーが、試験される候補化合物の存在下または不存在下で、事前に固定された第１のパートナーと共にインキュベートされる。次に、前記タンパク質パートナー間の、結合レベルを含む結合、または結合の不存在が検出される。この目的のために、光ビームが、試験される試料を含まない基質の表面領域側に向けられ、前記表面により反射される。ＳＰＲ現象により、角度および波長の組み合わせで反射光の強さが低減する。第１および第２のタンパク質パートナーの結合により、基質表面での屈折率が変化し、この変化がＳＰＲシグナルにおける変化として検出される。
【００５２】
アフィニティークロマトグラフィー：
本発明の別の１つの実施形態において、スクリーニング方法には、アフィニティークロマトグラフィーの使用が含まれる。
【００５３】
上記のスクリーニング方法において用いるための候補化合物はまた、上記で定義された（ｉ）第１のＨＣＶタンパク質または（ｉｉ）第２のヒトタンパク質が当業者に周知の技術に従って事前に上に固定されている任意のクロマトグラフィー基質を用いる、任意の免疫アフィニティークロマトグラフィー技術によって選択することができる。簡潔に述べると、上記で定義されたＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質は、アガロースであるＡｆｆｉ Ｇｅｌ（登録商標）などの適切なカラムマトリクスまたは当業者に有名な他のマトリクスへの化学的結合を含む従来の技術を用いてカラムに付着させることができる。この方法のいくつかの実施形態において、アフィニティーカラムは、上記で定義されたＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質がグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されているキメラタンパク質を含む。次に、候補化合物を、アフィニティーカラムのクロマトグラフィー基質に、前記第１および第２のタンパク質の間の他のタンパク質より前に、それと同時に、または連続して接触させる。洗浄した後、クロマトグラフィー基質を溶出し、回収された溶出溶液を、後に適用された前記第１または第２のタンパク質の検出および／または定量により分析し、それにより、候補化合物が（ｉ）第１のＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）第２のヒトタンパク質との間の結合を減少させているかどうか、および／またはその減少の程度を決定する。
【００５４】
蛍光アッセイ：
本発明に従ったスクリーニング方法の別の１つの実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、蛍光分子または蛍光基質で標識される。したがって、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質と第２のヒトタンパク質との間の結合に対する、試験される候補化合物の潜在的な改変効果が、蛍光の定量により決定される。
【００５５】
例えば、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、上記のＧＦＰまたはＹＦＰなどの自己蛍光ポリペプチドと融合され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質はまた、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて前記タンパク質間の結合について蛍光の検出および／または定量を実施するために適した蛍光分子で標識され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光分子との化学的共有結合によって、蛍光分子で直接的に標識され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質はまた、例えば前記ポリペプチドと前記蛍光分子との間の非共有結合により、蛍光分子で間接的に標識され得る。実際、上記で定義された前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、受容体またはリガンドと融合することができ、前記蛍光分子は、対応するリガンドまたは受容体と融合することができ、その結果、蛍光分子は、前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質に非共有結合し得る。適切な受容体／リガンドの対は、ビオチン／ストレプトアビジンの対になったメンバーであり得るか、または、抗原／抗体の対になったメンバーの間で選択され得る。例えば、本発明に従ったタンパク質は、ポリヒスチジン尾部に融合することができ、蛍光分子は、ポリヒスチジン尾部に対する抗体と融合することができる。
【００５６】
既に特定されているように、本発明に従ったスクリーニング方法のステップａ）は、ＦＲＥＴを用いた蛍光アッセイによる、上記で定義されたＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力の決定を包含する。したがって、特定の実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質は第１のフルオロフォア物質で標識され、第２のヒトタンパク質は第２のフルオロフォア物質で標識される。第１のフルオロフォア物質は、第２のフルオロフォアの励起波長値とほぼ等しい波長値を有し得、それにより、前記第１および第２のタンパク質の結合は、第２のフルオロフォア物質の発光波長で発光される蛍光シグナルの強度を測定することにより検出される。あるいは、第２のフルオロフォア物質はまた、第１のフルオロフォアの発光波長値を有し得、それにより、前記および第２のタンパク質の結合は、第１のフルオロフォア物質の波長で発光される蛍光シグナルの強度を測定することにより検出される。
【００５７】
用いられるフルオロフォアは、周知のランタニドキレートなどの様々な適切な種類のものであり得る。これらのキレートは、特異性のバイオアフィニティーアッセイにおいて化学的安定性、生物学的結合後の寿命の長い蛍光（０．１ｍｓを超える寿命）、および顕著なエネルギー移動を有していることが記載されている。文献ＵＳ５，１６２，５０８は、ビピリジンクリプテートを開示している。ＴＥＫＥＳ型の光感作物質（ＥＰ０２０３０４７Ａ１）およびテルピリジン型の光感作物質（ＥＰ０６４９０２０Ａ１）を有するポリカルボキシレートキレート剤が知られている。文献ＷＯ９６／００９０１は、カルボスチリルを感作物質として用いるジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）キレートを開示している。他の感作物質および他のトレーサー金属を有するさらなるＤＰＴキレートが、診断または画像化の使用について知られている（例えば、ＥＰ０４５０７４２Ａ１）。
【００５８】
好ましい実施形態において、スクリーニング方法のステップａ）で実施される蛍光アッセイは、文献ＷＯ００／０１６６３またはＵＳ６，７４０，７５６において記載されているような均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイからなり、前記文献の両方の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＴＲＦは、ＴＲＦ（時間分解蛍光）およびＦＲＥＴの両方の原理を用いる、ＴＲ−ＦＲＥＴに基づいた技術である。より具体的には、当業者であれば、Ｌｅｂｌａｎｃら（２００２年）において記載されている時間分解増幅クリプテート発光（ＴＲＡＣＥ）技術に基づいたＨＴＲＦアッセイを用い得る。ＨＴＲＦドナーフルオロフォアは、ランタニドの長寿命の発光とクリプテートのカプセル封入の安定性とを組み合わせて有する、ユーロピウムクリプテートである。紅藻類から精製された修飾アロフィコシアニンであるＸＬ６６５は、ＨＴＲＦの主要なアクセプターフルオロフォアである。これらの２つのフルオロフォアが生体分子相互作用により一緒にされると、励起の間にクリプテートにより捕捉されるエネルギーの一部は６２０ｎｍでの蛍光発光を介して放出され、一方、残りのエネルギーはＸＬ６６５に移動する。このエネルギーは次に、６６５ｎｍでの特異的な蛍光として、ＸＬ６６５により放出される。６６５ｎｍの光は、ユーロピウムを有するＦＲＥＴを介してのみ発光される。ユーロピウムクリプテートは常にアッセイ内に存在するため、６２０ｎｍの光は、生体分子の相互作用がＸＬ６６５を近接させない場合であっても検出される。
【００５９】
したがって、１つの実施形態において、スクリーニング方法のステップａ）はしたがって、
（１）− 第１の抗原に融合された第１のＨＣＶタンパク質、
− 第２の抗原に融合された第２のヒトタンパク質、
− 試験される候補化合物
を含むプレアッセイ試料を接触させるステップ、
（２）ステップ（１）の前記プレアッセイ試料に
− 前記第１の抗原に対して特異的な、ヨーロピアンクリプテートで標識された少なくとも１つの抗体、
− 前記第２の抗原に対するＸＬ６６５で標識された少なくとも１つの抗体
を添加するステップ、
（３）前記ヨーロピアンクリプテートの励起波長でステップ（２）のアッセイ試料を照射するステップ、
（４）ＸＬ６６５の発光波長で発光される蛍光シグナルを検出および／または定量するステップ、
（５）ステップ（４）で得られた蛍光シグナルを、ステップ（１）のプレアッセイ試料が試験される候補化合物の不存在下で調製される場合に得られる蛍光と比較するステップ
を含み得る。
【００６０】
上記のステップ（５）において、蛍光シグナルの強度値が、ステップ（１）のプレアッセイ試料が試験される候補化合物の不存在下で調製される場合に見られる蛍光シグナルの強度値よりも低い場合、候補化合物は、スクリーニング方法のステップｂ）で正の選択をされ得る。
【００６１】
ヨーロピアンクリプテートで標識されたかまたはＸＬ６６５で標識された抗体は、それが含む、ＧＳＴ、ポリヒスチジン尾部、ＤＮＰ、ｃ−ｍｙｘ、ＨＡ抗原、およびＦＬＡＧを含む、目的の様々な抗原に対するものであり得る。このような抗体は、ＣｉｓＢｉｏ（Ｂｅｄｆｏｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から市販されているもの、とりわけそれぞれ６１ＧＳＴＫＬＡまたは６１ＨＩＳＫＬＢと呼ばれるものを包含する。
【００６２】
候補化合物：
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の候補化合物は、事前に合成された化合物のライブラリー、またはデータベースにおいて構造が決定されている化合物のライブラリー、またはデノボ合成されている化合物のライブラリーから選択され得る。
【００６３】
候補化合物は、（ａ）タンパク質またはペプチド、（ｂ）核酸、および（ｃ）有機または化学的化合物の群から選択され得る。具体的には、事前に選択された候補核酸のライブラリーは、文献ＵＳ５，４７５，０９６およびＵＳ５，２７０，１６３において記載されているＳＥＬＥＸ方法を実施することにより得ることができる。さらに具体的には、候補化合物は、上記の前記ＨＣＶタンパク質および前記ヒトタンパク質に対する抗体の群から選択され得る。
【００６４】
インビボでのスクリーニング方法：
本明細書において先に記載したインビトロでのスクリーニングの実施形態のいずれか１つの最後に正の選択をされた候補化合物を、その抗ＨＣＶ生物学的特性をさらにアッセイすることを考慮したさらなる選択ステップに供することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質の生産：
本発明のタンパク質は、限定はしないが、単独のまたは組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝的、または酵素的技術などの、それ自体が当技術分野において知られている任意の技術によって生産することができる。
【００６６】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者は、標準的な技術によって前記タンパク質を容易に生産することができる。例えば、前記タンパク質は、周知の固相方法を用いて、好ましくは、市販されているペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより製造されているものなど）を製造者の指示に従って用いて合成することができる。
【００６７】
あるいは、本発明のタンパク質は、当技術分野において現在周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、これらの断片は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望のタンパク質を発現するであろう適切な真核宿主または原核宿主内に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、前記宿主から、周知の技術を用いて前記断片を後に単離することができる。
【００６８】
宿主／発現ベクターの広範な組み合わせが、本発明のポリペプチドをコードする核酸の発現において採用される。使用され得る有用な発現ベクターには、例えば、染色体断片、非染色体断片、および合成ＤＮＡ配列が含まれる。適切なベクターには、限定はしないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体、ならびに既知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９、およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８９などのファージＩの多数の誘導体などのファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミドまたは２ミクロンプラスミドの誘導体などの酵母プラスミド、ならびにセントロメアおよび組み込み性の酵母シャトルベクター；昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは発現制御配列を採用するために改変されているプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクターなどが含まれる。
【００６９】
したがって、哺乳動物および典型的にはヒトの細胞、ならびに細菌、酵母、真菌、昆虫、線虫、および植物の細胞が本発明において用いられ、本明細書において定義される核酸または組換えベクターによってトランスフェクトされ得る。適切な細胞の例には、限定はしないが、ＶＥＲＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２などのＨＥＬＡ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１などのＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ−７細胞およびＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０の細胞などのＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３６１などの３Ｔ３、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２細胞、２９３Ｔ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１などのＳｆ９細胞、ならびにＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０などのＣｖ１細胞が含まれる。本発明において用いることができる他の適切な細胞には、限定はしないが、大腸菌などの原核宿主細胞株（例えば、ＤＨ５−［アルファ］株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の株が含まれる。本発明において用いることができるさらなる適切な細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのものなどの酵母細胞が含まれる。
【００７０】
治療的方法および使用：
さらなる態様において、本発明は、上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する治療有効量の化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、ＨＣＶ感染を治療するかまたはＨＣＶ感染を予防するための方法を提供する。前記化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定することができる。
【００７１】
本発明の背景において、本明細書において用いられる「治療する」または「治療」という用語は、このような用語が適用される障害もしくは状態、または、肝障害、肝脂肪症に関連する代謝障害、線維形成、およびインスリン耐性などの、このような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状を回復に向かわせること、軽減すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。
【００７２】
本発明によれば、「患者」または「治療を必要とする対象」という用語は、ＨＣＶ感染に罹患しているかまたは罹患していると考えられるヒトまたはヒト以外の哺乳動物を意味する。
【００７３】
本発明の「治療有効量の」化合物は、任意の医療に適用可能な妥当な利益／リスク比の、ＨＣＶの感染を治療するために十分な量の化合物を意味する。しかし、本発明の化合物および本発明の組成物の毎日の使用量の全体は信頼できる医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。あらゆる特定の患者にとっての具体的な治療有効な用量レベルは、治療される障害およびその障害の重症度、採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、採用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度、治療の期間、採用される特定の化合物と組み合わせてまたはそれと同時に用いられる薬剤、ならびに医薬分野において周知の類似の因子を含む、様々な因子に依存する。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増大させることは、当技術分野の技術の範囲内に十分含まれる。
【００７４】
別の１つの実施形態において、本発明は、ＨＣＶ感染を治療することまたはＨＣＶ感染を予防することを目的とした医薬品の製造のための、上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００７５】
上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることができる。「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物、とりわけヒトに必要に応じて投与されたときに副作用、アレルギー反応、または他の有害な反応をもたらさない分子実体および組成物について言う。薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体、または液体のフィラー、希釈剤、カプセル封入材料、または製剤補助剤を言う。
【００７６】
以下の図面および実施例を考慮して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＨＣＶ相互作用ネットワークを示す図である。
【００７８】
Ａ．命名。Ｖ：ウイルスタンパク質（黒のノード）。ＨＨＣＶ：ＨＣＶタンパク質と相互作用するヒトタンパク質（赤のノード）。ＨＮＯＴ−ＨＣＶ：ＨＣＶタンパク質と相互作用しないヒトタンパク質（青のノード）。Ｖ−ＨＨＣＶ：ＨＣＶ−ヒトタンパク質相互作用（赤のエッジ）。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶ：ＨＣＶと相互作用するヒトタンパク質間の相互作用（青のエッジ）。Ｈ−Ｈ：ヒト−ヒトタンパク質相互作用（青のエッジ）。Ｖ−ＨＨＣＶは、ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を表す（黒の四角）。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶは、ウイルスタンパク質と相互作用するヒトタンパク質からなる（赤の四角）。Ｈ−Ｈネットワークは、ヒトタンパク質間の相互作用を表す（青の四角）。
【００７９】
Ｂ．タンパク質およびＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークにおける相互作用の数。
ＨＣＶタンパク質と相互作用するヒトタンパク質（ＨＨＣＶ）の数、およびタンパク質−タンパク質相互作用（Ｖ−ＨＨＣＶ ＰＰＩ）の対応する数。データは、本発明の酵母ツーハイブリッドスクリーン（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ）および文献をキュレーションした相互作用（ＩＭＡＰ ＬＣＩ）について示されている。
【００８０】
Ｃ．コアフィニティー精製アッセイによるＹ２Ｈ相互作用の検証。９回のｃｏ−ＡＰの正のアッセイが示されており、ＮＳ５Ａ−ＳＯＲＢＳ２（１）、ＮＳ３−ＣＡＬＣＯＣＯ２（２）、ＮＳ５Ａ−ＢＩＮ１（３）、ＮＳ５Ａ−ＭＯＢＫ１Ｂ（４）、ＮＳ５Ａ−ＥＦＥＭＰ１（５）、ＮＳ３−ＰＳＭＢ９およびＮＳ５Ａ−ＰＳＭＢ９（６）、ＮＳ５Ａ−ＰＰＰＩＲＩ３Ｌ（７）、ＮＳ３−ＲＡＳＡＬ２（８）を表している。ＧＳＴタグ付けされたウイルスベイト（＋）または陰性対照であるＧＳＴ単独（−）でのプルダウンの後、細胞プレイを抗Ｆｌａｇ抗体で同定する。抗ＧＳＴ抗体は、ＧＳＴ単独またはＧＳＴタグ付けされたウイルスベイトのいずれかを同定する。細胞溶解物における細胞プレイの発現は、抗Ｆｌａｇにより制御される（最下部のパネル）。
【００８１】
【図２】ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークのグラフィック表示である。
【００８２】
Ａ．Ｈ−Ｈネットワークのグラフィック表示。それぞれのノードはタンパク質を表し、それぞれのエッジは相互作用を表す。赤および青のノードはそれぞれＨＨＣＶおよびＨＮＯＴ−ＨＣＶである。
【００８３】
Ｂ．Ｖ−ＨＨＣＶ相互作用ネットワークのグラフィック表示。黒のノード：ウイルスタンパク質、赤のノード：ヒトタンパク質、赤のエッジ：ヒトタンパク質とウイルスタンパク質との間の相互作用（Ｖ−ＨＨＣＶ）、青のエッジ：ヒトタンパク質間の相互作用（ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶ）。１９６個のタンパク質を含む最大の成分がネットワークの中央部に表されている。３つの他の連結した成分に属する細胞タンパク質の名称もまた表されている。
【００８４】
【図３】ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの位相分析を示す図である。
【００８５】
Ａ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨおよびＨＨＣＶの位相分析。ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られる全てのヒトタンパク質およびＨＨＣＶについて、程度（ｋ）、媒介性（ｂ）、および最短経路（ｌ）を計算した。
【００８６】
Ｂ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨタンパク質およびＨＨＣＶタンパク質の程度および媒介性の分布。Ｈタンパク質（青）およびＨＨＣＶタンパク質（赤）の、標準化されたｌｏｇ程度（左）およびｌｏｇ媒介性（右）の分布。実線は、線形回帰のフィットを表す。垂直な点線は、程度および媒介性の値の平均を示す。それぞれのクラスは、従来の標準誤差と共に表されている。
【００８７】
Ｃ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨの程度および媒介性の相関関係。Ｈ−ＨネットワークにおけるＨタンパク質の、標準化されたｌｏｇ程度（ｘ軸）およびｌｏｇ媒介性（ｙ軸）。黒の実線は、線形回帰のフィットを表す（Ｒ２＝０．５６）。水平および垂直な点線はそれぞれ、程度および媒介性の値の平均を示す。低い程度（ＬＤ）および高い程度（ＨＤ）のクラスを、平均の程度でのカットオフを用いることにより定義した。
【００８８】
Ｄ．低いおよび高い程度のタンパク質についてのＨＮＯＴ−ＨＣＶおよびＨＨＣＶの程度および媒介性の平均。上部：ＨＮＯＴ−ＨＣＶ（青）およびＨＨＣＶ（赤）の媒介性の平均（ｌｏｇスケール）を、ＬＤおよびＨＤクラスについて示す。下部：ＨＮＯＴ−ＨＣＶ（青）およびＨＨＣＶ（赤）の程度の平均を、ＬＤおよびＨＤクラスについて示す。従来の標準誤差閾値およびＵ検定のｐ値が表されている（＊＊＊：ｐ値＜１０−１０、ＮＳ：有意性なし）。
【００８９】
【図４】ＩＪＴネットワークを示す図である。
【００９０】
Ａ．ＩＪＴネットワークのグラフィック表示。ＫＥＧＧアノテーションに従った、インスリン（青）、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ（赤）、およびＴＧＦβ（緑）経路のタンパク質（ノード）メンバー、ならびにそれらの相互作用（エッジ）が示されている（ＨＣＶタンパク質と相互作用するタンパク質が指定されている）。２つの経路により共有されるタンパク質は第２の色（ピンク、黄、および青緑）で示されている。灰色および黒のノードは、ＫＥＧＧ経路を連結しＨＣＶタンパク質と相互作用する隣接物である（灰色：ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られるタンパク質、黒：ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットから得られるタンパク質）。ＨＣＶと相互作用するがＫＥＧＧ経路は連結しない隣接物は表されていない。論じられるタンパク質の例であるＰＬＳＣＲ１およびＹＹ１は四角の中にある。インタラクティブな可視化のツールは補足的なファイルで提供される（ネットワークの可視化）。
【００９１】
ＢおよびＣ．Ｖ−ＨＨＣＶおよびＩＪＴネットワークにおけるそれぞれのウイルスタンパク質の相対的寄与。３つの最も相互作用するウイルスタンパク質のパーセンテージを示す。ＣＯＲＥ相互作用の５１．３％は、ＩＪＴネットワークに集中している。
【００９２】
【図５】ＨＣＶと接着斑との相互作用を示す図である。
【００９３】
Ａ．ＫＥＧＧから採用された接着斑の略図（ＩＤ：Ｈｓ０４５１０）。ＨＨＣＶは、オレンジの四角で表されており、ＨＮＯＴ−ＨＣＶは青の四角で表されている。
【００９４】
ＢおよびＣ．ＮＳ３およびＮＳ５Ａによる接着斑の摂動の機能的検証。
９６ウェルプレートを様々な濃度のフィブロネクチン（Ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（Ｃ）で被覆した。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａを発現する２９３Ｔ細胞を、マトリクス上に３０分間にわたり播種した。接着細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ＦＡ５０は、最大接着の半分に必要なマトリクス濃度である。値は、３つの独立した実験の平均をその標準偏差と共に表す。
【００９５】
【図６】ＨＣＶのＯＲＦｅｏｍｅを示す図である。ＨＣＶゲノム、およびＹ２Ｈのスクリーンのために設計されたＯＲＦの定義の略図。ＨＣＶのプラス鎖ゲノム（紫）は、１０個のタンパク質に共翻訳的にプロセシングされるポリタンパク質（オレンジ）をコードする。赤：完全長タンパク質、青：ドメイン、黄＋緑：ＮＳ４Ａ＋ＮＳ３キメラ融合体、ピンク：ＮＳ５Ａ膜アンカー。それぞれの構築物のゲノムおよびポリタンパク質の位置が表に示される。
【００９６】
【図７】Ｈ−ＨネットワークにおけるＨ、ＨＨＣＶ、およびＨＥＢＶタンパク質の程度および媒介性の分布を示す図である。Ｈタンパク質（青）、ＨＨＣＶ（赤）、およびＨＥＢＶ（緑）のｌｏｇ程度（左）およびｌｏｇ媒介性（右）の分布。実線は線形回帰のフィットを表す。垂直な点線は、程度および媒介性の値の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
表Ｓ１：ＨＨＣＶのリスト。
【００９８】
ＨＣＶタンパク質は、それらのＮＣＢＩの成熟ペプチド生成物名に従って参照される（第１欄）。ヒトタンパク質は、それらの同族のＮＣＢＩ遺伝子名および遺伝子ＩＤと共に参照される（第２および３欄）。ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ（スクリーニング方法に従ってＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２）のＩＳＴの数が第４および５欄に示される。テキストマイニングおよびＢＩＮＤデータベースに関連するＰｕｂＭｅｄ ＩＤから得られたＩＭＡＰ ＬＣＩ（文献をキュレーションした相互作用）が第６および７欄に示される。コアフィニティー精製（ＣｏＡＰ）またはＹ２Ｈペアワイズマトリクスの検証が第８および９欄に示される（＋：ＩＭＡＰ検証、−：検証されず、ＮＡ：タンパク質発現の欠損またはＧＳＴと直接的に相互作用する細胞タンパク質のためにアッセイ不可能）。
【００９９】
表Ｓ２：２つ以上のウイルスタンパク質と相互作用するヒト細胞タンパク質のリスト。
【０１００】
ヒトタンパク質は、それらの同族のＮＣＢＩ遺伝子名と共に参照される（第１欄）。ＨＣＶタンパク質は、それらのＮＣＢＩの成熟ペプチド生成物名に従って参照される（第２欄）。データセットの由来源（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ、ＩＭＡＰ ＬＣＩ、第３欄）。
【０１０１】
表Ｓ３：ＨＣＶ−ヒトネットワークの位相分析
ＨＣＶ−ヒトネットワークの連結された成分。
【０１０２】
Ｖ−ＨＨＣＶサブネットワークの最大の成分のサイズおよび連結された成分の数を計算した（ＩＭＡＰデータセット、第２欄）。観察された値の有意性を検定するために、本発明者らは、ランダムなサブネットワークを１０００個のシミュレーションした後の最大の成分のサイズの平均および連結された成分の数の平均を計算した（ＩＭＡＰ Ｓｉｍ、第３欄）。観察された値とシミュレーションされた値との間の差異は非常に有意であった（＊＊＊：ｐ値＜１０−１０）。
【０１０３】
ヒトインタラクトームにおけるＨＨＣＶタンパク質およびＨＥＢＶタンパク質の位相特性。
【０１０４】
完全なインタラクトーム（Ａ）、信頼性の高いインタラクトーム（Ｂ、少なくとも２つのＰＭＩＤを有するかまたは２つの異なる方法によって検証されたＰＰＩのみを含む）。タンパク質およびヒトインタラクトーム内に組み込まれ得るＰＰＩの数がＨＨＣＶおよびＨＥＢＶについて示される。ヒトインタラクトーム内に存在するＨＨＣＶおよびＨＥＢＶのパーセンテージが、データセットの由来源に従って示される。程度（ｋ）、媒介性（ｂ）、および最短経路（ｌ）の平均を、完全なおよび信頼性の高いインタラクトームの両方においてＨＨＣＶおよびＨＥＢＶについて計算した（２５）。
【０１０５】
表Ｓ４：ＨＨＣＶについてのＫＥＧＧ経路の強化。
【０１０６】
過剰に表されたＫＥＧＧ経路を、複数の検定調整の後に有意であると同定し（調整されたｐ値＜５×１０−２）、ウイルスタンパク質ごとに列挙する。それぞれの経路について、括弧内のＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットの相対的寄与と共に、ＨＨＣＶの数が示される。黒の四角は、論じられている経路を強調するものである。
【０１０７】
表Ｓ５：ＩＪＴネットワークにおけるＨＣＶタンパク質の分布および強化。
【０１０８】
Ａ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＩＪＴネットワークにおけるＨＨＣＶの強化。ＨＨＣＶの数がＶ−ＨＨＣＶおよびＩＪＴネットワークにおいて示される。ＩＪＴネットワークにおけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【０１０９】
Ｂ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの強化。（ＫＥＧＧデータベースにおいて定義されている）Ｖ−ＨＨＣＶネットワークならびにＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの数が示される。Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【０１１０】
Ｃ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路におけるＨＨＣＶの強化。相互経路は、２つまたは３つのＫＥＧＧ経路を連結するＨＨＣＶとして定義される。ＨＨＣＶの数が、Ｖ−ＨＨＣＶネットワークならびにＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路において示される。Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路におけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【実施例】
【０１１１】
＜実施例１＞
概説
Ｃ型肝炎ウイルスとヒトタンパク質との間の相互作用のプロテオームワイドなマッピングを実施して、細胞感染の包括的な見解を提供した。全部で３１４の、ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用を酵母ツーハイブリッドにより同定し、１７０の前記相互作用を文献マイニングにより同定した。再構築したヒトインタラクトーム内へのこのデータセットの組み込みにより、ＨＣＶと相互作用する細胞タンパク質が、非常に中心的で相互に連結されたタンパク質において強化されていることが示された。機能アノテーションに基づいた全体的な分析は、ＨＣＶにより標的化される細胞経路の強化を強調した。慢性的に感染した患者の頻繁な臨床障害に関連するタンパク質のネットワークを、インスリン、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、およびＴＧＦβ経路をＨＣＶにより標的化される細胞タンパク質と連結することにより構築した。ＣＯＲＥタンパク質は、このネットワークの主要な摂動付与物質として現れた。接着斑を、ＨＣＶ、主にＮＳ３およびＮＳ５Ａタンパク質により影響される新たな機能として同定した。
【０１１２】
材料および方法：
ＨＣＶのＯＲＦｅｏｍｅの構築。
【０１１３】
ＨＣＶゲノムは、構造タンパク質（ＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７）および非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）内の細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼにより切断される１つのポリタンパク質をコードするプラス鎖ＲＮＡ分子である（１）。全てのタンパク質を、ｅｕＨＣＶｄｂ設備（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｈｃｖｄｂ．ｉｂｃｐ．ｆｒ（２））を用いて、ドメインが設計されていないＮＳ４Ｂを除いて、完全長およびドメインでクローニングした（図６）。融合ＮＳ４Ａ−ＮＳ３タンパク質およびＮＳ４Ａ−ＮＳ３プロテアーゼドメインを構築した（３、４）。ＨＣＶ遺伝子型１ｂである単離体ｃｏｎ１（ＡＪ２３８７９９）から得られる全ての２７個のＯＲＦを（５）、ゲートウェイ組換えクローニング系においてクローニングした。それぞれのＯＲＦを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーに融合したａｔｔＢ１．１およびａｔｔＢ２．１組換え部位を用いて（ＫＯＤポリメラーゼ、Ｎｏｖａｇｅｎを用いて）ＰＣＲ増幅し、ｐＤＯＮＲ２２３内にクローニングした（６）。全てのエントリークローンを配列により検証した。
【０１１４】
酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）ライブラリーのスクリーン。
【０１１５】
ＨＣＶのＯＲＦを、ｐＤＯＮＲ２２３から、酵母においてＧａｌ４−ＤＢ融合体として発現されるベイトベクター（ｐＰＣ９７）内に移した。２つの異なるスクリーニング方法を用いた（ＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２）。ＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２戦略の両方のために、またベイトが自己転写活性化レポーター遺伝子を構築することがあるため、ＳＤ−Ｌ−Ｈ培地に３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を補った。この薬剤の適切な濃度は、３−ＡＴの濃度を増大させながら補ったＳＤ−Ｌ−Ｈ培地上でベイト株を成長させることにより決定した。膜アンカーを有さないＮＳ５Ａによる自己転写活性化は３−ＡＴで滴定するには高すぎ、さらなる試験は行わなかった。ＩＭＡＰ１では、ベイトベクターをＭＡＶ２０３酵母株に導入し、ヒト脾臓および胎児脳の両方のＡＤ−ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、記載されているような形質転換によりスクリーニングした（７）。最初に陽性であった全てのクローン（ＳＤ−Ｗ−Ｌ−Ｈ＋３−ＡＴ上で選択された）を、２つのさらなるレポーター遺伝子であるＬａｃＺ（Ｘ−Ｇａｌ比色分析）およびＵＲＡ３（５−ＦＯＡを補った培地上での成長アッセイ）を用いたさらなる表現型アッセイにより試験した。３つの陽性表現型のうち少なくとも２つを示した陽性クローンを、新鮮な酵母内で再試験した。再試験しなかったクローンは廃棄した。ＡＤ−ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、インサートを配列決定して相互作用子を同定した。ＩＭＡＰ２のスクリーンを、ＡＨ１０９およびＹ１８７酵母株を用いて、酵母の接合によって実施した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（８））。ベイトベクターをＡＨ１０９内に形質転換し（ベイト株）、ヒト脾臓および胎児脳のＡＣ−ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＹ１８７内に形質転換した（プレイ株）。単一のベイト株をプレイ株と接合し、２倍体をＳＤ−Ｗ−Ｌ−Ｈ＋３−ＡＴ培地に播種した。陽性のクローンをこの選択培地上で１５日間維持し、あらゆる汚染ＡＤ−ｃＤＮＡプラスミドを除去した（９）。ＡＤ−ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、インサートを配列決定した。
【０１１６】
ＩＳＴ（相互作用子配列タグ）分析
本発明者らは、それぞれのＩＳＴをその天然のヒトゲノム転写産物に割り当てる生物情報学的パイプラインを開発した。まず、ＩＳＴを、従来の閾値である２０を上回る品質スコア（１％未満の配列誤差）でＰＨＲＥＤ（１０、１１）を用いてフィルタリングした。Ｇａｌ４モチーフを検索し（ＧＡＬ４−ＡＤの最後の８７塩基）、このモチーフの下流の配列をペプチドに翻訳し、ＢＬＡＳＴＰを用いてＲＥＦＳＥＱ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）ヒトタンパク質配列データベース（２００７年４月リリース）に対してアラインした。信頼性の低いアラインメント（Ｅ値＞１０−１０、同一性＜８０％）および早期の停止コドンを含む配列を除去した。インフレームのタンパク質および質の高い配列のみをさらに検討した。
【０１１７】
組み込まれたヒトインタラクトームネットワーク（Ｈ−Ｈネットワーク）
物理的および直接的な異種分子間タンパク質−タンパク質相互作用のみを、ＢＩＮＤ（１２）、ＢｉｏＧＲＩＤ（１３）、ＤＩＰ（１４）、ＧｅｎｅＲＩＦ（１５）、ＨＰＲＤ（１６）、ＩｎｔＡｃｔ（１７）、ＭＩＮＴ（１８）、およびＲｅａｃｔｏｍｅ（１９）から取り出した。ＮＣＢＩの正式な遺伝子名を用いて、異なるゲノム参照データベース（すなわち、ＥＮＳＥＭＢＬ、ＵＮＩＰＲＯＴ、ＮＣＢＩ、ＩＮＴＡＣＴ、ＨＰＲＤなど）において定義されているタンパク質ＡＣＣ、タンパク質ＩＤ、遺伝子名、記号、または別名を統一し、かつ単一の遺伝子についての異なるタンパク質アイソフォームの存在に起因する相互作用の冗長性を除去した。したがって、遺伝子名は、タンパク質を同定するためにテキストにおいて用いた。最後に、冗長ではないタンパク質−タンパク質相互作用のみを、ヒトインタラクトームデータセットを構築するために維持し、すなわち、ＡがＢと相互作用し、かつＢがＡと相互作用する場合に、ＡとＢとの相互作用のみが選択された。
【０１１８】
ＨＣＶタンパク質と細胞タンパク質との間の相互作用のテキストマイニング
細胞タンパク質とＨＣＶタンパク質との間の２種分子間相互作用を記載する、文献をキュレーションした相互作用（ＬＣＩ）を、専門家のキュレーションプロセスにより完成した自動テキストマイニングパイプラインを用いることによって、ＢＩＮＤデータベースおよびＰｕｂＭｅｄ（２００７年８月前の刊行物）から抽出した。テキストマイニングアプローチでは、「ＨＣＶ」および「タンパク質相互作用」というキーワードに関連する全ての要約を取り出し、遺伝子名（ＮＣＢＩ遺伝子名および別名に基づく）ならびに相互作用の動詞（相互作用する、結合する、付着するなど）について、文作成プログラム（文の分割）および品詞タグ付けプログラムに供した（２０）。専門家によるキュレーションのために、少なくとも１つのヒト遺伝子名、１つのウイルス遺伝子名、および１つの相互作用項の共起を示す文の優先順位を付けた。
【０１１９】
コアフィニティー精製による検証
５９のＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ相互作用のランダムなプールをＣｏＡＰアッセイのために選択した。細胞のＯＲＦ（Ｙ２Ｈスクリーンにおいて見られる相互作用ドメイン）を、ＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーのプールまたはＭＧＣのｃＤＮＡプラスミドからｐＤＯＮＲ２０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に、組換えクローニングによってクローニングした。配列決定による検証の後、これらのＯＲＦをゲートウェイ変換されたｐＣｉ−ｎｅｏ−３ｘＦＬＡＧに移し、ＨＣＶのＯＲＦをｐＤＥＳＴ２７内に移した（Ｎ末端におけるＧＳＴ融合）。次に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、相互作用タンパク質をコードするそれぞれのプラスミド対によってコトランスフェクトした（ＪｅｔＰｅｉ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）。対照は、３ｘＦＬＡＧタグ付けされたプレイに対するＧＳＴのみである。トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、溶解した（０．５％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および完全プロテアーゼ阻害剤のカクテル）。細胞溶解物を、４℃で１３０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離することにより清澄化し、可溶性タンパク質複合体をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。次に、ビーズを溶解緩衝液で４回十分に洗浄し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＧＳＴタグ付けされたウイルスタンパク質および３ｘＦＬＡＧタグ付けされた細胞タンパク質を、抗ＧＳＴモノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）および抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、標準的な免疫ブロッティング技術を用いて検出した（２１）。
【０１２０】
ネットワークの可視化
Ｌａｒｇｅ Ｇｒａｐｈ Ｌａｙｏｕｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｌｇｌ／）を適用して、図２ＡにおけるＨ−Ｈネットワークを視覚化した。推測ツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｐｈｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ．ｃｏｎｄ．ｏｒｇ／）を用いて、図２ＢにおけるＨ−ＨＨＣＶ感染ネットワークおよび図４ＡにおけるＩＪＴネットワークをグラフィック表示した。図２Ｂおよび４Ａは、ＳＦ１．ｔａｒ．ｇｚにおけるＧＵＥＳＳ相互作用フォーマット（ＧＵＥＳＳデータフォーマット）において入手可能である（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＿ｎｅｔｗｏｒｋ．ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓおよびｉｊｔ＿ｎｅｔｗｏｒｋ．ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。
【０１２１】
位相分析
Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）統計環境を用いて統計分析を行い、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｃｎｅｕｒｏｃｖｓ．ｒｍｋｉ．ｋｆｋｉ．ｈｕ／ｉｇｒａｐｈ／）を用いて、ネットワークの連結された成分、中心性（程度、媒介性）、および最短経路の測定値を計算した。
【０１２２】
連結された成分：
無方向的なネットワークにおいて、連結された成分は、最大の連結されたサブネットワークである。２つのノード間に経路が存在する場合に２つのノードは同一の連結された成分内にあり、かつ、２つのノードが同一の連結された成分内にあるのは、２つのノード間に経路が存在する場合のみである。本発明者らはまた、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージに従って、他のタンパク質のいずれにも連結されていないタンパク質を、連結された成分に含めた。
【０１２３】
程度：
ノードの程度（ｋ）は、ノードに伴うエッジの数である。ヒトタンパク質の程度の平均を計算し、全てのＨＨＣＶの程度の平均と比較した。
【０１２４】
最短経路：
最短経路の問題は、その構成要素であるエッジのウェイトの合計が最小化するような、２つのノード間の経路の発見である。最短経路（Ｉ、また測地線とも呼ばれる）を、グラフにおいて幅優先サーチを用いることによってここで計算する。エッジのウェイトはここでは用いておらず、すなわち、全てのエッジウェイトは１である。任意の２つのヒトタンパク質対の間の最短経路の平均を計算し、任意の２つのＨＨＣＶ対の間の最短経路の平均と比較した。
【０１２５】
媒介性：
ノードの媒介性（ｂ）を、ノードを通過する最短経路の数により大まかに規定する。全てのヒトタンパク質の媒介性の平均を計算し、任意の２つのＨＨＣＶ対の間の最短経路の平均と比較した。
【０１２６】
位相分析の統計的検定：
観察された差異を統計的に確認するために、ウィルコクソン・マン・ホイットニー順位和検定（Ｕ検定）を選択した。Ｕ検定は、２つの関連するサンプルのためのペアステューデントｔ検定または１つのサンプルに対する反復測定に対する、ノンパラメトリックな代替物である。一般化された線形モデルおよびＡＮＯＶＡ分析を用いて、ＨＣＶタンパク質がヒトタンパク質と相互作用する確率に対する、程度および媒介性の個別のおよび追加の効果を、それぞれモデリングおよび検定した。
【０１２７】
ＫＥＧＧアノテーションを用いた機能分析
細胞経路のデータを、ＫＥＧＧ（２２）、すなわち京都遺伝子ゲノム百科事典（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）から取り出し、ＮＣＢＩ遺伝子の機能にアノテーションを付すために用いた。それぞれのウイルス−宿主タンパク質相互作用について、特定のＫＥＧＧ経路の強化を、フィッシャーの正確検定を用いて検定し（ｐ値＜５×１０−２）、その後、偽発見率を制御するためにＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの多重検定補正（２３）を行った。
【０１２８】
細胞接着アッセイ
ＰＢＳにおけるフィブロネクチンまたはポリ−Ｌ−リジンの連続希釈（１０から０．０４μｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレート上に被覆した。非特異的な結合部位を室温でＰＢＳ １％ ＢＳＡで１時間にわたり飽和させた。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をｐＣｉｎｅｏ３ｘＦｌａｇ ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａ（ＪｅｔＰｅｉ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）でトランスフェクトし、２日後にＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡで回収し、０．１％ＢＳＡを含む無血清培地内に細胞１．１０５個／ウェルで広げることを３回行い、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。非接着細胞を洗浄して除去し、接着細胞を３．７％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞を２０％メタノール内の０．５％クリスタルバイオレットを用いて室温で２０分間にわたり染色し、Ｈ２Ｏ内で５回洗浄した。染色をｐＨ４．５の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム中の５０％エタノールで抽出し、吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（ＭＲＸマイクロプレートリーダー、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５９０ｎｍで読み取った。値は１０μｇ／ｍｌでの１００％の接着に対して標準化した。接着のパーセンテージを、それぞれのマトリクス濃度でそれぞれの細胞型について決定した。最大接着の５０％（ＦＡ５０）を曲線から計算した（出典Ｍｉａｏら（２４））。
【０１２９】
材料および方法において引用される参考文献：
【０１３０】
【表１０】
【０１３１】
結果
ＨＣＶ−ヒトインタラクトームマップの構築
ＨＣＶタンパク質と細胞タンパク質との間の包括的なインタラクトームマップを、Ｙ２Ｈスクリーンにより作成した。完全長ＨＣＶ成熟タンパク質または不連続のドメインをコードする２７個の構築物を、組換えに基づいたクローニング系を用いてクローニングした（１０）（図６）。４個の独立したスクリーンをそれぞれのＨＣＶベイトタンパク質で実施し、２つの異なるヒトｃＤＮＡライブラリーを探査した（補足的な方法）。２７８個のヒトタンパク質を伴う、３１４個のＨＣＶ−ヒトＰＰＩを同定した（図１Ｂ、表Ｓ１におけるＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセット）。ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間のペアワイズ相互作用もまた、自動テキストマイニングにより文献から抽出し、専門家のキュレーションによって確認した（補足的な方法、図６におけるＩＭＡＰ ＬＣＩデータセット）。１３５個のＰＰＩをＰｕｂｍｅｄから抽出し、８９個をＢＩＮＤデータベースから抽出した（１１）（図１Ｂ）。得られるＨＣＶ−ヒト相互作用はこのように、１１個のＨＣＶタンパク質および４２１個の個別のヒトタンパク質を伴う、６５％の新たな相互作用を有する４８１個のＰＰＩからなる（図１Ｂ）。ＩＭＡＰ Ｙ２ＨデータベースとＩＭＡＰ ＬＣＩデータベースとの間の冗長性の低さは、Ｙ２Ｈ系の偽陰性率の高さを強調するものであり、これは最近の研究と一致している（１２、１３）。２つの検証方法を用いて、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットの信頼性を評価した。３分の２のデータセットをＹ２Ｈペアワイズマトリクスによって有効とした。残りの相互作用から、２５％をランダムに選択し、８５％を超える検証率をもたらすコアフィニティー精製によって試験した（図１Ｃおよび表Ｓ１）。このＹ２Ｈデータセットはしたがって、位相的および機能的なレベルで、さらなる分析に対して信頼性が非常に高いものである。ＨＣＶ感染ネットワークの分析（Ｖ−ＨＨＣＶ、図１Ａ）により、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＣＯＲＥが、それぞれ２１４、９６、および７６個の細胞パートナーを有する、ヒトインタラクトームにおいて最も連結されているタンパク質であることが示され、このことは、感染の間のこれらのタンパク質の潜在的な多機能性を強調するものである（表Ｓ１、図４Ｂ）。さらに、４５個の細胞タンパク質が２つ以上のウイルスタンパク質によって標的化され、このことは、それらがウイルスの生物学に必須であることを示唆するものである（７）（表Ｓ２）。
【０１３２】
ヒトＰＰＩネットワーク（Ｈ−Ｈネットワーク、図１Ａ）を、８個のデータベースから再構築した（１４）（補足的な方法）。このネットワークは、９５２０個の異なるタンパク質の間の４４２２３個の冗長でないＰＰＩからなる（図２Ａ）。興味深いことに、３０％のヒトタンパク質のみがこのデータセットに存在する一方で、ＨＣＶにより標的化されたヒトタンパク質（ＨＨＣＶ）がこのＨ−Ｈネットワークにおいて明らかに過剰に表されている（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセット：７６％、およびＩＭＡＰ ＬＣＩデータセット：９２％、フィッシャーの正確検定、ｐ値＜２．２×１０−１６）。このことは、ＨＣＶが、タンパク質−タンパク質相互作用に関与することが既に知られている宿主タンパク質を選択的に標的化することを示唆するものである（１２、１５）。ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットでは、ヒトインタラクトームに組み込まれるＨＨＣＶのパーセンテージの高さは、よく研究されているタンパク質および生物学的経路の調査のバイアスにより説明することができる。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶサブネットワークの分析により、ＨＣＶと相互作用する細胞タンパク質が、ランダムなサブネットワークについて期待されたものよりも有意に相互連結されていることが示された（図１Ａ、２Ｂ、補足的な方法）。実際、ヒトインタラクトームに組み込まれる３３８個のＨＨＣＶは、１３１個の連結された成分に分配される（ランダムなサブネットワークにより期待される２７６に対して、ｐ値＜１０−１０、表Ｓ３）。最大のものは、１つのタンパク質のみを含む１２７個の成分とは対照的に、１９６個のＨＨＣＶからなる（ランダムなサブネットワークにより期待される１８に対して、ｐ値＜１０−１０）。３つの残りの連結された成分は２つのタンパク質を含んでいた。２つは、機能的に関連するタンパク質を含んでおり（ＣＬＥＣ４ＭおよびＣＤ２０９は、ウイルスの侵入に関与するレクチンであり（１６）、ＭＶＰおよびＰＡＲＰ４は、ヴォールト複合体に関与する（１７））、１つは、機能的に関連することが知られていないタンパク質を含んでいた（ＫＩＡＡ１５４９およびＣＡＤＰＳ）。
【０１３３】
ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの位相分析
ＨＣＶタンパク質が細胞タンパク質ネットワークといかにして相互作用するかを評価するために、本発明者らは次に、Ｈ−Ｈインタラクトームに組み込まれるＨＨＣＶタンパク質の中心性の測定値に焦点を当てた。局所的な（程度）ならびに全体的な（最短経路および媒介性）の中心性の測定値を計算した。簡潔に述べると、ネットワークにおけるタンパク質の程度（ｋ）は、直接的なパートナーのその数に対応し、したがって、局所的な中心性の測定値である。媒介性（ｂ）は、所与のタンパク質を通過する最短経路（ネットワークにおける２つのタンパク質間の最短距離、ｌ）の数を測定するため、中心性の全体的な測定値である。Ｈ−Ｈネットワークの程度、媒介性、および最短経路の平均はそれぞれ、９．３、１．６×１０−４、および４．０４であり、これは、これまでの報告とよく一致する（１８）（図３Ａ）。バイアスのない分析を提供するために、計算は、ヒトインタラクトームに組み込まれるＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られる２１３個のＨＨＣＶに基づくものであった。ＨＨＣＶの程度の平均は、ヒトインタラクトームの程度の平均よりも有意に高い（１５．６対９．３、Ｕ検定、ｐ値＜１０−３）。程度の確率分布の比較により、ＨＨＣＶが程度の平均を超えて全てのクラスにおいて選択的に表されることが明らかになる（図３Ｂ、左）。このことは、ＨＣＶタンパク質が、高度に連結した細胞タンパク質と相互作用する大きな傾向を有することを示すものである。しかし、程度はタンパク質の局所的な連結性のみを測定するため、ネットワークにおける情報の交換および伝搬を反映し得る全体的な特徴を調べた（１９）。全体的な尺度で、ＨＨＣＶの媒介性の平均は、ヒトインタラクトームの媒介性の平均よりも有意に高かった（３．８×１０−４対１．６×１０−４、Ｕ検定、ｐ値＜１０−３）。程度に関しては、媒介性の確率分布の比較により、全てのクラスにおいてＨＨＣＶが媒介性の平均を超えて過剰であることが示される（図３Ｂ、右）。さらに、Ｈ−Ｈネットワークにおける最短経路の平均と比較して、ＨＨＣＶタンパク質間で見られる最短経路の平均が低いことにより、ＨＨＣＶが位相的に近いことが明らかになる（３．５０対４．０４、Ｕ検定、ｐ値＜１０−５）。ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットから得られるＨＨＣＶの局所的および全体的な中心性の両方は、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットについてよりも高く、このことは、文献調査のバイアスの問題を強調し、Ｙ２Ｈスクリーニングのバイアスのないアプローチを強固にするものである（表Ｓ３）。中心のＨＨＣＶに対する選択的な付着がＨ−Ｈインタラクトームにおける固有のバイアスによるものではないことを保証するために、本発明者らは、信頼性が非常に高いがあまり包括的ではないヒトインタラクトームで同一の分析を実施した（表Ｓ３、補足的な方法）。この傾向はこのデータセットで維持され、このことは、ＨＨＣＶがヒトインタラクトーム内で局所的および全体的に非常に中心的であり、かつこのネットワークにおいて互いに比較的近くに現れることを裏付けるものであった。ＨＣＶおよびＥＢＶの比較分析では、中心性の測定値をＨＥＢＶについても計算した（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄらからのデータセット（７））。程度、媒介性、および最短経路は、ＨＥＢＶタンパク質と同一の傾向に従い（表Ｓ３および図７）、これまでの報告とよく一致した（７）。これらの結果は、中心的なタンパク質に対する選択的な付着が、文献の分析により最近示唆されたような、ウイルスタンパク質の一般的な特質であることを示す（９）。これらのタンパク質の中心性の高さはこれまでに、細胞に対するそれらの機能的不可欠性と相関することが示されている（２０）。より詳細には、致死タンパク質および疾患に関連するタンパク質は中心的なタンパク質において富んでいることが明らかになった（１９、２１〜２３）。
【０１３４】
程度または媒介性のいずれがウイルスタンパク質と細胞タンパク質との間の相互作用の確率に最も影響するかを決定するために、本発明者らは一般化された線形モデルを用いて両方の測定値の分離したおよび追加的な効果を検定した（補足的な方法）。この分析により、媒介性がウイルスタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用の確率をより良好に説明することが明らかになった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜１０−３）。図３Ｃは、低い程度値で媒介性のばらつきが大きいことにより説明される、ｋとｂの中心性の測定値の間の、部分的な相関関係を示す（Ｒ２＝５６％、ｐ値＜１０−１６）。本発明者らはしたがって、低い程度で観察されたこの大きなばらつきが媒介性の優位な効果を説明し得るかどうかを求めた。この目的のために、データベースを、ヒトインタラクトームの程度の平均に従って、低い程度（ＬＤ）および高い程度（ＨＤ）のタンパク質クラスに分けた。ＬＤクラスに含まれる細胞タンパク質では、ＨＣＶは、それらの程度の特性に関わらず、媒介性が高いタンパク質と選択的に相互作用する（図３Ｄ）。ＨＤクラスにおいては、ＨＣＶタンパク質との相互作用は、細胞タンパク質の媒介性および程度の両方に依存する。酵母における最近の研究に基づいて（２４）、程度が低く媒介性が高いＨＨＣＶタンパク質が細胞モジュール間のコネクタまたは障害として作用し得、したがって感染に必須であり得ることが推定され得る。
【０１３５】
ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの機能的分析
ＨＣＶにより標的化される生物学的機能をより良く理解するために、本発明者らは次に、所与のウイルスタンパク質の全ての相互作用子について特定の経路の強化を検定した。これは、ＨＨＣＶタンパク質をＫＥＧＧ機能アノテーション経路に関して分析することにより行った（表Ｓ４、補足的な方法）。機能はいまだ全てのタンパク質によるものではないため、このアプローチは全体としてはバイアスがないが、それは依然として、システムレベルのデータセットに従来の生物学を組み込む有効な手段である。この分析により、ＨＣＶの臨床的症候群に関連する３つの経路についての強化が示され（インスリン、ＴＧＦβ、およびＪａｋ／ＳＴＡＴ経路）、ＨＣＶにより影響される新規な経路として接着斑が同定された。
【０１３６】
ＨＣＶによる慢性的な感染は、脂肪症の発症を伴う代謝障害に対するリスクの増大に関連する。インスリン耐性はこのプロセスの共通の特徴である。これはまた、肝線維症の原因ともなり、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）抗ウイルス療法に対する応答不良の予測因子である（２５、２６）。逆に、ＩＦＮ−αは線維症の進行を予防し得る（２７）。ＴＧＦβは、肝臓における細胞の成長および分化の維持において極めて重要な役割を有する。これは、感染の間に産生が増強されることが多い、強力な線維形成促進性のサイトカインである。低下したＴＧＦβ応答もまた、ＨＣＶ感染の間に観察される（２８）。インスリン、ＴＧＦβ、およびＪａｋ／ＳＴＡＴ経路はこれらの臨床的特徴に関与すると考えられているが（２９）、ＨＣＶ感染の間の、密接に関連するそれらの摂動は、依然としてほとんど説明されていない。本発明者はしたがって、ネットワークアプローチを用いて、ＨＣＶにより標的化され、これらの経路の界面に局在する、細胞タンパク質を同定した。得られる相互作用マップを構築して、ＩＪＴネットワークを形成した（インスリン−Ｊａｋ／ＳＴＡＴ−ＴＧＦβ、図４Ａ）。６６個のＨＨＣＶタンパク質は２つの経路を連結しており、一方、３０個のＨＨＣＶタンパク質は３つの経路を連結している。これらのタンパク質とＨＣＶタンパク質との相互作用はしたがって、隣接する経路に広がり得る機能的な摂動を誘発し得る。これらのタンパク質のうち１つは、インスリン経路とＪａｋ／ＳＴＡＴ経路とを連結するＰＬＳＣＲ１（スクランブラーゼ１）である。原形質膜のリン脂質の再分配に関与することが知られていることで（３０）、このタンパク質はまた、インターフェロンに応じた遺伝子の潜在的なアクチベーターであり、ｓｉＲＮＡでのそのノックダウンは、ウイルスの複製に有利に働く（３１）。興味深いことに、ＰＬＳＣＲ１−／−マウスはまた、インスリン耐性の発現を示す（３２）。インスリンまたはＪａｋ／ＳＴＡＴ経路においてはアノテーションを付されていないが、ＰＬＳＣＲ１はしたがって、これらの経路の機能性にとって必須であることが分かる。ＰＬＳＣＲ１と相互作用することにより、ＣＯＲＥはしたがってＪａｋ／ＳＴＡＴ経路とインスリン経路との両方に干渉し得る。別の例は、３つの経路を連結するためＩＪＴネットワークにおいてより中心的な位置を示す、核因子Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １（ＹＹ１）である。ＨＣＶ ＣＯＲＥとＹＹ１との相互作用は、ＮＰＭ１の発現を機能的に軽減することがこれまでに示されている。この所見は、インスリン経路およびＴＧＦβ経路の調節の裏付けとしての、ＰＰＡＲδの発現およびＳＭＡＤの転写活性に推定することができる（３３〜３５）。これらは、ＨＣＶ誘発性の表現型に関与すると考えられる細胞標的のただ２つの例示的な例である。これらの例は、本発明者らを、臨床的症候群に相関する分子メカニズムについてのより良い情報を提供する目的で、Ｃ型肝炎の論理的な還元主義的アプローチに戻すものである。病理学のこの分子アプローチは系（この研究においてはタンパク質）の基礎的な要素に適用可能であるが、慢性的なＨＣＶ感染において観察される臨床的表現型のいくつかは、ＩＪＴネットワークにおいて示されるタンパク質相互作用の統合的な効果の結果であると考えられる。さらに、ネットワークのロバスト性の特性は、異なる摂動に直面してもネットワークの能力が機能的であり続けるようにし得るため、ネットワークの還元主義的アプローチは、系レベルで常に適用可能ではあり得ない。
【０１３７】
ＩＪＴネットワークにおいて明らかになった別の問題は、ＣＯＲＥタンパク質が他のＨＣＶタンパク質よりも比例的に多くの相互作用を媒介するということである（図４Ｂ、４Ｃ）。実際、ＩＪＴネットワークとの選択的な相互作用は、ＣＯＲＥでのみ観察された（５１．３％、表Ｓ５）。結果として、ＣＯＲＥはＩＪＴネットワークにおける相互作用の２７．７％をもたらし、これは有意な増強に対応する（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜１０−４）。より詳細には、このタンパク質は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路およびＴＧＦβ経路（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜０．０５）、ならびにインスリン／Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路とインスリン／ＴＧＦβ経路とを連結するＨＨＣＶ（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜０．０５、表Ｓ５）において過剰に表される。したがって、ＣＯＲＥはＩＪＴネットワークの主要な摂動付与物質として現れる。興味深いことに、ＣＯＲＥを発現するトランスジェニックマウスはインスリン耐性を発現する（３６、３７）。提案されたメカニズムは、ＣＯＲＥ誘発性のＳＯＣＳ３がユビキチン化を介してＩＲＳ１およびＩＲＳ２のプロテアーソーム分解を促進するというものであった（３８）。ＳＯＣＳ３はまたＪａｋ／ＳＴＡＴ経路の負の調節因子であるため、このことは、ＩＦＮ−α耐性の発生を説明し得る。明らかに、ＩＪＴネットワークは、ＣＯＲＥの作用がこれまでに考えられていたよりもはるかに複雑であると考えられることを示す。ＩＪＴネットワークはいまだ動的に分析され得ないが、依然として、前記ネットワークは、慢性化に関連する複雑な障害のいくつかを解明する固有の手段を提供するものである。ＩＪＴネットワークがウイルス感染の不存在下で脂肪症および線維形成などの疾患に関与する一連の遺伝子を同定し得ることもまた考慮に値する。
【０１３８】
接着斑は、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈスクリーンにより生じるデータの主要な寄与と共に、ＮＳ３タンパク質およびＮＳ５Ａタンパク質により標的化される新たな機能として過剰に表された（表Ｓ４）。インテグリンに結合した接着斑複合体は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）への細胞の接着を制御し、これらの複合体とアクチン−細胞骨格との会合は、細胞の移動において主要な役割を有する。ＥＣＭに結合すると、αおよびβインテグリンサブユニットの両方は、アクチン−細胞骨格とシグナル伝達経路との間の物理的結合を確立するタンパク質を動員する。脱調節されると、この機能的プロセスは細胞の可動性の摂動、ＥＣＭからの分離、ならびに腫瘍の発生および進行をもたらし得る。図５Ａは、ＨＣＶにより標的化されるタンパク質、主にＮＳ３およびＮＳ５Ａタンパク質を伴うＫＥＧＧの接着斑経路を示す。接着斑の機能性に対するＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａの単一の発現の影響を、フィブロネクチンおよびポリ−Ｌ−リジンに対する細胞接着アッセイを用いて評価した。これらのウイルスタンパク質は、ＭＯＣＫまたはＮＳ２を発現する細胞と比較してフィブロネクチンに対する細胞接着を阻害した（図５Ｂ）。一方、インテグリンを組み込まないポリ−Ｌ−リジンに対する接着は影響されなかった（図５Ｃ）。同一の阻害レベルがＮＳ３／４ＡおよびＮＳ３について観察され、このことは、このプロテアーゼの酵素活性が接着斑の摂動に対して主要な効果を有さないことを示唆するものである。癌の発生および進行に加え、ＨＣＶによる接着斑の組み込みは、ウイルスの拡散に対する重要性を有し得る。アクチン−細胞骨格のリモデリングのいくつかのステップへの干渉は、侵入部位に到達するために標的細胞の細胞突起に沿って移動するためにこのプロセスを利用し得るレトロウイルスについて記載されている（３９）。インテグリンへのウイルスエンベロープの結合を伴う関連するプロセスが、ＨＣＶにより利用されてその伝達を促し得ることは、考えられることである。ＨＣＶ感染のネットワークアプローチにおいて、相互作用マップは、ウイルスが複製し宿主の防御から逃れるために潜在的に必要な、全ての連結を同定する。
【０１３９】
＜実施例２＞
胆汁酸（ＢＡ）の血清レベルが高い、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者は通常、抗ウイルス療法に対する応答を有さない。したがって、ＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＢＡの役割を評価した。ＢＡ、とりわけケノデオキシコール酸塩およびデオキシコール酸塩は、ＨＣＶのＲＮＡ複製を１０倍以上、上方調節した。遊離しているが抱合していないＢＡのみが活性であり、このことは、それらの効果が核受容体によって媒介されていたことを示唆するものである。ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のリガンドのみがＨＣＶの複製を刺激し、一方、グッグルステロンによるＦＸＲのサイレンシングおよびＦＸＲの拮抗作用は、ＢＡにより誘発される上方調節を遮断した。さらに、グッグルステロンは単独で、基底レベルのＨＣＶ複製を１０倍阻害した。ＦＸＲリガンドによるＨＣＶ複製の調節は、Ｉ型インターフェロンの存在下または不存在下で同一の割合で生じ、このことは、ウイルス複製のこの制御から独立した作用のメカニズムを示唆するものである。したがって、ＢＡへの曝露は、核受容体ＦＸＲの活性化を伴う新規なメカニズムによりＨＣＶ複製を増大させる。
【０１４０】
これにより、ウイルスがＦＸＲに直接的に干渉してその複製を促し得るという可能性が高まる。ＨＣＶタンパク質の細胞相互作用子のプロテオームワイドなスクリーニングを完了するために、本発明者らは、ＦＸＲに焦点を当てた特異的スクリーニングを実施して、この受容体と任意のウイルスタンパク質との間の全ての潜在的な相互作用を同定した。
【０１４１】
材料
細菌
大腸菌のコンピテント細菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｆ−ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）、７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ （ＳｔｒＲ） ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）。
【０１４２】
酵母
本発明者らは以下の株を用いた：ＡＨ１０９およびＹ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） 以下の遺伝子型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ１０９：ＭＡＴａ、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３、１１２、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ、ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３、ＧＡＬ２ＵＡＳ−ＧＡＬ２ＴＡＴＡ−ＡＤＥ２、ｕｒａ３：：ＭＥＬ１ＵＡＳ−ＭＥＬ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ。
Ｙ１８７：ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３、１１２、ｍｅｔ−、ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ、ＭＥＬ１、ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ。
【０１４３】
ヒト細胞
Ｈｅｋ−２９３Ｔ：ラージＴ抗原を発現するヒト胚腎細胞。
【０１４４】
酵母ツーハイブリッドマトリクスを用いたＦＸＲと相互作用するＨＣＶタンパク質の同定
本発明者らの以前の研究により、ＨＣＶの複製がＦＸＲ活性の制御下にあり得ることが示された。ＦＸＲ活性に干渉し得るウイルス成分を同定するために、本発明者らはウイルスタンパク質とＦＸＲとの間の相互作用を探求した。これは、酵母ツーハイブリッド法を用いるペアワイズ相互作用スクリーニングにより行った。全ての１０個のウイルスタンパク質を試験し、データを以下の表にまとめる。
【０１４５】
【表１１】
【０１４６】
プルダウン実験
データは、哺乳動物細胞におけるＧＳＴ−プルダウンによって確認されている。ＧＳＴと融合しているウイルスタンパク質を、３ＸＦｌａｇでタグ付けされたＦＸＲと共に、Ｈｅｋ−２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。４８時間後、細胞を溶解し、グルタチオンセファロースを用いて沈殿を実施し、電気泳動、および抗Ｆｌａｇ（ＦＸＲを明らかにするため）またはペルオキシダーゼに結合した抗ＧＳＴ抗体を用いたウェスタンブロットに供した。ＮＳ３およびＮＳ５ＡとのＦＸＲの共沈殿は、これらのウイルスタンパク質とＦＸＲとの直接的な相互作用を肯定的に確認するものであった。ＦＸＲと全ての他のウイルスタンパク質との共沈殿は、これらのタンパク質がＦＸＲと相互作用しないことを否定的に確認するものであった。
【０１４７】
参考文献
この出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関連する技術分野の状況を記載している。これらの参考文献の開示は本明細書において、参照により本開示に組み込まれる。
【０１４８】
【表１２】
【０１４９】
【表１３】
【０１５０】
【表１４】
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
【表１６】
【０１５３】
【表１７】
【０１５４】
【表１８】
【０１５５】
【表１９】
【０１５６】
【表２０】
【０１５７】
【表２１】
【０１５８】
【表２２】
【０１５９】
【表２３】
【０１６０】
【表２４】
【０１６１】
【表２５】
【０１６２】
【表２６】
【０１６３】
【表２７】
【０１６４】
【表２８】
【０１６５】
【表２９】
【０１６６】
【表３０】
【０１６７】
【表３１】
【０１６８】
【表３２】
【０１６９】
【表３３】
【０１７０】
【表３４】
【０１７１】
【表３５】
【０１７２】
【表３６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染は、慢性化の割合が高いことにより特徴付けられ、世界中で１億７千万人に影響している。慢性的に感染した患者は、肝脂肪症、線維形成、および様々な程度のインスリン耐性に関連する、免疫メカニズムおよび代謝障害により本質的に媒介される肝障害を示す（１、２）。長期にわたり感染している患者は肝硬変および肝細胞癌を発症するリスクが高いが、多大な尽力にもかかわらず、ＨＣＶ病理の分子的基盤は依然としてほとんど理解されていない。ＨＣＶのゲノムは、翻訳後に構造タンパク質（ＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７）ならびに非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）にプロセシングされるポリタンパク質をコードする、９．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡである（３）。
【０００３】
現在の治療法は、ペグ化インターフェロン（ＩＦＮ）アルファおよびリバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）の組み合わせにある。しかし、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染の転帰は個体間で多様であり、抗ウイルス治療に対する応答が持続する可能性は、ウイルスおよび宿主の特徴に依存する。ＨＣＶの天然に存在する変異体は、６個の主要な遺伝子型に分類される。ウイルスの遺伝子型は、治療の応答に関連する主要な因子の１つである。実際、持続性ウイルス学的著効（ＳＶＲ）は、遺伝子型１に感染した患者の４５％のみで達成され、一方、遺伝子型２または３に感染した患者の最大８０％がＳＶＲに達する（Ｆｅｌｄ ＪＪ．ら、２００５年）。
【０００４】
したがって、ＨＣＶ感染の他の治療が必要とされており、ＨＣＶタンパク質と宿主（ヒト）タンパク質との間の相互作用に焦点を当てることが奨励されている。細胞タンパク質ネットワークについての、また現在ではウイルス−細胞インタラクトームについての、迅速に増大する知識は、実際、ネットワークに基づいた疾患モデルを提供し始めている。ネットワークアプローチにおいて、ウイルス感染は、細胞インタラクトームの摂動として見ることができる。ウイルスの病原性は、細胞インタラクトームに連結したときにウイルスにより課せられるタンパク質ネットワークに対する新たな制約の発現として現れる。「感染したネットワーク」において喪失しているか、脱調節されているか、または出現する位相的および機能的特性の同定は、感染の複雑な系の分析に対する主要な課題となる。しかし、ヒトタンパク質とウイルスタンパク質との間の相互作用は、依然として完全には記載されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）とウイルスＨＣＶタンパク質ＮＳ３またはＮＳ５Ａとの間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、
ｂ）前記ウイルスファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）と前記ウイルスタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００６】
ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）は、超生理学的レベルのファルネソールにより活性化される核受容体である（Ｆｏｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ、１９９５年、８１、６８７〜６９３）。ＦＸＲはまた、ＮＲ１Ｈ４、レチノイドＸ受容体相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ１４）、および胆汁酸受容体（ＢＡＲ）としても知られている。
【０００７】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と、ＡＧＲＮ、ＢＣＡＲ１、ＣＤ６８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＤＸ３Ｙ、ＥＧＦＬ７、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＮ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＸＤ８、ＬＰＸＮ、ＬＲＲＴＭ１、ＬＴＢＰ４、ＭＡＧＥＤ１、ＭＥＧＦ６、ＭＭＲＮ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＡＢＰＮ１、ＰＡＫ４、ＰＬＳＣＲ１、ＲＮＦ３１、ＳＥＴＤ２、ＳＬＣ３１Ａ２、ＶＴＮ、ＶＷＦ、およびＺＮＦ２７１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ１タンパク質と、ＪＵＮ、ＮＲ４Ａ１、ＰＦＮ１、ＳＥＴＤ２、およびＴＭＳＢ４Ｘからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ１タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ２タンパク質と、ＨＯＸＤ８、ＩＴＧＢ１、ＫＩＡＡ１４１１、ＬＯＣ７３０７６５、ＮＲ４Ａ１、ＰＳＭＡ６、ＳＥＴＤ２、およびＳＭＥＫ２からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１０】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ２タンパク質と、ＡＤＦＰ、ＡＰＯＡ１、Ｃ７、ＦＢＬＮ５、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＲＰＬ１１、ＲＰＮ１、ＳＥＴＤ２、ＳＭＵＲＦ２、およびＴＲＩＭ２７からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１１】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ３タンパク質と、ｓｅｐ−１０、Ａ１ＢＧ、ＡＢＣＣ３、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ２、ＡＥＢＰ１、ＡＨＣＹ、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＮＫＲＤ１２、ＡＮＫＲＤ２８、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＲＦＩＰ２、ＡＲＧ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＮＴ、ＡＲＳ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＺＧＰ１、Ｂ２Ｍ、ＢＣＡＮ、ＢＣＫＤＫ、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＺＲＡＰ１、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ１０ｏｒｆ６、Ｃ１２ｏｒｆ４１、Ｃ１４ｏｒｆ１７３、Ｃ１６ｏｒｆ７、Ｃ１ｏｒｆ１６５、Ｃ１ｏｒｆ９４、Ｃ１Ｓ、Ｃ９ｏｒｆ３０、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＴ、ＣＢＹ１、ＣＣＤＣ２１、ＣＣＤＣ３７、ＣＣＤＣ５２、ＣＣＤＣ６６、ＣＣＤＣ９５、ＣＣＨＣＲ１、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２３、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＮＰＣ１、ＣＥＰ１５２、ＣＥＰ１９２、ＣＥＳ１、ＣＦＰ、ＣＨＰＦ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＲＯ１Ｂ、ＣＯＸ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＸｏｒｆ４５、ＤＥＡＦ１、ＤＥＤＤ２、ＤＥＳ、ＤＬＡＴ、ＤＯＣＫ７、ＤＰＦ１、ＤＰＰ７、ＥＣＨＳ１、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２、ＥＩＦ１、ＥＩＦ４ＥＮＩＦ１、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＦＡＭ６２Ｂ、ＦＡＭ６５Ａ、ＦＡＭ９６Ｂ、ＦＢＦ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ３、ＦＥＳ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＩＧＮＬ１、ＦＬＡＤ１、ＦＬＪ１１２８６、ＦＮ１、ＦＲＭＰＤ４、ＦＲＳ３、ＦＴＨ１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＡ、ＧＢＰ２、ＧＣ、ＧＦＡＰ、ＧＮＢ２、ＧＯＮ４Ｌ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＭＥＲ３、ＨＰ、ＨＴＲＡ１、ＩＦＩ４４、ＩＱＷＤ１、ＩＴＣＨ、ＩＴＧＢ４、ＪＡＧ２、ＪＵＮ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＫＩＡＡ１０１２、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ１７、ＫＩＦ７、ＫＮＧ１、ＫＰＮＡ１、ＫＰＮＢ１、Ｌ３ＭＢＴＬ３、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＣ３、ＬＤＢ１、ＬＯＣ７２８３０２、ＬＲＲＣ７、ＬＲＲＣＣ１、ＬＴＢＰ４、ＬＺＴＳ２、ＭＡＧＥＤ１、ＭＡＰＫ７、ＭＡＲＣＯ、ＭＡＳＰ２、ＭＥＧＦ８、ＭＬＬＴ４、ＭＬＸＩＰ、ＭＯＲＣ４、ＭＯＲＦ４Ｌ１、ＭＰＤＺ、ＭＶＰ、ＭＹＬ６、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＣＡＮ、ＮＤＣ８０、ＮＥＦＬ、ＮＥＦＭ、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＩＤ１、ＮＩＤ２、ＮＯＴＣＨ１、Ｎ−ＰＡＣ、ＮＵＣＢ１、ＮＵＰ１３３、ＮＵＰ６２、ＯＢＳＣＮ、ＯＲＭ１、ＯＴＣ、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ４、ＰＣＹＴ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＧＭ１、ＰＩＣＫ１、ＰＫＮＯＸ１、ＰＬＥＫＨＧ４、ＰＮＰＬＡ８、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＤＩＰ２、ＰＲＧ４、ＰＲＲＣ１、ＰＳＭＡ６、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＥ３、ＰＴＰＲＦ、ＰＴＰＲＮ２、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＩ１４、ＲＡＳＡＬ２、ＲＢＭ４、ＲＣＮ３、ＲＧＮＥＦ、ＲＩＣＳ、ＲＩＮＧ１、ＲＩＮＴ１、ＲＬＦ、ＲＮＦ３１、ＲＯＧＤＩ、ＲＰ１１−１３０Ｎ２４．１、ＲＳＨＬ２、ＲＵＳＣ２、ＳＢＦ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＣＩＳＢＰ２、ＳＥＬＯ、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＥＳＴＤ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＧＣＢ、ＳＩＡＨ１、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＩＴ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＮＸ４、ＳＰＯＣＫ３、ＳＰＯＮ１、ＳＰＰ２、ＳＲＰＸ２、ＳＳＸ２ＩＰ、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＲＡＤ、ＳＶＥＰ１、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＰＯ２、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１５、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＴＢＮ、ＴＢＸＡＳ１、ＴＦ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＡＰ１、ＴＭＥＭ６３Ｂ、ＴＰＳＴ２、ＴＰＴ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＯ、ＴＲＩＰ１１、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＳＨＢＰ１、ＵＸＴ、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＷＤＴＣ１、ＸＡＢ２、ＸＲＮ２、ＹＹ１ＡＰ１、ＺＡＤＨ１、ＺＢＴＢ１、ＺＣＣＨＣ７、ＺＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ４１０、ＺＮＦ４４０、ＺＸＤＣ、およびＺＺＺ３、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ３タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＥＬＡＣ２、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ３、ＵＢＱＬＮ１、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＴＦ６、ＫＮＧ１、およびＮＲ４Ａ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１４】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質と、ＡＡＲＳ２、ＡＢＣＣ３、ＡＣＬＹ、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢ、ＡＲＦＩＰ１、ＡＳＸＬ１、ＡＸＩＮ１、Ｃ１０ｏｒｆ３０、Ｃ９ｏｒｆ２３、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＤＰＳ２、ＣＣＤＣ１００、ＣＣＤＣ９０Ａ、ＣＣＴ７、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６３、ＣＥＳ１、ＣＦＨ、ＣＯＬ３Ａ１、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＩＦ３Ｓ２、ＥＴＦＡ、ＦＧＢ、ＦＨＬ２、ＧＬＴＳＣＲ２、ＧＯＬＧＡ２、ＧＰＳ２、ＨＲＳＰ１２、ＩＧＬＬ１、ＩＴＧＡＬ、ＬＤＨＤ、ＬＩＭＳ２、ＬＯＣ３７４３９５、ＭＡＦ、ＭＢＤ４、ＭＫＲＮ２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＭＯＮ２、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＦＥ２、ＮＵＣＢ１、ＯＳ９、ＰＡＲＶＧ、ＰＭＶＫ、ＰＯＭＰ、ＰＰＰ１Ｒ１３Ｌ、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＲＬＦ、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＲＢＰ１、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＳＭＹＤ３、ＳＯＲＢＳ２、ＳＯＲＢＳ３、ＴＨＢＳ１、ＴＭＦ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＴ、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＢＣ、ＵＳＰ１９、ＶＰＳ５２、ＺＧＰＡＴ、ＺＨ２Ｃ２、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ６４６、ＺＮＨＩＴ１、およびＺＮＨＩＴ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６８、ＣＴＳＦ、ＨＯＸＤ８、ＭＧＣ２７５２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＯＳ９、ＯＴＣ、ＰＫＭ２、ＰＳＭＢ９、ＳＥＴＤ２、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＴＡＧＬＮ、およびＴＵＢＢ２Ｃからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＦＢＬＮ２、ＦＸＹＤ６、ＬＭＮＢ１、ＲＮＵＸＡ、ＳＬＣ３９Ａ８、ＳＬＩＴ２、ＵＢＱＬＮ１、およびＵＢＱＬＮ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
定義
「Ｃ型肝炎ウイルス」または「ＨＣＶ」という用語は、本明細書において、その病原性株が非Ａ非Ｂ型肝炎としても知られているＣ型肝炎を生じさせるウイルス種を定義するために用いられる。
【００１８】
全てのヒトおよびＨＣＶの遺伝子およびタンパク質を表１に定義する。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
【表４】
【００２３】
【表５】
【００２４】
【表６】
【００２５】
【表７】
【００２６】
【表８】
【００２７】
【表９】
【００２８】
スクリーニング方法：
本発明は、ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）上記のウイルスＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法に関する。
【００２９】
１つの実施形態において、ステップｂ）は、前記ＨＣＶタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の相互作用を阻害するための前記候補化合物の能力を明らかにするかまたはしない物理的値を得ること、および前記値を、前記候補化合物の不存在下で行った同一のアッセイにおいて得られた標準的な物理的値と比較することにある。上述した「物理的値」は、実施される結合アッセイに応じて様々な種類のものであり得るが、特に、吸光値、放射性シグナル、および蛍光シグナルの強度値を包含する。物理的値を標準的な物理的値と比較した後であれば、前記候補化合物が前記ＨＣＶタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の結合を阻害することが決定され、そしてその候補はステップｂ）で正の選択をされる。
【００３０】
ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物は、ＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質のいずれかに結合するそのような化合物を包含するが、それは、前記目的の化合物の結合がそれによりＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を妨害するという条件に限ったものである。
【００３１】
標識ポリペプチド：
１つの実施形態において、本発明の任意のタンパク質は、検出可能な分子で標識される。
【００３２】
本発明によれば、前記検出可能な分子は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段により検出可能な任意の化合物または物質からなり得る。例えば、有用な検出可能な分子には、放射性物質（３２Ｐ、２５Ｓ、３Ｈ、もしくは１２５Ｉを含むものを含む）、蛍光色素（５−ブロモデソシルジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、もしくはジゴキシゲニンを含む）、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＹＦＰを含む）、または検出可能なタンパク質もしくはペプチド（ビオチン、ポリヒスチジン尾部、もしくはＨＡ抗原、ＦＬＡＧ抗原、ｃ−ｍｙｃ抗原、およびＤＮＰ抗原などの他の抗原タグを含む）が含まれる。
【００３３】
本発明によれば、検出可能な分子は、目的の前記アミノ酸配列の外側に位置するアミノ酸残基に位置するか、または前記残基に結合し、それにより、前記ポリペプチド間の結合、または前記候補化合物および／もしくは前記ポリペプチドのいずれかの間の結合に対する任意の人為的影響を最小にするかまたは予防する。
【００３４】
別の特定の実施形態において、本発明のポリペプチドはＧＳＴタグ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）と融合される。この実施形態において、前記融合タンパク質のＧＳＴ部分を検出可能な分子として用いることができる。前記融合タンパク質において、ＧＳＴは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。検出可能なＧＳＴ分子は、標識抗ＧＳＴ抗体を含む抗ＧＳＴ抗体とその後に接触すると検出され得る。様々な検出可能な分子で標識された抗ＧＳＴ抗体は、容易に市場で入手することができる。
【００３５】
別の特定の実施形態において、本発明のタンパク質はポリヒスチジンタグと融合される。前記ポリヒスチジンタグは、通常は少なくとも４つの連続したヒスチジン残基を含み、ほとんどの場合、少なくとも６個の連続したヒスチジン残基を含む。このようなポリペプチドタグはまた、最大２０個の連続したヒスチジン残基を含み得る。前記ポリヒスチジンタグは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。この実施形態において、ポリヒスチジンタグは、標識抗ポリヒスチジン抗体を含む抗ポリヒスチジン抗体とその後に接触すると検出され得る。様々な検出可能な分子で標識された抗ポリヒスチジン抗体は、容易に市場で入手することができる。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明のタンパク質は、転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたはアクチベータードメインのいずれかからなるタンパク質部分と融合される。転写の前記タンパク質部分ドメインは、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。このようなＤＮＡ結合ドメインは、大腸菌に由来するＬｅｘＡタンパク質の周知のＤＮＡ結合ドメインからなり得る。さらに、転写因子の前記アクチベータードメインは、酵母に由来する周知のＧａｌ４タンパク質のアクチベータードメインからなり得る。
【００３７】
ツーハイブリッドアッセイ：
本発明に従ったスクリーニング方法の１つの実施形態において、本発明のタンパク質は、転写因子の一部分を含む。前記アッセイにおいて、第１および第２の部分が共に結合することで、特異的な調節ＤＮＡ配列に結合する機能的な転写因子が生じ、それが次にレポーターＤＮＡ配列の発現を誘発し、前記発現がさらに検出および／または測定される。前記レポーターＤＮＡ配列の発現の正の検出は、前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質が共に結合することにより、活性な転写因子が形成されることを意味する。
【００３８】
通常、ツーハイブリッドアッセイにおいて、転写因子の第１および第２の部分はそれぞれ、（ｉ）転写因子のＤＮＡ結合ドメイン、および（ｉｉ）転写因子のアクチベータードメインからなる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびアクチベータードメインは両方とも、同一の天然に存在する転写因子に由来する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびアクチベータードメインは異なる天然に存在する因子に由来するが、共に結合すると、これらの２つの部分は活性な転写因子を形成する。「部分」という用語は、転写因子について本明細書において用いられる場合、複数のタンパク質転写因子に関与する完全なタンパク質、ならびに完全な転写因子タンパク質の特定の機能的なタンパク質ドメインを包含する。
【００３９】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法のステップａ）は、
（１） − （ｉ）上記に定義したＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）転写因子の第１のタンパク質部分との間の第１の融合ポリペプチド、
− （ｉ）上記に定義したヒトタンパク質と（ｉｉ）転写因子の第２の部分との間の第２の融合ポリペプチド、
を発現する宿主細胞を提供するステップであって、
第１および第２のタンパク質部分が共に結合すると、前記転写因子がＤＮＡの標的調節配列に対して活性となり、
前記宿主細胞が、（ｉ）前記活性な転写因子によって活性化され得る調節ＤＮＡ配列と、（ｉｉ）前記調節配列に作動可能に連結しているＤＮＡレポート配列とを含む核酸も含む
ステップ、
（２）ステップ１）で得られた前記宿主細胞を試験される候補化合物と接触させるステップ、
（３）前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルを決定するステップ
を含む。
【００４０】
上記のステップ（３）で決定された前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルは、ステップ（２）が省略された場合の前記ＤＮＡレポーター配列の発現と比較される。候補化合物の存在下における前記ＤＮＡレポーター配列の発現レベルが低いことは、前記候補化合物がＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の結合を効果的に阻害すること、および前記候補化合物がスクリーニング方法のステップｂ）において正の選択をされ得ることを意味する。
【００４１】
適切な宿主細胞には、限定はしないが、原核細胞（細菌など）および真核細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が含まれる。しかし、好ましい宿主細胞は酵母細胞であり、より好ましくは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ細胞である。
【００４２】
ツーハイブリッドアッセイの類似の系が当技術分野において周知であり、したがって、本発明に従ったスクリーニング方法を実施するために用いられ得る（Ｆｉｅｌｄｓら、１９８９年；Ｖａｓａｖａｄａら、１９９１年；Ｆｅａｒｏｎら、１９９２年；Ｄａｎｇら、１９９１年；Ｃｈｉｅｎら、１９９１年、ＵＳ５，２８３，１７３、ＵＳ５，６６７，９７３、ＵＳ５，４６８，６１４、ＵＳ５，５２５，４９０、およびＵＳ５，６３７，４６３を参照されたい）。例えば、これらの文献に記載されているように、Ｇａｌ４アクチベータードメインを、本発明に従ったスクリーニング方法を実施するために用いることができる。Ｇａｌ４は、２つの物理的に別のモジュールドメインからなり、その１つはＤＮＡ結合ドメインとして作用し、残りの１つは転写活性化ドメインとして機能する。前述の文献に記載されている酵母発現系は、この特性を利用したものである。Ｇａｌ４活性化プロモーターの制御下でのＧａｌ１−ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧａｌ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する発色基質を用いて検出される。タンパク質−タンパク質相互作用を同定するための競合キット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ、商標）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。
【００４３】
したがって、１つの実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質はＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインに融合され、上記で定義された第２のヒトタンパク質はＧａｌ４の活性化ドメインに融合される。
【００４４】
前記検出可能なマーカー遺伝子の発現は、産生される対応する特異的ｍＲＮＡの量を定量することにより評価することができる。しかし、通常は、検出可能なマーカー遺伝子の配列は検出可能なタンパク質をコードしており、その結果、前記検出可能なマーカー遺伝子の発現レベルは、産生される対応するタンパク質の量を定量することにより評価される。ｍＲＮＡまたはタンパク質の量を定量するための技術は、当技術分野において周知である。例えば、調節配列の制御下に置かれた検出可能なマーカー遺伝子は、上述のβ−ガラクトシダーゼからなり得る。
【００４５】
ウェスタンブロッティング：
別の１つの実施形態において、ステップａ）は、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質の混合物を、試験される候補化合物の存在下または不存在下でゲル移動アッセイに供し、その後、前記ポリペプチド間に形成された複合体の検出を行うことにより前記ポリペプチドの全ての結合を測定するステップを含む。ゲル移動アッセイは、当業者によって知られているようにして実施することができる。
【００４６】
したがって、本発明の１つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法のステップａ）は、
（１）上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質を提供するステップ、
（２）試験される候補化合物を前記ポリペプチドに接触させるステップ、
（３）ステップ（２）で得られた前記ポリペプチドおよび前記候補化合物を有する適切な移動基質のゲル移動アッセイを実施するステップ、
（４）ステップ（３）で実施された移動アッセイにおいて前記ポリペプチド間で形成された複合体を検出および定量するステップ
を含む。
【００４７】
次に、タンパク質間で形成された複合体の存在または量を、試験される候補化合物の不存在下でアッセイを実施した場合に得られる結果と比較する。したがって、タンパク質間の複合体が検出されない場合、あるいは、これらの複合体が、候補化合物の不存在下で得られる量と比較して少ない量で存在する場合、候補化合物はスクリーニング方法のステップｂ）で正の選択をされ得る。
【００４８】
第１および第２のタンパク質の間で形成される複合体は特定の明らかな分子量を有するため、前記２つのタンパク質間で形成される複合体の検出は、移動ゲルを適切な色素で染色すること、そして分析されるタンパク質に対応するタンパク質バンドを決定することにより容易に実施することができる。ゲルにおけるタンパク質の染色は、標準的なクマシーブリリアントブルー（もしくはＰＡＧＥブルー）、アミドブラック、または様々な種類の銀染色試薬を用いて行うことができる。ドデシル（ラウリル）硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルなどの適切なゲルが、当技術分野において周知である。通常の様式において、ウェスタンブロッティングアッセイが当技術分野において周知であり、広く記載されている（Ｒｙｂｉｃｋｉら、１９８２年；Ｔｏｗｂｉｎら、１９７９年；Ｋｕｒｉｅｎら、２００６年）。
【００４９】
特定の実施形態において、ゲル移動アッセイに供されるタンパク質に対応するタンパク質バンドは、特異的な抗体によって検出することができる。ＨＣＶタンパク質に対する抗体およびヒトタンパク質に対する特異的な抗体の両方を用いることができる。
【００５０】
別の実施形態において、前記２つのタンパク質は、上記の検出可能な抗原で標識される。したがって、タンパク質バンドは、前記検出可能な抗原に対する特異的な抗体によって検出することができる。好ましくは、ＨＣＶタンパク質に結合する検出可能な抗原は、ヒトタンパク質に結合する抗原とは異なる。例えば、第１のＨＣＶタンパク質は検出可能なＧＳＴ抗原に融合され得、第２のヒトタンパク質はＨＡ抗原と融合され得る。そして、２つのタンパク質間で形成されたタンパク質複合体は、それぞれＧＳＴ抗原およびＨＡ抗原に対する抗体で定量および決定され得る。
【００５１】
バイオセンサーアッセイ：
別の実施形態において、ステップａ）は、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９７年）およびＳｚａｂｏら（１９９５年）により記載されているような光バイオセンサーの使用を含んでいた。この技術により、標識された分子を必要とすることなく、分子間の相互作用をリアルタイムで検出することが可能になる。この技術は実際、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づくものである。簡潔に述べると、第１のタンパク質パートナーが表面（カルボキシメチルデキストランマトリクスなど）に付着する。次に、第２のタンパク質パートナーが、試験される候補化合物の存在下または不存在下で、事前に固定された第１のパートナーと共にインキュベートされる。次に、前記タンパク質パートナー間の、結合レベルを含む結合、または結合の不存在が検出される。この目的のために、光ビームが、試験される試料を含まない基質の表面領域側に向けられ、前記表面により反射される。ＳＰＲ現象により、角度および波長の組み合わせで反射光の強さが低減する。第１および第２のタンパク質パートナーの結合により、基質表面での屈折率が変化し、この変化がＳＰＲシグナルにおける変化として検出される。
【００５２】
アフィニティークロマトグラフィー：
本発明の別の１つの実施形態において、スクリーニング方法には、アフィニティークロマトグラフィーの使用が含まれる。
【００５３】
上記のスクリーニング方法において用いるための候補化合物はまた、上記で定義された（ｉ）第１のＨＣＶタンパク質または（ｉｉ）第２のヒトタンパク質が当業者に周知の技術に従って事前に上に固定されている任意のクロマトグラフィー基質を用いる、任意の免疫アフィニティークロマトグラフィー技術によって選択することができる。簡潔に述べると、上記で定義されたＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質は、アガロースであるＡｆｆｉ Ｇｅｌ（登録商標）などの適切なカラムマトリクスまたは当業者に有名な他のマトリクスへの化学的結合を含む従来の技術を用いてカラムに付着させることができる。この方法のいくつかの実施形態において、アフィニティーカラムは、上記で定義されたＨＣＶタンパク質またはヒトタンパク質がグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合されているキメラタンパク質を含む。次に、候補化合物を、アフィニティーカラムのクロマトグラフィー基質に、前記第１および第２のタンパク質の間の他のタンパク質より前に、それと同時に、または連続して接触させる。洗浄した後、クロマトグラフィー基質を溶出し、回収された溶出溶液を、後に適用された前記第１または第２のタンパク質の検出および／または定量により分析し、それにより、候補化合物が（ｉ）第１のＨＣＶタンパク質と（ｉｉ）第２のヒトタンパク質との間の結合を減少させているかどうか、および／またはその減少の程度を決定する。
【００５４】
蛍光アッセイ：
本発明に従ったスクリーニング方法の別の１つの実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、蛍光分子または蛍光基質で標識される。したがって、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質と第２のヒトタンパク質との間の結合に対する、試験される候補化合物の潜在的な改変効果が、蛍光の定量により決定される。
【００５５】
例えば、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、上記のＧＦＰまたはＹＦＰなどの自己蛍光ポリペプチドと融合され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質はまた、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて前記タンパク質間の結合について蛍光の検出および／または定量を実施するために適した蛍光分子で標識され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、ＧＦＰまたはＹＦＰなどの蛍光分子との化学的共有結合によって、蛍光分子で直接的に標識され得る。上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質はまた、例えば前記ポリペプチドと前記蛍光分子との間の非共有結合により、蛍光分子で間接的に標識され得る。実際、上記で定義された前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質は、受容体またはリガンドと融合することができ、前記蛍光分子は、対応するリガンドまたは受容体と融合することができ、その結果、蛍光分子は、前記第１のＨＣＶタンパク質および第２のヒトタンパク質に非共有結合し得る。適切な受容体／リガンドの対は、ビオチン／ストレプトアビジンの対になったメンバーであり得るか、または、抗原／抗体の対になったメンバーの間で選択され得る。例えば、本発明に従ったタンパク質は、ポリヒスチジン尾部に融合することができ、蛍光分子は、ポリヒスチジン尾部に対する抗体と融合することができる。
【００５６】
既に特定されているように、本発明に従ったスクリーニング方法のステップａ）は、ＦＲＥＴを用いた蛍光アッセイによる、上記で定義されたＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力の決定を包含する。したがって、特定の実施形態において、上記で定義された第１のＨＣＶタンパク質は第１のフルオロフォア物質で標識され、第２のヒトタンパク質は第２のフルオロフォア物質で標識される。第１のフルオロフォア物質は、第２のフルオロフォアの励起波長値とほぼ等しい波長値を有し得、それにより、前記第１および第２のタンパク質の結合は、第２のフルオロフォア物質の発光波長で発光される蛍光シグナルの強度を測定することにより検出される。あるいは、第２のフルオロフォア物質はまた、第１のフルオロフォアの発光波長値を有し得、それにより、前記および第２のタンパク質の結合は、第１のフルオロフォア物質の波長で発光される蛍光シグナルの強度を測定することにより検出される。
【００５７】
用いられるフルオロフォアは、周知のランタニドキレートなどの様々な適切な種類のものであり得る。これらのキレートは、特異性のバイオアフィニティーアッセイにおいて化学的安定性、生物学的結合後の寿命の長い蛍光（０．１ｍｓを超える寿命）、および顕著なエネルギー移動を有していることが記載されている。文献ＵＳ５，１６２，５０８は、ビピリジンクリプテートを開示している。ＴＥＫＥＳ型の光感作物質（ＥＰ０２０３０４７Ａ１）およびテルピリジン型の光感作物質（ＥＰ０６４９０２０Ａ１）を有するポリカルボキシレートキレート剤が知られている。文献ＷＯ９６／００９０１は、カルボスチリルを感作物質として用いるジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＰＴＡ）キレートを開示している。他の感作物質および他のトレーサー金属を有するさらなるＤＰＴキレートが、診断または画像化の使用について知られている（例えば、ＥＰ０４５０７４２Ａ１）。
【００５８】
好ましい実施形態において、スクリーニング方法のステップａ）で実施される蛍光アッセイは、文献ＷＯ００／０１６６３またはＵＳ６，７４０，７５６において記載されているような均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイからなり、前記文献の両方の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＴＲＦは、ＴＲＦ（時間分解蛍光）およびＦＲＥＴの両方の原理を用いる、ＴＲ−ＦＲＥＴに基づいた技術である。より具体的には、当業者であれば、Ｌｅｂｌａｎｃら（２００２年）において記載されている時間分解増幅クリプテート発光（ＴＲＡＣＥ）技術に基づいたＨＴＲＦアッセイを用い得る。ＨＴＲＦドナーフルオロフォアは、ランタニドの長寿命の発光とクリプテートのカプセル封入の安定性とを組み合わせて有する、ユーロピウムクリプテートである。紅藻類から精製された修飾アロフィコシアニンであるＸＬ６６５は、ＨＴＲＦの主要なアクセプターフルオロフォアである。これらの２つのフルオロフォアが生体分子相互作用により一緒にされると、励起の間にクリプテートにより捕捉されるエネルギーの一部は６２０ｎｍでの蛍光発光を介して放出され、一方、残りのエネルギーはＸＬ６６５に移動する。このエネルギーは次に、６６５ｎｍでの特異的な蛍光として、ＸＬ６６５により放出される。６６５ｎｍの光は、ユーロピウムを有するＦＲＥＴを介してのみ発光される。ユーロピウムクリプテートは常にアッセイ内に存在するため、６２０ｎｍの光は、生体分子の相互作用がＸＬ６６５を近接させない場合であっても検出される。
【００５９】
したがって、１つの実施形態において、スクリーニング方法のステップａ）はしたがって、
（１）− 第１の抗原に融合された第１のＨＣＶタンパク質、
− 第２の抗原に融合された第２のヒトタンパク質、
− 試験される候補化合物
を含むプレアッセイ試料を接触させるステップ、
（２）ステップ（１）の前記プレアッセイ試料に
− 前記第１の抗原に対して特異的な、ヨーロピアンクリプテートで標識された少なくとも１つの抗体、
− 前記第２の抗原に対するＸＬ６６５で標識された少なくとも１つの抗体
を添加するステップ、
（３）前記ヨーロピアンクリプテートの励起波長でステップ（２）のアッセイ試料を照射するステップ、
（４）ＸＬ６６５の発光波長で発光される蛍光シグナルを検出および／または定量するステップ、
（５）ステップ（４）で得られた蛍光シグナルを、ステップ（１）のプレアッセイ試料が試験される候補化合物の不存在下で調製される場合に得られる蛍光と比較するステップ
を含み得る。
【００６０】
上記のステップ（５）において、蛍光シグナルの強度値が、ステップ（１）のプレアッセイ試料が試験される候補化合物の不存在下で調製される場合に見られる蛍光シグナルの強度値よりも低い場合、候補化合物は、スクリーニング方法のステップｂ）で正の選択をされ得る。
【００６１】
ヨーロピアンクリプテートで標識されたかまたはＸＬ６６５で標識された抗体は、それが含む、ＧＳＴ、ポリヒスチジン尾部、ＤＮＰ、ｃ−ｍｙｘ、ＨＡ抗原、およびＦＬＡＧを含む、目的の様々な抗原に対するものであり得る。このような抗体は、ＣｉｓＢｉｏ（Ｂｅｄｆｏｒｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から市販されているもの、とりわけそれぞれ６１ＧＳＴＫＬＡまたは６１ＨＩＳＫＬＢと呼ばれるものを包含する。
【００６２】
候補化合物：
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の候補化合物は、事前に合成された化合物のライブラリー、またはデータベースにおいて構造が決定されている化合物のライブラリー、またはデノボ合成されている化合物のライブラリーから選択され得る。
【００６３】
候補化合物は、（ａ）タンパク質またはペプチド、（ｂ）核酸、および（ｃ）有機または化学的化合物の群から選択され得る。具体的には、事前に選択された候補核酸のライブラリーは、文献ＵＳ５，４７５，０９６およびＵＳ５，２７０，１６３において記載されているＳＥＬＥＸ方法を実施することにより得ることができる。さらに具体的には、候補化合物は、上記の前記ＨＣＶタンパク質および前記ヒトタンパク質に対する抗体の群から選択され得る。
【００６４】
インビボでのスクリーニング方法：
本明細書において先に記載したインビトロでのスクリーニングの実施形態のいずれか１つの最後に正の選択をされた候補化合物を、その抗ＨＣＶ生物学的特性をさらにアッセイすることを考慮したさらなる選択ステップに供することができる。
【００６５】
本発明のタンパク質の生産：
本発明のタンパク質は、限定はしないが、単独のまたは組み合わせた、任意の化学的、生物学的、遺伝的、または酵素的技術などの、それ自体が当技術分野において知られている任意の技術によって生産することができる。
【００６６】
所望の配列のアミノ酸配列を知ることで、当業者は、標準的な技術によって前記タンパク質を容易に生産することができる。例えば、前記タンパク質は、周知の固相方法を用いて、好ましくは、市販されているペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより製造されているものなど）を製造者の指示に従って用いて合成することができる。
【００６７】
あるいは、本発明のタンパク質は、当技術分野において現在周知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。例えば、これらの断片は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、所望のタンパク質を発現するであろう適切な真核宿主または原核宿主内に導入した後に、ＤＮＡ発現産物として得ることができ、前記宿主から、周知の技術を用いて前記断片を後に単離することができる。
【００６８】
宿主／発現ベクターの広範な組み合わせが、本発明のポリペプチドをコードする核酸の発現において採用される。使用され得る有用な発現ベクターには、例えば、染色体断片、非染色体断片、および合成ＤＮＡ配列が含まれる。適切なベクターには、限定はしないが、ＳＶ４０およびｐｃＤＮＡの誘導体、ならびに既知の細菌プラスミド、例えばｃｏｌ ＥＩ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＭＢ９、およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド、ＮＭ９８９などのファージＩの多数の誘導体などのファージＤＮＡ、ならびにＭ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡなどの他のファージＤＮＡ；２ミクロンプラスミドまたは２ミクロンプラスミドの誘導体などの酵母プラスミド、ならびにセントロメアおよび組み込み性の酵母シャトルベクター；昆虫細胞または哺乳動物細胞において有用なベクターなどの真核細胞において有用なベクター；ファージＤＮＡまたは発現制御配列を採用するために改変されているプラスミドなどの、プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクターなどが含まれる。
【００６９】
したがって、哺乳動物および典型的にはヒトの細胞、ならびに細菌、酵母、真菌、昆虫、線虫、および植物の細胞が本発明において用いられ、本明細書において定義される核酸または組換えベクターによってトランスフェクトされ得る。適切な細胞の例には、限定はしないが、ＶＥＲＯ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２などのＨＥＬＡ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１などのＣＨＯ細胞系、ＣＯＳ−７細胞およびＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０の細胞などのＣＯＳ細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６３６１などの３Ｔ３、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２細胞、２９３Ｔ細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１などのＳｆ９細胞、ならびにＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０などのＣｖ１細胞が含まれる。本発明において用いることができる他の適切な細胞には、限定はしないが、大腸菌などの原核宿主細胞株（例えば、ＤＨ５−［アルファ］株）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の株が含まれる。本発明において用いることができるさらなる適切な細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのものなどの酵母細胞が含まれる。
【００７０】
治療的方法および使用：
さらなる態様において、本発明は、上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する治療有効量の化合物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、ＨＣＶ感染を治療するかまたはＨＣＶ感染を予防するための方法を提供する。前記化合物は、本発明のスクリーニング方法によって同定することができる。
【００７１】
本発明の背景において、本明細書において用いられる「治療する」または「治療」という用語は、このような用語が適用される障害もしくは状態、または、肝障害、肝脂肪症に関連する代謝障害、線維形成、およびインスリン耐性などの、このような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状を回復に向かわせること、軽減すること、その進行を阻害すること、または予防することを意味する。
【００７２】
本発明によれば、「患者」または「治療を必要とする対象」という用語は、ＨＣＶ感染に罹患しているかまたは罹患していると考えられるヒトまたはヒト以外の哺乳動物を意味する。
【００７３】
本発明の「治療有効量の」化合物は、任意の医療に適用可能な妥当な利益／リスク比の、ＨＣＶの感染を治療するために十分な量の化合物を意味する。しかし、本発明の化合物および本発明の組成物の毎日の使用量の全体は信頼できる医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されよう。あらゆる特定の患者にとっての具体的な治療有効な用量レベルは、治療される障害およびその障害の重症度、採用される特定の化合物の活性、採用される特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、採用される特定の化合物の投与時間、投与経路、および排出速度、治療の期間、採用される特定の化合物と組み合わせてまたはそれと同時に用いられる薬剤、ならびに医薬分野において周知の類似の因子を含む、様々な因子に依存する。例えば、化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要な用量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで用量を徐々に増大させることは、当技術分野の技術の範囲内に十分含まれる。
【００７４】
別の１つの実施形態において、本発明は、ＨＣＶ感染を治療することまたはＨＣＶ感染を予防することを目的とした医薬品の製造のための、上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００７５】
上記のＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する化合物は、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせることができる。「薬学的に」または「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物、とりわけヒトに必要に応じて投与されたときに副作用、アレルギー反応、または他の有害な反応をもたらさない分子実体および組成物について言う。薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体、または液体のフィラー、希釈剤、カプセル封入材料、または製剤補助剤を言う。
【００７６】
以下の図面および実施例を考慮して本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ＨＣＶ相互作用ネットワークを示す図である。
【００７８】
Ａ．命名。Ｖ：ウイルスタンパク質（黒のノード）。ＨＨＣＶ：ＨＣＶタンパク質と相互作用するヒトタンパク質（赤のノード）。ＨＮＯＴ−ＨＣＶ：ＨＣＶタンパク質と相互作用しないヒトタンパク質（青のノード）。Ｖ−ＨＨＣＶ：ＨＣＶ−ヒトタンパク質相互作用（赤のエッジ）。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶ：ＨＣＶと相互作用するヒトタンパク質間の相互作用（青のエッジ）。Ｈ−Ｈ：ヒト−ヒトタンパク質相互作用（青のエッジ）。Ｖ−ＨＨＣＶは、ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用を表す（黒の四角）。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶは、ウイルスタンパク質と相互作用するヒトタンパク質からなる（赤の四角）。Ｈ−Ｈネットワークは、ヒトタンパク質間の相互作用を表す（青の四角）。
【００７９】
Ｂ．タンパク質およびＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークにおける相互作用の数。
ＨＣＶタンパク質と相互作用するヒトタンパク質（ＨＨＣＶ）の数、およびタンパク質−タンパク質相互作用（Ｖ−ＨＨＣＶ ＰＰＩ）の対応する数。データは、本発明の酵母ツーハイブリッドスクリーン（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ）および文献をキュレーションした相互作用（ＩＭＡＰ ＬＣＩ）について示されている。
【００８０】
Ｃ．コアフィニティー精製アッセイによるＹ２Ｈ相互作用の検証。９回のｃｏ−ＡＰの正のアッセイが示されており、ＮＳ５Ａ−ＳＯＲＢＳ２（１）、ＮＳ３−ＣＡＬＣＯＣＯ２（２）、ＮＳ５Ａ−ＢＩＮ１（３）、ＮＳ５Ａ−ＭＯＢＫ１Ｂ（４）、ＮＳ５Ａ−ＥＦＥＭＰ１（５）、ＮＳ３−ＰＳＭＢ９およびＮＳ５Ａ−ＰＳＭＢ９（６）、ＮＳ５Ａ−ＰＰＰＩＲＩ３Ｌ（７）、ＮＳ３−ＲＡＳＡＬ２（８）を表している。ＧＳＴタグ付けされたウイルスベイト（＋）または陰性対照であるＧＳＴ単独（−）でのプルダウンの後、細胞プレイを抗Ｆｌａｇ抗体で同定する。抗ＧＳＴ抗体は、ＧＳＴ単独またはＧＳＴタグ付けされたウイルスベイトのいずれかを同定する。細胞溶解物における細胞プレイの発現は、抗Ｆｌａｇにより制御される（最下部のパネル）。
【００８１】
【図２】ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークのグラフィック表示である。
【００８２】
Ａ．Ｈ−Ｈネットワークのグラフィック表示。それぞれのノードはタンパク質を表し、それぞれのエッジは相互作用を表す。赤および青のノードはそれぞれＨＨＣＶおよびＨＮＯＴ−ＨＣＶである。
【００８３】
Ｂ．Ｖ−ＨＨＣＶ相互作用ネットワークのグラフィック表示。黒のノード：ウイルスタンパク質、赤のノード：ヒトタンパク質、赤のエッジ：ヒトタンパク質とウイルスタンパク質との間の相互作用（Ｖ−ＨＨＣＶ）、青のエッジ：ヒトタンパク質間の相互作用（ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶ）。１９６個のタンパク質を含む最大の成分がネットワークの中央部に表されている。３つの他の連結した成分に属する細胞タンパク質の名称もまた表されている。
【００８４】
【図３】ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの位相分析を示す図である。
【００８５】
Ａ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨおよびＨＨＣＶの位相分析。ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られる全てのヒトタンパク質およびＨＨＣＶについて、程度（ｋ）、媒介性（ｂ）、および最短経路（ｌ）を計算した。
【００８６】
Ｂ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨタンパク質およびＨＨＣＶタンパク質の程度および媒介性の分布。Ｈタンパク質（青）およびＨＨＣＶタンパク質（赤）の、標準化されたｌｏｇ程度（左）およびｌｏｇ媒介性（右）の分布。実線は、線形回帰のフィットを表す。垂直な点線は、程度および媒介性の値の平均を示す。それぞれのクラスは、従来の標準誤差と共に表されている。
【００８７】
Ｃ．Ｈ−ＨネットワークにおけるＨの程度および媒介性の相関関係。Ｈ−ＨネットワークにおけるＨタンパク質の、標準化されたｌｏｇ程度（ｘ軸）およびｌｏｇ媒介性（ｙ軸）。黒の実線は、線形回帰のフィットを表す（Ｒ２＝０．５６）。水平および垂直な点線はそれぞれ、程度および媒介性の値の平均を示す。低い程度（ＬＤ）および高い程度（ＨＤ）のクラスを、平均の程度でのカットオフを用いることにより定義した。
【００８８】
Ｄ．低いおよび高い程度のタンパク質についてのＨＮＯＴ−ＨＣＶおよびＨＨＣＶの程度および媒介性の平均。上部：ＨＮＯＴ−ＨＣＶ（青）およびＨＨＣＶ（赤）の媒介性の平均（ｌｏｇスケール）を、ＬＤおよびＨＤクラスについて示す。下部：ＨＮＯＴ−ＨＣＶ（青）およびＨＨＣＶ（赤）の程度の平均を、ＬＤおよびＨＤクラスについて示す。従来の標準誤差閾値およびＵ検定のｐ値が表されている（＊＊＊：ｐ値＜１０−１０、ＮＳ：有意性なし）。
【００８９】
【図４】ＩＪＴネットワークを示す図である。
【００９０】
Ａ．ＩＪＴネットワークのグラフィック表示。ＫＥＧＧアノテーションに従った、インスリン（青）、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ（赤）、およびＴＧＦβ（緑）経路のタンパク質（ノード）メンバー、ならびにそれらの相互作用（エッジ）が示されている（ＨＣＶタンパク質と相互作用するタンパク質が指定されている）。２つの経路により共有されるタンパク質は第２の色（ピンク、黄、および青緑）で示されている。灰色および黒のノードは、ＫＥＧＧ経路を連結しＨＣＶタンパク質と相互作用する隣接物である（灰色：ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られるタンパク質、黒：ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットから得られるタンパク質）。ＨＣＶと相互作用するがＫＥＧＧ経路は連結しない隣接物は表されていない。論じられるタンパク質の例であるＰＬＳＣＲ１およびＹＹ１は四角の中にある。インタラクティブな可視化のツールは補足的なファイルで提供される（ネットワークの可視化）。
【００９１】
ＢおよびＣ．Ｖ−ＨＨＣＶおよびＩＪＴネットワークにおけるそれぞれのウイルスタンパク質の相対的寄与。３つの最も相互作用するウイルスタンパク質のパーセンテージを示す。ＣＯＲＥ相互作用の５１．３％は、ＩＪＴネットワークに集中している。
【００９２】
【図５】ＨＣＶと接着斑との相互作用を示す図である。
【００９３】
Ａ．ＫＥＧＧから採用された接着斑の略図（ＩＤ：Ｈｓ０４５１０）。ＨＨＣＶは、オレンジの四角で表されており、ＨＮＯＴ−ＨＣＶは青の四角で表されている。
【００９４】
ＢおよびＣ．ＮＳ３およびＮＳ５Ａによる接着斑の摂動の機能的検証。
９６ウェルプレートを様々な濃度のフィブロネクチン（Ｂ）またはポリ−Ｌ−リジン（Ｃ）で被覆した。ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａを発現する２９３Ｔ細胞を、マトリクス上に３０分間にわたり播種した。接着細胞をクリスタルバイオレットで染色した。ＦＡ５０は、最大接着の半分に必要なマトリクス濃度である。値は、３つの独立した実験の平均をその標準偏差と共に表す。
【００９５】
【図６】ＨＣＶのＯＲＦｅｏｍｅを示す図である。ＨＣＶゲノム、およびＹ２Ｈのスクリーンのために設計されたＯＲＦの定義の略図。ＨＣＶのプラス鎖ゲノム（紫）は、１０個のタンパク質に共翻訳的にプロセシングされるポリタンパク質（オレンジ）をコードする。赤：完全長タンパク質、青：ドメイン、黄＋緑：ＮＳ４Ａ＋ＮＳ３キメラ融合体、ピンク：ＮＳ５Ａ膜アンカー。それぞれの構築物のゲノムおよびポリタンパク質の位置が表に示される。
【００９６】
【図７】Ｈ−ＨネットワークにおけるＨ、ＨＨＣＶ、およびＨＥＢＶタンパク質の程度および媒介性の分布を示す図である。Ｈタンパク質（青）、ＨＨＣＶ（赤）、およびＨＥＢＶ（緑）のｌｏｇ程度（左）およびｌｏｇ媒介性（右）の分布。実線は線形回帰のフィットを表す。垂直な点線は、程度および媒介性の値の平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９７】
表Ｓ１：ＨＨＣＶのリスト。
【００９８】
ＨＣＶタンパク質は、それらのＮＣＢＩの成熟ペプチド生成物名に従って参照される（第１欄）。ヒトタンパク質は、それらの同族のＮＣＢＩ遺伝子名および遺伝子ＩＤと共に参照される（第２および３欄）。ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ（スクリーニング方法に従ってＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２）のＩＳＴの数が第４および５欄に示される。テキストマイニングおよびＢＩＮＤデータベースに関連するＰｕｂＭｅｄ ＩＤから得られたＩＭＡＰ ＬＣＩ（文献をキュレーションした相互作用）が第６および７欄に示される。コアフィニティー精製（ＣｏＡＰ）またはＹ２Ｈペアワイズマトリクスの検証が第８および９欄に示される（＋：ＩＭＡＰ検証、−：検証されず、ＮＡ：タンパク質発現の欠損またはＧＳＴと直接的に相互作用する細胞タンパク質のためにアッセイ不可能）。
【００９９】
表Ｓ２：２つ以上のウイルスタンパク質と相互作用するヒト細胞タンパク質のリスト。
【０１００】
ヒトタンパク質は、それらの同族のＮＣＢＩ遺伝子名と共に参照される（第１欄）。ＨＣＶタンパク質は、それらのＮＣＢＩの成熟ペプチド生成物名に従って参照される（第２欄）。データセットの由来源（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ、ＩＭＡＰ ＬＣＩ、第３欄）。
【０１０１】
表Ｓ３：ＨＣＶ−ヒトネットワークの位相分析
ＨＣＶ−ヒトネットワークの連結された成分。
【０１０２】
Ｖ−ＨＨＣＶサブネットワークの最大の成分のサイズおよび連結された成分の数を計算した（ＩＭＡＰデータセット、第２欄）。観察された値の有意性を検定するために、本発明者らは、ランダムなサブネットワークを１０００個のシミュレーションした後の最大の成分のサイズの平均および連結された成分の数の平均を計算した（ＩＭＡＰ Ｓｉｍ、第３欄）。観察された値とシミュレーションされた値との間の差異は非常に有意であった（＊＊＊：ｐ値＜１０−１０）。
【０１０３】
ヒトインタラクトームにおけるＨＨＣＶタンパク質およびＨＥＢＶタンパク質の位相特性。
【０１０４】
完全なインタラクトーム（Ａ）、信頼性の高いインタラクトーム（Ｂ、少なくとも２つのＰＭＩＤを有するかまたは２つの異なる方法によって検証されたＰＰＩのみを含む）。タンパク質およびヒトインタラクトーム内に組み込まれ得るＰＰＩの数がＨＨＣＶおよびＨＥＢＶについて示される。ヒトインタラクトーム内に存在するＨＨＣＶおよびＨＥＢＶのパーセンテージが、データセットの由来源に従って示される。程度（ｋ）、媒介性（ｂ）、および最短経路（ｌ）の平均を、完全なおよび信頼性の高いインタラクトームの両方においてＨＨＣＶおよびＨＥＢＶについて計算した（２５）。
【０１０５】
表Ｓ４：ＨＨＣＶについてのＫＥＧＧ経路の強化。
【０１０６】
過剰に表されたＫＥＧＧ経路を、複数の検定調整の後に有意であると同定し（調整されたｐ値＜５×１０−２）、ウイルスタンパク質ごとに列挙する。それぞれの経路について、括弧内のＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットの相対的寄与と共に、ＨＨＣＶの数が示される。黒の四角は、論じられている経路を強調するものである。
【０１０７】
表Ｓ５：ＩＪＴネットワークにおけるＨＣＶタンパク質の分布および強化。
【０１０８】
Ａ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＩＪＴネットワークにおけるＨＨＣＶの強化。ＨＨＣＶの数がＶ−ＨＨＣＶおよびＩＪＴネットワークにおいて示される。ＩＪＴネットワークにおけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【０１０９】
Ｂ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの強化。（ＫＥＧＧデータベースにおいて定義されている）Ｖ−ＨＨＣＶネットワークならびにＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの数が示される。Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリン経路におけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【０１１０】
Ｃ．それぞれのウイルスタンパク質についてのＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路におけるＨＨＣＶの強化。相互経路は、２つまたは３つのＫＥＧＧ経路を連結するＨＨＣＶとして定義される。ＨＨＣＶの数が、Ｖ−ＨＨＣＶネットワークならびにＪａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路において示される。Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、ＴＧＦβ、およびインスリンの相互経路におけるＨＨＣＶの強化を、それぞれのウイルスタンパク質についてフィッシャーの正確検定で検定した。関連するオッズ比およびｐ値が示される。
【実施例】
【０１１１】
＜実施例１＞
概説
Ｃ型肝炎ウイルスとヒトタンパク質との間の相互作用のプロテオームワイドなマッピングを実施して、細胞感染の包括的な見解を提供した。全部で３１４の、ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用を酵母ツーハイブリッドにより同定し、１７０の前記相互作用を文献マイニングにより同定した。再構築したヒトインタラクトーム内へのこのデータセットの組み込みにより、ＨＣＶと相互作用する細胞タンパク質が、非常に中心的で相互に連結されたタンパク質において強化されていることが示された。機能アノテーションに基づいた全体的な分析は、ＨＣＶにより標的化される細胞経路の強化を強調した。慢性的に感染した患者の頻繁な臨床障害に関連するタンパク質のネットワークを、インスリン、Ｊａｋ／ＳＴＡＴ、およびＴＧＦβ経路をＨＣＶにより標的化される細胞タンパク質と連結することにより構築した。ＣＯＲＥタンパク質は、このネットワークの主要な摂動付与物質として現れた。接着斑を、ＨＣＶ、主にＮＳ３およびＮＳ５Ａタンパク質により影響される新たな機能として同定した。
【０１１２】
材料および方法：
ＨＣＶのＯＲＦｅｏｍｅの構築。
【０１１３】
ＨＣＶゲノムは、構造タンパク質（ＣＯＲＥ、Ｅ１、Ｅ２、およびｐ７）および非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂ）内の細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼにより切断される１つのポリタンパク質をコードするプラス鎖ＲＮＡ分子である（１）。全てのタンパク質を、ｅｕＨＣＶｄｂ設備（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｈｃｖｄｂ．ｉｂｃｐ．ｆｒ（２））を用いて、ドメインが設計されていないＮＳ４Ｂを除いて、完全長およびドメインでクローニングした（図６）。融合ＮＳ４Ａ−ＮＳ３タンパク質およびＮＳ４Ａ−ＮＳ３プロテアーゼドメインを構築した（３、４）。ＨＣＶ遺伝子型１ｂである単離体ｃｏｎ１（ＡＪ２３８７９９）から得られる全ての２７個のＯＲＦを（５）、ゲートウェイ組換えクローニング系においてクローニングした。それぞれのＯＲＦを、フォワードプライマーおよびリバースプライマーに融合したａｔｔＢ１．１およびａｔｔＢ２．１組換え部位を用いて（ＫＯＤポリメラーゼ、Ｎｏｖａｇｅｎを用いて）ＰＣＲ増幅し、ｐＤＯＮＲ２２３内にクローニングした（６）。全てのエントリークローンを配列により検証した。
【０１１４】
酵母ツーハイブリッド（Ｙ２Ｈ）ライブラリーのスクリーン。
【０１１５】
ＨＣＶのＯＲＦを、ｐＤＯＮＲ２２３から、酵母においてＧａｌ４−ＤＢ融合体として発現されるベイトベクター（ｐＰＣ９７）内に移した。２つの異なるスクリーニング方法を用いた（ＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２）。ＩＭＡＰ１およびＩＭＡＰ２戦略の両方のために、またベイトが自己転写活性化レポーター遺伝子を構築することがあるため、ＳＤ−Ｌ−Ｈ培地に３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を補った。この薬剤の適切な濃度は、３−ＡＴの濃度を増大させながら補ったＳＤ−Ｌ−Ｈ培地上でベイト株を成長させることにより決定した。膜アンカーを有さないＮＳ５Ａによる自己転写活性化は３−ＡＴで滴定するには高すぎ、さらなる試験は行わなかった。ＩＭＡＰ１では、ベイトベクターをＭＡＶ２０３酵母株に導入し、ヒト脾臓および胎児脳の両方のＡＤ−ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、記載されているような形質転換によりスクリーニングした（７）。最初に陽性であった全てのクローン（ＳＤ−Ｗ−Ｌ−Ｈ＋３−ＡＴ上で選択された）を、２つのさらなるレポーター遺伝子であるＬａｃＺ（Ｘ−Ｇａｌ比色分析）およびＵＲＡ３（５−ＦＯＡを補った培地上での成長アッセイ）を用いたさらなる表現型アッセイにより試験した。３つの陽性表現型のうち少なくとも２つを示した陽性クローンを、新鮮な酵母内で再試験した。再試験しなかったクローンは廃棄した。ＡＤ−ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、インサートを配列決定して相互作用子を同定した。ＩＭＡＰ２のスクリーンを、ＡＨ１０９およびＹ１８７酵母株を用いて、酵母の接合によって実施した（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（８））。ベイトベクターをＡＨ１０９内に形質転換し（ベイト株）、ヒト脾臓および胎児脳のＡＣ−ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＹ１８７内に形質転換した（プレイ株）。単一のベイト株をプレイ株と接合し、２倍体をＳＤ−Ｗ−Ｌ−Ｈ＋３−ＡＴ培地に播種した。陽性のクローンをこの選択培地上で１５日間維持し、あらゆる汚染ＡＤ−ｃＤＮＡプラスミドを除去した（９）。ＡＤ−ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅し、インサートを配列決定した。
【０１１６】
ＩＳＴ（相互作用子配列タグ）分析
本発明者らは、それぞれのＩＳＴをその天然のヒトゲノム転写産物に割り当てる生物情報学的パイプラインを開発した。まず、ＩＳＴを、従来の閾値である２０を上回る品質スコア（１％未満の配列誤差）でＰＨＲＥＤ（１０、１１）を用いてフィルタリングした。Ｇａｌ４モチーフを検索し（ＧＡＬ４−ＡＤの最後の８７塩基）、このモチーフの下流の配列をペプチドに翻訳し、ＢＬＡＳＴＰを用いてＲＥＦＳＥＱ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＲｅｆＳｅｑ／）ヒトタンパク質配列データベース（２００７年４月リリース）に対してアラインした。信頼性の低いアラインメント（Ｅ値＞１０−１０、同一性＜８０％）および早期の停止コドンを含む配列を除去した。インフレームのタンパク質および質の高い配列のみをさらに検討した。
【０１１７】
組み込まれたヒトインタラクトームネットワーク（Ｈ−Ｈネットワーク）
物理的および直接的な異種分子間タンパク質−タンパク質相互作用のみを、ＢＩＮＤ（１２）、ＢｉｏＧＲＩＤ（１３）、ＤＩＰ（１４）、ＧｅｎｅＲＩＦ（１５）、ＨＰＲＤ（１６）、ＩｎｔＡｃｔ（１７）、ＭＩＮＴ（１８）、およびＲｅａｃｔｏｍｅ（１９）から取り出した。ＮＣＢＩの正式な遺伝子名を用いて、異なるゲノム参照データベース（すなわち、ＥＮＳＥＭＢＬ、ＵＮＩＰＲＯＴ、ＮＣＢＩ、ＩＮＴＡＣＴ、ＨＰＲＤなど）において定義されているタンパク質ＡＣＣ、タンパク質ＩＤ、遺伝子名、記号、または別名を統一し、かつ単一の遺伝子についての異なるタンパク質アイソフォームの存在に起因する相互作用の冗長性を除去した。したがって、遺伝子名は、タンパク質を同定するためにテキストにおいて用いた。最後に、冗長ではないタンパク質−タンパク質相互作用のみを、ヒトインタラクトームデータセットを構築するために維持し、すなわち、ＡがＢと相互作用し、かつＢがＡと相互作用する場合に、ＡとＢとの相互作用のみが選択された。
【０１１８】
ＨＣＶタンパク質と細胞タンパク質との間の相互作用のテキストマイニング
細胞タンパク質とＨＣＶタンパク質との間の２種分子間相互作用を記載する、文献をキュレーションした相互作用（ＬＣＩ）を、専門家のキュレーションプロセスにより完成した自動テキストマイニングパイプラインを用いることによって、ＢＩＮＤデータベースおよびＰｕｂＭｅｄ（２００７年８月前の刊行物）から抽出した。テキストマイニングアプローチでは、「ＨＣＶ」および「タンパク質相互作用」というキーワードに関連する全ての要約を取り出し、遺伝子名（ＮＣＢＩ遺伝子名および別名に基づく）ならびに相互作用の動詞（相互作用する、結合する、付着するなど）について、文作成プログラム（文の分割）および品詞タグ付けプログラムに供した（２０）。専門家によるキュレーションのために、少なくとも１つのヒト遺伝子名、１つのウイルス遺伝子名、および１つの相互作用項の共起を示す文の優先順位を付けた。
【０１１９】
コアフィニティー精製による検証
５９のＩＭＡＰ Ｙ２Ｈ相互作用のランダムなプールをＣｏＡＰアッセイのために選択した。細胞のＯＲＦ（Ｙ２Ｈスクリーンにおいて見られる相互作用ドメイン）を、ＫＯＤポリメラーゼ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリーのプールまたはＭＧＣのｃＤＮＡプラスミドからｐＤＯＮＲ２０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に、組換えクローニングによってクローニングした。配列決定による検証の後、これらのＯＲＦをゲートウェイ変換されたｐＣｉ−ｎｅｏ−３ｘＦＬＡＧに移し、ＨＣＶのＯＲＦをｐＤＥＳＴ２７内に移した（Ｎ末端におけるＧＳＴ融合）。次に、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、相互作用タンパク質をコードするそれぞれのプラスミド対によってコトランスフェクトした（ＪｅｔＰｅｉ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）。対照は、３ｘＦＬＡＧタグ付けされたプレイに対するＧＳＴのみである。トランスフェクションの２日後、細胞を回収し、溶解した（０．５％のＮＰ−４０、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１８０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および完全プロテアーゼ阻害剤のカクテル）。細胞溶解物を、４℃で１３０００ｒｐｍで２０分間にわたり遠心分離することにより清澄化し、可溶性タンパク質複合体をグルタチオンセファロース４Ｂビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。次に、ビーズを溶解緩衝液で４回十分に洗浄し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロース膜に移した。ＧＳＴタグ付けされたウイルスタンパク質および３ｘＦＬＡＧタグ付けされた細胞タンパク質を、抗ＧＳＴモノクローナル抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）および抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて、標準的な免疫ブロッティング技術を用いて検出した（２１）。
【０１２０】
ネットワークの可視化
Ｌａｒｇｅ Ｇｒａｐｈ Ｌａｙｏｕｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／ｌｇｌ／）を適用して、図２ＡにおけるＨ−Ｈネットワークを視覚化した。推測ツール（ｈｔｔｐ：／／ｇｒａｐｈｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ．ｃｏｎｄ．ｏｒｇ／）を用いて、図２ＢにおけるＨ−ＨＨＣＶ感染ネットワークおよび図４ＡにおけるＩＪＴネットワークをグラフィック表示した。図２Ｂおよび４Ａは、ＳＦ１．ｔａｒ．ｇｚにおけるＧＵＥＳＳ相互作用フォーマット（ＧＵＥＳＳデータフォーマット）において入手可能である（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＿ｎｅｔｗｏｒｋ．ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓおよびｉｊｔ＿ｎｅｔｗｏｒｋ．ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）。
【０１２１】
位相分析
Ｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）統計環境を用いて統計分析を行い、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｃｎｅｕｒｏｃｖｓ．ｒｍｋｉ．ｋｆｋｉ．ｈｕ／ｉｇｒａｐｈ／）を用いて、ネットワークの連結された成分、中心性（程度、媒介性）、および最短経路の測定値を計算した。
【０１２２】
連結された成分：
無方向的なネットワークにおいて、連結された成分は、最大の連結されたサブネットワークである。２つのノード間に経路が存在する場合に２つのノードは同一の連結された成分内にあり、かつ、２つのノードが同一の連結された成分内にあるのは、２つのノード間に経路が存在する場合のみである。本発明者らはまた、ｉｇｒａｐｈ Ｒパッケージに従って、他のタンパク質のいずれにも連結されていないタンパク質を、連結された成分に含めた。
【０１２３】
程度：
ノードの程度（ｋ）は、ノードに伴うエッジの数である。ヒトタンパク質の程度の平均を計算し、全てのＨＨＣＶの程度の平均と比較した。
【０１２４】
最短経路：
最短経路の問題は、その構成要素であるエッジのウェイトの合計が最小化するような、２つのノード間の経路の発見である。最短経路（Ｉ、また測地線とも呼ばれる）を、グラフにおいて幅優先サーチを用いることによってここで計算する。エッジのウェイトはここでは用いておらず、すなわち、全てのエッジウェイトは１である。任意の２つのヒトタンパク質対の間の最短経路の平均を計算し、任意の２つのＨＨＣＶ対の間の最短経路の平均と比較した。
【０１２５】
媒介性：
ノードの媒介性（ｂ）を、ノードを通過する最短経路の数により大まかに規定する。全てのヒトタンパク質の媒介性の平均を計算し、任意の２つのＨＨＣＶ対の間の最短経路の平均と比較した。
【０１２６】
位相分析の統計的検定：
観察された差異を統計的に確認するために、ウィルコクソン・マン・ホイットニー順位和検定（Ｕ検定）を選択した。Ｕ検定は、２つの関連するサンプルのためのペアステューデントｔ検定または１つのサンプルに対する反復測定に対する、ノンパラメトリックな代替物である。一般化された線形モデルおよびＡＮＯＶＡ分析を用いて、ＨＣＶタンパク質がヒトタンパク質と相互作用する確率に対する、程度および媒介性の個別のおよび追加の効果を、それぞれモデリングおよび検定した。
【０１２７】
ＫＥＧＧアノテーションを用いた機能分析
細胞経路のデータを、ＫＥＧＧ（２２）、すなわち京都遺伝子ゲノム百科事典（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／）から取り出し、ＮＣＢＩ遺伝子の機能にアノテーションを付すために用いた。それぞれのウイルス−宿主タンパク質相互作用について、特定のＫＥＧＧ経路の強化を、フィッシャーの正確検定を用いて検定し（ｐ値＜５×１０−２）、その後、偽発見率を制御するためにＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの多重検定補正（２３）を行った。
【０１２８】
細胞接着アッセイ
ＰＢＳにおけるフィブロネクチンまたはポリ−Ｌ−リジンの連続希釈（１０から０．０４μｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩、９６ウェルマイクロタイタープレート上に被覆した。非特異的な結合部位を室温でＰＢＳ １％ ＢＳＡで１時間にわたり飽和させた。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞をｐＣｉｎｅｏ３ｘＦｌａｇ ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａ（ＪｅｔＰｅｉ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）でトランスフェクトし、２日後にＰＢＳ中の２ｍＭのＥＤＴＡで回収し、０．１％ＢＳＡを含む無血清培地内に細胞１．１０５個／ウェルで広げることを３回行い、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。非接着細胞を洗浄して除去し、接着細胞を３．７％のパラホルムアルデヒドで固定した。細胞を２０％メタノール内の０．５％クリスタルバイオレットを用いて室温で２０分間にわたり染色し、Ｈ２Ｏ内で５回洗浄した。染色をｐＨ４．５の５０ｍＭのクエン酸ナトリウム中の５０％エタノールで抽出し、吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（ＭＲＸマイクロプレートリーダー、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で５９０ｎｍで読み取った。値は１０μｇ／ｍｌでの１００％の接着に対して標準化した。接着のパーセンテージを、それぞれのマトリクス濃度でそれぞれの細胞型について決定した。最大接着の５０％（ＦＡ５０）を曲線から計算した（出典Ｍｉａｏら（２４））。
【０１２９】
材料および方法において引用される参考文献：
【０１３０】
【表１０】
【０１３１】
結果
ＨＣＶ−ヒトインタラクトームマップの構築
ＨＣＶタンパク質と細胞タンパク質との間の包括的なインタラクトームマップを、Ｙ２Ｈスクリーンにより作成した。完全長ＨＣＶ成熟タンパク質または不連続のドメインをコードする２７個の構築物を、組換えに基づいたクローニング系を用いてクローニングした（１０）（図６）。４個の独立したスクリーンをそれぞれのＨＣＶベイトタンパク質で実施し、２つの異なるヒトｃＤＮＡライブラリーを探査した（補足的な方法）。２７８個のヒトタンパク質を伴う、３１４個のＨＣＶ−ヒトＰＰＩを同定した（図１Ｂ、表Ｓ１におけるＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセット）。ＨＣＶタンパク質とヒトタンパク質との間のペアワイズ相互作用もまた、自動テキストマイニングにより文献から抽出し、専門家のキュレーションによって確認した（補足的な方法、図６におけるＩＭＡＰ ＬＣＩデータセット）。１３５個のＰＰＩをＰｕｂｍｅｄから抽出し、８９個をＢＩＮＤデータベースから抽出した（１１）（図１Ｂ）。得られるＨＣＶ−ヒト相互作用はこのように、１１個のＨＣＶタンパク質および４２１個の個別のヒトタンパク質を伴う、６５％の新たな相互作用を有する４８１個のＰＰＩからなる（図１Ｂ）。ＩＭＡＰ Ｙ２ＨデータベースとＩＭＡＰ ＬＣＩデータベースとの間の冗長性の低さは、Ｙ２Ｈ系の偽陰性率の高さを強調するものであり、これは最近の研究と一致している（１２、１３）。２つの検証方法を用いて、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットの信頼性を評価した。３分の２のデータセットをＹ２Ｈペアワイズマトリクスによって有効とした。残りの相互作用から、２５％をランダムに選択し、８５％を超える検証率をもたらすコアフィニティー精製によって試験した（図１Ｃおよび表Ｓ１）。このＹ２Ｈデータセットはしたがって、位相的および機能的なレベルで、さらなる分析に対して信頼性が非常に高いものである。ＨＣＶ感染ネットワークの分析（Ｖ−ＨＨＣＶ、図１Ａ）により、ＮＳ３、ＮＳ５Ａ、およびＣＯＲＥが、それぞれ２１４、９６、および７６個の細胞パートナーを有する、ヒトインタラクトームにおいて最も連結されているタンパク質であることが示され、このことは、感染の間のこれらのタンパク質の潜在的な多機能性を強調するものである（表Ｓ１、図４Ｂ）。さらに、４５個の細胞タンパク質が２つ以上のウイルスタンパク質によって標的化され、このことは、それらがウイルスの生物学に必須であることを示唆するものである（７）（表Ｓ２）。
【０１３２】
ヒトＰＰＩネットワーク（Ｈ−Ｈネットワーク、図１Ａ）を、８個のデータベースから再構築した（１４）（補足的な方法）。このネットワークは、９５２０個の異なるタンパク質の間の４４２２３個の冗長でないＰＰＩからなる（図２Ａ）。興味深いことに、３０％のヒトタンパク質のみがこのデータセットに存在する一方で、ＨＣＶにより標的化されたヒトタンパク質（ＨＨＣＶ）がこのＨ−Ｈネットワークにおいて明らかに過剰に表されている（ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセット：７６％、およびＩＭＡＰ ＬＣＩデータセット：９２％、フィッシャーの正確検定、ｐ値＜２．２×１０−１６）。このことは、ＨＣＶが、タンパク質−タンパク質相互作用に関与することが既に知られている宿主タンパク質を選択的に標的化することを示唆するものである（１２、１５）。ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットでは、ヒトインタラクトームに組み込まれるＨＨＣＶのパーセンテージの高さは、よく研究されているタンパク質および生物学的経路の調査のバイアスにより説明することができる。ＨＨＣＶ−ＨＨＣＶサブネットワークの分析により、ＨＣＶと相互作用する細胞タンパク質が、ランダムなサブネットワークについて期待されたものよりも有意に相互連結されていることが示された（図１Ａ、２Ｂ、補足的な方法）。実際、ヒトインタラクトームに組み込まれる３３８個のＨＨＣＶは、１３１個の連結された成分に分配される（ランダムなサブネットワークにより期待される２７６に対して、ｐ値＜１０−１０、表Ｓ３）。最大のものは、１つのタンパク質のみを含む１２７個の成分とは対照的に、１９６個のＨＨＣＶからなる（ランダムなサブネットワークにより期待される１８に対して、ｐ値＜１０−１０）。３つの残りの連結された成分は２つのタンパク質を含んでいた。２つは、機能的に関連するタンパク質を含んでおり（ＣＬＥＣ４ＭおよびＣＤ２０９は、ウイルスの侵入に関与するレクチンであり（１６）、ＭＶＰおよびＰＡＲＰ４は、ヴォールト複合体に関与する（１７））、１つは、機能的に関連することが知られていないタンパク質を含んでいた（ＫＩＡＡ１５４９およびＣＡＤＰＳ）。
【０１３３】
ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの位相分析
ＨＣＶタンパク質が細胞タンパク質ネットワークといかにして相互作用するかを評価するために、本発明者らは次に、Ｈ−Ｈインタラクトームに組み込まれるＨＨＣＶタンパク質の中心性の測定値に焦点を当てた。局所的な（程度）ならびに全体的な（最短経路および媒介性）の中心性の測定値を計算した。簡潔に述べると、ネットワークにおけるタンパク質の程度（ｋ）は、直接的なパートナーのその数に対応し、したがって、局所的な中心性の測定値である。媒介性（ｂ）は、所与のタンパク質を通過する最短経路（ネットワークにおける２つのタンパク質間の最短距離、ｌ）の数を測定するため、中心性の全体的な測定値である。Ｈ−Ｈネットワークの程度、媒介性、および最短経路の平均はそれぞれ、９．３、１．６×１０−４、および４．０４であり、これは、これまでの報告とよく一致する（１８）（図３Ａ）。バイアスのない分析を提供するために、計算は、ヒトインタラクトームに組み込まれるＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットから得られる２１３個のＨＨＣＶに基づくものであった。ＨＨＣＶの程度の平均は、ヒトインタラクトームの程度の平均よりも有意に高い（１５．６対９．３、Ｕ検定、ｐ値＜１０−３）。程度の確率分布の比較により、ＨＨＣＶが程度の平均を超えて全てのクラスにおいて選択的に表されることが明らかになる（図３Ｂ、左）。このことは、ＨＣＶタンパク質が、高度に連結した細胞タンパク質と相互作用する大きな傾向を有することを示すものである。しかし、程度はタンパク質の局所的な連結性のみを測定するため、ネットワークにおける情報の交換および伝搬を反映し得る全体的な特徴を調べた（１９）。全体的な尺度で、ＨＨＣＶの媒介性の平均は、ヒトインタラクトームの媒介性の平均よりも有意に高かった（３．８×１０−４対１．６×１０−４、Ｕ検定、ｐ値＜１０−３）。程度に関しては、媒介性の確率分布の比較により、全てのクラスにおいてＨＨＣＶが媒介性の平均を超えて過剰であることが示される（図３Ｂ、右）。さらに、Ｈ−Ｈネットワークにおける最短経路の平均と比較して、ＨＨＣＶタンパク質間で見られる最短経路の平均が低いことにより、ＨＨＣＶが位相的に近いことが明らかになる（３．５０対４．０４、Ｕ検定、ｐ値＜１０−５）。ＩＭＡＰ ＬＣＩデータセットから得られるＨＨＣＶの局所的および全体的な中心性の両方は、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈデータセットについてよりも高く、このことは、文献調査のバイアスの問題を強調し、Ｙ２Ｈスクリーニングのバイアスのないアプローチを強固にするものである（表Ｓ３）。中心のＨＨＣＶに対する選択的な付着がＨ−Ｈインタラクトームにおける固有のバイアスによるものではないことを保証するために、本発明者らは、信頼性が非常に高いがあまり包括的ではないヒトインタラクトームで同一の分析を実施した（表Ｓ３、補足的な方法）。この傾向はこのデータセットで維持され、このことは、ＨＨＣＶがヒトインタラクトーム内で局所的および全体的に非常に中心的であり、かつこのネットワークにおいて互いに比較的近くに現れることを裏付けるものであった。ＨＣＶおよびＥＢＶの比較分析では、中心性の測定値をＨＥＢＶについても計算した（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄらからのデータセット（７））。程度、媒介性、および最短経路は、ＨＥＢＶタンパク質と同一の傾向に従い（表Ｓ３および図７）、これまでの報告とよく一致した（７）。これらの結果は、中心的なタンパク質に対する選択的な付着が、文献の分析により最近示唆されたような、ウイルスタンパク質の一般的な特質であることを示す（９）。これらのタンパク質の中心性の高さはこれまでに、細胞に対するそれらの機能的不可欠性と相関することが示されている（２０）。より詳細には、致死タンパク質および疾患に関連するタンパク質は中心的なタンパク質において富んでいることが明らかになった（１９、２１〜２３）。
【０１３４】
程度または媒介性のいずれがウイルスタンパク質と細胞タンパク質との間の相互作用の確率に最も影響するかを決定するために、本発明者らは一般化された線形モデルを用いて両方の測定値の分離したおよび追加的な効果を検定した（補足的な方法）。この分析により、媒介性がウイルスタンパク質とヒトタンパク質との間の相互作用の確率をより良好に説明することが明らかになった（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜１０−３）。図３Ｃは、低い程度値で媒介性のばらつきが大きいことにより説明される、ｋとｂの中心性の測定値の間の、部分的な相関関係を示す（Ｒ２＝５６％、ｐ値＜１０−１６）。本発明者らはしたがって、低い程度で観察されたこの大きなばらつきが媒介性の優位な効果を説明し得るかどうかを求めた。この目的のために、データベースを、ヒトインタラクトームの程度の平均に従って、低い程度（ＬＤ）および高い程度（ＨＤ）のタンパク質クラスに分けた。ＬＤクラスに含まれる細胞タンパク質では、ＨＣＶは、それらの程度の特性に関わらず、媒介性が高いタンパク質と選択的に相互作用する（図３Ｄ）。ＨＤクラスにおいては、ＨＣＶタンパク質との相互作用は、細胞タンパク質の媒介性および程度の両方に依存する。酵母における最近の研究に基づいて（２４）、程度が低く媒介性が高いＨＨＣＶタンパク質が細胞モジュール間のコネクタまたは障害として作用し得、したがって感染に必須であり得ることが推定され得る。
【０１３５】
ＨＣＶ−ヒト相互作用ネットワークの機能的分析
ＨＣＶにより標的化される生物学的機能をより良く理解するために、本発明者らは次に、所与のウイルスタンパク質の全ての相互作用子について特定の経路の強化を検定した。これは、ＨＨＣＶタンパク質をＫＥＧＧ機能アノテーション経路に関して分析することにより行った（表Ｓ４、補足的な方法）。機能はいまだ全てのタンパク質によるものではないため、このアプローチは全体としてはバイアスがないが、それは依然として、システムレベルのデータセットに従来の生物学を組み込む有効な手段である。この分析により、ＨＣＶの臨床的症候群に関連する３つの経路についての強化が示され（インスリン、ＴＧＦβ、およびＪａｋ／ＳＴＡＴ経路）、ＨＣＶにより影響される新規な経路として接着斑が同定された。
【０１３６】
ＨＣＶによる慢性的な感染は、脂肪症の発症を伴う代謝障害に対するリスクの増大に関連する。インスリン耐性はこのプロセスの共通の特徴である。これはまた、肝線維症の原因ともなり、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）抗ウイルス療法に対する応答不良の予測因子である（２５、２６）。逆に、ＩＦＮ−αは線維症の進行を予防し得る（２７）。ＴＧＦβは、肝臓における細胞の成長および分化の維持において極めて重要な役割を有する。これは、感染の間に産生が増強されることが多い、強力な線維形成促進性のサイトカインである。低下したＴＧＦβ応答もまた、ＨＣＶ感染の間に観察される（２８）。インスリン、ＴＧＦβ、およびＪａｋ／ＳＴＡＴ経路はこれらの臨床的特徴に関与すると考えられているが（２９）、ＨＣＶ感染の間の、密接に関連するそれらの摂動は、依然としてほとんど説明されていない。本発明者はしたがって、ネットワークアプローチを用いて、ＨＣＶにより標的化され、これらの経路の界面に局在する、細胞タンパク質を同定した。得られる相互作用マップを構築して、ＩＪＴネットワークを形成した（インスリン−Ｊａｋ／ＳＴＡＴ−ＴＧＦβ、図４Ａ）。６６個のＨＨＣＶタンパク質は２つの経路を連結しており、一方、３０個のＨＨＣＶタンパク質は３つの経路を連結している。これらのタンパク質とＨＣＶタンパク質との相互作用はしたがって、隣接する経路に広がり得る機能的な摂動を誘発し得る。これらのタンパク質のうち１つは、インスリン経路とＪａｋ／ＳＴＡＴ経路とを連結するＰＬＳＣＲ１（スクランブラーゼ１）である。原形質膜のリン脂質の再分配に関与することが知られていることで（３０）、このタンパク質はまた、インターフェロンに応じた遺伝子の潜在的なアクチベーターであり、ｓｉＲＮＡでのそのノックダウンは、ウイルスの複製に有利に働く（３１）。興味深いことに、ＰＬＳＣＲ１−／−マウスはまた、インスリン耐性の発現を示す（３２）。インスリンまたはＪａｋ／ＳＴＡＴ経路においてはアノテーションを付されていないが、ＰＬＳＣＲ１はしたがって、これらの経路の機能性にとって必須であることが分かる。ＰＬＳＣＲ１と相互作用することにより、ＣＯＲＥはしたがってＪａｋ／ＳＴＡＴ経路とインスリン経路との両方に干渉し得る。別の例は、３つの経路を連結するためＩＪＴネットワークにおいてより中心的な位置を示す、核因子Ｙｉｎ Ｙａｎｇ １（ＹＹ１）である。ＨＣＶ ＣＯＲＥとＹＹ１との相互作用は、ＮＰＭ１の発現を機能的に軽減することがこれまでに示されている。この所見は、インスリン経路およびＴＧＦβ経路の調節の裏付けとしての、ＰＰＡＲδの発現およびＳＭＡＤの転写活性に推定することができる（３３〜３５）。これらは、ＨＣＶ誘発性の表現型に関与すると考えられる細胞標的のただ２つの例示的な例である。これらの例は、本発明者らを、臨床的症候群に相関する分子メカニズムについてのより良い情報を提供する目的で、Ｃ型肝炎の論理的な還元主義的アプローチに戻すものである。病理学のこの分子アプローチは系（この研究においてはタンパク質）の基礎的な要素に適用可能であるが、慢性的なＨＣＶ感染において観察される臨床的表現型のいくつかは、ＩＪＴネットワークにおいて示されるタンパク質相互作用の統合的な効果の結果であると考えられる。さらに、ネットワークのロバスト性の特性は、異なる摂動に直面してもネットワークの能力が機能的であり続けるようにし得るため、ネットワークの還元主義的アプローチは、系レベルで常に適用可能ではあり得ない。
【０１３７】
ＩＪＴネットワークにおいて明らかになった別の問題は、ＣＯＲＥタンパク質が他のＨＣＶタンパク質よりも比例的に多くの相互作用を媒介するということである（図４Ｂ、４Ｃ）。実際、ＩＪＴネットワークとの選択的な相互作用は、ＣＯＲＥでのみ観察された（５１．３％、表Ｓ５）。結果として、ＣＯＲＥはＩＪＴネットワークにおける相互作用の２７．７％をもたらし、これは有意な増強に対応する（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜１０−４）。より詳細には、このタンパク質は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路およびＴＧＦβ経路（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜０．０５）、ならびにインスリン／Ｊａｋ／ＳＴＡＴ経路とインスリン／ＴＧＦβ経路とを連結するＨＨＣＶ（フィッシャーの正確検定、ｐ値＜０．０５、表Ｓ５）において過剰に表される。したがって、ＣＯＲＥはＩＪＴネットワークの主要な摂動付与物質として現れる。興味深いことに、ＣＯＲＥを発現するトランスジェニックマウスはインスリン耐性を発現する（３６、３７）。提案されたメカニズムは、ＣＯＲＥ誘発性のＳＯＣＳ３がユビキチン化を介してＩＲＳ１およびＩＲＳ２のプロテアーソーム分解を促進するというものであった（３８）。ＳＯＣＳ３はまたＪａｋ／ＳＴＡＴ経路の負の調節因子であるため、このことは、ＩＦＮ−α耐性の発生を説明し得る。明らかに、ＩＪＴネットワークは、ＣＯＲＥの作用がこれまでに考えられていたよりもはるかに複雑であると考えられることを示す。ＩＪＴネットワークはいまだ動的に分析され得ないが、依然として、前記ネットワークは、慢性化に関連する複雑な障害のいくつかを解明する固有の手段を提供するものである。ＩＪＴネットワークがウイルス感染の不存在下で脂肪症および線維形成などの疾患に関与する一連の遺伝子を同定し得ることもまた考慮に値する。
【０１３８】
接着斑は、ＩＭＡＰ Ｙ２Ｈスクリーンにより生じるデータの主要な寄与と共に、ＮＳ３タンパク質およびＮＳ５Ａタンパク質により標的化される新たな機能として過剰に表された（表Ｓ４）。インテグリンに結合した接着斑複合体は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）への細胞の接着を制御し、これらの複合体とアクチン−細胞骨格との会合は、細胞の移動において主要な役割を有する。ＥＣＭに結合すると、αおよびβインテグリンサブユニットの両方は、アクチン−細胞骨格とシグナル伝達経路との間の物理的結合を確立するタンパク質を動員する。脱調節されると、この機能的プロセスは細胞の可動性の摂動、ＥＣＭからの分離、ならびに腫瘍の発生および進行をもたらし得る。図５Ａは、ＨＣＶにより標的化されるタンパク質、主にＮＳ３およびＮＳ５Ａタンパク質を伴うＫＥＧＧの接着斑経路を示す。接着斑の機能性に対するＮＳ３、ＮＳ３／４Ａ、またはＮＳ５Ａの単一の発現の影響を、フィブロネクチンおよびポリ−Ｌ−リジンに対する細胞接着アッセイを用いて評価した。これらのウイルスタンパク質は、ＭＯＣＫまたはＮＳ２を発現する細胞と比較してフィブロネクチンに対する細胞接着を阻害した（図５Ｂ）。一方、インテグリンを組み込まないポリ−Ｌ−リジンに対する接着は影響されなかった（図５Ｃ）。同一の阻害レベルがＮＳ３／４ＡおよびＮＳ３について観察され、このことは、このプロテアーゼの酵素活性が接着斑の摂動に対して主要な効果を有さないことを示唆するものである。癌の発生および進行に加え、ＨＣＶによる接着斑の組み込みは、ウイルスの拡散に対する重要性を有し得る。アクチン−細胞骨格のリモデリングのいくつかのステップへの干渉は、侵入部位に到達するために標的細胞の細胞突起に沿って移動するためにこのプロセスを利用し得るレトロウイルスについて記載されている（３９）。インテグリンへのウイルスエンベロープの結合を伴う関連するプロセスが、ＨＣＶにより利用されてその伝達を促し得ることは、考えられることである。ＨＣＶ感染のネットワークアプローチにおいて、相互作用マップは、ウイルスが複製し宿主の防御から逃れるために潜在的に必要な、全ての連結を同定する。
【０１３９】
＜実施例２＞
胆汁酸（ＢＡ）の血清レベルが高い、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者は通常、抗ウイルス療法に対する応答を有さない。したがって、ＨＣＶのＲＮＡ複製に対するＢＡの役割を評価した。ＢＡ、とりわけケノデオキシコール酸塩およびデオキシコール酸塩は、ＨＣＶのＲＮＡ複製を１０倍以上、上方調節した。遊離しているが抱合していないＢＡのみが活性であり、このことは、それらの効果が核受容体によって媒介されていたことを示唆するものである。ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）のリガンドのみがＨＣＶの複製を刺激し、一方、グッグルステロンによるＦＸＲのサイレンシングおよびＦＸＲの拮抗作用は、ＢＡにより誘発される上方調節を遮断した。さらに、グッグルステロンは単独で、基底レベルのＨＣＶ複製を１０倍阻害した。ＦＸＲリガンドによるＨＣＶ複製の調節は、Ｉ型インターフェロンの存在下または不存在下で同一の割合で生じ、このことは、ウイルス複製のこの制御から独立した作用のメカニズムを示唆するものである。したがって、ＢＡへの曝露は、核受容体ＦＸＲの活性化を伴う新規なメカニズムによりＨＣＶ複製を増大させる。
【０１４０】
これにより、ウイルスがＦＸＲに直接的に干渉してその複製を促し得るという可能性が高まる。ＨＣＶタンパク質の細胞相互作用子のプロテオームワイドなスクリーニングを完了するために、本発明者らは、ＦＸＲに焦点を当てた特異的スクリーニングを実施して、この受容体と任意のウイルスタンパク質との間の全ての潜在的な相互作用を同定した。
【０１４１】
材料
細菌
大腸菌のコンピテント細菌（ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ１０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｆ−ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒａ−ｌｅｕ）、７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ ｒｐｓＬ （ＳｔｒＲ） ｅｎｄＡ１ ｎｕｐＧ）。
【０１４２】
酵母
本発明者らは以下の株を用いた：ＡＨ１０９およびＹ１８７（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） 以下の遺伝子型を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＨ１０９：ＭＡＴａ、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３、１１２、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ、ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３、ＧＡＬ２ＵＡＳ−ＧＡＬ２ＴＡＴＡ−ＡＤＥ２、ｕｒａ３：：ＭＥＬ１ＵＡＳ−ＭＥＬ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ。
Ｙ１８７：ＭＡＴα、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ３−２００、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐ１−９０１、ｌｅｕ２−３、１１２、ｍｅｔ−、ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ、ＭＥＬ１、ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ。
【０１４３】
ヒト細胞
Ｈｅｋ−２９３Ｔ：ラージＴ抗原を発現するヒト胚腎細胞。
【０１４４】
酵母ツーハイブリッドマトリクスを用いたＦＸＲと相互作用するＨＣＶタンパク質の同定
本発明者らの以前の研究により、ＨＣＶの複製がＦＸＲ活性の制御下にあり得ることが示された。ＦＸＲ活性に干渉し得るウイルス成分を同定するために、本発明者らはウイルスタンパク質とＦＸＲとの間の相互作用を探求した。これは、酵母ツーハイブリッド法を用いるペアワイズ相互作用スクリーニングにより行った。全ての１０個のウイルスタンパク質を試験し、データを以下の表にまとめる。
【０１４５】
【表１１】
【０１４６】
プルダウン実験
データは、哺乳動物細胞におけるＧＳＴ−プルダウンによって確認されている。ＧＳＴと融合しているウイルスタンパク質を、３ＸＦｌａｇでタグ付けされたＦＸＲと共に、Ｈｅｋ−２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。４８時間後、細胞を溶解し、グルタチオンセファロースを用いて沈殿を実施し、電気泳動、および抗Ｆｌａｇ（ＦＸＲを明らかにするため）またはペルオキシダーゼに結合した抗ＧＳＴ抗体を用いたウェスタンブロットに供した。ＮＳ３およびＮＳ５ＡとのＦＸＲの共沈殿は、これらのウイルスタンパク質とＦＸＲとの直接的な相互作用を肯定的に確認するものであった。ＦＸＲと全ての他のウイルスタンパク質との共沈殿は、これらのタンパク質がＦＸＲと相互作用しないことを否定的に確認するものであった。
【０１４７】
参考文献
この出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関連する技術分野の状況を記載している。これらの参考文献の開示は本明細書において、参照により本開示に組み込まれる。
【０１４８】
【表１２】
【０１４９】
【表１３】
【０１５０】
【表１４】
【０１５１】
【表１５】
【０１５２】
【表１６】
【０１５３】
【表１７】
【０１５４】
【表１８】
【０１５５】
【表１９】
【０１５６】
【表２０】
【０１５７】
【表２１】
【０１５８】
【表２２】
【０１５９】
【表２３】
【０１６０】
【表２４】
【０１６１】
【表２５】
【０１６２】
【表２６】
【０１６３】
【表２７】
【０１６４】
【表２８】
【０１６５】
【表２９】
【０１６６】
【表３０】
【０１６７】
【表３１】
【０１６８】
【表３２】
【０１６９】
【表３３】
【０１７０】
【表３４】
【０１７１】
【表３５】
【０１７２】
【表３６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）とウイルスＨＣＶタンパク質ＮＳ３またはＮＳ５Ａとの間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップと、
ｂ）前記ウイルスファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）と前記ウイルスタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と、ＡＧＲＮ、ＢＣＡＲ１、ＣＤ６８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＤＸ３Ｙ、ＥＧＦＬ７、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＮ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＸＤ８、ＬＰＸＮ、ＬＲＲＴＭ１、ＬＴＢＰ４、ＭＡＧＥＤ１、ＭＥＧＦ６、ＭＭＲＮ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＡＢＰＮ１、ＰＡＫ４、ＰＬＳＣＲ１、ＲＮＦ３１、ＳＥＴＤ２、ＳＬＣ３１Ａ２、ＶＴＮ、ＶＷＦ、およびＺＮＦ２７１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項３】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ１タンパク質と、ＪＵＮ、ＮＲ４Ａ１、ＰＦＮ１、ＳＥＴＤ２、およびＴＭＳＢ４Ｘからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ１タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ２タンパク質と、ＨＯＸＤ８、ＩＴＧＢ１、ＫＩＡＡ１４１１、ＬＯＣ７３０７６５、ＮＲ４Ａ１、ＰＳＭＡ６、ＳＥＴＤ２、およびＳＭＥＫ２からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項５】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ２タンパク質と、ＡＤＦＰ、ＡＰＯＡ１、Ｃ７、ＦＢＬＮ５、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＲＰＬ１１、ＲＰＮ１、ＳＥＴＤ２、ＳＭＵＲＦ２、およびＴＲＩＭ２７からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項６】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ３タンパク質と、ｓｅｐ−１０、Ａ１ＢＧ、ＡＢＣＣ３、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ２、ＡＥＢＰ１、ＡＨＣＹ、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＮＫＲＤ１２、ＡＮＫＲＤ２８、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＲＦＩＰ２、ＡＲＧ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＮＴ、ＡＲＳ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＺＧＰ１、Ｂ２Ｍ、ＢＣＡＮ、ＢＣＫＤＫ、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＺＲＡＰ１、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ１０ｏｒｆ６、Ｃ１２ｏｒｆ４１、Ｃ１４ｏｒｆ１７３、Ｃ１６ｏｒｆ７、Ｃ１ｏｒｆ１６５、Ｃ１ｏｒｆ９４、Ｃ１Ｓ、Ｃ９ｏｒｆ３０、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＴ、ＣＢＹ１、ＣＣＤＣ２１、ＣＣＤＣ３７、ＣＣＤＣ５２、ＣＣＤＣ６６、ＣＣＤＣ９５、ＣＣＨＣＲ１、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２３、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＮＰＣ１、ＣＥＰ１５２、ＣＥＰ１９２、ＣＥＳ１、ＣＦＰ、ＣＨＰＦ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＲＯ１Ｂ、ＣＯＸ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＸｏｒｆ４５、ＤＥＡＦ１、ＤＥＤＤ２、ＤＥＳ、ＤＬＡＴ、ＤＯＣＫ７、ＤＰＦ１、ＤＰＰ７、ＥＣＨＳ１、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２、ＥＩＦ１、ＥＩＦ４ＥＮＩＦ１、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＦＡＭ６２Ｂ、ＦＡＭ６５Ａ、ＦＡＭ９６Ｂ、ＦＢＦ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ３、ＦＥＳ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＩＧＮＬ１、ＦＬＡＤ１、ＦＬＪ１１２８６、ＦＮ１、ＦＲＭＰＤ４、ＦＲＳ３、ＦＴＨ１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＡ、ＧＢＰ２、ＧＣ、ＧＦＡＰ、ＧＮＢ２、ＧＯＮ４Ｌ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＭＥＲ３、ＨＰ、ＨＴＲＡ１、ＩＦＩ４４、ＩＱＷＤ１、ＩＴＣＨ、ＩＴＧＢ４、ＪＡＧ２、ＪＵＮ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＫＩＡＡ１０１２、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ１７、ＫＩＦ７、ＫＮＧ１、ＫＰＮＡ１、ＫＰＮＢ１、Ｌ３ＭＢＴＬ３、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＣ３、ＬＤＢ１、ＬＯＣ７２８３０２、ＬＲＲＣ７、ＬＲＲＣＣ１、ＬＴＢＰ４、ＬＺＴＳ２、ＭＡＧＥＤ１、ＭＡＰＫ７、ＭＡＲＣＯ、ＭＡＳＰ２、ＭＥＧＦ８、ＭＬＬＴ４、ＭＬＸＩＰ、ＭＯＲＣ４、ＭＯＲＦ４Ｌ１、ＭＰＤＺ、ＭＶＰ、ＭＹＬ６、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＣＡＮ、ＮＤＣ８０、ＮＥＦＬ、ＮＥＦＭ、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＩＤ１、ＮＩＤ２、ＮＯＴＣＨ１、Ｎ−ＰＡＣ、ＮＵＣＢ１、ＮＵＰ１３３、ＮＵＰ６２、ＯＢＳＣＮ、ＯＲＭ１、ＯＴＣ、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ４、ＰＣＹＴ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＧＭ１、ＰＩＣＫ１、ＰＫＮＯＸ１、ＰＬＥＫＨＧ４、ＰＮＰＬＡ８、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＤＩＰ２、ＰＲＧ４、ＰＲＲＣ１、ＰＳＭＡ６、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＥ３、ＰＴＰＲＦ、ＰＴＰＲＮ２、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＩ１４、ＲＡＳＡＬ２、ＲＢＭ４、ＲＣＮ３、ＲＧＮＥＦ、ＲＩＣＳ、ＲＩＮＧ１、ＲＩＮＴ１、ＲＬＦ、ＲＮＦ３１、ＲＯＧＤＩ、ＲＰ１１−１３０Ｎ２４．１、ＲＳＨＬ２、ＲＵＳＣ２、ＳＢＦ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＣＩＳＢＰ２、ＳＥＬＯ、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＥＳＴＤ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＧＣＢ、ＳＩＡＨ１、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＩＴ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＮＸ４、ＳＰＯＣＫ３、ＳＰＯＮ１、ＳＰＰ２、ＳＲＰＸ２、ＳＳＸ２ＩＰ、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＲＡＤ、ＳＶＥＰ１、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＰＯ２、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１５、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＴＢＮ、ＴＢＸＡＳ１、ＴＦ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＡＰ１、ＴＭＥＭ６３Ｂ、ＴＰＳＴ２、ＴＰＴ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＯ、ＴＲＩＰ１１、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＳＨＢＰ１、ＵＸＴ、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＷＤＴＣ１、ＸＡＢ２、ＸＲＮ２、ＹＹ１ＡＰ１、ＺＡＤＨ１、ＺＢＴＢ１、ＺＣＣＨＣ７、ＺＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ４１０、ＺＮＦ４４０、ＺＸＤＣ、およびＺＺＺ３、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ３タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項７】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＥＬＡＣ２、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ３、ＵＢＱＬＮ１、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項８】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＴＦ６、ＫＮＧ１、およびＮＲ４Ａ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項９】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質と、ＡＡＲＳ２、ＡＢＣＣ３、ＡＣＬＹ、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢ、ＡＲＦＩＰ１、ＡＳＸＬ１、ＡＸＩＮ１、Ｃ１０ｏｒｆ３０、Ｃ９ｏｒｆ２３、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＤＰＳ２、ＣＣＤＣ１００、ＣＣＤＣ９０Ａ、ＣＣＴ７、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６３、ＣＥＳ１、ＣＦＨ、ＣＯＬ３Ａ１、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＩＦ３Ｓ２、ＥＴＦＡ、ＦＧＢ、ＦＨＬ２、ＧＬＴＳＣＲ２、、ＧＯＬＧＡ２、ＧＰＳ２、ＨＲＳＰ１２、ＩＧＬＬ１、ＩＴＧＡＬ、ＬＤＨＤ、ＬＩＭＳ２、ＬＯＣ３７４３９５、ＭＡＦ、ＭＢＤ４、ＭＫＲＮ２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＭＯＮ２、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＦＥ２、ＮＵＣＢ１、ＯＳ９、ＰＡＲＶＧ、ＰＭＶＫ、ＰＯＭＰ、ＰＰＰ１Ｒ１３Ｌ、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＲＬＦ、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＲＢＰ１、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＳＭＹＤ３、ＳＯＲＢＳ２、ＳＯＲＢＳ３、ＴＨＢＳ１、ＴＭＦ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＴ、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＢＣ、ＵＳＰ１９、ＶＰＳ５２、ＺＧＰＡＴ、ＺＨ２Ｃ２、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ６４６、ＺＮＨＩＴ１、およびＺＮＨＩＴ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６８、ＣＴＳＦ、ＨＯＸＤ８、ＭＧＣ２７５２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＯＳ９、ＯＴＣ、ＰＫＭ２、ＰＳＭＢ９、ＳＥＴＤ２、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＴＡＧＬＮ、およびＴＵＢＢ２Ｃからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＦＢＬＮ２、ＦＸＹＤ６、ＬＭＮＢ１、ＲＮＵＸＡ、ＳＬＣ３９Ａ８、ＳＬＩＴ２、ＵＢＱＬＮ１、およびＵＢＱＬＮ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）とウイルスＨＣＶタンパク質ＮＳ３またはＮＳ５Ａとの間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップと、
ｂ）前記ウイルスファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）と前記ウイルスタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と、ＡＧＲＮ、ＢＣＡＲ１、ＣＤ６８、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＤＸ３Ｙ、ＥＧＦＬ７、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＮ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＸＤ８、ＬＰＸＮ、ＬＲＲＴＭ１、ＬＴＢＰ４、ＭＡＧＥＤ１、ＭＥＧＦ６、ＭＭＲＮ２、ＮＲ４Ａ１、ＰＡＢＰＮ１、ＰＡＫ４、ＰＬＳＣＲ１、ＲＮＦ３１、ＳＥＴＤ２、ＳＬＣ３１Ａ２、ＶＴＮ、ＶＷＦ、およびＺＮＦ２７１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ＣＯＲＥタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項３】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ１タンパク質と、ＪＵＮ、ＮＲ４Ａ１、ＰＦＮ１、ＳＥＴＤ２、およびＴＭＳＢ４Ｘからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ１タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ Ｅ２タンパク質と、ＨＯＸＤ８、ＩＴＧＢ１、ＫＩＡＡ１４１１、ＬＯＣ７３０７６５、ＮＲ４Ａ１、ＰＳＭＡ６、ＳＥＴＤ２、およびＳＭＥＫ２からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＥ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項５】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ２タンパク質と、ＡＤＦＰ、ＡＰＯＡ１、Ｃ７、ＦＢＬＮ５、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＰＯＵ３Ｆ２、ＲＰＬ１１、ＲＰＮ１、ＳＥＴＤ２、ＳＭＵＲＦ２、およびＴＲＩＭ２７からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ２タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項６】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ３タンパク質と、ｓｅｐ−１０、Ａ１ＢＧ、ＡＢＣＣ３、ＡＣＴＮ１、ＡＣＴＮ２、ＡＥＢＰ１、ＡＨＣＹ、ＡＨＳＧ、ＡＬＢ、ＡＮＫＲＤ１２、ＡＮＫＲＤ２８、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＡ２、ＡＲＦＩＰ２、ＡＲＧ１、ＡＲＨＧＤＩＡ、ＡＲＨＧＥＦ６、ＡＲＮＴ、ＡＲＳ２、ＡＳＸＬ１、ＡＴＰ５Ｈ、ＡＺＧＰ１、Ｂ２Ｍ、ＢＣＡＮ、ＢＣＫＤＫ、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ６、ＢＣＲ、ＢＺＲＡＰ１、Ｃ１０ｏｒｆ１８、Ｃ１０ｏｒｆ６、Ｃ１２ｏｒｆ４１、Ｃ１４ｏｒｆ１７３、Ｃ１６ｏｒｆ７、Ｃ１ｏｒｆ１６５、Ｃ１ｏｒｆ９４、Ｃ１Ｓ、Ｃ９ｏｒｆ３０、ＣＡＬＣＯＣＯ２、ＣＡＴ、ＣＢＹ１、ＣＣＤＣ２１、ＣＣＤＣ３７、ＣＣＤＣ５２、ＣＣＤＣ６６、ＣＣＤＣ９５、ＣＣＨＣＲ１、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＤ５Ｌ、ＣＤＣ２３、ＣＥＬＳＲ２、ＣＥＮＰＣ１、ＣＥＰ１５２、ＣＥＰ１９２、ＣＥＳ１、ＣＦＰ、ＣＨＰＦ、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＲＯ１Ｂ、ＣＯＸ３、ＣＳＮＫ２Ｂ、ＣＴＧＦ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＸｏｒｆ４５、ＤＥＡＦ１、ＤＥＤＤ２、ＤＥＳ、ＤＬＡＴ、ＤＯＣＫ７、ＤＰＦ１、ＤＰＰ７、ＥＣＨＳ１、ＥＥＦ１Ａ１、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＥＭＰ２、ＥＩＦ１、ＥＩＦ４ＥＮＩＦ１、ＦＡＭ１２０Ｂ、ＦＡＭ６２Ｂ、ＦＡＭ６５Ａ、ＦＡＭ９６Ｂ、ＦＢＦ１、ＦＢＬＮ１、ＦＢＬＮ２、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ３、ＦＥＳ、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＩＧＮＬ１、ＦＬＡＤ１、ＦＬＪ１１２８６、ＦＮ１、ＦＲＭＰＤ４、ＦＲＳ３、ＦＴＨ１、ＦＵＣＡ２、ＧＡＡ、ＧＢＰ２、ＧＣ、ＧＦＡＰ、ＧＮＢ２、ＧＯＮ４Ｌ、ＨＩＶＥＰ２、ＨＯＭＥＲ３、ＨＰ、ＨＴＲＡ１、ＩＦＩ４４、ＩＱＷＤ１、ＩＴＣＨ、ＩＴＧＢ４、ＪＡＧ２、ＪＵＮ、ＫＨＤＲＢＳ１、ＫＩＡＡ１０１２、ＫＩＡＡ１５４９、ＫＩＦ１７、ＫＩＦ７、ＫＮＧ１、ＫＰＮＡ１、ＫＰＮＢ１、Ｌ３ＭＢＴＬ３、ＬＡＭＡ５、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＣ３、ＬＤＢ１、ＬＯＣ７２８３０２、ＬＲＲＣ７、ＬＲＲＣＣ１、ＬＴＢＰ４、ＬＺＴＳ２、ＭＡＧＥＤ１、ＭＡＰＫ７、ＭＡＲＣＯ、ＭＡＳＰ２、ＭＥＧＦ８、ＭＬＬＴ４、ＭＬＸＩＰ、ＭＯＲＣ４、ＭＯＲＦ４Ｌ１、ＭＰＤＺ、ＭＶＰ、ＭＹＬ６、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＣＡＮ、ＮＤＣ８０、ＮＥＦＬ、ＮＥＦＭ、ＮＥＬＬ１、ＮＥＬＬ２、ＮＩＤ１、ＮＩＤ２、ＮＯＴＣＨ１、Ｎ−ＰＡＣ、ＮＵＣＢ１、ＮＵＰ１３３、ＮＵＰ６２、ＯＢＳＣＮ、ＯＲＭ１、ＯＴＣ、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ４、ＰＣＹＴ２、ＰＤＥ４ＤＩＰ、ＰＤＬＩＭ５、ＰＧＭ１、ＰＩＣＫ１、ＰＫＮＯＸ１、ＰＬＥＫＨＧ４、ＰＮＰＬＡ８、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＤＩＰ２、ＰＲＧ４、ＰＲＲＣ１、ＰＳＭＡ６、ＰＳＭＢ９、ＰＳＭＥ３、ＰＴＰＲＦ、ＰＴＰＲＮ２、ＲＡＢＥＰ１、ＲＡＩ１４、ＲＡＳＡＬ２、ＲＢＭ４、ＲＣＮ３、ＲＧＮＥＦ、ＲＩＣＳ、ＲＩＮＧ１、ＲＩＮＴ１、ＲＬＦ、ＲＮＦ３１、ＲＯＧＤＩ、ＲＰ１１−１３０Ｎ２４．１、ＲＳＨＬ２、ＲＵＳＣ２、ＳＢＦ１、ＳＤＣＣＡＧ８、ＳＥＣＩＳＢＰ２、ＳＥＬＯ、ＳＥＲＴＡＤ１、ＳＥＳＴＤ１、ＳＦ３Ｂ２、ＳＧＣＢ、ＳＩＡＨ１、ＳＬＩＴ１、ＳＬＩＴ２、ＳＬＩＴ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＵＲＦ２、ＳＮＸ４、ＳＰＯＣＫ３、ＳＰＯＮ１、ＳＰＰ２、ＳＲＰＸ２、ＳＳＸ２ＩＰ、ＳＴＡＢ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＲＡＤ、ＳＶＥＰ１、ＳＹＮＥ１、ＳＹＮＰＯ２、ＴＡＦ１、ＴＡＦ１５、ＴＢＣ１Ｄ２Ｂ、ＴＢＮ、ＴＢＸＡＳ１、ＴＦ、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＨ１Ｌ、ＴＨＡＰ１、ＴＭＥＭ６３Ｂ、ＴＰＳＴ２、ＴＰＴ１、ＴＲＩＭ２３、ＴＲＩＭ２７、ＴＲＩＯ、ＴＲＩＰ１１、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＳＨＢＰ１、ＵＸＴ、ＶＣＡＮ、ＶＩＭ、ＶＷＦ、ＷＤＴＣ１、ＸＡＢ２、ＸＲＮ２、ＹＹ１ＡＰ１、ＺＡＤＨ１、ＺＢＴＢ１、ＺＣＣＨＣ７、ＺＨＸ３、ＺＭＹＭ２、ＺＮＦ２８１、ＺＮＦ４１０、ＺＮＦ４４０、ＺＸＤＣ、およびＺＺＺ３、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ３タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項７】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ａタンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＥＬＡＣ２、ＨＯＸＤ８、ＮＲ４Ａ１、ＴＲＡＦ３ＩＰ３、ＵＢＱＬＮ１、ＡＰＯＡ１、およびＤＮＡＪＢ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項８】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ４Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＴＦ６、ＫＮＧ１、およびＮＲ４Ａ１からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ４Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項９】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質と、ＡＡＲＳ２、ＡＢＣＣ３、ＡＣＬＹ、ＡＣＴＢ、ＡＬＤＯＢ、ＡＰＯＢ、ＡＲＦＩＰ１、ＡＳＸＬ１、ＡＸＩＮ１、Ｃ１０ｏｒｆ３０、Ｃ９ｏｒｆ２３、ＣＡＤＰＳ、ＣＡＤＰＳ２、ＣＣＤＣ１００、ＣＣＤＣ９０Ａ、ＣＣＴ７、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６３、ＣＥＳ１、ＣＦＨ、ＣＯＬ３Ａ１、ＤＤＸ５、ＤＮＡＪＡ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＩＦ３Ｓ２、ＥＴＦＡ、ＦＧＢ、ＦＨＬ２、ＧＬＴＳＣＲ２、、ＧＯＬＧＡ２、ＧＰＳ２、ＨＲＳＰ１２、ＩＧＬＬ１、ＩＴＧＡＬ、ＬＤＨＤ、ＬＩＭＳ２、ＬＯＣ３７４３９５、ＭＡＦ、ＭＢＤ４、ＭＫＲＮ２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＭＯＮ２、ＮＡＰ１Ｌ１、ＮＦＥ２、ＮＵＣＢ１、ＯＳ９、ＰＡＲＶＧ、ＰＭＶＫ、ＰＯＭＰ、ＰＰＰ１Ｒ１３Ｌ、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＲＬＦ、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＲＢＰ１、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＳＭＹＤ３、ＳＯＲＢＳ２、ＳＯＲＢＳ３、ＴＨＢＳ１、ＴＭＦ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＴ、ＴＸＮＤＣ１１、ＵＢＡＳＨ３Ａ、ＵＢＣ、ＵＳＰ１９、ＶＰＳ５２、ＺＧＰＡＴ、ＺＨ２Ｃ２、ＺＮＦ１３５、ＺＮＦ３５０、ＺＮＦ６４６、ＺＮＨＩＴ１、およびＺＮＨＩＴ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ａタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ＮＳ５Ｂタンパク質と、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＣ３、ＣＣＮＤＢＰ１、ＣＥＰ２５０、ＣＥＰ６８、ＣＴＳＦ、ＨＯＸＤ８、ＭＧＣ２７５２、ＭＯＢＫ１Ｂ、ＯＳ９、ＯＴＣ、ＰＫＭ２、ＰＳＭＢ９、ＳＥＴＤ２、ＳＨＡＲＰＩＮ、ＴＡＧＬＮ、およびＴＵＢＢ２Ｃからなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＮＳ５Ｂタンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【請求項１１】
ＨＣＶ感染を治療および／または予防するための化合物をスクリーニングするための方法であって、
ａ）ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と、ＣＲＥＢ３、ＦＢＬＮ２、ＦＸＹＤ６、ＬＭＮＢ１、ＲＮＵＸＡ、ＳＬＣ３９Ａ８、ＳＬＩＴ２、ＵＢＱＬＮ１、およびＵＢＱＬＮ４からなる群から選択されるヒトタンパク質との間の相互作用を阻害する候補化合物の能力を決定するステップ、ならびに
ｂ）前記ウイルスＨＣＶ ｐ７タンパク質と前記ヒトタンパク質との間の前記相互作用を阻害する候補化合物を選択するステップ
を含む方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５１７７７９（Ｐ２０１１−５１７７７９Ａ）
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０４４６８（Ｐ２０１１−５０４４６８）
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４５３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７６９３
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１６日（２００９．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５４５３６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１２７６９３
【国際公開日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【出願人】（５９９１７６５０６）アンセルム（アンスチチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル） (23)
【Ｆターム（参考）】
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