Ｃ型肝炎ウイルス複製系
【課題】ＨＣＶ全ゲノム複製を支持することができ、かつウイルス粒子を産生し得る、改良されたインビトロ細胞培養系を提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞を提供する。本発明はまた、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質の他にも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現されるような細胞も提供する。
【解決手段】本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞を提供する。本発明はまた、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質の他にも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現されるような細胞も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用する文書はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス培養およびタンパク質発現の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）には、効率のよいインビトロ培養系がないので、ウイルスの構造および集合については、ほとんどわかっていない。ＨＣＶの非構造タンパク質の大半を含有するサブゲノムレプリコンは、ヘパトーム細胞株中で複製することが示されており［１（非特許文献１）］、トランスフェクション効率が改善されたさらなるサブゲノムレプリコンも開示されている［２（非特許文献２）、３（特許文献１）］。これらの系はＨＣＶ複製機序に関する詳細な研究を可能にしたが、それらのレプリコンに構造遺伝子が存在しないことは、ビリオンの集合が可能でないことを意味する。
参考文献４（非特許文献３）には、細胞培養中で全長ＨＣＶゲノムを持続性および一過性に複製させるための方法が記載されており、そこでは、変異型の「選択可能な全長」（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ：ｓｆｌ）ゲノムが、（Ｈｕｈ−７細胞株に由来する）２１−５細胞中で安定に複製することができ、そして全てのウイルスタンパク質を発現させることができた。これらの変異を選択可能なサブゲノムレプリコンに導入することにより、ＲＮＡ複製と高いコロニー形成効率（ＥＣＦ）とが可能になったものの、ｓｆｌゲノムの場合、そのＥＣＦは、サブゲノムレプリコンと比較すると３〜４桁低かった。２１−５培養物の上清にはウイルスＲＮＡが見られたが、この作用はサブゲノムレプリコンでも見られたので、この放出はウイルス構造タンパク質の関与によるものではなく、むしろ非特異的機序によるものであったと、著者らは考えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０１／８９３６４号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｏｈｍａｍｍら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１１０−１１３
【非特許文献２】Ｂｌｉｇｈｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１９７２−１９７４
【非特許文献３】Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：４００８−２１
【非特許文献４】Ｋｌｅｉｎら（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：９２５７−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＨＣＶウイルス粒子のインビトロ集合は無細胞系では可能であるが［５］、効率のよい細胞系は２００５年まで報告されなかった［６−８］。参考文献４に記載された２１−５細胞はウイルス粒子を産生しないことがわかったので、ＨＣＶ全ゲノム複製を支持することができ、かつウイルス粒子を産生し得るインビトロ細胞培養系、ならびに参考文献６〜８と比較して、さらなる改良された系は、依然として、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
参考文献４の著者らは、２１−５細胞がウイルス粒子形成を支持できないのは、宿主細胞因子の欠如が理由であるかもしれないことを示唆した。これとは対照的に、本発明者らは、この不首尾は、ＨＣＶ構造エンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現できないことによって、少なくとも部分的には説明され得ると考えている。そこで本発明者らは、この不足を克服するために、これらのタンパク質をトランスに補完することを選択した。その結果得られる細胞は、ＨＣＶ複製をより良く支持することができ、ＨＣＶ粒子をより良く産生し得る。
したがって本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞を提供する。
【０００８】
本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質の他にも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現されるような細胞も提供する。したがってＥ１および／またはＥ２は、ウイルス生活環中にＨＣＶゲノムから発現されるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングから生じるＥ１／Ｅ２とは別個の形態で発現される。２つの異なるタイプのＲＮＡ、すなわちＨＣＶ ＲＮＡゲノムになるタイプと、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質に翻訳されるタイプとが産生される。
【０００９】
本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現し、そして（ｃ）インビトロ培養で増殖し得る細胞も提供する。
【００１０】
本発明は、以下の２つの核酸をトランスに含有する細胞も提供する：（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸。本発明は、以下の２つの核酸をトランスに含有する細胞も提供する：（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸。
【００１１】
本発明の細胞は、ＨＣＶ複製を支持するために培養下で増殖させ得、ＨＣＶビリオンおよびＥ１／Ｅ２複合体をそこから精製し得る。
【００１２】
本発明は、本発明の細胞を調製するための方法であって、（ａ）細胞にＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入する工程；（ｂ）細胞にＣ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を導入する工程を包含する方法も提供する。工程（ａ）と工程（ｂ）とは別個に行ってもよく、または同時に行なってもよい。本発明は、細胞中でＣ型肝炎ウイルスを培養するためのインビトロでの方法であって、上記工程（ａ）および工程（ｂ）、続いて（ｃ）得られた細胞を培養する工程を包含する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を調製するための方法であって、（ａ）本発明の細胞を培養する工程；ならびに（ｂ）培養した細胞からＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を精製する工程を包含する方法も提供する。Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は好ましくは複合体の形態にあり、本発明は、本発明の方法によって得られ得るＥ１／Ｅ２複合体を提供する。
【００１４】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を導入し得る細胞も提供する。同様に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入し得る細胞も提供する。本発明は、ＨＣＶのＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質をコードする配列を含むベクターも提供する。このベクターは、インビトロでの細胞培養においてＨＣＶ複製を支持するという細胞の能力を強化するのに使用される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
細胞であって、
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸、ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を含む、細胞。
（項目２）
前記Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１および／またはＥ２タンパク質に加えて、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現される、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記Ｅ１および／またはＥ２が、ウイルス生活環中にＨＣＶゲノムから発現されるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングから生じるＥ１／Ｅ２とは別個の形態で発現される、項目１または２に記載の細胞。
（項目４）
前記細胞が、
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み、
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現し、そして
（ｃ）インビトロ培養で増殖し得る、
項目１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５）
前記細胞が、以下の２つの核酸：
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム；ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸
をトランスに含有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６）
前記細胞が、以下の２つの核酸：
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸
をトランスに含有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７）
項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞を調製するための方法であって、
（ａ）細胞にＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入する工程；
（ｂ）該細胞にＣ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を導入する工程
を包含する、方法。
（項目８）
工程（ａ）と工程（ｂ）とが別個に行なわれる、項目７に記載の方法。
（項目９）
工程（ａ）と工程（ｂ）とが同時に行なわれる、項目７に記載の方法。
（項目１０）
細胞中でＣ型肝炎ウイルスを培養するためのインビトロ方法であって、項目７〜９のいずれか一項に従って細胞を調製する工程、次に（ｃ）得られた細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目１１）
Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を調製するための方法であって、
（ａ）項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；ならびに
（ｂ）培養した細胞からＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を精製する工程
を包含する、方法。
（項目１２）
前記Ｅ１タンパク質および前記Ｅ２タンパク質がＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質のうちの１以上と共に精製される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｅ１タンパク質および前記Ｅ２タンパク質が複合体の形態にある、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法によって得られ得る、Ｅ１／Ｅ２複合体。
（項目１５）
前記複合体がビリオン様粒子である、項目１４に記載のＥ１／Ｅ２複合体。
（項目１６）
前記ビリオン様粒子がＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質および／またはＲＮＡのうちの１以上を含む、項目１５に記載のＥ１／Ｅ２複合体。
（項目１７）
Ｃ型肝炎ウイルスを処置または予防するためのワクチンであって、項目１３〜１６のいずれか一項のＥ１／Ｅ２複合体を含むワクチン。
（項目１８）
Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を導入し得る、細胞。
（項目１９）
Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入し得る、細胞。
【００１５】
（細胞）
本発明の細胞は、ＨＣＶ生活環およびその複製を支持するためにＨＣＶゲノムを発現させることができ、ＨＣＶ生活環中に産生されるＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質とは別個に、Ｅ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質を発現させ得る。したがって、ウイルスＲＮＡゲノムから翻訳されたウイルスポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングによるＥ１およびＥ２の産生が、別個の非ＨＣＶ ＲＮＡから（例えば細胞性ｍＲＮＡから）翻訳されるタンパク質によって補完される。
【００１６】
ＨＣＶのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質は本来、グリコシル化されるので、本発明では一般に真核細胞を使用する。哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む霊長類細胞を使用することが好ましい。ＨＣＶは本来、肝臓細胞に感染するので、肝臓由来の細胞を使用すると好都合である。
【００１７】
代表的には、本発明で使用される細胞は細胞株、好ましくはパッケージング細胞株である。本発明での使用に好ましい細胞株は肝細胞癌、すなわち、「Ｈｕｈ７」として知られているヒトヘパトーム細胞株に由来する［９］。最も好ましい細胞株は、「２１−５」として知られている、全長ＨＣＶ複製を支持する、Ｈｕｈ７由来の細胞株である。他の好ましい細胞株は、細胞培養下での完全な複製を支持し得るＨｕｈ７の亜系統である、Ｈｕｈ−７．５、Ｈｕｈ−７．５．１［８］およびＨｕｈ−７．８である。Ｈｕｈ７細胞（およびそれらの誘導物）の継代培養によって誘導される細胞、ならびにＨｕｈ７細胞をα−インターフェロンおよび／またはγ−インターフェロンで処理することによって誘導される細胞も、使用され得る。参考文献［１０］に開示されているように、ＨＣＶを許容する細胞株は、（ａ）ＨＣＶに感染させた細胞を培養すること；（ｂ）その細胞をＨＣＶから治癒させること；および（ｃ）その治癒細胞の亜系統であってＨＣＶ複製を許容するものを同定することを含むプロセスによって調製され得る。
【００１８】
他の樹立ヒトヘパトーム細胞株および樹立肝芽腫細胞株としては、ＨｕＨ−６ ｃｌ−５、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ｈｕＨ−１、およびｈｕＨ−４が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞を、完全ＤＭＥＭ（例えば、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変最小必須培地）などの培地で単層として増殖させ得る。
【００１９】
特定のウイルス株には特定の細胞タイプを使用することが好ましい場合があり、逆もまた同様である。
【００２０】
本発明の細胞は、ＨＣＶゲノムからポリタンパク質を発現させると共に、補完的なＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質も発現させる。その結果、本細胞は、ビリオンおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むＨＣＶ粒子を発現させるためのタンパク質構築ブロックを含む。したがってビリオンおよびＶＬＰを本発明の細胞から調製し得る。これらはＲＮＡゲノムを含んでも含まなくてもよい。本細胞はまた、Ｅ１およびＥ２の複合体を発現させ得る。本細胞はＥ１、Ｅ２、ＮＳ３およびＮＳ５ａの複合体も発現させ得る。
【００２１】
以下でより詳細に述べるように、本発明の細胞はＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。ＨＣＶゲノムはウイルス感染によって細胞内に導入され得るか、またはウイルス感染（実際の感染または人工的感染）後もしくは当該ゲノムのＤＮＡコピーからの転写後に、インサイチュで産生され得る。ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡを細胞内に導入するための方法は、当技術分野では慣用されている。インビトロで転写されたＨＣＶゲノムは、参考文献４に開示されているように、エレクトロポレーションを使ってＨｕｈ７細胞内に導入され得る（１μｇの精製インビトロ転写物でエレクトロポレーションされた４×１０６個のＨｕｈ−７細胞または６０μｇのＨＣＶ ＲＮＡをエレクトロポレーションされた２．４×１０７個のＨｕｈ−７細胞）。
【００２２】
本発明の細胞は、Ｅ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質をコードする核酸も含む。そのような核酸を導入するための方法は、当技術分野では慣用されている。
【００２３】
ＨＣＶゲノムおよびＥ１／Ｅ２核酸を両方とも発現させた場合、免疫蛍光染色を用いると、ドット状粒子を見ることができる。所望であれば、細胞を（例えばエキソソームの放出を引き起こすために）適切な放出剤で処理することなどにより、細胞からのこれらの粒子の放出を促進し得る。そのような薬剤としては、アルコール、ストレス状態などが挙げられる。非共有結合的Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体は小胞体中に検出されており、この細胞区画から回収され得る。
【００２４】
（Ｃ型肝炎ウイルスゲノム）
本発明の細胞はＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。したがって本細胞は、＋鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを含み得るか、または転写されて直接的または間接的に＋鎖ＲＮＡゲノムを与え得る核酸を含み得る。例えば（本来のＨＣＶ生活環はＤＮＡ段階を含まないものの）ゲノムのＤＮＡコピーが正しい向きに転写されると、ＨＣＶゲノムとして作用し得る（すなわち、ＨＣＶポリタンパク質の発現を指示することができ、そしてそのポリタンパク質は、正常なＨＣＶ生活環に見られるようにプロセシングされる）ＲＮＡが生じる。
【００２５】
ＨＣＶゲノムＲＮＡは、本来、５’キャップ（ｍ７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ａ）を含み、ポリＡテールを含まず、５’非コード領域および３’非コード領域（ＮＣＲ）の両方を伴っている。本発明で使用されるＨＣＶゲノムには、代表的には、これらのエレメントが存在するが、ＨＣＶゲノムおよび／または同ゲノムをコードする核酸は、天然ゲノムには見られない１以上のエレメントを含んでもよい。例えば、インビトロ複製系で使用するＨＣＶゲノムの場合、以下のエレメントのうちの１以上を含むことが普通である：例えばポリタンパク質の上流、ゲノムの５’末端近くに、選択マーカー（ネオマイシン耐性マーカーなど）をコードする配列；たとえ他の上流コード配列が存在してもポリタンパク質の翻訳が可能であるように、例えばポリタンパク質コード配列の上流に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（ＥＭＣＶに由来するものなど）。ゲノムの５’末端に５’Ｔ７プロモーターを持つ構築物が記述されているが［１０１］、これは好ましくない。
【００２６】
ＨＣＶゲノムは、どのタイプ（例えば１、２、３、４、５、６）でも、どのサブタイプ（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４ａ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、５ａ、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ）でもよい。この命名法はＮＩＡＩＤの「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」［１１］に説明されているように現在の標準であり、この命名法では、以前の遺伝子型７〜９が、参考文献１２に基づいてタイプ６のサブタイプとして再分類されている。したがって、この新しい分類には、以前の分類Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、４α、４β、７ａ、７ｂ、７ｃ／ＮＧＩＩ／ＶＩＩ、７ｄ、ＮＧＩ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ／ＴＤ３および１１ａが含まれる。本発明での使用に適したＨＣＶ株の１つは、遺伝子型２ａのＪＦＨ１株である［６］。ＨＣＶゲノムは野生型ゲノムに対して１以上の変異（挿入、欠失および／または置換を含む）を含んでもよく、あるいは１より多くの野生型ゲノムのハイブリッド、例えばサブタイプ２ａの株（例えばＪ６）とサブタイプ１ａの株（例えばＨ７７）とのキメラなどであってもよい［７］。ウイルスＲＮＡレプリカーゼはプルーフリーディング活性を持たないので、ゲノムにおける変異は頻繁に起こり、その結果生じる変異型ゲノム（または「疑似種」）を容易に取得して解析し得る。参考文献４には、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、Ｋ１８４６ＴおよびＳ２１９７Ｐを含め、細胞適応のための変異体が記載されている。参考文献３には、トランスフェクション効率および二次継代（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）に耐える能力を増加させる変異（例えばＲ１１６４Ｇ、Ｓ１１７２Ｃ、Ｓ１１７２Ｐ、Ａ１１７４Ｓ、Ｓ１１７９Ｉ）を含むＨＣＶ改変体が記載されている。他の既知変異としては、Ｌ１７５７Ｉ、Ｎ２１０９Ｄ、Ｐ２３２７ＳおよびＫ２３５０Ｅが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特定の宿主細胞には特定の変異を使用することが好ましい場合があり、逆もまた同様である。ＨＣＶのポリタンパク質はＣ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを全て含むことが好ましいものの、より大きな欠失および挿入も可能である（例えば、非構造タンパク質などの成熟コード領域の欠失、または非ＨＣＶ配列の挿入）。サブゲノムＨＣＶ（すなわち、全ゲノムより小さいものを含むもの；代表的には、非構造タンパク質を含むが、構造タンパク質を含まないもの；例えば全長Ｃ、全長Ｅ１、全長Ｅ２を欠いているもの）でも本発明を使用し得るが、本発明の重要な利点は、それが全長ゲノムの複製を可能にするということである。
【００２７】
本発明に従って使用されるＨＣＶゲノムには、これらおよび他の変異が存在し得るが、ＨＣＶポリタンパク質（このポリタンパク質を発現されたＨＣＶゲノムを複製し得るもの）の発現を指示するというゲノムの能力がこれらの変異によって失われることは、一般にない。
【００２８】
ＨＣＶ ＲＮＡまたはＨＣＶ ＲＮＡをコードする核酸は、細胞内に導入され得るか、または既に細胞の一部であり得る。例えば、２１−５細胞株［４］は既にＨＣＶに感染している。
【００２９】
細胞がＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む場合、これはＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとることができ、染色体核酸または染色体外（例えばエピソーム）核酸であり得る。ＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡプラスミドは便利に使用し得る。
【００３０】
ＨＣＶゲノムとＥ１／Ｅ２タンパク質との両方をコードするＤＮＡを使用し得る。このＤＮＡは通常は２つの別個の転写物：（ｉ）ＨＣＶゲノム（または場合によりアンチゲノム）、および（ｉｉ）Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを有するが、（ｉ）ＨＣＶゲノム（またはアンチゲノム）およびＥ１／Ｅ２のコード配列を含み、下流配列の翻訳を制御するためにＩＲＥＳを伴う、単一の転写物を持つことも可能である。
【００３１】
ＨＣＶゲノムは代表的には、レプリコン（すなわち自分自身のコピーの生成を指示し得す核酸）の形態で含まれる。ゲノムレプリコン系またはサブゲノムレプリコン系を用いる細胞ベースのＨＣＶ複製系は周知である。レプリコンはウイルスＲＮＡのセンス鎖に基づくが、本発明では、センス鎖に変換されてレプリコンを与えることができる相補的配列を利用することもできる。レプリコンは、例えばレポーター遺伝子などの非ＨＣＶ遺伝子も含有し得る。
【００３２】
（Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸）
本発明の細胞は、Ｅ１およびＥ２の一方または好ましくは両方をコードする核酸を含む。この核酸はＨＣＶゲノムとは別個であり、ＨＣＶゲノムをコードするどの核酸とも別個である。しかし、補完的Ｅ１およびＥ２の配列は、好ましくは、ＨＣＶポリタンパク質中に見出されるＥ１配列およびＥ２配列と同じである。
【００３３】
Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸はＤＮＡであることも、ＲＮＡであることもできる。ＤＮＡベクターは好ましい。核酸は染色体核酸または染色体外（例えばエピソーム）核酸であり得る。
【００３４】
細胞にＥ１およびＥ２を導入するための好ましい核酸ベクターはレトロウイルスベクターであり、それは組込み型ベクターであってもよい。したがって、Ｅ１配列およびＥ２配列をレトロウイルスのＲＮＡゲノムにインサートとして導入し得る。逆転写（そして該当する場合は組込み）後は、Ｅ１配列およびＥ２配列が細胞内でＤＮＡの形態をとる。他の適切なベクターとしてはＤＮＡプラスミドが挙げられる。
【００３５】
Ｅ１およびＥ２を両方とも発現させる場合、これらは同じ核酸から発現させてもよいし、異なる核酸から発現させてもよい。例えば、両方のタンパク質をコードする１つのプラスミド（例えば２つの異なる遺伝子、またはＩＲＥＳを有する１つの遺伝子）を使用してもよく、または２つのプラスミドを使用してもよい。さらにまた、これらのタンパク質は互いに別個に翻訳されてもよいし、ＨＣＶポリタンパク質と同様にしてタンパク質分解的に切断されて分離したＥ１およびＥ２を与える単一のポリペプチドとして翻訳されてもよい。
【００３６】
Ｅ１／Ｅ２発現の制御は一般にプロモーターの制御を受ける。本発明では、構成的プロモーターを使用することも、制御可能なプロモーターを使用することもできる。好ましいプロモーターは、糖分解酵素に由来するもの、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。ヒトプロモーターが好ましく、ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２は、好ましくは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）の制御を受ける。
【００３７】
本核酸は、Ｅ１およびＥ２を発現することに加え、ｐ７を発現してもよい。別法として、Ｅ１またはＥ２の一方のみと同じ核酸からｐ７を発現させてもよく、あるいはＥ１およびＥ２とは異なる核酸からｐ７を発現させてもよい。例えば、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７にそれぞれ１つのプラスミドを使用してもよい。
【００３８】
（Ｅ１／Ｅ２組成物）
Ｅ１およびＥ２タンパク質は、本発明に従って発現させた場合、一緒に局在することが見出された。そのため、これらを細胞から共に精製し得る。次に、Ｅ１／Ｅ２複合体（例えばヘテロ二量体）は、ＨＣＶ感染を処置および／または予防するためのワクチンなどといった免疫原性組成物において例えば活性成分として使用され得る。
【００３９】
本発明の細胞によって産生されるビリオンおよび／またはＶＬＰも、免疫原性組成物に活性成分として使用され得る。これらのビリオン／ＶＬＰにＲＮＡが含まれる場合、ＲＮＡは好ましくはサブゲノムである。
【００４０】
本発明の組成物は、薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物であり得る。そのような組成物は、Ｅ１／Ｅ２複合体を薬学的に許容され得るキャリアと混合する工程を含むプロセスを使って調製され得る。
【００４１】
代表的な「薬学的に許容され得るキャリア」としては、当該組成物を受容する個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導することのない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きくてゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム））などである。そのようなキャリアは当業者には周知である。ワクチンは水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有することができる。さらに、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ショ糖などの補助物質も存在し得る。無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水は代表的キャリアである（例えば注射用水に基づくもの）。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な考察は参考文献１３において入手可能である。
【００４２】
本発明の組成物は、代表的には、乾燥形態（例えば凍結乾燥形態）よりむしろ、水性形態（例えば溶液または懸濁液）である。水性組成物は、他の材料を凍結乾燥形態から再構成するのにも適している。本発明の組成物がそのような即時再構成に使用されるべきである場合、本発明はキットも提供する。このキットは、二本のバイアルを含んでもよく、または１本の充填済み注射器と１本のバイアルとを含んでもよい（注射に先だって、注射器の水性内容物がバイアルの乾燥内容物を再活性化するために使用される）。
【００４３】
本発明の組成物はバイアルに入れて提供されてもよく、または充填済み注射器に入れて提供されてもよい。注射器は針を付けて供給されてもよく、または針を付けずに供給されてもよい。組成物は１回用量型または複数回用量型に包装され得る。注射器は一般に１回用量の組成物を含む。これに対して、バイアルは１回用量または複数回用量を含むことができる。したがって、複数回量型には、バイアルの方が充填済み注射器より好ましい。
【００４４】
有効投薬体積は慣用的に確立され得るが、本組成物の代表的なヒト用量は、例えば筋肉内注射の場合、約０．５ｍｌの体積を持つ。
【００４５】
組成物のｐＨは、好ましくは６と８との間、より好ましくは６．５と７．５との間（例えば約７）である。Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を使用することにより、安定したｐＨを維持することができる。本発明の組成物は一般に緩衝液を含む。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合は、例えば１〜１０ｍＭ（好ましくは約５ｍＭ）のヒスチジン緩衝液［１４］を使用することが好ましい。本組成物は無菌である、および／または発熱物質を含まないことができる。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性であり得る。組成物は、好ましくは、ＨＣＶ ＲＮＡおよび／またはＨＣＶビリオンを含まない。
【００４６】
本発明の組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防用（すなわち感染症を防止するため）であっても、治療用（すなわち感染症を処置するため）であってもよいが、代表的には予防用である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は免疫有効量の抗原を含み、必要に応じて他の任意の成分を含む。「免疫有効量」とは、その量を、単回投与で、または一連の投与の一部として、個体に投与することが、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が持つ抗体合成能力、所望する保護の程度、ワクチンの処方、処置医による医学的状況の評価、および他の関連要因に依存して変動する。この量は、慣用的な試行によって決定することができる比較的広い範囲に収まると予想される。
【００４７】
組成物は注射剤として、液状の溶液または懸濁液の形で調製され得る。組成物は、例えば微粉末を用いた吸入器またはスプレーとして、肺投与用に調製され得る。組成物は坐剤または膣坐薬として調製され得る。組成物は、鼻、耳または眼への投与のために、例えばスプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉末剤として調製され得る［例えば参考文献１５および１６］。筋肉内投与用の注射剤が代表的である。
【００４８】
本発明の組成物は、複数回用量形式で包装される場合は特に、抗微生物剤を含み得る。
チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗微生物剤はワクチンには一般に見出されるが、水銀を含まない保存剤を使用するか、保存剤を全く使用しないことが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物は界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。界面活性剤は一般に低レベルで、例えば＜０．０１％で、存在する。
【００５０】
本発明の組成物は、張性を得るためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含むことができる。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が代表的である。塩化ナトリウムの濃度は好ましくは約９ｍｇ／ｍｌである。
【００５１】
本発明の組成物は一般に、他の免疫調節剤と一緒に投与される。特に、組成物は通常、１以上のアジュバントを含む。そして本発明は、本発明の組成物を調製するためのプロセスであって、本発明の小胞をアジュバントと、例えば薬学的に許容され得るキャリア中で混合する工程を包含するプロセスを提供する。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：
（Ａ．無機物含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が含まれる。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩［例えば参考文献１７の第８章および第９章を参照されたい］、または異なる無機化合物の混合物を包含し、化合物は任意の適切な形態（例えばゲル、結晶、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子として処方され得る［１８］。
【００５２】
代表的なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇ Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間の非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムによる吸着（例えば１用量あたり１コンジュゲートあたり５０〜１００μｇ Ａｌ３＋）を使用し得る。リン酸アルミニウムを使用し、抗原をアジュバントに吸着させないことを望む場合は、（例えばリン酸緩衝液を使用することにより）溶解した状態の遊離リン酸イオンを含めることが好ましい。
【００５３】
アルミニウムアジュバントの代表的な用量は約３．３ｍｇ／ｍｌ（Ａｌ３＋濃度として表現）である。
【００５４】
（Ｂ．油エマルジョン）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９［参考文献１７の第１０章；参考文献１９も参照されたい］（マイクロフルイダイザーを使ってサブミクロン粒子へと処方された５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。
【００５５】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１７の第２２章］）
本発明ではサポニン処方物もアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、幹、根、そしてさらには花にも見出される異種のステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体群である。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から得られるサポニンはアジュバントとして広く研究されてきた。Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ）由来のサポニンも市販されている。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製処方物の他、ＩＳＣＯＭなどの脂質処方物も挙げられる。ＱＳ２１はＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
【００５６】
サポニン組成物はＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使って精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含め、これらの技法を使った特定の精製画分が同定されている。サポニンは好ましくはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は参考文献２０に開示されている。サポニン処方物はコレステロールなどのステロールも含み得る［２１］。
【００５７】
サポニン類とコレステロール類との組み合わせを使って、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成させることができる［参考文献１７の第２３章］。ＩＳＣＯＭは代表的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。既知のサポニンはどれでもＩＳＣＯＭに使用し得る。ＩＳＣＯＭは、好ましくは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１以上を含む。ＩＳＣＯＭは参考文献２１〜２３にさらに詳しく記述されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは余分な界面活性剤を欠いてもよい［２４］。
【００５８】
サポニンベースのアジュバントの開発に関する総説は、参考文献２５および２６に見出すことができる。
【００５９】
（Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子）
本発明ではビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もアジュバントとして使用され得る。これらの構造物は一般に、ウイルスに由来する１以上のタンパク質を含有し、このタンパク質は、必要に応じて、リン脂質と組み合わされるか、またはリン脂質を使って処方される。これらは一般に非病原性、非複製性であり、一般に天然ウイルスゲノムを一切含有しない。ウイルスタンパク質は組換え生産されるか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロゾームまたはＶＬＰでの使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質（コアタンパク質またはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質、麻疹ウイルスに由来するタンパク質、シンドビスウイルスに由来するタンパク質、ロタウイルスに由来するタンパク質、口蹄疫ウイルスに由来するタンパク質、レトロウイルスに由来するタンパク質、ノーウォークウイルスに由来するタンパク質、ヒトパピローマウイルスに由来するタンパク質、ＨＩＶに由来するタンパク質、ＲＮＡファージに由来するタンパク質、Ｑβファージに由来するタンパク質（コートタンパク質など）、ＧＡファージに由来するタンパク質、ｆｒファージに由来するタンパク質、ＡＰ２０５ファージに由来するタンパク質、およびＴｙに由来するタンパク質（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）が挙げられる。ＶＬＰは参考文献２７〜３２でさらに詳しく論じられている。ビロゾームは例えば参考文献３３でさらに詳しく論じられている。
【００６０】
（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明での使用に適したアジュバントとしては、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体などといった細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられる。
【００６１】
ＬＰＳの無毒性誘導体としてはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４，５または６アシル化鎖を持つ３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい「小粒子」状の３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡが参考文献３４に開示されている。３ｄＭＰＬのそのような「小粒子」は、０．２２μｍ膜による滅菌濾過が可能なほど小さい［３４］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体、例えばＲＣ−５２９などの、モノホスホリルリピドＡ模倣物が挙げられる［３５，３６］。
【００６２】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は例えば参考文献３７および３８に記載されている。
【００６３】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。
【００６４】
これらのＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含むことができ、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献３９、４０および４１には、例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換など、可能な類似体置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用は、参考文献４２〜４７で、さらに論じられている。
【００６５】
モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る［４８］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的（例えばＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）であってもよく、またはＢ細胞応答の誘導に特異的（例えばＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）であってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは参考文献４９〜５１で論じられている。ＣｐＧは、好ましくは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００６６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５’末端を受容体認識に利用することができるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成させてもよい。例えば参考文献４８および５２〜５４を参照されたい。
【００６７】
本発明では細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体をアジュバントとして使用し得る。このタンパク質は、好ましくは、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は参考文献５５に、また非経口アジュバントとしての使用は参考文献５６に記載されている。この毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットを両方とも含むホロ毒素の形態にある。Ａサブユニットは、好ましくは、無毒化変異を含有し、Ｂサブユニットは、好ましくは、変異していない。アジュバントは、好ましくは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などの無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献５７〜６４に見出すことができる。アミノ酸置換に関する参照番号は、好ましくは、参考文献６５に記載されているＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列に基づき、この参考文献は、参照によりその全体が、特に本明細書に援用される。
【００６８】
（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質としては、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［６６］など）［６７］、インターフェロン（例えばインターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが挙げられる。
【００６９】
（Ｇ．生体接着剤および粘膜付着剤）
本発明では生体接着剤および粘膜付着剤もアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［６８］または粘膜付着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。本発明ではキトサンおよびその誘導体もアジュバントとして使用し得る［６９］。
【００７０】
（Ｈ．微粒子）
本発明では微粒子もアジュバントとして使用し得る。生分解性であってかつ無毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましい）から形成され、そして必要に応じて、（例えばＳＤＳで）負に荷電した表面を持つように処理されるかまたは（例えばＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤で）正に荷電した表面を持つように処理された、微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。
【００７１】
（Ｉ．リポソーム（参考文献１７の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献７０〜７２に記載されている。
【００７２】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明での使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［７３］。そのような処方物には、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［７４］、ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［７５］が含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００７３】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ製剤は、例えば参考文献７６および７７に記載されている。
【００７４】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【００７５】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族体（例えば「レシキモド３Ｍ」）が挙げられ、それらは参考文献７８および７９にさらに記述されている。
【００７６】
本発明は、上述したアジュバントのうちの１以上の局面の組み合わせも含み得る。例えば、本発明では以下のアジュバント組成物を使用し得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８０］；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［８１］；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［８２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［８３］；（６）１０％スクアラン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、マイクロフルイダイザーでサブミクロンエマルジョンにするか、ボルテックスによってさらに大粒径のエマルジョンを生成させたもの；（７）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１以上の無機塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。
【００７７】
免疫刺激剤として作用する他の物質が、参考文献１７の第７章に開示されている。
【００７８】
アルミニウム塩アジュバントの使用は特に好ましく、一般的には抗原をそのような塩に吸着させる。本発明の組成物では、抗原の一部は水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原はリン酸アルミニウムと会合させておくということも可能である。しかし一般的には、塩を１つだけ使用し（例えば水酸化物だけまたはリン酸塩だけを使用し）、両方は使用しないことが好ましい。全ての小胞を吸着させる必要はない。すなわち一部または全部が溶解状態で遊離していてもよい。
【００７９】
（処置の方法）
本発明は、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法であって、その哺乳動物に本発明の薬学的組成物を投与することを包含する方法も提供する。免疫応答は、好ましくは防御であり、好ましくは抗体が関与する。本方法では、ＨＣＶに対する初回免疫を既に受けている患者における追加免疫応答を惹起することもできる。
【００８０】
哺乳動物は好ましくはヒトである。ワクチンが予防用である場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば幼児もしくは乳児）またはティーンエージャーであり、ワクチンが治療用である場合、ヒトは、好ましくは、成人である。小児用のワクチンを、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与してもよい。
【００８１】
本発明は、医薬として使用するための本発明のＥ１／Ｅ２複合体も提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物の免疫応答を惹起することができ（すなわち免疫原性組成物であり）、より好ましくはワクチンである。
【００８２】
本発明は、哺乳動物の免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のＥ１／Ｅ２複合体の使用も提供する。
【００８３】
これらの使用および方法は、好ましくは、ＨＣＶによって引き起こされる疾患（例えば肝炎）の予防用および／または処置用である。
【００８４】
治療的肝炎処置の効力をチェックするための方法は当技術分野では知られている。予防的処置の効力をチェックする一方法では、当該組成物の投与後に、Ｅ１／Ｅ２抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を含む。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験対象（例えば１２〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル）に投与した後、ＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）などの標準的パラメータを決定することによって決定され得る。これらの免疫応答は一般に、組成物投与の約４週間後に決定され、組成物の投与前に決定した値と比較される。
【００８５】
一般に、本発明の組成物は、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、もしくは組織の間質腔への注射）によって、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所外用、経皮投与、鼻腔内投与、眼投与、耳投与、肺投与もしくは他の粘膜投与によって、達成され得る。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば皮下針）を通して行なわれ得るが、これに代えて無針注射を使用してもよい。代表的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【００８６】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで使用され得る。一次投与スケジュールに続いて、追加投与スケジュールを行なうことができる。初回投与間（例えば４〜１６週間）および初回投与と追加投与との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【００８７】
本発明は全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために使用され得る。
【００８８】
（一般事項）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、何か他のものを含んでもよい（例えばＸ＋Ｙ）。
【００８９】
数値ｘに関して「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９０】
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合は、「実質的に」という用語を本発明の定義から省略することができる。
Ｃ型肝炎ウイルスに関する詳細な情報は、その生活環、複製、培養条件、ゲノム、ポリタンパク質、タンパク質分解プロセッシングなどを含めて、参考文献８４の第３２〜３４章に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、ｒｖＥ１８０９（Ｒ８０９）レトロウイルスベクターを生成させ、細胞をそれに感染させるために使用した方法の概略図を示す。
【図２】図２は、Ｒ８０９ベクターをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７または２１−５細胞のウェスタンブロットを示す。染色抗体は抗Ｅ１／Ｅ２である。
【図３】図３は、抗Ｅ１Ｅ２、抗コアまたは抗Ｅ２を使った免疫沈降後の、抗Ｅ１／Ｅ２抗体で染色した、２１−５細胞および培養上清のウェスタンブロットを示す。図３は非還元ゲルである。
【図４】図４は、抗Ｅ１Ｅ２、抗コアまたは抗Ｅ２を使った免疫沈降後の、抗Ｅ１／Ｅ２抗体で染色した、２１−５細胞のウェスタンブロットを示す。図４は還元ゲルである。
【図５】図５は、図３と同様であるが、染色抗体は抗Ｅ１／Ｅ２ではなく抗コアである。
【図６】図６は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２または抗コアのいずれかで染色した。これら２つの個別の染色を重ね合わせると、Ｅ１／Ｅ２とコアとが一緒に局在することが示される。
【図７】図７は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２または抗コアのいずれかで染色した。これら２つの個別の染色を重ね合わせると、Ｅ１／Ｅ２とコアとが一緒に局在することが示される。
【図８】図８は、個々の２１−５／Ｒ８０９細胞の免疫蛍光解析を示す。Ｅ１／Ｅ２を発現させる細胞の一部はコアタンパク質を発現しておらず、コアを発現する細胞の一部はＥ１／Ｅ２を発現していなかった。
【図９】図９は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。Ｅ１およびＥ２は、さまざまな形状、寸法および個々の分布を持つ「ドット」に構造化される。
【図１０】図１０は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。Ｅ１およびＥ２の「ドット」は、非構造タンパク質ＮＳ３と部分的に一緒に局在することを示す。
【図１１】図１１は、ＨＣＶレプリコンを欠くＨｕｈ７／Ｒ８０９の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２で染色した。Ｅ１／Ｅ２はドット状の分布を示すが、標識は２１−５／Ｒ８０９細胞の場合の約５分の１だった。
【図１２】図１２は、約３μｍの最大長を持つ細胞に沿ったＥ１／Ｅ２の分布の３次元グラフィック表示を示す。
【図１３】図１３は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２と抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０のいずれかとで染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２は標準的なＥＲマーカーであるＣＮＸおよびＥＲＰ６０と全く一緒に局在しないことが示唆される。
【図１４】図１４は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２と抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０のいずれかとで染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２は標準的なＥＲマーカーであるＣＮＸおよびＥＲＰ６０と全く一緒に局在しないことが示唆される。
【図１５】図１５は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２および抗ＧＭ１３０で染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２とＧＭ１３０とは一緒に局在しないことが示唆される。
【図１６】図１６は、ＩＦＮ−αによる細胞培養物の処理前および処理後の２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２で染色した。ＩＦＮ−αで処理した細胞は、Ｅ１およびＥ２の代表的なＥＲパターン分布を失う。
【図１７】図１７は、細胞培養物のＩＦＮ−α処理後のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを示す。
【図１８】図１８は、細胞培養物のＩＦＮ−α処理後のリボソームＲＮＡのレベルを示す。
【図１９】図１９は、分画遠心分離後の画分のウェスタンブロットを示す。
【図２０】図２０は、Ｅ１およびＥ２の大半がＮＰ−４０耐性膜と会合し、細胞内脂質ラフトのマーカーであるカベオリン−２と一緒に分画されることを実証する膜浮遊解析の結果を示す。
【図２１】図２１は、レプリコン細胞株におけるＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１／Ｅ２の発現を示す。（Ａ）ＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ＨＩＶ調節タンパク質ｒｅｖをコードするプラスミド、ならびにヒトホスホグリセロキナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターの制御下にキャプシド形成シグナルおよびＥ１Ｅ２ｐ７転写単位をコードする自己不活化型レンチウイルスベクターを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、ＶＳＶ−シュードタイプ粒子を産生させた。（Ｂ）Ｈｕｈ−７および２１−５形質導入細胞株におけるＥ１／Ｅ２発現を、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９を用いる免疫蛍光解析によって検出した［８５］。Ｅ１／Ｅ２は赤色で視覚化され、青色は核のＤＡＰＩ染色を表す。（Ｃ）２１−５および２１−５ Ｒ８０９から得た細胞溶解物を、コンフォメーショナルモノクローナル抗体ＣＢＨ−２で免疫沈降させ、その免疫沈降物を抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９でブロットして、Ｅ１およびＥ２の両方を明らかにした。
【図２２】図２２は、ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が、コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａと一緒に局在することを示す。接種の１日後に、２１−５および２１−５Ｒ８０９を、コア、ＮＳ３またはＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体（元は緑色として検出される）と抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色として検出される）とで二重染色した。
【図２３】図２３は、ＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の、新生ＲＮＡが一緒に局在することを示す。（Ａ）接種の１日後に、２１−５Ｒ８０９細胞を固定し、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、ＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体７−Ｄ４（元は緑色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は青色）で染色した。（Ｂ）リポフェクトアミン２０００を使って２１−５Ｒ８０９をトランスフェクトし、そしてＢｒＵＴＰで２時間または４時間、標識した。細胞を、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、ＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は青色）、およびＢｒｄＵＴＰに対するモノクローナル抗体（元は緑色）で染色した。（Ｃ）では、細胞を４時間パルスし、（Ｂ）と同様に染色した。底面および側面の帯は、表示した線を通るｚ切片を表し、斑紋様構造をしたＥ１／Ｅ２、ＮＳ３およびＲＮＡが一緒に局在することを示している。バーは５μｍ。
【図２４】図２４は、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を支持する異なる細胞株におけるＨＣＶ非構造タンパク質の分布を示す。接種の１日後に、全長レプリコンを保有する２１−５、サブゲノムレプリコンを保有するＮＳ３−３’およびＮＳ３−３’Ｒ８０９を固定し、ＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体７−Ｄ４（元は赤色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は緑色）で染色した。下のパネルでは、挿入図は、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は青色）によるＥ１／Ｅ２染色を示す。バーは５μｍ。
【図２５】図２５は、ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２の細胞内局在を示す。（Ａ）２１−５Ｒ８０９を固定し、そして示した抗体で染色した。組み合わせた画像だけを示す。（Ｂ）抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、カルネキシンに対するウサギポリクローナル抗体（元は緑色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は真ん中のパネルでは赤色、または下のパネルでは緑色）で染色した２１−５Ｒ８０９細胞の拡大像。バーは２．２μｍ。
【図２６】図２６は、ＨＣＶタンパク質の細胞成分分画および界面活性剤可溶化を示す。（Ａ）２１−５Ｒ８０９細胞から得た細胞溶解物をそのまま処理しないか、１％ＴＸ−１００により氷上で処理するか、１％ＴＸ−１００により３７℃で処理した。不連続ショ糖密度勾配遠心分離によって細胞成分分画を行なった。勾配の上端から下端まで画分を集めた。回収した画分を、等体積ずつ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、ニトロセルロース膜に転写し、Ｅ１／Ｅ２に対する抗体、ＮＳ３に対する抗体、コアに対する抗体、カベオリン−２に対する抗体、カルネキシンに対する抗体で免疫ブロットした。画分には上端から下端に向かって１から１１までの番号を付ける。（Ｂ）収集した画分の密度プロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
（発明を実施するための形態）
（ＨＣＶゲノムレプリコン系における糖タンパク質発現の補強）
ＨＣＶ複製／集合複合体の性質および細胞内区画化を明確にするために、本発明者らは、全長遺伝子型１ｂレプリコンを保有する２１−５細胞におけるＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の局在を調べた［４］。これらの細胞では、ノーザンブロットによって持続的ＲＮＡ複製が証明され、ウェスタンブロットおよび３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ標識と、それに続く免疫沈降によって、タンパク質発現が証明された。これらの技法を使って、本発明者らは、細胞抽出物におけるコア、ＮＳ３、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂの存在を明らかにした。意外なことに、ウェスタンブロット法、代謝標識法、または免疫蛍光解析法では、Ｅ１およびＥ２の発現を検出することができなかった。
【００９３】
この低い糖タンパク質発現レベルが、この系がウイルス粒子を産生できないことの原因になっているかどうかを決定するために［４］、本発明者らは、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入を使って、２１−５細胞にＥ１およびＥ２の安定な発現を提供することにした［８６］。本発明者らは、ＨＣＶ１ａ遺伝子型のＥ１Ｅ２ｐ７コード領域を、自己不活化型レンチウイルスベクターにおいて、遍在発現されるホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫｐ）の下流にクローニングし［８７］、ＶＳＶシュードタイプ粒子を生成させた。
【００９４】
（細胞株）
この研究では、以下の３つの異なる細胞株を使用した：１）ナイーブＨｕｈ７；２）全長レプリコンＩ３８９ｎｅｏ／ｃｏｒｅ−３’／５．１を持つＨｕｈ−２１−５［４］、サブゲノムレプリコンＩ３８９ｎｅｏ／ＮＳ３−３’を持つＨｕｈ−５−１５［１］。これらの細胞を、ＨＣＶレプリコンを保持する細胞株については、完全ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８（ジェネティシン；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた（Ｈｕｈ−２１−５には２５０μｇ／ｍｌ；Ｈｕｈ−５−１５には７５０μｇ／ｍｌ）。Ｈｕｈ７細胞および２１−５細胞［４］は供給業者から入手した。比較のためにＨｅｐＧ２細胞も使用した。Ｈｕｈ７細胞はＨＣＶに感染していないが、２１−５細胞は感染している。
【００９５】
（レンチウイルスベクターの作製およびＨＣＶレプリコン細胞株の形質導入）
ＰＧＫ／ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ｐ７レンチウイルスベクターを生成させるために、本発明者らは、Ｔｙｒ１６４の上流にＭｅｔ残基が付加され、Ａｌａ８０９の下流に停止コドンが付加されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使って、ＨＣＶ１ａ遺伝子型のＴｙｒ１６４からＡｌａ８０９までをコードする１９３５塩基対断片を増幅した。本発明者らは、自己不活化型レンチウイルスベクターｐＣＣＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．Ｗｐｒｅ［８８］，［８７］の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、増幅したＥ１Ｅ２ｐ７断片で置き換えた。
【００９６】
図１に示すプロセスにより、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を調製した。ウイルスＬＴＲが両側に隣接した、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質およびｐ７タンパク質をコードするＤＮＡ（１０μｇのｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．Ｅ１Ｅ２ｐ７）を、１０ｃｍディッシュにプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リン酸カルシウム法で、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）をコードするＤＮＡ（３．５μｇ）、（ｉｉ）ＲＳＶプロモーターの制御下にあるＲＥＶをコードするＤＮＡ（２．５μｇ）、および（ｉｉｉ）ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＧＡＧおよびＰＯＬをコードするＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、Ｅ１Ｅ２ ＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生し、これらの粒子を、そのＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物の上清から集めることができた。ウイルス上清の収集は、トランスフェクションの２４時間後と４８時間後とで２回行なった。０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した後、超遠心分離によってレンチウイルスベクターを濃縮した。精製された粒子（５０μｌまたは１００μｌのいずれか）を使用し、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下に、３７℃および５％ＣＯ２で、濃縮レンチウイルスベクターに６時間曝露することにより、ナイーブＨｕｈ−７、Ｈｕｈ−５−１５または２１−５細胞を感染させ、形質導入の９６時間後に、これらの細胞を、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質の発現について、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット法で解析した。このレトロウイルスベクターを「ｒｖＥ１８０９」または「Ｒ８０９」と名付けた。
【００９７】
ナイーブＨｕｈ−７細胞および２１−５細胞のレンチウイルス形質導入は、どちらも非常に効率よく起こり、透過処理した細胞のＦＡＣＳ解析によって評価したところ、これらの細胞のほとんど１００％で、ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２の安定な発現を可能にした。本発明者らは、ＨＣＶ−１ａ Ｅ１Ｅ２ｐ７で形質導入された細胞をＲ８０９と呼ぶ。
【００９８】
ウェスタンブロットで抗Ｅ１／Ｅ２抗体を使用したところ、Ｅ１およびＥ２がＨｕｈ７細胞と２１−５細胞とのどちらにも見られた（図２）。この解析により、Ｅ１およびＥ２が必要なシグナルペプチダーゼによってプロセシングされることも確認された。
【００９９】
抗Ｅ１Ｅ２、抗コアおよび抗Ｅ２（「Ｈ２」）抗体を使用し、２１−５細胞で、免疫沈降実験を行なった。図３（非還元ゲル）および図４（還元ゲル）のウェスタンブロットは抗Ｅ１Ｅ２抗体で染色したものであり、Ｒ８０９ベクターを持たない２１−５細胞ではＥ１発現が検出されないこと；Ｅ１は抗Ｅ２モノクローナル抗体によって共沈されるので、Ｅ１とＥ２はヘテロ二量体として安定に会合していること；そして抗コア抗体はＥ１もＥ２も沈降させないので、Ｅ１／Ｅ２はコアとは会合していないことを示している。図５のウェスタンブロットは抗コア抗体で染色したものであり、コアタンパク質はＲ８０９ベクターを含む２１−５細胞またはＲ８０９ベクターを含まない２１−５細胞によって発現されるが、抗コアモノクローナル抗体によって沈降されないことを示している。３５Ｓ−Ｍｅｔ標識でもＥ１／Ｅ２発現を検出することができた。
【０１００】
（免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法）
細胞を、２４ウェルプレート中の３０ｍｍカバースリップ上に、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの１日後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した後、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過処理した。次に、製造者の指示に従って、細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミン）で３０分間、前処理し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒコンジュゲート二次抗体を、１：２００の希釈率で、室温で１時間、細胞に加えた。ＰＢＳで洗浄した後、カバースリップを蒸留水で洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と共に水性封入媒体Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入した。
【０１０１】
２１−５／Ｒ８０９細胞の免疫蛍光解析は、Ｅ１とＥ２とが一緒に局在すること（細胞の２０〜３０％にドット）を示し、コアタンパク質がＥ１／Ｅ２複合体と共に蓄積していることも示した（図６および図７）。抗コアによる可視蛍光スポットは、抗Ｅ１／Ｅ２で見られるものと、同じ形状を持っていた。図７に示すように、一部の例では、スポットが部分的にしか重なっていないことから、コアタンパク質とＥ１／Ｅ２タンパク質とは、同じドットに蓄積しようと試みていることが示唆された。異なる細胞を個別に調べたところ、Ｅ１／Ｅ２ドットを持つ一部の細胞はコアタンパク質を発現せず、コアドットを持つ細胞の一部は、Ｅ１／Ｅ２を発現しなかったので（図８）、細胞は均質ではなかった。しかし、コアとＥ１／Ｅ２とをどちらも発現させる細胞は、他の細胞から容易に識別され得、そして分離することができた。Ｅ１／Ｅ２スポットの形状、寸法および細胞内分布もさまざまだった（図９）。この変動性は、ウイルス疑似種の相違、トランスフェクション効率の相違（異なるクローン）に起因し得るか、またはそれは、ウイルス生活環の異なる段階にある同一の細胞であり得る。
【０１０２】
ＨＣＶ糖タンパク質の細胞内分布を可視化するために、Ｈｕｈ−７細胞、Ｈｕｈ−７Ｒ８０９細胞、２１−５細胞および２１−５Ｒ８０９細胞で、さらなる免疫蛍光解析を行なった。図２１Ｂに示す実験では、Ｅ１とＥ２との両方を明らかにするために、本発明者らは抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９［８５］を使用した。しかし、ヒト起源またはマウス起源のモノクローナル抗Ｅ２抗体を使った場合にも、同様のパターンが得られた。Ｈｕｈ−７Ｒ８０９および２１−５Ｒ８０９はどちらも、Ｅ１／Ｅ２の発現レベルに大きな変動性を示した（図２１Ｂの上のパネル）が、これはおそらくそれらの起源がクローン性でないという事実に依存する。全体としてＥ１／Ｅ２はＥＲ様分布を持つようだったが、細胞の有意なサブセットが、サブゲノムレプリコンを保有する細胞で記載されているＮＳ３およびＮＳ５Ａに富むドット状構造［８９〜９２］に似たドット状構造へのこれら２つの構造タンパク質の濃縮を示した（図２１Ｂ）。代表的な細胞の拡大図によって証明されるように、これらの構造はどちらの細胞タイプにも存在したが、それらの構造の形状および局在は同等ではなかった（図２１Ｂの下のパネル）。一般的所見として、Ｈｕｈ−７では、ドット状構造がより散漫に見え、細胞の辺縁部にある程度局在しているのに対して、２１−５Ｒ８０９では核の近くに、より密集してみえた。
【０１０３】
（２１−５Ｒ８０９におけるＥ１／Ｅ２と他のＨＣＶタンパク質との一緒の局在）
さらなる実験により、Ｅ１／Ｅ２はＮＳ３（図１０）およびＮＳ５ａとも一緒に局在することが示された。
【０１０４】
サブゲノムレプリコンの活発なＲＮＡ複製を支持するＨｕｈ−７細胞では、ＮＳ３とＮＳ５Ａがどちらも、新たに合成されたＨＣＶ ＲＮＡと共に、ＨＣＶ複製複合体を表し得る明確なドット状構造上に局在することが示されている［９０、９１、９３］。さらにまた、ＨＣＶ非構造タンパク質を含有する精製された膜画分は内在性レプリコンＲＮＡに会合することも見出され、ｄＮＴＰ類が供給されると、このＲＮＡをインビトロで複製することができた［８９〜９２，９４〜９７］。２１−５Ｒ８０９細胞では、Ｅ１／Ｅ２も、ドット状の形状をした稠密構造に組織化されることを、本発明者らは明らかにした。次に、本発明者らは、２１−５および２１−５Ｒ８０９細胞において、非構造ＨＣＶタンパク質も何らかの種類の構造に組織化されるかどうか、そしてＥ１／Ｅ２との一緒の局在が存在するかどうかを、決定しようとした。本発明者らは、Ｌ５５９抗血清によってＥ１／Ｅ２を明らかにする共焦点顕微鏡法を、それぞれコア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａと組み合わせて行なった。結果を図２２に示す。
【０１０５】
左側のパネルでは、全長レプリコンを保有する２１−５細胞における、コア（上）、ＮＳ３（真ん中）およびＮＳ５Ａ（下）の分布が、明らかにされた。これらの細胞では、コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａが、一定数の稠密局在領域を持つＥＲ様分布を示した。コアタンパク質は、かなりの数のドット状構造を形成すると共に、文献（３４）に記載されているように輪状構造もいくつか形成するようだった。２つのＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ３およびＮＳ５Ａは、よりＥＲ様の分布パターンを示し、小さなドットが主に核周囲領域に局在していた（図２２の左側のパネルの真ん中の段および下段）。このように、ＮＳ３およびＮＳ５Ａのパターンは、より大きな多数のドットの形成が記述されているサブゲノムレプリコンを保有する細胞に見出されるパターン［９０〜９３，９８］とは異なるようだった。これらのタンパク質の分布パターンは、Ｅ１およびＥ２が高レベルに発現される２１−５Ｒ８０９細胞では、異なるように見えた（図２２，右側のパネル）。この場合、コアタンパク質、ＮＳ３タンパク質およびＮＳ５Ａタンパク質は、弱いＥＲ様分布を伴うドット状構造を形成した。注目すべきことに、Ｅ１／Ｅ２が形成するドットは、コア、ＮＳ３またはＮＳ５Ａによって形成される同様の構造との強い、一緒での局在を示した（図２２、右側のパネル）。一方、散漫なＥＲ様パターンは、個別に解析した４つのタンパク質に関して類似していたが、これらの化学種の厳密な一緒の局在はもたらさなかった。
【０１０６】
さらにまた、抗アイソタイプ・フルオレシネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎａｔｅ）二次抗体を使って、２１−５Ｒ８０９細胞におけるＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＥ１／Ｅ２の同時染色を達成した。ＮＳ５Ａに代えて、新生細胞質ＲＮＡを抗ＢｒＵＴＰ抗体で標識した。これらの実験で得た結果を図２３に示す。組合せ写真で得られる色により、任意の組み合わせでの異なる化学種の一緒の局在が明らかになった。ＮＳ３化学種とＥ１／Ｅ２、およびＮＳ５ＡまたはウイルスＲＮＡとの会合は、青色がより明るくなることによって明らかになった。Ｅ１／Ｅ２とＮＳ５Ａ（またはウイルスＲＮＡ）とが一緒に局在することによって黄色が生成したのに対して、白色の領域は３つ全ての化学種の完全な一緒の局在を示した。図２３Ｃでは、三重に染色したこれらドット状構造の一部を、ｚ切片でも示す（上側および右側の帯）。
【０１０７】
図２３Ａに示すように、Ｅ１／Ｅ２とＮＳ３またはＮＳ５Ａのいずれかとの幅広い一緒の局在が観察された。さらにまた、これらのドット状構造のいくつかは、解析した３つの化学種全てについて陽性だった。これらの知見は、全ての化学種が一緒に局在している構造を生成させる、このレプリコンを背景として発現されるＨＣＶタンパク質の共通する分布を示唆している。
【０１０８】
類似する状況が、他のウイルスタンパク質と比較した新生ウイルスＲＮＡの分布にも観察された（図２３Ｂおよび図２３Ｃ）。これらの実験では、免疫蛍光染色および共焦点解析のために固定する前に、細胞を、アクチノマイシンＤの存在下に、ＲＮＡ前駆体ＢｒＵＴＰで２時間および４時間処理した。図２３Ｂに示すように、２時間パルスでは、新生ＲＮＡが、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３も蓄積しているドットに対応する不連続な構造と会合していた。細胞をＢｒＵＴＰでさらに長い期間（４時間）パルスすると、標識されたウイルスＲＮＡは、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３と共にドット内に見出すことができるだけでなく、細胞全体にも広がっていた（図２３Ｃ）。これは、複製されなければならないウイルスゲノムを構成するが、メッセンジャーとしても機能するという、ＨＣＶ ＲＮＡが持つ二重の機能と合致する。非構造タンパク質と新生ＲＮＡとが一緒に局在することは、ウイルス複製複合体を表すと報告されている［８９〜９２］。本発明者らのデータは、上記２つのＨＣＶ糖タンパク質も、それらを発現させた場合には、これらの複合体とも会合することを示唆している。
【０１０９】
免疫蛍光ドットの共焦点顕微鏡法により、Ｅ１／Ｅ２ラベルは、約３μｍの最大長の細胞に沿って分布することが明らかになった。このことは、管状構造を示唆する（図１１）。
【０１１０】
Ｒ８０９ベクター（すなわち、ＨＣＶが存在しないもの）でトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞も、Ｅ１／Ｅ２ドットを示したが、標識は２１−５細胞の５分の１程度（５０％対１０％）であり、細胞内分布はわずかに異なるようだった（図１２）。これは、Ｒ８０９ベクターから発現されるＥ１およびＥ２は細胞内で集合できるが、それらはコア（および他の）タンパク質がなければウイルス自己集合をさらに進めることができないことを示唆している。
【０１１１】
（Ｅ１／Ｅ２の細胞内局在）
ほとんどの報告では、ＨＣＶタンパク質はＥＲ膜またはＥＲ由来の膜に会合すると記述されており、一部の研究では、ゴルジ装置またはトランスゴルジ網の関与が指摘されている［８９，９０，９２，９８〜１００］。本発明者らは、２１−５Ｒ８０９細胞におけるＥ１／Ｅ２の位置を、共焦点解析により、これら２つのＨＣＶ糖タンパク質とさまざまな細胞区画の既知マーカーとの同時標識によって捉えようとした。
【０１１２】
簡単に述べると、細胞内局在を評価するために、細胞を抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０（どちらも小胞体（それぞれ膜および内腔）のマーカーである）でも染色した。Ｅ１／Ｅ２はＣＮＸと完全には一緒に局在せず、一部のＥ１／Ｅ２は細胞の周辺部に見られたことから、このタンパク質複合体はＥＲを超えて進行していたことが示唆される（図１３および図１４）。次に細胞を、シスゴルジのマーカーである抗ＧＭ１３０で標識した。Ｅ１／Ｅ２とＧＭ１３０とが一緒に局在していることは見られなかった（図１５）。Ｅ１／Ｅ２はエンドグリコシダーゼＨ処理に対して感受性であったことから、それらはＥＲに保持されていることが示された。
【０１１３】
より詳細に述べると、図２５Ａに示すこのような解析の結果から、本発明者らは、Ｅ１／Ｅ２はゴルジ装置（ＧＭ−１３０）にもミトコンドリア（ＴＣＰ１）にも一緒に局在はせず、かつこれらは微小管（α−チューブリン）に結合せず、カベオリン−２にも会合しないと結論することができた。非常に限られた領域しか組合せの可能性が見えない図２５Ａに示すように、２つのＥＲマーカーである、可溶性内腔タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５７および膜貫通タンパク質カルネキシンとの幅広い一緒の局在もなさそうだった。Ｅ１／Ｅ２、Ｅｒｐ５７およびカルネキシンは、有意な重なりの不在を特徴とする幅広い細網状のパターンを示した。一方、Ｅ１／Ｅ２によって形成されるドット状構造を取り囲む領域の周辺における両化学種の分布は、判定がはるかに困難だった。
【０１１４】
カルネキシンはしばしばＨＣＶ糖タンパク質に会合していたので、いくつかの異なる試料で、より高倍率の共焦点走査解析を行なった。図２５Ｂは、そのような解析の代表的画像を示している。カルネキシンとＥ１／Ｅ２との一緒の局在は、ドットの辺縁部にある数少ない微小な領域に限定されていた（図２５Ｂの上段）。ＮＳ３化学種がカルネキシンから完全に離れて存在することは、もっとはっきりしていて（図２５Ｂの中段）、Ｅ１／Ｅ２とＮＳ３との強い一緒の局在は明白だった（図２５Ｂの下段）。後者の場合、２つの化学種は、一緒の局在の稠密なコアと、周辺部に数少ない単化学種分布の領域を示した。
【０１１５】
結論として、ＥＲ膜貫通型シャペロン・カルネキシンは、本質的にはＥ１／Ｅ２と一緒に分布するが、一緒の局在は非常にわずかな部分でしか起こらないようだった。さらにまた、カルネキシンは、ドットの中心領域からは排除されるようだった。このように、高い百分率の２１−５Ｒ８０９細胞では、コア、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３およびＮＳ５ＡというＨＣＶタンパク質が稠密構造中に蓄積すると共に厳密に一緒に局在した。また、その周辺で唯一認識できる細胞マーカーはＥＲ膜貫通シャペロンである。まとめて考えると、これらのデータは、ＥＲ由来区画におけるＨＣＶタンパク質の局在と合致した。
【０１１６】
（Ｅ１／Ｅ２発現の存在下または不在下でのＮＳ３およびＮＳ５Ａの細胞分布）
ドット状構造におけるＨＣＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３およびＮＳ５Ａの会合は、サブゲノムレプリコンを保有する細胞で既に報告されている。
【０１１７】
これら異なるウイルスタンパク質のドット形成プロセスへの相対的寄与を解明するために、本発明者らは、２１−５細胞（コアタンパク質の検出可能な発現はあるが、２つの糖タンパク質の検出可能な発現はない系）、ならびにＥ１およびＥ２を発現するかまたは発現しない、サブゲノムレプリコンを保有するＨｕｈ−７において、非構造タンパク質ＮＳ３およびＮＳ５Ａの分布を解析した。ＮＳ３−３’ＨＣＶ−１ｂ領域に相当するサブゲノムレプリコンの複製を支持するＨｕｈ−７細胞株は、参考文献１に記載された。本発明者らは、図２１Ａに示すように、遺伝子型１ａ由来のＥ１Ｅ２ｐ７遺伝子を保持するレンチウイルスベクターによって、この細胞株の形質導入を行なった。２つの糖タンパク質の発現をウェスタンブロットによってチェックしたが、免疫蛍光解析では、細胞の事実上１００％がＥ１／Ｅ２を発現させることがわかった。これらの細胞タイプでの共焦点解析で得た代表的画像を図２４に示す。２１−５細胞では、ＮＳ３とＮＳ５Ａがどちらも、細胞表面全体に小さなドット状領域をいくつか持つ散漫なＥＲ様分布を示した（図２４の上段）。これら２つの非構造タンパク質の一緒の局在は、数少ない可視ドットに限定されるらしく、細網状に分布したタンパク質は会合していないようだった。ＮＳ３−３’細胞では、ＥＲ様パターンが減少し、両タンパク質を含有する、より大きなドットの数の増加を伴った（図２４の中段）。ドット状構造におけるＮＳ３とＮＳ５Ａとの同時存在は、ＮＳ３−３’Ｒ８０９細胞でははるかに明確だった（図２４の下段）。これらの細胞において、これらの構造は数および大きさの両方が増し、それと同時にどちらの化学種についてもＥＲ様分布の減少が観察された。ここでもまた、２つの非構造タンパク質の一緒の局在は、ドット領域に優先的に限定された。これらの細胞におけるＥ１／Ｅ２の同時標識を挿入図内に示す（図２４の下段）。結果は、２つの化学種が一緒に局在するドットおよびいくつかの領域におけるこれら２つの非構造タンパク質とＥ１／Ｅ２との広範な一緒の局在を明確に示した。これらの観察は、全長レプリコンまたはサブゲノムレプリコンを保有する細胞におけるドット状構造形成の誘発にＥ１／Ｅ２発現が及ぼす相乗効果と合致した。
【０１１８】
まとめると、これらの観察は、これらの細胞におけるドット状構造の形成を駆動し得る相互作用の複雑なパターンを示した。現在までに解析されたウイルスタンパク質はいずれも、細網状の分布を示したか、またはドット状構造に濃縮され、その数および位置は、特定ウイルスタンパク質の存在に依存するのではなく、それが発現される状況に依存するようだった。さらにまた、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を許す細胞のサブタイプは、利用できるウイルス産物の全てを、出芽前領域に相当し得る大きな構造に蓄積させることも明らかだった。
【０１１９】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）は細胞培養中でＨＣＶ複製を阻害することが知られている［１０１］。２１−５／Ｒ８０９細胞をＩＦＮ−αと共にインキュベートすると、Ｅ１およびＥ２のＥＲパターン分布が変化し（図１６）、絶対的にも（図１７）、リボソームＲＮＡとの比較でも（図１８）、ＨＣＶ ＲＮＡレベルの減少を引き起こした。
【０１２０】
（ａ）Ｈｕｈ７細胞；（ｂ）Ｒ８０９トランスフェクトＨｕｈ７細胞、および（ｃ）２１−５／Ｒ８０９細胞からエキソソームを精製するために、分画遠心分離を使用した。図１９に示すように、ある遠心分離実験のＰ５画分に、ゴルジ修飾Ｅ２タンパク質に一致するかすかなバンドが検出された。ＣＤ８１も検出することができた。
【０１２１】
（新規合成されたウイルスＲＮＡの標識）
細胞を、２４ウェルプレート中のカバースリップ上に、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度でプレーティングした。接種の１日後に、リポフェクトアミン２０００を製造者の指示に従って使用することにより、細胞をブロモ−ＵＴＰ（ＢｒＵＴＰ）でトランスフェクトした。簡単に述べると、Ｏｐｔｉｍｅｍ中の１２ｍＭ ＢｒＵＴＰ ５０μｌを、５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎに希釈した１μｌのリポフェクトアミン２０００に加えた。室温で２０分間インキュベートした後、そのＢｒＵＴＰ−リポフェクトアミン複合体を、アクチノマイシンＤ（５μｇ／μｌ）の存在下で、ＤＭＥＭ完全培地５００μｌ中の細胞に直接加えた。２時間または４時間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した。ＨＣＶタンパク質を上述のように同定し、一方、新たに合成されたウイルスＲＮＡを、２μｇ／ｍｌのマウス抗ＢｒＵＴＰ抗体を使って検出した。一次抗体を、ＰＢＳ／ＢＳＡ ０．５％に２００：１に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体で検出した。
【０１２２】
新規合成されたＨＣＶ ＲＮＡを標識することにより、本発明者らは、本発明の複合体がウイルスＲＮＡ合成の部位を構成することを示した。
【０１２３】
（膜浮遊アッセイ）
ＨＣＶタンパク質と会合する細胞内膜の性質をより良く特徴づけるために、本発明者らは、膜画分と細胞質ゾル画分とを分離するための細胞成分分画研究を行なった。
【０１２４】
細胞を１ｍｌの低張緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で溶解し、Ｗｈｅａｔｏｎルーズフィットダウンスホモジナイザーで５０ストローク、ホモジナイズした。４℃、１０００×ｇで５分間の遠心分離によって、核および未破砕細胞を除去した。膜構造を特徴づけるために、細胞溶解物の核成分分画後上清（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を４℃または３７℃で３０分間、１％トリトンＸ−１００で処理した。次に、低塩濃度緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で８０％ショ糖と混合することによって細胞溶解物を５５％ショ糖にし、そして６ｍｌの３５％ショ糖を重層し、最後に３ｍｌの５％ショ糖を重層した。この勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター中、４℃、３８０００ｒｐｍで、２０時間遠心分離した。遠心分離後に、勾配の上端から１ｍｌずつの画分を集め、ＰＢＳに希釈し、３５００００×ｇで６０分間遠心分離することにより、物質を沈降させた。ペレットをＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング後に、膜を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次に適切な化学種特異的セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共に、室温でさらに１時間インキュベートした。
【０１２５】
２１−５Ｒ８０９細胞株からの細胞抽出物をショ糖勾配で分画し、そしてＨＣＶの構造タンパク質およびＨＣＶの非構造タンパク質、ＥＲ膜結合型タンパク質カルネキシン、ならびに細胞質脂質ラフトマーカーのカベオリン−２の存在について調べた。膜結合型タンパク質は勾配内の平衡な密度へと浮遊すると予想された。実際、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３はどちらも充分な割合のものが膜画分（画分４〜５）に見出され、一方、コアタンパク質は、最も可能性が高いのはその発現レベルが低いことに起因して、可溶性画分にしか検出できなかった（図２６Ａ、左図）。ＥＲマーカーであるカルネキシンは、これらの生物学的手法で一般に見出されるように、膜画分および細胞質ゾル画分の両方に分布した。分画に先だって細胞抽出物を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４℃（ＥＲタンパク質を細胞質ゾルに放出させる条件）にて処理した場合は、全てのＨＣＶタンパク質が勾配の最下部の細胞質ゾル画分に見出された（図２６Ａ、真ん中の図）。したがって、以前の報告［９５］と一致して、細胞抽出物のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理は、ＨＣＶ複製複合体とＥＲ膜との解離をもたらした。これと同じ処理では、Ｃａｖ−２と一緒に分画される界面活性剤耐性膜（ＤＲＭ）は破壊されなかった（図２６Ａ、真ん中のパネル）。ＴＸ−１００と共に３７℃でインキュベートすると、ＤＲＭタンパク質の完全な可溶化が起こった（図２６Ａ、左のパネル）。まとめて考えると、これらのデータは、今までに記載されたＨＣＶ複製／集合複合体が、ＥＲ起源の膜構造と会合することを示した。
【０１２６】
膜浮遊解析により、Ｅ２の大半は、１％ＮＰ４０による処理に対して耐性でかつカベオリン−２と一緒に分画される膜と会合することが証明された（図２０）。
【０１２７】
（まとめ）
この報文で、本発明者らは、ＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の細胞内局在の解析ならびにウイルス出芽機序の研究に役立ち得る新しい細胞系を記載する。本発明者らは、全長遺伝子型１ｂレプリコンを保有する細胞株におけるＥ１Ｅ２（およびｐ７）の安定かつ検出可能な発現を樹立し、これら２つの糖タンパク質の局在を、非構造タンパク質、ウイルスＲＮＡおよび細胞内マーカーとの関連で特徴づけた。この系では、２つの糖タンパク質の発現は妥当に持続し続け、予想どおり、Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体の形成をもたらした。さらにまた、これら２つの糖タンパク質の染色体発現は、これら２つの化学種の遺伝的浮動を防止するので、Ｅ１Ｅ２の安定性に影響を及ぼし得る変異蓄積が回避される。タンパク質分布には２つのパターン、すなわち他の任意のＥＲマーカー標識に似た「細網状」パターンと、ウイルスタンパク質の局在した蓄積がドット状構造を生成した「斑点状」パターンが観察された。細網状分布の場合、ＨＣＶタンパク質は、互いとも、細胞内区域を同定するために用いられる標準的マーカーとも、優先的には一緒に局在しなかった。
【０１２８】
全てのＨＣＶタンパク質は宿主細胞膜と、膜結合タンパク質として直接的に、または間接的に相互作用して、特異的な変化のパターンを誘発する。本発明者らは、ナイーブＨｕｈ７細胞においてドット様構造を誘発するには、Ｅ１Ｅ２ｐ７の孤立した発現で十分であることを確認した（図２１Ｂ）。しかし、これらの構造の数、形状および局在は、同時に発現されるウイルスタンパク質の状況に依存していた。実際、本発明者らは、全長レプリコンまたはサブゲノムレプリコンを保有する細胞における補強されたＥ１Ｅ２発現が、ＮＳ３およびＮＳ５Ａの細網状分布の減少と、それに付随する、全てのウイルス成分が濃縮される、より明確な領域への蓄積とを誘発することを実証した（図２２および図２４）。逆に、発現された外因性Ｅ１／Ｅ２は、レプリコンとの関連で発現させた場合に、ナイーブＨｕｈ７細胞中でのそれらの細胞局在と比較して、より輪郭のはっきりした、より大きい、より核周囲性の強いドット状構造に組織化される。
【０１２９】
以上は本発明を例示するための説明に過ぎず、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく改変を加え得ることが理解される。
【０１３０】
（参考文献：これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）
【０１３１】
【表１−１】
【０１３２】
【表１−２】
【０１３３】
【表１−３】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で引用する文書はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス培養およびタンパク質発現の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）には、効率のよいインビトロ培養系がないので、ウイルスの構造および集合については、ほとんどわかっていない。ＨＣＶの非構造タンパク質の大半を含有するサブゲノムレプリコンは、ヘパトーム細胞株中で複製することが示されており［１（非特許文献１）］、トランスフェクション効率が改善されたさらなるサブゲノムレプリコンも開示されている［２（非特許文献２）、３（特許文献１）］。これらの系はＨＣＶ複製機序に関する詳細な研究を可能にしたが、それらのレプリコンに構造遺伝子が存在しないことは、ビリオンの集合が可能でないことを意味する。
参考文献４（非特許文献３）には、細胞培養中で全長ＨＣＶゲノムを持続性および一過性に複製させるための方法が記載されており、そこでは、変異型の「選択可能な全長」（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ：ｓｆｌ）ゲノムが、（Ｈｕｈ−７細胞株に由来する）２１−５細胞中で安定に複製することができ、そして全てのウイルスタンパク質を発現させることができた。これらの変異を選択可能なサブゲノムレプリコンに導入することにより、ＲＮＡ複製と高いコロニー形成効率（ＥＣＦ）とが可能になったものの、ｓｆｌゲノムの場合、そのＥＣＦは、サブゲノムレプリコンと比較すると３〜４桁低かった。２１−５培養物の上清にはウイルスＲＮＡが見られたが、この作用はサブゲノムレプリコンでも見られたので、この放出はウイルス構造タンパク質の関与によるものではなく、むしろ非特異的機序によるものであったと、著者らは考えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０１／８９３６４号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｏｈｍａｍｍら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１１０−１１３
【非特許文献２】Ｂｌｉｇｈｔら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１９７２−１９７４
【非特許文献３】Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：４００８−２１
【非特許文献４】Ｋｌｅｉｎら（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：９２５７−６９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＨＣＶウイルス粒子のインビトロ集合は無細胞系では可能であるが［５］、効率のよい細胞系は２００５年まで報告されなかった［６−８］。参考文献４に記載された２１−５細胞はウイルス粒子を産生しないことがわかったので、ＨＣＶ全ゲノム複製を支持することができ、かつウイルス粒子を産生し得るインビトロ細胞培養系、ならびに参考文献６〜８と比較して、さらなる改良された系は、依然として、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
参考文献４の著者らは、２１−５細胞がウイルス粒子形成を支持できないのは、宿主細胞因子の欠如が理由であるかもしれないことを示唆した。これとは対照的に、本発明者らは、この不首尾は、ＨＣＶ構造エンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現できないことによって、少なくとも部分的には説明され得ると考えている。そこで本発明者らは、この不足を克服するために、これらのタンパク質をトランスに補完することを選択した。その結果得られる細胞は、ＨＣＶ複製をより良く支持することができ、ＨＣＶ粒子をより良く産生し得る。
したがって本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞を提供する。
【０００８】
本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質の他にも、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現されるような細胞も提供する。したがってＥ１および／またはＥ２は、ウイルス生活環中にＨＣＶゲノムから発現されるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングから生じるＥ１／Ｅ２とは別個の形態で発現される。２つの異なるタイプのＲＮＡ、すなわちＨＣＶ ＲＮＡゲノムになるタイプと、Ｅ１および／またはＥ２タンパク質に翻訳されるタイプとが産生される。
【０００９】
本発明は、（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み、（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現し、そして（ｃ）インビトロ培養で増殖し得る細胞も提供する。
【００１０】
本発明は、以下の２つの核酸をトランスに含有する細胞も提供する：（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸。本発明は、以下の２つの核酸をトランスに含有する細胞も提供する：（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸。
【００１１】
本発明の細胞は、ＨＣＶ複製を支持するために培養下で増殖させ得、ＨＣＶビリオンおよびＥ１／Ｅ２複合体をそこから精製し得る。
【００１２】
本発明は、本発明の細胞を調製するための方法であって、（ａ）細胞にＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入する工程；（ｂ）細胞にＣ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を導入する工程を包含する方法も提供する。工程（ａ）と工程（ｂ）とは別個に行ってもよく、または同時に行なってもよい。本発明は、細胞中でＣ型肝炎ウイルスを培養するためのインビトロでの方法であって、上記工程（ａ）および工程（ｂ）、続いて（ｃ）得られた細胞を培養する工程を包含する方法も提供する。
【００１３】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を調製するための方法であって、（ａ）本発明の細胞を培養する工程；ならびに（ｂ）培養した細胞からＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を精製する工程を包含する方法も提供する。Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は好ましくは複合体の形態にあり、本発明は、本発明の方法によって得られ得るＥ１／Ｅ２複合体を提供する。
【００１４】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を導入し得る細胞も提供する。同様に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２のうちの一方または両方をコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入し得る細胞も提供する。本発明は、ＨＣＶのＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質をコードする配列を含むベクターも提供する。このベクターは、インビトロでの細胞培養においてＨＣＶ複製を支持するという細胞の能力を強化するのに使用される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
細胞であって、
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸、ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を含む、細胞。
（項目２）
前記Ｃ型肝炎ウイルスが複製し、Ｃ型肝炎ウイルス生活環の結果として発現されるＥ１および／またはＥ２タンパク質に加えて、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２が発現される、項目１に記載の細胞。
（項目３）
前記Ｅ１および／またはＥ２が、ウイルス生活環中にＨＣＶゲノムから発現されるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングから生じるＥ１／Ｅ２とは別個の形態で発現される、項目１または２に記載の細胞。
（項目４）
前記細胞が、
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含み、
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２を発現し、そして
（ｃ）インビトロ培養で増殖し得る、
項目１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
（項目５）
前記細胞が、以下の２つの核酸：
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノム；ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸
をトランスに含有する、項目１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
（項目６）
前記細胞が、以下の２つの核酸：
（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸；ならびに
（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸
をトランスに含有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
（項目７）
項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞を調製するための方法であって、
（ａ）細胞にＣ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入する工程；
（ｂ）該細胞にＣ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を導入する工程
を包含する、方法。
（項目８）
工程（ａ）と工程（ｂ）とが別個に行なわれる、項目７に記載の方法。
（項目９）
工程（ａ）と工程（ｂ）とが同時に行なわれる、項目７に記載の方法。
（項目１０）
細胞中でＣ型肝炎ウイルスを培養するためのインビトロ方法であって、項目７〜９のいずれか一項に従って細胞を調製する工程、次に（ｃ）得られた細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目１１）
Ｃ型肝炎ウイルスのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を調製するための方法であって、
（ａ）項目１〜６のいずれか一項に記載の細胞を培養する工程；ならびに
（ｂ）培養した細胞からＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を精製する工程
を包含する、方法。
（項目１２）
前記Ｅ１タンパク質および前記Ｅ２タンパク質がＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質のうちの１以上と共に精製される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記Ｅ１タンパク質および前記Ｅ２タンパク質が複合体の形態にある、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４）
項目１３に記載の方法によって得られ得る、Ｅ１／Ｅ２複合体。
（項目１５）
前記複合体がビリオン様粒子である、項目１４に記載のＥ１／Ｅ２複合体。
（項目１６）
前記ビリオン様粒子がＣ型肝炎ウイルス非構造タンパク質および／またはＲＮＡのうちの１以上を含む、項目１５に記載のＥ１／Ｅ２複合体。
（項目１７）
Ｃ型肝炎ウイルスを処置または予防するためのワクチンであって、項目１３〜１６のいずれか一項のＥ１／Ｅ２複合体を含むワクチン。
（項目１８）
Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、および／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を導入し得る、細胞。
（項目１９）
Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の一方または両方をコードする核酸を含む細胞であって、その中に、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムおよび／またはＣ型肝炎ウイルスゲノムをコードする核酸を導入し得る、細胞。
【００１５】
（細胞）
本発明の細胞は、ＨＣＶ生活環およびその複製を支持するためにＨＣＶゲノムを発現させることができ、ＨＣＶ生活環中に産生されるＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質とは別個に、Ｅ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質を発現させ得る。したがって、ウイルスＲＮＡゲノムから翻訳されたウイルスポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングによるＥ１およびＥ２の産生が、別個の非ＨＣＶ ＲＮＡから（例えば細胞性ｍＲＮＡから）翻訳されるタンパク質によって補完される。
【００１６】
ＨＣＶのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質は本来、グリコシル化されるので、本発明では一般に真核細胞を使用する。哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む霊長類細胞を使用することが好ましい。ＨＣＶは本来、肝臓細胞に感染するので、肝臓由来の細胞を使用すると好都合である。
【００１７】
代表的には、本発明で使用される細胞は細胞株、好ましくはパッケージング細胞株である。本発明での使用に好ましい細胞株は肝細胞癌、すなわち、「Ｈｕｈ７」として知られているヒトヘパトーム細胞株に由来する［９］。最も好ましい細胞株は、「２１−５」として知られている、全長ＨＣＶ複製を支持する、Ｈｕｈ７由来の細胞株である。他の好ましい細胞株は、細胞培養下での完全な複製を支持し得るＨｕｈ７の亜系統である、Ｈｕｈ−７．５、Ｈｕｈ−７．５．１［８］およびＨｕｈ−７．８である。Ｈｕｈ７細胞（およびそれらの誘導物）の継代培養によって誘導される細胞、ならびにＨｕｈ７細胞をα−インターフェロンおよび／またはγ−インターフェロンで処理することによって誘導される細胞も、使用され得る。参考文献［１０］に開示されているように、ＨＣＶを許容する細胞株は、（ａ）ＨＣＶに感染させた細胞を培養すること；（ｂ）その細胞をＨＣＶから治癒させること；および（ｃ）その治癒細胞の亜系統であってＨＣＶ複製を許容するものを同定することを含むプロセスによって調製され得る。
【００１８】
他の樹立ヒトヘパトーム細胞株および樹立肝芽腫細胞株としては、ＨｕＨ−６ ｃｌ−５、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ｈｕＨ−１、およびｈｕＨ−４が挙げられる。Ｈｕｈ７細胞を、完全ＤＭＥＭ（例えば、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変最小必須培地）などの培地で単層として増殖させ得る。
【００１９】
特定のウイルス株には特定の細胞タイプを使用することが好ましい場合があり、逆もまた同様である。
【００２０】
本発明の細胞は、ＨＣＶゲノムからポリタンパク質を発現させると共に、補完的なＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質も発現させる。その結果、本細胞は、ビリオンおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むＨＣＶ粒子を発現させるためのタンパク質構築ブロックを含む。したがってビリオンおよびＶＬＰを本発明の細胞から調製し得る。これらはＲＮＡゲノムを含んでも含まなくてもよい。本細胞はまた、Ｅ１およびＥ２の複合体を発現させ得る。本細胞はＥ１、Ｅ２、ＮＳ３およびＮＳ５ａの複合体も発現させ得る。
【００２１】
以下でより詳細に述べるように、本発明の細胞はＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。ＨＣＶゲノムはウイルス感染によって細胞内に導入され得るか、またはウイルス感染（実際の感染または人工的感染）後もしくは当該ゲノムのＤＮＡコピーからの転写後に、インサイチュで産生され得る。ＨＣＶゲノムまたはＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡを細胞内に導入するための方法は、当技術分野では慣用されている。インビトロで転写されたＨＣＶゲノムは、参考文献４に開示されているように、エレクトロポレーションを使ってＨｕｈ７細胞内に導入され得る（１μｇの精製インビトロ転写物でエレクトロポレーションされた４×１０６個のＨｕｈ−７細胞または６０μｇのＨＣＶ ＲＮＡをエレクトロポレーションされた２．４×１０７個のＨｕｈ−７細胞）。
【００２２】
本発明の細胞は、Ｅ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質をコードする核酸も含む。そのような核酸を導入するための方法は、当技術分野では慣用されている。
【００２３】
ＨＣＶゲノムおよびＥ１／Ｅ２核酸を両方とも発現させた場合、免疫蛍光染色を用いると、ドット状粒子を見ることができる。所望であれば、細胞を（例えばエキソソームの放出を引き起こすために）適切な放出剤で処理することなどにより、細胞からのこれらの粒子の放出を促進し得る。そのような薬剤としては、アルコール、ストレス状態などが挙げられる。非共有結合的Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体は小胞体中に検出されており、この細胞区画から回収され得る。
【００２４】
（Ｃ型肝炎ウイルスゲノム）
本発明の細胞はＨＣＶゲノムおよび／またはＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む。したがって本細胞は、＋鎖一本鎖ＲＮＡゲノムを含み得るか、または転写されて直接的または間接的に＋鎖ＲＮＡゲノムを与え得る核酸を含み得る。例えば（本来のＨＣＶ生活環はＤＮＡ段階を含まないものの）ゲノムのＤＮＡコピーが正しい向きに転写されると、ＨＣＶゲノムとして作用し得る（すなわち、ＨＣＶポリタンパク質の発現を指示することができ、そしてそのポリタンパク質は、正常なＨＣＶ生活環に見られるようにプロセシングされる）ＲＮＡが生じる。
【００２５】
ＨＣＶゲノムＲＮＡは、本来、５’キャップ（ｍ７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ａ）を含み、ポリＡテールを含まず、５’非コード領域および３’非コード領域（ＮＣＲ）の両方を伴っている。本発明で使用されるＨＣＶゲノムには、代表的には、これらのエレメントが存在するが、ＨＣＶゲノムおよび／または同ゲノムをコードする核酸は、天然ゲノムには見られない１以上のエレメントを含んでもよい。例えば、インビトロ複製系で使用するＨＣＶゲノムの場合、以下のエレメントのうちの１以上を含むことが普通である：例えばポリタンパク質の上流、ゲノムの５’末端近くに、選択マーカー（ネオマイシン耐性マーカーなど）をコードする配列；たとえ他の上流コード配列が存在してもポリタンパク質の翻訳が可能であるように、例えばポリタンパク質コード配列の上流に、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（ＥＭＣＶに由来するものなど）。ゲノムの５’末端に５’Ｔ７プロモーターを持つ構築物が記述されているが［１０１］、これは好ましくない。
【００２６】
ＨＣＶゲノムは、どのタイプ（例えば１、２、３、４、５、６）でも、どのサブタイプ（１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ、１ｅ、１ｆ、１ｇ、１ｈ、１ｉ、１ｊ、１ｋ、１ｌ、１ｍ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、２ｅ、２ｆ、２ｇ、２ｈ、２ｉ、２ｋ、２ｌ、２ｍ、３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ、３ｅ、３ｆ、３ｇ、３ｈ、３ｉ、３ｋ、４ａ、４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｋ、４ｌ、４ｍ、４ｎ、４ｏ、４ｐ、４ｑ、４ｒ、４ｓ、４ｔ、５ａ、６ａ、６ｂ、６ｄ、６ｆ、６ｇ、６ｈ、６ｉ、６ｊ、６ｋ、６ｌ、６ｍ、６ｎ）でもよい。この命名法はＮＩＡＩＤの「Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ（ＨＣＶ）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」［１１］に説明されているように現在の標準であり、この命名法では、以前の遺伝子型７〜９が、参考文献１２に基づいてタイプ６のサブタイプとして再分類されている。したがって、この新しい分類には、以前の分類Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、４α、４β、７ａ、７ｂ、７ｃ／ＮＧＩＩ／ＶＩＩ、７ｄ、ＮＧＩ、８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、９ｃ、１０ａ／ＴＤ３および１１ａが含まれる。本発明での使用に適したＨＣＶ株の１つは、遺伝子型２ａのＪＦＨ１株である［６］。ＨＣＶゲノムは野生型ゲノムに対して１以上の変異（挿入、欠失および／または置換を含む）を含んでもよく、あるいは１より多くの野生型ゲノムのハイブリッド、例えばサブタイプ２ａの株（例えばＪ６）とサブタイプ１ａの株（例えばＨ７７）とのキメラなどであってもよい［７］。ウイルスＲＮＡレプリカーゼはプルーフリーディング活性を持たないので、ゲノムにおける変異は頻繁に起こり、その結果生じる変異型ゲノム（または「疑似種」）を容易に取得して解析し得る。参考文献４には、Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２８０Ｉ、Ｋ１８４６ＴおよびＳ２１９７Ｐを含め、細胞適応のための変異体が記載されている。参考文献３には、トランスフェクション効率および二次継代（ｓｕｂｐａｓｓａｇｅ）に耐える能力を増加させる変異（例えばＲ１１６４Ｇ、Ｓ１１７２Ｃ、Ｓ１１７２Ｐ、Ａ１１７４Ｓ、Ｓ１１７９Ｉ）を含むＨＣＶ改変体が記載されている。他の既知変異としては、Ｌ１７５７Ｉ、Ｎ２１０９Ｄ、Ｐ２３２７ＳおよびＫ２３５０Ｅが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。特定の宿主細胞には特定の変異を使用することが好ましい場合があり、逆もまた同様である。ＨＣＶのポリタンパク質はＣ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを全て含むことが好ましいものの、より大きな欠失および挿入も可能である（例えば、非構造タンパク質などの成熟コード領域の欠失、または非ＨＣＶ配列の挿入）。サブゲノムＨＣＶ（すなわち、全ゲノムより小さいものを含むもの；代表的には、非構造タンパク質を含むが、構造タンパク質を含まないもの；例えば全長Ｃ、全長Ｅ１、全長Ｅ２を欠いているもの）でも本発明を使用し得るが、本発明の重要な利点は、それが全長ゲノムの複製を可能にするということである。
【００２７】
本発明に従って使用されるＨＣＶゲノムには、これらおよび他の変異が存在し得るが、ＨＣＶポリタンパク質（このポリタンパク質を発現されたＨＣＶゲノムを複製し得るもの）の発現を指示するというゲノムの能力がこれらの変異によって失われることは、一般にない。
【００２８】
ＨＣＶ ＲＮＡまたはＨＣＶ ＲＮＡをコードする核酸は、細胞内に導入され得るか、または既に細胞の一部であり得る。例えば、２１−５細胞株［４］は既にＨＣＶに感染している。
【００２９】
細胞がＨＣＶゲノムをコードする核酸を含む場合、これはＤＮＡまたはＲＮＡの形態をとることができ、染色体核酸または染色体外（例えばエピソーム）核酸であり得る。ＨＣＶゲノムをコードするＤＮＡプラスミドは便利に使用し得る。
【００３０】
ＨＣＶゲノムとＥ１／Ｅ２タンパク質との両方をコードするＤＮＡを使用し得る。このＤＮＡは通常は２つの別個の転写物：（ｉ）ＨＣＶゲノム（または場合によりアンチゲノム）、および（ｉｉ）Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを有するが、（ｉ）ＨＣＶゲノム（またはアンチゲノム）およびＥ１／Ｅ２のコード配列を含み、下流配列の翻訳を制御するためにＩＲＥＳを伴う、単一の転写物を持つことも可能である。
【００３１】
ＨＣＶゲノムは代表的には、レプリコン（すなわち自分自身のコピーの生成を指示し得す核酸）の形態で含まれる。ゲノムレプリコン系またはサブゲノムレプリコン系を用いる細胞ベースのＨＣＶ複製系は周知である。レプリコンはウイルスＲＮＡのセンス鎖に基づくが、本発明では、センス鎖に変換されてレプリコンを与えることができる相補的配列を利用することもできる。レプリコンは、例えばレポーター遺伝子などの非ＨＣＶ遺伝子も含有し得る。
【００３２】
（Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸）
本発明の細胞は、Ｅ１およびＥ２の一方または好ましくは両方をコードする核酸を含む。この核酸はＨＣＶゲノムとは別個であり、ＨＣＶゲノムをコードするどの核酸とも別個である。しかし、補完的Ｅ１およびＥ２の配列は、好ましくは、ＨＣＶポリタンパク質中に見出されるＥ１配列およびＥ２配列と同じである。
【００３３】
Ｅ１および／またはＥ２をコードする核酸はＤＮＡであることも、ＲＮＡであることもできる。ＤＮＡベクターは好ましい。核酸は染色体核酸または染色体外（例えばエピソーム）核酸であり得る。
【００３４】
細胞にＥ１およびＥ２を導入するための好ましい核酸ベクターはレトロウイルスベクターであり、それは組込み型ベクターであってもよい。したがって、Ｅ１配列およびＥ２配列をレトロウイルスのＲＮＡゲノムにインサートとして導入し得る。逆転写（そして該当する場合は組込み）後は、Ｅ１配列およびＥ２配列が細胞内でＤＮＡの形態をとる。他の適切なベクターとしてはＤＮＡプラスミドが挙げられる。
【００３５】
Ｅ１およびＥ２を両方とも発現させる場合、これらは同じ核酸から発現させてもよいし、異なる核酸から発現させてもよい。例えば、両方のタンパク質をコードする１つのプラスミド（例えば２つの異なる遺伝子、またはＩＲＥＳを有する１つの遺伝子）を使用してもよく、または２つのプラスミドを使用してもよい。さらにまた、これらのタンパク質は互いに別個に翻訳されてもよいし、ＨＣＶポリタンパク質と同様にしてタンパク質分解的に切断されて分離したＥ１およびＥ２を与える単一のポリペプチドとして翻訳されてもよい。
【００３６】
Ｅ１／Ｅ２発現の制御は一般にプロモーターの制御を受ける。本発明では、構成的プロモーターを使用することも、制御可能なプロモーターを使用することもできる。好ましいプロモーターは、糖分解酵素に由来するもの、例えばホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。ヒトプロモーターが好ましく、ＨＣＶ Ｅ１および／またはＥ２は、好ましくは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ｈＰＧＫ）の制御を受ける。
【００３７】
本核酸は、Ｅ１およびＥ２を発現することに加え、ｐ７を発現してもよい。別法として、Ｅ１またはＥ２の一方のみと同じ核酸からｐ７を発現させてもよく、あるいはＥ１およびＥ２とは異なる核酸からｐ７を発現させてもよい。例えば、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７にそれぞれ１つのプラスミドを使用してもよい。
【００３８】
（Ｅ１／Ｅ２組成物）
Ｅ１およびＥ２タンパク質は、本発明に従って発現させた場合、一緒に局在することが見出された。そのため、これらを細胞から共に精製し得る。次に、Ｅ１／Ｅ２複合体（例えばヘテロ二量体）は、ＨＣＶ感染を処置および／または予防するためのワクチンなどといった免疫原性組成物において例えば活性成分として使用され得る。
【００３９】
本発明の細胞によって産生されるビリオンおよび／またはＶＬＰも、免疫原性組成物に活性成分として使用され得る。これらのビリオン／ＶＬＰにＲＮＡが含まれる場合、ＲＮＡは好ましくはサブゲノムである。
【００４０】
本発明の組成物は、薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物であり得る。そのような組成物は、Ｅ１／Ｅ２複合体を薬学的に許容され得るキャリアと混合する工程を含むプロセスを使って調製され得る。
【００４１】
代表的な「薬学的に許容され得るキャリア」としては、当該組成物を受容する個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導することのない任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きくてゆっくり代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー状アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム））などである。そのようなキャリアは当業者には周知である。ワクチンは水、食塩水、グリセロールなどの希釈剤も含有することができる。さらに、例えば湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ショ糖などの補助物質も存在し得る。無菌で発熱物質を含まないリン酸緩衝生理食塩水は代表的キャリアである（例えば注射用水に基づくもの）。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な考察は参考文献１３において入手可能である。
【００４２】
本発明の組成物は、代表的には、乾燥形態（例えば凍結乾燥形態）よりむしろ、水性形態（例えば溶液または懸濁液）である。水性組成物は、他の材料を凍結乾燥形態から再構成するのにも適している。本発明の組成物がそのような即時再構成に使用されるべきである場合、本発明はキットも提供する。このキットは、二本のバイアルを含んでもよく、または１本の充填済み注射器と１本のバイアルとを含んでもよい（注射に先だって、注射器の水性内容物がバイアルの乾燥内容物を再活性化するために使用される）。
【００４３】
本発明の組成物はバイアルに入れて提供されてもよく、または充填済み注射器に入れて提供されてもよい。注射器は針を付けて供給されてもよく、または針を付けずに供給されてもよい。組成物は１回用量型または複数回用量型に包装され得る。注射器は一般に１回用量の組成物を含む。これに対して、バイアルは１回用量または複数回用量を含むことができる。したがって、複数回量型には、バイアルの方が充填済み注射器より好ましい。
【００４４】
有効投薬体積は慣用的に確立され得るが、本組成物の代表的なヒト用量は、例えば筋肉内注射の場合、約０．５ｍｌの体積を持つ。
【００４５】
組成物のｐＨは、好ましくは６と８との間、より好ましくは６．５と７．５との間（例えば約７）である。Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液などの緩衝液を使用することにより、安定したｐＨを維持することができる。本発明の組成物は一般に緩衝液を含む。組成物が水酸化アルミニウム塩を含む場合は、例えば１〜１０ｍＭ（好ましくは約５ｍＭ）のヒスチジン緩衝液［１４］を使用することが好ましい。本組成物は無菌である、および／または発熱物質を含まないことができる。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性であり得る。組成物は、好ましくは、ＨＣＶ ＲＮＡおよび／またはＨＣＶビリオンを含まない。
【００４６】
本発明の組成物は免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防用（すなわち感染症を防止するため）であっても、治療用（すなわち感染症を処置するため）であってもよいが、代表的には予防用である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は免疫有効量の抗原を含み、必要に応じて他の任意の成分を含む。「免疫有効量」とは、その量を、単回投与で、または一連の投与の一部として、個体に投与することが、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および身体状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が持つ抗体合成能力、所望する保護の程度、ワクチンの処方、処置医による医学的状況の評価、および他の関連要因に依存して変動する。この量は、慣用的な試行によって決定することができる比較的広い範囲に収まると予想される。
【００４７】
組成物は注射剤として、液状の溶液または懸濁液の形で調製され得る。組成物は、例えば微粉末を用いた吸入器またはスプレーとして、肺投与用に調製され得る。組成物は坐剤または膣坐薬として調製され得る。組成物は、鼻、耳または眼への投与のために、例えばスプレー剤、滴剤、ゲル剤または粉末剤として調製され得る［例えば参考文献１５および１６］。筋肉内投与用の注射剤が代表的である。
【００４８】
本発明の組成物は、複数回用量形式で包装される場合は特に、抗微生物剤を含み得る。
チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗微生物剤はワクチンには一般に見出されるが、水銀を含まない保存剤を使用するか、保存剤を全く使用しないことが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物は界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含み得る。界面活性剤は一般に低レベルで、例えば＜０．０１％で、存在する。
【００５０】
本発明の組成物は、張性を得るためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含むことができる。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が代表的である。塩化ナトリウムの濃度は好ましくは約９ｍｇ／ｍｌである。
【００５１】
本発明の組成物は一般に、他の免疫調節剤と一緒に投与される。特に、組成物は通常、１以上のアジュバントを含む。そして本発明は、本発明の組成物を調製するためのプロセスであって、本発明の小胞をアジュバントと、例えば薬学的に許容され得るキャリア中で混合する工程を包含するプロセスを提供する。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：
（Ａ．無機物含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が含まれる。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの無機塩［例えば参考文献１７の第８章および第９章を参照されたい］、または異なる無機化合物の混合物を包含し、化合物は任意の適切な形態（例えばゲル、結晶、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子として処方され得る［１８］。
【００５２】
代表的なリン酸アルミニウムアジュバントは、０．６ｍｇ Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる、ＰＯ４／Ａｌモル比が０．８４と０．９２との間の非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムによる吸着（例えば１用量あたり１コンジュゲートあたり５０〜１００μｇ Ａｌ３＋）を使用し得る。リン酸アルミニウムを使用し、抗原をアジュバントに吸着させないことを望む場合は、（例えばリン酸緩衝液を使用することにより）溶解した状態の遊離リン酸イオンを含めることが好ましい。
【００５３】
アルミニウムアジュバントの代表的な用量は約３．３ｍｇ／ｍｌ（Ａｌ３＋濃度として表現）である。
【００５４】
（Ｂ．油エマルジョン）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９［参考文献１７の第１０章；参考文献１９も参照されたい］（マイクロフルイダイザーを使ってサブミクロン粒子へと処方された５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用され得る。
【００５５】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１７の第２２章］）
本発明ではサポニン処方物もアジュバントとして使用し得る。サポニンは、広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、幹、根、そしてさらには花にも見出される異種のステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体群である。キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から得られるサポニンはアジュバントとして広く研究されてきた。Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサプリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ）由来のサポニンも市販されている。サポニンアジュバント処方物としては、ＱＳ２１などの精製処方物の他、ＩＳＣＯＭなどの脂質処方物も挙げられる。ＱＳ２１はＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
【００５６】
サポニン組成物はＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使って精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含め、これらの技法を使った特定の精製画分が同定されている。サポニンは好ましくはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生産方法は参考文献２０に開示されている。サポニン処方物はコレステロールなどのステロールも含み得る［２１］。
【００５７】
サポニン類とコレステロール類との組み合わせを使って、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成させることができる［参考文献１７の第２３章］。ＩＳＣＯＭは代表的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。既知のサポニンはどれでもＩＳＣＯＭに使用し得る。ＩＳＣＯＭは、好ましくは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１以上を含む。ＩＳＣＯＭは参考文献２１〜２３にさらに詳しく記述されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは余分な界面活性剤を欠いてもよい［２４］。
【００５８】
サポニンベースのアジュバントの開発に関する総説は、参考文献２５および２６に見出すことができる。
【００５９】
（Ｄ．ビロゾームおよびウイルス様粒子）
本発明ではビロゾームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もアジュバントとして使用され得る。これらの構造物は一般に、ウイルスに由来する１以上のタンパク質を含有し、このタンパク質は、必要に応じて、リン脂質と組み合わされるか、またはリン脂質を使って処方される。これらは一般に非病原性、非複製性であり、一般に天然ウイルスゲノムを一切含有しない。ウイルスタンパク質は組換え生産されるか、またはウイルス全体から単離され得る。ビロゾームまたはＶＬＰでの使用に適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質（コアタンパク質またはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルスに由来するタンパク質、麻疹ウイルスに由来するタンパク質、シンドビスウイルスに由来するタンパク質、ロタウイルスに由来するタンパク質、口蹄疫ウイルスに由来するタンパク質、レトロウイルスに由来するタンパク質、ノーウォークウイルスに由来するタンパク質、ヒトパピローマウイルスに由来するタンパク質、ＨＩＶに由来するタンパク質、ＲＮＡファージに由来するタンパク質、Ｑβファージに由来するタンパク質（コートタンパク質など）、ＧＡファージに由来するタンパク質、ｆｒファージに由来するタンパク質、ＡＰ２０５ファージに由来するタンパク質、およびＴｙに由来するタンパク質（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）が挙げられる。ＶＬＰは参考文献２７〜３２でさらに詳しく論じられている。ビロゾームは例えば参考文献３３でさらに詳しく論じられている。
【００６０】
（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明での使用に適したアジュバントとしては、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体などといった細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられる。
【００６１】
ＬＰＳの無毒性誘導体としてはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４，５または６アシル化鎖を持つ３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。好ましい「小粒子」状の３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡが参考文献３４に開示されている。３ｄＭＰＬのそのような「小粒子」は、０．２２μｍ膜による滅菌濾過が可能なほど小さい［３４］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体、例えばＲＣ−５２９などの、モノホスホリルリピドＡ模倣物が挙げられる［３５，３６］。
【００６２】
リピドＡ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に由来するリピドＡの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は例えば参考文献３７および３８に記載されている。
【００６３】
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によってグアノシンに連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含有する二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。
【００６４】
これらのＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含むことができ、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献３９、４０および４１には、例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによるグアノシンの置換など、可能な類似体置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント作用は、参考文献４２〜４７で、さらに論じられている。
【００６５】
モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に関し得る［４８］。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的（例えばＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）であってもよく、またはＢ細胞応答の誘導に特異的（例えばＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）であってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは参考文献４９〜５１で論じられている。ＣｐＧは、好ましくは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【００６６】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、好ましくは、５’末端を受容体認識に利用することができるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端で結合して、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成させてもよい。例えば参考文献４８および５２〜５４を参照されたい。
【００６７】
本発明では細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体をアジュバントとして使用し得る。このタンパク質は、好ましくは、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰリボシル化毒素の使用は参考文献５５に、また非経口アジュバントとしての使用は参考文献５６に記載されている。この毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットを両方とも含むホロ毒素の形態にある。Ａサブユニットは、好ましくは、無毒化変異を含有し、Ｂサブユニットは、好ましくは、変異していない。アジュバントは、好ましくは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴ−Ｇ１９２などの無毒化ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献５７〜６４に見出すことができる。アミノ酸置換に関する参照番号は、好ましくは、参考文献６５に記載されているＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列に基づき、この参考文献は、参照によりその全体が、特に本明細書に援用される。
【００６８】
（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質としては、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［６６］など）［６７］、インターフェロン（例えばインターフェロンγ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが挙げられる。
【００６９】
（Ｇ．生体接着剤および粘膜付着剤）
本発明では生体接着剤および粘膜付着剤もアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着剤としては、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［６８］または粘膜付着剤（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。本発明ではキトサンおよびその誘導体もアジュバントとして使用し得る［６９］。
【００７０】
（Ｈ．微粒子）
本発明では微粒子もアジュバントとして使用し得る。生分解性であってかつ無毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）が好ましい）から形成され、そして必要に応じて、（例えばＳＤＳで）負に荷電した表面を持つように処理されるかまたは（例えばＣＴＡＢなどのカチオン性界面活性剤で）正に荷電した表面を持つように処理された、微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。
【００７１】
（Ｉ．リポソーム（参考文献１７の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用に適したリポソーム処方物の例は、参考文献７０〜７２に記載されている。
【００７２】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明での使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［７３］。そのような処方物には、さらに、オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［７４］、ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［７５］が含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【００７３】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ製剤は、例えば参考文献７６および７７に記載されている。
【００７４】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【００７５】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例としては、イミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその同族体（例えば「レシキモド３Ｍ」）が挙げられ、それらは参考文献７８および７９にさらに記述されている。
【００７６】
本発明は、上述したアジュバントのうちの１以上の局面の組み合わせも含み得る。例えば、本発明では以下のアジュバント組成物を使用し得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８０］；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）［８１］；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［８２］；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［８３］；（６）１０％スクアラン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦであって、マイクロフルイダイザーでサブミクロンエマルジョンにするか、ボルテックスによってさらに大粒径のエマルジョンを生成させたもの；（７）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群より選択される１以上の細菌細胞壁成分（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含有する、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１以上の無機塩（アルミニウム塩など）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（３ｄＭＰＬなど）。
【００７７】
免疫刺激剤として作用する他の物質が、参考文献１７の第７章に開示されている。
【００７８】
アルミニウム塩アジュバントの使用は特に好ましく、一般的には抗原をそのような塩に吸着させる。本発明の組成物では、抗原の一部は水酸化アルミニウムに吸着させるが、他の抗原はリン酸アルミニウムと会合させておくということも可能である。しかし一般的には、塩を１つだけ使用し（例えば水酸化物だけまたはリン酸塩だけを使用し）、両方は使用しないことが好ましい。全ての小胞を吸着させる必要はない。すなわち一部または全部が溶解状態で遊離していてもよい。
【００７９】
（処置の方法）
本発明は、哺乳動物の免疫応答を惹起するための方法であって、その哺乳動物に本発明の薬学的組成物を投与することを包含する方法も提供する。免疫応答は、好ましくは防御であり、好ましくは抗体が関与する。本方法では、ＨＣＶに対する初回免疫を既に受けている患者における追加免疫応答を惹起することもできる。
【００８０】
哺乳動物は好ましくはヒトである。ワクチンが予防用である場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば幼児もしくは乳児）またはティーンエージャーであり、ワクチンが治療用である場合、ヒトは、好ましくは、成人である。小児用のワクチンを、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与してもよい。
【００８１】
本発明は、医薬として使用するための本発明のＥ１／Ｅ２複合体も提供する。この医薬は、好ましくは、哺乳動物の免疫応答を惹起することができ（すなわち免疫原性組成物であり）、より好ましくはワクチンである。
【００８２】
本発明は、哺乳動物の免疫応答を惹起するための医薬の製造における本発明のＥ１／Ｅ２複合体の使用も提供する。
【００８３】
これらの使用および方法は、好ましくは、ＨＣＶによって引き起こされる疾患（例えば肝炎）の予防用および／または処置用である。
【００８４】
治療的肝炎処置の効力をチェックするための方法は当技術分野では知られている。予防的処置の効力をチェックする一方法では、当該組成物の投与後に、Ｅ１／Ｅ２抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を含む。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験対象（例えば１２〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル）に投与した後、ＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）などの標準的パラメータを決定することによって決定され得る。これらの免疫応答は一般に、組成物投与の約４週間後に決定され、組成物の投与前に決定した値と比較される。
【００８５】
一般に、本発明の組成物は、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射、もしくは組織の間質腔への注射）によって、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所外用、経皮投与、鼻腔内投与、眼投与、耳投与、肺投与もしくは他の粘膜投与によって、達成され得る。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば皮下針）を通して行なわれ得るが、これに代えて無針注射を使用してもよい。代表的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【００８６】
投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールで使用され得る。一次投与スケジュールに続いて、追加投与スケジュールを行なうことができる。初回投与間（例えば４〜１６週間）および初回投与と追加投与との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【００８７】
本発明は全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために使用され得る。
【００８８】
（一般事項）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む」組成物は、もっぱらＸからなってもよいし、何か他のものを含んでもよい（例えばＸ＋Ｙ）。
【００８９】
数値ｘに関して「約」という用語は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９０】
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除しない。例えばＹを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合は、「実質的に」という用語を本発明の定義から省略することができる。
Ｃ型肝炎ウイルスに関する詳細な情報は、その生活環、複製、培養条件、ゲノム、ポリタンパク質、タンパク質分解プロセッシングなどを含めて、参考文献８４の第３２〜３４章に見出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、ｒｖＥ１８０９（Ｒ８０９）レトロウイルスベクターを生成させ、細胞をそれに感染させるために使用した方法の概略図を示す。
【図２】図２は、Ｒ８０９ベクターをトランスフェクトしたＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７または２１−５細胞のウェスタンブロットを示す。染色抗体は抗Ｅ１／Ｅ２である。
【図３】図３は、抗Ｅ１Ｅ２、抗コアまたは抗Ｅ２を使った免疫沈降後の、抗Ｅ１／Ｅ２抗体で染色した、２１−５細胞および培養上清のウェスタンブロットを示す。図３は非還元ゲルである。
【図４】図４は、抗Ｅ１Ｅ２、抗コアまたは抗Ｅ２を使った免疫沈降後の、抗Ｅ１／Ｅ２抗体で染色した、２１−５細胞のウェスタンブロットを示す。図４は還元ゲルである。
【図５】図５は、図３と同様であるが、染色抗体は抗Ｅ１／Ｅ２ではなく抗コアである。
【図６】図６は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２または抗コアのいずれかで染色した。これら２つの個別の染色を重ね合わせると、Ｅ１／Ｅ２とコアとが一緒に局在することが示される。
【図７】図７は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２または抗コアのいずれかで染色した。これら２つの個別の染色を重ね合わせると、Ｅ１／Ｅ２とコアとが一緒に局在することが示される。
【図８】図８は、個々の２１−５／Ｒ８０９細胞の免疫蛍光解析を示す。Ｅ１／Ｅ２を発現させる細胞の一部はコアタンパク質を発現しておらず、コアを発現する細胞の一部はＥ１／Ｅ２を発現していなかった。
【図９】図９は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。Ｅ１およびＥ２は、さまざまな形状、寸法および個々の分布を持つ「ドット」に構造化される。
【図１０】図１０は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。Ｅ１およびＥ２の「ドット」は、非構造タンパク質ＮＳ３と部分的に一緒に局在することを示す。
【図１１】図１１は、ＨＣＶレプリコンを欠くＨｕｈ７／Ｒ８０９の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２で染色した。Ｅ１／Ｅ２はドット状の分布を示すが、標識は２１−５／Ｒ８０９細胞の場合の約５分の１だった。
【図１２】図１２は、約３μｍの最大長を持つ細胞に沿ったＥ１／Ｅ２の分布の３次元グラフィック表示を示す。
【図１３】図１３は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２と抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０のいずれかとで染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２は標準的なＥＲマーカーであるＣＮＸおよびＥＲＰ６０と全く一緒に局在しないことが示唆される。
【図１４】図１４は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２と抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０のいずれかとで染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２は標準的なＥＲマーカーであるＣＮＸおよびＥＲＰ６０と全く一緒に局在しないことが示唆される。
【図１５】図１５は、２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２および抗ＧＭ１３０で染色した。重ね合わせにより、Ｅ１／Ｅ２とＧＭ１３０とは一緒に局在しないことが示唆される。
【図１６】図１６は、ＩＦＮ−αによる細胞培養物の処理前および処理後の２１−５／Ｒ８０９細胞の細胞内免疫蛍光解析を示す。細胞を抗Ｅ１／Ｅ２で染色した。ＩＦＮ−αで処理した細胞は、Ｅ１およびＥ２の代表的なＥＲパターン分布を失う。
【図１７】図１７は、細胞培養物のＩＦＮ−α処理後のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを示す。
【図１８】図１８は、細胞培養物のＩＦＮ−α処理後のリボソームＲＮＡのレベルを示す。
【図１９】図１９は、分画遠心分離後の画分のウェスタンブロットを示す。
【図２０】図２０は、Ｅ１およびＥ２の大半がＮＰ−４０耐性膜と会合し、細胞内脂質ラフトのマーカーであるカベオリン−２と一緒に分画されることを実証する膜浮遊解析の結果を示す。
【図２１】図２１は、レプリコン細胞株におけるＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１／Ｅ２の発現を示す。（Ａ）ＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌタンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ＨＩＶ調節タンパク質ｒｅｖをコードするプラスミド、ならびにヒトホスホグリセロキナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターの制御下にキャプシド形成シグナルおよびＥ１Ｅ２ｐ７転写単位をコードする自己不活化型レンチウイルスベクターを同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で、ＶＳＶ−シュードタイプ粒子を産生させた。（Ｂ）Ｈｕｈ−７および２１−５形質導入細胞株におけるＥ１／Ｅ２発現を、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９を用いる免疫蛍光解析によって検出した［８５］。Ｅ１／Ｅ２は赤色で視覚化され、青色は核のＤＡＰＩ染色を表す。（Ｃ）２１−５および２１−５ Ｒ８０９から得た細胞溶解物を、コンフォメーショナルモノクローナル抗体ＣＢＨ−２で免疫沈降させ、その免疫沈降物を抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９でブロットして、Ｅ１およびＥ２の両方を明らかにした。
【図２２】図２２は、ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が、コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａと一緒に局在することを示す。接種の１日後に、２１−５および２１−５Ｒ８０９を、コア、ＮＳ３またはＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体（元は緑色として検出される）と抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色として検出される）とで二重染色した。
【図２３】図２３は、ＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の、新生ＲＮＡが一緒に局在することを示す。（Ａ）接種の１日後に、２１−５Ｒ８０９細胞を固定し、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、ＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体７−Ｄ４（元は緑色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は青色）で染色した。（Ｂ）リポフェクトアミン２０００を使って２１−５Ｒ８０９をトランスフェクトし、そしてＢｒＵＴＰで２時間または４時間、標識した。細胞を、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、ＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は青色）、およびＢｒｄＵＴＰに対するモノクローナル抗体（元は緑色）で染色した。（Ｃ）では、細胞を４時間パルスし、（Ｂ）と同様に染色した。底面および側面の帯は、表示した線を通るｚ切片を表し、斑紋様構造をしたＥ１／Ｅ２、ＮＳ３およびＲＮＡが一緒に局在することを示している。バーは５μｍ。
【図２４】図２４は、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を支持する異なる細胞株におけるＨＣＶ非構造タンパク質の分布を示す。接種の１日後に、全長レプリコンを保有する２１−５、サブゲノムレプリコンを保有するＮＳ３−３’およびＮＳ３−３’Ｒ８０９を固定し、ＮＳ５Ａに対するマウスモノクローナル抗体７−Ｄ４（元は赤色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は緑色）で染色した。下のパネルでは、挿入図は、抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は青色）によるＥ１／Ｅ２染色を示す。バーは５μｍ。
【図２５】図２５は、ＨＣＶ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２の細胞内局在を示す。（Ａ）２１−５Ｒ８０９を固定し、そして示した抗体で染色した。組み合わせた画像だけを示す。（Ｂ）抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９（元は赤色）、カルネキシンに対するウサギポリクローナル抗体（元は緑色）およびＮＳ３に対するマウスモノクローナル抗体ＭＭＭ３３（元は真ん中のパネルでは赤色、または下のパネルでは緑色）で染色した２１−５Ｒ８０９細胞の拡大像。バーは２．２μｍ。
【図２６】図２６は、ＨＣＶタンパク質の細胞成分分画および界面活性剤可溶化を示す。（Ａ）２１−５Ｒ８０９細胞から得た細胞溶解物をそのまま処理しないか、１％ＴＸ−１００により氷上で処理するか、１％ＴＸ−１００により３７℃で処理した。不連続ショ糖密度勾配遠心分離によって細胞成分分画を行なった。勾配の上端から下端まで画分を集めた。回収した画分を、等体積ずつ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、ニトロセルロース膜に転写し、Ｅ１／Ｅ２に対する抗体、ＮＳ３に対する抗体、コアに対する抗体、カベオリン−２に対する抗体、カルネキシンに対する抗体で免疫ブロットした。画分には上端から下端に向かって１から１１までの番号を付ける。（Ｂ）収集した画分の密度プロファイル。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
（発明を実施するための形態）
（ＨＣＶゲノムレプリコン系における糖タンパク質発現の補強）
ＨＣＶ複製／集合複合体の性質および細胞内区画化を明確にするために、本発明者らは、全長遺伝子型１ｂレプリコンを保有する２１−５細胞におけるＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の局在を調べた［４］。これらの細胞では、ノーザンブロットによって持続的ＲＮＡ複製が証明され、ウェスタンブロットおよび３５Ｓ−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ標識と、それに続く免疫沈降によって、タンパク質発現が証明された。これらの技法を使って、本発明者らは、細胞抽出物におけるコア、ＮＳ３、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂの存在を明らかにした。意外なことに、ウェスタンブロット法、代謝標識法、または免疫蛍光解析法では、Ｅ１およびＥ２の発現を検出することができなかった。
【００９３】
この低い糖タンパク質発現レベルが、この系がウイルス粒子を産生できないことの原因になっているかどうかを決定するために［４］、本発明者らは、レンチウイルスベクターによる遺伝子導入を使って、２１−５細胞にＥ１およびＥ２の安定な発現を提供することにした［８６］。本発明者らは、ＨＣＶ１ａ遺伝子型のＥ１Ｅ２ｐ７コード領域を、自己不活化型レンチウイルスベクターにおいて、遍在発現されるホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫｐ）の下流にクローニングし［８７］、ＶＳＶシュードタイプ粒子を生成させた。
【００９４】
（細胞株）
この研究では、以下の３つの異なる細胞株を使用した：１）ナイーブＨｕｈ７；２）全長レプリコンＩ３８９ｎｅｏ／ｃｏｒｅ−３’／５．１を持つＨｕｈ−２１−５［４］、サブゲノムレプリコンＩ３８９ｎｅｏ／ＮＳ３−３’を持つＨｕｈ−５−１５［１］。これらの細胞を、ＨＣＶレプリコンを保持する細胞株については、完全ＤＭＥＭ＋Ｇ４１８（ジェネティシン；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増殖させた（Ｈｕｈ−２１−５には２５０μｇ／ｍｌ；Ｈｕｈ−５−１５には７５０μｇ／ｍｌ）。Ｈｕｈ７細胞および２１−５細胞［４］は供給業者から入手した。比較のためにＨｅｐＧ２細胞も使用した。Ｈｕｈ７細胞はＨＣＶに感染していないが、２１−５細胞は感染している。
【００９５】
（レンチウイルスベクターの作製およびＨＣＶレプリコン細胞株の形質導入）
ＰＧＫ／ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ｐ７レンチウイルスベクターを生成させるために、本発明者らは、Ｔｙｒ１６４の上流にＭｅｔ残基が付加され、Ａｌａ８０９の下流に停止コドンが付加されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使って、ＨＣＶ１ａ遺伝子型のＴｙｒ１６４からＡｌａ８０９までをコードする１９３５塩基対断片を増幅した。本発明者らは、自己不活化型レンチウイルスベクターｐＣＣＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．Ｗｐｒｅ［８８］，［８７］の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、増幅したＥ１Ｅ２ｐ７断片で置き換えた。
【００９６】
図１に示すプロセスにより、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を調製した。ウイルスＬＴＲが両側に隣接した、Ｅ１タンパク質、Ｅ２タンパク質およびｐ７タンパク質をコードするＤＮＡ（１０μｇのｐＣＣＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．Ｅ１Ｅ２ｐ７）を、１０ｃｍディッシュにプレーティングしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、リン酸カルシウム法で、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）をコードするＤＮＡ（３．５μｇ）、（ｉｉ）ＲＳＶプロモーターの制御下にあるＲＥＶをコードするＤＮＡ（２．５μｇ）、および（ｉｉｉ）ＣＭＶプロモーターの制御下にあるＧＡＧおよびＰＯＬをコードするＤＮＡで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、Ｅ１Ｅ２ ＲＮＡを含有するレトロウイルス粒子を産生し、これらの粒子を、そのＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物の上清から集めることができた。ウイルス上清の収集は、トランスフェクションの２４時間後と４８時間後とで２回行なった。０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチューセッツ州ベッドフォード）を通して濾過した後、超遠心分離によってレンチウイルスベクターを濃縮した。精製された粒子（５０μｌまたは１００μｌのいずれか）を使用し、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）の存在下に、３７℃および５％ＣＯ２で、濃縮レンチウイルスベクターに６時間曝露することにより、ナイーブＨｕｈ−７、Ｈｕｈ−５−１５または２１−５細胞を感染させ、形質導入の９６時間後に、これらの細胞を、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質の発現について、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット法で解析した。このレトロウイルスベクターを「ｒｖＥ１８０９」または「Ｒ８０９」と名付けた。
【００９７】
ナイーブＨｕｈ−７細胞および２１−５細胞のレンチウイルス形質導入は、どちらも非常に効率よく起こり、透過処理した細胞のＦＡＣＳ解析によって評価したところ、これらの細胞のほとんど１００％で、ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２の安定な発現を可能にした。本発明者らは、ＨＣＶ−１ａ Ｅ１Ｅ２ｐ７で形質導入された細胞をＲ８０９と呼ぶ。
【００９８】
ウェスタンブロットで抗Ｅ１／Ｅ２抗体を使用したところ、Ｅ１およびＥ２がＨｕｈ７細胞と２１−５細胞とのどちらにも見られた（図２）。この解析により、Ｅ１およびＥ２が必要なシグナルペプチダーゼによってプロセシングされることも確認された。
【００９９】
抗Ｅ１Ｅ２、抗コアおよび抗Ｅ２（「Ｈ２」）抗体を使用し、２１−５細胞で、免疫沈降実験を行なった。図３（非還元ゲル）および図４（還元ゲル）のウェスタンブロットは抗Ｅ１Ｅ２抗体で染色したものであり、Ｒ８０９ベクターを持たない２１−５細胞ではＥ１発現が検出されないこと；Ｅ１は抗Ｅ２モノクローナル抗体によって共沈されるので、Ｅ１とＥ２はヘテロ二量体として安定に会合していること；そして抗コア抗体はＥ１もＥ２も沈降させないので、Ｅ１／Ｅ２はコアとは会合していないことを示している。図５のウェスタンブロットは抗コア抗体で染色したものであり、コアタンパク質はＲ８０９ベクターを含む２１−５細胞またはＲ８０９ベクターを含まない２１−５細胞によって発現されるが、抗コアモノクローナル抗体によって沈降されないことを示している。３５Ｓ−Ｍｅｔ標識でもＥ１／Ｅ２発現を検出することができた。
【０１００】
（免疫蛍光染色および共焦点顕微鏡法）
細胞を、２４ウェルプレート中の３０ｍｍカバースリップ上に、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度でプレーティングした。プレーティングの１日後に、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した後、ＰＢＳ中の０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で１５分間透過処理した。次に、製造者の指示に従って、細胞をブロッキング溶液（ＰＢＳ中の０．５％ウシ血清アルブミン）で３０分間、前処理し、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｏｕｒコンジュゲート二次抗体を、１：２００の希釈率で、室温で１時間、細胞に加えた。ＰＢＳで洗浄した後、カバースリップを蒸留水で洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）と共に水性封入媒体Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで封入した。
【０１０１】
２１−５／Ｒ８０９細胞の免疫蛍光解析は、Ｅ１とＥ２とが一緒に局在すること（細胞の２０〜３０％にドット）を示し、コアタンパク質がＥ１／Ｅ２複合体と共に蓄積していることも示した（図６および図７）。抗コアによる可視蛍光スポットは、抗Ｅ１／Ｅ２で見られるものと、同じ形状を持っていた。図７に示すように、一部の例では、スポットが部分的にしか重なっていないことから、コアタンパク質とＥ１／Ｅ２タンパク質とは、同じドットに蓄積しようと試みていることが示唆された。異なる細胞を個別に調べたところ、Ｅ１／Ｅ２ドットを持つ一部の細胞はコアタンパク質を発現せず、コアドットを持つ細胞の一部は、Ｅ１／Ｅ２を発現しなかったので（図８）、細胞は均質ではなかった。しかし、コアとＥ１／Ｅ２とをどちらも発現させる細胞は、他の細胞から容易に識別され得、そして分離することができた。Ｅ１／Ｅ２スポットの形状、寸法および細胞内分布もさまざまだった（図９）。この変動性は、ウイルス疑似種の相違、トランスフェクション効率の相違（異なるクローン）に起因し得るか、またはそれは、ウイルス生活環の異なる段階にある同一の細胞であり得る。
【０１０２】
ＨＣＶ糖タンパク質の細胞内分布を可視化するために、Ｈｕｈ−７細胞、Ｈｕｈ−７Ｒ８０９細胞、２１−５細胞および２１−５Ｒ８０９細胞で、さらなる免疫蛍光解析を行なった。図２１Ｂに示す実験では、Ｅ１とＥ２との両方を明らかにするために、本発明者らは抗Ｅ１／Ｅ２チンパンジー抗血清Ｌ５５９［８５］を使用した。しかし、ヒト起源またはマウス起源のモノクローナル抗Ｅ２抗体を使った場合にも、同様のパターンが得られた。Ｈｕｈ−７Ｒ８０９および２１−５Ｒ８０９はどちらも、Ｅ１／Ｅ２の発現レベルに大きな変動性を示した（図２１Ｂの上のパネル）が、これはおそらくそれらの起源がクローン性でないという事実に依存する。全体としてＥ１／Ｅ２はＥＲ様分布を持つようだったが、細胞の有意なサブセットが、サブゲノムレプリコンを保有する細胞で記載されているＮＳ３およびＮＳ５Ａに富むドット状構造［８９〜９２］に似たドット状構造へのこれら２つの構造タンパク質の濃縮を示した（図２１Ｂ）。代表的な細胞の拡大図によって証明されるように、これらの構造はどちらの細胞タイプにも存在したが、それらの構造の形状および局在は同等ではなかった（図２１Ｂの下のパネル）。一般的所見として、Ｈｕｈ−７では、ドット状構造がより散漫に見え、細胞の辺縁部にある程度局在しているのに対して、２１−５Ｒ８０９では核の近くに、より密集してみえた。
【０１０３】
（２１−５Ｒ８０９におけるＥ１／Ｅ２と他のＨＣＶタンパク質との一緒の局在）
さらなる実験により、Ｅ１／Ｅ２はＮＳ３（図１０）およびＮＳ５ａとも一緒に局在することが示された。
【０１０４】
サブゲノムレプリコンの活発なＲＮＡ複製を支持するＨｕｈ−７細胞では、ＮＳ３とＮＳ５Ａがどちらも、新たに合成されたＨＣＶ ＲＮＡと共に、ＨＣＶ複製複合体を表し得る明確なドット状構造上に局在することが示されている［９０、９１、９３］。さらにまた、ＨＣＶ非構造タンパク質を含有する精製された膜画分は内在性レプリコンＲＮＡに会合することも見出され、ｄＮＴＰ類が供給されると、このＲＮＡをインビトロで複製することができた［８９〜９２，９４〜９７］。２１−５Ｒ８０９細胞では、Ｅ１／Ｅ２も、ドット状の形状をした稠密構造に組織化されることを、本発明者らは明らかにした。次に、本発明者らは、２１−５および２１−５Ｒ８０９細胞において、非構造ＨＣＶタンパク質も何らかの種類の構造に組織化されるかどうか、そしてＥ１／Ｅ２との一緒の局在が存在するかどうかを、決定しようとした。本発明者らは、Ｌ５５９抗血清によってＥ１／Ｅ２を明らかにする共焦点顕微鏡法を、それぞれコア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａと組み合わせて行なった。結果を図２２に示す。
【０１０５】
左側のパネルでは、全長レプリコンを保有する２１−５細胞における、コア（上）、ＮＳ３（真ん中）およびＮＳ５Ａ（下）の分布が、明らかにされた。これらの細胞では、コア、ＮＳ３およびＮＳ５Ａが、一定数の稠密局在領域を持つＥＲ様分布を示した。コアタンパク質は、かなりの数のドット状構造を形成すると共に、文献（３４）に記載されているように輪状構造もいくつか形成するようだった。２つのＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ３およびＮＳ５Ａは、よりＥＲ様の分布パターンを示し、小さなドットが主に核周囲領域に局在していた（図２２の左側のパネルの真ん中の段および下段）。このように、ＮＳ３およびＮＳ５Ａのパターンは、より大きな多数のドットの形成が記述されているサブゲノムレプリコンを保有する細胞に見出されるパターン［９０〜９３，９８］とは異なるようだった。これらのタンパク質の分布パターンは、Ｅ１およびＥ２が高レベルに発現される２１−５Ｒ８０９細胞では、異なるように見えた（図２２，右側のパネル）。この場合、コアタンパク質、ＮＳ３タンパク質およびＮＳ５Ａタンパク質は、弱いＥＲ様分布を伴うドット状構造を形成した。注目すべきことに、Ｅ１／Ｅ２が形成するドットは、コア、ＮＳ３またはＮＳ５Ａによって形成される同様の構造との強い、一緒での局在を示した（図２２、右側のパネル）。一方、散漫なＥＲ様パターンは、個別に解析した４つのタンパク質に関して類似していたが、これらの化学種の厳密な一緒の局在はもたらさなかった。
【０１０６】
さらにまた、抗アイソタイプ・フルオレシネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎａｔｅ）二次抗体を使って、２１−５Ｒ８０９細胞におけるＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＥ１／Ｅ２の同時染色を達成した。ＮＳ５Ａに代えて、新生細胞質ＲＮＡを抗ＢｒＵＴＰ抗体で標識した。これらの実験で得た結果を図２３に示す。組合せ写真で得られる色により、任意の組み合わせでの異なる化学種の一緒の局在が明らかになった。ＮＳ３化学種とＥ１／Ｅ２、およびＮＳ５ＡまたはウイルスＲＮＡとの会合は、青色がより明るくなることによって明らかになった。Ｅ１／Ｅ２とＮＳ５Ａ（またはウイルスＲＮＡ）とが一緒に局在することによって黄色が生成したのに対して、白色の領域は３つ全ての化学種の完全な一緒の局在を示した。図２３Ｃでは、三重に染色したこれらドット状構造の一部を、ｚ切片でも示す（上側および右側の帯）。
【０１０７】
図２３Ａに示すように、Ｅ１／Ｅ２とＮＳ３またはＮＳ５Ａのいずれかとの幅広い一緒の局在が観察された。さらにまた、これらのドット状構造のいくつかは、解析した３つの化学種全てについて陽性だった。これらの知見は、全ての化学種が一緒に局在している構造を生成させる、このレプリコンを背景として発現されるＨＣＶタンパク質の共通する分布を示唆している。
【０１０８】
類似する状況が、他のウイルスタンパク質と比較した新生ウイルスＲＮＡの分布にも観察された（図２３Ｂおよび図２３Ｃ）。これらの実験では、免疫蛍光染色および共焦点解析のために固定する前に、細胞を、アクチノマイシンＤの存在下に、ＲＮＡ前駆体ＢｒＵＴＰで２時間および４時間処理した。図２３Ｂに示すように、２時間パルスでは、新生ＲＮＡが、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３も蓄積しているドットに対応する不連続な構造と会合していた。細胞をＢｒＵＴＰでさらに長い期間（４時間）パルスすると、標識されたウイルスＲＮＡは、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３と共にドット内に見出すことができるだけでなく、細胞全体にも広がっていた（図２３Ｃ）。これは、複製されなければならないウイルスゲノムを構成するが、メッセンジャーとしても機能するという、ＨＣＶ ＲＮＡが持つ二重の機能と合致する。非構造タンパク質と新生ＲＮＡとが一緒に局在することは、ウイルス複製複合体を表すと報告されている［８９〜９２］。本発明者らのデータは、上記２つのＨＣＶ糖タンパク質も、それらを発現させた場合には、これらの複合体とも会合することを示唆している。
【０１０９】
免疫蛍光ドットの共焦点顕微鏡法により、Ｅ１／Ｅ２ラベルは、約３μｍの最大長の細胞に沿って分布することが明らかになった。このことは、管状構造を示唆する（図１１）。
【０１１０】
Ｒ８０９ベクター（すなわち、ＨＣＶが存在しないもの）でトランスフェクトしたＨｕｈ７細胞も、Ｅ１／Ｅ２ドットを示したが、標識は２１−５細胞の５分の１程度（５０％対１０％）であり、細胞内分布はわずかに異なるようだった（図１２）。これは、Ｒ８０９ベクターから発現されるＥ１およびＥ２は細胞内で集合できるが、それらはコア（および他の）タンパク質がなければウイルス自己集合をさらに進めることができないことを示唆している。
【０１１１】
（Ｅ１／Ｅ２の細胞内局在）
ほとんどの報告では、ＨＣＶタンパク質はＥＲ膜またはＥＲ由来の膜に会合すると記述されており、一部の研究では、ゴルジ装置またはトランスゴルジ網の関与が指摘されている［８９，９０，９２，９８〜１００］。本発明者らは、２１−５Ｒ８０９細胞におけるＥ１／Ｅ２の位置を、共焦点解析により、これら２つのＨＣＶ糖タンパク質とさまざまな細胞区画の既知マーカーとの同時標識によって捉えようとした。
【０１１２】
簡単に述べると、細胞内局在を評価するために、細胞を抗カルネキシン（ＣＮＸ）または抗ＥＲＰ６０（どちらも小胞体（それぞれ膜および内腔）のマーカーである）でも染色した。Ｅ１／Ｅ２はＣＮＸと完全には一緒に局在せず、一部のＥ１／Ｅ２は細胞の周辺部に見られたことから、このタンパク質複合体はＥＲを超えて進行していたことが示唆される（図１３および図１４）。次に細胞を、シスゴルジのマーカーである抗ＧＭ１３０で標識した。Ｅ１／Ｅ２とＧＭ１３０とが一緒に局在していることは見られなかった（図１５）。Ｅ１／Ｅ２はエンドグリコシダーゼＨ処理に対して感受性であったことから、それらはＥＲに保持されていることが示された。
【０１１３】
より詳細に述べると、図２５Ａに示すこのような解析の結果から、本発明者らは、Ｅ１／Ｅ２はゴルジ装置（ＧＭ−１３０）にもミトコンドリア（ＴＣＰ１）にも一緒に局在はせず、かつこれらは微小管（α−チューブリン）に結合せず、カベオリン−２にも会合しないと結論することができた。非常に限られた領域しか組合せの可能性が見えない図２５Ａに示すように、２つのＥＲマーカーである、可溶性内腔タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＥｒｐ５７および膜貫通タンパク質カルネキシンとの幅広い一緒の局在もなさそうだった。Ｅ１／Ｅ２、Ｅｒｐ５７およびカルネキシンは、有意な重なりの不在を特徴とする幅広い細網状のパターンを示した。一方、Ｅ１／Ｅ２によって形成されるドット状構造を取り囲む領域の周辺における両化学種の分布は、判定がはるかに困難だった。
【０１１４】
カルネキシンはしばしばＨＣＶ糖タンパク質に会合していたので、いくつかの異なる試料で、より高倍率の共焦点走査解析を行なった。図２５Ｂは、そのような解析の代表的画像を示している。カルネキシンとＥ１／Ｅ２との一緒の局在は、ドットの辺縁部にある数少ない微小な領域に限定されていた（図２５Ｂの上段）。ＮＳ３化学種がカルネキシンから完全に離れて存在することは、もっとはっきりしていて（図２５Ｂの中段）、Ｅ１／Ｅ２とＮＳ３との強い一緒の局在は明白だった（図２５Ｂの下段）。後者の場合、２つの化学種は、一緒の局在の稠密なコアと、周辺部に数少ない単化学種分布の領域を示した。
【０１１５】
結論として、ＥＲ膜貫通型シャペロン・カルネキシンは、本質的にはＥ１／Ｅ２と一緒に分布するが、一緒の局在は非常にわずかな部分でしか起こらないようだった。さらにまた、カルネキシンは、ドットの中心領域からは排除されるようだった。このように、高い百分率の２１−５Ｒ８０９細胞では、コア、Ｅ１／Ｅ２、ＮＳ３およびＮＳ５ＡというＨＣＶタンパク質が稠密構造中に蓄積すると共に厳密に一緒に局在した。また、その周辺で唯一認識できる細胞マーカーはＥＲ膜貫通シャペロンである。まとめて考えると、これらのデータは、ＥＲ由来区画におけるＨＣＶタンパク質の局在と合致した。
【０１１６】
（Ｅ１／Ｅ２発現の存在下または不在下でのＮＳ３およびＮＳ５Ａの細胞分布）
ドット状構造におけるＨＣＶ非構造タンパク質、特にＮＳ３およびＮＳ５Ａの会合は、サブゲノムレプリコンを保有する細胞で既に報告されている。
【０１１７】
これら異なるウイルスタンパク質のドット形成プロセスへの相対的寄与を解明するために、本発明者らは、２１−５細胞（コアタンパク質の検出可能な発現はあるが、２つの糖タンパク質の検出可能な発現はない系）、ならびにＥ１およびＥ２を発現するかまたは発現しない、サブゲノムレプリコンを保有するＨｕｈ−７において、非構造タンパク質ＮＳ３およびＮＳ５Ａの分布を解析した。ＮＳ３−３’ＨＣＶ−１ｂ領域に相当するサブゲノムレプリコンの複製を支持するＨｕｈ−７細胞株は、参考文献１に記載された。本発明者らは、図２１Ａに示すように、遺伝子型１ａ由来のＥ１Ｅ２ｐ７遺伝子を保持するレンチウイルスベクターによって、この細胞株の形質導入を行なった。２つの糖タンパク質の発現をウェスタンブロットによってチェックしたが、免疫蛍光解析では、細胞の事実上１００％がＥ１／Ｅ２を発現させることがわかった。これらの細胞タイプでの共焦点解析で得た代表的画像を図２４に示す。２１−５細胞では、ＮＳ３とＮＳ５Ａがどちらも、細胞表面全体に小さなドット状領域をいくつか持つ散漫なＥＲ様分布を示した（図２４の上段）。これら２つの非構造タンパク質の一緒の局在は、数少ない可視ドットに限定されるらしく、細網状に分布したタンパク質は会合していないようだった。ＮＳ３−３’細胞では、ＥＲ様パターンが減少し、両タンパク質を含有する、より大きなドットの数の増加を伴った（図２４の中段）。ドット状構造におけるＮＳ３とＮＳ５Ａとの同時存在は、ＮＳ３−３’Ｒ８０９細胞でははるかに明確だった（図２４の下段）。これらの細胞において、これらの構造は数および大きさの両方が増し、それと同時にどちらの化学種についてもＥＲ様分布の減少が観察された。ここでもまた、２つの非構造タンパク質の一緒の局在は、ドット領域に優先的に限定された。これらの細胞におけるＥ１／Ｅ２の同時標識を挿入図内に示す（図２４の下段）。結果は、２つの化学種が一緒に局在するドットおよびいくつかの領域におけるこれら２つの非構造タンパク質とＥ１／Ｅ２との広範な一緒の局在を明確に示した。これらの観察は、全長レプリコンまたはサブゲノムレプリコンを保有する細胞におけるドット状構造形成の誘発にＥ１／Ｅ２発現が及ぼす相乗効果と合致した。
【０１１８】
まとめると、これらの観察は、これらの細胞におけるドット状構造の形成を駆動し得る相互作用の複雑なパターンを示した。現在までに解析されたウイルスタンパク質はいずれも、細網状の分布を示したか、またはドット状構造に濃縮され、その数および位置は、特定ウイルスタンパク質の存在に依存するのではなく、それが発現される状況に依存するようだった。さらにまた、ＨＣＶ ＲＮＡ複製を許す細胞のサブタイプは、利用できるウイルス産物の全てを、出芽前領域に相当し得る大きな構造に蓄積させることも明らかだった。
【０１１９】
インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）は細胞培養中でＨＣＶ複製を阻害することが知られている［１０１］。２１−５／Ｒ８０９細胞をＩＦＮ−αと共にインキュベートすると、Ｅ１およびＥ２のＥＲパターン分布が変化し（図１６）、絶対的にも（図１７）、リボソームＲＮＡとの比較でも（図１８）、ＨＣＶ ＲＮＡレベルの減少を引き起こした。
【０１２０】
（ａ）Ｈｕｈ７細胞；（ｂ）Ｒ８０９トランスフェクトＨｕｈ７細胞、および（ｃ）２１−５／Ｒ８０９細胞からエキソソームを精製するために、分画遠心分離を使用した。図１９に示すように、ある遠心分離実験のＰ５画分に、ゴルジ修飾Ｅ２タンパク質に一致するかすかなバンドが検出された。ＣＤ８１も検出することができた。
【０１２１】
（新規合成されたウイルスＲＮＡの標識）
細胞を、２４ウェルプレート中のカバースリップ上に、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度でプレーティングした。接種の１日後に、リポフェクトアミン２０００を製造者の指示に従って使用することにより、細胞をブロモ−ＵＴＰ（ＢｒＵＴＰ）でトランスフェクトした。簡単に述べると、Ｏｐｔｉｍｅｍ中の１２ｍＭ ＢｒＵＴＰ ５０μｌを、５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎに希釈した１μｌのリポフェクトアミン２０００に加えた。室温で２０分間インキュベートした後、そのＢｒＵＴＰ−リポフェクトアミン複合体を、アクチノマイシンＤ（５μｇ／μｌ）の存在下で、ＤＭＥＭ完全培地５００μｌ中の細胞に直接加えた。２時間または４時間のインキュベーション後に、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中の１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した。ＨＣＶタンパク質を上述のように同定し、一方、新たに合成されたウイルスＲＮＡを、２μｇ／ｍｌのマウス抗ＢｒＵＴＰ抗体を使って検出した。一次抗体を、ＰＢＳ／ＢＳＡ ０．５％に２００：１に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体で検出した。
【０１２２】
新規合成されたＨＣＶ ＲＮＡを標識することにより、本発明者らは、本発明の複合体がウイルスＲＮＡ合成の部位を構成することを示した。
【０１２３】
（膜浮遊アッセイ）
ＨＣＶタンパク質と会合する細胞内膜の性質をより良く特徴づけるために、本発明者らは、膜画分と細胞質ゾル画分とを分離するための細胞成分分画研究を行なった。
【０１２４】
細胞を１ｍｌの低張緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で溶解し、Ｗｈｅａｔｏｎルーズフィットダウンスホモジナイザーで５０ストローク、ホモジナイズした。４℃、１０００×ｇで５分間の遠心分離によって、核および未破砕細胞を除去した。膜構造を特徴づけるために、細胞溶解物の核成分分画後上清（ｐｏｓｔｎｕｃｌｅａｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を４℃または３７℃で３０分間、１％トリトンＸ−１００で処理した。次に、低塩濃度緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）中で８０％ショ糖と混合することによって細胞溶解物を５５％ショ糖にし、そして６ｍｌの３５％ショ糖を重層し、最後に３ｍｌの５％ショ糖を重層した。この勾配を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４０ローター中、４℃、３８０００ｒｐｍで、２０時間遠心分離した。遠心分離後に、勾配の上端から１ｍｌずつの画分を集め、ＰＢＳに希釈し、３５００００×ｇで６０分間遠心分離することにより、物質を沈降させた。ペレットをＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング後に、膜を一次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、次に適切な化学種特異的セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共に、室温でさらに１時間インキュベートした。
【０１２５】
２１−５Ｒ８０９細胞株からの細胞抽出物をショ糖勾配で分画し、そしてＨＣＶの構造タンパク質およびＨＣＶの非構造タンパク質、ＥＲ膜結合型タンパク質カルネキシン、ならびに細胞質脂質ラフトマーカーのカベオリン−２の存在について調べた。膜結合型タンパク質は勾配内の平衡な密度へと浮遊すると予想された。実際、Ｅ１／Ｅ２およびＮＳ３はどちらも充分な割合のものが膜画分（画分４〜５）に見出され、一方、コアタンパク質は、最も可能性が高いのはその発現レベルが低いことに起因して、可溶性画分にしか検出できなかった（図２６Ａ、左図）。ＥＲマーカーであるカルネキシンは、これらの生物学的手法で一般に見出されるように、膜画分および細胞質ゾル画分の両方に分布した。分画に先だって細胞抽出物を１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４℃（ＥＲタンパク質を細胞質ゾルに放出させる条件）にて処理した場合は、全てのＨＣＶタンパク質が勾配の最下部の細胞質ゾル画分に見出された（図２６Ａ、真ん中の図）。したがって、以前の報告［９５］と一致して、細胞抽出物のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００処理は、ＨＣＶ複製複合体とＥＲ膜との解離をもたらした。これと同じ処理では、Ｃａｖ−２と一緒に分画される界面活性剤耐性膜（ＤＲＭ）は破壊されなかった（図２６Ａ、真ん中のパネル）。ＴＸ−１００と共に３７℃でインキュベートすると、ＤＲＭタンパク質の完全な可溶化が起こった（図２６Ａ、左のパネル）。まとめて考えると、これらのデータは、今までに記載されたＨＣＶ複製／集合複合体が、ＥＲ起源の膜構造と会合することを示した。
【０１２６】
膜浮遊解析により、Ｅ２の大半は、１％ＮＰ４０による処理に対して耐性でかつカベオリン−２と一緒に分画される膜と会合することが証明された（図２０）。
【０１２７】
（まとめ）
この報文で、本発明者らは、ＨＣＶ構造タンパク質およびＨＣＶ非構造タンパク質の細胞内局在の解析ならびにウイルス出芽機序の研究に役立ち得る新しい細胞系を記載する。本発明者らは、全長遺伝子型１ｂレプリコンを保有する細胞株におけるＥ１Ｅ２（およびｐ７）の安定かつ検出可能な発現を樹立し、これら２つの糖タンパク質の局在を、非構造タンパク質、ウイルスＲＮＡおよび細胞内マーカーとの関連で特徴づけた。この系では、２つの糖タンパク質の発現は妥当に持続し続け、予想どおり、Ｅ１Ｅ２ヘテロ二量体の形成をもたらした。さらにまた、これら２つの糖タンパク質の染色体発現は、これら２つの化学種の遺伝的浮動を防止するので、Ｅ１Ｅ２の安定性に影響を及ぼし得る変異蓄積が回避される。タンパク質分布には２つのパターン、すなわち他の任意のＥＲマーカー標識に似た「細網状」パターンと、ウイルスタンパク質の局在した蓄積がドット状構造を生成した「斑点状」パターンが観察された。細網状分布の場合、ＨＣＶタンパク質は、互いとも、細胞内区域を同定するために用いられる標準的マーカーとも、優先的には一緒に局在しなかった。
【０１２８】
全てのＨＣＶタンパク質は宿主細胞膜と、膜結合タンパク質として直接的に、または間接的に相互作用して、特異的な変化のパターンを誘発する。本発明者らは、ナイーブＨｕｈ７細胞においてドット様構造を誘発するには、Ｅ１Ｅ２ｐ７の孤立した発現で十分であることを確認した（図２１Ｂ）。しかし、これらの構造の数、形状および局在は、同時に発現されるウイルスタンパク質の状況に依存していた。実際、本発明者らは、全長レプリコンまたはサブゲノムレプリコンを保有する細胞における補強されたＥ１Ｅ２発現が、ＮＳ３およびＮＳ５Ａの細網状分布の減少と、それに付随する、全てのウイルス成分が濃縮される、より明確な領域への蓄積とを誘発することを実証した（図２２および図２４）。逆に、発現された外因性Ｅ１／Ｅ２は、レプリコンとの関連で発現させた場合に、ナイーブＨｕｈ７細胞中でのそれらの細胞局在と比較して、より輪郭のはっきりした、より大きい、より核周囲性の強いドット状構造に組織化される。
【０１２９】
以上は本発明を例示するための説明に過ぎず、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく改変を加え得ることが理解される。
【０１３０】
（参考文献：これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）
【０１３１】
【表１−１】
【０１３２】
【表１−２】
【０１３３】
【表１−３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公開番号】特開２０１２−１９６２３３（Ｐ２０１２−１９６２３３Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−１６０２７３（Ｐ２０１２−１６０２７３）
【出願日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【分割の表示】特願２００７−５３４１１４（Ｐ２００７−５３４１１４）の分割
【原出願日】平成１７年１０月３日（２００５．１０．３）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１６０２７３（Ｐ２０１２−１６０２７３）
【出願日】平成２４年７月１９日（２０１２．７．１９）
【分割の表示】特願２００７−５３４１１４（Ｐ２００７−５３４１１４）の分割
【原出願日】平成１７年１０月３日（２００５．１０．３）
【出願人】（５９２２４３７９３）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル (107)
【Ｆターム（参考）】
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