ＤＮＡチップ解析方法および解析装置
【課題】 ＤＮＡチップの解析において、スキャナーの走査機構の精度が悪い場合でも、影響を受けずに解析する方法および装置を提供する。
【解決手段】 スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得する。
【解決手段】 スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップを用いる解析方法およびその解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析が実現されている。ＤＮＡチップとは、ガラスや樹脂等からなる基板の上にＤＮＡをスポットしたものをいう。ＤＮＡチップ上には、標識されるＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、ＤＮＡがスポットされている。一方、解析すべき未知のＤＮＡサンプルは光学的に検出可能な発光又は蛍光物質で標識する。こうすると、解析すべき未知のＤＮＡサンプルを前記ＤＮＡチップを用いてハイブリダイゼーション反応させることで、該ＤＮＡサンプルは、これと相補的な塩基配列を有するスポット上のプローブＤＮＡと結合する。プローブＤＮＡと結合しなかったＤＮＡサンプルはすべて洗い流し、ＤＮＡチップ上に結合した解析したいＤＮＡサンプルを発光させ、これを読取り装置（スキャナー）により読みとると、結合したＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡチップ上で発光するスポットの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析することができる。このように、ＤＮＡチップ上に塩基配列が既知のプローブＤＮＡセットを構成し、このプローブＤＮＡのセットを換えることで、目的に応じた遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
【０００３】
以下、図１に、一般的なＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示す。
【０００４】
図１に示すように、前処理工程においては、検体から抽出したＤＮＡサンプル中に含まれる未知の解析したいＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡを蛍光物質（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）で標識する。
【０００５】
次にハイブリダイゼーション工程において、プローブＤＮＡが搭載されたスポットを含むＤＮＡチップの基板に、蛍光標識されたＤＮＡサンプルを添加する。ここで、ＤＮＡサンプルがスポット上のプローブＤＮＡと相補的な塩基配列を有すると、これと結合する。
【０００６】
次に、洗浄工程において、所定の洗浄液により、ハイブリダイゼーション反応後のＤＮＡチップを洗浄する。これにより、基板上のプローブＤＮＡと結合しなかったＤＮＡサンプルがすべて洗い流される。
【０００７】
続いて、洗浄後のＤＮＡチップをスキャニングする。スキャニング工程においては、読取り装置内にて、蛍光物質（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を励起するのに適した所定の波長のレーザー光をＤＮＡチップ基板に照射し走査する。これにより、スポットされた各プローブＤＮＡに結合した標識されたＤＮＡサンプルの発光量が測定され、それに基づいて解析処理を行う画像データを取得する。
【０００８】
解析工程においては、得られた画像データに対してテンプレートを利用して各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。
【０００９】
ここで、図２に、ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップ１の一例を示す。図２に示すＤＮＡチップ１は、基板２の上に、解析目的となるＤＮＡサンプルの相補的塩基配列を有するプローブＤＮＡが行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを有している（以下、ＤＮＡチップ基板上の当該ブロックに配置されているプローブＤＮＡが固定化された領域を「スポット」と称する）。なお、基板２上に配置されるスポットの基板２上におけるその配置位置、および各スポットに固定化されているプローブＤＮＡの塩基配列は、予め定められている。
【００１０】
また、図３に、ＤＮＡチップの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を示す。図３に示すように、テンプレートは、例えば１〜３２などの複数のブロックに分割されており、各ブロック内においてはｍ行ｎ列（図３では４０×４０）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡチップの個々のスポットに対応する）が設けられている。
【００１１】
上記の解析工程においては、読みとったＤＮＡチップのスキャン画像中の個々のスポットに、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアを当てはめ（アラインメント）、当該検出エリアにおいて各スポットの蛍光強度を算出する。このとき、正確な解析を実行するためには画像上の個々のスポットに対してテンプレートの個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント処理が正確に実行される必要がある（このアラインメント処理において、位置ずれが検出された場合には、画像あるいは検出スポットの位置が、対応するテンプレートの検出エリアに正しく設定されるよう、補正されなければならない）。
【００１２】
そのため、例えば特許文献１には、ＤＮＡチップのスキャン画像への検出エリアの位置決めに用いる基準パターンをＤＮＡチップの基板上に設け、この基準パターンを利用してアラインメント処理を行う方法が開始されている。
【００１３】
しかしながら、スキャナーによっては、走査機構の精度が悪い場合があり、スポット配列の行方向と列方向とが垂直に直交するＤＮＡチップをスキャニングしたにも関わらず、図４に示すとおり画像に歪みが生じて垂直にならない場合がある。そして、このような画像データは、特許文献１に開示の、画像の回転、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれを補正する技術では正確に位置合わせすることが出来ない。
【００１４】
特に、本来、スキャナーの走査機構には高い精度が要求されるが、長期間使用したものは、組上げ当初は精度が良い場合でも、読取り時や装置移設時の際の振動、あるいは温度変化による部材の膨張収縮等が引き金となり、組上げ調整時に残留した応力によって走査機構の部材の固定にずれが生じ、画像に歪みが生じる場合が多い。読取り装置のメーカーでオーバーホールすることにより改善することは可能であるが、費用がかかるうえ、修繕している期間、解析作業ができない等の問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００５−１７２８４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ＤＮＡチップの解析において、スキャナーの走査機構の精度が悪い場合でも、この影響を受けずに解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成する本発明は、以下のいずれかの構成を特徴とするものである。
（１） スポットが二方向に規則的に配列されたDNAチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得するＤＮＡチップの解析方法。
（２） 前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像データにおいて、二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度をそれぞれ求め、これらの角度から剪断変形歪みを補正する、前記（１）に記載のＤＮＡチップの解析方法。
（３） 前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度をスポットの配列角度θｘ、θｙとして得、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から画像データの剪断変更歪みを補正する、前記（２）に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【００１８】
【数１】
【００１９】
【数２】
【００２０】
（４） ステップ（ａ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向のいずれか一方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を補正角度として画像データを回転補正する、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
（５） ＤＮＡチップの読取り手段と、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により画像データから所望の数値データを取得するデータ取得手段とを有するＤＮＡチップの解析装置。
（６） 前記読取り手段が、異なる方向に走査する２つの走査機構を備えるとともに、それら走査機構の基準軸の直交度を記録する記録手段を備えている、前記（５）に記載のＤＮＡチップの解析装置。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＤＮＡチップの解析において、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップの基板上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＤＮＡチップ解析の一連の工程を示す概略図である。
【図２】ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップの一例を示す概略図である。
【図３】ＤＮＡチップ解析において、ＤＮＡチップの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を示す模式図である。
【図４】スポット配列の行方向と列方向とが垂直に直交するＤＮＡチップをスキャニングしたにも関わらず歪みが生じて該スポット配列が垂直にならない画像データの一例を示す模式図である。
【図５】本発明のＤＮＡチップの解析装置の一実施形態を示す概略模式図である。
【図６】本発明のＤＮＡチップの解析方法の一実施形態を示すブロック図である。
【図７】ｙ軸に対するスポットの配列角度の検出方法を示す図である。
【図８】ｙ軸に対するスポットの配列角度の検出方法を示す図である。
【図９】図６におけるＳｔｅｐ３、Ｓｔｅｐ４の処理を示す図である。
【図１０】図６におけるＳｔｅｐ５の処理を示す図である。
【図１１】本発明で解析に供した画像データの一例である。
【図１２】本発明で好適に解析されスポット位置が検出されたＤＮＡチップの画像データの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態に係るＤＮＡチップの解析装置および解析方法を説明する。
【００２４】
本発明のＤＮＡチップの解析装置は、スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップ１の、そのスポットの規則性を利用して、読み取り手段によって得られた画像の補正を行うものであり、たとえば例えば図５に示すように、スキャナー４（読み取り手段）と、スキャナー制御用ＰＣ５と、画像サーバー６と、解析用ＰＣ７（データ取得手段）とを具備する。
【００２５】
スキャナー４は、例えば、ＤＮＡチップ１を二方向に走査するための走査機構（本実施形態においては、チップの長手方向をｙ軸、それに直交する方向をｘ軸としている）と、ＤＮＡチップ１を複数載置するオートローダー機構とを備え、発光性の物質により標識されたＤＮＡサンプルを添加してハイブリダイゼーション反応させたＤＮＡチップを、レーザー光により励起し、画像データを取得する。当該二方向に走査する機構の基準軸は、歪みの無い画像を得るために、直交していることが好ましく、後述するように複数のＤＮＡチップを処理する場合には、当該基準軸の直交度を記録する手段を有していることが好ましい。なお、走査機構は、一般的に２軸ともスライダーが用いられることが多いが、例えばラインセンサカメラとスライダーを組合わせても良い。
【００２６】
画像データを取得する際には、スキャナー制御用ＰＣ５により、スキャナー４におけるＤＮＡチップ１の走査や画像取得の制御を行う。当該スキャナー制御用ＰＣ５としては、汎用パーソナルコンピュータなどを用いる。
【００２７】
また、得られた画像データは、ＤＮＡチップ画像ファイル８として画像サーバー６に保存する。ＤＮＡチップ１は、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長でスキャンされ、１つのＤＮＡチップ１に対応してそれぞれの励起波長に対応した画像データが得られるが、この画像データは、例えば、１６ビットグレイスケールＴｉｆｆフォーマット、ＢＭＰフォーマット、ＪＰＥＧフォーマットなどのファイル形式で保存される。
【００２８】
解析用ＰＣ７は、画像サーバー６に保存されたＤＮＡチップ画像ファイル８を読み込む。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル９を読み込んで、ＤＮＡチップ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル１０として出力する。この解析用ＰＣ７には、本発明の解析方法を実行するための解析ツールとなるプログラムが導入される。
【００２９】
以下に解析用ＰＣ７で行われるＤＮＡチップの解析について説明する。
【００３０】
まず、例えばスキャナーが２つのスライダーを備えたものである場合等、これらスライダーは必ずしも直交しているとは限らない。装置組み立て時、もしくは時間の経過等に伴って、ずれてしまうことある。そのため、スキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像も、例えば図７（ａ）に示すように傾いている可能性がある。
【００３１】
このように、ｘ軸とｙ軸が直交しない場合は得られた画像が歪んでしまい、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることが出来ない。このため、画像から直交度のズレを検出して補正する必要がある。
【００３２】
そのため、解析用ＰＣ７は、画像サーバー６に保存されているＤＮＡチップの画像ファイル８を読みこみ、画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、その後、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから、該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得する。
【００３３】
図６に該解析の手順例を示すブロック図を示す。
【００３４】
まず、Ｓｔｅｐ１では、ｘ軸に対して各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を検出する。すなわち、この工程では、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙを検出する。
【００３５】
より具体的には、画像データをｘ軸に対してｙ軸方向に投影し、Ｘ位置毎の積算強度（各画素値の積算値）を算出する。この処理を、画像データを予め設定した角度づつ回転させて繰り返す。投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向がずれている場合の積算強度グラフは、図７（ａ）に示すように振幅のないグラフになる。一方、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向が一致した場合の積算強度グラフは、図７（ｂ）に示すとおり、信号の振幅が最大となる。投影データのこのような特徴を利用し、図８に示すように、横軸に画像の回転角度θ、縦軸に積算強度の標準偏差をとり、最大値をとる角度を求めることで、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙを検出することができる。なお、以上のようにして検出される角度θｙは、後述の工程で画像データを回転補正する際に用いるとともに、画像データの剪断変形歪みを補正する際に用いられる。
【００３６】
続いて、Ｓｔｅｐ２では、Ｓｔｅｐ１の処理の方向をｘｙ置き換えて行い、スポットのｘ軸に対する配列角度（隣接するスポットを直線的に結んだ線のｘ軸に対する傾斜角度）θｘを検出する。ここで検出される角度θｘは、後述の工程で画像データの剪断変形歪み補正する際に用いられる。
【００３７】
次に、Ｓｔｅｐ３においては、図９（ａ）、（ｂ）に示すとおり、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙ分を補正角度として用い、画像データを回転させて、スポットをｙ軸に対して平行にする。
【００３８】
その後、Ｓｔｅｐ４においては、回転後の画像に対して、上述のように検出した二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式に基づいて変換（せん断変形）を実施し、画像の剪断変形歪みを補正する。下記式の（ｘ、ｙ）は変換前の座標、（Ｘ、Ｙ）は変換後の座標である。なお、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙは、数４に示すように、スポットのｘ軸に対する配列角度θｘからｙ軸に対する配列角度θｙを減じて求める。この変換後の画像を図９（ｃ）に示す。
【００３９】
【数３】
【００４０】
【数４】
【００４１】
上記Ｓｔｅｒｐ１からＳｔｅｐ４までが、画像データの回転を補正するステップと画像データの剪断変形歪みを補正するステップに該当する。なお、画像データの回転を補正するステップと画像データの剪断変形歪みを補正するステップとは、上述のｓｔｅｐ４の後に上述のｓｔｅｐ３を行うようにし、先に剪断変形歪みを補正し、その後回転を補正してもよい。また、ｓｔｅｐ２とｓｔｅｐ３の順番を入れ替えて、剪断変形歪みの補正に用いる二方向目のスポットの配列角度（上記態様ではスポットのｘ軸に対する配列角度θｘ）を求めるまえに、画像を回転してしまってもよい。
【００４２】
続いて、ｓｔｅｐ５、６において、画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量（テンプレートの基準位置からのずれ量）を算出する。
【００４３】
Ｓｔｅｐ５においてｘ軸方向のずれ量を算出するにあたっては、図１０（ａ）に示すように、せん断変形して得られた画像データについて、ｘ軸に対してｙ軸方向に各画素数値を投影し、Ｘ位置毎の各画素値の積算データ（図１０（ｂ））を取得する。そして、これと、ＤＮＡチップの設計情報から予め作成した基準データ（図１２（ｃ））とから、下記の相互相関関数に基づいてｘ軸方向のずれ量を算出する。
【００４４】
【数５】
【００４５】
図１２（ｂ）のｘ軸に対してｙ方向に投影したデータと、図１２（ｃ）の基準データとの相互相関関数を図１２（ｄ）に示す。投影データをｆ（ｘ）、基準データをｇ（ｘ）、基準データの移動量をｍ画素とすると、上記数５が相互相関関数ｆ＊ｇであり、投影データと基準データが重なる移動量ｍの時、最大値を取るので、その時の移動量ｍがｘ軸方向のずれ量となる。
【００４６】
なお、ｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量の検出は、ＤＮＡチップ単位で実施しても良いが、ＤＮＡチップ１自体の歪みを考慮し、ブロック単位で実施するのが好ましい。図１２（ｃ）においては、グラフの原点がブロックの始点を示し、スポットの配置位置に対応するＹ座標に１を、他を０に割当てている。
【００４７】
続いて、Ｓｔｅｐ６においては、Ｓｔｅｐ５の処理をｘｙ置き換えて行い、ｙ軸方向のずれ量を検出する。
【００４８】
そして、解析定義ファイルに保存しているテンプレートにおける各スポットの位置情報と、Ｓｔｅｐ５、Ｓｔｅｐ６で求めたｘ軸方向、ｙ軸方向のずれ量から、回転、歪みを補正した後の画像での各スポット中心座標を算出し、スポットの位置を検出する（Ｓｔｅｐ７）。なお、スキャナーで得られた画像を図１１（ａ）に、上述の処理を行って検出・確定したスポット位置が示された画像を図１１（ｂ）に示す。図（ｂ）の点線で描画した円の内部が、テンプレートで規定された検出エリアである。
【００４９】
その後Ｓｔｅｐ８においては、Ｓｔｅｐ７で求めた各スポットの中心座標から、スポット半径内の画素の信号強度について、平均値、メディアン値、標準偏差等の統計量を算出し、スポットの属するブロック番号、スポットの行列番号、配置されているＤＮＡ名と合わせて、各種数値データをファイルとして出力する。
【００５０】
本発明においては、このようにして遺伝子の発現に基づいて得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するが、得られる各種の数値データは、検体内で、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析するため等に用いられる。
【００５１】
以上のような本発明においては、ＤＮＡチップの解析において、スポットの規則性を利用して画像データ自体から当該画像の補正を行うため、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップの基板上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。
なお、本実施形態においては、１枚の画像データを解析する場合について説明したが、複数のＤＮＡチップを単一のスキャナーで読み込み、解析を行う場合には、計算時間の短縮化を図るために、次のようにすることが好ましい。すなわち、先の画像データの解析で得られた、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙの情報をスキャナーに保存しておき、後続のＤＮＡチップをスキャナーで読み込みんで画像データを取得しファイルとして保存すると同時に当該ファイルのヘッダ部分にスキャナーで保存していたθｘｙの情報を書き込み、解析用ＰＣで当該ファイルから画像データを読み込むと同時にθｘｙの情報も読み込み、該θｘｙの情報に基づいて画像の補正を行うことが好ましい。
【００５２】
また本発明で解析されるＤＮＡチップとしては、図１２に示すように、基板上のプローブＤＮＡが固定化された表面（スポットの表面）が、基板上の他の表面より高い凹凸構造のものが望ましい。樹脂を射出成形する等してこのような構造とすることで、上記Ｓｔｅｐ１〜４において積算強度のグラフを求める際により凹凸のはっきりしたグラフを得ることができる。また、針等でスポットされたＤＮＡの広がりを押さえ、位置精度よくスポットを配置することが可能となる。
【００５３】
さらに上記実施形態においては、ＤＮＡチップにＤＮＡがスポットされた実施形態を説明したが、ＲＮＡをスポットしたチップに対しても適用可能である。
【符号の説明】
【００５４】
１ ＤＮＡチップ
２ 基板
３ スポット
４ スキャナー
５ スキャナー制御ＰＣ
６ 画像サーバー
７ 解析用ＰＣ
８ ＤＮＡ画像ファイル
９ 解析定義ファイル
１０ 数値化データファイル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡチップを用いる解析方法およびその解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップを用いた遺伝子解析が実現されている。ＤＮＡチップとは、ガラスや樹脂等からなる基板の上にＤＮＡをスポットしたものをいう。ＤＮＡチップ上には、標識されるＤＮＡサンプルと特異的に反応可能なプローブとして、ＤＮＡがスポットされている。一方、解析すべき未知のＤＮＡサンプルは光学的に検出可能な発光又は蛍光物質で標識する。こうすると、解析すべき未知のＤＮＡサンプルを前記ＤＮＡチップを用いてハイブリダイゼーション反応させることで、該ＤＮＡサンプルは、これと相補的な塩基配列を有するスポット上のプローブＤＮＡと結合する。プローブＤＮＡと結合しなかったＤＮＡサンプルはすべて洗い流し、ＤＮＡチップ上に結合した解析したいＤＮＡサンプルを発光させ、これを読取り装置（スキャナー）により読みとると、結合したＤＮＡの状況を画像として観察することができる。すなわち、ＤＮＡチップ上で発光するスポットの分布を解析することで、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析することができる。このように、ＤＮＡチップ上に塩基配列が既知のプローブＤＮＡセットを構成し、このプローブＤＮＡのセットを換えることで、目的に応じた遺伝子の変異や遺伝子の発現量などを検出することができる。
【０００３】
以下、図１に、一般的なＤＮＡチップ解析の一連の処理工程の詳細を示す。
【０００４】
図１に示すように、前処理工程においては、検体から抽出したＤＮＡサンプル中に含まれる未知の解析したいＤＮＡを増幅し、これらのＤＮＡを蛍光物質（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）で標識する。
【０００５】
次にハイブリダイゼーション工程において、プローブＤＮＡが搭載されたスポットを含むＤＮＡチップの基板に、蛍光標識されたＤＮＡサンプルを添加する。ここで、ＤＮＡサンプルがスポット上のプローブＤＮＡと相補的な塩基配列を有すると、これと結合する。
【０００６】
次に、洗浄工程において、所定の洗浄液により、ハイブリダイゼーション反応後のＤＮＡチップを洗浄する。これにより、基板上のプローブＤＮＡと結合しなかったＤＮＡサンプルがすべて洗い流される。
【０００７】
続いて、洗浄後のＤＮＡチップをスキャニングする。スキャニング工程においては、読取り装置内にて、蛍光物質（例えば、Ｃｙ３，Ｃｙ５など）を励起するのに適した所定の波長のレーザー光をＤＮＡチップ基板に照射し走査する。これにより、スポットされた各プローブＤＮＡに結合した標識されたＤＮＡサンプルの発光量が測定され、それに基づいて解析処理を行う画像データを取得する。
【０００８】
解析工程においては、得られた画像データに対してテンプレートを利用して各スポットの蛍光強度を算出し、各種の解析を実行する。
【０００９】
ここで、図２に、ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップ１の一例を示す。図２に示すＤＮＡチップ１は、基板２の上に、解析目的となるＤＮＡサンプルの相補的塩基配列を有するプローブＤＮＡが行方向および列方向に所定数、マトリクス状に配列されたブロックを有している（以下、ＤＮＡチップ基板上の当該ブロックに配置されているプローブＤＮＡが固定化された領域を「スポット」と称する）。なお、基板２上に配置されるスポットの基板２上におけるその配置位置、および各スポットに固定化されているプローブＤＮＡの塩基配列は、予め定められている。
【００１０】
また、図３に、ＤＮＡチップの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を示す。図３に示すように、テンプレートは、例えば１〜３２などの複数のブロックに分割されており、各ブロック内においてはｍ行ｎ列（図３では４０×４０）のマトリクス状に配置された検出エリア（ＤＮＡチップの個々のスポットに対応する）が設けられている。
【００１１】
上記の解析工程においては、読みとったＤＮＡチップのスキャン画像中の個々のスポットに、解析ツールが提供するテンプレートの検出エリアを当てはめ（アラインメント）、当該検出エリアにおいて各スポットの蛍光強度を算出する。このとき、正確な解析を実行するためには画像上の個々のスポットに対してテンプレートの個々の検出エリアが正しく設定されるよう、アラインメント処理が正確に実行される必要がある（このアラインメント処理において、位置ずれが検出された場合には、画像あるいは検出スポットの位置が、対応するテンプレートの検出エリアに正しく設定されるよう、補正されなければならない）。
【００１２】
そのため、例えば特許文献１には、ＤＮＡチップのスキャン画像への検出エリアの位置決めに用いる基準パターンをＤＮＡチップの基板上に設け、この基準パターンを利用してアラインメント処理を行う方法が開始されている。
【００１３】
しかしながら、スキャナーによっては、走査機構の精度が悪い場合があり、スポット配列の行方向と列方向とが垂直に直交するＤＮＡチップをスキャニングしたにも関わらず、図４に示すとおり画像に歪みが生じて垂直にならない場合がある。そして、このような画像データは、特許文献１に開示の、画像の回転、ｘ方向ずれ、ｙ方向ずれを補正する技術では正確に位置合わせすることが出来ない。
【００１４】
特に、本来、スキャナーの走査機構には高い精度が要求されるが、長期間使用したものは、組上げ当初は精度が良い場合でも、読取り時や装置移設時の際の振動、あるいは温度変化による部材の膨張収縮等が引き金となり、組上げ調整時に残留した応力によって走査機構の部材の固定にずれが生じ、画像に歪みが生じる場合が多い。読取り装置のメーカーでオーバーホールすることにより改善することは可能であるが、費用がかかるうえ、修繕している期間、解析作業ができない等の問題が生じる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開２００５−１７２８４０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、ＤＮＡチップの解析において、スキャナーの走査機構の精度が悪い場合でも、この影響を受けずに解析する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成する本発明は、以下のいずれかの構成を特徴とするものである。
（１） スポットが二方向に規則的に配列されたDNAチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得するＤＮＡチップの解析方法。
（２） 前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像データにおいて、二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度をそれぞれ求め、これらの角度から剪断変形歪みを補正する、前記（１）に記載のＤＮＡチップの解析方法。
（３） 前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度をスポットの配列角度θｘ、θｙとして得、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から画像データの剪断変更歪みを補正する、前記（２）に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【００１８】
【数１】
【００１９】
【数２】
【００２０】
（４） ステップ（ａ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向のいずれか一方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を補正角度として画像データを回転補正する、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
（５） ＤＮＡチップの読取り手段と、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法により画像データから所望の数値データを取得するデータ取得手段とを有するＤＮＡチップの解析装置。
（６） 前記読取り手段が、異なる方向に走査する２つの走査機構を備えるとともに、それら走査機構の基準軸の直交度を記録する記録手段を備えている、前記（５）に記載のＤＮＡチップの解析装置。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＤＮＡチップの解析において、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップの基板上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＤＮＡチップ解析の一連の工程を示す概略図である。
【図２】ＤＮＡチップ解析に用いられるＤＮＡチップの一例を示す概略図である。
【図３】ＤＮＡチップ解析において、ＤＮＡチップの画像ファイルに対して適用されるテンプレートの一例を示す模式図である。
【図４】スポット配列の行方向と列方向とが垂直に直交するＤＮＡチップをスキャニングしたにも関わらず歪みが生じて該スポット配列が垂直にならない画像データの一例を示す模式図である。
【図５】本発明のＤＮＡチップの解析装置の一実施形態を示す概略模式図である。
【図６】本発明のＤＮＡチップの解析方法の一実施形態を示すブロック図である。
【図７】ｙ軸に対するスポットの配列角度の検出方法を示す図である。
【図８】ｙ軸に対するスポットの配列角度の検出方法を示す図である。
【図９】図６におけるＳｔｅｐ３、Ｓｔｅｐ４の処理を示す図である。
【図１０】図６におけるＳｔｅｐ５の処理を示す図である。
【図１１】本発明で解析に供した画像データの一例である。
【図１２】本発明で好適に解析されスポット位置が検出されたＤＮＡチップの画像データの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態に係るＤＮＡチップの解析装置および解析方法を説明する。
【００２４】
本発明のＤＮＡチップの解析装置は、スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップ１の、そのスポットの規則性を利用して、読み取り手段によって得られた画像の補正を行うものであり、たとえば例えば図５に示すように、スキャナー４（読み取り手段）と、スキャナー制御用ＰＣ５と、画像サーバー６と、解析用ＰＣ７（データ取得手段）とを具備する。
【００２５】
スキャナー４は、例えば、ＤＮＡチップ１を二方向に走査するための走査機構（本実施形態においては、チップの長手方向をｙ軸、それに直交する方向をｘ軸としている）と、ＤＮＡチップ１を複数載置するオートローダー機構とを備え、発光性の物質により標識されたＤＮＡサンプルを添加してハイブリダイゼーション反応させたＤＮＡチップを、レーザー光により励起し、画像データを取得する。当該二方向に走査する機構の基準軸は、歪みの無い画像を得るために、直交していることが好ましく、後述するように複数のＤＮＡチップを処理する場合には、当該基準軸の直交度を記録する手段を有していることが好ましい。なお、走査機構は、一般的に２軸ともスライダーが用いられることが多いが、例えばラインセンサカメラとスライダーを組合わせても良い。
【００２６】
画像データを取得する際には、スキャナー制御用ＰＣ５により、スキャナー４におけるＤＮＡチップ１の走査や画像取得の制御を行う。当該スキャナー制御用ＰＣ５としては、汎用パーソナルコンピュータなどを用いる。
【００２７】
また、得られた画像データは、ＤＮＡチップ画像ファイル８として画像サーバー６に保存する。ＤＮＡチップ１は、例えば蛍光色素Ｃｙ３，Ｃｙ５に対応する励起波長でスキャンされ、１つのＤＮＡチップ１に対応してそれぞれの励起波長に対応した画像データが得られるが、この画像データは、例えば、１６ビットグレイスケールＴｉｆｆフォーマット、ＢＭＰフォーマット、ＪＰＥＧフォーマットなどのファイル形式で保存される。
【００２８】
解析用ＰＣ７は、画像サーバー６に保存されたＤＮＡチップ画像ファイル８を読み込む。さらに解析実行用のパラメータ等を定義する解析定義ファイル９を読み込んで、ＤＮＡチップ画像の解析を実行し、数値化された解析結果データを数値化データファイル１０として出力する。この解析用ＰＣ７には、本発明の解析方法を実行するための解析ツールとなるプログラムが導入される。
【００２９】
以下に解析用ＰＣ７で行われるＤＮＡチップの解析について説明する。
【００３０】
まず、例えばスキャナーが２つのスライダーを備えたものである場合等、これらスライダーは必ずしも直交しているとは限らない。装置組み立て時、もしくは時間の経過等に伴って、ずれてしまうことある。そのため、スキャナーで読み取ったＤＮＡチップの画像も、例えば図７（ａ）に示すように傾いている可能性がある。
【００３１】
このように、ｘ軸とｙ軸が直交しない場合は得られた画像が歪んでしまい、テンプレートの検出エリアを得られた画像に正しく位置合わせすることが出来ない。このため、画像から直交度のズレを検出して補正する必要がある。
【００３２】
そのため、解析用ＰＣ７は、画像サーバー６に保存されているＤＮＡチップの画像ファイル８を読みこみ、画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、その後、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから、該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得する。
【００３３】
図６に該解析の手順例を示すブロック図を示す。
【００３４】
まず、Ｓｔｅｐ１では、ｘ軸に対して各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を検出する。すなわち、この工程では、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙを検出する。
【００３５】
より具体的には、画像データをｘ軸に対してｙ軸方向に投影し、Ｘ位置毎の積算強度（各画素値の積算値）を算出する。この処理を、画像データを予め設定した角度づつ回転させて繰り返す。投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向がずれている場合の積算強度グラフは、図７（ａ）に示すように振幅のないグラフになる。一方、投影方向とスポットのｙ軸方向の配列方向が一致した場合の積算強度グラフは、図７（ｂ）に示すとおり、信号の振幅が最大となる。投影データのこのような特徴を利用し、図８に示すように、横軸に画像の回転角度θ、縦軸に積算強度の標準偏差をとり、最大値をとる角度を求めることで、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙを検出することができる。なお、以上のようにして検出される角度θｙは、後述の工程で画像データを回転補正する際に用いるとともに、画像データの剪断変形歪みを補正する際に用いられる。
【００３６】
続いて、Ｓｔｅｐ２では、Ｓｔｅｐ１の処理の方向をｘｙ置き換えて行い、スポットのｘ軸に対する配列角度（隣接するスポットを直線的に結んだ線のｘ軸に対する傾斜角度）θｘを検出する。ここで検出される角度θｘは、後述の工程で画像データの剪断変形歪み補正する際に用いられる。
【００３７】
次に、Ｓｔｅｐ３においては、図９（ａ）、（ｂ）に示すとおり、スポットのｙ軸に対する配列角度θｙ分を補正角度として用い、画像データを回転させて、スポットをｙ軸に対して平行にする。
【００３８】
その後、Ｓｔｅｐ４においては、回転後の画像に対して、上述のように検出した二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式に基づいて変換（せん断変形）を実施し、画像の剪断変形歪みを補正する。下記式の（ｘ、ｙ）は変換前の座標、（Ｘ、Ｙ）は変換後の座標である。なお、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙは、数４に示すように、スポットのｘ軸に対する配列角度θｘからｙ軸に対する配列角度θｙを減じて求める。この変換後の画像を図９（ｃ）に示す。
【００３９】
【数３】
【００４０】
【数４】
【００４１】
上記Ｓｔｅｒｐ１からＳｔｅｐ４までが、画像データの回転を補正するステップと画像データの剪断変形歪みを補正するステップに該当する。なお、画像データの回転を補正するステップと画像データの剪断変形歪みを補正するステップとは、上述のｓｔｅｐ４の後に上述のｓｔｅｐ３を行うようにし、先に剪断変形歪みを補正し、その後回転を補正してもよい。また、ｓｔｅｐ２とｓｔｅｐ３の順番を入れ替えて、剪断変形歪みの補正に用いる二方向目のスポットの配列角度（上記態様ではスポットのｘ軸に対する配列角度θｘ）を求めるまえに、画像を回転してしまってもよい。
【００４２】
続いて、ｓｔｅｐ５、６において、画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量（テンプレートの基準位置からのずれ量）を算出する。
【００４３】
Ｓｔｅｐ５においてｘ軸方向のずれ量を算出するにあたっては、図１０（ａ）に示すように、せん断変形して得られた画像データについて、ｘ軸に対してｙ軸方向に各画素数値を投影し、Ｘ位置毎の各画素値の積算データ（図１０（ｂ））を取得する。そして、これと、ＤＮＡチップの設計情報から予め作成した基準データ（図１２（ｃ））とから、下記の相互相関関数に基づいてｘ軸方向のずれ量を算出する。
【００４４】
【数５】
【００４５】
図１２（ｂ）のｘ軸に対してｙ方向に投影したデータと、図１２（ｃ）の基準データとの相互相関関数を図１２（ｄ）に示す。投影データをｆ（ｘ）、基準データをｇ（ｘ）、基準データの移動量をｍ画素とすると、上記数５が相互相関関数ｆ＊ｇであり、投影データと基準データが重なる移動量ｍの時、最大値を取るので、その時の移動量ｍがｘ軸方向のずれ量となる。
【００４６】
なお、ｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量の検出は、ＤＮＡチップ単位で実施しても良いが、ＤＮＡチップ１自体の歪みを考慮し、ブロック単位で実施するのが好ましい。図１２（ｃ）においては、グラフの原点がブロックの始点を示し、スポットの配置位置に対応するＹ座標に１を、他を０に割当てている。
【００４７】
続いて、Ｓｔｅｐ６においては、Ｓｔｅｐ５の処理をｘｙ置き換えて行い、ｙ軸方向のずれ量を検出する。
【００４８】
そして、解析定義ファイルに保存しているテンプレートにおける各スポットの位置情報と、Ｓｔｅｐ５、Ｓｔｅｐ６で求めたｘ軸方向、ｙ軸方向のずれ量から、回転、歪みを補正した後の画像での各スポット中心座標を算出し、スポットの位置を検出する（Ｓｔｅｐ７）。なお、スキャナーで得られた画像を図１１（ａ）に、上述の処理を行って検出・確定したスポット位置が示された画像を図１１（ｂ）に示す。図（ｂ）の点線で描画した円の内部が、テンプレートで規定された検出エリアである。
【００４９】
その後Ｓｔｅｐ８においては、Ｓｔｅｐ７で求めた各スポットの中心座標から、スポット半径内の画素の信号強度について、平均値、メディアン値、標準偏差等の統計量を算出し、スポットの属するブロック番号、スポットの行列番号、配置されているＤＮＡ名と合わせて、各種数値データをファイルとして出力する。
【００５０】
本発明においては、このようにして遺伝子の発現に基づいて得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するが、得られる各種の数値データは、検体内で、求める遺伝子の存在や、ある遺伝子が発現しているか否か、またはどの程度発現しているかを解析するため等に用いられる。
【００５１】
以上のような本発明においては、ＤＮＡチップの解析において、スポットの規則性を利用して画像データ自体から当該画像の補正を行うため、走査機構の精度が悪い読取り装置によって得られた画像に対しても、ＤＮＡチップの基板上に配置された検出エリアの位置決め処理を高精度に実行可能となる。
なお、本実施形態においては、１枚の画像データを解析する場合について説明したが、複数のＤＮＡチップを単一のスキャナーで読み込み、解析を行う場合には、計算時間の短縮化を図るために、次のようにすることが好ましい。すなわち、先の画像データの解析で得られた、スキャナーの走査機構のずれ（走査機構の基準軸の直交度）に相当するθｘｙの情報をスキャナーに保存しておき、後続のＤＮＡチップをスキャナーで読み込みんで画像データを取得しファイルとして保存すると同時に当該ファイルのヘッダ部分にスキャナーで保存していたθｘｙの情報を書き込み、解析用ＰＣで当該ファイルから画像データを読み込むと同時にθｘｙの情報も読み込み、該θｘｙの情報に基づいて画像の補正を行うことが好ましい。
【００５２】
また本発明で解析されるＤＮＡチップとしては、図１２に示すように、基板上のプローブＤＮＡが固定化された表面（スポットの表面）が、基板上の他の表面より高い凹凸構造のものが望ましい。樹脂を射出成形する等してこのような構造とすることで、上記Ｓｔｅｐ１〜４において積算強度のグラフを求める際により凹凸のはっきりしたグラフを得ることができる。また、針等でスポットされたＤＮＡの広がりを押さえ、位置精度よくスポットを配置することが可能となる。
【００５３】
さらに上記実施形態においては、ＤＮＡチップにＤＮＡがスポットされた実施形態を説明したが、ＲＮＡをスポットしたチップに対しても適用可能である。
【符号の説明】
【００５４】
１ ＤＮＡチップ
２ 基板
３ スポット
４ スキャナー
５ スキャナー制御ＰＣ
６ 画像サーバー
７ 解析用ＰＣ
８ ＤＮＡ画像ファイル
９ 解析定義ファイル
１０ 数値化データファイル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得するＤＮＡチップの解析方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像データにおいて、二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度をそれぞれ求め、これらの角度から剪断変形歪みを補正する、請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度をスポットの配列角度θｘ、θｙとして得、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から画像データの剪断変更歪みを補正する、請求項２に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【数１】
【数２】
【請求項４】
ステップ（ａ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向のいずれか一方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を補正角度として画像データを回転補正する、請求項１〜３のいずれかに記載の請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【請求項５】
ＤＮＡチップの読取り手段と、請求項１〜４のいずれかに記載の方法により画像データから所望の数値データを取得するデータ取得手段とを有するＤＮＡチップの解析装置。
【請求項６】
前記読取り手段が、異なる方向に走査する２つの走査機構を備えるとともに、それら走査機構の基準軸の直交度を記録する記録手段を備えている、請求項５に記載のＤＮＡチップの解析装置。
【請求項１】
スポットが二方向に規則的に配列されたＤＮＡチップを用いる測定で得られた画像データを処理して所望の数値データを取得するにあたり、得られた画像データの回転を補正するステップ（ａ）と、得られた画像データの剪断変形歪みを補正するステップ（ｂ）とを実施し、ステップ（ａ）および（ｂ）を経た補正後の画像データから該画像データのｘ軸方向およびｙ軸方向のずれ量ならびにスポット位置を検出し、スポットにおける所望の数値データを取得するＤＮＡチップの解析方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像データにおいて、二方向に規則的に配列されているスポットの配列角度をそれぞれ求め、これらの角度から剪断変形歪みを補正する、請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度をスポットの配列角度θｘ、θｙとして得、該スポットの配列角度θｘ、θｙおよび下記式から画像データの剪断変更歪みを補正する、請求項２に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【数１】
【数２】
【請求項４】
ステップ（ａ）においては、得られた画像のｘ軸方向およびｙ軸方向のいずれか一方向に各画素値を投影積算するステップを、該画像を所定角度ずつ回転させて繰り返し、投影積算によって得られる信号の振幅が最大となる回転角度を補正角度として画像データを回転補正する、請求項１〜３のいずれかに記載の請求項１に記載のＤＮＡチップの解析方法。
【請求項５】
ＤＮＡチップの読取り手段と、請求項１〜４のいずれかに記載の方法により画像データから所望の数値データを取得するデータ取得手段とを有するＤＮＡチップの解析装置。
【請求項６】
前記読取り手段が、異なる方向に走査する２つの走査機構を備えるとともに、それら走査機構の基準軸の直交度を記録する記録手段を備えている、請求項５に記載のＤＮＡチップの解析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−１８２７０５（Ｐ２０１１−１８２７０５Ａ）
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１２７３（Ｐ２０１０−５１２７３）
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月２２日（２０１１．９．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月９日（２０１０．３．９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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