ＦＲＥＴプローブ、発現ベクター、細胞、およびＦＲＥＴ測定方法
【課題】標的分子によって使用が制限されることなく高い蛍光共鳴エネルギー移動の効率を有するＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ検出方法を提供する。
【解決手段】標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、ドナー領域とアクセプター領域の間に連結され、標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することによりドナー領域とアクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、アクセプター領域は、互いに連続配置され、励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有する。
【解決手段】標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、ドナー領域とアクセプター領域の間に連結され、標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することによりドナー領域とアクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、アクセプター領域は、互いに連続配置され、励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブおよび蛍光共鳴エネルギー移動の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達に関する研究は、従来、試験管内でシグナル伝達に関わる分子の同定や機能解析が行われていた。しかし、細胞内におけるシグナル伝達は、複数の分子の相互作用によって行われる複雑な反応であるため、実際の細胞内におけるシグナル伝達のメカニズムとは大きな隔たりがあった。現在、細胞内のシグナル伝達の解明において、細胞内の反応を可視化する蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用したＦＲＥＴプローブが注目されている。
【０００３】
蛍光共鳴エネルギー移動とは、近接する２つの色素分子において励起された一方の色素分子（ドナー分子）から近接する他方の色素分子（アクセプター分子）へ励起エネルギーが共鳴により移動する現象であり、この現象によりアクセプター分子から蛍光が放出される。そこで、ドナー分子とアクセプター分子を有し、シグナル伝達を行う２つの分子が結合した時にドナー分子とアクセプター分子が蛍光共鳴エネルギー移動を発生する距離に近接するように設計されたものがＦＲＥＴプローブである。
【０００４】
このＦＲＥＴプローブを用いて蛍光共鳴エネルギー移動を高感度に観察するためには、ドナー分子からアクセプター分子への励起エネルギーの移動効率を高める必要がある。すなわち、ドナー分子の励起エネルギーをアクセプター分子へ移動し易くする必要がある。
【０００５】
ここで、従来、ＦＲＥＴプローブのＲＮＡ上のハイブリダイゼーション領域を精度よく設計することでエネルギー移動効率を高めることが提案されている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に開示のＦＲＥＴプローブは、ＲＮＡの高感度検出に特化した方法であり、タンパク質や化合物など幅広い分野に応用されるＦＲＥＴプローブにおいて、汎用性が低いといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３７４６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、標的分子によって使用が制限されることなく高い蛍光共鳴エネルギー移動の効率を有するＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、
標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、
光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、
前記ドナー領域と前記アクセプター領域の間に連結され、前記標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することにより前記ドナー領域と前記アクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連続配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブを提供するものである。
【００１０】
ここで、前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、各アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することが好ましい。
また、前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することが好ましい。
また、前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子の特異的な結合に伴う前記構造変化領域の構造変化により、前記ドナー領域の前記ドナー分子と対向することが好ましい。
また、前記アクセプター領域の複数の前記蛍光タンパク質は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、標的分子と結合分子との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブであって、
前記標的分子と連結し、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記結合分子と連結し、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連結配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子を結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブを提供するものである。
【００１２】
ここで、前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、前記アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することが好ましい。
また、前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することが好ましい。
また、前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子と前記結合分子との特異的な結合により、前記ドナー領域のドナー分子と対向することが好ましい。
また、前記アクセプター領域は、互いにリンカーで連結される複数の前記蛍光タンパク質を有することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、上記のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードする核酸を含む発現ベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記に記載の発現ベクターを有する細胞を提供するものである。
また、本発明は、上記のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを細胞に導入し、前記細胞に光ビームを照射し、前記ドナー領域から前記アクセプター領域への蛍光共鳴エネルギー移動を測定するＦＲＥＴ測定方法を提供するものである。
ここで、前記蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、前記ドナー領域から発せられる蛍光の蛍光寿命の検出により行われることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、標的分子によって使用が制限されることなく高い蛍光共鳴エネルギー移動の効率を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態１にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図２】標的分子と結合する際の実施形態１のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図３】標的分子が結合した実施形態１のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図４】図１に示すＦＲＥＴプローブを用いてＦＲＥＴを測定するフローサイトメータの構成を表す図である。
【図５】本発明の実施形態２にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図６】標的分子と結合分子が結合する際の実施形態２のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図７】標的分子と結合分子が結合した実施形態２のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図８】本発明の実施形態３にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図９】本発明の実施形態３の変形例にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、添付の図面に示す好適実施形態に基づいて、本発明のＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ測定方法を詳細に説明する。
【００１７】
実施形態１
図１は、本発明の実施形態１に係るＦＲＥＴプローブ１０の模式図である。同図に示すＦＲＥＴプローブ１０は、図示しない標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により蛍光共鳴エネルギーを発生させるものであって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光色素を結合するためのドナー領域１４と、標的分子との特異的な結合に伴って構造変化する構造変化領域１６と、励起エネルギーを受けて蛍光を放出する蛍光色素を結合するためのアクセプター領域１８と、これらの領域を互いに連結する複数のリンカー２０とを有して構成される。
【００１８】
ドナー領域１４は、ＦＲＥＴプローブ１０の一端側に配置されるアミノ酸配列であって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する図示しない蛍光色素（ドナー分子）を結合するためのアミノ酸配列である１つのドナー結合配列２４を有する。なお、１つのドナー結合配列２４には１つのドナー分子が結合できる。
【００１９】
構造変化領域１６は、ドナー領域１４に連結して配置されるアミノ酸配列であって、構造変化領域１６の一部に標的分子と特異的に結合する標的分子結合部位２６を有する。構造変化領域１６は、標的分子結合部位２６と標的分子との特異的な結合に伴って、構造変化領域１６の両端に連結されるドナー領域１４とアクセプター領域１８を近接させるように構造変化する。
【００２０】
アクセプター領域１８は、構造変化領域１６に連結することによりＦＲＥＴプローブ１０の他端側に配置されるアミノ酸配列であって、ドナー分子２２からの励起エネルギーを受けて蛍光を放出する図示しない蛍光色素（アクセプター分子）を結合するためのアミノ酸配列である３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃを順次連結して構成される。なお、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃには、それぞれ１つのアクセプター分子が結合できる。また、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃは、構造変化領域１６の構造変化に伴いドナー領域１４とアクセプター領域１８とが近接する時に、アクセプター領域１８に結合する少なくとも１つのアクセプター分子がドナー領域１４に結合するドナー分子２２と蛍光共鳴エネルギー移動の発生する距離に近接するように設計される。
【００２１】
ドナー領域１４と構造変化領域１６の間およびアクセプター領域１８と構造変化領域１６の間がそれぞれアミノ酸配列からなるリンカー２０によって連結されている。また、アクセプター領域１８においても各アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃの間がリンカー２０により連結されている。各リンカー２０を構成するアミノ酸配列やその長さは、標的分子１２と構造変化領域１６の結合や蛍光共鳴エネルギー移動を阻害しないものであれば何ら限定されない。
【００２２】
次に、図２および３に示す模式図を用いて、ＦＲＥＴプローブ１０における蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。図２に示すように、標的分子１２との結合前のＦＲＥＴプローブ１０は、ドナー領域１４に１つのドナー分子２２を結合し、構造変化領域１６を挟んでドナー領域１４の他端側に配置されるアクセプター領域１８に３つのアクセプター分子２８を結合して存在する。なお、３つのアクセプター分子２８は、アクセプター領域１８に設けられた３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃにそれぞれ結合する。
【００２３】
ＦＲＥＴプローブ１０の構造変化領域１６と標的分子１２が特異的に結合すると、図３に示すように、構造変化領域１６がドナー領域１４とアクセプター領域１８とを近接させるように（構造変化領域１６を曲げるように）構造変化する。この構造変化により、アクセプター領域１８に結合する３つのアクセプター分子２８のうち、少なくとも１つのアクセプター分子２８とドナー領域１４に結合するドナー分子２２が、蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接される。なお、図３に示すように、構造変化領域１６は３つのアクセプター分子２８全てにドナー分子２２からの蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離にドナー領域１４とアクセプター領域１８を近接させ、３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃのうち中央部に位置するアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８がドナー領域１４に結合するドナー分子２２と対向するように構造変化するのが好ましい。
【００２４】
次に、ドナー分子２２を励起する波長の光ビームをドナー分子２２へ照射すると、ドナー分子２２が励起され、励起エネルギーがドナー分子２２から各アクセプター分子２８へ移動する。また、ドナー分子２２と最も近接するアクセプター分子２８（アクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８）には最も強度の大きい励起エネルギーの移動が生じる（図３の矢印Ｍ２）。このように、３つのアクセプター分子２８を配列することで、ドナー分子２２の励起エネルギーをアクセプター分子２８へ移動し易くすることができる。すなわち、励起エネルギーの移動効率を高めることができる。また、構造変化領域１６の構造変化の誤差等に起因してドナー分子２２とアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子２８（アクセプター結合配列３０ａおよびｃに結合するアクセプター分子２８）がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００２５】
続いて、励起エネルギーにより励起された３つのアクセプター分子２８は、励起状態から基底状態に戻るときに各々蛍光を放出する。ここで、アクセプター結合配列３０ｂのドナー分子２８が最も強度の大きい励起エネルギーを受けているので、各アクセプター分子２８から放出される蛍光強度もアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８が最も大きくなる（図３の矢印Ｎ２）。また、光ビームが照射されドナー分子２２からアクセプター分子２８へ移動しなかった励起エネルギーにより、ドナー分子２２自体からも蛍光を放出する。
ここで、蛍光共鳴エネルギー移動は光学的手法を用いて観察することができる。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動に伴うアクセプター分子２８からの蛍光強度並びに蛍光寿命および蛍光共鳴エネルギー移動に伴うドナー分子２２の蛍光強度並びに蛍光寿命により観察することができる。
【００２６】
なお、ドナー分子２２とアクセプター分子２８は、これら両分子間に蛍光共鳴エネルギー移動が発生する蛍光波長を有していれば特に限定されず、例えばＦＬＡｓＨ（インビトロジェン）などの市販の蛍光色素を用いて行うことができる。また、ドナー結合配列２４とアクセプター結合配列３０は、ドナー分子２２またはアクセプター分子２８に応じて変えることができ、例えばテトラシステインタグ（−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−）が利用できる。
【００２７】
次に、ＦＲＥＴプローブ１０の作成方法と、ＦＲＥＴプローブ１０を用いて行われる蛍光共鳴エネルギー移動の測定方法について説明する。
【００２８】
まず、ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸の作成を行う。ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、ドナー領域１４、構造変化領域１６、アクセプター領域１８、および複数のリンカー２０から成るＦＲＥＴプローブ１０をコードする遺伝子配列を、所定の順番で直鎖状に連結して調整する。なお、ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、公知の遺伝子工学的技術により取得でき、例えばＰＣＲにより合成する方法や各遺伝子を発現している細胞３２からｃＤＮＡライブラリーを調整してスクリーニングする方法などが利用できる。
調整されたＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、例えば制限酵素配列を利用してベクターに挿入することができる。なお、ベクターは蛍光共鳴エネルギー移動の測定に使用する細胞内でＦＲＥＴプローブ１０を発現できるものであれば特に限定されない。このようにして得られた発現ベクターは、公知の形質転換方法に従い細胞内に導入することができ、形質転換された細胞（ＦＲＥＴプローブ１０が導入された細胞）をＦＲＥＴプローブ１０の発現可能な条件で培養する。このような方法により、ＦＲＥＴプローブ１０が作成できる。
【００２９】
なお、ドナー領域１４およびアクセプター領域１８に蛍光色素（ドナー分子２２およびアクセプター分子２８）を結合する方法は、用いる蛍光色素の種類に適する方法で行えばよい。
【００３０】
細胞内で発現したＦＲＥＴプローブ１０は、蛍光分子を結合すると、細胞内に標的分子が存在する場合には標的分子と結合し、図３に示すような構造変化を行う。また、細胞内に標的分子が存在しない場合、ＦＲＥＴプローブ１０は図３に示すような構造変化を起こさない。続いて、これら細胞をフローサイトメータ３４に供する。
【００３１】
フローサイトメータ３４を用いて蛍光共鳴エネルギー移動の測定が開始されると、細胞３２はフローセル３６内を１列で間隔をあけて１つずつ流れると共に、光学ユニット３８は照射部４０からフローセル３６へ向けてドナー分子２２を励起させる特定波長のレーザ光の照射を開始する。フローセル３６を１列で１つずつ流れる細胞３２がレーザ光の照射域を通過すると、標的分子を有しない（蛍光共鳴エネルギー移動の発生していない）細胞３２からは、レーザ光による、前方散乱光、側方散乱光、ドナー分子２２からの蛍光、およびアクセプター分子２８からの蛍光が生じる。また、標的分子を有する（図３に示すような蛍光共鳴エネルギー移動の発生する）細胞３２からは、レーザ光による、前方散乱光、側方散乱光、ドナー分子２２からの蛍光、およびアクセプター分子２８からの蛍光が生じると共に、蛍光共鳴エネルギー移動によるアクセプター分子２８からの蛍光が生じる。
ここで、ＦＲＥＴプローブ１０のアクセプター領域１８に３つのアクセプター分子２８を配列したことで、標的分子を有する細胞３２において、ドナー分子２２の励起エネルギーがアクセプター分子２８へ移動し易くなる。すなわち、励起エネルギーの移動効率が高くなる。また、構造変化領域１６の構造変化の誤差等に起因してドナー分子２２とアクセプター分子２８との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子２８がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００３２】
このように各細胞３２がレーザ光照射域を通過すると、前方散乱光が受光部４２ａにより検出され、側方散乱光、ドナー分子２２、およびアクセプター分子２８からの蛍光が受光部４２ｂにより検出され、それぞれの検出強度に応じたアナログ電気信号が解析部４４に送信される。なお、受光部４２ａは、フローセル３６を挟んで照射部４０と対向するように配置され、受光部４２ｂは、照射部４０からのレーザ光の照射方向に対して垂直方向であって、かつ、フローセル３６の中心軸に対して垂直方向に配置されている。
【００３３】
アナログ電気信号を受信した解析部４４は、それぞれの細胞３２について前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、ドナー分子２２からの蛍光強度および蛍光寿命、アクセプター分子２８からの蛍光強度および蛍光寿命の解析を行い、標的物質を有する細胞３２であるか否かを判断する。
【００３４】
ここで、ドナー分子２２からアクセプター分子２８への蛍光共鳴エネルギー移動の効率を高めたことにより、ドナー分子２２およびアクセプター分子２８からの蛍光強度を高感度に検出でき、より正確な解析を行うことができる。
なお、アクセプター分子２８からの蛍光強度および蛍光寿命のみを基に解析を行うと、アクセプター分子２８からの蛍光には、ドナー分子２２からの励起エネルギーによる蛍光だけでなく光ビームによりアクセプター分子２８が直接励起されたことによる蛍光も含まれるため、解析結果に誤差が生じるおそれがある。一方、ドナー分子２２からの蛍光は、ドナー分子２２からアクセプター分子２８へ移動しなかった励起エネルギーによりドナー分子２２から発せられる蛍光（励起エネルギーの移動量に応じて変化する蛍光）である。このように、ドナー分子２２からの蛍光は、蛍光共鳴エネルギー移動に関係しないエネルギーによる蛍光を含むおそれが少ないため、ドナー分子２２からの蛍光強度および蛍光寿命を基に解析を行うのが好ましい。
【００３５】
解析部４４は、それぞれの細胞３２について解析が終了すると解析結果を出力し、所望の結果が得られた段階で蛍光共鳴エネルギー移動の測定を終了する。
【００３６】
なお、蛍光共鳴エネルギー移動の測定方法の詳細は、例えば、特開２００７−２４０４２４号公報等に開示されている。
【００３７】
本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０によれば、標的分子１２や構造変化領域１６の種類に関わらずアクセプター結合配列３０を複数連結して配置すればよく汎用性が高い。
また、実験系の確立していない標的分子であってもその特性に縛られることなく柔軟なＦＲＥＴプローブ１０の設計ができる。すなわち、標的分子の構造等によりＦＲＥＴプローブ１０の設計が困難で、近接したドナー分子２２とアクセプター分子２８の位置にずれが生じる場合でも、他のアクセプター分子２８がそれを補いドナー分子２２からの励起エネルギーを受け取ることができるため、ＦＲＥＴプローブ１０の柔軟な設計が可能である。
また、ドナー分子２２からアクセプター分子２８へのＦＲＥＴ効率が高まることにより、蛍光共鳴エネルギー移動を高感度に観察することができる。
また、遺伝子工学的手段によりアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃをそれぞれ連結して配置すればよく、簡便な作業により蛍光共鳴エネルギー移動の効率を高めることができる。
【００３８】
実施形態２
図５は、本発明の実施形態２に係るＦＲＥＴプローブ５０の模式図である。同図に示すＦＲＥＴプローブ５０は、標的分子５２と結合分子５４との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブ５０であって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナープローブ部５６と、励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプタープローブ部５８とを有して構成される。
ドナープローブ部５６は、図示しないドナー分子を結合するためのアミノ酸配列である１つのドナー結合配列６０を有するドナー領域６２と、ドナー領域６２に連結された標的分子５２を有する。
アクセプタープローブ部５８は、図示しないアクセプター分子を結合するためのアミノ酸配列である３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃを順次連結して構成されるアクセプター領域６６と、アクセプター領域６６に連結され標的分子５２と特異的に結合する結合分子５４を有する。また、アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃは、標的分子５２と結合分子５４との特異的な結合に伴いドナー領域６２とアクセプター領域６６とが近接する時に、アクセプター領域６６に結合する少なくとも１つのアクセプター分子がドナー領域６２に結合するドナー分子と蛍光共鳴エネルギー移動を発生し得る距離に近接するように設計される。
【００３９】
なお、ドナープローブ部５６のドナー領域６２と標的分子５２の間およびアクセプタープローブ部５８のアクセプター領域６６と結合分子５４との間がそれぞれアミノ酸配列からなるリンカー６８により連結されている。また、アクセプター領域６６においても各アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃの間がそれぞれリンカー６８により連結されている。各リンカー６８を構成するアミノ酸配列やその長さは、標的分子５２と結合分子５４の結合や蛍光共鳴エネルギー移動を阻害しないものであれば何ら限定されない。
【００４０】
次に、図６および７に示す模式図を用いて、ＦＲＥＴプローブ５０における蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。図６に示すように、標的分子５２と結合分子５４の結合前のＦＲＥＴプローブ５０は、ドナープローブ部５６のドナー領域６２に１つのドナー分子７０を結合し、アクセプタープローブ部５８のアクセプター領域６６に３つのアクセプター分子７２を結合して存在する。なお、３つのアクセプター分子７２は、アクセプター領域６６に設けられた３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃにそれぞれ結合している。
【００４１】
ドナープローブ部５６の標的分子５２とアクセプタープローブ部５８の結合分子５４との特異的な結合に伴い、図７に示すようにドナー領域６２とアクセプター領域６６とが近接する。これにより、アクセプター領域６６に結合する３つのアクセプター分子７２のうち、少なくとも１つのアクセプター分子７２とドナー領域６２に結合するドナー分子７０が、蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接される。なお、図７に示すように、ドナー領域６２とアクセプター領域６６はドナー分子７０から３つのアクセプター分子７２全てに蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接し、３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃのうち中央部に位置するアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２がドナー領域６２に結合するドナー分子７０と対向するように近接するのが好ましい。
【００４２】
次に、ドナー分子７０を励起する波長の光ビームをドナー分子７０へ照射すると、ドナー分子７０が励起され、励起エネルギーがドナー分子７０から各アクセプター分子７２へ移動する。また、ドナー分子７０と最も近接するアクセプター分子７２（アクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２）には最も強度の大きい励起エネルギーの移動が生じる（図７の矢印Ｍ２）。このように、３つのアクセプター分子７２を配列することで、ドナー分子７０の励起エネルギーをアクセプター分子７２へ移動し易くすることができる。すなわち、励起エネルギーの移動効率を高めることができる。また、ドナー分子７０とアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子７２（アクセプター結合配列６４ａおよび６４ｃに結合するアクセプター分子７２）がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００４３】
続いて、励起エネルギーにより励起された３つのアクセプター分子７２は、励起状態から基底状態に戻るときに各々蛍光を放出する。ここで、アクセプター結合配列６４ｂのアクセプター分子７２が最も強度の大きい励起エネルギーを受けているので、各アクセプター分子７２から放出される蛍光強度もアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２が最も大きくなる（図３の矢印Ｎ２）。
なお、光ビームが照射されドナー分子７０からアクセプター分子７２へ移動しなかった励起エネルギーにより、ドナー分子７０も蛍光を放出する。また、アクセプター分子７２は、直接アクセプター分子７２に照射された光ビームによる蛍光も放出する。
【００４４】
なお、本実施形態において、ドナープローブ部５６が標的分子５２を有しアクセプタープローブ部５８が結合分子５４を有していたが、ドナープローブ部５６が結合分子５４を有しアクセプタープローブ部５８が標的分子５２を有する構成でもよい。
また、実施形態１および２のドナー結合配列２４および６０は、それぞれ１つのドナー分子２２および７０を結合するためのアミノ酸配列であるが、複数のドナー分子２２および７０を結合するためのアミノ酸配列であってもよい。また、実施形態１および２のアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃおよび６４ａ〜６４ｃは、それぞれ１つのアクセプター分子２８および７２を結合するためのアミノ酸配列であるが、複数のアクセプター分子２８および７２を結合するためのアミノ酸配列であってもよい。また、実施形態１および２において、ドナー領域１４および６２は１つのドナー結合配列１４および６０から構成されているが、複数のドナー結合配列１４および６０から構成されてもよい。
【００４５】
なお、本実施形態のドナー領域５２およびアクセプター領域７２は、実施形態１のドナー領域１４およびアクセプター領域１８と同様の構成である。また、本実施形態のＦＲＥＴプローブ５０は、実施形態１のＦＲＥＴプローブ１０と同様の方法で作成することができ、ＦＲＥＴプローブ５０（ドナープローブ部５６とアクセプタープローブ部５８）をコードする核酸をベクターに挿入して作成された発現ベクターを細胞内に導入し、同じ細胞内でＦＲＥＴプローブ５０を発現することができる。このような実施形態２のＦＲＥＴプローブ５０を用いても実施形態１と同様に蛍光共鳴エネルギー移動の測定を行うことができる。
【００４６】
実施形態３
また、実施形態１では、ドナー領域１４およびアクセプター領域１８にそれぞれ蛍光色素であるドナー分子２２およびアクセプター分子３０を結合していたが、図８に示すようにドナー領域１４およびアクセプター領域１８が蛍光タンパク質から構成されるようにしてもよい。例えば、構造変化領域１６の両端に設けられたドナー領域１４とアクセプター領域１８において、ドナー領域１４に１つのドナー蛍光タンパク質７４を配置し、アクセプター領域１８にそれぞれリンカー２０で連結された３つのアクセプター蛍光タンパク質７６を配置することができる。また、実施形態２においても同様であり、図９に示すようにドナー領域６２およびアクセプター領域６６が蛍光タンパク質から構成されるようにしてもよい。例えば、ドナープローブ部５６の標的分子５２に連結されたドナー領域６２に１つのドナー蛍光タンパク質７４を配置し、アクセプタープローブ部５８の結合分子５４に連結されたアクセプター領域６６にそれぞれリンカー６８で連結された３つのアクセプター蛍光タンパク質７６を配置することができる。
【００４７】
なお、ドナー領域１４および６２のドナー蛍光タンパク質７４とアクセプター領域１８および６６のアクセプター蛍光タンパク質７６は、両蛍光タンパク質間に蛍光共鳴エネルギー移動が発生する蛍光波長を有していれば特に限定されず、例えばＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が利用できる。
なお、本実施形態のドナー領域１４、構造変化領域１６、およびアクセプター領域１８の配置、または、ドナー領域６２、標的分子５２、アクセプター領域６６、および結合分子５４の配置は、実施形態１または２と同様である。また、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０および５０は、実施形態１および２のＦＲＥＴプローブ１０および５０と同様の方法で作成することができ、このような実施形態３のＦＲＥＴプローブ１０および５０を用いても実施形態１および２と同様に蛍光共鳴エネルギー移動の測定を行うことができる。
【００４８】
なお、実施形態１および２のアクセプター領域１８および６６は、３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃおよび３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃが順次連結して構成され、また、実施形態３においても同様にアクセプター領域１８および６６は、３つのアクセプター蛍光タンパク質７６が順次連結して構成されているが、これらは３つでなくともよく、複数であればよい。すなわち、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃ、アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃ、およびアクセプター蛍光タンパク質７６は、複数連結されていればよく２つまたは４つ以上が順次連結された構成であってもよい。また、実施形態１〜３のアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃ、６４ａ〜６４ｃ、およびアクセプター蛍光タンパク質７６の連結は、リンカー２０および６８で順次連結されて構成されているが、リンカー２０および６８を介さずに複数連続して配置されていてもよい。
【００４９】
また、実施形態１〜３のアクセプター領域１８および６６は、蛍光色素（アクセプター分子２２および７２）または蛍光タンパク質（アクセプター蛍光タンパク質７６）によりドナー領域１４および６２から励起エネルギーを受けているが、ドナー領域１４および６２とアクセプター領域１８および６６との間で蛍光共鳴エネルギー移動が発生すれば蛍光を発しないアクセプター分子またはタンパク質であってもよい。この場合、蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、ドナー分子２２および７０からの蛍光強度および蛍光寿命により行うことができる。
【００５０】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００５１】
１０、５０ ＦＲＥＴプローブ
１２、５２ 標的分子
１４、６２ ドナー領域
１６ 構造変化領域
１８、６６ アクセプター領域
２０、６８ リンカー
２２、７０ ドナー分子
２４、６０ ドナー結合配列
２６ 標的分子結合部位
２８、７２ アクセプター分子
３０ａ〜３０ｃ、６４ａ〜６４ｃ アクセプター結合配列
３２ 細胞
３４ フローサイトメータ
３６ フローセル
３８ 光学ユニット
４０ 照射部
４２ａ、４２ｂ 受光部
４４ 解析部
５４ 結合分子
５６ ドナープローブ部
５８ アクセプタープローブ部
７４ ドナー蛍光タンパク質
７６ アクセプター蛍光タンパク質
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブおよび蛍光共鳴エネルギー移動の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達に関する研究は、従来、試験管内でシグナル伝達に関わる分子の同定や機能解析が行われていた。しかし、細胞内におけるシグナル伝達は、複数の分子の相互作用によって行われる複雑な反応であるため、実際の細胞内におけるシグナル伝達のメカニズムとは大きな隔たりがあった。現在、細胞内のシグナル伝達の解明において、細胞内の反応を可視化する蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用したＦＲＥＴプローブが注目されている。
【０００３】
蛍光共鳴エネルギー移動とは、近接する２つの色素分子において励起された一方の色素分子（ドナー分子）から近接する他方の色素分子（アクセプター分子）へ励起エネルギーが共鳴により移動する現象であり、この現象によりアクセプター分子から蛍光が放出される。そこで、ドナー分子とアクセプター分子を有し、シグナル伝達を行う２つの分子が結合した時にドナー分子とアクセプター分子が蛍光共鳴エネルギー移動を発生する距離に近接するように設計されたものがＦＲＥＴプローブである。
【０００４】
このＦＲＥＴプローブを用いて蛍光共鳴エネルギー移動を高感度に観察するためには、ドナー分子からアクセプター分子への励起エネルギーの移動効率を高める必要がある。すなわち、ドナー分子の励起エネルギーをアクセプター分子へ移動し易くする必要がある。
【０００５】
ここで、従来、ＦＲＥＴプローブのＲＮＡ上のハイブリダイゼーション領域を精度よく設計することでエネルギー移動効率を高めることが提案されている（特許文献１）。
【０００６】
しかしながら、特許文献１に開示のＦＲＥＴプローブは、ＲＮＡの高感度検出に特化した方法であり、タンパク質や化合物など幅広い分野に応用されるＦＲＥＴプローブにおいて、汎用性が低いといった問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−３７４６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、標的分子によって使用が制限されることなく高い蛍光共鳴エネルギー移動の効率を有するＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明は、
標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、
光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、
前記ドナー領域と前記アクセプター領域の間に連結され、前記標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することにより前記ドナー領域と前記アクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連続配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブを提供するものである。
【００１０】
ここで、前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、各アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することが好ましい。
また、前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することが好ましい。
また、前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子の特異的な結合に伴う前記構造変化領域の構造変化により、前記ドナー領域の前記ドナー分子と対向することが好ましい。
また、前記アクセプター領域の複数の前記蛍光タンパク質は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることが好ましい。
【００１１】
また、本発明は、標的分子と結合分子との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブであって、
前記標的分子と連結し、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記結合分子と連結し、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連結配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子を結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブを提供するものである。
【００１２】
ここで、前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることが好ましい。
また、前記アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することが好ましい。
また、前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することが好ましい。
また、前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子と前記結合分子との特異的な結合により、前記ドナー領域のドナー分子と対向することが好ましい。
また、前記アクセプター領域は、互いにリンカーで連結される複数の前記蛍光タンパク質を有することが好ましい。
また、前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることが好ましい。
【００１３】
また、本発明は、上記のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードする核酸を含む発現ベクターを提供するものである。
また、本発明は、上記に記載の発現ベクターを有する細胞を提供するものである。
また、本発明は、上記のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを細胞に導入し、前記細胞に光ビームを照射し、前記ドナー領域から前記アクセプター領域への蛍光共鳴エネルギー移動を測定するＦＲＥＴ測定方法を提供するものである。
ここで、前記蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、前記ドナー領域から発せられる蛍光の蛍光寿命の検出により行われることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、標的分子によって使用が制限されることなく高い蛍光共鳴エネルギー移動の効率を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態１にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図２】標的分子と結合する際の実施形態１のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図３】標的分子が結合した実施形態１のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図４】図１に示すＦＲＥＴプローブを用いてＦＲＥＴを測定するフローサイトメータの構成を表す図である。
【図５】本発明の実施形態２にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図６】標的分子と結合分子が結合する際の実施形態２のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図７】標的分子と結合分子が結合した実施形態２のＦＲＥＴプローブを表す図である。
【図８】本発明の実施形態３にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【図９】本発明の実施形態３の変形例にかかるＦＲＥＴプローブの構成を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、添付の図面に示す好適実施形態に基づいて、本発明のＦＲＥＴプローブおよびＦＲＥＴ測定方法を詳細に説明する。
【００１７】
実施形態１
図１は、本発明の実施形態１に係るＦＲＥＴプローブ１０の模式図である。同図に示すＦＲＥＴプローブ１０は、図示しない標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により蛍光共鳴エネルギーを発生させるものであって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光色素を結合するためのドナー領域１４と、標的分子との特異的な結合に伴って構造変化する構造変化領域１６と、励起エネルギーを受けて蛍光を放出する蛍光色素を結合するためのアクセプター領域１８と、これらの領域を互いに連結する複数のリンカー２０とを有して構成される。
【００１８】
ドナー領域１４は、ＦＲＥＴプローブ１０の一端側に配置されるアミノ酸配列であって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する図示しない蛍光色素（ドナー分子）を結合するためのアミノ酸配列である１つのドナー結合配列２４を有する。なお、１つのドナー結合配列２４には１つのドナー分子が結合できる。
【００１９】
構造変化領域１６は、ドナー領域１４に連結して配置されるアミノ酸配列であって、構造変化領域１６の一部に標的分子と特異的に結合する標的分子結合部位２６を有する。構造変化領域１６は、標的分子結合部位２６と標的分子との特異的な結合に伴って、構造変化領域１６の両端に連結されるドナー領域１４とアクセプター領域１８を近接させるように構造変化する。
【００２０】
アクセプター領域１８は、構造変化領域１６に連結することによりＦＲＥＴプローブ１０の他端側に配置されるアミノ酸配列であって、ドナー分子２２からの励起エネルギーを受けて蛍光を放出する図示しない蛍光色素（アクセプター分子）を結合するためのアミノ酸配列である３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃを順次連結して構成される。なお、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃには、それぞれ１つのアクセプター分子が結合できる。また、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃは、構造変化領域１６の構造変化に伴いドナー領域１４とアクセプター領域１８とが近接する時に、アクセプター領域１８に結合する少なくとも１つのアクセプター分子がドナー領域１４に結合するドナー分子２２と蛍光共鳴エネルギー移動の発生する距離に近接するように設計される。
【００２１】
ドナー領域１４と構造変化領域１６の間およびアクセプター領域１８と構造変化領域１６の間がそれぞれアミノ酸配列からなるリンカー２０によって連結されている。また、アクセプター領域１８においても各アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃの間がリンカー２０により連結されている。各リンカー２０を構成するアミノ酸配列やその長さは、標的分子１２と構造変化領域１６の結合や蛍光共鳴エネルギー移動を阻害しないものであれば何ら限定されない。
【００２２】
次に、図２および３に示す模式図を用いて、ＦＲＥＴプローブ１０における蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。図２に示すように、標的分子１２との結合前のＦＲＥＴプローブ１０は、ドナー領域１４に１つのドナー分子２２を結合し、構造変化領域１６を挟んでドナー領域１４の他端側に配置されるアクセプター領域１８に３つのアクセプター分子２８を結合して存在する。なお、３つのアクセプター分子２８は、アクセプター領域１８に設けられた３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃにそれぞれ結合する。
【００２３】
ＦＲＥＴプローブ１０の構造変化領域１６と標的分子１２が特異的に結合すると、図３に示すように、構造変化領域１６がドナー領域１４とアクセプター領域１８とを近接させるように（構造変化領域１６を曲げるように）構造変化する。この構造変化により、アクセプター領域１８に結合する３つのアクセプター分子２８のうち、少なくとも１つのアクセプター分子２８とドナー領域１４に結合するドナー分子２２が、蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接される。なお、図３に示すように、構造変化領域１６は３つのアクセプター分子２８全てにドナー分子２２からの蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離にドナー領域１４とアクセプター領域１８を近接させ、３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃのうち中央部に位置するアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８がドナー領域１４に結合するドナー分子２２と対向するように構造変化するのが好ましい。
【００２４】
次に、ドナー分子２２を励起する波長の光ビームをドナー分子２２へ照射すると、ドナー分子２２が励起され、励起エネルギーがドナー分子２２から各アクセプター分子２８へ移動する。また、ドナー分子２２と最も近接するアクセプター分子２８（アクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８）には最も強度の大きい励起エネルギーの移動が生じる（図３の矢印Ｍ２）。このように、３つのアクセプター分子２８を配列することで、ドナー分子２２の励起エネルギーをアクセプター分子２８へ移動し易くすることができる。すなわち、励起エネルギーの移動効率を高めることができる。また、構造変化領域１６の構造変化の誤差等に起因してドナー分子２２とアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子２８（アクセプター結合配列３０ａおよびｃに結合するアクセプター分子２８）がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００２５】
続いて、励起エネルギーにより励起された３つのアクセプター分子２８は、励起状態から基底状態に戻るときに各々蛍光を放出する。ここで、アクセプター結合配列３０ｂのドナー分子２８が最も強度の大きい励起エネルギーを受けているので、各アクセプター分子２８から放出される蛍光強度もアクセプター結合配列３０ｂに結合するアクセプター分子２８が最も大きくなる（図３の矢印Ｎ２）。また、光ビームが照射されドナー分子２２からアクセプター分子２８へ移動しなかった励起エネルギーにより、ドナー分子２２自体からも蛍光を放出する。
ここで、蛍光共鳴エネルギー移動は光学的手法を用いて観察することができる。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動に伴うアクセプター分子２８からの蛍光強度並びに蛍光寿命および蛍光共鳴エネルギー移動に伴うドナー分子２２の蛍光強度並びに蛍光寿命により観察することができる。
【００２６】
なお、ドナー分子２２とアクセプター分子２８は、これら両分子間に蛍光共鳴エネルギー移動が発生する蛍光波長を有していれば特に限定されず、例えばＦＬＡｓＨ（インビトロジェン）などの市販の蛍光色素を用いて行うことができる。また、ドナー結合配列２４とアクセプター結合配列３０は、ドナー分子２２またはアクセプター分子２８に応じて変えることができ、例えばテトラシステインタグ（−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−）が利用できる。
【００２７】
次に、ＦＲＥＴプローブ１０の作成方法と、ＦＲＥＴプローブ１０を用いて行われる蛍光共鳴エネルギー移動の測定方法について説明する。
【００２８】
まず、ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸の作成を行う。ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、ドナー領域１４、構造変化領域１６、アクセプター領域１８、および複数のリンカー２０から成るＦＲＥＴプローブ１０をコードする遺伝子配列を、所定の順番で直鎖状に連結して調整する。なお、ＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、公知の遺伝子工学的技術により取得でき、例えばＰＣＲにより合成する方法や各遺伝子を発現している細胞３２からｃＤＮＡライブラリーを調整してスクリーニングする方法などが利用できる。
調整されたＦＲＥＴプローブ１０をコードする核酸は、例えば制限酵素配列を利用してベクターに挿入することができる。なお、ベクターは蛍光共鳴エネルギー移動の測定に使用する細胞内でＦＲＥＴプローブ１０を発現できるものであれば特に限定されない。このようにして得られた発現ベクターは、公知の形質転換方法に従い細胞内に導入することができ、形質転換された細胞（ＦＲＥＴプローブ１０が導入された細胞）をＦＲＥＴプローブ１０の発現可能な条件で培養する。このような方法により、ＦＲＥＴプローブ１０が作成できる。
【００２９】
なお、ドナー領域１４およびアクセプター領域１８に蛍光色素（ドナー分子２２およびアクセプター分子２８）を結合する方法は、用いる蛍光色素の種類に適する方法で行えばよい。
【００３０】
細胞内で発現したＦＲＥＴプローブ１０は、蛍光分子を結合すると、細胞内に標的分子が存在する場合には標的分子と結合し、図３に示すような構造変化を行う。また、細胞内に標的分子が存在しない場合、ＦＲＥＴプローブ１０は図３に示すような構造変化を起こさない。続いて、これら細胞をフローサイトメータ３４に供する。
【００３１】
フローサイトメータ３４を用いて蛍光共鳴エネルギー移動の測定が開始されると、細胞３２はフローセル３６内を１列で間隔をあけて１つずつ流れると共に、光学ユニット３８は照射部４０からフローセル３６へ向けてドナー分子２２を励起させる特定波長のレーザ光の照射を開始する。フローセル３６を１列で１つずつ流れる細胞３２がレーザ光の照射域を通過すると、標的分子を有しない（蛍光共鳴エネルギー移動の発生していない）細胞３２からは、レーザ光による、前方散乱光、側方散乱光、ドナー分子２２からの蛍光、およびアクセプター分子２８からの蛍光が生じる。また、標的分子を有する（図３に示すような蛍光共鳴エネルギー移動の発生する）細胞３２からは、レーザ光による、前方散乱光、側方散乱光、ドナー分子２２からの蛍光、およびアクセプター分子２８からの蛍光が生じると共に、蛍光共鳴エネルギー移動によるアクセプター分子２８からの蛍光が生じる。
ここで、ＦＲＥＴプローブ１０のアクセプター領域１８に３つのアクセプター分子２８を配列したことで、標的分子を有する細胞３２において、ドナー分子２２の励起エネルギーがアクセプター分子２８へ移動し易くなる。すなわち、励起エネルギーの移動効率が高くなる。また、構造変化領域１６の構造変化の誤差等に起因してドナー分子２２とアクセプター分子２８との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子２８がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００３２】
このように各細胞３２がレーザ光照射域を通過すると、前方散乱光が受光部４２ａにより検出され、側方散乱光、ドナー分子２２、およびアクセプター分子２８からの蛍光が受光部４２ｂにより検出され、それぞれの検出強度に応じたアナログ電気信号が解析部４４に送信される。なお、受光部４２ａは、フローセル３６を挟んで照射部４０と対向するように配置され、受光部４２ｂは、照射部４０からのレーザ光の照射方向に対して垂直方向であって、かつ、フローセル３６の中心軸に対して垂直方向に配置されている。
【００３３】
アナログ電気信号を受信した解析部４４は、それぞれの細胞３２について前方散乱光の強度、側方散乱光の強度、ドナー分子２２からの蛍光強度および蛍光寿命、アクセプター分子２８からの蛍光強度および蛍光寿命の解析を行い、標的物質を有する細胞３２であるか否かを判断する。
【００３４】
ここで、ドナー分子２２からアクセプター分子２８への蛍光共鳴エネルギー移動の効率を高めたことにより、ドナー分子２２およびアクセプター分子２８からの蛍光強度を高感度に検出でき、より正確な解析を行うことができる。
なお、アクセプター分子２８からの蛍光強度および蛍光寿命のみを基に解析を行うと、アクセプター分子２８からの蛍光には、ドナー分子２２からの励起エネルギーによる蛍光だけでなく光ビームによりアクセプター分子２８が直接励起されたことによる蛍光も含まれるため、解析結果に誤差が生じるおそれがある。一方、ドナー分子２２からの蛍光は、ドナー分子２２からアクセプター分子２８へ移動しなかった励起エネルギーによりドナー分子２２から発せられる蛍光（励起エネルギーの移動量に応じて変化する蛍光）である。このように、ドナー分子２２からの蛍光は、蛍光共鳴エネルギー移動に関係しないエネルギーによる蛍光を含むおそれが少ないため、ドナー分子２２からの蛍光強度および蛍光寿命を基に解析を行うのが好ましい。
【００３５】
解析部４４は、それぞれの細胞３２について解析が終了すると解析結果を出力し、所望の結果が得られた段階で蛍光共鳴エネルギー移動の測定を終了する。
【００３６】
なお、蛍光共鳴エネルギー移動の測定方法の詳細は、例えば、特開２００７−２４０４２４号公報等に開示されている。
【００３７】
本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０によれば、標的分子１２や構造変化領域１６の種類に関わらずアクセプター結合配列３０を複数連結して配置すればよく汎用性が高い。
また、実験系の確立していない標的分子であってもその特性に縛られることなく柔軟なＦＲＥＴプローブ１０の設計ができる。すなわち、標的分子の構造等によりＦＲＥＴプローブ１０の設計が困難で、近接したドナー分子２２とアクセプター分子２８の位置にずれが生じる場合でも、他のアクセプター分子２８がそれを補いドナー分子２２からの励起エネルギーを受け取ることができるため、ＦＲＥＴプローブ１０の柔軟な設計が可能である。
また、ドナー分子２２からアクセプター分子２８へのＦＲＥＴ効率が高まることにより、蛍光共鳴エネルギー移動を高感度に観察することができる。
また、遺伝子工学的手段によりアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃをそれぞれ連結して配置すればよく、簡便な作業により蛍光共鳴エネルギー移動の効率を高めることができる。
【００３８】
実施形態２
図５は、本発明の実施形態２に係るＦＲＥＴプローブ５０の模式図である。同図に示すＦＲＥＴプローブ５０は、標的分子５２と結合分子５４との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブ５０であって、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナープローブ部５６と、励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプタープローブ部５８とを有して構成される。
ドナープローブ部５６は、図示しないドナー分子を結合するためのアミノ酸配列である１つのドナー結合配列６０を有するドナー領域６２と、ドナー領域６２に連結された標的分子５２を有する。
アクセプタープローブ部５８は、図示しないアクセプター分子を結合するためのアミノ酸配列である３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃを順次連結して構成されるアクセプター領域６６と、アクセプター領域６６に連結され標的分子５２と特異的に結合する結合分子５４を有する。また、アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃは、標的分子５２と結合分子５４との特異的な結合に伴いドナー領域６２とアクセプター領域６６とが近接する時に、アクセプター領域６６に結合する少なくとも１つのアクセプター分子がドナー領域６２に結合するドナー分子と蛍光共鳴エネルギー移動を発生し得る距離に近接するように設計される。
【００３９】
なお、ドナープローブ部５６のドナー領域６２と標的分子５２の間およびアクセプタープローブ部５８のアクセプター領域６６と結合分子５４との間がそれぞれアミノ酸配列からなるリンカー６８により連結されている。また、アクセプター領域６６においても各アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃの間がそれぞれリンカー６８により連結されている。各リンカー６８を構成するアミノ酸配列やその長さは、標的分子５２と結合分子５４の結合や蛍光共鳴エネルギー移動を阻害しないものであれば何ら限定されない。
【００４０】
次に、図６および７に示す模式図を用いて、ＦＲＥＴプローブ５０における蛍光共鳴エネルギー移動について説明する。図６に示すように、標的分子５２と結合分子５４の結合前のＦＲＥＴプローブ５０は、ドナープローブ部５６のドナー領域６２に１つのドナー分子７０を結合し、アクセプタープローブ部５８のアクセプター領域６６に３つのアクセプター分子７２を結合して存在する。なお、３つのアクセプター分子７２は、アクセプター領域６６に設けられた３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃにそれぞれ結合している。
【００４１】
ドナープローブ部５６の標的分子５２とアクセプタープローブ部５８の結合分子５４との特異的な結合に伴い、図７に示すようにドナー領域６２とアクセプター領域６６とが近接する。これにより、アクセプター領域６６に結合する３つのアクセプター分子７２のうち、少なくとも１つのアクセプター分子７２とドナー領域６２に結合するドナー分子７０が、蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接される。なお、図７に示すように、ドナー領域６２とアクセプター領域６６はドナー分子７０から３つのアクセプター分子７２全てに蛍光共鳴エネルギー移動が発生し得る距離に近接し、３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃのうち中央部に位置するアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２がドナー領域６２に結合するドナー分子７０と対向するように近接するのが好ましい。
【００４２】
次に、ドナー分子７０を励起する波長の光ビームをドナー分子７０へ照射すると、ドナー分子７０が励起され、励起エネルギーがドナー分子７０から各アクセプター分子７２へ移動する。また、ドナー分子７０と最も近接するアクセプター分子７２（アクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２）には最も強度の大きい励起エネルギーの移動が生じる（図７の矢印Ｍ２）。このように、３つのアクセプター分子７２を配列することで、ドナー分子７０の励起エネルギーをアクセプター分子７２へ移動し易くすることができる。すなわち、励起エネルギーの移動効率を高めることができる。また、ドナー分子７０とアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２との距離にずれが生じた場合でも、少なくとも１つの他のアクセプター分子７２（アクセプター結合配列６４ａおよび６４ｃに結合するアクセプター分子７２）がこれを補って励起エネルギーの移動を生じさせるため、蛍光共鳴エネルギー移動を起こし易くすることができる。
【００４３】
続いて、励起エネルギーにより励起された３つのアクセプター分子７２は、励起状態から基底状態に戻るときに各々蛍光を放出する。ここで、アクセプター結合配列６４ｂのアクセプター分子７２が最も強度の大きい励起エネルギーを受けているので、各アクセプター分子７２から放出される蛍光強度もアクセプター結合配列６４ｂに結合するアクセプター分子７２が最も大きくなる（図３の矢印Ｎ２）。
なお、光ビームが照射されドナー分子７０からアクセプター分子７２へ移動しなかった励起エネルギーにより、ドナー分子７０も蛍光を放出する。また、アクセプター分子７２は、直接アクセプター分子７２に照射された光ビームによる蛍光も放出する。
【００４４】
なお、本実施形態において、ドナープローブ部５６が標的分子５２を有しアクセプタープローブ部５８が結合分子５４を有していたが、ドナープローブ部５６が結合分子５４を有しアクセプタープローブ部５８が標的分子５２を有する構成でもよい。
また、実施形態１および２のドナー結合配列２４および６０は、それぞれ１つのドナー分子２２および７０を結合するためのアミノ酸配列であるが、複数のドナー分子２２および７０を結合するためのアミノ酸配列であってもよい。また、実施形態１および２のアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃおよび６４ａ〜６４ｃは、それぞれ１つのアクセプター分子２８および７２を結合するためのアミノ酸配列であるが、複数のアクセプター分子２８および７２を結合するためのアミノ酸配列であってもよい。また、実施形態１および２において、ドナー領域１４および６２は１つのドナー結合配列１４および６０から構成されているが、複数のドナー結合配列１４および６０から構成されてもよい。
【００４５】
なお、本実施形態のドナー領域５２およびアクセプター領域７２は、実施形態１のドナー領域１４およびアクセプター領域１８と同様の構成である。また、本実施形態のＦＲＥＴプローブ５０は、実施形態１のＦＲＥＴプローブ１０と同様の方法で作成することができ、ＦＲＥＴプローブ５０（ドナープローブ部５６とアクセプタープローブ部５８）をコードする核酸をベクターに挿入して作成された発現ベクターを細胞内に導入し、同じ細胞内でＦＲＥＴプローブ５０を発現することができる。このような実施形態２のＦＲＥＴプローブ５０を用いても実施形態１と同様に蛍光共鳴エネルギー移動の測定を行うことができる。
【００４６】
実施形態３
また、実施形態１では、ドナー領域１４およびアクセプター領域１８にそれぞれ蛍光色素であるドナー分子２２およびアクセプター分子３０を結合していたが、図８に示すようにドナー領域１４およびアクセプター領域１８が蛍光タンパク質から構成されるようにしてもよい。例えば、構造変化領域１６の両端に設けられたドナー領域１４とアクセプター領域１８において、ドナー領域１４に１つのドナー蛍光タンパク質７４を配置し、アクセプター領域１８にそれぞれリンカー２０で連結された３つのアクセプター蛍光タンパク質７６を配置することができる。また、実施形態２においても同様であり、図９に示すようにドナー領域６２およびアクセプター領域６６が蛍光タンパク質から構成されるようにしてもよい。例えば、ドナープローブ部５６の標的分子５２に連結されたドナー領域６２に１つのドナー蛍光タンパク質７４を配置し、アクセプタープローブ部５８の結合分子５４に連結されたアクセプター領域６６にそれぞれリンカー６８で連結された３つのアクセプター蛍光タンパク質７６を配置することができる。
【００４７】
なお、ドナー領域１４および６２のドナー蛍光タンパク質７４とアクセプター領域１８および６６のアクセプター蛍光タンパク質７６は、両蛍光タンパク質間に蛍光共鳴エネルギー移動が発生する蛍光波長を有していれば特に限定されず、例えばＣＦＰ（Ｃｙａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）が利用できる。
なお、本実施形態のドナー領域１４、構造変化領域１６、およびアクセプター領域１８の配置、または、ドナー領域６２、標的分子５２、アクセプター領域６６、および結合分子５４の配置は、実施形態１または２と同様である。また、本実施形態のＦＲＥＴプローブ１０および５０は、実施形態１および２のＦＲＥＴプローブ１０および５０と同様の方法で作成することができ、このような実施形態３のＦＲＥＴプローブ１０および５０を用いても実施形態１および２と同様に蛍光共鳴エネルギー移動の測定を行うことができる。
【００４８】
なお、実施形態１および２のアクセプター領域１８および６６は、３つのアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃおよび３つのアクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃが順次連結して構成され、また、実施形態３においても同様にアクセプター領域１８および６６は、３つのアクセプター蛍光タンパク質７６が順次連結して構成されているが、これらは３つでなくともよく、複数であればよい。すなわち、アクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃ、アクセプター結合配列６４ａ〜６４ｃ、およびアクセプター蛍光タンパク質７６は、複数連結されていればよく２つまたは４つ以上が順次連結された構成であってもよい。また、実施形態１〜３のアクセプター結合配列３０ａ〜３０ｃ、６４ａ〜６４ｃ、およびアクセプター蛍光タンパク質７６の連結は、リンカー２０および６８で順次連結されて構成されているが、リンカー２０および６８を介さずに複数連続して配置されていてもよい。
【００４９】
また、実施形態１〜３のアクセプター領域１８および６６は、蛍光色素（アクセプター分子２２および７２）または蛍光タンパク質（アクセプター蛍光タンパク質７６）によりドナー領域１４および６２から励起エネルギーを受けているが、ドナー領域１４および６２とアクセプター領域１８および６６との間で蛍光共鳴エネルギー移動が発生すれば蛍光を発しないアクセプター分子またはタンパク質であってもよい。この場合、蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、ドナー分子２２および７０からの蛍光強度および蛍光寿命により行うことができる。
【００５０】
以上、本発明について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００５１】
１０、５０ ＦＲＥＴプローブ
１２、５２ 標的分子
１４、６２ ドナー領域
１６ 構造変化領域
１８、６６ アクセプター領域
２０、６８ リンカー
２２、７０ ドナー分子
２４、６０ ドナー結合配列
２６ 標的分子結合部位
２８、７２ アクセプター分子
３０ａ〜３０ｃ、６４ａ〜６４ｃ アクセプター結合配列
３２ 細胞
３４ フローサイトメータ
３６ フローセル
３８ 光学ユニット
４０ 照射部
４２ａ、４２ｂ 受光部
４４ 解析部
５４ 結合分子
５６ ドナープローブ部
５８ アクセプタープローブ部
７４ ドナー蛍光タンパク質
７６ アクセプター蛍光タンパク質
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、
光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、
前記ドナー領域と前記アクセプター領域の間に連結され、前記標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することにより前記ドナー領域と前記アクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連続配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブ。
【請求項２】
前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項３】
各アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することを特徴とする請求項１または２に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項４】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項５】
前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することを特徴とする請求項４に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項６】
前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子の特異的な結合に伴う前記構造変化領域の構造変化により、前記ドナー領域の前記ドナー分子と対向することを特徴とする請求項４または５に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項７】
前記アクセプター領域の複数の前記蛍光タンパク質は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項８】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることを特徴とする請求項１〜３および７のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項９】
標的分子と結合分子との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブであって、
前記標的分子と連結し、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記結合分子と連結し、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連結配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子を結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブ。
【請求項１０】
前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項９にＦＲＥＴプローブ。
【請求項１１】
前記アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することを特徴とする請求項９または１０に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１２】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１３】
前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することを特徴とする請求項１２に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１４】
前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子と前記結合分子との特異的な結合により、前記ドナー領域のドナー分子と対向することを特徴とする請求項１２または１３に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１５】
前記アクセプター領域は、互いにリンカーで連結される複数の前記蛍光タンパク質を有することを特徴とする請求項９に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１６】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることを特徴とする請求項９〜１１および１５のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを有する細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを細胞に導入し、前記細胞に光ビームを照射し、前記ドナー領域から前記アクセプター領域への蛍光共鳴エネルギー移動を測定するＦＲＥＴ測定方法。
【請求項２０】
前記蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、前記ドナー領域から発せられる蛍光の蛍光寿命の検出により行われる請求項１９に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【請求項１】
標的分子との特異的な結合に伴う構造変化により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるＦＲＥＴプローブであって、
光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域と、
前記ドナー領域と前記アクセプター領域の間に連結され、前記標的分子との特異的な結合に伴って構造変化することにより前記ドナー領域と前記アクセプター領域を近接させる構造変化領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連続配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子が結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブ。
【請求項２】
前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項３】
各アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することを特徴とする請求項１または２に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項４】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項５】
前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することを特徴とする請求項４に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項６】
前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子の特異的な結合に伴う前記構造変化領域の構造変化により、前記ドナー領域の前記ドナー分子と対向することを特徴とする請求項４または５に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項７】
前記アクセプター領域の複数の前記蛍光タンパク質は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項１に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項８】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることを特徴とする請求項１〜３および７のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項９】
標的分子と結合分子との特異的な結合により、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させる２分子からなるＦＲＥＴプローブであって、
前記標的分子と連結し、光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するためのドナー領域と、
前記結合分子と連結し、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するためのアクセプター領域とを有し、
前記アクセプター領域は、互いに連結配置され、前記励起エネルギーを受けて蛍光を発するアクセプター分子を結合する複数のアクセプター結合配列または前記励起エネルギーを受けて蛍光を発する複数の蛍光タンパク質を有することを特徴とするＦＲＥＴプローブ。
【請求項１０】
前記アクセプター領域の複数の前記アクセプター結合配列は、互いにリンカーで連結されていることを特徴とする請求項９にＦＲＥＴプローブ。
【請求項１１】
前記アクセプター結合配列は、１つの前記アクセプター分子を結合することを特徴とする請求項９または１０に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１２】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発するドナー分子が結合する１つのドナー結合配列を有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１３】
前記ドナー結合配列は、１つの前記ドナー分子を結合することを特徴とする請求項１２に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１４】
前記アクセプター領域に結合する１つの前記アクセプター分子は、前記標的分子と前記結合分子との特異的な結合により、前記ドナー領域のドナー分子と対向することを特徴とする請求項１２または１３に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１５】
前記アクセプター領域は、互いにリンカーで連結される複数の前記蛍光タンパク質を有することを特徴とする請求項９に記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１６】
前記ドナー領域は、前記光ビームの照射を受けて励起エネルギーを発する蛍光タンパク質から構成されることを特徴とする請求項９〜１１および１５のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブ。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを有する細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のＦＲＥＴプローブを細胞に導入し、前記細胞に光ビームを照射し、前記ドナー領域から前記アクセプター領域への蛍光共鳴エネルギー移動を測定するＦＲＥＴ測定方法。
【請求項２０】
前記蛍光共鳴エネルギー移動の測定は、前記ドナー領域から発せられる蛍光の蛍光寿命の検出により行われる請求項１９に記載のＦＲＥＴ測定方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１０−２３３４９１（Ｐ２０１０−２３３４９１Ａ）
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−８４６７８（Ｐ２００９−８４６７８）
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月２１日（２０１０．１０．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月３１日（２００９．３．３１）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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