Ｆｃレセプターの製造方法
【課題】遺伝子工学手法を用いて天然に近いヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミドを形質転換することで得られる微生物、および前記微生物を用いたヒトＦｃγＲＩの製造方法を提供すること。
【解決手段】可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌、および前記麹菌を用いて可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造することで、天然に近いヒトＦｃγＲＩを、安価に、かつ可溶化した状態で大量に製造することを可能にした。
【解決手段】可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌、および前記麹菌を用いて可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを製造することで、天然に近いヒトＦｃγＲＩを、安価に、かつ可溶化した状態で大量に製造することを可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、Ｆｃレセプターを発現する麹菌、および前記麹菌を用いたＦｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるサブクラスのうち、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３と強く結合し、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４との結合は弱いことが知られている。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子工学的手法により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内に発現するため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化などの操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２７８９４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．，４７．，４４１，２００６
【非特許文献７】Ｍａｓａｙａ Ｎａｇａｏ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１，６７０，１９９７
【非特許文献８】Ｏｓａｍｕ Ｙａｍａｄａ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１，１３６７，１９９７
【非特許文献９】Ｓｅｔｓｕｚｏ Ｔａｄａ等，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，５９３，１９８９
【非特許文献１０】Ｏｓａｍｕ Ｙａｍａｄａ等，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５，８２，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、遺伝子工学手法を用いて天然に近いヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミドを形質転換することで得られる微生物、および前記微生物を用いたヒトＦｃγＲＩの製造方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題に関し鋭意検討した結果、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現プラスミドに挿入し、当該挿入された発現プラスミドにより形質転換された麹菌を用いて発現させることで、活性を有し、かつ可溶化などの操作が不要なヒトＦｃγＲＩを製造できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌。
（２）可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、（１）に記載の麹菌。
（３）麹菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、（１）または（２）に記載の麹菌。
（４）（１）から（３）のいずれかに記載の麹菌を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の麹菌を取得する際に用いる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、報告されているヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なポリヌクレオチドである。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。前述したように配列番号１にはヒトＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列が示されており、前記アミノ酸中、細胞外領域は１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸に相当し、膜貫通領域は２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３１４番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸に相当する。前記細胞外領域または膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、遺伝子工学的に可能である。また、適当な合成オリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により連結することで、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したポリヌクレオチドを調製してもよい。この際、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に関しては必ずしもヒトに合わせなくてもよく、例えば、麹菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、麹菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。なお、コドンの使用頻度の情報は例えば公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から得ることができる。
【００１３】
また、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されているポリヌクレオチドであっても、宿主である麹菌から分泌され、かつ、ヒトＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ポリヌクレオチドとみなすことができる。さらに、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列と９０％以上の配列同一性を有し、しかも宿主である麹菌から分泌され、かつ、ヒトＦｃγＲＩの活性を保持するものも前記ポリヌクレオチドとみなすことができる。なお、前記ポリヌクレオチドはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどを出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。ヌクレオチドの置換としては、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法などの公知の変異導入法のほかに、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）などを用いることができる。前記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
【００１４】
さらに、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、その５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンとシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここで述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側（ポリヌクレオチドの５’末端側）に位置しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの一例として、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸からなるペプチドをあげることができるが、好ましくは麹菌において分泌発現されるタンパク質であるα−アミラーゼ、リパーゼやプロテアーゼなどのシグナルペプチドを付加するのが好ましい。
【００１５】
さらに、発現したヒトＦｃγＲＩを簡便に検出・精製することを目的として、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｃ−ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）などを例示することができる。付加させる位置は、ヒトＦｃγＲＩとしての生物活性を損なわない限りにおいて、５’末端側（Ｎ末端側）、３’末端側（Ｃ末端側）どちらでもよい。なお、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００１６】
本発明の麹菌を取得する際に用いる、ヒトＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドは、前述した可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを、公知の発現プラスミドの適切な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、得ることができる。公知の発現プラスミドとしては、例えば、麹菌の形質転換に利用されるｐＵＮＡ、ｐＵＳＡ（非特許文献１０）などをあげることができる。また、ここで述べる適切な位置とは発現プラスミドの複製機能、所望の栄養要求マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置のことをいう。前記ヒトＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、形質転換体を培養することにより、ヒトＦｃγＲＩを麹菌菌体外へ発現させることができる。
【００１７】
本発明で形質転換に用いる麹菌に特に制限はないが、不完全菌類に属する麹菌が好ましく、醗酵生産において歴史的に利用されてきたアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する麹菌がさらに好ましく、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、特に硝酸塩非資化性、硫酸塩非資化性の特徴を有するアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＳ４株（非特許文献８）が最も好ましい。また、前記麹菌をさらに遺伝子組換えや変異処理することにより得られる麹菌変異株を利用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線、放射線などの当業者に周知の変異処理剤を利用して行なえばよい。
【００１８】
本発明の麹菌を取得する際に用いる、麹菌への発現プラスミドの導入、発現のための手順・方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法などがあげられる。
【００１９】
本発明の麹菌は、選択した麹菌の培養に好ましい、公知の培地で増殖させることができる。本発明に用いる培地としては麹菌が増殖し、ヒトＦｃγＲＩを生産し得るものであれば特に制限はなく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕などの天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシンなどのアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが使用できる。また、蒸煮して湿潤させた小麦フスマや米などを用いた固体培養を行なうこともできる。
【００２０】
本発明の麹菌を培養する際の温度は、麹菌が増殖し、かつ、ヒトＦｃγＲＩを生産し得るものであれば特に制限はないが、通常は約１０℃から５０℃、好ましくは２５℃から３５℃であり、より好ましくは３０℃前後である。また、培地のｐＨは、通常は約４から９、好ましくは８前後である。
【００２１】
本発明の麹菌を培養する際は、通常、通気および／または撹拌することにより酸素の供給を行なえばよいが、酸素供給量は培養装置の形態に依存するため、発現したヒトＦｃγＲＩの発現量や活性などを測定して決定するのが好ましい。一例として、振とうフラスコで培養する際は、通常８０ｒｐｍから１２０ｒｐｍ、好ましくは１００ｒｐｍ前後で振とうすればよい。なお、小麦フスマを用いた固体培養で本発明の麹菌を培養する際は、１日に２回程度の撹拌により小麦フスマを分散させることで酸素供給を行なえばよい。
【００２２】
本発明の麹菌を培養する際の培養時間にも特に制限はないが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したヒトＦｃγＲＩの発現量や活性などを測定して決定するのが好ましい。一例として、５×ＤＰＹ（１０％デキストリン、５％ペプトン、２．５％ Ｙｅａｓｔ ＥＸＴＲＡＣＴ、２．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ未調整）培地、３０℃で培養する場合は、３日から４日程度培養するのが好ましい。
【００２３】
培養液から、ヒトＦｃγＲＩを取得するには、培養物の可溶性（水溶性）画分からヒトＦｃγＲＩを回収すればよい。例えば液体培養の場合は、遠心分離やろ過によって菌体を分離して得られる培養上清を回収すればよい。また固体培養の場合には、培養物に水または緩衝液を添加することでヒトＦｃγＲＩを水溶性画分に抽出後、遠心分離やろ過により固形分を分離することでヒトＦｃγＲＩを回収することができる。なお、前記方法で得られたヒトＦｃγＲＩは、その使用目的により、回収した水溶液画分の中から塩析法や液体クロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて精製して利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどをあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒトＦｃγＲＩを調製することができる。
【００２４】
本発明により得られたヒトＦｃγＲＩは医薬として利用することができ、また、ヒト血清を検体にすることにより特異性の高いイムノアッセイが可能であり各種診断材料としても利用することができる。さらには担体にヒトＦｃγＲＩを固定化することにより抗体を液相から吸着・分離することができるため、試料中に含まれる抗体を分離除去する目的に使用することができる。担体としてはセルロース、アガロースなどの多糖類、ガラス、セラミックス、またはポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレンなどのプラスチック素材が例示できる。また、担体に固定したヒトＦｃγＲＩをカラムに充填することにより抗体を精製するためのクロマトグラフィーに利用することもできる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明で提供される、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換して得られた、ヒトＦｃγＲＩを発現可能な麹菌を用いて、ヒトＦｃγＲＩの生産を行ない、当該タンパク質を分離・精製することにより、天然に近いヒトＦｃγＲＩを、安価に、かつ可溶化した状態で大量に製造することが可能である。
【００２６】
また、本発明の麹菌を用いて製造したヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬などの開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。その他、ＦｃγＲＩを担体に固定化することで検体からの抗体除去や抗体精製に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造略図。
【図２】発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃの構造を示す図。
【図３】形質転換体培養上清のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃγＲＩ測定結果を示す図。
【図４】ヒトＦｃγＲＩ標準品を用いて作成したヒトＦｃγＲＩの検量線を示す図。
【図５】形質転換体培養上清より得られたヒトＦｃγＲＩのＩｇＧサブクラス特異性を示す図。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ Ｃ末端側にＨｉｓ−ｔａｇを付加したヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの調製
（１）配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子を鋳型とし、配列番号２および３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲはタカラバイオ社製ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用い、９４℃で５分加熱し、９４℃で３０秒加熱−５７℃で３０秒アニーリング−７２℃で４５秒伸張のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃で７分加温することにより行なった。
【００３０】
（２）ＰＣＲ後の液をキアゲン社製ＰＣＲ精製キットで精製することで、配列番号４に示す配列からなるポリヌクレオチド溶液５０μＬを得た。配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチドは５’末端側から、６塩基の付加配列（ＧＧＴＡＣＣ）、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩ遺伝子のうち１番目から８６７番目の領域（すなわち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド）、スレオニン（Ｔｈｒ）−セリン（Ｓｅｒ）からなる２残基のスペーサーおよび６残基のヒスチジン（Ｈｉｓ）をコードするオリゴヌクレオチド、停止コドン（ＴＧＡ）、ならびに６塩基の付加配列（ＧＧＴＡＣＣ）より構成される。
【００３１】
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、（１）から（２）と同様にＰＣＲおよび精製操作を行なうことで、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチド溶液を得た。配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドは５’末端側から、α−アミラーゼシグナル配列の一部である５残基のアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ）をコードするオリゴヌクレオチド、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩ遺伝子のうち４６番目から８６７番目の領域（すなわち、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒよりなる２残基のスペーサーおよび６残基のＨｉｓをコードするオリゴヌクレオチド、停止コドン（ＴＧＡ）、ならびに１５塩基（ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴ）の付加配列より構成される。
【００３２】
実施例２ 発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃの調製
（１）５’末端側より、６１７塩基からなる麹菌α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙＢ）、６２塩基からなるα−アミラーゼシグナル、１０塩基（ＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧ）の付加配列、および１８２塩基からなるα−アミラーゼターミネータ（非特許文献９）からなる配列番号８に記載のポリヌクレオチドを含む、ｐＵＣ１１８由来プラスミドｐＵＰＳＴａｍｙＢに、発現プラスミドｐＵＳＡ（非特許文献１０）よりＸｂａＩ−ＳｐｈＩで消化で得られたｓＣ遺伝子（選択マーカー遺伝子）断片を挿入することで発現プラスミドｐＵＳＡＳを作製した。
（２）ｐＵＳＡＳを制限酵素ＫｐｎＩで消化後、東洋紡社製Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈにより平滑化し、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチド溶液と混合後、タカラバイオ社製ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキットにより３７℃で１５分、ついで５０℃で１５分加温することにより発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃを調製した。ｐＵＳＡＳ−Ｆｃの概略図を図２に示す。
【００３３】
実施例３ 形質転換体の調製と培養
（１）実施例２で調製した発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃ（図２）を制限酵素ＡａｔＩＩで直鎖化後、麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＳ４株（非特許文献８）へ、プロトプラスト−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法により導入し、硫酸塩資化性をマーカーとして、形質転換体ＴＦ１からＴＦ２４を取得した。
（２）得られた形質転換体を２０ｍＬの５×ＤＰＹ培地に１白金耳植菌し、１００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにて、３０℃で３日から４日程度培養することで培養上清を得た。なお培養液には、終濃度１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを、終濃度１％となるようにＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ Ｓｏｌｎ． ｆｏｒ Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ Ｙｅａｓｔ（和光純薬社製）をそれぞれ添加した。
【００３４】
実施例４ 形質転換体の抗体結合活性評価
実施例３の（２）で得られた形質転換体培養上清をＥＬＩＳＡにより抗体結合活性を評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３）同様に、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、実施例３の（２）で得られた形質転換体培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体であるヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）ヒトＦｃγＲＩを発現する動物細胞培養上清（特許文献２）より公知の方法で精製した濃度既知のヒトＦｃγＲＩを標準物質として用い、（１）から（４）の測定を行なうことで検量線（図４）を作成した。前記検量線を基に、形質転換体培養上清中のヒトＦｃγＲＩ量を定量した。
【００３５】
結果を図３に示す。実施例２で調製した発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃ（図２）でアスペルギルス・オリゼ ＮＳ４株を形質転換することにより得られた形質転換体を培養することで、培養上清にヒトＦｃγＲＩを発現させることができた。なお、最も高い生産性を示した形質転換体（ＴＦ１株）について、図４の検量線から発現量を定量したところ、１．７ｍｇ／Ｌと計算された。
【００３６】
実施例５ 抗体サブクラス依存性の確認
実施例４の（１）において固定化するガンマグロブリンを、各サブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）に変更したほかは、実施例４と同様な方法でＥＬＩＳＡを行ない、形質転換体培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩのサブクラス依存性を確認した。結果を図５に示す。形質転換体の培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩはＩｇＧ１およびＩｇＧ３に高い結合性を示した。前記サブクラス依存性は天然ヒトＦｃγＲＩと同様であることから、形質転換体培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩは目的とするヒトＦｃγＲＩであることが判明した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子工学的手法により得られた、Ｆｃレセプターを発現する麹菌、および前記麹菌を用いたＦｃレセプターの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。Ｆｃレセプターはその結合する免疫グロブリンの種類によって分類されており、ＩｇＧのＦｃ領域に結合するＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある（非特許文献１）。また、各レセプターは、その構造の違いによりさらに細かく分類され、Ｆｃγレセプターの場合、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
Ｆｃγレセプターの一つであるＦｃγＲＩは単球とマクロファージ中で発現しており、好中球ではγインターフェロンにより誘導的に発現される（非特許文献１）。また、ＦｃγＲＩはＩｇＧに対する結合親和性が高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わる分子量約４２０００のα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域との境界で共有結合することでホモダイマーを形成している（非特許文献３）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるサブクラスのうち、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ３と強く結合し、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４との結合は弱いことが知られている。
【０００４】
ヒトＦｃγＲＩのアミノ酸配列、および遺伝子配列（配列番号１）はＥｘＰＡＳｙ（Ｐｒｉｍａｒｙ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ１２３１４）などの公的データベースに公表されている。また、ＦｃγＲＩの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されており、図１にヒト型ＦｃγＲＩの構造略図を示す。なお、図１中のアミノ酸番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞外領域、２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３７４番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までが細胞膜貫通領域および細胞内領域とされている。
【０００５】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。また、ＦｃγＲＩの機能である抗体の吸着能は各種抗体精製用クロマトグラフィーゲルの捕捉機能を担うタンパク質としても利用することができる。
【０００６】
ＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列（非特許文献４）はＪａｎｅｔ等により明らかにされ、その後、遺伝子工学的手法により、大腸菌（特許文献１）または動物細胞を利用した発現が報告されている。しかしながら、大腸菌を利用した発現系においてはＦｃγＲＩの細胞外領域タンパク質の発現量は極めて低く、また、発現されたタンパク質は菌体内に発現するため、多くの場合発現したタンパク質は不溶性の封入体となる。封入体タンパク質は可溶化などの操作をすることにより、活性型タンパク質として調製することは可能であるが、煩雑な操作を必要とする。また、動物細胞を用いた系では、大腸菌以上の発現量が報告（非特許文献３）されているが培養に多大な時間を要し、かつ、生産性も高くない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００４−５３０４１９号公報
【特許文献２】特開２００９−２７８９４８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献４】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献５】Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｈｏｏｖｅｒ等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２
【非特許文献６】Ｇａｎｇ Ｗｕ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．，４７．，４４１，２００６
【非特許文献７】Ｍａｓａｙａ Ｎａｇａｏ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１，６７０，１９９７
【非特許文献８】Ｏｓａｍｕ Ｙａｍａｄａ等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６１，１３６７，１９９７
【非特許文献９】Ｓｅｔｓｕｚｏ Ｔａｄａ等，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，５９３，１９８９
【非特許文献１０】Ｏｓａｍｕ Ｙａｍａｄａ等，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９５，８２，２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、遺伝子工学手法を用いて天然に近いヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩが発現可能なプラスミドを形質転換することで得られる微生物、および前記微生物を用いたヒトＦｃγＲＩの製造方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題に関し鋭意検討した結果、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを発現プラスミドに挿入し、当該挿入された発現プラスミドにより形質転換された麹菌を用いて発現させることで、活性を有し、かつ可溶化などの操作が不要なヒトＦｃγＲＩを製造できることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する：
（１）可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌。
（２）可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、（１）に記載の麹菌。
（３）麹菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、（１）または（２）に記載の麹菌。
（４）（１）から（３）のいずれかに記載の麹菌を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の麹菌を取得する際に用いる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、報告されているヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるＦｃγＲＩを細胞外に分泌させることが可能なポリヌクレオチドである。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。前述したように配列番号１にはヒトＦｃγＲＩの全アミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列が示されており、前記アミノ酸中、細胞外領域は１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸に相当し、膜貫通領域は２９０番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）から３１４番目のアルギニン（Ａｒｇ）までのアミノ酸に相当する。前記細胞外領域または膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、遺伝子工学的に可能である。また、適当な合成オリゴヌクレオチドを作製しＰＣＲ法により連結することで、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域もしくは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したポリヌクレオチドを調製してもよい。この際、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドにおけるコドン使用頻度（ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ）に関しては必ずしもヒトに合わせなくてもよく、例えば、麹菌におけるレアコドン（ｒａｒｅ ｃｏｄｏｎ、当該宿主におけるコドンの使用頻度が少ないもの）の全部または一部を、コードするアミノ酸を同一のまま、麹菌の翻訳機構において利用頻度が高いコドン（ｃｏｄｏｎ）に変換したポリヌクレオチドであってもよい。なお、コドンの使用頻度の情報は例えば公的データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から得ることができる。
【００１３】
また、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも１塩基が他のヌクレオチドに置換、および／または欠失、および／または付加されているポリヌクレオチドであっても、宿主である麹菌から分泌され、かつ、ヒトＦｃγＲＩの活性を保持するものは前記ポリヌクレオチドとみなすことができる。さらに、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、ヒトＦｃγＲＩの全塩基配列のうち膜貫通領域を除去した配列と９０％以上の配列同一性を有し、しかも宿主である麹菌から分泌され、かつ、ヒトＦｃγＲＩの活性を保持するものも前記ポリヌクレオチドとみなすことができる。なお、前記ポリヌクレオチドはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどを出発材料として作製してもよいし、人工的に合成してもよい。ヌクレオチドの置換としては、Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法などの公知の変異導入法のほかに、合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲを組合わせたＤＮＡＷｏｒｋｓ法（非特許文献５）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ法（非特許文献６）などを用いることができる。前記方法では、ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を基にして、数十塩基からなるオリゴヌクレオチド群を合成し、ＰＣＲにより合成オリゴヌクレオチドをアッセンブリーさせることによって完全長の遺伝子を作製することができる。
【００１４】
さらに、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドは、その５’末端側に、転写を開始するためのメチオニンとシグナルペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加してもよい。ここで述べる、シグナルペプチドとは、細胞質内で発現したタンパク質が細胞膜を通過し、細胞膜外において分泌するためのポリペプチドであり、通常、当該タンパク質のＮ末端側（ポリヌクレオチドの５’末端側）に位置しており、細胞膜通過後、特定のプロテアーゼ酵素によって切断される。シグナルペプチドの一例として、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸からなるペプチドをあげることができるが、好ましくは麹菌において分泌発現されるタンパク質であるα−アミラーゼ、リパーゼやプロテアーゼなどのシグナルペプチドを付加するのが好ましい。
【００１５】
さらに、発現したヒトＦｃγＲＩを簡便に検出・精製することを目的として、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドに、タグ（ｔａｇ）となるペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを付加させてもよい。タグペプチドとしてはポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｃ−ミックタグ（Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ）などを例示することができる。付加させる位置は、ヒトＦｃγＲＩとしての生物活性を損なわない限りにおいて、５’末端側（Ｎ末端側）、３’末端側（Ｃ末端側）どちらでもよい。なお、可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドへのタグペプチドをコードするオリゴヌクレオチドの付加は、当業者に周知の方法にて遺伝子工学的に作製することが可能である。
【００１６】
本発明の麹菌を取得する際に用いる、ヒトＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドは、前述した可溶性ヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを、公知の発現プラスミドの適切な位置に遺伝子工学的に挿入することにより、得ることができる。公知の発現プラスミドとしては、例えば、麹菌の形質転換に利用されるｐＵＮＡ、ｐＵＳＡ（非特許文献１０）などをあげることができる。また、ここで述べる適切な位置とは発現プラスミドの複製機能、所望の栄養要求マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置のことをいう。前記ヒトＦｃγＲＩを発現させるためのプラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、形質転換体を培養することにより、ヒトＦｃγＲＩを麹菌菌体外へ発現させることができる。
【００１７】
本発明で形質転換に用いる麹菌に特に制限はないが、不完全菌類に属する麹菌が好ましく、醗酵生産において歴史的に利用されてきたアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する麹菌がさらに好ましく、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、特に硝酸塩非資化性、硫酸塩非資化性の特徴を有するアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＳ４株（非特許文献８）が最も好ましい。また、前記麹菌をさらに遺伝子組換えや変異処理することにより得られる麹菌変異株を利用することもできる。変異処理はニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル、紫外線、放射線などの当業者に周知の変異処理剤を利用して行なえばよい。
【００１８】
本発明の麹菌を取得する際に用いる、麹菌への発現プラスミドの導入、発現のための手順・方法は、実施例に記載した方法のほかにも、遺伝子工学の分野により慣用されているものを含み、具体的にはエレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法などがあげられる。
【００１９】
本発明の麹菌は、選択した麹菌の培養に好ましい、公知の培地で増殖させることができる。本発明に用いる培地としては麹菌が増殖し、ヒトＦｃγＲＩを生産し得るものであれば特に制限はなく、炭素源には廃糖蜜、グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、デンプン、乳糖、グリセロール、酢酸などが、窒素源にはコーンスティープリカー、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粕などの天然成分や、酢酸アンモニウム、アスパラギン酸、グリシンなどのアミノ酸類が、無機塩にはリン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウムなどのリン酸塩や塩化ナトリウムなどが、金属イオンには塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、ビタミン類としては酵母エキス、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンなどが使用できる。また、蒸煮して湿潤させた小麦フスマや米などを用いた固体培養を行なうこともできる。
【００２０】
本発明の麹菌を培養する際の温度は、麹菌が増殖し、かつ、ヒトＦｃγＲＩを生産し得るものであれば特に制限はないが、通常は約１０℃から５０℃、好ましくは２５℃から３５℃であり、より好ましくは３０℃前後である。また、培地のｐＨは、通常は約４から９、好ましくは８前後である。
【００２１】
本発明の麹菌を培養する際は、通常、通気および／または撹拌することにより酸素の供給を行なえばよいが、酸素供給量は培養装置の形態に依存するため、発現したヒトＦｃγＲＩの発現量や活性などを測定して決定するのが好ましい。一例として、振とうフラスコで培養する際は、通常８０ｒｐｍから１２０ｒｐｍ、好ましくは１００ｒｐｍ前後で振とうすればよい。なお、小麦フスマを用いた固体培養で本発明の麹菌を培養する際は、１日に２回程度の撹拌により小麦フスマを分散させることで酸素供給を行なえばよい。
【００２２】
本発明の麹菌を培養する際の培養時間にも特に制限はないが、最適な培養時間は培地成分、培養温度、および通気量といった条件により変化するため、発現したヒトＦｃγＲＩの発現量や活性などを測定して決定するのが好ましい。一例として、５×ＤＰＹ（１０％デキストリン、５％ペプトン、２．５％ Ｙｅａｓｔ ＥＸＴＲＡＣＴ、２．５％ ＫＨ２ＰＯ４、０．２５％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ未調整）培地、３０℃で培養する場合は、３日から４日程度培養するのが好ましい。
【００２３】
培養液から、ヒトＦｃγＲＩを取得するには、培養物の可溶性（水溶性）画分からヒトＦｃγＲＩを回収すればよい。例えば液体培養の場合は、遠心分離やろ過によって菌体を分離して得られる培養上清を回収すればよい。また固体培養の場合には、培養物に水または緩衝液を添加することでヒトＦｃγＲＩを水溶性画分に抽出後、遠心分離やろ過により固形分を分離することでヒトＦｃγＲＩを回収することができる。なお、前記方法で得られたヒトＦｃγＲＩは、その使用目的により、回収した水溶液画分の中から塩析法や液体クロマトグラフィーなどの公知の方法を用いて精製して利用することができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどをあげることができる。これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより高純度なヒトＦｃγＲＩを調製することができる。
【００２４】
本発明により得られたヒトＦｃγＲＩは医薬として利用することができ、また、ヒト血清を検体にすることにより特異性の高いイムノアッセイが可能であり各種診断材料としても利用することができる。さらには担体にヒトＦｃγＲＩを固定化することにより抗体を液相から吸着・分離することができるため、試料中に含まれる抗体を分離除去する目的に使用することができる。担体としてはセルロース、アガロースなどの多糖類、ガラス、セラミックス、またはポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレンなどのプラスチック素材が例示できる。また、担体に固定したヒトＦｃγＲＩをカラムに充填することにより抗体を精製するためのクロマトグラフィーに利用することもできる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明で提供される、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを用いて形質転換して得られた、ヒトＦｃγＲＩを発現可能な麹菌を用いて、ヒトＦｃγＲＩの生産を行ない、当該タンパク質を分離・精製することにより、天然に近いヒトＦｃγＲＩを、安価に、かつ可溶化した状態で大量に製造することが可能である。
【００２６】
また、本発明の麹菌を用いて製造したヒト型ＦｃγＲＩは、個体発生および免疫機構の研究、さらにはそれらの成果に基づく治療診断薬などの開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、さらにはＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。その他、ＦｃγＲＩを担体に固定化することで検体からの抗体除去や抗体精製に利用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの構造略図。
【図２】発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃの構造を示す図。
【図３】形質転換体培養上清のＥＬＩＳＡによるヒトＦｃγＲＩ測定結果を示す図。
【図４】ヒトＦｃγＲＩ標準品を用いて作成したヒトＦｃγＲＩの検量線を示す図。
【図５】形質転換体培養上清より得られたヒトＦｃγＲＩのＩｇＧサブクラス特異性を示す図。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１ Ｃ末端側にＨｉｓ−ｔａｇを付加したヒトＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドの調製
（１）配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ遺伝子を鋳型とし、配列番号２および３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲはタカラバイオ社製ＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用い、９４℃で５分加熱し、９４℃で３０秒加熱−５７℃で３０秒アニーリング−７２℃で４５秒伸張のサイクルを２５回繰り返した後、７２℃で７分加温することにより行なった。
【００３０】
（２）ＰＣＲ後の液をキアゲン社製ＰＣＲ精製キットで精製することで、配列番号４に示す配列からなるポリヌクレオチド溶液５０μＬを得た。配列番号４に記載の配列からなるポリヌクレオチドは５’末端側から、６塩基の付加配列（ＧＧＴＡＣＣ）、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩ遺伝子のうち１番目から８６７番目の領域（すなわち、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸をコードするポリヌクレオチド）、スレオニン（Ｔｈｒ）−セリン（Ｓｅｒ）からなる２残基のスペーサーおよび６残基のヒスチジン（Ｈｉｓ）をコードするオリゴヌクレオチド、停止コドン（ＴＧＡ）、ならびに６塩基の付加配列（ＧＧＴＡＣＣ）より構成される。
【００３１】
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号５および６に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、（１）から（２）と同様にＰＣＲおよび精製操作を行なうことで、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチド溶液を得た。配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチドは５’末端側から、α−アミラーゼシグナル配列の一部である５残基のアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ）をコードするオリゴヌクレオチド、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩ遺伝子のうち４６番目から８６７番目の領域（すなわち、１６番目のグルタミン（Ｇｌｎ）から２８９番目のバリン（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）、Ｔｈｒ−Ｓｅｒよりなる２残基のスペーサーおよび６残基のＨｉｓをコードするオリゴヌクレオチド、停止コドン（ＴＧＡ）、ならびに１５塩基（ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴ）の付加配列より構成される。
【００３２】
実施例２ 発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃの調製
（１）５’末端側より、６１７塩基からなる麹菌α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙＢ）、６２塩基からなるα−アミラーゼシグナル、１０塩基（ＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧ）の付加配列、および１８２塩基からなるα−アミラーゼターミネータ（非特許文献９）からなる配列番号８に記載のポリヌクレオチドを含む、ｐＵＣ１１８由来プラスミドｐＵＰＳＴａｍｙＢに、発現プラスミドｐＵＳＡ（非特許文献１０）よりＸｂａＩ−ＳｐｈＩで消化で得られたｓＣ遺伝子（選択マーカー遺伝子）断片を挿入することで発現プラスミドｐＵＳＡＳを作製した。
（２）ｐＵＳＡＳを制限酵素ＫｐｎＩで消化後、東洋紡社製Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈにより平滑化し、配列番号７に記載の配列からなるポリヌクレオチド溶液と混合後、タカラバイオ社製ＩｎＦｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキットにより３７℃で１５分、ついで５０℃で１５分加温することにより発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃを調製した。ｐＵＳＡＳ−Ｆｃの概略図を図２に示す。
【００３３】
実施例３ 形質転換体の調製と培養
（１）実施例２で調製した発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃ（図２）を制限酵素ＡａｔＩＩで直鎖化後、麹菌アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＮＳ４株（非特許文献８）へ、プロトプラスト−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法により導入し、硫酸塩資化性をマーカーとして、形質転換体ＴＦ１からＴＦ２４を取得した。
（２）得られた形質転換体を２０ｍＬの５×ＤＰＹ培地に１白金耳植菌し、１００ｍＬ容バッフル付三角フラスコにて、３０℃で３日から４日程度培養することで培養上清を得た。なお培養液には、終濃度１０ｍＭとなるようにＥＤＴＡを、終濃度１％となるようにＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ Ｓｏｌｎ． ｆｏｒ Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ Ｙｅａｓｔ（和光純薬社製）をそれぞれ添加した。
【００３４】
実施例４ 形質転換体の抗体結合活性評価
実施例３の（２）で得られた形質転換体培養上清をＥＬＩＳＡにより抗体結合活性を評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に５０μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することにより固定した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を施した。
（３）同様に、ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、実施例３の（２）で得られた形質転換体培養上清を１００μＬ添加し、固定化した抗体であるヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（４）反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）ヒトＦｃγＲＩを発現する動物細胞培養上清（特許文献２）より公知の方法で精製した濃度既知のヒトＦｃγＲＩを標準物質として用い、（１）から（４）の測定を行なうことで検量線（図４）を作成した。前記検量線を基に、形質転換体培養上清中のヒトＦｃγＲＩ量を定量した。
【００３５】
結果を図３に示す。実施例２で調製した発現プラスミドｐＵＳＡＳ−Ｆｃ（図２）でアスペルギルス・オリゼ ＮＳ４株を形質転換することにより得られた形質転換体を培養することで、培養上清にヒトＦｃγＲＩを発現させることができた。なお、最も高い生産性を示した形質転換体（ＴＦ１株）について、図４の検量線から発現量を定量したところ、１．７ｍｇ／Ｌと計算された。
【００３６】
実施例５ 抗体サブクラス依存性の確認
実施例４の（１）において固定化するガンマグロブリンを、各サブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）に変更したほかは、実施例４と同様な方法でＥＬＩＳＡを行ない、形質転換体培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩのサブクラス依存性を確認した。結果を図５に示す。形質転換体の培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩはＩｇＧ１およびＩｇＧ３に高い結合性を示した。前記サブクラス依存性は天然ヒトＦｃγＲＩと同様であることから、形質転換体培養上清に発現したヒトＦｃγＲＩは目的とするヒトＦｃγＲＩであることが判明した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌。
【請求項２】
可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、請求項１または２に記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の麹菌を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【請求項１】
可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドを導入することで麹菌を形質転換して得られる、可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩを発現可能な麹菌。
【請求項２】
可溶性ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩをコードするポリヌクレオチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドである、請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である、請求項１または２に記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の麹菌を用いた、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１１−２００２０３（Ｐ２０１１−２００２０３Ａ）
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−７３２３６（Ｐ２０１０−７３２３６）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１０月１３日（２０１１．１０．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【出願人】（３０１０２５６３４）独立行政法人酒類総合研究所 (55)
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【Ｆターム（参考）】
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