Ｆｃ含有タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法
本発明は、新規な洗浄緩衝液を使用して、プロテインＡクロマトグラフィーによって細胞培養上清から不純物、特にホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡを枯渇させる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法および当該方法のための薬剤に関する。
【０００２】
タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などの生体分子は、医薬としての、診断薬としての、食品添加物、洗剤などとしての、研究用試薬としての、および多数の他の応用への商業的重要性をますます増している。例えばタンパク質の場合、一般にもはや天然起源から分子を単離することによってそのような生体分子の必要を満たすことはできず、バイオテクノロジー生産法を使用することが不可欠である。
【０００３】
タンパク質のバイオテクノロジーによる調製は、典型的には所望のタンパク質をコードするＤＮＡを単離すること、および適切な発現ベクターにそれをクローニングすることで始まる。適切な原核発現細胞または真核発現細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞を続いて選択した後で、後者が発酵槽の中で培養され、所望のタンパク質が発現される。次に、細胞または培養上清が回収され、その中に含有されるタンパク質が処理および精製される。
【０００４】
真核発現系の場合、すなわち例えばＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの哺乳動物細胞培養物を使用する場合、発現工程で達成できる細胞培養物または細胞培養上清中の所望のタンパク質の濃度に過去１５年間に１００倍の増加があった。その後のタンパク質精製に使用されるクロマトグラフィー材料の結合能は、同じ期間に３倍に増加した。この理由から、工業的大規模で実施できる、生体分子、特にタンパク質のための改良および最適化された精製方法が緊急に必要である。
【０００５】
例えば医薬、例えば治療用抗体として使用されるタンパク質などの生物薬剤の場合、生成物の収率に加えて不純物の分離も決定的に重要である。プロセス依存性不純物と生成物依存性不純物が区別されることがある。プロセス依存性不純物は、タンパク質（ホスト細胞タンパク質、ＨＣＰ）および核酸などのホスト細胞構成成分を含有し、細胞培養物（培地成分など）または処理（例えば塩または溶解したクロマトグラフィーリガンドなど）に由来する。生成物依存性不純物は、異なる性質を有する生成物の分子変異体である。これらには、前駆物質および加水分解生成物などの簡略化された形態だけでなく、例えば脱アミノ、不完全なグリコシル化または誤連結したジスルフィド架橋によって生成された改変形態が含まれる。生成物依存性変異体には、ポリマーおよび凝集物も含まれる。他の不純物は、混入物である。これらによって、製造プロセスに直接属さない化学的、生化学的または微生物学的性質の全ての他の物質が意味される。混入物は、例えば細胞培養物中に望ましくなく出現するおそれのあるウイルスである。
【０００６】
生物薬剤の場合、不純物は安全上の懸念につながる。生物薬剤の場合に非常に多く当てはまるように、治療用タンパク質が注射または点滴によって血流中に直接投与されるならば、これらの懸念はさらに強まる。このように、ホスト細胞構成成分は、アレルギー反応または免疫病理学的作用につながるおそれがある。加えて不純物は、投与されたタンパク質の望ましくない免疫原性につながるおそれもあり、すなわちそれらは、治療剤に対する患者による望ましくない免疫反応を、可能性があることには生命にかかわるアナフィラキシーショックまでトリガーするおそれがある。したがって、全ての望ましくない物質を取るに足りないレベルまで枯渇することができる適切な精製方法の必要がある。
【０００７】
他方で、生物薬剤の場合、経済的な側面を無視することができない。したがって、使用される製造方法および精製方法は、そのように製造された生物製剤の経済的実現性を危うくしてはならない。加えて、樹立することのできる新しい精製方法内の時間尺度は、重要な役割を果たす。コストに対するその影響に加えて、方法開発は、薬物の前臨床開発および臨床開発と合わせなければならない。要するに、十分な純度の生物薬剤の十分な量が入手可能な場合に限り、例えば前臨床試験の一部および臨床試験の全てを開始することができる。
【０００８】
四つの基本工程から成る以下の標準方法は、大規模に実施することのできる抗体精製方法を開発するための出発点として役立つことがある。第一の工程では、ターゲットタンパク質が、単離、濃縮および安定化される（「捕捉」）。第二工程では、ウイルスが除去され、第三工程では、精製が実施され、核酸、他のタンパク質およびエンドトキシンなどの大部分の不純物が枯渇される。最終工程では、任意の残留微量混入物が除去される（「ポリッシング」）。
【０００９】
濾過工程および沈殿工程に加えて、（カラム）クロマトグラフィー法が最も重要である。したがって捕捉には、多くの場合にアフィニティークロマトグラフィーによる精製工程が含まれる。したがって、無数の既知のカラムクロマトグラフィー法およびそれらで使用することのできるクロマトグラフィー材料がある。
【００１０】
本明細書の以下にアフィニティーマトリックスとも呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、様々な物質の工業精製において固定相として使用される。固定化リガンドによって、使用される特定のリガンドに対してある親和性を有する物質を特異的に濃厚化および精製することが可能である。抗体（免疫グロブリン）の工業的精製、特にモノクローナル抗体の精製のために、固定化プロテインＡの使用が初回精製工程として有効であることが証明されている。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣＨ２／ＣＨ３ドメインに高い親和性（１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのヒトＩｇＧ）で結合する、Staphylococcus aureusの約４１kDAのタンパク質である。プロテインＡクロマトグラフィーでは、移動相由来のプロテインＡ結合性Ｆｃ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質は、担体（例えばセファロース）に共有結合しているプロテインＡリガンドに特異的に結合する。Staphylococcus aureus由来プロテインＡ（野生型プロテインＡ）および遺伝的に改変されたリコンビナントプロテインＡ（ｒｅｃ．プロテインＡ）は、非共有相互作用によって抗体の定常領域（Ｆｃフラグメント）と相互作用する。この特異的相互作用は、抗体から不純物を効率的に分離するために利用することができる。ｐＨを改変することによって、抗体とプロテインＡリガンドの間の相互作用を故意に止めることができ、固定相から抗体を遊離または溶離させることができる。
【００１１】
チャージ後に固定相が洗浄される場合、アフィニティークロマトグラフィーの効果が増大することがある。この場合の洗浄は、固定相からターゲット生成物ではなく不純物を溶離させる移動相の適用を意味する。プロテインＡマトリックスによる抗体のアフィニティークロマトグラフィーの場合、アルギニン、イソプロパノール、ＮａＣｌまたは洗剤を含有する洗浄緩衝液が使用されている（国際公開公報第２００８０３１０２０号、国際公開公報第２００７１０９１６３号、国際公開公報第２００７０８１９０６号、国際公開公報第２００３０６６６６２号、Millipore Tech Brief TB1026EN00）が、単一の洗浄緩衝液中にこれらの構成成分の組み合わせは使用されていない。これらの構成成分の二つ、すなわち塩と、洗剤、すなわち例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらから成るコポリマーなどのポリマーとの組み合わせは、米国特許第６，８７０，０３４（Ｂ２）号に記載された。
【００１２】
発明の概要
驚くことに、プロテインＡクロマトグラフィーにおいて単一の洗浄緩衝液中に構成成分を一定に組み合わせることで、精製されるべきターゲットタンパク質が、同じ構成成分を相次いで別々に使用するよりも高い純度になることが見出された。そのうえ、本発明による洗浄緩衝液は、標準ベースで抗体精製に使用することに適し、最適化工程を取り除くことで方法開発を短縮化できる。
【００１３】
本発明は、プロテインＡクロマトグラフィーによって、免疫グロブリンのＦｃドメインを含むタンパク質（ターゲットタンパク質）を含有する組成物から不純物を枯渇させる方法であって：
ａ． プロテインＡを含有する固定相に、ターゲットタンパク質が固定相に結合する条件下で、ターゲットタンパク質を含有する移動相を適用すること；
ｂ． 添加剤として
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンおよび／または洗剤
を含有するｐＨ４から８の間の洗浄緩衝液を移動相として適用すること；
ｃ． ターゲットタンパク質が固定相から溶離される条件下で、移動相として溶離緩衝液を使用すること
を含む方法に関する。
【００１４】
別の局面では、洗浄緩衝液は４．５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は６〜８のｐＨを有する。
【００１５】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、好ましくは濃度０．１〜２％(w/v)で、特に０．２５％(w/v)で使用される。加えて、またはその代わりに、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウレート（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）を濃度０．０５〜２％(w/v)で使用してもよい。
【００１６】
別の局面では、本発明は、
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノール、およびエタノールより選択される濃度５〜３０％(v/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨを有する、アフィニティークロマトグラフィー用の洗浄緩衝液に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｂ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｃ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｄ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図２ａ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｂ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｃ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｄ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図３】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液中のＨＣＰ量を比較する図である。
【図４】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００１ｂを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液中のＨＣＰ量を比較する図である。抗体ＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを一例として挙げた組成。ｘ軸の数字は、実施例に詳述された洗浄緩衝液への添加剤に関するものである。
【００１８】
発明の具体的な説明
本発明は、タンパク質がリコンビナント発現または内因性発現された細胞培養物から得られるようなタンパク質組成物から不純物を、特にホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡを枯渇させるための方法に関する。特に本発明は、リガンドによって固定相に可逆的に固定化することができることからアフィニティークロマトグラフィーに適する、タンパク質（ターゲットタンパク質）を精製または濃縮するための方法に関する。
【００１９】
ターゲットタンパク質は、特に免疫グロブリン、または免疫グロブリンのＦｃドメインを有し、プロテインＡと結合することのできるタンパク質であってよい。好ましい態様では、これらは、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖から成る免疫グロブリンである。抗体は、２本の同一の重鎖（Ｈ）および２本の同一の軽鎖（Ｌ）が共有ジスルフィド架橋によって一緒に結合してＹ型構造を形成したものから成る。軽鎖は、それぞれ１個の可変ドメインおよび１個の定常ドメインから成り、それらはＶＬおよびＣＬと呼ばれる。他方で重鎖は、それぞれ１個の可変ドメインおよび免疫グロブリンに依存して３〜４個の定常ドメインを有する。これらは、同様にＶＨおよびＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３と呼ばれる。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。ドメインＣＨ２は、補体系に対する結合部位を形成する糖鎖を有する。ＣＨ３ドメインは、Ｆｃレセプター結合部位を有する。
【００２０】
プロテインＡは、重鎖との相互作用によって免疫グロブリンのＦｃに結合する。結合親和性は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ２ａに対して、ならびにマウスＩｇＧ２ｂに対して最高である。プロテインＡは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ならびにマウスＩｇＧ３およびＩｇＧ１に中等度の親和性で結合する。しかしプロテインＡは、ヒトＩｇＧ３およびＩｇＤとも、以下のマウス免疫グロブリン：ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのいずれとも反応しない。
【００２１】
本発明による方法が適用されることがあるターゲットタンパク質は、免疫グロブリンなどの、Ｆｃドメインを有する全てのタンパク質である。免疫グロブリンは、ハイブリドーマ細胞またはリコンビナントホスト細胞に発現されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のことがある。そのような抗体は、トランスジェニック動物、例えばヒト免疫グロブリンを発現するマウスなどの、動物、特に哺乳動物を免疫処置することによって本来生成されていることがある。しかしながら、適切なターゲットタンパク質には、また、任意の所望のタンパク質と免疫グロブリンのＦｃドメインとが融合された融合タンパク質が含まれる。
【００２２】
本発明のためのプロテインＡマトリックスは、リガンドとして固定化タンパク質を有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスである。これらには、リガンドとして例えばStaphylococcus aureus由来の野生型プロテインＡを有するアフィニティーマトリックスが含まれる。プロテインＡの説明は、とりわけ、Lofdahl, Sら、１９８３（Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J (1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.）およびLindmarkら、１９８３（Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J (1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.）に見出すことができる。加えて本発明は、また、リコンビナント生成されたプロテインＡをリガンドとして有するマトリックスに関する。リコンビナントプロテインＡは、一例としてDuggleby C.J.およびJones, S.A.、１９８３（Duggleby, C.J. and Jones, S.A. (1983), Cloning and expression of Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichia coli. Nucl.Acid.Res. 1983 May 25; 11(10):3065-76.）またはLi, R.ら、１９９８（Li, R. Dowd, V., Stewart, D.J., Burton, S.J. Lowe, C.R., Design, Synthesis and application of a protein A mimetic. Nat.Biotechnol. 1998 Feb; 16(2):190-5.）によって記載されており、当技術分野において公知である。
【００２３】
プロテインＡは、例えばアガロース、多糖、デキストラン、シリカゲルおよびガラスビーズなどの様々な担体材料にカップリングさせることができる。適切な担体材料の非限定的な列挙は、Harlow, E.およびLane, D.、１９９９に見出すことができる。多くの場合に使用される一担体材料は、例えばAmersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Swedenによって製造された「セファロース」などの、当業者に公知のアガロースベースの材料によって形成される。プロテインＡセファロースの特定例は、２００１年の日付でこの会社によって主題「Affinity Chromatography」に関して作成されたマニュアルから見出すことができる。さらに、例えばMabSelect（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、STREAMLINE（商標）rProtein A（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、Poros A（Millipore, Durham, England）のような、他のプロテインＡクロマトグラフィーマトリックスが技術者に公知である。本発明による方法には、対応するマトリックスの処理が含まれ、マトリックスの列挙は例として提供されるものであって、包括的であるべきとは主張しない。
【００２４】
リガンドのカップリングは、一般に、臭化シアン活性化、ＮＨＳ活性化または担体マトリックスへのチオールカップリングによるアミノ基、カルボキシル基または硫黄基によって実施される。この主題に関しては、例えばマニュアル「Affinity Chromatography」（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, 2001）を参照されたい。
【００２５】
特に好ましい態様では、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、ポリビドンまたはポビドンとしても知られている、ＣＡＳ：９００３−３９−８）が、本発明による洗浄緩衝液中に使用される。ポリビニルピロリドンは、Ｎ−ビニルピロリドンモノマーユニットから成る水溶性ポリマーである。しかしながら、それは、他の極性溶媒に溶解されていてもよい。ＰＶＰは、色が白〜淡黄色である吸湿性の非晶質粉末である。標準的な市販のポリマーは、約２５００〜２，５００，０００ダルトンの範囲のモル質量を有する。
【００２６】
本発明の洗浄緩衝液中の洗剤は、ＰＶＰに追加的にまたはＰＶＰの代わりに使用することができる。洗剤は、ミセル、すなわち洗剤分子集合体を形成することができる界面活性両親媒性分子であって、親水性頭基が水性溶媒に向けて外側に向いている分子である。
【００２７】
本発明のための洗剤は、非イオン性物質およびイオン性物質の両方である。しかしながら、例えばポリグリコールエーテル（NP-40型、Tergitol NP40、ＣＡＳ：１２７０８７−８７−０）、ＰＥＧ−アルキルエーテルポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ＣＡＳ：９００２−９２−０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノラウレート（ポリソルベート２０、ＣＡＳ：９００５−６４−５）またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノオレエート（ポリソルベート８０、ＣＡＳ：９００５−６５−６）などのＰＥＧ−ソルビタン脂肪酸エステル、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトン−Ｘ−１００、ＣＡＳ：９００２−９３−１）などのアルキルフェニル−ＰＥＧ−エーテル、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー(Pluronic F68、Lutrol F68、Poloxamer 188、ＣＡＳ：９００３−１１−６またはPoloxamer 407、Pluronic F127、Lutrol F127、ＣＡＳ：９００３−１１−６）などのＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマー（ポロキサマー誘導体）などの非イオン性洗剤が好ましい。
【００２８】
洗浄緩衝液および溶離緩衝液のｐＨ値は、全体としてシステムに依存し、したがって一般に個別に決定され、各システム毎に最適化される。
【００２９】
一局面では、洗浄緩衝液は４〜８のｐＨを有する。技術者は、タンパク質がカラムから溶離されるｐＨがいくつかの要因に依存するという事実を熟知している。これらには、とりわけ結合、洗浄および溶離の間に使用される緩衝系、不純物の存在、マトリックス粒子の幾何学的配置、クロマトグラフィーマトリックスへのアフィニティーリガンドのカップリングの性質が含まれることがあろう。特に、タンパク質の特異的性質が決定的な影響を有する。
【００３０】
場合によっては、アフィニティーリガンドからのタンパク質の部分的または全体的溶離がｐＨ４を超えてもなお起こることがある組み合わせがありうる。そのような場合、そしてタンパク質の損失が許容されない場合、洗浄緩衝液はより高いｐＨを有さなければならない。技術者は、そのような場合に洗浄緩衝液のｐＨをそれに応じて調整しなければならないことを認識している。しかしながら大部分の場合、タンパク質とプロテインＡアフィニティーリガンドの間の結合は、ｐＨ４未満のときにだけ形成されない。
【００３１】
別の局面では、洗浄緩衝液は、４．５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は、５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は、６〜８のｐＨを有する。
【００３２】
典型的な態様では、本発明は、例えば以下のように実施されることがある。
【００３３】
プロテインＡクロマトグラフィーは、一般に第１の精製工程である。無細胞細胞培養上清は、カラムに直接加えることができるが、またはまず第一に限外濾過膜、いわゆるＵＦ／ＤＦシステムを通して濃縮物を製造してもよい。
【００３４】
プロテインＡカラムは、最初に、物理化学的性質がおおよそチャージングプール（charging pool）に対応するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化される。チャージングプールは、細胞培養物からの上清から成り、その上清は、精製されるべき生成物と、さらに例えばＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの問題となる哺乳動物細胞を成長させるために必要な追加的な培地成分とを含有する。細胞培養物のこの無細胞上清またはその濃縮物は、プロテインＡカラム上にチャージされる。すると、ターゲットタンパク質は、カラム上のプロテインＡ結合部位に結合する。次に、未結合の培地構成成分および細胞生成物が溶離してしまうまで、カラムは平衡化緩衝液でフラッシュされる。記載された洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液の後またはチャージの直後に加えることができる。洗浄緩衝液の量は、規模に依存し、したがって、クロマトグラフィーカラムのサイズに関係して与えられる。
【００３５】
通常は、洗浄緩衝液の体積は、クロマトグラフィーカラムの体積のおよそ２〜５倍である（２〜５ベッド体積、ＢＶ）。洗浄緩衝液を加えた後に、洗浄緩衝液の構成成分が生成物と共に溶離しないように、カラムを再び平衡化緩衝液または別の緩衝液で処理することができる。ここで使用される緩衝液は、洗浄緩衝液よりも低いが溶離緩衝液よりも高いｐＨを有さなければならず、溶離緩衝液と緩衝塩および組成が類似している。ｐＨ４未満の緩衝液は、溶離のために使用され、その主成分として例えば酢酸塩またはクエン酸塩を含有することがある。溶離緩衝液は、１０mMから２００mMの間、好ましくは２０mMから１００mM、最も好ましくは５０mMから１００mMの間の濃度で酢酸塩を含有することがあるか、または１０から２００mMの間、好ましくは２０から１００mMの間の濃度でクエン酸塩を含有することがある。両方の緩衝液は、４未満、好ましくは３から４の間、特に好ましくは３．４から３．６の間の上記ｐＨ範囲にあるべきである。そのうえ、アルギニンまたはＰＶＰなどの添加剤も存在することがある。さらに、濃度が１０から２００mMの間、好ましくは２５から１００mMの間で、ｐＨが２から３．５の間のグリシン緩衝液、または抗体のＦｃドメインとプロテインＡの間の結合を軽減するために適する他の緩衝液が使用されることがある。次に、溶離液は、以下のプロセス、例えばより低いｐＨでのインキュベーションまたは中和でさらに処理することができる。
【００３６】
実施例
異なる培地中で発酵され、異なる細胞系（ＣＨＯおよびＮＳ０）から得られ、Ｆｃ部が異なるＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）に属する様々なタンパク質を用いて実験を実施した。
【００３７】
標準から開始し、洗浄緩衝液または緩衝液だけを変えた一連の試験を実施した。添加剤を有さない平衡化緩衝液を導入するか、１種の添加剤だけを有する洗浄緩衝液を使用するか、それぞれ１種の添加剤を有するいくつかの異なる緩衝液を順次加えるか、またはいくつかの添加剤の組み合わせを有する洗浄緩衝液を使用するかのいずれかとした。
【００３８】
適用されるタンパク質溶液は、常にそれぞれのタンパク質について同一であった。
【００３９】
各試験で、溶離液中の不純物の量を測定した。実験同士で比較して、後の溶離液が最小可能量の核不純物を有した洗浄緩衝液を同定した。いくつかの実験では、収率、濁度およびモノマー含量も測定した。
【００４０】
クロマトグラフィー
クロマトグラフィー実験は、自動AEKTA-FPLCモデル900システム（GE Healthcare)で実施した。４種の異なる生成物を実験に使用した。生成物のうち無細胞培養上清または濃縮培養上清のいずれかを出発物質として使用し、調製物を５０kD Omega膜（Pall）で１０倍濃縮し、次にＰＢＳで３回ダイアフィルトレーションした。
【００４１】
使用されるカラムは、体積１ml〜８mlを有し、クロマトグラフィーゲルMabSelectまたはMabSelect Xtra（GE Healthcare）の一方を内部に含んでいた。
【００４２】
緩衝液
全ての実験において、１０mMリン酸塩、５mM塩化カリウムおよび１４０mM塩化ナトリウムを有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をｐＨ７．４で平衡化緩衝液として使用した。
【００４３】
全ての洗浄緩衝液は、
８mmol/Lリン酸一水素ナトリウム、
１．５mmol/Lリン酸水素カリウム、
２．７mM塩化カリウム、および
１４０mM塩化ナトリウム
を含有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をベースとした。
【００４４】
（図に詳述するように）添加剤として、以下のものを個別にまたは様々な組み合わせで使用した：
（１） ８６０mmol/L塩化ナトリウム（合計含量１mol/L塩化ナトリウム）、
（２） ０．２５％(w/V)ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、
（３） １５％(V/V)イソプロパノール、
（４） ０．５mol/L Ｌ−アルギニン。
【００４５】
生成物に応じて、溶離のために異なる緩衝液を異なる酢酸塩濃度およびｐＨで使用した。以下の濃度を用いた：
ＢＩ−Ｍａｂ０６ａ：１００mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ１００３ａ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ１００１ｂ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ０７ｃ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．６
【００４６】
分析
実験の溶離液をそれらの不純物含量について比較し、収率を決定した。
【００４７】
細胞構成成分の量を決定するために、一般的サンドイッチＥＬＩＳＡを用い、ホスト細胞タンパク質を経験的パラメーターとして決定した。アッセイのためにポリクローナル検出抗体を使用した。
【００４８】
モノマー含量は、Agilent Series HPLC 1200（waters）システムと、タンパク質に依存してTSK 3000SWまたはTSK 3000SWXLカラム（To-soH）とを使用して決定した。均一濃度法を流速１ml/minのトリス緩衝液（Ｈ７．０）で行った。
【００４９】
ＤＮＡは、しきい値法によって決定する（Kung, V.T. et al., Picogram Quantitation of Total DNA Using DNA-Binding Proteins in a Silicon Sensor-Based System, Anal. Biochem. 1990, 187, 220-227）。
【００５０】
Phastシステム（GE Healthcare）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する。試料はPhast SDSゲル（４％〜１５％、GE）を使用して分離する。染色は、Heukeshoven銀染色（Heukeshoven, Dernick 1988, Electrophoresis 9 (1), pages 28-32）を使用して行う。
【００５１】
チャージおよび溶離液中の抗体量を決定するために、PA2-1001-00プロテインＡカラム（Applied Biosystems）およびAgilent Series 1200 HPLCシステム（waters）を使用した。結合および溶離は、ｐＨ７．４〜ｐＨ２．８の勾配をかけてＰＢＳ緩衝系で実施し、問題となる抗体の外部検量線を使用して評価を行った。
【００５２】
濁度測定は、製造業者の濁度標準を用いて較正後に2100AN濁度計（Hach）で実施した。
【００５３】
結果
サブクラスＩｇＧ１の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ０６ａを用いた実験
結果から、洗浄が収率、モノマー、濁度およびホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）に及ぼす有意な作用が示される。
【００５４】
４種の添加剤全てを含有する緩衝液で洗浄後に、溶離液は、収率、モノマー含量およびＨＣＰ枯渇という品質基準において最良の値を示す。そのうえ、添加剤の組み合わせは、三つの成分０．８６mol/L塩化ナトリウム、０．２５％(w/V)ＰＶＰおよび１５％(V/V)イソプロパノールの組み合わせ、ならびに四つの添加剤全て、すなわち０．８６mol/L塩化ナトリウム、０．２５％(w/V）ＰＶＰ、１５％(V/V)イソプロパノールおよび０．５mol/Lアルギニンの組み合わせの両方で濁度の実質的な減少につながる。
【００５５】
サブクラスＩｇＧ１の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを用いた実験
ＨＣＰの最良の枯渇は、追加的な構成成分４種全てを含有する洗浄緩衝液で達成される。同様に良好な値は、塩化ナトリウム、ＰＶＰおよびイソプロパノールの組み合わせを有する洗浄緩衝液で得られる。４種の構成成分を個別に含有する緩衝液を用いた洗浄によって、溶離液中により多いＨＣＰが得られる。
【００５６】
濁度に関しても、緩衝液中に洗浄物質を組み合わせることでより良好な結果が得られる。
【００５７】
サブクラスＩｇＧ４の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを用いた実験
個別の洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液は、組み合わされた洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液よりも高いレベルのＨＣＰを有する。
【００５８】
サブクラスＩｇＧ２の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ１００１ｂを用いた実験
個別の洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液は、組み合わされた洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液よりも高いレベルのＨＣＰを有する。
【００５９】
４回の実験は、単一の洗浄緩衝液中に４種の添加剤である塩化ナトリウム、ＰＶＰ、イソプロパノールおよびアルギニンを組み合わせることが、溶離液中のホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）の含量に関して、個別の添加剤を有する洗浄緩衝液を使用するよりも利点があることを示す。
【００６０】
記載された洗浄緩衝液の使用は、また、溶離液中の濁度が有意に減少することも示す。モノマーの量および収率もまた改善されるか（ＢＩ−ＭＡｂ０６ａ）、または少なくとも同じままである（ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａ）。
【００６１】
したがって記載された洗浄緩衝液は、タンパク質の製造方法を著しく改善するために適している。洗浄緩衝液の組み合わせの導入は、その他の方法では追加的な精製工程によって除去しなければならない不純物を枯渇させる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を精製するためのクロマトグラフィー法および当該方法のための薬剤に関する。
【０００２】
タンパク質、ポリヌクレオチド、多糖などの生体分子は、医薬としての、診断薬としての、食品添加物、洗剤などとしての、研究用試薬としての、および多数の他の応用への商業的重要性をますます増している。例えばタンパク質の場合、一般にもはや天然起源から分子を単離することによってそのような生体分子の必要を満たすことはできず、バイオテクノロジー生産法を使用することが不可欠である。
【０００３】
タンパク質のバイオテクノロジーによる調製は、典型的には所望のタンパク質をコードするＤＮＡを単離すること、および適切な発現ベクターにそれをクローニングすることで始まる。適切な原核発現細胞または真核発現細胞に発現ベクターをトランスフェクションし、トランスフェクションされた細胞を続いて選択した後で、後者が発酵槽の中で培養され、所望のタンパク質が発現される。次に、細胞または培養上清が回収され、その中に含有されるタンパク質が処理および精製される。
【０００４】
真核発現系の場合、すなわち例えばＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの哺乳動物細胞培養物を使用する場合、発現工程で達成できる細胞培養物または細胞培養上清中の所望のタンパク質の濃度に過去１５年間に１００倍の増加があった。その後のタンパク質精製に使用されるクロマトグラフィー材料の結合能は、同じ期間に３倍に増加した。この理由から、工業的大規模で実施できる、生体分子、特にタンパク質のための改良および最適化された精製方法が緊急に必要である。
【０００５】
例えば医薬、例えば治療用抗体として使用されるタンパク質などの生物薬剤の場合、生成物の収率に加えて不純物の分離も決定的に重要である。プロセス依存性不純物と生成物依存性不純物が区別されることがある。プロセス依存性不純物は、タンパク質（ホスト細胞タンパク質、ＨＣＰ）および核酸などのホスト細胞構成成分を含有し、細胞培養物（培地成分など）または処理（例えば塩または溶解したクロマトグラフィーリガンドなど）に由来する。生成物依存性不純物は、異なる性質を有する生成物の分子変異体である。これらには、前駆物質および加水分解生成物などの簡略化された形態だけでなく、例えば脱アミノ、不完全なグリコシル化または誤連結したジスルフィド架橋によって生成された改変形態が含まれる。生成物依存性変異体には、ポリマーおよび凝集物も含まれる。他の不純物は、混入物である。これらによって、製造プロセスに直接属さない化学的、生化学的または微生物学的性質の全ての他の物質が意味される。混入物は、例えば細胞培養物中に望ましくなく出現するおそれのあるウイルスである。
【０００６】
生物薬剤の場合、不純物は安全上の懸念につながる。生物薬剤の場合に非常に多く当てはまるように、治療用タンパク質が注射または点滴によって血流中に直接投与されるならば、これらの懸念はさらに強まる。このように、ホスト細胞構成成分は、アレルギー反応または免疫病理学的作用につながるおそれがある。加えて不純物は、投与されたタンパク質の望ましくない免疫原性につながるおそれもあり、すなわちそれらは、治療剤に対する患者による望ましくない免疫反応を、可能性があることには生命にかかわるアナフィラキシーショックまでトリガーするおそれがある。したがって、全ての望ましくない物質を取るに足りないレベルまで枯渇することができる適切な精製方法の必要がある。
【０００７】
他方で、生物薬剤の場合、経済的な側面を無視することができない。したがって、使用される製造方法および精製方法は、そのように製造された生物製剤の経済的実現性を危うくしてはならない。加えて、樹立することのできる新しい精製方法内の時間尺度は、重要な役割を果たす。コストに対するその影響に加えて、方法開発は、薬物の前臨床開発および臨床開発と合わせなければならない。要するに、十分な純度の生物薬剤の十分な量が入手可能な場合に限り、例えば前臨床試験の一部および臨床試験の全てを開始することができる。
【０００８】
四つの基本工程から成る以下の標準方法は、大規模に実施することのできる抗体精製方法を開発するための出発点として役立つことがある。第一の工程では、ターゲットタンパク質が、単離、濃縮および安定化される（「捕捉」）。第二工程では、ウイルスが除去され、第三工程では、精製が実施され、核酸、他のタンパク質およびエンドトキシンなどの大部分の不純物が枯渇される。最終工程では、任意の残留微量混入物が除去される（「ポリッシング」）。
【０００９】
濾過工程および沈殿工程に加えて、（カラム）クロマトグラフィー法が最も重要である。したがって捕捉には、多くの場合にアフィニティークロマトグラフィーによる精製工程が含まれる。したがって、無数の既知のカラムクロマトグラフィー法およびそれらで使用することのできるクロマトグラフィー材料がある。
【００１０】
本明細書の以下にアフィニティーマトリックスとも呼ばれるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、様々な物質の工業精製において固定相として使用される。固定化リガンドによって、使用される特定のリガンドに対してある親和性を有する物質を特異的に濃厚化および精製することが可能である。抗体（免疫グロブリン）の工業的精製、特にモノクローナル抗体の精製のために、固定化プロテインＡの使用が初回精製工程として有効であることが証明されている。プロテインＡは、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣＨ２／ＣＨ３ドメインに高い親和性（１０−８Ｍ〜１０−１２ＭのヒトＩｇＧ）で結合する、Staphylococcus aureusの約４１kDAのタンパク質である。プロテインＡクロマトグラフィーでは、移動相由来のプロテインＡ結合性Ｆｃ領域を有する免疫グロブリンまたは融合タンパク質は、担体（例えばセファロース）に共有結合しているプロテインＡリガンドに特異的に結合する。Staphylococcus aureus由来プロテインＡ（野生型プロテインＡ）および遺伝的に改変されたリコンビナントプロテインＡ（ｒｅｃ．プロテインＡ）は、非共有相互作用によって抗体の定常領域（Ｆｃフラグメント）と相互作用する。この特異的相互作用は、抗体から不純物を効率的に分離するために利用することができる。ｐＨを改変することによって、抗体とプロテインＡリガンドの間の相互作用を故意に止めることができ、固定相から抗体を遊離または溶離させることができる。
【００１１】
チャージ後に固定相が洗浄される場合、アフィニティークロマトグラフィーの効果が増大することがある。この場合の洗浄は、固定相からターゲット生成物ではなく不純物を溶離させる移動相の適用を意味する。プロテインＡマトリックスによる抗体のアフィニティークロマトグラフィーの場合、アルギニン、イソプロパノール、ＮａＣｌまたは洗剤を含有する洗浄緩衝液が使用されている（国際公開公報第２００８０３１０２０号、国際公開公報第２００７１０９１６３号、国際公開公報第２００７０８１９０６号、国際公開公報第２００３０６６６６２号、Millipore Tech Brief TB1026EN00）が、単一の洗浄緩衝液中にこれらの構成成分の組み合わせは使用されていない。これらの構成成分の二つ、すなわち塩と、洗剤、すなわち例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびそれらから成るコポリマーなどのポリマーとの組み合わせは、米国特許第６，８７０，０３４（Ｂ２）号に記載された。
【００１２】
発明の概要
驚くことに、プロテインＡクロマトグラフィーにおいて単一の洗浄緩衝液中に構成成分を一定に組み合わせることで、精製されるべきターゲットタンパク質が、同じ構成成分を相次いで別々に使用するよりも高い純度になることが見出された。そのうえ、本発明による洗浄緩衝液は、標準ベースで抗体精製に使用することに適し、最適化工程を取り除くことで方法開発を短縮化できる。
【００１３】
本発明は、プロテインＡクロマトグラフィーによって、免疫グロブリンのＦｃドメインを含むタンパク質（ターゲットタンパク質）を含有する組成物から不純物を枯渇させる方法であって：
ａ． プロテインＡを含有する固定相に、ターゲットタンパク質が固定相に結合する条件下で、ターゲットタンパク質を含有する移動相を適用すること；
ｂ． 添加剤として
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンおよび／または洗剤
を含有するｐＨ４から８の間の洗浄緩衝液を移動相として適用すること；
ｃ． ターゲットタンパク質が固定相から溶離される条件下で、移動相として溶離緩衝液を使用すること
を含む方法に関する。
【００１４】
別の局面では、洗浄緩衝液は４．５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は６〜８のｐＨを有する。
【００１５】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）は、好ましくは濃度０．１〜２％(w/v)で、特に０．２５％(w/v)で使用される。加えて、またはその代わりに、ポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウレート（ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）を濃度０．０５〜２％(w/v)で使用してもよい。
【００１６】
別の局面では、本発明は、
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノール、およびエタノールより選択される濃度５〜３０％(v/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨを有する、アフィニティークロマトグラフィー用の洗浄緩衝液に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｂ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｃ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図１ｄ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０６ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（１ａ）、濁度（１ｂ）、モノマー含量（１ｃ）およびＨＣＰ量（１ｄ）を示す図である。
【図２ａ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｂ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｃ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図２ｄ】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液における回収率（２ａ）、濁度（２ｂ）、モノマー含量（２ｃ）およびＨＣＰ量（２ｄ）を示す図である。
【図３】抗体ＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液中のＨＣＰ量を比較する図である。
【図４】抗体ＢＩ−ＭＡｂ１００１ｂを一例として挙げた、異なる組み合わせおよび異なる組成の洗浄緩衝液で洗浄後のアフィニティークロマトグラフィーからの溶離液中のＨＣＰ量を比較する図である。抗体ＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを一例として挙げた組成。ｘ軸の数字は、実施例に詳述された洗浄緩衝液への添加剤に関するものである。
【００１８】
発明の具体的な説明
本発明は、タンパク質がリコンビナント発現または内因性発現された細胞培養物から得られるようなタンパク質組成物から不純物を、特にホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡを枯渇させるための方法に関する。特に本発明は、リガンドによって固定相に可逆的に固定化することができることからアフィニティークロマトグラフィーに適する、タンパク質（ターゲットタンパク質）を精製または濃縮するための方法に関する。
【００１９】
ターゲットタンパク質は、特に免疫グロブリン、または免疫グロブリンのＦｃドメインを有し、プロテインＡと結合することのできるタンパク質であってよい。好ましい態様では、これらは、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖から成る免疫グロブリンである。抗体は、２本の同一の重鎖（Ｈ）および２本の同一の軽鎖（Ｌ）が共有ジスルフィド架橋によって一緒に結合してＹ型構造を形成したものから成る。軽鎖は、それぞれ１個の可変ドメインおよび１個の定常ドメインから成り、それらはＶＬおよびＣＬと呼ばれる。他方で重鎖は、それぞれ１個の可変ドメインおよび免疫グロブリンに依存して３〜４個の定常ドメインを有する。これらは、同様にＶＨおよびＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３と呼ばれる。軽鎖および重鎖の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。ドメインＣＨ２は、補体系に対する結合部位を形成する糖鎖を有する。ＣＨ３ドメインは、Ｆｃレセプター結合部位を有する。
【００２０】
プロテインＡは、重鎖との相互作用によって免疫グロブリンのＦｃに結合する。結合親和性は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ２ａに対して、ならびにマウスＩｇＧ２ｂに対して最高である。プロテインＡは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ならびにマウスＩｇＧ３およびＩｇＧ１に中等度の親和性で結合する。しかしプロテインＡは、ヒトＩｇＧ３およびＩｇＤとも、以下のマウス免疫グロブリン：ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥのいずれとも反応しない。
【００２１】
本発明による方法が適用されることがあるターゲットタンパク質は、免疫グロブリンなどの、Ｆｃドメインを有する全てのタンパク質である。免疫グロブリンは、ハイブリドーマ細胞またはリコンビナントホスト細胞に発現されるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のことがある。そのような抗体は、トランスジェニック動物、例えばヒト免疫グロブリンを発現するマウスなどの、動物、特に哺乳動物を免疫処置することによって本来生成されていることがある。しかしながら、適切なターゲットタンパク質には、また、任意の所望のタンパク質と免疫グロブリンのＦｃドメインとが融合された融合タンパク質が含まれる。
【００２２】
本発明のためのプロテインＡマトリックスは、リガンドとして固定化タンパク質を有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスである。これらには、リガンドとして例えばStaphylococcus aureus由来の野生型プロテインＡを有するアフィニティーマトリックスが含まれる。プロテインＡの説明は、とりわけ、Lofdahl, Sら、１９８３（Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J (1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.）およびLindmarkら、１９８３（Lindmark, R., Thoren-Tolling, K., Sjoquist J (1983); Binding of immunoglobulins to protein A and immunoglobulin levels in mammalian sera: J Immunol Methods 1983 Aug 12;62(1):1-13.）に見出すことができる。加えて本発明は、また、リコンビナント生成されたプロテインＡをリガンドとして有するマトリックスに関する。リコンビナントプロテインＡは、一例としてDuggleby C.J.およびJones, S.A.、１９８３（Duggleby, C.J. and Jones, S.A. (1983), Cloning and expression of Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichia coli. Nucl.Acid.Res. 1983 May 25; 11(10):3065-76.）またはLi, R.ら、１９９８（Li, R. Dowd, V., Stewart, D.J., Burton, S.J. Lowe, C.R., Design, Synthesis and application of a protein A mimetic. Nat.Biotechnol. 1998 Feb; 16(2):190-5.）によって記載されており、当技術分野において公知である。
【００２３】
プロテインＡは、例えばアガロース、多糖、デキストラン、シリカゲルおよびガラスビーズなどの様々な担体材料にカップリングさせることができる。適切な担体材料の非限定的な列挙は、Harlow, E.およびLane, D.、１９９９に見出すことができる。多くの場合に使用される一担体材料は、例えばAmersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Swedenによって製造された「セファロース」などの、当業者に公知のアガロースベースの材料によって形成される。プロテインＡセファロースの特定例は、２００１年の日付でこの会社によって主題「Affinity Chromatography」に関して作成されたマニュアルから見出すことができる。さらに、例えばMabSelect（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、STREAMLINE（商標）rProtein A（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）、Poros A（Millipore, Durham, England）のような、他のプロテインＡクロマトグラフィーマトリックスが技術者に公知である。本発明による方法には、対応するマトリックスの処理が含まれ、マトリックスの列挙は例として提供されるものであって、包括的であるべきとは主張しない。
【００２４】
リガンドのカップリングは、一般に、臭化シアン活性化、ＮＨＳ活性化または担体マトリックスへのチオールカップリングによるアミノ基、カルボキシル基または硫黄基によって実施される。この主題に関しては、例えばマニュアル「Affinity Chromatography」（Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden, 2001）を参照されたい。
【００２５】
特に好ましい態様では、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、ポリビドンまたはポビドンとしても知られている、ＣＡＳ：９００３−３９−８）が、本発明による洗浄緩衝液中に使用される。ポリビニルピロリドンは、Ｎ−ビニルピロリドンモノマーユニットから成る水溶性ポリマーである。しかしながら、それは、他の極性溶媒に溶解されていてもよい。ＰＶＰは、色が白〜淡黄色である吸湿性の非晶質粉末である。標準的な市販のポリマーは、約２５００〜２，５００，０００ダルトンの範囲のモル質量を有する。
【００２６】
本発明の洗浄緩衝液中の洗剤は、ＰＶＰに追加的にまたはＰＶＰの代わりに使用することができる。洗剤は、ミセル、すなわち洗剤分子集合体を形成することができる界面活性両親媒性分子であって、親水性頭基が水性溶媒に向けて外側に向いている分子である。
【００２７】
本発明のための洗剤は、非イオン性物質およびイオン性物質の両方である。しかしながら、例えばポリグリコールエーテル（NP-40型、Tergitol NP40、ＣＡＳ：１２７０８７−８７−０）、ＰＥＧ−アルキルエーテルポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル（ＣＡＳ：９００２−９２−０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノラウレート（ポリソルベート２０、ＣＡＳ：９００５−６４−５）またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタン−モノオレエート（ポリソルベート８０、ＣＡＳ：９００５−６５−６）などのＰＥＧ−ソルビタン脂肪酸エステル、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（トリトン−Ｘ−１００、ＣＡＳ：９００２−９３−１）などのアルキルフェニル−ＰＥＧ−エーテル、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー(Pluronic F68、Lutrol F68、Poloxamer 188、ＣＡＳ：９００３−１１−６またはPoloxamer 407、Pluronic F127、Lutrol F127、ＣＡＳ：９００３−１１−６）などのＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマー（ポロキサマー誘導体）などの非イオン性洗剤が好ましい。
【００２８】
洗浄緩衝液および溶離緩衝液のｐＨ値は、全体としてシステムに依存し、したがって一般に個別に決定され、各システム毎に最適化される。
【００２９】
一局面では、洗浄緩衝液は４〜８のｐＨを有する。技術者は、タンパク質がカラムから溶離されるｐＨがいくつかの要因に依存するという事実を熟知している。これらには、とりわけ結合、洗浄および溶離の間に使用される緩衝系、不純物の存在、マトリックス粒子の幾何学的配置、クロマトグラフィーマトリックスへのアフィニティーリガンドのカップリングの性質が含まれることがあろう。特に、タンパク質の特異的性質が決定的な影響を有する。
【００３０】
場合によっては、アフィニティーリガンドからのタンパク質の部分的または全体的溶離がｐＨ４を超えてもなお起こることがある組み合わせがありうる。そのような場合、そしてタンパク質の損失が許容されない場合、洗浄緩衝液はより高いｐＨを有さなければならない。技術者は、そのような場合に洗浄緩衝液のｐＨをそれに応じて調整しなければならないことを認識している。しかしながら大部分の場合、タンパク質とプロテインＡアフィニティーリガンドの間の結合は、ｐＨ４未満のときにだけ形成されない。
【００３１】
別の局面では、洗浄緩衝液は、４．５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は、５〜８のｐＨを有する。別の局面では、洗浄緩衝液は、６〜８のｐＨを有する。
【００３２】
典型的な態様では、本発明は、例えば以下のように実施されることがある。
【００３３】
プロテインＡクロマトグラフィーは、一般に第１の精製工程である。無細胞細胞培養上清は、カラムに直接加えることができるが、またはまず第一に限外濾過膜、いわゆるＵＦ／ＤＦシステムを通して濃縮物を製造してもよい。
【００３４】
プロテインＡカラムは、最初に、物理化学的性質がおおよそチャージングプール（charging pool）に対応するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で平衡化される。チャージングプールは、細胞培養物からの上清から成り、その上清は、精製されるべき生成物と、さらに例えばＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞などの問題となる哺乳動物細胞を成長させるために必要な追加的な培地成分とを含有する。細胞培養物のこの無細胞上清またはその濃縮物は、プロテインＡカラム上にチャージされる。すると、ターゲットタンパク質は、カラム上のプロテインＡ結合部位に結合する。次に、未結合の培地構成成分および細胞生成物が溶離してしまうまで、カラムは平衡化緩衝液でフラッシュされる。記載された洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液の後またはチャージの直後に加えることができる。洗浄緩衝液の量は、規模に依存し、したがって、クロマトグラフィーカラムのサイズに関係して与えられる。
【００３５】
通常は、洗浄緩衝液の体積は、クロマトグラフィーカラムの体積のおよそ２〜５倍である（２〜５ベッド体積、ＢＶ）。洗浄緩衝液を加えた後に、洗浄緩衝液の構成成分が生成物と共に溶離しないように、カラムを再び平衡化緩衝液または別の緩衝液で処理することができる。ここで使用される緩衝液は、洗浄緩衝液よりも低いが溶離緩衝液よりも高いｐＨを有さなければならず、溶離緩衝液と緩衝塩および組成が類似している。ｐＨ４未満の緩衝液は、溶離のために使用され、その主成分として例えば酢酸塩またはクエン酸塩を含有することがある。溶離緩衝液は、１０mMから２００mMの間、好ましくは２０mMから１００mM、最も好ましくは５０mMから１００mMの間の濃度で酢酸塩を含有することがあるか、または１０から２００mMの間、好ましくは２０から１００mMの間の濃度でクエン酸塩を含有することがある。両方の緩衝液は、４未満、好ましくは３から４の間、特に好ましくは３．４から３．６の間の上記ｐＨ範囲にあるべきである。そのうえ、アルギニンまたはＰＶＰなどの添加剤も存在することがある。さらに、濃度が１０から２００mMの間、好ましくは２５から１００mMの間で、ｐＨが２から３．５の間のグリシン緩衝液、または抗体のＦｃドメインとプロテインＡの間の結合を軽減するために適する他の緩衝液が使用されることがある。次に、溶離液は、以下のプロセス、例えばより低いｐＨでのインキュベーションまたは中和でさらに処理することができる。
【００３６】
実施例
異なる培地中で発酵され、異なる細胞系（ＣＨＯおよびＮＳ０）から得られ、Ｆｃ部が異なるＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）に属する様々なタンパク質を用いて実験を実施した。
【００３７】
標準から開始し、洗浄緩衝液または緩衝液だけを変えた一連の試験を実施した。添加剤を有さない平衡化緩衝液を導入するか、１種の添加剤だけを有する洗浄緩衝液を使用するか、それぞれ１種の添加剤を有するいくつかの異なる緩衝液を順次加えるか、またはいくつかの添加剤の組み合わせを有する洗浄緩衝液を使用するかのいずれかとした。
【００３８】
適用されるタンパク質溶液は、常にそれぞれのタンパク質について同一であった。
【００３９】
各試験で、溶離液中の不純物の量を測定した。実験同士で比較して、後の溶離液が最小可能量の核不純物を有した洗浄緩衝液を同定した。いくつかの実験では、収率、濁度およびモノマー含量も測定した。
【００４０】
クロマトグラフィー
クロマトグラフィー実験は、自動AEKTA-FPLCモデル900システム（GE Healthcare)で実施した。４種の異なる生成物を実験に使用した。生成物のうち無細胞培養上清または濃縮培養上清のいずれかを出発物質として使用し、調製物を５０kD Omega膜（Pall）で１０倍濃縮し、次にＰＢＳで３回ダイアフィルトレーションした。
【００４１】
使用されるカラムは、体積１ml〜８mlを有し、クロマトグラフィーゲルMabSelectまたはMabSelect Xtra（GE Healthcare）の一方を内部に含んでいた。
【００４２】
緩衝液
全ての実験において、１０mMリン酸塩、５mM塩化カリウムおよび１４０mM塩化ナトリウムを有するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）をｐＨ７．４で平衡化緩衝液として使用した。
【００４３】
全ての洗浄緩衝液は、
８mmol/Lリン酸一水素ナトリウム、
１．５mmol/Lリン酸水素カリウム、
２．７mM塩化カリウム、および
１４０mM塩化ナトリウム
を含有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）をベースとした。
【００４４】
（図に詳述するように）添加剤として、以下のものを個別にまたは様々な組み合わせで使用した：
（１） ８６０mmol/L塩化ナトリウム（合計含量１mol/L塩化ナトリウム）、
（２） ０．２５％(w/V)ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、
（３） １５％(V/V)イソプロパノール、
（４） ０．５mol/L Ｌ−アルギニン。
【００４５】
生成物に応じて、溶離のために異なる緩衝液を異なる酢酸塩濃度およびｐＨで使用した。以下の濃度を用いた：
ＢＩ−Ｍａｂ０６ａ：１００mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ１００３ａ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ１００１ｂ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．４
ＢＩ−Ｍａｂ０７ｃ：５０mM酢酸塩、ｐＨ３．６
【００４６】
分析
実験の溶離液をそれらの不純物含量について比較し、収率を決定した。
【００４７】
細胞構成成分の量を決定するために、一般的サンドイッチＥＬＩＳＡを用い、ホスト細胞タンパク質を経験的パラメーターとして決定した。アッセイのためにポリクローナル検出抗体を使用した。
【００４８】
モノマー含量は、Agilent Series HPLC 1200（waters）システムと、タンパク質に依存してTSK 3000SWまたはTSK 3000SWXLカラム（To-soH）とを使用して決定した。均一濃度法を流速１ml/minのトリス緩衝液（Ｈ７．０）で行った。
【００４９】
ＤＮＡは、しきい値法によって決定する（Kung, V.T. et al., Picogram Quantitation of Total DNA Using DNA-Binding Proteins in a Silicon Sensor-Based System, Anal. Biochem. 1990, 187, 220-227）。
【００５０】
Phastシステム（GE Healthcare）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施する。試料はPhast SDSゲル（４％〜１５％、GE）を使用して分離する。染色は、Heukeshoven銀染色（Heukeshoven, Dernick 1988, Electrophoresis 9 (1), pages 28-32）を使用して行う。
【００５１】
チャージおよび溶離液中の抗体量を決定するために、PA2-1001-00プロテインＡカラム（Applied Biosystems）およびAgilent Series 1200 HPLCシステム（waters）を使用した。結合および溶離は、ｐＨ７．４〜ｐＨ２．８の勾配をかけてＰＢＳ緩衝系で実施し、問題となる抗体の外部検量線を使用して評価を行った。
【００５２】
濁度測定は、製造業者の濁度標準を用いて較正後に2100AN濁度計（Hach）で実施した。
【００５３】
結果
サブクラスＩｇＧ１の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ０６ａを用いた実験
結果から、洗浄が収率、モノマー、濁度およびホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）に及ぼす有意な作用が示される。
【００５４】
４種の添加剤全てを含有する緩衝液で洗浄後に、溶離液は、収率、モノマー含量およびＨＣＰ枯渇という品質基準において最良の値を示す。そのうえ、添加剤の組み合わせは、三つの成分０．８６mol/L塩化ナトリウム、０．２５％(w/V)ＰＶＰおよび１５％(V/V)イソプロパノールの組み合わせ、ならびに四つの添加剤全て、すなわち０．８６mol/L塩化ナトリウム、０．２５％(w/V）ＰＶＰ、１５％(V/V)イソプロパノールおよび０．５mol/Lアルギニンの組み合わせの両方で濁度の実質的な減少につながる。
【００５５】
サブクラスＩｇＧ１の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ１００３ａを用いた実験
ＨＣＰの最良の枯渇は、追加的な構成成分４種全てを含有する洗浄緩衝液で達成される。同様に良好な値は、塩化ナトリウム、ＰＶＰおよびイソプロパノールの組み合わせを有する洗浄緩衝液で得られる。４種の構成成分を個別に含有する緩衝液を用いた洗浄によって、溶離液中により多いＨＣＰが得られる。
【００５６】
濁度に関しても、緩衝液中に洗浄物質を組み合わせることでより良好な結果が得られる。
【００５７】
サブクラスＩｇＧ４の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ０７ｃを用いた実験
個別の洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液は、組み合わされた洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液よりも高いレベルのＨＣＰを有する。
【００５８】
サブクラスＩｇＧ２の抗体であるＢＩ−ＭＡｂ１００１ｂを用いた実験
個別の洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液は、組み合わされた洗浄緩衝液を用いた試験からの溶離液よりも高いレベルのＨＣＰを有する。
【００５９】
４回の実験は、単一の洗浄緩衝液中に４種の添加剤である塩化ナトリウム、ＰＶＰ、イソプロパノールおよびアルギニンを組み合わせることが、溶離液中のホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）の含量に関して、個別の添加剤を有する洗浄緩衝液を使用するよりも利点があることを示す。
【００６０】
記載された洗浄緩衝液の使用は、また、溶離液中の濁度が有意に減少することも示す。モノマーの量および収率もまた改善されるか（ＢＩ−ＭＡｂ０６ａ）、または少なくとも同じままである（ＢＩ−ＭＡｂ１００３ａ）。
【００６１】
したがって記載された洗浄緩衝液は、タンパク質の製造方法を著しく改善するために適している。洗浄緩衝液の組み合わせの導入は、その他の方法では追加的な精製工程によって除去しなければならない不純物を枯渇させる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＡクロマトグラフィーによって、免疫グロブリンのＦｃドメインを含むタンパク質（ターゲットタンパク質）を含有する組成物から不純物を枯渇させる方法であって：
ａ． プロテインＡを含有する固定相に、該ターゲットタンパク質が該固定相に結合する条件下で、該ターゲットタンパク質を含有する移動相を適用すること；
ｂ．
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４から８の間の洗浄緩衝液を移動相として適用すること；
ｃ． 該ターゲットタンパク質が該固定相から溶離される条件下で、移動相として溶離緩衝液を使用すること
を含む方法。
【請求項２】
洗浄緩衝液中のアルギニン濃度が、０．４〜０．６mol/lであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が、０．９〜１．１mol/lであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
洗浄緩衝液中のアルコールが、濃度１０〜２０％(w/v)のイソプロパノールであることを特徴とする、請求項１〜３の一つに記載の方法。
【請求項５】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が、濃度０．１〜２％(w/v)であることを特徴とする、請求項１〜４の一つに記載の方法。
【請求項６】
洗剤が、濃度０．０５〜２％(w/v)のポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウレートであることを特徴とする、請求項１〜５の一つに記載の方法。
【請求項７】
洗浄緩衝液が、５〜８のｐＨを有することを特徴とする、請求項１〜６の一つに記載の方法。
【請求項８】
不純物が、ホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）であることを特徴とする、請求項１〜７の一つに記載の方法。
【請求項９】
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４〜８のアフィニティークロマトグラフィー用の洗浄緩衝液。
【請求項１０】
ｐＨ５〜８の、請求項９に記載の洗浄緩衝液。
【請求項１】
プロテインＡクロマトグラフィーによって、免疫グロブリンのＦｃドメインを含むタンパク質（ターゲットタンパク質）を含有する組成物から不純物を枯渇させる方法であって：
ａ． プロテインＡを含有する固定相に、該ターゲットタンパク質が該固定相に結合する条件下で、該ターゲットタンパク質を含有する移動相を適用すること；
ｂ．
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４から８の間の洗浄緩衝液を移動相として適用すること；
ｃ． 該ターゲットタンパク質が該固定相から溶離される条件下で、移動相として溶離緩衝液を使用すること
を含む方法。
【請求項２】
洗浄緩衝液中のアルギニン濃度が、０．４〜０．６mol/lであることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
洗浄緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が、０．９〜１．１mol/lであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
洗浄緩衝液中のアルコールが、濃度１０〜２０％(w/v)のイソプロパノールであることを特徴とする、請求項１〜３の一つに記載の方法。
【請求項５】
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が、濃度０．１〜２％(w/v)であることを特徴とする、請求項１〜４の一つに記載の方法。
【請求項６】
洗剤が、濃度０．０５〜２％(w/v)のポリオキシエチレン−ソルビタン−モノラウレートであることを特徴とする、請求項１〜５の一つに記載の方法。
【請求項７】
洗浄緩衝液が、５〜８のｐＨを有することを特徴とする、請求項１〜６の一つに記載の方法。
【請求項８】
不純物が、ホスト細胞タンパク質（ＨＣＰ）であることを特徴とする、請求項１〜７の一つに記載の方法。
【請求項９】
ｉ． 濃度０．１〜１mol/lのアルギニン、
ｉｉ． 濃度０．２〜２mol/lの塩化ナトリウム、
ｉｉｉ． イソプロパノール、ｎ−プロパノールおよびエタノールより選択される濃度５〜３０％(w/v)のアルコール、ならびに
ｉｖ． 濃度０．０５〜２％(w/v)のポリビニルピロリドンまたは洗剤
を含有する、ｐＨ４〜８のアフィニティークロマトグラフィー用の洗浄緩衝液。
【請求項１０】
ｐＨ５〜８の、請求項９に記載の洗浄緩衝液。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図２ｄ】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１３−５１７３１８（Ｐ２０１３−５１７３１８Ａ）
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４９３６８（Ｐ２０１２−５４９３６８）
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９２１２
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月１６日（２０１３．５．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月２１日（２０１１．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５０８１７
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８９２１２
【国際公開日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【出願人】（５０３３８５９２３）ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング (976)
【Ｆターム（参考）】
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