【課題】標的ヌクレオチドに対する結合特異性を有するジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを提供すること。
【解決手段】１つまたは複数のＧＮＮトリプレットを含む標的ヌクレオチドに対する結合特異性を有するジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。そのようなポリペプチドを含む組成物、並びにヌクレオチド機能を調節するためのそのようなポリペプチドおよび組成物の使用もまた提供される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ヌクレオチドとジンクフィンガー蛋白質の結合である。より具体的には、本発明は、５'−（ＧＮＮ）−３'なる式の標的ヌクレオチドと特異的に結合するジンクフィンガーのαヘリックスドメイン内のアミノ酸残基配列に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術
遺伝子発現を支配する主要メカニズムは、配列特異的態様でＤＮＡと結合する蛋白質スイッチを必要とするという考え方は１９６７年に確立された（M. Ptashne, Nature(London) 214:323-4(1967)）。構造的に多様な種類のＤＮＡ結合蛋白質が報告されてきた。多数の構造的多様性にもかかわらず、Ｃｙｓ₂−Ｈｉｓ₂ジンクフィンガーモチーフは真核細胞でもっとも頻繁に利用される核酸結合モチーフである。この観察はヒトの場合と同様に酵母でも同様である。Ｃｙｓ₂−Ｈｉｓ₂ジンクフィンガーモチーフ（これは最初ＤＮＡおよびＲＮＡ結合転写因子ＴＦＩＩＩＡで特定された（J. Miller, A.D. McLachlan & A. Klug, Embo J. 4:1609-14(1985)）は、それを土台にして配列特異的蛋白質を構築することができる理想的な構造的足場である。１つのジンクフィンガードメインは、疎水性相互作用とただ１つの亜鉛イオンのキレート化によって安定化されたただ１つのββα折りたたみをもつ約３０のアミノ酸から成る（J. Miller, A.D. McLachlan & A. Klug, Embo J. 4:1609-14(1985)；M.S. Lee, G.P. Gippert, K.V. Soman, D.A. Case & P.E. Wright, Science 245:635-7(1989)）。
【０００３】
ＤＮＡの主溝にこのドメインのαヘリックスを提示することによって、配列特異的な塩基の接触が可能になる。各ジンクフィンガードメインは、典型的には３つのＤＮＡ塩基対を認識するが（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-)252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London) 4:1171-1180(1996); M. Elrod-Erickson, T.E. Benson & C.O. Pabo, Structure(London) 6:451-464(1998); C.A. Kim & J.M. Berg, Nature Structual Biology 3:940-945(1996))、ヘリックス提示の変動によってより広範な部位の認識が可能になる（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 261:1701-7(1993); H.B. Houbaviy, A. Usheva, T. Shenk & S.K. Burley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13577-82(1996) ；L. Fairall, J.W.R. Schwabe, L. Chapman, J.T. Finch & D. Rhodes, Nature(London) 366:483-7(1993); D.S. Wuttke, M.P. Foster, D.A. Case, J.M. Gottesfeld & P.E. Wright, J. Mol. Biol. 273:183-206)）。より長いＤＮＡ配列またはアドレスとの蛋白質−ＤＮＡ接触の拡張のためには蛋白質ドメインの二量体形成が必要とされるほとんどの転写因子とは対照的に、ジンクフィンガードメインの単純な共有結合による縦並びの繰り返しは、このモチーフによるより長い非対称性ＤＮＡ配列の認識を可能にする。
【０００４】
最近になって、我々は、６つのジンクフィンガードメインをもち、１８塩基対の連続ＤＮＡ配列に結合するポリダクチルジンクフィンガーを報告した（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, PNAS 94:5525-5530(1997)。高度に特異的な遺伝子スイッチとしてポリダクチル蛋白質を用いるための要件であるＤＮＡの１８塩基対の認識は、既知の全てのゲノム内の固有のＤＮＡアドレスを書き表すために十分である。実際、これらポリダクチル蛋白質を用いて、遺伝子活性化および遺伝子抑圧の両方がモデル系で示された（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, PNAS 94:5525-5530(1997)）。
【０００５】
ジンクフィンガードメインの各々が３塩基対配列と結合するので、完全な認識アルファベットは６４ドメインの性状決定を必要とする。これらドメインの構築のガイドとなる現存の情報は３つのタイプの研究から得られた：構造決定（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-)252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London) 4:1171-1180(1996); M. Elrod-Erickson, T.E. Benson & C.O. Pabo, Structure(London), 6:451-464(1998); C.A. Kim & J.M. Berg, Nature Structual Biology 3:940-945(1996); N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington D.C., 1883-) 261:1701-7(1993); H.B. Houbaviy, A. Usheva, T. Shenk & S.K. Burley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13577-82(1996); L. Fairall, J.W.R. Schwabe, L. Chapman, J.T. Finch & D. Rhodes, Nature(London) 366:483-7, 11(1993); D.S. Wuttke, M.P. Foster, D.A. Case, J.M. Gottesfeld & P.E. Wright, J. Mol. Biol. 273:183-206(1997); R.T. Nolte, R.M. Conlin, S.C. Harrison & R.S. Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2938-2943(1998); V.A. Narayan, R.W. Kriwacki & J.P. Caradonna, J. Biol. Chem. 272:7801-7809(1997))；位置特異的突然変異（M. Isalan, Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5617-5621(1997); J. Nardelli, T.J. Gibson, C. Vesque & P. Charnay, Nture 349:175-178(1991); J. Nardelli, T. Gibson & P. Charnay, Nucleic Acids Res. 20:4137-44(1922); W.E. Taylor, H.K. Suruki, A.H.T. Lin, P. Naraghi-Arani, R.Y. Igarashi, M. Younessian, P. Katkus N.V. Vo, Biochemistry 34:3222-3230(1995); J.R. Desjarlais & J.M. Berg, Proteins:Struct, Func, Genet. 12:101-4(1992); J. R. Desjarlais & J.M. Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7345-9(1992))；およびファージディスプレー選別（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994); H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science(Washington D.C.) 275:657-661.23(1997); E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington D.C., 1883-) 263:671-3; A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695(1994); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998); H. Wu, W.-P. Yang, & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995)）。すべての研究が我々のジンクフィンガー／ＤＮＡ認識の理解に役立ったが、各々それぞれの限界があった。
【０００６】
構造研究によって多様な蛋白質／ＤＮＡ相互反応スペクトルが特定されたが、別の相互反応がより適しているか否かについては明らかではない。さらにまた、配列特異的認識を可能にする相互作用が観察されるが、一方、別のどのような配列が結合から除外されるかについての情報はほとんど提供されていない。これらの疑問は現在知られている蛋白質の突然変異によって部分的に強調されてきたが、そのデータは性状が決定できる変異体の数のために制限がある。任意抽出ライブラリーのファージディスプレーおよび選別は数に関するある種の制限を克服したが、選別に必要な特異性と親和性の両方を担保できる適切な選別圧力が困難であるという条件付きである。我々自身の研究（H. Wu, W.-P. Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995)）を含むいくつかの研究室の実験では、この認識アルファベットのいくつかをデザインまたは選別することが可能なことを示した（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994); H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C.) 275:657-661(1994);E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington D.C., 1883-) 263:671-3(1994); A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695.25(1994); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H.Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998)）。しかしながら、その標的ＤＮＡに対するこれらドメインの特異性および親和性は、これらの初期の実験では厳格で系統的な態様ではほとんど研究されなかった。
【０００７】
ヤコブとモノドがリプレッサーの化学的特性について問題を提起し、細胞内で個々の蛋白質の合成が惹起または抑制される機構を提唱して以来、特別な実験による遺伝子発現の制御は興味をそそるものであった（F. Jacob & J. Monod, J. Mol. Biol. 3:318-356(1961)）。ゲノムは、主に配列特異的態様でＤＮＡに結合する転写因子として知られている蛋白質の作用によって転写段階で調節されるということは現在周知である。これらの蛋白質因子は、しばしば複雑な組み合わせ様式で作用し、遺伝子発現について一時的、空間的制御および環境的反応制御を可能にする（M. Ptashne, Nature Medicine 3:1069-1072(1997))。しばしば転写因子は、蛋白質をゲノム内の特定の部位に配置させるＤＮＡ結合部位および付属エフェクタードメイン（当該部位およびその近くでの転写を惹起（活性化）または抑圧するために作用する）の両者を介して作用する（I.G. Cowell, Trends Biochem. Sci. 19:38-42(1994)）。エフェクタードメイン、例えば活性化ドメインＶＰ１６（I. Sadowski, J. Ma, S. Triezenberg & M. Ptashne, Nature 335:563-564(1988))および抑圧ドメインＫＲＡＢ（J.F. Margolin, J.R. Friedman, W. Meyer, K.-H., H. Vissing, H.-J. Thiesen & F.J. Rauscher III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4509-4513(1994)）は典型的にはモジュール式で、それらが他のＤＮＡ結合蛋白質と融合したときそれらの活性を維持する。ゲノム内の特定の部位に転写因子を誘導することによって遺伝子は容易に制御できるかもしれないが、一方、与えられたいずれの配列とも結合できるように適合させたＤＮＡ結合蛋白質をデザインすることはきわめて困難なチャレンジであった。
【０００８】
本発明は、核酸に結合するジンクフィンガー蛋白質のＣｙｓ₂−Ｈｉｓ₂クラスに固有の構造的特性の認識を基にしている。Ｃｙｓ₂−Ｈｉｓ₂ジンクフィンガードメインは、長さが約３０アミノ酸の単純なββα折りたたみから成る。この折りたたみの構造的安定性は、疎水性相互作用と保存Ｃｙｓ₂−Ｈｉｓ₂残基によるただ１つの亜鉛イオンのキレーションによって達成される（M.S. Lee, G.P. Gippert, K.V. Soman, D.A. Case & P.E. Wright, Science 245:635-637(1989)）。
核酸の認識は、典型的にはＤＮＡ配列の３塩基対と結合する、このドメインのαヘリックスから発生する特異的アミノ酸側鎖の接触により達成される（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure 4:1171-1180(1996)）。他の核酸認識モチーフと異なり、マルチジンクフィンガードメインの単純な共有結合による連結は広い範囲の非対称性ＤＮＡ配列の認識を可能にする。天然のジンクフィンガー蛋白質の研究によって、３つのジンクフィンガードメインは連続した９塩基対のＤＮＡ配列と結合できることが明らかにされた（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science 252:809-17(1991); A.H. Swirnoff & J. Milbrandt, Mol. Cell. Biol. 15:2257-87(1995))。９塩基対の配列の認識では大腸菌（E. coli)の小さなゲノムでさえもその中の固有の部位を特定するためには不十分であるが、一方、６つのジンクフィンガードメインを含むポリダクチル蛋白質は１８塩基対認識を特定できる（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5525-5530(1997))。遺伝子制御のための普遍的な系の開発に関して、１８塩基対アドレスは、全ての既知ゲノム内のただ１つの部位を特定するために十分である。しかしながら、このタイプのポリダクチル蛋白質の性質は知られていないが、遺伝子の活性化および抑圧におけるヒトの生細胞内でのそれらの有効性が最近になって示された（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5525-5530(1997))。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明が解決しようとする課題
本発明の特徴の１つでは、配列番号：１−１１０のいずれかのアミノ酸残基配列を含む、単離および精製したジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される。関連する特徴では、本発明はさらに２つから約１２のそのようなジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを含む組成物を提供する。本組成物は好ましくは２つから約６つのポリペプチドを含む。好ましい実施態様では、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、好ましくは配列番号：１１１の配列を有するアミノ酸残基によって機能的に連結されている。本発明の組成物は、５'−（ＧＮＮ）_n−３'なる配列を含むヌクレオチド標的と特異的に結合する。ここで各ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであるが、ただし全てのＮがＣであることはないということを条件とし、ｎは好ましくは２から６である。ポリペプチドまたは組成物は、さらに１つまたは２つ以上の転写調節因子、例えば転写アクチベーターまたは転写サプレッサーもしくはリプレッサーに機能的に連結されていてもよい。本発明はまた、本発明のポリペプチドまたは組成物をコードする単離および精製ポリヌクレオチド並びにそのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１０】
また別の特徴では、本発明は、５'−（ＧＮＮ）_n−３'なる配列を含むヌクレオチド配列の機能を調節する方法を提供する。ここでｎは１から６の整数で、本方法は、１つまたは２つ以上の転写調節因子に機能的に連結させた、有効な量の本発明の組成物に前記ヌクレオチド配列を暴露することを含む。５'−（ＧＮＮ）_n−３'なる配列は、前記ヌクレオチドの転写領域もしくはプロモーター領域または発現された配列タグ内に見出される。
【００１１】
本発明は、遺伝子スイッチの迅速な製造のための普遍的手法の平易さおよび有効性を明示してみせる。６４種のジンクフィンガーアルファベットの５'−ＧＮＮ−３'サブセット配列を認識する規定ジンクフィンガードメイン類を用いて、新規な９塩基対、または初めて１８塩基対配列を特異的に認識するポリダクチル蛋白質を構築し性状を決定した。強力な転写因子が生成され、遺伝子活性化および遺伝子抑圧の両制御が可能なことが示された。遺伝子活性化は、単純疱疹ウイルスＶＰ１６活性化ドメイン（I. Sadowski, J. Ma, S. Triezenberg & M. Ptashne, Nature 335:563-564(1988))およびその最小活性化ドメインの組換え四量体リピートを用いて達成された。遺伝子抑圧または無発現（silencing)は、ヒト由来の３つのエフェクタードメイン、クリュッペル付随ボックス（Krｕppel associated box, ＫＲＡＢ）(J.F. Margolin, J.R. Friedman, W. Meyer, K.-H., H. Vissing, H.-J. Thiesen & F.J. Rauscher III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4509-4513(1994))、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）（D.N. Sgouras, M.A. Athanasiou, G.J. Beal,Jr., R.J. Fisher, D.G. Blair & G.J. Mavrothalassitis, EMBO J. 14:4781-4793(1995))、およびｍＳＩＮ３相互反応ドメイン（ＳＩＤ）（D.E. Ayer, C.D. Laherty, Q.A. Lawrence, A.P. Armstrong & R.N. Eisenman, Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781(1996))を用いて達成された。ヒト上皮細胞でルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて、プロト癌遺伝子ｅｒｂＢ−２／ＨＥＲ−２のプロモーターを標的とするようにデザインされた人工的転写調節因子は、特異的態様で遺伝子発現を低下または活性化できることが示された。遺伝子転写物内に標的を誘導することによって初めて遺伝子活性化または遺伝子抑圧が達成され、発現された配列タグ（expressed sequence tag, EST)から得られる情報は遺伝子スイッチの構築に十分であろうということが示唆された。本明細書に開示した新規な方法および材料は、遺伝子治療、遺伝子導入生物、ゲノム機能学並びに他の細胞生物学および分子生物学分野で多様な応用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（６枚のパネルで示されている）は、本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの領域の結合特異性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
課題を解決するための手段
Ｉ．本発明
本発明は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド、１つまたは２つ以上の前記ポリペプチドを含む組成物、並びに遺伝子発現調節を目的とする前記ポリペプチドおよび組成物の使用を提供する。
ＩＩ．化合物
本発明の化合物は、ＧＮＮヌクレオチド配列と結合し、当該ヌクレオチド配列の機能を調節する単離されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドである。本ポリペプチドは遺伝子の転写を強化または抑圧することができ、さらにＤＮＡまたはＲＮＡと結合することができる。ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、野性型ジンクフィンガー蛋白質の誘導形または遺伝子組換えによって製造されたポリペプチドである。ポリペプチドは、例えば第二の蛋白質のジンクフィンガードメインと連結された蛋白質のジンクフィンガードメインを含むハイブリッドでもよい。このドメインは野性型でも変異型でもよい。ポリペプチドには野性型ジンクフィンガー蛋白質の切端形が含まれる。前記ポリペプチドが得られるジンクフィンガー蛋白質の例にはＴＦＩＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が含まれる。
【００１４】
本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、そのポリペプチドのαヘリックスドメイン内の固有のヘプタマー（７アミノ酸残基の連続した配列）で、この七量体配列は標的ヌクレオチドとの結合特異性を決定する。この七量体配列はαヘリックスドメイン内のいずれの場所に位置してもよいが、ただし残基に当技術分野で通常のとおりに番号を付与したとき、好ましくはヘプタマーは−１位から６位に広がっている。本発明のポリペプチドは、β−シートおよびジンクフィンガー蛋白質の部分として機能することが当技術分野で知られているフレームワーク配列を含むことができる。多数のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを作製し、ＧＮＮトリプレットを含む標的ヌクレオチドに対する結合特異性について検査した。これらの実験の結果は図１に要約されている。
図１では、各ペプチドに対するＧＮＮトリプレット結合特異性は右側の欄に示されている。もっとも強い特異性は第一番目にさらに太字で示されている。図１では配列番号は括弧内に示されている。各々特定のＧＮＮ（例えばＧＡＡ、これは図１の右側の欄に示されている）標的について、当該トリプレットに対する特異性の高いものから順に配列が並べられている。
【００１５】
図１に示すように、このデータでは、主要ＤＮＡ接触ポジション（−１、３および６）の３つの全てが驚くほど保存されているのが与えられた標的の実質的に全てについて観察された。これら残基の多くは以前にもはるかに不完全なライブラリーによる選別の後でこれらの場所で観察されたが、ここで認められた保存の程度は以前の実験よりも劇的な改良を示している（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994); H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C.) 275:657-661(1997); E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington D.C., 1883-) 263:671-3(1994); A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695(1994); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); H. Wu, W.-P. Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995))。本発明は、ジンクフィンガードメインの３つのヘリックスポジション（−１、３および６）はドメインのＤＮＡ結合特異性を詳細に示すために十分であるという従来の教示が正しくないことを示している。
【００１６】
典型的には、ファージ選別はこれらのポジションのほんの１つまたは２つにおいてコンセンサス選別を示した。もっともおおきな配列変動は、ポジション１および５の残基で生じ（これらのポジションはＺｉｆ２６８／ＤＮＡ構造では塩基接触を生じない）、認識に顕著には寄与しないと考えられた（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London) 4:1171-1180(1996))。ポジション１および５の変動はまた、他のポジションにおける保存はＤＮＡとの相互作用によるもので、他の理由によるただ１つのクローンの単なる偶然の増幅のためではないことを暗示している。ポジション２の残基同一性保存もまた観察された。ポジション−２の保存はいくぶん人為的で、ＮＮＫライブラリーはセリンとして固定されたこの残基を有していた。この残基はＺｉｆ２６８構造でＤＮＡ骨格と接触する。両ライブラリーがポジション４に不変のロイシンを含んでいた（ロイシンは、このドメインの折りたたみを安定化させる疎水性コア中の必須の残基である）。
【００１７】
見事なアミノ酸保存が、異なる標的内の同じヌクレオチドの認識について観察された。例えば、ＧＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＴまたはＧＡＣコンテクストのいずれであれ、ポジション３のＡｓｎ（Ａｓｎ３）は中央のポジションのアデニンを認識するために実質的に常に選ばれた。Ｇｌｎ−１およびＡｒｇ−１は、コンテクストにかかわらず３'ポジションでそれぞれアデニンまたはグアニンを認識するために常に選ばれた。ＧｌｎまたはＡｓｎによるアミド側鎖を基にしたアデニンの認識は、３'または５'グアニンとのグアニン接触に対するＡｒｇグアニジニウム側鎖の場合のように構造研究で詳しく記述されている（M. Elrod-Erickson, T.E. Benson & C.O. Pabo, Structure(London) 6:451-464(1998); C.A. Kim & J.M. Berg, Nature Structual Biology 3:940-945(1996); L. Fairall, J.W.R. Schwabe, L. Chapman, J.T. Finch & D. Rhodes, Nature(London) 366:483-7(1993))。しかしながら、より頻繁に２つまたは３つのアミノ酸がヌクレオチド認識のために選ばれた。Ｈｉｓ３またはＬｙｓ３（およびより低い頻度でＧｌｙ３）が中央のグアニンの認識のために選ばれた。Ｓｅｒ３およびＡｌａ３は中央のチミンを認識するために選ばれた。Ｔｈｒ３、Ａｓｐ３およびＧｌｕ３は、中央のシトシンを認識するために選ばれた。ＡｓｐおよびＧｌｕはまた３'シトシンを認識するためにポジション−１で選ばれ、一方、Ｔｈｒ−１およびＳｅｒ−１は３'チミンを認識するために選ばれた。
【００１８】
選別されたＺｉｆ２６８変種は細菌性発現ベクターでサブクローニングされ、蛋白質を過剰発現させた（フィンガー−２蛋白質、以下ではそれら蛋白質が選別されるサブサイトによって呼ばれる）。ファージ融合物よりも可溶性蛋白質を研究することが重要である。なぜならば、これら２つはそれらの結合特性が顕著に異なることが知られているからである（A. Crameri, S. Cwirla & W.P. Stemmer, Nat. Med. 2:100-102(1996))。１６の５'−ＧＮＮ−３'フィンガー−２サブサイトの各々を認識するそれら蛋白質の能力をマルチ標的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検査した。このアッセイは特異性について極めてきびしいテストを提供した。なぜならば、常に６つの"非特異的"部位が存在し、これは"特異的"部位とは９ヌクレオチドの標的のうちの１つのヌクレオチドだけが"特異的"部位と異なっていたからである。ファージ選別フィンガー−２蛋白質の多くが完璧な特異性を示し、一方、他のものは様々な程度の交差反応性を示した。いくつかのポリペプチドはそれらが選別されたもの以外のサブサイトとより良好に結合した。
【００１９】
認識ヘリックスを位置特異的変異を用いて改造することによって結合特異性を改良する試みを実施した。我々の選別および構造情報のデータが変異体デザインのガイドであった。今日まで徹底的な実験を実施して、１００を越える変異蛋白質の性状を決定し認識の規則についての我々の理解を拡張しようと試みた。ヘリックスのポジション１および５はＤＮＡ認識に直接の役割を果たすとは期待されていないが、特異性についての最善の改良は常にこれらのポジションの改変を必要とした。これらの残基は燐酸骨格を接触させることが観察された（燐酸骨格は配列非特異的態様の親和性に寄与する）。非特異的接触の除去は、複合体の全体的な安定性に対する特異的接触の重要性を増加させ、それによって特異性を強化する。例えば、標的トリプレットＧＡＣ、ＧＡＡおよびＧＡＧに対するポリペプチドの特異性は、ポジション１および５の非典型的な荷電を有する残基をより小型の荷電をもたない残基で置換することによって簡単に改造された。
【００２０】
別の種類の改造は結合残基および非結合残基の両方の変化を含んでいた。ＧＧＧおよびフィンガー−２サブサイトＧＡＧに対する交差反応性はＨｉｓ３ＬｙｓおよびＴｈｒ５Ｖａｌなる改造によって消失した。Ｈｉｓ３は中央のグアニン認識の選別中に常に選択されたが、Ｌｙｓ３はＡおよびＧのより明瞭な区別を提供したということは注目に値する。これは、この蛋白質の選別条件が、特異性のパラメーターよりも親和性のようなパラメーターによる選別に適していることを示唆している。Ｚｉｆ２６８構造では、Ｈｉｓ３は中央のグアニンのＮ７に水素結合を与える（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L.Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London), 4:1171-1180(1996))。この結合はアデニンのＮ７とも形成することができ、実際Ｚｉｆ２６８はこのポジションではＧとＡを区別しない（A.H. Swirnoff & J. Milbrandt, Mol. Cell. Biol. 15:2275-87(1995))。Ｈｉｓ３は、ＧＧＡ、ＧＧＣおよびＧＧＴを標的とするポリペプチドでは、たとえＬｙｓ３がＧＧＣおよびＧＧＴの選別中に選択されたとしても中央のグアニンのみを指定することが判明した。同様に、ＧＴＧを標的とするポリペプチドのマルチ交差反応性は、Ｌｙｓ１ＳｅｒおよびＳｅｒ３Ｇｌｕなる改造によって減弱され、親和性が１／５になった。Ｇｌｕ３は、Ｚｉｆ２６８の結合部位選択実験ではシトシンに対して非常に特異性を有することが示された（A.H. Swirnoff & J. Milbrandt, Mol. Cell. Biol. 15:2275-87(1995))。構造的実験では、Ｇｌｕ３と中央のチミンとの相互反応は認められず、我々の実験でも他の研究でも中央のチミンを認識するためにＧｌｕ３は選択されることはなかった(Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994)；H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C.) 275:657-661(1997); E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington D.C., 1883-) 263:671-3(1994); A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695(1994); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998); H. Wu, W.-P. Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995)）。それにもかかわらず、Ｓｅｒ３Ｇｌｕなる改造はシトシンよりも中央のチミンの認識に有利であった。これらの例は、特異性の基礎となる構造的要素を理解するためにはこれまでの構造と選択に関するデータに頼ることの限界を示している。さらにまた、ポジション１および５を含む改造による改良はこれまでの"認識コード"によっては予想されなかったことも強調されるべきで、前記認識コードは典型的にはポジション−１、２、３および６だけを考慮している。（J.R. Desjarlais & J.M. Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7345-9(1992); M. Suzuki, M. Gerstein & N. Yagi, Nucleic Acids Res. 22:3397-405(1994); Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11168-72(1994); Y. Choo & A. Klug, Curr. Opin. Struc. Biol. 7:117-125(1997))。選別と位置特異的変異の組み合わせによってのみ、ジンクフィンガー／ＤＮＡ認識の複雑さについての完全な理解が始まるであろう。
【００２１】
選別と変異誘発データを組み合わせることによって、多くのヌクレオチドの特異的認識は単一のアミノ酸ではなくモチーフを用いて極めて良好に達成できるであろうということが明らかになった。例えば、３'グアニンのもっとも強力な指定は、Ａｒｇ−１、Ｓｅｒ１およびＡｓｐ２の組み合わせ（ＲＳＤモチーフ）を用いて達成された。５'グアニンを指定するためにＶａｌ５およびＡｒｇ６を用いることによって、サブサイトＧＧＧ、ＧＡＧ、ＧＴＧおよびＧＣＧの認識が通常のヘリックス構造（ＳＲＳＤ−Ｘ−ＬＶＲ）を用いて達成できた。前記通常のヘリックス構造はポジション３の残基のみに相違が存在する（ＧＧＧのためにはＬｙｓ３、ＧＡＧのためにはＡｓｎ３、ＧＴＧのためにはＧｌｕ３、およびＧＣＧのためにはＡｓｐ３）。同様に、３'チミンは最後のクローンでＴｈｒ−１、Ｓｅｒ１およびＧｌｙ２（ＴＳＧモチーフ）を用いて指定された。さらに、３'シトシンはＡｓｐ−１、Ｐｒｏ１およびＧｌｙ２（ＤＰＧモチーフ）を用いて指定できたが、ただしサブサイトがＧＣＣの場合は、Ｐｒｏ１はこのサブサイトによって受け入れられることはなかった。３'アデニンは２つのクローン（ＱＳＳモチーフ）ではＧｌｎ−１、Ｓｅｒ１およびＳｅｒ２を用いて指定された。モチーフのポジション１および２の残基を３'塩基の各々について調べたところ、本明細書に開示したように与えられた３'塩基に対して最適の特異性を提供することが判明した。
【００２２】
マルチ標的ＥＬＩＳＡアッセイによれば、全ての蛋白質は５'位にグアニンを好むようであった。なぜならば、全ての蛋白質がＡｒｇ６を含み、さらにこの残基は、このポジションでグアニンと接触することが構造的実験から判明しているからである（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C.. 1883-) 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London) 4:1171-1180(1996); M. Elrod-Erickson, T.E. Benson & C.O. Pabo, Structure(London) 6:451-464(1998); C.A. Kim & J.M. Berg, Nature Structural Biology 3:940-945(1996); N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 261:1701-7(1993); H.B. Houbaviy, A. Usheva, T. Shenk & S.K. Burley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13577-82(1996); L. Fairall, J.W.R. Schwabe, L. Chapman, J.T. Finch & D. Rhodes, Nature(London) 366:483-7(1993); D.S. Wuttke, M.P. Foster, D.A. Case, J.M. Gottesfeld & P.E. Wright, J. Mol. Biol. 273:183-206(1997); R.T. Nolte, R.M. Conlin, S.C. Harrison & R.S. Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2938-2943(1998))。この相互作用は、５'結合部位シグナチャーアッセイを用いて本明細書では明らかにした（(Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11168-72(1994) ；図２、白棒）。各蛋白質は１６のオリゴヌクレオチド標的プールに用いられた。前記プールでは、フィンガー−２サブサイトの５'ヌクレオチドがＧ、Ａ、ＴまたはＣとして固定され、中央および３'ヌクレオチドは任意抽出されていた。全ての蛋白質はＧＮＮプールを好み、本質的に交差反応性はなかった。
【００２３】
マルチ標的ＥＬＩＳＡアッセイの結果は精製蛋白質の親和性実験によって確認された。ＥＬＩＳＡアッセイで交差反応性が最小限であった事例では、ただ１つのヌクレオチドミスマッチは、典型的には親和性の１００倍以上の損失をもたらした。この程度の特異性はそれでもジンクフィンガー蛋白質を用いて示されねばならなかった。一般に、中央および３'位にＧまたはＡをもつサブサイトと結合するように選択またはデザインされた蛋白質は最高の親和性を有し、続いて中央または３'位にただ１つのＧまたはＡをもつものが続き、さらにＴまたＣのみを含むものがこれに続く。前者の群は、典型的にはＺｉｆ２６８よりも高い親和性で（１０ｎＭ）それらの標的と結合し、後者はいくぶん低い親和性で結合し、ほとんど全ての蛋白質は親のＣ７蛋白質の親和性よりも低い親和性を有していた。
結合親和性と結合特異性の間には相関性が存在せず、特異性は特異的な蛋白質−ＤＮＡ接触から生じるだけでなく、正しいヌクレオチド以外は全て排除する相互作用によっても生じることを示唆している。
【００２４】
Ａｓｐ２は、標的サブサイトがＧＮＧである全ての蛋白質で常にＡｒｇ１と一緒に選択された。これには２つの理由があることが今や理解される。Ｚｉｆ２６８の構造的実験から（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould L. Nekludova & C.O. Pabo Structure(London) 4:1171-1180(1996))、フィンガー２のＡｓｐ２はＡｒｇ−１と１対の支持水素結合を形成し、これはいくつかの水仲介接触と同様にＡｒｇ−１／３'グアニン相互反応を安定化させることが知られている。しかしながら、Ａｓｐ２のカルボキシレートはまた、フィンガー−１サブサイトの５'グアニンと塩基対を形成しているシトシンのＮ４からの水素結合も受容している。この位置のＴと塩基対を形成しているアデニンはシトシンで認められる接触と同様な接触を生じることができる。この相互反応は特に重要である。なぜならば、それによってフィンガー２の認識サブサイトは３ヌクレオチド（ＧＮＧ）から４ヌクレオチド（ＧＮＧ（Ｇ／Ｔ))に拡大されるからである（M. Isalan, Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5617-5621(1997); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998))。この現象は"標的部位オーバーラップ"と称され、３つの重要な結果をもたらす。第一に、我々のフィンガー−１サブサイトは５'グアニンを含んでいたので、Ａｓｐ２は、フィンガー−２サブサイトがＧＮＧの場合、我々のライブラリーによる選別にとって有利であった。第二に、それは、この実験で用いられるライブラリーのＧＮＮまたはＴＮＮフィンガー−２サブサイトによる選別に対する有用性を制限するかもしれない。
なぜならば、これらのライブラリーのフィンガー３はＡｓｐ２を含み、これはフィンガー−２サブサイトの５'ヌクレオチドをＧまたはＴに特定させるかもしれないからである。Ｚｉｆ２６８およびＣ７（これらはフィンガー２にＴｈｒ６をもつ）では、フィンガー３のＡｓｐ２は５'位でＧまたはＴ認識を強制する((Ｔ／Ｇ）ＧＧ）。この相互作用はまた、なぜこれまでのファージディスプレー実験（これらは全てＺｉｆ２６８系ライブラリーを用いた）は主にＧＮＮ認識に限定された選別を見出したのかを説明することができる（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994); E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 263:671-3(1994); A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695(1994); A.C. Jamieson, H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998); H. Wu, W.-P. Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995)）。
【００２５】
最後に、標的部位オーバーラップは、これらジンクフィンガーのモジュール式結合ブロックとしての使用を潜在的に制限する。構造的データから、標的部位オーバーラップが極めて広範囲であるいくつかのジンクフィンガー（例えばＧＬＩおよびＹＹ１の場合のもの）およびＺｉｆ２６８と類似していてほんの中等度のオーバーラップを示すその他のものが存在することが知られている。我々の最後の蛋白質セットでは、Ａｓｐ２は、ＧＧＧ、ＧＡＧ、ＧＴＧおよびＧＣＧと結合するポリペプチドで見出される。ポジション２で見出される他の残基のオーバーラップの潜在能力はほとんど知られていないが、しかしながら構造的実験では、このポジションで見出される他の多くの残基がそのようなクロスサブサイト接触に参画する可能性が示されている。Ａｓｐ２を含むフィンガーはモジュール性を制限する可能性がある。なぜならば、それらは、各ＧＮＧサブサイトにＴまたはＧが続くことを要求するからである。
【００２６】
下記の表１は、ＧＮＮ標的トリプレットの１６の具体例に対してもっとも強い選択性を示す配列（配列番号：１−１６）を要約する。
【００２７】
【表１】

【００２８】
このデータは、全ての可能なＧＮＮトリプレット配列は、ジンクフィンガードメインによって完璧な特異性で認識されることを示している。最適化されたジンクフィンガードメインは、親和性を１００倍以上消失させてただ１つの塩基の違いを識別することができる。必須の接触ポジション−１、３および６で最適化された蛋白質で見出されるアミノ酸の多くが単純な認識コードと一致するものであるが、一方、最適な特異的認識は、これらの残基が提示されているコンテクストに感受性を有することが見出された。ポジション１、２および５の残基は特異的認識に必須であることが見出された。さらに、ポジション１の残基の単純な同一性よりむしろポジション−１、１および２の配列モチーフが高度に特異的な３'塩基の認識に要求されることをこのデータは初めて示した。おそらくこれらの残基は、特異的塩基の認識および他の塩基の排除という両方に関してヘリックスの相互反応のために適切な立体化学的背景を提供し、高度に特異的な相互作用という究極の結果を提供する。これらドメインの広範囲の有用性は、それらが、ＤＮＡおよび他のジンクフィンガードメインとの両相互作用においてモジュール形式である場合に認められるであろう。これは、標的部位オーバーラップによって強制される蓋然性の高い制限内で作業することによって（すなわち５'−（ＧＮＮ）_n−３'型が標的とされるはずである）達成できるであろう。開示したドメインの容易な組換えは、ポリダクチル蛋白質の生成のためにファージディスプレーライブラリーの開発を必要としない、規定の特異性をもつポリダクチル蛋白質の製造を可能にする。これらのポリダクチル蛋白質は、生細胞中でヒトのｅｒｂＢ−２プロモーターによって駆動される転写の活性化および抑圧のために用いられた。本明細書に開示したこの種類のジンクフィンガードメインは、５'−（ＧＮＮ）_n−３'のＤＮＡ配列類と結合する１６⁶または１７００万の新規な蛋白質の構築のためにはおそらく十分である。
【００２９】
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、切端または伸長によって野性型ジンクフィンガー蛋白質から、または位置特異的変異によって野性型誘導ポリペプチドの変種として、またはそれら方法の組み合わせによっ誘導または製造できる。"切端"という用語は、天然のジンクフィンガー結合蛋白質で見出されるジンクフィンガーの完全な数より少ないジンクフィンガーを含むか、または所望しない配列を欠失させたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質ＴＦＩＩＩＡ（これは天然には９つのジンクフィンガーを含む）の切端形は、わずかに１つから３つのジンクフィンガーをもつポリペプチドであってもよい。伸長とは、さらに別のジンクフィンガーモジュールが付加されたジンクフィンガーポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡは３つのジンクフィンガードメインを付加することによって１２のフィンガーに伸長できる。さらに、切端形のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは２つ以上の野性型ポリペプチド由来のジンクフィンガーモジュールを含むことができる（したがって"ハイブリッド"ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを生じる）。
【００３０】
"変異させた"という用語は、前記蛋白質をコードするＤＮＡのランダム変異または位置特異的変異を達成する既知のいずれかの方法を実施して得られたジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドを指す。例えば、ＴＦＩＩＩＡでは、突然変異は１つまたは２つ以上のコンセンサス配列の繰り返し中で非保存的残基を置換するために実施できる。切端ジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質もまた変異させることができる。
ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を抑制するために、本発明にしたがって切端、伸長および／または変異させることができる既知のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの例には、ＴＦＩＩＩＡおよびｚｉｆ２６８が含まれる。他のジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質も当業者の知るところであろう。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、当技術分野で知られている種々の標準的技術を用いて製造できる（例えば以下を参照されたい：米国特許出願０８／６７６３１８号（１９９５年１月１８日出願）、この文献は参照により本明細書に含まれる）。
ジンクフィンガー蛋白質のファージディスプレーライブラリーは配列特異的蛋白質の増加に適した条件下で作製および選別した。多数の配列を認識するジンクフィンガードメインは、ファージ選別データおよび構造的情報の両方により誘導される位置特異的突然変異による精錬を必要とした。
【００３２】
ネズミのＣｙｓ₂−Ｈｉｓ₂ジンクフィンガー蛋白質Ｚｉｆ２６８をファージディスプレーライブラリーの構築に用いた（H. Wu, W.-P. Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995)）。Ｚｉｆ２６８は、ジンクフィンガー蛋白質のうちで構造的にもっとも性状が調べられている（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 252:809-17(1991); M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure(London) 4:1171-1180(1996); A.H. Swirnoff & J. Milbrandt, Mol. Cell. Biol. 15:2275-87(1995)）。この蛋白質の３つのジンクフィンガードメインの各々におけるＤＮＡ認識は、ＤＮＡの一本鎖上の主に３つのヌクレオチドと接触するαヘリックスのＮ−末端残基によって仲介される。この３フィンガー蛋白質に対するオペレーター結合部位は５'−ＧＣＧＴＧＧＧＣＧ−３'である（フィンガー−２サブサイトには下線を施した）。Ｚｉｆ２６８および他の関連するジンクフィンガーＤＮＡ複合体に関する構造研究によって、αヘリックス上の主に３つのポジション、−１、３および６の残基が特異的な塩基接触に必要とされることが示された（M. Elrod-Erickson, T.E. Benson & C.O. Pabo, Structure(London) 6:451-464(1998); C.A. Kim & J.M. Berg, Nature Structural Biology 3:940-945(1996); N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 261:1701-7(1993); H.B. Houbaviy, A. Usheva, T. Shenk & S.K. Burley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:13577-82(1996); L. Fairall, J.W.R. Schwabe, L. Champman, J.T. Finch & D. Rhodes, Nature(London) 366:483-7(1993); D.S. Wuttke, M.P. Foster, D.A. Case, J.M. Gottesfeld & P.E. Wright, J. Mol. Biol. 273:183-206(1997); R.T. Nolte, R.M. Conlin, S.C. Harrison & R.S. Brown, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:2938-2943(1998); V.A. Narayan, R.W. Kriwacki & J.P. Caradonna, J. Biol. Chem. 272:7801-7809(1977))。典型的には、αヘリックスのポジション−１の残基が当該フィンガーのサブサイトの３'塩基と接触し、一方、ポジション３および６はそれぞれ中央の塩基および５'塩基と接触する。
【００３３】
配列内の５'−ＧＮＮ−３'サブセットを認識するジンクフィンガードメイン類を選別するために、２つの高度に異なるジンクフィンガーライブラリーをファージディスプレーベクターｐＣｏｍｂ３Ｈで構築した（C.F. Barbas III, A.S. Kang, R.A. Lerner & S.J. Benkovic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982(1991); C. Rader & C.F. Barbas III, Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508(1997)）。両ライブラリーとも、Ｃ７（Ｚｉｆ２６８の変種）のフィンガー２のαヘリックス内の残基が任意抽出されていた（H. Wu, W.-P.Yang & C.F. Barbas III, PNAS 92:344-348(1995))。ライブラリー１はＮＫＫドーピング法を用いてポジション−１、１、２、３、５、６の任意抽出によって構築され、一方、ライブラリー２は、ポジション−２、−１、１、２、３、５、６の任意抽出によるＶＮＳドーピング法を用いて構築された。
【００３４】
ＮＫＫドーピング法は、３２コドン内で全てのアミノ酸の組み合わせを可能にし、一方、ＶＮＳはその２４コドンセットからＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓおよび全ての終止コドンを排除する。これらのライブラリーは、それぞれ４．４×１０⁹および３．５×１０⁹の構成メンバーから成り、各々は５'−ＧＣＧＮＮＮＧＣＧ−３'タイプの配列を認識することができる。ＮＫＫライブラリーのサイズはそれが９９％の信頼度で調査可能であることを担保したが、一方、ＶＮＳライブラリーは高度に多様性をもつがいくぶん不完全であった。これらのライブラリーは、しかしながら以前に報告されたジンクフィンガーライブラリーよりも極めて大きい（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-7(1994); H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C.) 275:657-661(1997); E.J. Rebar & C.O. Pabo, Science(Washington, D.C., 1883-) 263:671-3(1994); A.C. Jamieson, S.-H. Kim & J.A. Wells, Biochemistry 33:5689-5695(1994); A.C. Jamieson H. Wang & S.-H. Kim, PNAS 93:12834-12839(1996); M. Isalan, A. Klug & Y. Choo, Biochemistry 37:12026-33(1998))。１６の５'−ＧＣＧＧＮＮＧＣＧ−３'ビオチン付加ヘアピンＤＮＡ標的の各々とともにジンクフィンガーディスプレーファージで、溶液結合プロトコルを用いて７ラウンドの選別を実施した。
【００３５】
厳格度（ストリンジェンシー）は、競合ＤＮＡの添加により各ラウンドで増加させた。せん断ニシン精子ＤＮＡを非特異的にＤＮＡと結合するファージを選別するために加えた。配列特異性のために厳格な選択圧力は、特異的競合物質として５'−ＧＣＧＮＮＮＧＣＧ３'タイプのＤＮＡを提供することによって得られた。５'−ＧＣＧＧＮＮＧＣＧ−３'タイプの過剰ＤＮＡを添加することによって、ビオチン付加標的と比較したとき一塩基変化または二塩基変化をもつＤＮＡとの結合に対していっそう厳格な選別を提供した。ストレプトアビジン被覆ビーズを用い、ただ１つのビオチン付加ＤＮＡ標的配列と結合したファージを回収した。
いくつかの事例では、この選別方法を繰り返した。このデータは、これらのドメインは機能的にモジュール式で、互いに組み換えてナノモル以下の親和性で１８塩基対配列と結合できるポリダクチル蛋白質を生成することができる。本明細書で開示するジンクフィンガードメイン類は、５'−（ＧＮＮ）₆−３'のＤＮＡ配列類と結合する１７００万の新規な蛋白質を構築するために十分である。
【００３６】
本発明は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド（天然のポリペプチド、切端および伸長ポリペプチドを含む）をコードするＤＮＡ配列はいくつかの方法によって得ることができる。例えば、ＤＮＡは当技術分野で周知のハイブリダイゼーション工程を用いて単離できる。これらには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（１）共有ヌクレオチド配列を検出するためにゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーとプローブをハイブリダイズさせる；（２）共通の構造特性を検出するために発現ライブラリーを抗体でスクリーニングする；（３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成する。本発明のＲＮＡ配列は当技術分野で知られている方法によって得ることができる（例えば以下を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology Ausubel, et al. Eds., 1989)。
【００３７】
本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードする特異的ＤＮＡ配列の生成は以下によって得ることができる：（１）ゲノムＤＮＡから二本鎖ＤＮＡ配列を単離する；（２）問題のポリペプチドのために必要なコドンを提供するためにＤＮＡ配列を化学的に製造する；および（３）真核細胞ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写によって二本鎖ＤＮＡ配列をインビトロで合成する。後者の場合、ｍＲＮＡの二本鎖ＤＮＡ相補物（一般にｃＤＮＡと称される）は最後に形成される。組換え工程で使用する特異的ＤＮＡ配列を生成するこれら３つの方法のうち、ゲノムＤＮＡの単離がもっとも稀である。これは、哺乳類のポリペプチドを微生物で発現させたい場合にイントロンの存在のために特に言えることである。
【００３８】
所望のポリペプチド生成物の完全なアミノ酸残基配列が知られているとき、ＤＮＡ配列の合成は、ジンクフィンガー由来ＤＮＡ結合ポリペプチドを得るためにしばしば選択される方法である。所望のポリペプチドの完全なアミノ酸残基配列が分からない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は不可能で、選択できる方法はｃＤＮＡ配列の作製である。問題のｃＤＮＡ配列を単離する標準的な方法のうち、とりわけプラスミド含有ｃＤＮＡライブラリーの生成が挙げられる。前記ライブラリーは、高レベルの遺伝子発現を示すドナー細胞中に豊富なｍＲＮＡを逆転写して得られる。ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせて用いる場合は、稀少な発現生成物でさえもクローニングすることができる。ポリペプチドのアミノ酸配列の大部分が判明している場合には、標的ｃＤＮＡにおそらく存在すると思われる配列の複製である標識一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを生成し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション工程に用いてもよい。この工程は、変性させて一本鎖形にしたｃＤＮＡのクローン化コピーによって実施される（Jay et al., Nucleic Acid Research 11:2325(1983))。
【００３９】
本発明の別の特徴では、治療的に有効な量のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドまたはジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の治療的に有効な量を医薬的に許容できる担体とともに含む医薬組成物が提供される。
本明細書で用いられるように、"医薬的に許容できる""生理学的に耐えうる"という用語は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合は、それら物質が、望ましくない生理学的影響（例えば吐き気、眠気、胸焼けなど）を前記組成物の投与を禁止しなければならない程度まで発生させることなく人に投与できることを意味し、さらに相互に使用される。
その中に溶解または分散させた活性成分を含む医薬組成物の調製は当技術分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液、水性または非水性の滅菌された注射可能物として調製されるが、溶液または分散液に適した固形物も使用前に液体として調製することができる。調製物はまた乳化させてもよい。
【００４０】
活性成分は、医薬的に許容でき、活性成分に適合する賦形剤とともに、さらに本明細書で述べる治療方法で使用するために適した量で混合できる。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。さらに、所望の場合は、組成物は微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤を、ｐＨ調節剤および活性成分に有効性を高める物などと同様に含むことができる。
本発明の治療用医薬組成物は、その中に前記成分の医薬的に許容できる塩を含むことができる。医薬的に許容できる塩には（ポリペプチドの遊離アミノ基で形成される）酸付加塩が含まれる。酸付加塩は、無機酸（例えば塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸など）で生成される。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄）および有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導できる。
【００４１】
生理学的に耐えうる担体は当技術分野で周知である。液体担体の例は滅菌水溶液で、これは、活性成分および水の他には物質を含まないか、または生理的ｐＨ値の緩衝液（例えばリン酸ナトリウム）、生理学的食塩水またはその両方（例えば燐酸緩衝食塩水）を含む。さらにまた、水性担体は１種以上の緩衝塩とともに塩類（例えば塩化ナトリウムおよびカリウム）、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質を含むことができる。液体組成物はまた、水とともに、または水以外の液相を含むことができる。そのような付加できる液相の例はグリセリン、植物油（例えば綿実油）、有機エステル（例えばエチルオリエート）および油水乳化物である。
【００４２】
ＩＩＩ．組成物
本発明の別の特徴では、５'−（ＧＮＮ）_n−３'と規定されるヌクレオチド標的モチーフと特異的に結合できるように、機能的に連結された複数のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドが提供される（式中ｎは１より大きい整数である）。好ましくはｎは２から約６の整数である。
ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを連結する手段は以下の実施例の他に米国特許出願０８／６７６３１８号（１９９５年１月１８日出願）に記載されている。個々のポリペプチドは好ましくはオリゴペプチドリンカーで連結される。そのようなリンカーは、好ましくは天然に存在するジンクフィンガー蛋白質に見出されるリンカーに類似する。本発明で使用される好ましいリンカーはアミノ酸残基配列ＴＧＥＫＰ（配列番号：１１１）である。
【００４３】
そのような組成物を製造する効率および遺伝子制御でのそれらの使用を調べるために、ヒトｅｒｂＢ−２遺伝子をモデルとして選択した。この遺伝子の５'非翻訳領域の１８塩基対配列を特に認識するポリダクチル蛋白質を、ＫＲＡＢ、ＥＲＤまたはＳＩＤリプレッサードメインと融合させて転写リプレッサーに変換した。転写アクチベーターは、単純疱疹ウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、またはＶＰ１６の最小活性化ドメインの４量体リピート（ＶＰ６４と称する）と融合させて作製した。遺伝子の抑圧および活性化の両方が、遺伝子の転写領域内のただ１つの部位を標的とするようにデザインされた蛋白質によって惹起されることが、データによって初めて示された。
【００４４】
ヒトのｅｒｂＢ−２遺伝子が、ジンクフィンガー系転写スイッチの作製のためのモデル標的として選ばれた。ＥｒｂＢレセプター類に属するものはヒトの悪性腫瘍の成長に重要な役割を果たす。特にｅｒｂＢ−２は、多数の部位（乳房、卵巣、肺、胃および唾液腺を含む）に生じるヒトの腺癌に高い割合で見られる遺伝子増幅および／または転写の脱調節の結果として過剰発現される（N.E. Hynes & D.F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184(1994)）。ＥｒｂＢ−２の発現増加は、その本来のチロシンキナーゼの構成的活性化をもたらし、培養細胞を形質転換させることを示した。多数の臨床的研究によって、ＥｒｂＢ−２発現レベルの高い腫瘍をもつ患者は予後が悪いことが示された（N.E. Hynes & D.F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184(1994)）。ヒトの癌における関与の他に、ｅｒｂＢ−２は、哺乳類の成長体および胚の発生時の両方で重要な役割をもつ（N.E. Hynes & D.F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184(1994; N. Altiok, J.-L. Bessereau & J.-P. Changeux, EMBO J. 14:4258-4266(1995); K.-F. Lee, H. Simon, H. Chen, B. Bates, M.-C. Hung & C. Hauser, Nature 378:394-398(1995)）。
【００４５】
ｅｒｂＢ−２プロモーターは、したがって人工的転写調節因子の開発のための興味深い試験例の代表である。このプロモーターは詳細に性状が調べられ、比較的複雑でＴＡＴＡ依存性転写開始部位およびＴＡＴＡ非依存性転写開始部位の両方を含むことが示された（S. Ishii, F. Imamoto, Y. Yamanashi, K. Toyoshima & T. Yamamoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:4374-4378(1987)）。初期の実験は、ポリダクチル蛋白質が転写を特異的に活性化または抑圧する転写調節因子として機能することを示したが、一方、これらの蛋白質は、人工プロモーターの上流で蛋白質結合部位の６つの縦並びリピートと結合した（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5525-5530(1997))。さらにまた、この実験ではその結合特異性が改造されていないポリダクチル蛋白質が利用された。ここでは、我々は、天然のｅｒｂＢ−２プロモーターの単一部位に結合させるために、予め規定した構築ブロックから組み立てたポリダクチル蛋白質の有効性を調べた。１６の５'−ＧＮＮ−３'ＤＮＡトリプレットの各々と結合するジンクフィンガードメイン類の作製と性状決定は上記で述べた。この種類の認識ドメインの生成に我々が焦点を当てた理由の１つは、ほとんどの生物のプロモーター領域ではその塩基の内容は比較的ＧＣに富むからである。したがって、５'−（ＧＮＮ）_x−３'部位を認識する蛋白質が特定のジンクフィンガードメインのこのセットから容易に組み立てられるならば、多くの遺伝子が迅速かつ特異的に調節のための標的となりえるであろう。６つのジンクフィンガードメインを含み、さらに１８塩基対のＤＮＡを認識する蛋白質は、全ての既知のゲノム内のただ１つのアドレスを特定するために十分であるはずである。
ｅｒｂＢ−２プロモーターの試験では２つの５'−（ＧＮＮ）₆−３'部位および１つの５'−（ＧＮＮ）₉−３'部位を明らかにした。これらの部位のうちの１つ（ここではｅ２ｃと特定された）はｅｒｂＢ−２遺伝子の５'非翻訳領域内に収まり、遺伝子特異的転写スイッチの作製のための標的部位として選択した。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ配列類似性検索によって、この配列はｅｒｂＢ−２に固有であることが確認された。ｅ２ｃ標的配列の位置（２つの主要な転写開始部位の下流でその近傍にある）は、転写開始または伸長のどちらかの抑制による抑圧の試験を可能にした。ｅ２ｃ標的部位の興味深い特性は、ヒト、ラットおよびマウスｅｒｂＢ−２遺伝子間で保存されている短い配列ストレッチ内で見出されるということである（M.R.-A. White & M.-C. Hung, Oncogene 7:677-683(1992)）。この部位を標的とすることによって、ヒトの疾患に適用する前に動物モデルでこの手法を調べることが可能になるであろう。
【００４６】
所望のＤＮＡ結合特異性をもつポリダクチル蛋白質を作製するために、本実験は予め規定したジンクフィンガードメインの組み立てに焦点を絞った（これは、他の文献で提唱された連続的選別手法と対照的である（H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science 275:657-661(1997)）。そのような手法は、要求される各々の蛋白質のために６つのジンクフィンガーライブラリーの連続的作製と選別を必要とし、そのためにこの実験アプローチをほとんどの研究室で利用できないものにし、さらに誰にとっても甚だしく時間を食うアプローチにした。さらに、この手法ではまた別の結合配列に対する特異的な負の選別を適用することは困難であるので、最近になって報告されたように比較的特異性のない蛋白質が生じる可能性がある（J.-S. Kim & C.O. Pabo, J. Biol. Chem. 272:29795-29800(1997))。
【００４７】
９塩基対ＤＮＡを認識する３フィンガー蛋白質を作製するための２つの異なる手法の普遍的有用性を調べた。各々の手法はジンクフィンガードメインのモジュール式特性を基にしており、５'−ＧＮＮ−３'のトリプレットを認識するジンクフィンガードメイン類を利用する。第一の手法では、５'−（ＧＮＮ）₆−３'ｅｒｂＢ−２標的部位ｅ２ｃのハーフサイト（ＨＳ）１および２を、ＰＣＲアッセンブリー法を用いて予め規定したフィンガー２（Ｆ２）ドメイン変種と一緒に融合させて作製した。このアプローチの普遍性を調べるために、５'−（ＧＮＮ）₃−３'タイプを認識する３つのまた別の３フィンガー蛋白質を同じアプローチを用いて調製した。精製したジンクフィンガー蛋白質を、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）との融合物として調製した。ＥＬＩＳＡ分析によって、一連のものとして順次結合させたＦ２蛋白質は協調的に作用し、所望の９塩基対のＤＮＡ標的配列を特異的に認識できることが明らかになった。表示の５つの蛋白質の各々が、標的と非標的５'−（ＧＮＮ）₃−３'配列を識別できた。
【００４８】
その標的に対する前記蛋白質の各々の親和性を電気泳動移動性シフトアッセイによって測定した。これらの実験は、ジンクフィンガーペプチドは、Ｚｉｆ２６８および他の天然の転写因子に匹敵する親和性（３から７０ｎＭの範囲のＫ_d値）を有することを示した。
ここでＺｉｆ２６８のそのオペレーターに対するＫ_d値は１０ｎＭであることが見出された。説明できない理由で、１グループが天然のＺｉｆ２６８蛋白質のＫ_d値を６ｎＭから１０ｐＭの範囲（６００倍の変動）であると報告したことは特記する必要がある（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science 252:809-17(1991); H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science 275:657-661(1997)）。ほとんどの実験ではＺｉｆ２６８−ＤＮＡ相互反応のＫ_d値は
３から１０ｎＭと報告された（Y. Choo & A. Klug, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163-11167(1994); T.B. Hamilton, F. Borel & P.J. Romaniuk, Biochemistry 37:2051-2
058(1998))。したがって、ここで報告した結果を別の場所で報告された結果と比較するために、相対Ｋ_dｓ、（変異体Ｋ_d）／（Ｚｉｆ２６８Ｋ_d）を比較するべきである（前式では両方の値が同じ報告に由来する）。本データは、ファージディスプレーを用いて調製された新規な３フィンガー蛋白質についての他の研究（この場合Ｚｉｆ２６８より１０から２００倍低い親和性が報告されている（H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science 275:657-661; Y. Choo, I. Sanchez-Garcia & A. Klug, Nature 372:642-5(1994)）と適切に比較できる。
【００４９】
Ｆ２ドメイン変種の連続的結合に対する別の選択肢として、第二の手法では、２つのｅ２ｃ５'−（ＧＮＮ）₃−３'ハーフサイトに特異的に３フィンガー蛋白質を"ヘリックス移植"によって製造した。ジンクフィンガードメインのフレームワーク残基（認識ヘリックスの提示を支持する残基）は、蛋白質間で変動する。
我々は、フレームワーク残基は親和性と特異性において重要な役割をもつであろうと期待した。ヘリックス移植のために、ＤＮＡ認識ヘリックスのアミノ酸ポジションの−２から６をＺｉｆ２６８に移植するか（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science 252:809-17）、またはＳｐ１Ｃフレームワークに移植した（J.R. Desjarlais & J.M. Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2256-60(1993))。Ｓｐ１Ｃ蛋白質は、キレート剤に対して安定性が強化されていることが示されたデザインされたコンセンサス蛋白質である。これらの蛋白質は迅速なＰＣＲによる遺伝子アッセンブリー手法によって調製されたＤＮＡ鋳型から発現された。各々の事例で、ＭＢＰ融合蛋白質のＥＬＩＳＡ分析は、Ｆ２フレームワーク構築物を用いて観察されたＤＮＡ結合特異性および親和性は保持されていることを示した。
【００５０】
上記で考察したように、９塩基対のＤＮＡ配列の認識は複雑なゲノム内の固有の部位を特定するためには十分ではない。対照的に、連続した１８塩基対ＤＮＡ配列を認識する６フィンガー蛋白質はヒトのゲノム内のただ１つの部位を特定でき、したがって遺伝子特異的転写スイッチの作製のための重要な前提条件を満たす。３フィンガー構築物から、ｅｒｂＢ−２標的配列ｅ２ｃと結合する６フィンガー蛋白質を単純な制限酵素消化並びにＦ２、Ｚｉｆ２６８およびＳｐ１Ｃフレームワークの鋳型ＤＮＡとともにクローニングすることによって作製した。精製ＭＢＰ融合蛋白質のＥＬＩＳＡ分析は、６フィンガー蛋白質の各々が特異的な標的配列を認識することができ、非標的５'−（ＧＮＮ）₆−３'部位またはＺｉｆ２６８標的部位の縦並びリピートに対する酵素反応性はほとんどないことを示した。
【００５１】
ｅ２ｃＤＮＡ標的部位に対する各蛋白質の親和性はゲルシフト分析によって決定した。Ｆ２フレームワークから構築されたＥ２Ｃ（Ｆ２）６フィンガー蛋白質で中等度のＫ_d値（２５ｎＭ）が観察された。この値はその構成成分である３フィンガー蛋白質よりもわずかに２から３倍良好である。６フィンガー蛋白質に関する我々の以前の実験では、それらの３フィンガー構成成分と比較したとき６フィンガー蛋白質のＤＮＡリガンドに対して約７０倍強い親和性が観察された（Q. Liu, D.J. Segal, J.B. Ghiara & C.F. Barbas III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:5525-5530(1997))。Ｅ２Ｃ（Ｆ２）ペプチドの親和性で実質的な増加が見られないということは、Ｆ２ドメインの連続的結合は最適ではないことを示唆している。
【００５２】
６フィンガー蛋白質のＦ２ドメインの周期性はこの伸長配列のＤＮＡの周期性と適合しておらず、この蛋白質の結合エネルギーの相当部分がＤＮＡを解くために費やされている可能性がある（Y. Shi & J.M. Berg, Biochemistry 35:3845-8(1996)）。Ｆ２ドメイン蛋白質とは対照的に、Ｅ２Ｃ（Ｚｉｆ）およびＥ２Ｃ（Ｓｐ１）６フィンガー蛋白質は、それらの本来の３フィンガー蛋白質構成成分と比較したとき４０から７０倍の親和性増加を示した（Ｋ_d値はそれぞれ１．６ｎＭおよび０．５ｎＭ）。際立ったことには、どちらのハーフサイトの変異も親和性のほぼ１００倍の低下をもたらしたので、これら蛋白質の両３フィンガー成分が結合に必要とされるということであった。既知の転写因子の多くはナノモルの親和性でそれらの特異的ＤＮＡリガンドと結合し、このことは、遺伝子発現の制御は普通の寿命をもつ蛋白質／ＤＮＡ複合体によって支配されていることを示唆している。したがって、親和性の増加したジンクフィンガー蛋白質が要求される必要はなく、特に非特異的結合も増加するという場合には不利であろう。
【００５３】
一般に、ジンクフィンガードメインは性質としてモジュール式で、各フィンガーは３塩基対のサブサイトを認識する（N.P. Pavletich & C.O. Pabo, Science 252:809-17(1991)）。このことは、ジンクフィンガードメインを所望のいずれの配列にも組み換えて、５'−（ＧＮＮ）_x−３'なる構造をもつ伸長された配列を認識するポリダクチル蛋白質を得ることができる我々の能力によって支持される。しかしながら、少なくともいくつかの事例では、ジンクフィンガードメインは個々の３塩基対部位ではなくオーバーラップした４塩基対を特定するらしいということは特記されるべきである。Ｚｉｆ２６８では、ヘリックスポジション−１、３および６で見出されるものの他にさらに残基がＤＮＡ接触に含まれる（M. Elrod-Erickson, M.A. Rould, L. Nekludova & C.O. Pabo, Structure 4:1171-1180(1996)）。特に、Ｆ２のヘリックスポジション２のアスパルテートは認識にいくつかの役割を果たし、多様な接触をもたらす。アスパルテート側鎖のカルボキシレートはポジション−１のアルギニンと水素結合し、その標的部位の３'グアニンとの相互作用を安定化させる。このアスパルテートはまた、グアニンの相補性シトシンとの水仲介接触に参画する。さらに、このカルボキシレートは、フィンガー１の結合部位の５'グアニン塩基の対抗する鎖上のシトシン塩基のＮ４と直接接触する。標的部位のオーバーラップのための化学的基礎となるのはこの相互作用である。実際、Ｚｉｆ２６８Ｆ２ライブラリーが４種の５'−ＧＣＧＧＮＧＧＣＧ−３'配列に対して選択されたとき、ポジション−１のアルギニンおよびポジション２のアスパルテートの両方が得られ、天然のＺｉｆ２６８の残基と同様であった。ｅ２ｃ標的配列（５'−ＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３'）（配列番号：１１２）はその後にＧではなくＡが続くので、潜在的な標的部位オーバーラップ問題は、ｅ２ｃ特異的６フィンガー蛋白質のフィンガー１で予想された。しかしながら、ＺｉｆフレームワークおよびＳｐ１Ｃフレームワーク６フィンガー蛋白質の両方で、ポジション２にアスパルテートを含むＧＴＧ特異的フィンガー１は、５'−ＧＴＧＡ−３'および５'−ＧＴＧＧ−３'の配列を等しく良好に認識するようである。これは、標的部位ｅ２ｃ−ａおよびｅ２ｃ−ｇに対するそれらの類似する親和性によって示される。
【００５４】
上記で説明したように本発明のポリヌクレオチドまたは組成物は、１つまたは２つ以上の転写調節因子と機能的に連結されていてもよい。調節因子、例えば転写アクチベーターまたは転写サプレッサーまたはリプレッサーは当技術分野で周知である。そのような因子にポリペプチドを機能的に連結する手段もまた当技術分野で周知である。遺伝子発現を調節するために典型的で好ましいそのような因子およびそれらの使用は下記で詳細に考察する。
【００５５】
ＩＩ．使用
実施態様の１つでは、本発明の方法は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むヌクレオチド配列の機能を調節（抑制または抑圧）する工程を含み、これは、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを前記モチーフと結合するジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドの有効量と接触させることを含む。ヌクレオチド配列がプロモーターである場合は、本方法は、ジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの転写トランスアクチベーションの抑制を含む。"抑制"という用語は、プロモーターに機能的に連結された構造遺伝子の転写の活性化レベルの抑圧を意味する（前記プロモーターは例えばジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含む）。さらに、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド誘導体は、構造遺伝子内またはＲＮＡ配列内のモチーフと結合してもよい。
【００５６】
"有効量"という用語は、先に活性化されたプロモーターの脱活性化をもたらす量、またはジンクフィンガーヌクレオチド結合モチーフを含むプロモーターの不活化をもたらす量、または構造遺伝子の転写またはＲＮＡの翻訳を遮断する量を含む。必要とされるジンクフィンガー由来ヌクレオチド結合ポリペプチドの量は、現在存在する蛋白質／プロモーター複合体中で天然のジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質にとって代わるために必要な量、または天然のジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質と競合してプロモーター自体と複合体を形成するために必要な量である。同様に、構造遺伝子またはＲＮＡを遮断するために必要な量は、それぞれ、ＲＮＡポリメラーゼと結合してこれを遺伝子の読み取りから遮断する量、または翻訳を抑制する量である。好ましくは本方法は細胞内で実施される。プロモーターまたは構造遺伝子を機能的に不活化させることによって転写または翻訳は抑圧される。ジンクフィンガーヌクレオチド結合蛋白質モチーフを含む細胞性ヌクレオチド配列と結合または"接触"させるために有効量の抑制蛋白質の輸送は、本明細書に記載した機構の１つによって達成できる。これらは、例えばレトロウイルスベクターまたはリポソームによるもの、または当技術分野で周知の他の方法である。
【００５７】
"調節"という用語は、機能の抑圧、強化または誘発を指す。例えば、本発明のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは、プロモーター内のモチーフと結合し、それによってプロモーターヌクレオチド配列と機能的に連結された遺伝子の転写を強化または抑圧することによってプロモーター配列を調節することができる。また別には、調節は遺伝子の転写の抑制を含むことができる。この場合、ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドは構造遺伝子と結合し、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを遺伝子読み取りから遮断し、したがって遺伝子の転写を抑制する。構造遺伝子は、例えば正常な細胞遺伝子またはオンコジーンである。また別には、調節は転写物の翻訳の抑制を含むことができる。
【００５８】
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には構造遺伝子に対して５'側に存在する調節エレメントを含む。遺伝子が活性化される場合は、転写因子として知られる蛋白質がこの遺伝子のプロモーター領域に結合する。このアッセンブリーは、酵素がＤＮＡからＲＮＡへと第二の遺伝子セグメントを転写することを可能にすることによって"スイッチが入る"ことと類似する。ほとんどの場合、生じたＲＮＡ分子は特異的蛋白質の合成のための鋳型として機能し、時にはＲＮＡそれ自体が最終生成物である。
プロモーター領域は正常な細胞性プロモーターでも、または例えばオンコプロモーターでもよい。オンコプロモーターは一般にウイルス由来プロモーターである。例えば、レトロウイルスのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）は、本発明のジンクフィンガー結合ポリペプチド変種の標的となることができるプロモーターである。レンチウイルス群の構成メンバー由来のプロモーターは、本発明のジンクフィンガー結合ポリペプチドによる転写調節のための標的とすることができるウイルスプロモーター領域の例である（レンチウイルス群は、ヒトのＴ細胞リンパ栄養性ウイルス（ＨＴＬＶ）１型および２型、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＬＶ）１型または２型のような病原体を含む）。
【００５９】
ジンクフィンガー蛋白質を遺伝子特異的転写調節因子として使用するという概念を調べるために、Ｅ２Ｃ（Ｓｐ１）６フィンガー蛋白質を多数のエフェクタードメインと融合させた。転写リプレッサーは、３つのヒト由来リプレッサードメインをジンクフィンガー蛋白質に結合させて作製した。第一のリプレッサー蛋白質はＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）（ｅｔｓ２リプレッサー因子（ＥＲＦ）のアミノ酸４７３から５３０と規定される）を用いて調製した（D.N. Sgouras, M.A. Athanasiou, G.J. Beal, Jr., R.J. Fisher, D.G. Blair & G.J. Mavrothalassitis, EMBO J. 14:4781-4793(1995)）。このドメインは、ｅｔｓ類の転写因子の活性に対するＥＲＦの拮抗作用を仲介する。合成リプレッサーは、このドメインをジンクフィンガー蛋白質のＣ−末端に融合させて構築した。
【００６０】
第二のリプレッサー蛋白質は、クリュッペル付随ボックス（Krｕppel-associated box, ＫＲＡＢ）ドメインを用いて調製した（J.F. Margolin, J.R. Friedman, W.K.-H., Meyer, H. Vissing, H.-J.Thiesen & F.J. Rauscher III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4509-4513(1994)）。このリプレッサードメインは、ジンクフィンガー蛋白質のＮ−末端に一般的に見出され、おそらく距離と方向性に依存しない態様で（G. Pengue & L. Lania, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1015-1020(1996)）、ＲＩＮＧフィンガー蛋白質ＫＡＰ−１と相互作用することによってＴＡＴＡ依存転写に対するその抑圧活性を示す（J.R. Friedman, W.J. Fredericks, D.E. Jensen, D.W. Speicher, X.-P. Huang, E.G. Neilson & F.J. Rauscher III, Genes & Dev. 10:2067-2078(1996)）。我々は、ジンクフィンガー蛋白質ＫＯＸ１のアミノ酸１から９７の間に見出されるＫＲＡＢドメインを利用した（J.F. Margolin, J.R. Friedman, W.K.-H. Meyer, H. Vissing, H.-J.Thiesen & F.J. Rauscher III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4509-4513(1994) ）。この事例では、６フィンガー蛋白質とのＮ−末端融合を実施した。
【００６１】
最後に抑圧のためのヒストン脱アセチル化の有用性を調べるために、ＭａｄｍＳＩＮ３相互反応ドメイン（ＳＩＤ）のアミノ酸１から３６をジンクフィンガー蛋白質のＮ−末端に融合させた（D.E. Ayer, C.D. Laherty, Q.A. Lawrence, A.P. Armstrong & R.N. Eisenman, Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781(1996))。この小ドメインは転写因子ＭａｄのＮ−末端に見出され、ｍＳＩＮ３（これは順次コリプレッサーＮ−ＣｏＲと相互反応する）およびヒストンデアセチラーゼｍＲＰＤ１と相互作用することによってその転写抑圧の仲介に必要である（T. Heinzel, R.M. Lavinsky, T.-M. Mullen, M. Ssderstrsm, C.D. Laherty, J. Torchia, W.-M. Yang, G. Brard, S.D. Ngo & al., e. Nature 387:43-46(1997))。遺伝子特異的活性化を調べるために、転写アクチベーターを、単純疱疹ウイルスのＶＰ１６蛋白質のアミノ酸４１３から４８９にジンクフィンガー蛋白質を融合させるか（I. Sadowski, J. Ma, S. Triezenberg & M. Ptashne, Nature 335:563-564(1988))、またはＶＰ１６の最小活性化ドメイン（ＤＡＬＤＤＦＤＬＤＭＬ（配列番号：１１３))の人工四量体リピート（ＶＰ６４と称する）を融合させて作製した（K. Seipel, O. Georgiev & W. Schaffner, EMBO J. 11:4961-4968(1992))。
【００６２】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子と結合したｅｒｂＢ−２プロモーターのフラグメントを含むレポーター構築物を作製し、我々のデザインした転写調節因子の特異的活性を調べた。ターゲットレポータープラスミドはＡＴＧ開始コドンに対してヌクレオチド−７５８から−１を含み、一方、コントロールレポータープラスミドはヌクレオチド−１５７１から−２４を含み、したがって−２４位から−７位に包含されているＥ２Ｃ結合部位の１つのヌクレオチドを除いて全てを欠いていた。両方のプロモーターフラグメントは、ＨｅＬａ細胞に一過性にトランスフェクトされたとき類似の活性を示し、以前の報告と一致した（L.G. Hudson, A.P. Ertl & G.N. Gill, J. Biol. Chem. 265:4389-4393(1990)）。ジンクフィンガーリプレッサードメイン融合構築物のｅｒｂＢ−２プロモーター活性に対する影響を検査するために、ジンクフィンガー発現ベクターおよびルシフェラーゼレポーター構築物の各々をＨｅＬａ細胞に一過性に同時にトランスフェクトした（図５Ａ）。
【００６３】
各構築物で顕著な抑圧が観察された。ＥＲＤおよびＳＩＤ融合蛋白質はそれぞれ約５０％および８０％の抑圧をもたらした。もっとも強力なリプレッサーはＫＲＡＢ融合蛋白質であった。この蛋白質はｅｒｂＢ−２プロモーター活性を完全に抑圧した。観察された残留活性は、プロモーターのないｐＧＬ３レポーターのバックグラウンドレベルであった。対照的に、いずれの蛋白質もＥ２Ｃ標的部位を欠くコントロールのｅｒｂＢ−２レポーター構築物は顕著には抑圧せず、抑圧は、実際にその標的部位へのＥ２Ｃ（Ｓｐ１）蛋白質の特異的結合によって仲介されることを示した。エフェクタードメインを全く欠いているジンクフィンガー蛋白質の発現は弱い抑圧（約３０％）をもたらし、ＳＩＤおよびＫＲＡＢ構築物で観察される抑圧のほとんどは、ＤＮＡ結合のみによるというよりはそれらのエフェクタードメインによって引き起こされることを示している。この観察は、抑圧メカニズムは、伸長の抑制というよりはむしろ転写開始の能動的抑制であることを強く示している。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写開始がいったん開始したら、ジンクフィンガー蛋白質はポリメラーゼの作用によってＤＮＡから容易に追い出されるようである。
【００６４】
転写の活性化を仲介するための遺伝子特異的ポリダクチル蛋白質の有用性を、同じ２つのレポーター構築物を用いて調べた。ＶＰ１６融合蛋白質は転写を約５倍刺激することが判明したが、一方、ＶＰ６４融合蛋白質は２７倍の活性化をもたらした。ただ１つのＶＰ１６を主体とする転写アクチベーターによって惹起されるプロモーター活性のこの劇的な刺激は、ジンクフィンガー蛋白質は遺伝子の転写領域に結合するという事実から見れば例外的である。このことはまた、ジンクフィンガー蛋白質のＲＮＡポリメラーゼＩＩの通り道との単なる結合（たとえナノモル以下の親和性をもつものとの結合であっても）は、遺伝子発現に負の作用を必ずしも与えるとは限らないことを示している。
【００６５】
本明細書に提示したデータは、新規な９および１８塩基対ＤＮＡ標的部位と結合することができるジンクフィンガー蛋白質は、５'−ＧＮＮ−３'部位を認識する予め規定したドメインを用いて容易に調製できることを示している。この情報は、各々が１８塩基対のＤＮＡ配列と結合できる１６⁶または１７００万の新規な６フィンガー蛋白質を調製するために十分である。新規なジンクフィンガー蛋白質を構築するこの迅速な方法は、他の研究者によって提唱されたジンクフィンガードメインの連続的生成および選別（H.A. Greisman & C.O. Pabo, Science 275:657-661(1997)）に較べて利点を有し、さらに、上記に特定したような標的オーバーラップの問題についての可能性を５'−ＧＮＮ−３'部位を標的とする蛋白質では回避できるであろうということを示唆する構造的情報を利用するものである。複雑でよく研究されたｅｒｂＢ−２プロモーターおよびヒトの生細胞を用いたとき、得られたデータは、適切なエフェクタードメインを提供されたときこれらの蛋白質は発現を喚起または活性化され、さらにこれらの実験でバックグラウンドのレベルまで等級を有する抑圧レベルをもたらすことができることを示した。
【００６６】
これらの実験は、ＫＲＡＢドメインはＥＲＤまたはＳＩＤドメインよりも転写リプレッサーとして極めて強力で、このプロモーターのＴＡＴＡ非依存性およびＴＡＴＡ依存性転写開始の両方を抑制できることを示唆している。これらのリプレッサードメインは以前には直接比較されたことはなかった。エフェクタードメインに結合したポリダクチル蛋白質を構築するために、予め規定したジンクフィンガードメインを用いる本手法は、転写複合体に含まれる蛋白質と競合または干渉することによって転写を抑制するだけのこれまでの手法よりも顕著な利点を有する（J.-S. Kim & C.O. Pabo, J. Biol. Chem. 272:29795-29800(1997); J.-S. Kim, J. Kim, K.L. Cepek, P.A. Sharp & C.O. Pabo, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616-3620(1997)）。ある距離を越えて作用する能力をもつエフェクタードメインの利用は、性状が不明の遺伝子およびプロモーターの調節のためにこれら遺伝子スイッチを利用することを可能にするであろう。これらの転写調節因子は我々の高効率のＰＣＲアッセンブリー手法を用いて調製できるので、それらの実用的有用性についてコメントすることは適切であると我々は考える。
【００６７】
このようにして作製された新規なＤＮＡ結合蛋白質は、ＤＮＡを主体とした診断で潜在的な有用性をもつであろう。遺伝子機能の研究の場合には、遺伝子転写の活性化および抑圧の両方におけるその能力によって（必要な場合にはレベルの等級を指定できる）、遺伝子機能の割り振りを補助することができる。これらの蛋白質はトランスで作用することによってその制御を発揮するので、機能的遺伝子ノックアウトまたは活性化をヘテロ接合体の遺伝子導入動物で発生させることができるかもしれない。これは、動物の完全体で遺伝子ノックアウトを発生させるために必要な時間を劇的に減少させ、さらにノックアウト技術を応用できる生物の範囲を拡大させるであろう。これらの蛋白質はまた、ウイルスの遺伝子生成物の産生を抑制し、または疾患との戦いに必要な遺伝子を活性化するために、遺伝子治療に用いることができるであろう。目ざましいことには、これらの蛋白質の調製の容易さは、上記の提案の研究者集団による試験を促進するであろう。
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を詳述するもので、その内容または請求の範囲をどのような態様においても限定するものではない。
【００６８】
実施例
実施例１：ファージディスプレーによる選別
ＰＣＲオーバーラップ伸長によるジンクフィンガーライブラリーの構築は本質的には以前に報告されたとおりであった（Y. Shi & J.M. Berg, Biochemistry 35:3845-8(1996)）。ファージの増殖および沈澱は以前に記載されたとおりであったが（G. Pengue & L. Lania, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1015-1020(1996)；Ｊ.R. Friedman, W.J. Fredericks, D.E. Jensen, D.W. Speicher, X.-P. Huang, E.G. Neilson & F.J. Rauscher, Genes & Dev. 10:2067-2078(1996))、ただしＥＲ２５３７細胞（New England Biolabs)を用いてファージを増殖させ、９０μＭのＺｎＣｌ₂ を増殖培地に添加した。沈澱させたファージを亜鉛緩衝液Ａ（ＺＢＡ；１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５／９０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、９０μＭのＺｎＣｌ₂ ）／１％ＢＳＡ／５ｍＭのＤＴＴ中に再懸濁させた。
結合反応物（５００μｌ：ＺＢＡ／５ｍＭのＤＴＴ／１％ブロット（BioRad）／競合オリゴヌクレオチド／４μｇのせん断ニシン精子ＤＮＡ（Sigma)／１００μｌのろ過ファージ（約１０¹³コロニー形成単位))を、７２ｎＭのビオチン付加ヘアピン標的オリゴヌクレオチドを添加する前に室温で３０分保温した。保温は定常的に穏やかに攪拌しながら３．５時間継続させた。ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（５０μｌ；Dynal)を２回５００μｌのＺＢＡ／１％ＢＳＡで洗浄し、続いて５００μｌのＺＢＡ／５％ブロット／抗体表示（無関係）ファージ（約１０¹²コロニー形成単位）で約４時間室温で封鎖した。結合時間の終わりに、封鎖溶液を結合反応物と置き換え、さらに室温で１時間保温した。５００μｌのＺＢＡ／５ｍＭのＤＴＴ／２％トゥイーン２０を用いて１時間かけて１０回、続いてトゥイーン２０を含まないもので１回前記ビーズを洗浄した。結合ファージを１０μｇ／μｌのトリプシンで３０分溶出させた。
【００６９】
ヘアピン標的オリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた：５'−ビオチン−ＧＧＡＣＧＣＮ'Ｎ'Ｎ'ＣＧＣＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＧＣＧＮＮＮＧＣＧＴＣＣ−３'（配列番号：１１４）、式中ＮＮＮは３ヌクレオチドフィンガー２−標的配列でＮ'Ｎ'Ｎ'はその相補物である。ビオチンが付加されていない同じオリゴヌクレオチド（この場合、その標的配列はＴＧＧ（ＴＧＧの相補物))は毎回の選別で７．２ｎＭ含まれ、夾雑する親ファージを選択除去した。以下の非ビオチン付加オリゴヌクレオチドの２つのプールもまた競合物質として用いた：１方は全ての可能な６４の３ヌクレオチド標的配列（ＮＮＮの相補物）を含み、他方は目下の選別標的（ＧＮＮの相補物）を除く全てのＧＮＮ標的配列を含む。これらのプールは典型的には以下のように用いた：１回目、ＮＮＮ相補物またはＧＮＮの相補物無し；２回目、７．２ｎＭのＧＮＮの相補物；３回目、１０．８ｎＭのＧＮＮ相補物；４回目、１．８μＭのＮＮＮ相補物、２５ｎＭのＧＮＮ相補物；５回目、２．７μＭのＮＮＮ相補物、９０ｎＭのＧＮＮ相補物；６回目、２．７μＭのＮＮＮ相補物、２５０ｎＭのＧＮＮ相補物；７回目、３．６μＭのＮＮＮ相補物、２５０ｎＭのＧＮＮ相補物。
【００７０】
実施例２：マルチ標的特異性アッセイ
ジンクフィンガーコード配列を含むｐＣｏｍｂ３Ｈ

ファージミドＲＦＤＮＡのフラグメントを改造ｐＭＡＬ−ｃ２（New England Biolabs)細菌発現ベクターでサブクローニングし、ＸＬ１−ブルー（Stratagene）を形質転換した。
過剰発現したマルトース結合蛋白質−ジンクフィンガー融合蛋白質を含む凍結／融解抽出物をＩＰＴＧ誘発培養から蛋白質融合精製系（New England Biolabs)を用いて調製した。
９６穴（ウェル）のＥＬＩＳＡプレートで０．２μｇのストレプトアビジン（Pierce）を各ウェルに３７℃で１時間適用し、続いて水で２回洗浄した。ビオチン付加標的オリゴヌクレオチド（０．０２５μｇ）を同様に適用した。ＺＢＡ／３％ＢＳＡを封鎖に用いたが、ウェルは保温のあと洗浄しなかった。その後の全ての保温は室温で実施した。２倍段階希釈した８つの抽出物を１×結合緩衝液（ＺＢＡ／１＆ＢＳＡ／５ＭｍのＤＴＴ／０．１２μｇ／μｌのせん断ニシン精子ＤＮＡ）中に適用した。サンプルを１時間保温し、続いて水で１０回洗浄した。ＺＢＡ／１％ＢＳＡ中のマウスの抗マルトース結合蛋白質ｍＡｂ（Sigma)をウェルに３０分適用し、続いて水で１０回洗浄した。アルカリホスファターゼと共役させたヤギ抗マウスＩｇＧｍＡｂ（Sigma)をウェルに３０分適用し、続いて水で１０回洗浄した。アルカリホスファターゼ基質（Sigma)を適用し、ＯＤ₄₀₅をＳＯＦＴｍａｘ２．３５（Molecular Devices）で定量した。
【００７１】
実施例３：ゲル移動度シフトアッセイ
蛋白質融合および精製系（New England Biolabs)を用い融合蛋白質を＞９０％の均質性に精製したが、ただしカラム緩衝液としてＺＢＡ／５ｍＭのＤＴＴを用いた。蛋白質の精製および濃度は、ＢＳＡ標準物との比較によりクマシーブルー染色１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した。標的オリゴヌクレオチドはその５'または３'末端を〔³²Ｐ〕で標識し、ゲルで精製した。１１の３倍段階希釈蛋白質を２０μｌの結合反応物（１×結合緩衝液／１０％グリセロール／約１ｐＭ標的オリゴヌクレオチド）中で３時間室温で保温し、続いて０．５×ＴＢＥ緩衝液中の５％ポリアクリルアミドゲルで解析した。乾燥ゲルの定量は、ホスファイメージャー（PhosphorImager）およびイメージクォント（ImageQuant）ソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いて実施し、ＫDはスキャッチャード分析によって決定した。
【００７２】
実施例４：所望のＤＮＡ結合特異性をもつポリダクチル蛋白質の作製
ここで報告する実験はフィンガー２（Ｆ２）変種ｐｍＧＡＣ、ｐｍＧＡＧ、ｐｍＧＣＡ、ｐＧＣＣ、ｐｍＧＧＡ、ｐｍＧＧＣ、ｐｍＧＧＧおよびｐＧＴＧ（付属のマニュスクリプトで規定）を用いる（L.G. Hudson, A.P. Ertl & G.N. Gill, J. Biol. Chem. 265:4389-4393(1990)）。３フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡを作製するために、Ｆ２コード領域は、選別Ｆ２変種またはデザインしたＦ２変種からＰＣＲ増幅させ、ＰＣＲオーバーラップ伸長によって組み立てた。また別には、Ｚｉｆ２６８またはＳｐ１Ｃフレームワークをもつ３フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡをそれぞれ８または６オーバーラップオリゴヌクレオチドから合成した。Ｓｐ１Ｃフレームワーク構築物（本明細書に記載した全てのレポーターアッセイで使用）は以下のようにして作製された。Ｅ２ＣＨＳ１（Ｓｐ１）の場合には、各々０．４ピコモルのオリゴヌクレオチドＳＰＥ２−３（５'−ＧＣＧＡＧＣＡＡＧＧＴＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＣＣＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧＣＡＴＴＴＡＴＡＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＣＣ−３'）（配列番号：１１５）およびＳＰＥ２−４（５'−ＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＧＣＡＣＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣ−３'）（配列番号：１１６）を、各々４０ピコモルのオリゴヌクレオチドＳＰＥ２−２（５'−ＧＧＴＡＡＧＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＴＡＣＣＣＡＣＡＣＧＧＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＡＴＡＡＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧ−３'）（配列番号：１１７）およびＳＰＥ２−５（５'−ＡＣＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＴＴＧＴＡＴＧＧＣ−３'）（配列番号：１１８）と標準ＰＣＲ混合物中で混合し、２５サイクルを実施した（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒）。続いてこの予備アッセンブリー反応の部分標本を各々４０ピコモルの以下のプライマーにより同じサイクル条件で増幅させた：ＳＰＥ２−１（５'−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＴＴＧＴＣＣＧＧＡＡＴＧＴＧＧＴＡＡＧＴＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＣ−３'）（配列番号：１１９）およびＳＰＥ２−６（５'−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＧＧＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＴＴＧＧＴＧＡＣＧＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＴＣＡＧＡＧＣＧ−３'）（配列番号：１２０）。Ｅ２Ｃ−ＨＳ２（Ｓｐ１）ＤＮＡは、同様なオリゴヌクレオチドセット（ただし認識ヘリックスコード領域は異なる）を用い同じ方法で作製した。組み立てた３フィンガーコード領域の全てを制限エンドヌクレアーゼＳｆｉ１で消化し、ｐＭａｌ−ＣＳＳ（細菌発現ベクターｐＭａｌ−Ｃ２の誘導物）（New England Biolabs)でクローニングした。各々異なるフレームワークをもつ６フィンガー蛋白質をコードするＤＮＡは、３フィンガーコード領域のフランキング配列に含まれるＸｍａ１およびＢｓｒＦ１を用いｐＭａｌ−ＣＳＳ中で組み立てた。ジンクフィンガー蛋白質の各々は大腸菌株ＸＬ１−ブルーで発現させ、結合特性は、付属マニュスクリプト（L.G. Hudson, A.P. Ertl & G.N. Gill, J. Biol. Chem. 265:4389-4393(1990)）に記載したようにＥＬＩＳＡおよびゲルシフトアッセイによって調べた。
【００７３】
実施例５：ジンクフィンガー−エフェクタードメイン融合蛋白質の構築
ジンクフィンガーエフェクタードメイン融合蛋白質の構築のために、ｅｒｓリプレッサー因子（ＥＲＦ）リプレッサードメイン（ＥＲＤ）（D.N. Sgouras, M.A. Athanasiou, G.J. Beal, Jr., R.J. Fisher, D.G. Blair & G.J. Mavrothalassitis, EMBO J. 14:4781-4793(1995)）のアミノ酸４７３から５３０をコードするＤＮＡ、ＫＯＸ１のＫＲＡＢドメイン（J.F. Margolin, J.R. Friedman, W.K.-H. Meyer, H. Vissing, H.-J. Thiesen & F.J. Rauscher III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 914509-4513(1994))のアミノ酸１から９７をコードするＤＮＡ、またはＭａｄｍＳＩＮ３相互反応ドメイン（ＳＩＤ）（D.E. Ayer, C.D. Laherty, Q.A. Lawrence, A.P. Armstrong & R.N. Eisenman, Mol. Cell. Biol. 16:5772-5781(1996))のアミノ酸１から３６をコードするＤＮＡをオーバーラップオリゴヌクレオチドからＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いて組み立てた。ＶＰ１６転写活性化ドメイン（I. Sadowski, J. Ma, S. Triezenberg & M. Ptashne, Nature 335:563-564(1988))のアミノ酸４１３から４８９のためのコード領域はｐｃＤＮＡ３／Ｃ７−Ｃ７−ＶＰ１６（１０）からＰＣＲ増幅させた。ＶＰ６４ＤＮＡ（ＶＰ１６の最小活性化ドメインの４量体リピートをコードし、アミノ酸４３７から４４７を含む）は２つの相補性オリゴヌクレオチド対から作製した。得られたフラグメントをジンクフィンガーコード領域と標準的クローニング手法によって融合させ、各々得られた構築物が内部ＳＶ４０核局在シグナルをＣ−末端ＨＡ１０ペプチドタグを含むようにした。
【００７４】
実施例６：ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築
ＡＴＧ開始コドンに対して、ヌクレオチド−７５８から−１を含むｅｒｂＢ−２プロモーターフラグメントを、タックエクスパンド（TaqExpand)ＤＮＡポリメラーゼミックス（Boehringer Mannheim)を用いてヒトの骨髄ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＧＬ３ベーシック（Promega)のホタルのルシフェラーゼ遺伝子の上流でクローニングした。ヒトのｅｒｂＢ−２プロモーターフラグメント（ヌクレオチド−１５７１から−２４を包含する）をｐＳＶＯＡＬΔ５'／ｅｒｂＢ−２（Ｎ−Ｎ）（L.G. Hudson, A.P. Ertl & G.N. Gill, J. Biol. Chem. 265:4389-4393(1990)）からＨｉｎｄ３消化によって切り出し、ｐＧＬ３ベーシック（Promega)のホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流でサブクローニングした。
【００７５】
実施例７：ルシフェラーゼアッセイ
全てのトランスフェクションのために、ＨｅＬａ細胞を４０−６０％の細胞集合度（コンフルエンシー）で用いた。典型的には、４００ｎｇのレポータープラスミド（ｐＧＬ３−プロモーター構築物またはネガティブコントロールとしてｐＧＬ３ベーシック）、５０ｎｇのエフェクタープラスミド（ｐｃＤＮＡ３、またはネガティブコントロールとしてエンプティーｐｃＤＮＡ３中のジンクフィンガー構築物）、および２００ｎｇの内部標準プラスミド（ｐｈｒＡｃｔ−βＧａｌ）を、リポフェクタミン試薬（Gibco BRL)を用い６ウェルディッシュの１ウェル中の細胞にトランスフェクトした。細胞抽出物はトランスフェクション後４８時間で調製した。ルシフェラーゼ活性はルシフェラーゼ試薬（Promega)で、βＧａｌ活性はガラクト−ライト（Galacto-Light, Tropix)でマイクロルーマット（MicroLumat）ＬＢ９６Ｐルミノメーター（EG&G Berthold)で測定した。ルシフェラーゼ活性はβＧａｌ活性を基準に標準化した。
【００７６】
実施例８：ＨｅＬａ細胞でのｅｒｂＢ−２遺伝子の調節
ｅｒｂＢ−２遺伝子は強制的調節のための標的とした。この遺伝子はしばしばヒトの癌（特に乳癌および卵巣癌）で過剰発現され、ＥｒｂＢ−２遺伝子の上昇は予後の悪さと相関している（N.E. Hynes & D.F. Stern, Biochim. Biophys. Acta 1198:165(1994)）。天然のｅｒｂＢ−２遺伝子を調節するために、合成リプレッサー蛋白質（Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢと称する）およびトランスアクチベーター蛋白質（Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４と称する）を利用した（R.P. Beerli, D.J. Segal, B. Creier, C.F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14628(1998)）。
両蛋白質は同じデザインのジンクフィンガー蛋白質Ｅ２Ｃを含み、これはプロトオンコジーンｅｒｂＢ−２の５'−非翻訳領域内の１８塩基対のＤＮＡ配列、５'−ＧＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＡＧＴＧ−３'（配列番号：１２１）を認識する。このＤＮＡ結合蛋白質は、６つの予め規定したモジュール形式ジンクフィンガードメインから構築された（D.J. Segal, R.P. Beerli, C.F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:14628(1999))。リプレッサー蛋白質はＫｏｘ−１ＫＲＡＢドメインを含み（J.F. Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4509(1994))、一方、トランスアクチベーターＶＰ６４は、単純疱疹ウイルス蛋白質ＶＰ１６に由来する最小活性化ドメインの４量体リピートを含む（K. Seipel, O. Georgiev, W. Schaffner, EMBO J. 11:4691(1992))。
【００７７】
ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａの派生株、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆを用いた（M. Gossen & H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547(1992)）。ＨｅＬａ細胞は上皮起源であるので、ＥｒｂＢ−２を発現し、ｅｒｂＢ−２遺伝子を標的とする実験に非常に適している。ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞は、テトラサイクリンを制御するトランスアクチベーターを産生し、増殖培養液からテトラサイクリンまたはその誘導体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を除去することによって、テトラサイクリンレスポンスエレメント（ＴＲＥ）の制御下で、問題の遺伝子の導入を可能にする。我々はこの系を用いて我々の転写因子を化学的制御の下で挿入した。したがって、ｐＲｅｖＴＲＥ／Ｅ２Ｃ−ＳＫＤおよびｐＲｅｖＴＲＥ／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４プラスミドを構築し（Ｅ２Ｃ（Ｓｐ１）−ＫＲＡＢおよびＥ２Ｃ（Ｓｐ１）−ＶＰ６４コード領域は、ｐｃＤＮＡ３系発現プラスミドからＰＣＲ増幅させ（R.R. Beerli, D.J. Segal, B. Creier, C.F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14628(1998)）、さらにＢａｍＨ１およびＣｌａ１制限部位を用いｐＲｅｖＴＲＥ（Clontech）でサブクローニングし、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限部位を用いてｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰでサブクローニングし（X. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10669(1997))、ＰＣＲ増幅の忠実性は配列決定によって確認した）、ＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞にトランスフェクトし、２０の安定クローンを各々単離し、Ｄｏｘ依存標的遺伝子調節について分析した（ｐＲｅｖＴＲＥ／Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびｐＲｅｖＴＲＥ／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４構築物はＨｅＬａ／ｔｅｔ−ｏｆｆ細胞株（M. Gossen & H. Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547(1992)）にリポフェクタミンプラス（Lipofectamine Plus）試薬（Gibco BRL)を用いてトランスフェクトし、２μｇ／ｍｌのＤｏｘの存在下でヒグロマイシン含有培養液中で２週間選別した後、安定なクローンを単離し、ＥｒｂＢ−２発現のＤｏｘ依存調節について分析した。ウェスタンブロット、免疫沈澱、ノザンブロット、およびフローサイトメーターによる分析を本質的に記載（D. Graus-Porta, R.R. Beerli. N.E. Hynes, Mol. Cell. Biol. 15:1182(1995))にしたがって実施した）。
【００７８】
ｅｒｂＢ−２プロモーター活性の読み出しとして、ＥｒｂＢ−２蛋白質レベルをウェスタンブロットによって先ず最初に分析した。これらクローンのかなりの割合で、Ｄｏｘを４日間除去したときＥｒｂＢ−２発現の調節、すなわちＥ２Ｃ−ＫＲＡＢクローンでＥｒｂＢ−２の下降調節、Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４で上昇調節が示された。ＥｒｂＢ−２蛋白質レベルはそれらの特異的ｍＲＮＡのレベルの変化に相関し、ＥｒｂＢ−２発現の調節は転写の抑圧または活性化の結果であることを示している。Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４クローンで発現される新たなＥｒｂＢ−２蛋白質は天然の発現蛋白質と識別不能で生物学的な活性を有していた。なぜならば上皮性増殖因子（ＥＧＦ）は容易にチロシン燐酸化を誘発した。Ｄｏｘの非存在下でのＥ２Ｃ−ＫＲＡＢクローン＃２７のＥｒｂＢ−２レベルは、そのＥＧＦ誘発チロシン燐酸化のように検出レベル以下であった。したがって、ＥｒｂＢ−２発現もまたフローサイトメトリーで分析したところ、Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢクローン＃２７で検出可能なＥｒｂＢ−２発現は示されず、Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４クローン＃１８におけるＥｒｂＢ−２の劇的な上昇調節（５．６倍）とは極めて対照的であった。したがって、ｅｒｂＢ−２遺伝子調節の程度は完全抑圧（Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢクローン＃２７）からほぼ６倍の活性化（Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４クローン＃１８）の範囲であった。ＥｒｂＢ−１蛋白質の発現に対する顕著な影響は認められず、このことはＥｒｂＢ−２発現の調節は一般的な転写の下降調節または上昇調節の結果ではないことを示している。６ジンクフィンガードメインを用い１８塩基対のＤＮＡ配列を標的とするこれらの転写因子とは対照的に、Ｅ２Ｃ標的配列の９塩基対ハーフサイトのどちらかに結合する３ジンクフィンガードメインで調製された転写活性化因子は、ｅｒｂＢ−２ルシフェラーゼレポーターの転写を活性化することができなかった。これらの結果は、６ジンクフィンガードメインの特異性および親和性の増加は遺伝子調節に対する優性的作用を提供することを要求する可能性を示唆している。
【００７９】
実施例９：Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびＥ２Ｃ−ＶＰ６４蛋白質のコード領域のレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＥＦへの導入
いくつかの他の細胞株でＥ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびＥ２Ｃ−ＶＰ６４蛋白質を発現させるために、それらのコード領域をレトロウイルスベクターｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰに導入した。Ｅ２Ｃ（Ｓｐ１）−ＫＲＡＢおよびＥ２Ｃ（Ｓｐ１）−ＶＰ６４コード領域をｐｃＤＮＡ３系発現プラスミドからＰＣＲ増幅させ（R.R. Beerli, D.J. Segal, B. Creier, C.F. Barbas, III, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14628(1998)）、ＢａｍＨ１およびＣｌａ１制限部位を用いｐＲｅｖＴＲＥ（Clontech）にサブクローニングし、ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１制限部位を用いてｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰでサブクローニングした（X. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10669(1997))。ＰＣＲ増幅の忠実性は配列決定によって確認した。このベクターはジンクフィンガー蛋白質の翻訳のためのただ１つの二シストロン性メッセージ、および内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）から緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を発現する。両コード領域は同じｍＲＮＡを共有するので、それらの発現は物理的に互いに連関しており、ＧＦＰ発現はジンクフィンガー発現のインジケーターである。これらのプラスミドから調製したウイルスを続いてヒトの癌細胞株Ａ４３１に感染させた（ｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＥＦ／Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびｐＭＸ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４プラスミドを一過性にアンホトロピックパッケージング細胞株Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏにリポフェクタミンプラス（Gibco BRL)を用いてトランスフェトし、２日後に培養上清を８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で標的細胞の感染に用いた。
感染後３日して、細胞を分析のために採集した）。感染後３日で、Ｅｒｂ−２発現をフローサイトメトリーで測定した。
【００８０】
意義深いことには、Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢウイルス処理細胞の約５９％が本質的にＥｒｂＢ−２陰性で、一方、約２７％のＥ２Ｃ−ＶＰ６４ウイルス処理細胞で、ＥｒｖＢ−２レベルが増加した。ＧＦＰ蛍光に対してＥｒｂＢ−２の蛍光を図表に表すと２つの細胞集団が存在することが明らかとなった：１つはＧＦＰが陰性で正常なＥｒｂＢ−２レベルをもち、もう一方はＧＦＰ陽性でＥｒｂＢ−２レベルが変化している。遺伝子への誘導の特異性は、関連ＥｒｂＢ−１およびＥｒｂＢ−３蛋白質の発現レベルを測定することによって調べた。これらの蛋白質レベルの顕著な変化は検出されず、ＥｒｂＢ−２遺伝子への誘導は特異的で、遺伝子発現の一般的変化の非特異的な結果またはエフェクタードメインの過剰発現ではないことを示唆している。ｅｒｂＢ−３の評価可能な調節が認められないということは特に注目に値する。なぜならば、その５'−ＵＴＲは１８塩基対配列、５'−ＧＧａＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧｇＡＧＴｃ−３'（配列番号：１２２）を含み、Ｅ２Ｃのデザインした標的配列とはわずか３つのミスマッチが存在するだけである（１５塩基対同一、小文字が相違を示す）（M.H. Kraus, W. Issing, T. Miki, N.C. Popescu, S.A. Aaronson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9193(1989)）。
【００８１】
実施例１０：非ヒト霊長類細胞におけるｅｒｂＢ−２遺伝子の調節
ｅｒｂＢ−２の５'−ＵＴＲ内のジンクフィンガー標的配列は、多くの種で保存されている２８塩基対配列ストレッチ内に存在する。非ヒト霊長類細胞のｅｒｂＢ−２遺伝子発現の調節を調べるために、ＣＯＳ−７線維芽細胞に二シストロン性Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢレトロウイルスを感染させ、フローサイトメトリーで分析した。ヒト細胞の場合のように、ＧＦＰマーカーによって示されるリプレッサー蛋白質の発現は、ＥｒｂＢ−２蛋白質の低下とよく相関した。同様に、ネズミ細胞における遺伝子への誘導は、Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢおよびＥ２Ｃ−ＶＰ６４をコードするレトロウイルスでＮＩＨ／３Ｔ３細胞を感染させることによって調べた。
続いてＥｒｂＢ−２発現レベルをフローサイトメトリーではなくウェスタンブロッティングによってモニターした（ｍＡｂのネズミＥｒｂＢ−２細胞外ドメインとの反応性の欠如のために）。ここでもまた、感染細胞で修正したとき、Ｅ２Ｃ−ＫＲＡＢでは完璧な転写ノックアウトが観察された。しかしながら、ヒトの細胞株とは異なり、Ｅ２Ｃ−ＶＰ６４誘発ＥｒｂＢ−２上昇調節はＮＩＨ／３Ｔ３細胞ではより穏やかで、感染効率について修正したとき約１．８倍であった。この矛盾についての蓋然性の高い説明はヒトとマウスプロモーターの構造の相違である。ヒトと異なり、マウスｅｒｂＢ−２プロモーターはＴＡＴＡボックスを含まない（M.R. White & M.C. Hung, Oncogene 7:677(1992)）。ＶＰ１６による転写活性化は、少なくとも部分的にはＴＦＩＩＤ（マルチ蛋白質複合体で、またＴＡＴＡ結合蛋白質を含む）との相互作用によって仲介される（C.J. Ingles, M. Shales, W.D. Cress, S.J. Triezenberg, J. Greenblatt, Nature 351:588(1991))。したがって、おそらくＥ２Ｃ−ＶＰ６４蛋白質は、ＴＡＴＡボックスの非存在下ではより低い有効性で転写が活性化されるのであろう。これらのデータは、ＤＮＡ結合部位は、配列および標的細胞内の相対的ポジションについて保存されるであろうが、一方、エフェクタードメインはコンテクスト効果のために最大の効率について最適化される必要があるかもしれない。それでもやはり、それらの能力が異なるにもかかわらず、本明細書で述べた人工的転写因子は、異なる種に由来する細胞でｅｒｂＢ−２遺伝子転写の調節を強制することができ、多様な生物での遺伝子機能の研究のための手法を提供する。
【００８２】
実施例１１：ＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞におけるＧ１蓄積の特異的誘発
ＥｒｂＢ−２の過剰発現は、その固有のチロシンキナーゼ活性の構成的活性化をもたらし（P.P. Di Fiore et al., Science 237:178(1987))、レセプターを過剰発現している腫瘍細胞でのＥｒｂＢ−２の下降調節は増殖抑制をもたらす（R.M. Hudziak et al., Mol. Cell. Biol. 9:1165(1989); J. Deshane et al., Gene Ther. 1:332(1994); J.M. Daly et al., Cancer Res. 57:3804(1997)）。増殖抑制メカニズムは、細胞サイクルのＧ１からＳ期への進行が妨げられるということのようである（R.M. Neve, H. Sutterluty, N. Pullen, H.A. Lane, J.M. Daly, W. Krek, N. E. Hynes, Submitted for publication）。したがって、我々は、我々のデザインした転写リプレッサーのｅｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞での過剰発現はＧ１ブロックをもたらすか否かを調べた。したがって、ＳＫＢＲ３乳癌細胞をＥ２Ｃ−ＫＲＡＢレトロウイルスで感染させ、フローサイトメトリーでＥｒｂＢ−２発現レベルに対する細胞サイクルの分布を分析した（２２）。２つの細胞集団を観察した：約４０％の細胞は感染しないで正常なＥｒｂＢ−２レベルを有し、一方、感染細胞（約６０％）は、３日後に約７倍低いレセプターレベルを示した。正常なレセプターレベルを有する細胞と比較して、ＥｒｂＢ−２発現レベルの低下した大部分の細胞は細胞サイクルのＧ１期であった。ＳＫＢＲ３細胞で観察されたＧ１蓄積はＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞について特異的であることを確認するために、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞株を用いて実施した（この細胞はＥｒｂＢ−２レベルの上昇を示さない（図４Ｂ))。実際、Ｔ４７Ｄ細胞にＥ２Ｃ−ＫＲＡＢレトロウイルスを感染させ、フローサイトメトリー分析に付したとき、ＥｒｂＢ−２レベルが正常および低下している細胞集団はそれぞれ区別できないＤＮＡ含有量を示すことが判明した。したがって、我々がデザインしたリプレッサー蛋白質は、ＥｒｂＢ−２過剰発現腫瘍細胞のＧ１蓄積を特異的に誘発することができる。細胞サイクルの進行を抑制する能力（したがってＥｒｂ−２過剰発現腫瘍細胞の増殖を抑制する能力）は、癌の遺伝子治療のためにデザインされた転写因子の能力を示唆している。
【００８３】
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The Scripps Research Institute

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1 5



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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 66
Asp Arg Ser Lys Leu Ala Arg
1 5



<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 67
Asp Pro Gly Lys Leu Ala Arg
1 5



<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 68
Arg Ser Asp Lys Leu Thr Arg
1 5



<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 69
Arg Ser Asp His Leu Thr Arg
1 5



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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 70
Lys Ser Ala Lys Leu Glu Arg
1 5



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<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

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Thr Ala Asp His Leu Ser Arg
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<213> Artificial Sequence

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binding polypeptides

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Thr Ala Asp Lys Leu Ser Arg
1 5



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<213> Artificial Sequence

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binding polypeptides

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Thr Pro Gly His Leu Val Arg
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<213> Artificial Sequence

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Thr Ser Ser His Leu Val Arg
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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

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Thr Ser Gly Lys Leu Val Arg
1 5



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<213> Artificial Sequence

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<400> 76
Gln Pro Gly Glu Leu Val Arg
1 5



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Gln Ser Gly Glu Leu Val Arg
1 5



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Gln Ser Gly Glu Leu Arg Arg
1 5



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Asp Pro Gly Ser Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 80
Arg Lys Asp Ser Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 81
Arg Ser Asp Val Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 82
Arg His Asp Ser Leu Leu Arg
1 5



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<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 83
Arg Ser Asp Ala Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 84
Arg Ser Ser Ser Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 85
Arg Ser Ser Ser His Val Arg
1 5



<210> 86
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 86
Arg Ser Asp Glu Leu Val Lys
1 5



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<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 87
Arg Ser Asp Ala Leu Val Lys
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 88
Arg Ser Asp Val Leu Val Lys
1 5



<210> 89
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 89
Arg Ser Ser Ala Leu Val Arg
1 5



<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 90
Arg Lys Asp Ser Leu Val Lys
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 91
Arg Ser Ala Ser Leu Val Arg
1 5



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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 92
Arg Ser Asp Ser Leu Val Arg
1 5



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 93
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1 5



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<212> PRT
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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 94
Arg Pro Gly Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 95
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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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Arg Pro Gly Ala Leu Val Arg
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<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 97
Lys Ser Ala Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 98
Lys Ser Ala Ala Leu Val Arg
1 5



<210> 99
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 99
Lys Ser Ala Val Leu Val Arg
1 5



<210> 100
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 100
Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg
1 5



<210> 101
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 101
Thr Ser Gln Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 102
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 102
Thr Ser Ser Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
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<400> 103
Thr Pro Gly Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 104
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 104
Thr Ser Gly Ala Leu Val Arg
1 5



<210> 105
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 105
Thr Pro Gly Ala Leu Val Arg
1 5



<210> 106
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 106
Thr Gly Gly Ser Leu Val Arg
1 5



<210> 107
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 107
Thr Ser Gly Glu Leu Val Arg
1 5



<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 108
Thr Ser Gly Glu Leu Thr Arg
1 5



<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 109
Thr Ser Ser Ala Leu Val Lys
1 5



<210> 110
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:nucleotide
binding polypeptides

<400> 110
Thr Ser Ser Ala Leu Val Arg
1 5



<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:peptide linker

<400> 111
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5



<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:e2c target
sequence

<400> 112
ggggccggag ccgcagtg 18


<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:VP16's minimal
activation domain

<400> 113
Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu
1 5 10



<210> 114
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Hairpin target
oligonucleotide

<400> 114
ggacgcnnnc gcgggttttc ccgcgnnngc gtcc 34


<210> 115
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-3

<400> 115
gcgagcaagg tcgcggcagt cactaaaaga tttgccgcac tctgggcatt tatacggttt 60
ttcacc 66


<210> 116
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-4

<400> 116
gtgactgccg cgaccttgct cgccatcaac gcactcatac tggcgagaag ccatacaaat 60
gtccagaatg tggc 74


<210> 117
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-2

<400> 117
ggtaagtcct tctctcagag ctctcacctg gtgcgccacc agcgtaccca cacgggtgaa 60
aaaccgtata aatgcccaga g 81


<210> 118
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-5

<400> 118
acgcaccagc ttgtcagagc ggctgaaaga cttgccacat tctggacatt tgtatggc 58


<210> 119
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-1

<400> 119
gaggaggagg aggtggccca ggcggccctc gagcccgggg agaagcccta tgcttgtccg 60
gaatgtggta agtccttctc tcagagc 87


<210> 120
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide SPE2-6

<400> 120
gaggaggagg agctggccgg cctggccact agttttttta ccggtgtgag tacgttggtg 60
acgcaccagc ttgtcagagc g 81


<210> 121
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:part of erbB-2
5'UTR

<400> 121
ggggccggag ccgcagtg 18


<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence

<220>
<223> Description of Artificial Sequence:part of erbB-3
5'UTR

<400> 122
ggagccggag ccggagtc 18
【図１−１】

【図１−２】

【図１−３】

【図１−４】

【図１−５】

【図１−６】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の配列：
i) RS/L/K/HS/DD/N/S/T/E/A/V/K/H(X₁X₂X₃)（(X₁X₂X₃)はLGR、LLR、LVK、LRR又はLSRである）、
ii) RSDX₅LTR（X₅はK又はHである）、又は
iii) RS/KDX₄LVR（X₄はN/S/T/E/A/V/K/H/Dである）
を有するヌクレオチド結合領域を含む、非天然ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドであって、
該ヌクレオチド結合領域が、5'-GNG-3'（NはA、T、C又はGである）の形態のヌクレオチド配列に特異的に結合する、非天然ジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項２】
前記配列が、(1) RSDTLVR (配列番号: 40); (2) RSDDLVR (配列番号: 42); (3) RKDSLVR (配列番号: 80); (4) RSDVLVR (配列番号: 81); (5) RSDALVR (配列番号: 83); (6) RSDNLVR (配列番号: 3); (7) RSDDLVK (配列番号: 7); (8) RSDSLVR (配列番号:92) (9) RSDNLRR (配列番号: 21); (10) RSDNLVK (配列番号: 23); (11) RSDTLVK (配列番号: 43); (12) RSDELVK (配列番号: 86); (13) RSDALVK (配列番号: 87); (14) RSDVLVK (配列番号: 88); (15) RKDSLVK (配列番号: 90); (16) RSDKLTR (配列番号: 68); (17) RSDHLTR (配列番号: 69); (18) RSDKLVR (配列番号: 11); (19) RLDTLGR (配列番号: 38); (20) RHDSLLR (配列番号: 82) 及び (21) RSDELVR (配列番号: 15)からなる群より選ばれる、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項３】
前記配列が最初の３つの部位にRSDを含む、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項４】
前記配列が最後の３つの部位にLVRを含む、請求項１に記載のジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド。
【請求項５】
さらに１つまたは２つ以上の転写調節因子と機能的に連結された請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１のポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項１のポリペプチドを２つから１２含む組成物であって、該ポリペプチドは同一又は異なっている、組成物。
【請求項９】
２つから６つの請求項１に記載のポリペプチドを含む請求項８の組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが機能的に連結された請求項８または９の組成物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが配列番号１１１の配列をもつリンカーによって連結された請求項８から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記ポリペプチドの各々が異なるヌクレオチド配列と結合する請求項８から１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、さらに１つまたは２つ以上の転写調節因子と機能的に連結された、請求項８から１２のいずれかに記載の組成物。

【公開番号】特開２０１０−１４３９３６（Ｐ２０１０−１４３９３６Ａ）
【公開日】平成２２年７月１日（２０１０．７．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５９２５（Ｐ２０１０−１５９２５）
【出願日】平成２２年１月２７日（２０１０．１．２７）
【分割の表示】特願２０００−５７７１９０（Ｐ２０００−５７７１９０）の分割
【原出願日】平成１１年１０月１４日（１９９９．１０．１４）
【出願人】（５９３０５２７８５）ザ　スクリップス　リサーチ　インスティテュート (91)
【Ｆターム（参考）】