ＨＧＦの中和可能エピトープ及びこれに結合する中和抗体
本発明の目的は、ＨＧＦとその受容体幹の結合を抑制するＨＧＦの新規中和可能エピトープ及び前記エピトープに結合して単一の薬剤としてＨＧＦを中和させることができる中和抗体を提供すること。本発明のＨＧＦの中和可能エピトープに結合するＨＧＦに対する中和抗体は単剤としてＨＧＦを中和させることができるので、ＨＧＦとその受容体であるＭｅｔの結合によって引き起こされる難治病疾患及び癌を予防、治療するのに効果的に用いられることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＧＦがその受容体に結合することを抑制するＨＧＦ（hepatocyte growth factor）の中和可能エピトープ、及び前記ＨＧＦの中和可能エピトープに結合し単一の薬剤としてＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor）は間葉細胞（mesenchymal cell）により生産される多機能性ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）ポリペプチドである。ＨＧＦは、Ｎ末端ドメインとセリンプロテアーゼ類似ベータ−鎖Ｃ末端ドメインに共有結合で連結された４個のクリングルドメイン（ＮＫ４）を含むアルファ−鎖からなっている（図１参照）。ヒトＨＧＦは、成熟タンパク質には存在しない２９個のアミノ酸シグナルペプチドを有する７２８個のアミノ酸で構成された生物学的に不活性の単鎖前駆体として合成される。生物活性ＨＧＦは、特異的な細胞外の血清セリンプロテアーゼによるＲ４９４残基での切断を通じて得られる。この活性ＨＧＦは、ジサルファイド結合で連結された６９ｋＤａのアルファ−チェーンと３４ｋＤａのベータ−チェーンで構成された完全活性ヘテロ二量体である。しかし、ＨＧＦの全体３次元構造は未だに明かされておらず、これらのドメインのいずれがＨＧＦの特徴的な機能を担当するかについても明確に知られていない（Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 13(1): 41-59, 2002）。
その受容体であるＭｅｔに対するＨＧＦの結合は、多様な細胞類型の成長及び分散を誘導し、上皮間葉転移及び細管（ｔｕｂｕｌｅ）と内腔（ｌｕｍｅｎ）の形成を媒介し、また、血管形成を促進する。ＭｅｔとＨＧＦが共にノックアウット（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたマウスは胚芽段階で死亡率が高く、胎盤、胎児の肝及び手足／筋肉形成において分化欠陥を示す（Cao et al., PNAS 98(13): 7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American Journal of Pathology 159(2): 579-90, 2001）。
【０００３】
元々Ｍｅｔは、トランスフォーミング活性を有する構成的に活性（constitutively active）な変形されたタンパク質キナーゼをコードする、ヒト癌遺伝子ｔｒｐ−ｍｅｔの産物として最初に分離された。また、Ｍｅｔ活性化は、血管形成、細胞運動性及び細胞表面プロテアーゼの調節のような過程に刺激的な影響を及ぼすことから始めて癌の転移を著しく増加させると知られている（Wielenga et al., American Journal of Pathology 157(5):1563-73, 2000）。Ｍｅｔは、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚を含む多様なヒト癌で過発現すると報告されているため（Maulik et al, supra）、癌の予防及び治療のための重要な標的因子と見なされている。また、マラリヤ感染が分泌したＨＧＦによるＨＧＦ受容体の活性化に依存的だと報告されたことがあり、従って、ＨＧＦ及びその受容体はマラリヤ予防に対する新たな治療法の潜在的な標的として知られている（Carroloo M, et al., Nat. Med. 9(11): 1363-1369, 2003）。また、ＨＧＦがアルツハイマー病から引き起こされる病理学的変化に関与し得る可能性が報告されている（Fenton H, et al., Brain Res.779(1-2):262-270, 1998）。さらに、ＨＧＦが再上皮細胞化、新生血管形成及び果粒化組織形成を含む皮膚傷の治癒過程の向上に明らかに関与することが発見されている（Yoshida S.et al., J.Invest.Dermatol.120(2):335-343, 2003）。
【０００４】
一方、癌の発病及び転移に重要な役目をする腫瘍−関連成長因子またはサイトカインとその受容体の選択的中和は抗癌剤開発のための魅力的な戦略として認識されてきた。最近、これらを標的にするハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のような多数の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び抗アンジオポエチン（anti-angiopoietin）ヒトｍＡｂｓが組合せ抗体ライブラリ（combinatorial antibody library）のファージ(ｐｈａｇｅ)ディスプレイのような組換え抗体技術を利用して開発されている。
【０００５】
ＨＧＦに対する多クローン抗体が多くのＨＧＦの生物学的機能を抑制するということがよく知られている。また、最近はＨＧＦに対する中和ｍＡｂｓの混合物が動物モデルで抗−腫瘍活性を示すと報告されたことがある（Cao et al., PNAS 98(13):7443-7448, 2001）。具体的に、カオらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＨＧＦ活性を抑制するために３個以上のエピトープ、例えばＭｅｔ受容体に対して２個、ヘパリンに対して１個のエピトープが必要であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で少なくとも３個のｍＡｂｓの混合物がＨＧＦを中和させることができることを開示している。
しかし、今まで単剤としてＨＧＦを中和してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞分散活性（cell scattering activity）を制御できるモノクローナル抗体は報告されたことがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、その受容体に対するＨＧＦの結合を抑制するＨＧＦの中和可能エピトープを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は次のものを提供することである。
前記中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチド；
前記中和可能エピトープに結合し、単剤としてＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体；
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体の用途；
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬学組成物；及び
患者に前記中和抗体を投与することを含む、難治病及び癌を予防・治療する方法。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を果たすために、本発明は、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を有するＨＧＦの中和可能エピトープを提供する。
【０００９】
また、本発明は、配列番号２７または２９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と配列番号２８または３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む前記中和可能エピトープに結合するＨＧＦに対する中和抗体を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるＨＧＦの中和可能エピトープに結合する中和抗体は単一の薬剤としてＨＧＦを中和することができるので、効果的にＨＧＦとその受容体であるＭｅｔとの結合により引き起こされる様々な疾患、特に、癌の予防及び治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書で用いる用語「中和可能エピトープ」は、ＨＧＦがその受容体であるｃ−Ｍｅｔに結合することを抑制することができる任意のタンパク質決定部を含む。エピトープ決定部は、一般的にアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性化されたものが群を構成し、通常的に特異的な電荷特徴だけではなく、特異的な３次元構造的な特性を有する。好ましくは、本発明の中和可能エピトープは：３２または３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１２】
用語「中和抗体」は、ＨＧＦの中和可能エピトープに特異的に結合し、ＨＧＦの生活性を抑制・除去できる抗体を意味する。概して中和抗体はこのようなＨＧＦの生活性を少なくとも５０％、好ましくは８０％以上抑制する。本発明の中和抗体は難治病および癌を予防・治療するための治療学的適用に特に有用である。
【００１３】
本発明は、ＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することができる：３２または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明によるＨＧＦの中和可能エピトープを製造する目的の下で、ＨＧＦで免疫化された動物の抗血清が組換えヒトＨＧＦに結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡ分析を行い、該抗血清がＨＧＦに特異的に結合することを確認してから、ＨＧＦで免疫化された動物から総ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成する。
【００１５】
ラビット軽鎖（ＶＬ）（Ｖκ、Ｖλ）及び重鎖（ＶＨ）を含む抗体可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とヒトＣκ及びＣＨ１を含む抗体不変領域（Constant region）を増幅するために、前記合成されたｃＤＮＡを鋳型として：１〜２０のプライマーを組合せてＰＣＲ反応を行い、これから得たＰＣＲ産物を鋳型としてラビット／ヒトキメラ抗体の軽鎖及び重鎖を増幅する。増幅されたラビットＶＬ及び ＶＨ配列を、増幅されたヒトＣκ及びＣＨ１配列と連結した後、抗体切片（Ｆａｂ）をコードする最終ＰＣＲ産物を発現ベクターにクローニングした後、前記ベクターを宿主細胞、例えば大腸菌に形質変換させてキメララビット／ヒトＦａｂライブラリを製造する。本発明で使用可能な前記ベクターと宿主細胞は当業界で通常的に用いられるものであれば制限なく用いることができるが、発現ベクターとしてファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（Scripps Research Institute, CA, USA）を、宿主細胞としてＥ．Ｃｏｌｉ ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を用いることが好ましい。
【００１６】
ＨＧＦにコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体を用いたＥＩＡを用いて抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別する。 前記選別されたファージクローンを各々Ｈ６１（クローン６１）及びＨ６８（クローン６８）と命名した。
【００１７】
Ｈ６１及びＨ６８クローンに対して塩基配列分析を行い、分析された塩基配列からこれらのアミノ酸配列を決定した。本発明の好ましい実施の形態においては、塩基配列分析を染料−標示プライマーシーケンス方法（dye labeled primer sequencing method）（Chung et al., J Cancer Res Clin Oncol 128:641-649, 2002）を用いて行った。その結果、Ｈ６１クローンはそれぞれ配列番号２３及び２４の塩基配列を有するＶＨ及びＶＬ領域で構成され、Ｈ６８クローンはそれぞれ配列番号２５及び２６の塩基配列を有するＶＨ及びＶＬ領域で構成されることを確認した。
【００１８】
分析された塩基配列からＨ６１及びＨ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域それぞれに対するアミノ酸配列を類推した結果、Ｈ６１クローンは：２７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ領域で構成され、Ｈ６８クローンは配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と：３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域で構成されることを確認した。
【００１９】
Ｈ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列中の骨格構造領域（framework region;FR）と抗原結合部（complementarity determining region;CDR）とを分析した結果、Ｈ６１及びＨ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ４個のＦＲと３個のＣＤＲを有することが明らかになった（表２参照）。
【００２０】
ＨＧＦの中和可能エピトープを同定するために、Ｈ６１及びＨ６８クローンを複合ペプチドライブラリのファージディスプレイを用いたパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を通じて増殖させた後、前記ファージ群を抗ＨＧＦ Ｈ６１あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂと抗ＨＧＦ Ｈ６１ Ｆａｂ−あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＩＡで分析した。これから抗ＨＧＦ Ｈ６１あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂに結合するファージクローンを選別した。本発明の好ましい実施の形態においては、前記ペプチドライブラリとしてＰＨＤペプチドライブラリ（ＰＨＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙＴＭ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｂ）を用いる。
【００２１】
選別したファージクローンに対して塩基配列分析を行い、分析された塩基配列から類推したアミノ酸配列は配列番号３２及び３３のアミノ酸配列を有し、これらはｃ−ＭＥＴに結合することが確認できる（図６参照）。このような結果は、抗ＨＧＦ抗体Ｈ６１またはＨ６８の抗原結合部はｃ−ＭＥＴのＨＧＦ結合部を模倣（ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）し、抗ＨＧＦ Ｈ６１またはＨ６８に結合する：３２及び３３のペプチドは ＨＧＦのｃ−ＭＥＴ結合部を模倣するということを示す。従って、本発明の配列番号３２及び３３のペプチドはＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することが判明した。
【００２２】
また、本発明は、前記中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的に、前記中和可能エピトープは、配列番号３４または３５の塩基配列を有する。
【００２３】
さらに、本発明は、ＨＧＦの中和可能エピトープとして配列番号３２または３３のペプチドに結合してＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体を提供する。
本発明の中和抗体はキメラ抗体、モノクロナール抗体またはヒト化抗体である。
【００２４】
キメラ抗体は、ヒト及び非ヒト由来部を含む免疫グロブリン分子である。具体的に、キメラ抗体の抗原結合領域（antigen combining region）（可変領域）は非ヒト起源（例えば、マウス、ラビット、家禽類）から由来し、免疫グロブリンに生物学的効果基機能を付与するキメラ抗体の不変領域はヒト起源から由来する。前記キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって付与された効果基機能を有する。
一般的に、キメラ抗体の生産に用いられる過程は次の段階を含む。
（ａ）抗体分子の抗原結合部をコードする正確な遺伝子切片を定めてクローニングする段階であって、前記遺伝子切片（ＶＤＪとして知られている重鎖についての可変的、多様性及び連結領域、ＶＪとして知られている軽鎖についての可変的、連結領域、または単にＶとして知られている可変領域）はｃＤＮＡまたはゲノムの形態であり得、
（ｂ）不変領域またはその目的する部位をコードする遺伝子切片をクローニングする段階、
（ｃ）前記可変領域を前記不変領域と連結し、これが転写・翻訳できる形態に構造して完全なキメラ抗体としてコードされる段階；
（ｄ）前記構造物を選別可能マーカー及びプローモーター、エンハンサー及びポリ（Ａ）付加信号を含むベクター内に導入する段階、
（ｅ）前記ベクターを増幅して真核細胞（通常は哺乳動物リンパ球内）に導入（形質感染）させる段階、
（ｆ）前記選別可能マーカーを発現する細胞を選別する段階、
（ｇ）目的するキメラ抗体を発現する細胞をスクリーニングする段階、及び
（ｈ）前記抗体をその適切な抗原特異性及びエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ）に対して前記抗体を調査する段階。
モノクローナル抗体は、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導された抗体を称する。前記モノクローナル抗体は、二つのタンパク質、すなわち重鎖及び軽鎖を含む。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術を含む当分野に公知の多様な技術中の一つまたはこれらの組合せを用いて製造できる。
【００２５】
ヒト化抗体は、そのＣＤＲｓ（相補性決定領域）が非ヒト免疫グロブリンから由来し、前記抗体分子の他の部分が主にヒト免疫グロブリンから由来する分子を意味する。本明細書で用いる、前記用語「抗体」は、抗体及び抗体に由来する分子の両方を幅広く意味する。このような抗体由来分子は、少なくとも一つの可変領域（可変領域の重鎖または軽鎖）を含み、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’ 断片、Ｆ（ａｂ’）．Sｕｂ．２断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ’ 断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂｃ断片、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、個別的抗体軽鎖、個別的抗体重鎖、前記抗体鎖間のキメラ融合および他の分子のような分子構造を含む。
【００２６】
特に、本発明は、ＨＧＦに対する中和抗体としてラビット／ヒトキメラ抗体を提供する。本発明の中和抗体は、配列番号２７のＶＨ領域と配列番号２８のＶＬ領域とを含むか、または：２９のＶＨ領域と：３０のＶＬ領域とを含む。
【００２７】
ある中和抗体が中和活性を示すか否かは、ＭＤＣＫ２分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析によって確認することができる（Cao et al., PNAS 98(13):7443-7448, 2001）。ＭＤＣＫ２細胞に２ｎｇ／ｍｌ（２９ｐＭ）のＨＧＦを処理した場合に、本発明の中和抗体はＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂのモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）が５０：１であり、ＨＧＦに対する抗ヒトＦａｂ抗体のモル比が５０：１〜１００：１である時、最高の分散抑制活性を示す（図９参照）。このような結果は、ＨＧＦを中和してＭＤＣＫ２細胞の分散を抑制するために、少なくとも３個のエプトープを中和する必要があるというカオら（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、上記）の報告とは異なり、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏで１個のエピトープのみでＨＧＦを中和可能であることを最初に示すものである。また、本発明では、中和可能エピトープに結合する抗体が二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）以上である場合のみに中和抗体が中和活性を発揮するということが証明されたが、このような結果は、同じエピトープがＨＧＦの二つ以上の部分に存在できることを示す。
【００２８】
本発明の他の実施の形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ分析方法を用いてＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの結合親和力、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合のためのクローン６８の抑制活性及びｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合のための水溶性ｃ−Ｍｅｔの抑制活性をＥＩＡによって調べることができる。クローン６８抗体の注入量の増加に応じてセンサーチップ上に固定されたＨＧＦに結合するクローン６８抗体の量は増加し（図１０参照）、クローン６８抗体の濃度の増加に応じてｃ−ＭＥＴに結合するＨＧＦの量は減少する（図１１参照）。また、センサーチップ上に固定されたｃ−Ｍｅｔに結合するＨＧＦの量は、水溶性ｃ−Ｍｅｔの濃度の増加に応じて減少する（図１２参照）。
【００２９】
前記結果は、本発明による中和抗体がＨＧＦを中和させることができる単一の薬剤として作用することを立証する。
【００３０】
従って、本発明は、ＨＧＦがその受容体に結合して引き起こされる難治病及び癌を予防・治療するための本発明の中和抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、本発明の中和抗体を用い難治病及び癌を予防・治療する方法を提供する。前記癌の好ましい例としては、これに限定されるものではないが、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚を含む多様なヒト癌を含み、難治病は、ＨＧＦがその受容体ｃ−Ｍｅｔに結合して引き起こされる疾患であるが、これに限定されるものではなく、マラリヤ、アルツハイマー病及びその他を含む。
【００３１】
本発明の薬学的組成物は、通常的な方法のいずれか一つにより製剤化できる。剤形の製造において、有効成分は担体と混合または希釈されることが望ましい。適当な担体、賦形剤または希釈剤の例としては、ラクトース、デックストロス、スクロス、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスファート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油を含む。前記剤形は、追加的に充填剤、抗凝固制、光沢剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、防腐剤及びその他等々を含み得る。本発明の組成物は、患者に投与された後に活性成分の迅速で持続的な、又は遅延された放出を提供するために当分野に公知の方法のいずれか一つを用いて剤形化されることができる。
【００３２】
本発明の薬学剤形は、注射（例えば、筋肉内、静脈内、腹膜内、皮下）または有効形態で血流内への伝達を保障する他の方法により投与できる。また、前記薬学剤形は、全身的だけでなく局所的な治療効果を発揮するために腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周経路に投与され得るが、この場合、局所的または静脈内の注射が望ましい。
ヒト患者を治療するために、有効成分として本発明の中和抗体の通常的な投与量は、０．１〜１００ｍｇ／kg体重であり、好ましくは１〜１０ｍｇ／kg体重の範囲であり、１日１回または数回に分けて投与することができる。しかし、活性成分の実際投与量は、治療条件、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び癌の種類及び症状の重症度などの多様な関連因子に照らして決定するべきであるので、前記投与量はどの方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示することだけであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
ＨＧＦ免疫化及び抗体ライブラリ製造
４〜５ヶ月にわたって、ニュージーランドホワイト種のラビット２匹にＭＰＬ（Monophosphoryl Lipid A, highly-refined non-toxic Lipid A isolated from remutants of S.minnesota）＋ＴＤＭ（synthetic Trehalose Dicorynomycolate, an analogue of trehalose dimycolate from the cord factor of the tubercle bacillus）＋ＣＷＳ（Cell Wall Skeleton, from deproteinized and delipidated cell walls of mycobacteria）補助剤（Ｓｉｇｍａ社）のエマルジョンに分散させたＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を３週の間隔で５回皮下注射して免疫させた。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ラビットＦｃゴート多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いたＥＬＩＳＡを通じて前記免疫ラビットの抗血清と組換えヒトＨＧＦ（R&D systems or Research Diagnostics, Inc.）との結合有無を分析した。その結果、 ＨＧＦ免疫前に得た血清はＨＧＦにほとんど結合しない一方、５回皮下注射後に得た血清はＨＧＦに特異的に結合することが判明した。
【００３５】
最後の注射から７日後に、免疫動物から脾臓及び骨髄を採取し、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ社）及び塩化リチウム沈殿を用いて総ＲＮＡを分離した。オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、スーパースクリプト前増幅システム（SUPERSCRIPT Preamlification System; Life Technologies社）を用いて第１ストランドｃＤＮＡを合成した。上記において、ラビット／ヒト異種抗体ライブラリは、レーダーなど（Rader C.et al., J.Biol.Chem.275:13668-13676, 2000）の方法により製作した。
【００３６】
実施例２
ラビット−由来Ａｂ可変領域及びヒト−由来Ａｂ不変領域の増幅
（２−１）
ラビット−由来Ａｂ可変領域の増幅
ラビットＶＬ（Ｖκ、Ｖλ）及びＶＨの可変領域を増幅するために、下記表１のプライマー組合せを用いてＰＣＲ反応を行った。
【表１】
【００３７】
ＰＣＲ反応溶液を実施例１で合成した１μｌの鋳型ｃＤＮＡ（約０．５μｇ）、６０ｐｍｏｌのプライマー、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。このように増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｅｘ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００３８】
（２−２）
ヒト−由来Ａｂ不変領域の増幅
ヒト−由来Ａｂ不変領域のＣκ領域を、ＰＣＲを利用して次のように増幅した。ＰＣＲ反応溶液を２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 15:88(18), 7978-82, 1991）、配列番号１４及び１５のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。
【００３９】
一方、ヒト−由来Ａｂ ＣＨ１領域を増幅するために次のようにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液を２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ（Barbas et al., 上記）、配列番号１６及び１７のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。このように増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４０】
実施例３
キメラ抗体の軽鎖及び重鎖の増幅
（３−１） 軽鎖の増幅
軽鎖を増幅するためのＰＣＲを次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（２−１）で精製されたＶＬ（Ｖκ、Ｖλ）ＰＣＲ産物と前記実施例（２−２）で精製されたＣκＰＣＲ産物、配列番号１８及び１５のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１２０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。
増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４１】
（３−２） 重鎖の増幅
重鎖のＦｄ領域（ＶＨ及びＣＨ１）を増幅するためのオーバーラップ延長ＰＣＲ（overlap extension PCR）を次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（２−１）で精製されたＶＨ ＰＣＲ産物と前記実施例（２−２）で精製されたＣＨ１ ＰＣＲ産物、配列番号１９及び１７のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１２０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４２】
実施例４
キメラＦａｂライブラリの製造
キメララビット／ヒトＦａｂ遺伝子を増幅するためにＰＣＲを次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（３−１）で精製されたキメラ軽鎖産物と前記実施例（３−２）で精製されたキメラ重鎖産物、配列番号１８及び２０のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．７５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１８０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃から１０分間最終延長させた。
【００４３】
増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４４】
ラビットＶＬ及びＶＨ配列をコードするＰＣＲ産物をヒトＣκ及びＣＨ１配列をコードするＰＣＲ産物と連結させた後、抗体切片のライブラリをコードする最終ＰＣＲ切片を限定酵素ＳｆｉＩで切断し、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（the Scripps Research Institute, CA, USA）に挿入した（図２）。製造されたファージミドＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を電気穿孔（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法により形質転換させた。このように導入されたファージは、ファージコートタンパク質（phage coat protein）であるｐIII上に融合された融合タンパク質としてＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）し、このＤＮＡは、ファージＤＮＡ内のファージ粒子（一単位としての遺伝子及びポリペプチド）を形成する。
【００４５】
実施例５
抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンの選別
９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）を２５μｌのＴＢＳ溶液に溶解されたＨＧＦで各ウェル当り１０μｌ／ｍｌの濃度でコーティングした後、実施例 ４で製造したＦａｂを表面発現するファージを前記ウェルプレートに添加して室温で ２時間放置した後、前記ウェルプレートに固定されたＨＧＦ抗原に対してパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を実施した。前記ウェルプレートをＰＢＳの０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０溶液で洗浄した後、０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニングでは５回、二番目のパニングでは１０回、三番目のパニングでは１５回と増加させ、全体として７回のパニングを行った。パニングが進行されるによりＨＧＦに特異的に結合するＦａｂを表面発現するファージ群が増加したが、この現像はＨＲＰ−結合された抗Ｍ１３ファージ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｍ１３ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＨＧＦ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＩＡでＦａｂに結合するＨＧＦを示す吸光度における増加をもたらす（図３）。最後回のパニング後に、ＨＧＦ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたＥＩＡを用いて抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別し、これらのクローンをＨ６１（クローン６１）及びＨ６８（クローン６８）で命名した。基準値以上の強い信号を示す（図７）Ｈ６１及びＨ６８クローンの塩基配列分析を次のように行った。
【００４６】
実施例６
選別されたファージの塩基配列を分析
塩基配列を分析は、配列番号２１及び２２の２種シーケンシングプライマーを用いた染料−標識プライマーシーケンシング方法（dye labeled primer sequencing method）（Chung et al., J.Cancer Res.Clin.Oncol.128:641-649, 2002）を用いて行った。その結果、Ｈ６１クローンは、配列番号２３の塩基配列を有するＶＨ領域及び配列番号２４の塩基配列を有するＶＬ領域で構成される抗ＨＧＦ Ｆａｂをコードし、Ｈ６８クローンは、配列番号２５の塩基配列を有するＶＨ領域及び配列番号２６の塩基配列を有するＶＬ領域で構成される抗ＨＧＦ Ｆａｂをコードすることを確認した。
【００４７】
前記で分析された塩基配列からＨ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列をそれぞれ類推した結果、Ｈ６１クローンのＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ配列番号２７及び２８のアミノ酸配列を有し、Ｈ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ：２９及び３０のアミノ酸配列を有することを確認した。
【００４８】
Ｈ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列でフレーム枠構造領域（framework region; FR）と抗原結合部（complementarity determining region; CDR）をヘリスにより記述された方法（Harris et al., Protein Science 4(2):306-10, 1995）を用いて分析した結果、Ｈ６１及びＨ６８クローンは下記表２のような領域構成を有することが分かった。
【表２】
【００４９】
実施例７
抗ＨＧＦ Ｆａｂ発現及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のための精製
実施例５で選別されたファージミドＤＮＡのクローンを非抑制性大腸菌ＨＢ２１５１に形質転換させた。６００ｎｍでの吸光度が０．５〜１になるまでクローンを培養し、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して２０〜２４時間、抗ＨＧＦ Ｆａｂの発現を誘導した。培養上澄液をラブスケールＴＦＦシステム（Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。抗ＨＡ標示マウスモノクローナル抗体を用いた親和クロマトグラフィを行って濃縮された抗ＨＧＦ Ｆａｂを精製した。このＦａｂ切片をクマシ染色及びウエスタンブロットティング分析した。
【００５０】
まず、精製されたＨ６８抗体Ｆａｂ（約１〜３μｇ）をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Bis-Tris Gel, Invitrogen）にローディングして電気泳動を行った。ローディングされたゲルをクマシゲル（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｇｅｌ）染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３０分間撹拌した後、クマシゲル脱染色溶液に移してタンパク質バンドが観察されるまで撹拌した。クマシ染色結果を図４に示す。図４に示したように、非還元されたＨ６８抗体の場合（レーン２）、大部分のＦａｂ抗体は分子量５０，０００Ｄａにあたる位置で検出され、還元されたＨ６８抗体は（レーン３）、Ｆａｂ抗体が軽鎖及び重鎖のＦｄ領域にそれぞれ分離され、バンドが分子量２５，０００Ｄａにあたる位置で検出され、抗体バンドを除いた他のバンドは検出されなかった。Ｈ６８抗体Ｆａｂの軽鎖及び重鎖の大きさがそれぞれ約２５，０００Ｄａであり、二硫化結合による軽鎖と重鎖との間に共有結合されて形成されたＦａｂが約５０，０００Ｄａの大きさを有するという事実に照らして、Ｈ６８抗体Ｆａｂは、満たすべき純度（ｐｕｒｉｔｙ）を有する形態で分離された。レーン２から２５，０００Ｄａ付近で検出された弱いバンドは互いに結合できなかったＦａｂ軽鎖及び重鎖の遊離Ｆｄ領域の存在に起因する。
【００５１】
一方、ウエスタンブロットティングのために、精製された抗ＨＧＦ Ｆａｂ（約１〜３μｇ）をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Bis-Tris Gel, Invitrogen）にローディングして電気泳動を行い、分子量に従って分離したＦａｂをバイオトラスニトロセルロース膜（BioTrace Nitrocellulose membrane, PALL）に固定させた。前記膜を５％乾燥スキムミルク／ＴＢＳ（non-fat dry milk/TBS）で３０分間処理して遮断した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１０００：１の比率で３％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで希釈した後、前記膜と１時間撹拌しながら反応させた。前記膜をＴＢＳで３０分間洗浄しSupersignal West Pico stable peroxide solution（Pierce）とSupersignal West Pico Luminol/Enhancer solution（Pierce）との同量混合液で均等に濡らした後、暗室でＸ−ｒａｙ フィルム（Ｋｏｄａｋ）に感光させた。
【００５２】
図５は、このように精製されたＦａｂ切片の発現を分析したウエスタンブロットティング結果を示すことであって、左側レーンは大きさのマーカーであり、他のレーンは精製されたＦａｂをローディングしたレーンである。図５で見るように、５０、０００Ｄａにあたる位置で多量のＦａｂが検出され、２５、０００Ｄａにあたる位置で軽鎖と重鎖との遊離Ｆｄ領域が検出された。
【００５３】
実施例８
ＨＧＦの中和可能エピトープの塩基配列を及び特性分析
（８−１） 塩基配列の分析
９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）に２５μｌのＴＢＳ溶液に溶解された抗ＨＧＦ Ｈ６１Ｆａｂまたは抗ＨＧＦ Ｈ６８Ｆａｂを各ウェル当り１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。ＰＨＤペプチドライブラリＴＭ（phage display of combinatorial peptide library）（New England Bioloｂ）を前記ウェルプレートに加えた後、室温で２時間放置した。前記ウェルプレートをＰＢＳ内に０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０で洗浄した後、０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）で５回、二番目のパニングで１０回、三番目のパニングで１５回増加させ、全体として７回のパニングを行った。最終回のパニング後に、抗ＨＧＦ Ｈ６１Ｆａｂあるいは抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼで結合された抗Ｍ１３ファージゴートモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＥＩＡを通じて、抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂあるいはＨ６８ Ｆａｂを含むファージクローンを選別した。このように選別されたクローンの塩基配列を分析してそのアミノ酸配列を決めた。
【００５４】
前記塩基配列分析は配列番号３１のシクォンシングプライマーを用いた染料−標示プライマーシーケンシング方法（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ）を用いて行った。その結果、分析された塩基配列から類推した抗ＨＧＦ Ｈ６１及びＨ６８Ｆａｂｓをコードするペプチドはそれぞれ配列番号３２及び３３のアミノ酸配列を有することが判明した。
【００５５】
ついで、９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）に２５μｌのＴＢＳ溶液を加えて溶解させたｃ−ＭＥＴで各ウェル当り１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、配列番号３２及び３３のペプチドを含むクローンを添加した。前記ウェルプレートをＰＢＳ内の０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗Ｍ１３ファージゴートモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。
【００５６】
図６に示されたように、配列番号３２及び３３のペプチドそれぞれを含むファージ（１及び２）はｃ−ＭＥＴに結合する一方、前記ペプチドを含まない２個の対照群ファージ（３及び４）はｃ−ＭＥＴに結合しなかった。このような結果は、抗ＨＧＦ抗体Ｈ６８の抗原結合部はｃ−ＭＥＴのＨＧＦ結合部を模倣し、クローン６８に結合する配列番号３２及び３３のペプチドはＨＧＦのｃ−ＭＥＴ結合部を模倣するので、配列番号３２及び３３のペプチドがＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することができることを示す。
【００５７】
（８−２） 特性の分析
抗ＨＧＦ抗体の抗原結合部の特性を把握するために、次のようにウエスタンブロットティングを行った。１〜３μｇのＨＧＦをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングして電気泳動を行った。この時、一部は還元剤を処理した後ゲルにローディングし、一部は還元剤を処理しないでゲルにローディングした。分子量によって分離したタンパク質をニトロセルローズ膜（BioTrace Nitrocellulose membrane, PALL）に固定化させた。前記膜を遮断するために５％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで３０分間処理した。前記膜に抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂとＨ６８Ｆａｂとを添加して１時間撹拌した。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を３％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで１：１０００の比率で希釈し、前記膜に添加した後、１時間膜を撹拌した。前記膜をＴＢＳで３０分間洗浄し、スーパーシグナルウェストピコ安定化ペルオキシダーゼ溶液（Supersignal West Pico stable peroxide solution, Pierce）と、スーパーシグナルウェストピコルミノール／エンハンサー溶液（Supersignal West Pico Luminol/Enhancer solution, Pierce）との同量混合液で前記膜を均等に濡らした。前記膜を暗室でＸ−ｒａｙフィルム（Ｋｏｄａｋ）に感光させた。
【００５８】
図８は、Ｈ６１及びＨ６８によって決った中和可能エピトープの形態依存性を示したのであって、矢印は大きさのマーカーを、Ａはクローン６１を、Ｂはクローン６８を、レーン１は非還元ＨＧＦを、レーン２は還元ＨＧＦである。その結果、クローン６１と６８は全て非還元ＨＧＦに結合するが、還元ＨＧＦには結合しないことを発見した。このような結果はクローン６１及び６８の結合部で提供される抗原結晶部、すなわちエピトープの３次元的な構造が抗原−抗体反応に決定的であり、本発明の中和可能エピトープが非線形（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ）構造を有することを示唆する。
【００５９】
実施例９
ＭＤＣＫ分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の分析
ＭＤＣＫ細胞（Madine Darby canine kidney cell; ATCC CCL 34）を５％ＦＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地において３７℃、９５％ 湿度及び５％ＣＯ２の存在下で培養した。この細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り２×１０３個の細胞の濃度で分株し、新鮮な培地内で２ｎｇ／ｍｌ（２９ｐＭ）のＨＧＦの濃度で一晩露出させてから、抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体を前記ウェルプレートにそれぞれ異なる濃度で添加した。それによって発生する効果は光学顕微鏡で観察し、その結果を図９に示した。図９ａは等級１〜６の範囲を有する細胞の分散程度を示す基準を示したものであって、等級６はＨＧＦによる分散効果の１００％抑制を、等級５はＨＧＦによる分散効果の１００〜９０％抑制、等級４はＨＧＦによる分散効果の９０〜６０％抑制、等級３はＨＧＦによる分散効果の６０〜３０％抑制、等級２はＨＧＦによる分散効果の３０〜１０％の抑制、等級１はＨＧＦによる分散効果の１０％以下抑制をそれぞれ意味する。図９ｂは、抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体の分散程度が添加されたＨＧＦ濃度により変化し得ることを示す。
その結果、ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂのモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）が５０：１であり、ＨＧＦに対する抗ヒトＦａｂ抗体のモル比が５０：１〜１００：１の範囲である時、最も効果的な分散抑制効果を期待できた。
【００６０】
実施例１０
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
（１０−１） ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの親和力の分析
ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの親和力は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって決定した。
【００６１】
ＨＧＦの約１０６９共鳴単位（Resonance units; RＵ）はアミン結合方法（amine coupling method）を用いてＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）に結合され、この結合相互作用は、２５℃で３０μｌ／ｍｉｎの流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液中で進行するようにし、その表面は、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生させた。このような実験から運動速度定数（ｋｏｎ 及び ｋｏｆｆ）と平衡解離定数（Ｋｄ）とが決めることができた。図１０は、ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの結合親和力を示し、センサーチップ上に固定されているＨＧＦに結合する抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの量は抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの濃度に従って増加することを確認した。
【００６２】
（１０−２） ＨＧＦに対するクローン６８抗体のＨＧＦ結合抑制活性の分析
抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを実時間で確認するために、ｃ−Ｍｅｔをアミン結合方法を通じてＣＭ５センサーチップに結合させた。その後、ＨＧＦを５０ｎＭの濃度でそのまま注入し、それを５個の異なる濃度を有する（５０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ及び１．５μＭ）抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂと５個の異なる濃度を有する（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ及び６００ｎＭ）水溶性ｃ−Ｍｅｔとそれぞれ予め混合した。これらの結合相互作用は、２５℃で３０μｌ／分の流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液内で行われ、その結果生じる表面は、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生した。
【００６３】
図１１は、抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す。その結果、５０ｎＭ ＨＧＦを注入した場合には、ＨＧＦが４５５．５ＲＵかつｃ−Ｍｅｔに結合する一方（Ｉ）、５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭ（ＩＩ）、２５０ｎＭ（III）、５００ｎＭ（IV）、１μＭ（Ｖ）及び１．５μＭ（VI）の５個の異なる濃度で抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂを混合して注入した場合にはそれぞれ４０６．５、３２８、２６０、１１１．１及び７１のＲＵ値でｃ−Ｍｅｔに結合することを確認できた。これらの結果からｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合の強さは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの濃度が増加するに従って減少することを示す。抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂが単独注入された場合には、ＨＧＦの結合が発見されなかった。
【００６４】
（１０−３） 水溶性ｃ−ＭｅｔによるＨＧＦのｃ−Ｍｅｔ結合抑制活性の分析
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合が水溶性ｃ−Ｍｅｔにより抑制されるか否かを次のように調べた。２９７９ＲＵのｃ−Ｍｅｔを、アミン結合方法を通じてＣＭ５センサーチップに固定し、それらの結合相互作用を２５℃で３０μｌ／分の流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液内で誘導し、その結果生じる表面を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生した。
【００６５】
図１２は、水溶性ｃ−Ｍｅｔがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す。図１２で見るように、５０ｎＭのＨＧＦが注入された場合に、ＨＧＦは、４５５．５ＲＵでｃ−Ｍｅｔに結合する一方（Ｉ）、５０ｎＭ ＨＧＦに水溶性ｃ−Ｍｅｔをそれぞれ５０ｎＭ（ＩＩ）、１００ｎＭ（III）、２００ｎＭ（IV）、４００ｎＭ（Ｖ）及び６００ｎＭ（VI）で注入した場合には、ＨＧＦがそれぞれ３１０．３、２２５．７、１６７．４、９３．７及び７０.９のＲＵ値で結合することを確認できた。これからセンサーチップに固定されたｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの量は、水溶性ｃ−Ｍｅｔの濃度が増加するとともに漸次に減少することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のＨＧＦの構造を示す図である。
【図２】本発明の抗体ライブラリ製造に用いられたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘの遺伝子地図を示す図である。Ａ：ファージミド表面にＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）する場合、及びＢ：ファージミド表面にｓｃＦｖまたは二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）を表面発現する場合
【図３】本発明のＨＧＦ−結合クローンの培養の時、パニングを通じてＨＧＦに特異的に結合するＦａｂを表面発現するファージ群（ｐｏｏｌ）の増菌を示す図である。
【図４】本発明の精製されたＦａｂ切片をクマシブルーで染色した結果を示す図である。１：マーカー、２：非還元のクローン６８抗体（５０、０００Ｄａ）、及び３：還元のクローン６８抗体（２５、０００Ｄａ）
【図５】本発明の精製されたＦａｂ切片の発現有無を決定するためのウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図６】本発明のｃ−ＭＥＴに対する本発明の中和可能エピトープを含むファージの結合程度を示す図である。１：配列番号３２のペプチドを含むファージ、２：配列番号３３のペプチドを含むファージ、及び３及び４：配列番号３２及び３３のペプチドを含まない対照群ファージ、
【図７】本発明のクローン６１及び６８ＦａｂのＨＧＦに対する特異的結合を示す図である。
【図８】本発明のクローン６１及び６８により明らかにされた本発明の中和可能エピトープの形態依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ）を示す図である。Ａ：クローン６１、Ｂ：クローン６８レーン１：非還元ＨＧＦ、レーン２：還元ＨＧＦ
【図９ａ】本発明の等級１〜６の範囲の細胞の分散程度を示す基準を示す図である。
【図９ｂ】本発明の添加されたＨＧＦの濃度に応じて抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体の分散程度が変わることを示す分散分析結果を示す図である。
【図１０】本発明のＣＭ５センサーチップ上に固定されたＨＧＦに結合するクローン６８抗体の量はクローン６８抗体の注入量に応じて増加することを示す図である。Ｉ：非特異的Ｆａｂ注入、ＩＩ：５０ｎＭクローン６８抗体注入、ＩＩＩ：１００ｎＭクローン６８抗体注入、ＩＶ：２００ｎＭクローン６８抗体注入、Ｖ：４００ｎＭクローン６８抗体注入、ＶＩ：６００ｎＭクローン６８抗体注入
【図１１】本発明のクローン６８抗体は、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す図である。Ｉ：５０ｎＭ ＨＧＦ注入、ＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、ＩＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに２５０ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、ＩＶ：５０ｎＭ ＨＧＦに５００ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、Ｖ：５０ｎＭ ＨＧＦに１μＭクローン６８抗体を混合して注入、及びＶＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに１．５μＭクローン６８抗体を混合・注入、
【図１２】水溶性ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す図である。Ｉ：５０ｎＭ ＨＧＦ注入、ＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＩＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに１００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＩＶ：５０ｎＭ ＨＧＦに２００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、Ｖ：５０ｎＭ ＨＧＦに４００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＶＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに６００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＧＦがその受容体に結合することを抑制するＨＧＦ（hepatocyte growth factor）の中和可能エピトープ、及び前記ＨＧＦの中和可能エピトープに結合し単一の薬剤としてＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor）は間葉細胞（mesenchymal cell）により生産される多機能性ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）ポリペプチドである。ＨＧＦは、Ｎ末端ドメインとセリンプロテアーゼ類似ベータ−鎖Ｃ末端ドメインに共有結合で連結された４個のクリングルドメイン（ＮＫ４）を含むアルファ−鎖からなっている（図１参照）。ヒトＨＧＦは、成熟タンパク質には存在しない２９個のアミノ酸シグナルペプチドを有する７２８個のアミノ酸で構成された生物学的に不活性の単鎖前駆体として合成される。生物活性ＨＧＦは、特異的な細胞外の血清セリンプロテアーゼによるＲ４９４残基での切断を通じて得られる。この活性ＨＧＦは、ジサルファイド結合で連結された６９ｋＤａのアルファ−チェーンと３４ｋＤａのベータ−チェーンで構成された完全活性ヘテロ二量体である。しかし、ＨＧＦの全体３次元構造は未だに明かされておらず、これらのドメインのいずれがＨＧＦの特徴的な機能を担当するかについても明確に知られていない（Maulik et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 13(1): 41-59, 2002）。
その受容体であるＭｅｔに対するＨＧＦの結合は、多様な細胞類型の成長及び分散を誘導し、上皮間葉転移及び細管（ｔｕｂｕｌｅ）と内腔（ｌｕｍｅｎ）の形成を媒介し、また、血管形成を促進する。ＭｅｔとＨＧＦが共にノックアウット（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されたマウスは胚芽段階で死亡率が高く、胎盤、胎児の肝及び手足／筋肉形成において分化欠陥を示す（Cao et al., PNAS 98(13): 7443-7448, 2001; Gmyrek et al., American Journal of Pathology 159(2): 579-90, 2001）。
【０００３】
元々Ｍｅｔは、トランスフォーミング活性を有する構成的に活性（constitutively active）な変形されたタンパク質キナーゼをコードする、ヒト癌遺伝子ｔｒｐ−ｍｅｔの産物として最初に分離された。また、Ｍｅｔ活性化は、血管形成、細胞運動性及び細胞表面プロテアーゼの調節のような過程に刺激的な影響を及ぼすことから始めて癌の転移を著しく増加させると知られている（Wielenga et al., American Journal of Pathology 157(5):1563-73, 2000）。Ｍｅｔは、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚を含む多様なヒト癌で過発現すると報告されているため（Maulik et al, supra）、癌の予防及び治療のための重要な標的因子と見なされている。また、マラリヤ感染が分泌したＨＧＦによるＨＧＦ受容体の活性化に依存的だと報告されたことがあり、従って、ＨＧＦ及びその受容体はマラリヤ予防に対する新たな治療法の潜在的な標的として知られている（Carroloo M, et al., Nat. Med. 9(11): 1363-1369, 2003）。また、ＨＧＦがアルツハイマー病から引き起こされる病理学的変化に関与し得る可能性が報告されている（Fenton H, et al., Brain Res.779(1-2):262-270, 1998）。さらに、ＨＧＦが再上皮細胞化、新生血管形成及び果粒化組織形成を含む皮膚傷の治癒過程の向上に明らかに関与することが発見されている（Yoshida S.et al., J.Invest.Dermatol.120(2):335-343, 2003）。
【０００４】
一方、癌の発病及び転移に重要な役目をする腫瘍−関連成長因子またはサイトカインとその受容体の選択的中和は抗癌剤開発のための魅力的な戦略として認識されてきた。最近、これらを標的にするハーセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のような多数の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）及び抗アンジオポエチン（anti-angiopoietin）ヒトｍＡｂｓが組合せ抗体ライブラリ（combinatorial antibody library）のファージ(ｐｈａｇｅ)ディスプレイのような組換え抗体技術を利用して開発されている。
【０００５】
ＨＧＦに対する多クローン抗体が多くのＨＧＦの生物学的機能を抑制するということがよく知られている。また、最近はＨＧＦに対する中和ｍＡｂｓの混合物が動物モデルで抗−腫瘍活性を示すと報告されたことがある（Cao et al., PNAS 98(13):7443-7448, 2001）。具体的に、カオらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＨＧＦ活性を抑制するために３個以上のエピトープ、例えばＭｅｔ受容体に対して２個、ヘパリンに対して１個のエピトープが必要であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で少なくとも３個のｍＡｂｓの混合物がＨＧＦを中和させることができることを開示している。
しかし、今まで単剤としてＨＧＦを中和してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞分散活性（cell scattering activity）を制御できるモノクローナル抗体は報告されたことがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、その受容体に対するＨＧＦの結合を抑制するＨＧＦの中和可能エピトープを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は次のものを提供することである。
前記中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチド；
前記中和可能エピトープに結合し、単剤としてＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体；
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体の用途；
難治病及び癌を予防・治療するための前記中和抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬学組成物；及び
患者に前記中和抗体を投与することを含む、難治病及び癌を予防・治療する方法。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を果たすために、本発明は、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を有するＨＧＦの中和可能エピトープを提供する。
【０００９】
また、本発明は、配列番号２７または２９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と配列番号２８または３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含む前記中和可能エピトープに結合するＨＧＦに対する中和抗体を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によるＨＧＦの中和可能エピトープに結合する中和抗体は単一の薬剤としてＨＧＦを中和することができるので、効果的にＨＧＦとその受容体であるＭｅｔとの結合により引き起こされる様々な疾患、特に、癌の予防及び治療剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本明細書で用いる用語「中和可能エピトープ」は、ＨＧＦがその受容体であるｃ−Ｍｅｔに結合することを抑制することができる任意のタンパク質決定部を含む。エピトープ決定部は、一般的にアミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性化されたものが群を構成し、通常的に特異的な電荷特徴だけではなく、特異的な３次元構造的な特性を有する。好ましくは、本発明の中和可能エピトープは：３２または３３のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００１２】
用語「中和抗体」は、ＨＧＦの中和可能エピトープに特異的に結合し、ＨＧＦの生活性を抑制・除去できる抗体を意味する。概して中和抗体はこのようなＨＧＦの生活性を少なくとも５０％、好ましくは８０％以上抑制する。本発明の中和抗体は難治病および癌を予防・治療するための治療学的適用に特に有用である。
【００１３】
本発明は、ＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することができる：３２または３３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明によるＨＧＦの中和可能エピトープを製造する目的の下で、ＨＧＦで免疫化された動物の抗血清が組換えヒトＨＧＦに結合するか否かを決定するために、ＥＬＩＳＡ分析を行い、該抗血清がＨＧＦに特異的に結合することを確認してから、ＨＧＦで免疫化された動物から総ＲＮＡを抽出しｃＤＮＡを合成する。
【００１５】
ラビット軽鎖（ＶＬ）（Ｖκ、Ｖλ）及び重鎖（ＶＨ）を含む抗体可変領域（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）とヒトＣκ及びＣＨ１を含む抗体不変領域（Constant region）を増幅するために、前記合成されたｃＤＮＡを鋳型として：１〜２０のプライマーを組合せてＰＣＲ反応を行い、これから得たＰＣＲ産物を鋳型としてラビット／ヒトキメラ抗体の軽鎖及び重鎖を増幅する。増幅されたラビットＶＬ及び ＶＨ配列を、増幅されたヒトＣκ及びＣＨ１配列と連結した後、抗体切片（Ｆａｂ）をコードする最終ＰＣＲ産物を発現ベクターにクローニングした後、前記ベクターを宿主細胞、例えば大腸菌に形質変換させてキメララビット／ヒトＦａｂライブラリを製造する。本発明で使用可能な前記ベクターと宿主細胞は当業界で通常的に用いられるものであれば制限なく用いることができるが、発現ベクターとしてファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（Scripps Research Institute, CA, USA）を、宿主細胞としてＥ．Ｃｏｌｉ ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を用いることが好ましい。
【００１６】
ＨＧＦにコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体を用いたＥＩＡを用いて抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別する。 前記選別されたファージクローンを各々Ｈ６１（クローン６１）及びＨ６８（クローン６８）と命名した。
【００１７】
Ｈ６１及びＨ６８クローンに対して塩基配列分析を行い、分析された塩基配列からこれらのアミノ酸配列を決定した。本発明の好ましい実施の形態においては、塩基配列分析を染料−標示プライマーシーケンス方法（dye labeled primer sequencing method）（Chung et al., J Cancer Res Clin Oncol 128:641-649, 2002）を用いて行った。その結果、Ｈ６１クローンはそれぞれ配列番号２３及び２４の塩基配列を有するＶＨ及びＶＬ領域で構成され、Ｈ６８クローンはそれぞれ配列番号２５及び２６の塩基配列を有するＶＨ及びＶＬ領域で構成されることを確認した。
【００１８】
分析された塩基配列からＨ６１及びＨ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域それぞれに対するアミノ酸配列を類推した結果、Ｈ６１クローンは：２７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ領域で構成され、Ｈ６８クローンは配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と：３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域で構成されることを確認した。
【００１９】
Ｈ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列中の骨格構造領域（framework region;FR）と抗原結合部（complementarity determining region;CDR）とを分析した結果、Ｈ６１及びＨ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域は、それぞれ４個のＦＲと３個のＣＤＲを有することが明らかになった（表２参照）。
【００２０】
ＨＧＦの中和可能エピトープを同定するために、Ｈ６１及びＨ６８クローンを複合ペプチドライブラリのファージディスプレイを用いたパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を通じて増殖させた後、前記ファージ群を抗ＨＧＦ Ｈ６１あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂと抗ＨＧＦ Ｈ６１ Ｆａｂ−あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いるＥＩＡで分析した。これから抗ＨＧＦ Ｈ６１あるいは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂに結合するファージクローンを選別した。本発明の好ましい実施の形態においては、前記ペプチドライブラリとしてＰＨＤペプチドライブラリ（ＰＨＤ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙＴＭ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｂ）を用いる。
【００２１】
選別したファージクローンに対して塩基配列分析を行い、分析された塩基配列から類推したアミノ酸配列は配列番号３２及び３３のアミノ酸配列を有し、これらはｃ−ＭＥＴに結合することが確認できる（図６参照）。このような結果は、抗ＨＧＦ抗体Ｈ６１またはＨ６８の抗原結合部はｃ−ＭＥＴのＨＧＦ結合部を模倣（ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ）し、抗ＨＧＦ Ｈ６１またはＨ６８に結合する：３２及び３３のペプチドは ＨＧＦのｃ−ＭＥＴ結合部を模倣するということを示す。従って、本発明の配列番号３２及び３３のペプチドはＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することが判明した。
【００２２】
また、本発明は、前記中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的に、前記中和可能エピトープは、配列番号３４または３５の塩基配列を有する。
【００２３】
さらに、本発明は、ＨＧＦの中和可能エピトープとして配列番号３２または３３のペプチドに結合してＨＧＦを中和させることができるＨＧＦに対する中和抗体を提供する。
本発明の中和抗体はキメラ抗体、モノクロナール抗体またはヒト化抗体である。
【００２４】
キメラ抗体は、ヒト及び非ヒト由来部を含む免疫グロブリン分子である。具体的に、キメラ抗体の抗原結合領域（antigen combining region）（可変領域）は非ヒト起源（例えば、マウス、ラビット、家禽類）から由来し、免疫グロブリンに生物学的効果基機能を付与するキメラ抗体の不変領域はヒト起源から由来する。前記キメラ抗体は、非ヒト抗体分子の抗原結合特異性とヒト抗体分子によって付与された効果基機能を有する。
一般的に、キメラ抗体の生産に用いられる過程は次の段階を含む。
（ａ）抗体分子の抗原結合部をコードする正確な遺伝子切片を定めてクローニングする段階であって、前記遺伝子切片（ＶＤＪとして知られている重鎖についての可変的、多様性及び連結領域、ＶＪとして知られている軽鎖についての可変的、連結領域、または単にＶとして知られている可変領域）はｃＤＮＡまたはゲノムの形態であり得、
（ｂ）不変領域またはその目的する部位をコードする遺伝子切片をクローニングする段階、
（ｃ）前記可変領域を前記不変領域と連結し、これが転写・翻訳できる形態に構造して完全なキメラ抗体としてコードされる段階；
（ｄ）前記構造物を選別可能マーカー及びプローモーター、エンハンサー及びポリ（Ａ）付加信号を含むベクター内に導入する段階、
（ｅ）前記ベクターを増幅して真核細胞（通常は哺乳動物リンパ球内）に導入（形質感染）させる段階、
（ｆ）前記選別可能マーカーを発現する細胞を選別する段階、
（ｇ）目的するキメラ抗体を発現する細胞をスクリーニングする段階、及び
（ｈ）前記抗体をその適切な抗原特異性及びエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ）に対して前記抗体を調査する段階。
モノクローナル抗体は、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導された抗体を称する。前記モノクローナル抗体は、二つのタンパク質、すなわち重鎖及び軽鎖を含む。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術を含む当分野に公知の多様な技術中の一つまたはこれらの組合せを用いて製造できる。
【００２５】
ヒト化抗体は、そのＣＤＲｓ（相補性決定領域）が非ヒト免疫グロブリンから由来し、前記抗体分子の他の部分が主にヒト免疫グロブリンから由来する分子を意味する。本明細書で用いる、前記用語「抗体」は、抗体及び抗体に由来する分子の両方を幅広く意味する。このような抗体由来分子は、少なくとも一つの可変領域（可変領域の重鎖または軽鎖）を含み、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’ 断片、Ｆ（ａｂ’）．Sｕｂ．２断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ’ 断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂｃ断片、Ｓｃ抗体（単鎖抗体）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、個別的抗体軽鎖、個別的抗体重鎖、前記抗体鎖間のキメラ融合および他の分子のような分子構造を含む。
【００２６】
特に、本発明は、ＨＧＦに対する中和抗体としてラビット／ヒトキメラ抗体を提供する。本発明の中和抗体は、配列番号２７のＶＨ領域と配列番号２８のＶＬ領域とを含むか、または：２９のＶＨ領域と：３０のＶＬ領域とを含む。
【００２７】
ある中和抗体が中和活性を示すか否かは、ＭＤＣＫ２分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）分析によって確認することができる（Cao et al., PNAS 98(13):7443-7448, 2001）。ＭＤＣＫ２細胞に２ｎｇ／ｍｌ（２９ｐＭ）のＨＧＦを処理した場合に、本発明の中和抗体はＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂのモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）が５０：１であり、ＨＧＦに対する抗ヒトＦａｂ抗体のモル比が５０：１〜１００：１である時、最高の分散抑制活性を示す（図９参照）。このような結果は、ＨＧＦを中和してＭＤＣＫ２細胞の分散を抑制するために、少なくとも３個のエプトープを中和する必要があるというカオら（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．、上記）の報告とは異なり、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏで１個のエピトープのみでＨＧＦを中和可能であることを最初に示すものである。また、本発明では、中和可能エピトープに結合する抗体が二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）以上である場合のみに中和抗体が中和活性を発揮するということが証明されたが、このような結果は、同じエピトープがＨＧＦの二つ以上の部分に存在できることを示す。
【００２８】
本発明の他の実施の形態では、ＢＩＡｃｏｒｅ分析方法を用いてＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの結合親和力、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合のためのクローン６８の抑制活性及びｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合のための水溶性ｃ−Ｍｅｔの抑制活性をＥＩＡによって調べることができる。クローン６８抗体の注入量の増加に応じてセンサーチップ上に固定されたＨＧＦに結合するクローン６８抗体の量は増加し（図１０参照）、クローン６８抗体の濃度の増加に応じてｃ−ＭＥＴに結合するＨＧＦの量は減少する（図１１参照）。また、センサーチップ上に固定されたｃ−Ｍｅｔに結合するＨＧＦの量は、水溶性ｃ−Ｍｅｔの濃度の増加に応じて減少する（図１２参照）。
【００２９】
前記結果は、本発明による中和抗体がＨＧＦを中和させることができる単一の薬剤として作用することを立証する。
【００３０】
従って、本発明は、ＨＧＦがその受容体に結合して引き起こされる難治病及び癌を予防・治療するための本発明の中和抗体及び薬剤学的に許容可能な担体を含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、本発明の中和抗体を用い難治病及び癌を予防・治療する方法を提供する。前記癌の好ましい例としては、これに限定されるものではないが、肝、前立腺、大腸、乳房、脳及び皮膚を含む多様なヒト癌を含み、難治病は、ＨＧＦがその受容体ｃ−Ｍｅｔに結合して引き起こされる疾患であるが、これに限定されるものではなく、マラリヤ、アルツハイマー病及びその他を含む。
【００３１】
本発明の薬学的組成物は、通常的な方法のいずれか一つにより製剤化できる。剤形の製造において、有効成分は担体と混合または希釈されることが望ましい。適当な担体、賦形剤または希釈剤の例としては、ラクトース、デックストロス、スクロス、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスファート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油を含む。前記剤形は、追加的に充填剤、抗凝固制、光沢剤、湿潤剤、芳香剤、乳化剤、防腐剤及びその他等々を含み得る。本発明の組成物は、患者に投与された後に活性成分の迅速で持続的な、又は遅延された放出を提供するために当分野に公知の方法のいずれか一つを用いて剤形化されることができる。
【００３２】
本発明の薬学剤形は、注射（例えば、筋肉内、静脈内、腹膜内、皮下）または有効形態で血流内への伝達を保障する他の方法により投与できる。また、前記薬学剤形は、全身的だけでなく局所的な治療効果を発揮するために腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周経路に投与され得るが、この場合、局所的または静脈内の注射が望ましい。
ヒト患者を治療するために、有効成分として本発明の中和抗体の通常的な投与量は、０．１〜１００ｍｇ／kg体重であり、好ましくは１〜１０ｍｇ／kg体重の範囲であり、１日１回または数回に分けて投与することができる。しかし、活性成分の実際投与量は、治療条件、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び癌の種類及び症状の重症度などの多様な関連因子に照らして決定するべきであるので、前記投与量はどの方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を、実施例を通じてより詳しく説明する。
但し、下記の実施例は、本発明を例示することだけであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１
ＨＧＦ免疫化及び抗体ライブラリ製造
４〜５ヶ月にわたって、ニュージーランドホワイト種のラビット２匹にＭＰＬ（Monophosphoryl Lipid A, highly-refined non-toxic Lipid A isolated from remutants of S.minnesota）＋ＴＤＭ（synthetic Trehalose Dicorynomycolate, an analogue of trehalose dimycolate from the cord factor of the tubercle bacillus）＋ＣＷＳ（Cell Wall Skeleton, from deproteinized and delipidated cell walls of mycobacteria）補助剤（Ｓｉｇｍａ社）のエマルジョンに分散させたＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を３週の間隔で５回皮下注射して免疫させた。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ラビットＦｃゴート多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いたＥＬＩＳＡを通じて前記免疫ラビットの抗血清と組換えヒトＨＧＦ（R&D systems or Research Diagnostics, Inc.）との結合有無を分析した。その結果、 ＨＧＦ免疫前に得た血清はＨＧＦにほとんど結合しない一方、５回皮下注射後に得た血清はＨＧＦに特異的に結合することが判明した。
【００３５】
最後の注射から７日後に、免疫動物から脾臓及び骨髄を採取し、ＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ社）及び塩化リチウム沈殿を用いて総ＲＮＡを分離した。オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、スーパースクリプト前増幅システム（SUPERSCRIPT Preamlification System; Life Technologies社）を用いて第１ストランドｃＤＮＡを合成した。上記において、ラビット／ヒト異種抗体ライブラリは、レーダーなど（Rader C.et al., J.Biol.Chem.275:13668-13676, 2000）の方法により製作した。
【００３６】
実施例２
ラビット−由来Ａｂ可変領域及びヒト−由来Ａｂ不変領域の増幅
（２−１）
ラビット−由来Ａｂ可変領域の増幅
ラビットＶＬ（Ｖκ、Ｖλ）及びＶＨの可変領域を増幅するために、下記表１のプライマー組合せを用いてＰＣＲ反応を行った。
【表１】
【００３７】
ＰＣＲ反応溶液を実施例１で合成した１μｌの鋳型ｃＤＮＡ（約０．５μｇ）、６０ｐｍｏｌのプライマー、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。このように増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｅｘ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００３８】
（２−２）
ヒト−由来Ａｂ不変領域の増幅
ヒト−由来Ａｂ不変領域のＣκ領域を、ＰＣＲを利用して次のように増幅した。ＰＣＲ反応溶液を２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴベクター（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 15:88(18), 7978-82, 1991）、配列番号１４及び１５のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。
【００３９】
一方、ヒト−由来Ａｂ ＣＨ１領域を増幅するために次のようにＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応溶液を２０ｎｇのｐＣｏｍｂ３ＸＴＴ（Barbas et al., 上記）、配列番号１６及び１７のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で９０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。このように増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４０】
実施例３
キメラ抗体の軽鎖及び重鎖の増幅
（３−１） 軽鎖の増幅
軽鎖を増幅するためのＰＣＲを次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（２−１）で精製されたＶＬ（Ｖκ、Ｖλ）ＰＣＲ産物と前記実施例（２−２）で精製されたＣκＰＣＲ産物、配列番号１８及び１５のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１２０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。
増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４１】
（３−２） 重鎖の増幅
重鎖のＦｄ領域（ＶＨ及びＣＨ１）を増幅するためのオーバーラップ延長ＰＣＲ（overlap extension PCR）を次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（２−１）で精製されたＶＨ ＰＣＲ産物と前記実施例（２−２）で精製されたＣＨ１ ＰＣＲ産物、配列番号１９及び１７のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１２０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃で１０分間最終延長させた。増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４２】
実施例４
キメラＦａｂライブラリの製造
キメララビット／ヒトＦａｂ遺伝子を増幅するためにＰＣＲを次のように行った。ＰＣＲ反応溶液をそれぞれ１００ｎｇの前記実施例（３−１）で精製されたキメラ軽鎖産物と前記実施例（３−２）で精製されたキメラ重鎖産物、配列番号１８及び２０のプライマーをそれぞれ６０ｐｍｏｌ、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝溶液、８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物及び０．７５μｌのＴａｑポリメラーゼを混合し、蒸留水で最終体積を１００μｌにした。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０分間初期変性させ、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒及び７２℃で１８０秒の反応を２０回繰り返した後、７２℃から１０分間最終延長させた。
【００４３】
増幅されたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動させた後、クィアエクスゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてゲルから精製した。
【００４４】
ラビットＶＬ及びＶＨ配列をコードするＰＣＲ産物をヒトＣκ及びＣＨ１配列をコードするＰＣＲ産物と連結させた後、抗体切片のライブラリをコードする最終ＰＣＲ切片を限定酵素ＳｆｉＩで切断し、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（the Scripps Research Institute, CA, USA）に挿入した（図２）。製造されたファージミドＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ ＥＲ２５３７（ＮＥＢ）を電気穿孔（ｅｌｅｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）法により形質転換させた。このように導入されたファージは、ファージコートタンパク質（phage coat protein）であるｐIII上に融合された融合タンパク質としてＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）し、このＤＮＡは、ファージＤＮＡ内のファージ粒子（一単位としての遺伝子及びポリペプチド）を形成する。
【００４５】
実施例５
抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンの選別
９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）を２５μｌのＴＢＳ溶液に溶解されたＨＧＦで各ウェル当り１０μｌ／ｍｌの濃度でコーティングした後、実施例 ４で製造したＦａｂを表面発現するファージを前記ウェルプレートに添加して室温で ２時間放置した後、前記ウェルプレートに固定されたＨＧＦ抗原に対してパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）を実施した。前記ウェルプレートをＰＢＳの０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０溶液で洗浄した後、０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニングでは５回、二番目のパニングでは１０回、三番目のパニングでは１５回と増加させ、全体として７回のパニングを行った。パニングが進行されるによりＨＧＦに特異的に結合するＦａｂを表面発現するファージ群が増加したが、この現像はＨＲＰ−結合された抗Ｍ１３ファージ抗体（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−Ｍ１３ ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＨＧＦ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＩＡでＦａｂに結合するＨＧＦを示す吸光度における増加をもたらす（図３）。最後回のパニング後に、ＨＧＦ−コーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いたＥＩＡを用いて抗ＨＧＦ Ｆａｂを含むファージクローンを選別し、これらのクローンをＨ６１（クローン６１）及びＨ６８（クローン６８）で命名した。基準値以上の強い信号を示す（図７）Ｈ６１及びＨ６８クローンの塩基配列分析を次のように行った。
【００４６】
実施例６
選別されたファージの塩基配列を分析
塩基配列を分析は、配列番号２１及び２２の２種シーケンシングプライマーを用いた染料−標識プライマーシーケンシング方法（dye labeled primer sequencing method）（Chung et al., J.Cancer Res.Clin.Oncol.128:641-649, 2002）を用いて行った。その結果、Ｈ６１クローンは、配列番号２３の塩基配列を有するＶＨ領域及び配列番号２４の塩基配列を有するＶＬ領域で構成される抗ＨＧＦ Ｆａｂをコードし、Ｈ６８クローンは、配列番号２５の塩基配列を有するＶＨ領域及び配列番号２６の塩基配列を有するＶＬ領域で構成される抗ＨＧＦ Ｆａｂをコードすることを確認した。
【００４７】
前記で分析された塩基配列からＨ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列をそれぞれ類推した結果、Ｈ６１クローンのＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ配列番号２７及び２８のアミノ酸配列を有し、Ｈ６８クローンのＶＨ及びＶＬ領域はそれぞれ：２９及び３０のアミノ酸配列を有することを確認した。
【００４８】
Ｈ６１及びＨ６８クローンのアミノ酸配列でフレーム枠構造領域（framework region; FR）と抗原結合部（complementarity determining region; CDR）をヘリスにより記述された方法（Harris et al., Protein Science 4(2):306-10, 1995）を用いて分析した結果、Ｈ６１及びＨ６８クローンは下記表２のような領域構成を有することが分かった。
【表２】
【００４９】
実施例７
抗ＨＧＦ Ｆａｂ発現及びｉｎ ｖｉｔｒｏ分析のための精製
実施例５で選別されたファージミドＤＮＡのクローンを非抑制性大腸菌ＨＢ２１５１に形質転換させた。６００ｎｍでの吸光度が０．５〜１になるまでクローンを培養し、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して２０〜２４時間、抗ＨＧＦ Ｆａｂの発現を誘導した。培養上澄液をラブスケールＴＦＦシステム（Ｌａｂｓｃａｌｅ ＴＦＦ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。抗ＨＡ標示マウスモノクローナル抗体を用いた親和クロマトグラフィを行って濃縮された抗ＨＧＦ Ｆａｂを精製した。このＦａｂ切片をクマシ染色及びウエスタンブロットティング分析した。
【００５０】
まず、精製されたＨ６８抗体Ｆａｂ（約１〜３μｇ）をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Bis-Tris Gel, Invitrogen）にローディングして電気泳動を行った。ローディングされたゲルをクマシゲル（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｇｅｌ）染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３０分間撹拌した後、クマシゲル脱染色溶液に移してタンパク質バンドが観察されるまで撹拌した。クマシ染色結果を図４に示す。図４に示したように、非還元されたＨ６８抗体の場合（レーン２）、大部分のＦａｂ抗体は分子量５０，０００Ｄａにあたる位置で検出され、還元されたＨ６８抗体は（レーン３）、Ｆａｂ抗体が軽鎖及び重鎖のＦｄ領域にそれぞれ分離され、バンドが分子量２５，０００Ｄａにあたる位置で検出され、抗体バンドを除いた他のバンドは検出されなかった。Ｈ６８抗体Ｆａｂの軽鎖及び重鎖の大きさがそれぞれ約２５，０００Ｄａであり、二硫化結合による軽鎖と重鎖との間に共有結合されて形成されたＦａｂが約５０，０００Ｄａの大きさを有するという事実に照らして、Ｈ６８抗体Ｆａｂは、満たすべき純度（ｐｕｒｉｔｙ）を有する形態で分離された。レーン２から２５，０００Ｄａ付近で検出された弱いバンドは互いに結合できなかったＦａｂ軽鎖及び重鎖の遊離Ｆｄ領域の存在に起因する。
【００５１】
一方、ウエスタンブロットティングのために、精製された抗ＨＧＦ Ｆａｂ（約１〜３μｇ）をＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Bis-Tris Gel, Invitrogen）にローディングして電気泳動を行い、分子量に従って分離したＦａｂをバイオトラスニトロセルロース膜（BioTrace Nitrocellulose membrane, PALL）に固定させた。前記膜を５％乾燥スキムミルク／ＴＢＳ（non-fat dry milk/TBS）で３０分間処理して遮断した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１０００：１の比率で３％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで希釈した後、前記膜と１時間撹拌しながら反応させた。前記膜をＴＢＳで３０分間洗浄しSupersignal West Pico stable peroxide solution（Pierce）とSupersignal West Pico Luminol/Enhancer solution（Pierce）との同量混合液で均等に濡らした後、暗室でＸ−ｒａｙ フィルム（Ｋｏｄａｋ）に感光させた。
【００５２】
図５は、このように精製されたＦａｂ切片の発現を分析したウエスタンブロットティング結果を示すことであって、左側レーンは大きさのマーカーであり、他のレーンは精製されたＦａｂをローディングしたレーンである。図５で見るように、５０、０００Ｄａにあたる位置で多量のＦａｂが検出され、２５、０００Ｄａにあたる位置で軽鎖と重鎖との遊離Ｆｄ領域が検出された。
【００５３】
実施例８
ＨＧＦの中和可能エピトープの塩基配列を及び特性分析
（８−１） 塩基配列の分析
９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）に２５μｌのＴＢＳ溶液に溶解された抗ＨＧＦ Ｈ６１Ｆａｂまたは抗ＨＧＦ Ｈ６８Ｆａｂを各ウェル当り１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。ＰＨＤペプチドライブラリＴＭ（phage display of combinatorial peptide library）（New England Bioloｂ）を前記ウェルプレートに加えた後、室温で２時間放置した。前記ウェルプレートをＰＢＳ内に０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０で洗浄した後、０．１Ｍ ＨＣｌ−グリシン（ｐＨ２．２）で湧出した。洗浄段階は、一番目のパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）で５回、二番目のパニングで１０回、三番目のパニングで１５回増加させ、全体として７回のパニングを行った。最終回のパニング後に、抗ＨＧＦ Ｈ６１Ｆａｂあるいは抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂでコーティングされたＥＬＩＳＡプレート及び西洋ワサビペルオキシダーゼで結合された抗Ｍ１３ファージゴートモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＥＩＡを通じて、抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂあるいはＨ６８ Ｆａｂを含むファージクローンを選別した。このように選別されたクローンの塩基配列を分析してそのアミノ酸配列を決めた。
【００５４】
前記塩基配列分析は配列番号３１のシクォンシングプライマーを用いた染料−標示プライマーシーケンシング方法（Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、ｓｕｐｒａ）を用いて行った。その結果、分析された塩基配列から類推した抗ＨＧＦ Ｈ６１及びＨ６８Ｆａｂｓをコードするペプチドはそれぞれ配列番号３２及び３３のアミノ酸配列を有することが判明した。
【００５５】
ついで、９６−ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ Ｎｏ．３６９０）に２５μｌのＴＢＳ溶液を加えて溶解させたｃ−ＭＥＴで各ウェル当り１０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、配列番号３２及び３３のペプチドを含むクローンを添加した。前記ウェルプレートをＰＢＳ内の０．５％（ｖ／ｖ）ツイン２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗Ｍ１３ファージゴートモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。
【００５６】
図６に示されたように、配列番号３２及び３３のペプチドそれぞれを含むファージ（１及び２）はｃ−ＭＥＴに結合する一方、前記ペプチドを含まない２個の対照群ファージ（３及び４）はｃ−ＭＥＴに結合しなかった。このような結果は、抗ＨＧＦ抗体Ｈ６８の抗原結合部はｃ−ＭＥＴのＨＧＦ結合部を模倣し、クローン６８に結合する配列番号３２及び３３のペプチドはＨＧＦのｃ−ＭＥＴ結合部を模倣するので、配列番号３２及び３３のペプチドがＨＧＦの中和可能エピトープとして作用することができることを示す。
【００５７】
（８−２） 特性の分析
抗ＨＧＦ抗体の抗原結合部の特性を把握するために、次のようにウエスタンブロットティングを行った。１〜３μｇのＨＧＦをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ４−１２％ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にローディングして電気泳動を行った。この時、一部は還元剤を処理した後ゲルにローディングし、一部は還元剤を処理しないでゲルにローディングした。分子量によって分離したタンパク質をニトロセルローズ膜（BioTrace Nitrocellulose membrane, PALL）に固定化させた。前記膜を遮断するために５％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで３０分間処理した。前記膜に抗ＨＧＦ Ｈ６１ＦａｂとＨ６８Ｆａｂとを添加して１時間撹拌した。西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗ヒトゴートＦａｂ多クローン抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を３％乾燥スキムミルク／ＴＢＳで１：１０００の比率で希釈し、前記膜に添加した後、１時間膜を撹拌した。前記膜をＴＢＳで３０分間洗浄し、スーパーシグナルウェストピコ安定化ペルオキシダーゼ溶液（Supersignal West Pico stable peroxide solution, Pierce）と、スーパーシグナルウェストピコルミノール／エンハンサー溶液（Supersignal West Pico Luminol/Enhancer solution, Pierce）との同量混合液で前記膜を均等に濡らした。前記膜を暗室でＸ−ｒａｙフィルム（Ｋｏｄａｋ）に感光させた。
【００５８】
図８は、Ｈ６１及びＨ６８によって決った中和可能エピトープの形態依存性を示したのであって、矢印は大きさのマーカーを、Ａはクローン６１を、Ｂはクローン６８を、レーン１は非還元ＨＧＦを、レーン２は還元ＨＧＦである。その結果、クローン６１と６８は全て非還元ＨＧＦに結合するが、還元ＨＧＦには結合しないことを発見した。このような結果はクローン６１及び６８の結合部で提供される抗原結晶部、すなわちエピトープの３次元的な構造が抗原−抗体反応に決定的であり、本発明の中和可能エピトープが非線形（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ）構造を有することを示唆する。
【００５９】
実施例９
ＭＤＣＫ分散（ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の分析
ＭＤＣＫ細胞（Madine Darby canine kidney cell; ATCC CCL 34）を５％ＦＣＳが添加されたＤＭＥＭ培地において３７℃、９５％ 湿度及び５％ＣＯ２の存在下で培養した。この細胞を９６−ウェルプレートにウェル当り２×１０３個の細胞の濃度で分株し、新鮮な培地内で２ｎｇ／ｍｌ（２９ｐＭ）のＨＧＦの濃度で一晩露出させてから、抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体を前記ウェルプレートにそれぞれ異なる濃度で添加した。それによって発生する効果は光学顕微鏡で観察し、その結果を図９に示した。図９ａは等級１〜６の範囲を有する細胞の分散程度を示す基準を示したものであって、等級６はＨＧＦによる分散効果の１００％抑制を、等級５はＨＧＦによる分散効果の１００〜９０％抑制、等級４はＨＧＦによる分散効果の９０〜６０％抑制、等級３はＨＧＦによる分散効果の６０〜３０％抑制、等級２はＨＧＦによる分散効果の３０〜１０％の抑制、等級１はＨＧＦによる分散効果の１０％以下抑制をそれぞれ意味する。図９ｂは、抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体の分散程度が添加されたＨＧＦ濃度により変化し得ることを示す。
その結果、ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂのモル比（ｍｏｌａｒ ｒａｔｉｏ）が５０：１であり、ＨＧＦに対する抗ヒトＦａｂ抗体のモル比が５０：１〜１００：１の範囲である時、最も効果的な分散抑制効果を期待できた。
【００６０】
実施例１０
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
（１０−１） ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの親和力の分析
ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｆａｂの親和力は、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＳＰＲ（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって決定した。
【００６１】
ＨＧＦの約１０６９共鳴単位（Resonance units; RＵ）はアミン結合方法（amine coupling method）を用いてＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ）に結合され、この結合相互作用は、２５℃で３０μｌ／ｍｉｎの流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液中で進行するようにし、その表面は、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生させた。このような実験から運動速度定数（ｋｏｎ 及び ｋｏｆｆ）と平衡解離定数（Ｋｄ）とが決めることができた。図１０は、ＨＧＦに対する抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの結合親和力を示し、センサーチップ上に固定されているＨＧＦに結合する抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの量は抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの濃度に従って増加することを確認した。
【００６２】
（１０−２） ＨＧＦに対するクローン６８抗体のＨＧＦ結合抑制活性の分析
抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを実時間で確認するために、ｃ−Ｍｅｔをアミン結合方法を通じてＣＭ５センサーチップに結合させた。その後、ＨＧＦを５０ｎＭの濃度でそのまま注入し、それを５個の異なる濃度を有する（５０ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ及び１．５μＭ）抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂと５個の異なる濃度を有する（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ及び６００ｎＭ）水溶性ｃ−Ｍｅｔとそれぞれ予め混合した。これらの結合相互作用は、２５℃で３０μｌ／分の流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液内で行われ、その結果生じる表面は、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生した。
【００６３】
図１１は、抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す。その結果、５０ｎＭ ＨＧＦを注入した場合には、ＨＧＦが４５５．５ＲＵかつｃ−Ｍｅｔに結合する一方（Ｉ）、５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭ（ＩＩ）、２５０ｎＭ（III）、５００ｎＭ（IV）、１μＭ（Ｖ）及び１．５μＭ（VI）の５個の異なる濃度で抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂを混合して注入した場合にはそれぞれ４０６．５、３２８、２６０、１１１．１及び７１のＲＵ値でｃ−Ｍｅｔに結合することを確認できた。これらの結果からｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合の強さは抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂの濃度が増加するに従って減少することを示す。抗ＨＧＦ Ｈ６８ Ｆａｂが単独注入された場合には、ＨＧＦの結合が発見されなかった。
【００６４】
（１０−３） 水溶性ｃ−ＭｅｔによるＨＧＦのｃ−Ｍｅｔ結合抑制活性の分析
ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合が水溶性ｃ−Ｍｅｔにより抑制されるか否かを次のように調べた。２９７９ＲＵのｃ−Ｍｅｔを、アミン結合方法を通じてＣＭ５センサーチップに固定し、それらの結合相互作用を２５℃で３０μｌ／分の流速で０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含有するＰＢＳ緩衝溶液内で誘導し、その結果生じる表面を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭ ＮａＯＨで再生した。
【００６５】
図１２は、水溶性ｃ−Ｍｅｔがｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す。図１２で見るように、５０ｎＭのＨＧＦが注入された場合に、ＨＧＦは、４５５．５ＲＵでｃ−Ｍｅｔに結合する一方（Ｉ）、５０ｎＭ ＨＧＦに水溶性ｃ−Ｍｅｔをそれぞれ５０ｎＭ（ＩＩ）、１００ｎＭ（III）、２００ｎＭ（IV）、４００ｎＭ（Ｖ）及び６００ｎＭ（VI）で注入した場合には、ＨＧＦがそれぞれ３１０．３、２２５．７、１６７．４、９３．７及び７０.９のＲＵ値で結合することを確認できた。これからセンサーチップに固定されたｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの量は、水溶性ｃ−Ｍｅｔの濃度が増加するとともに漸次に減少することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明のＨＧＦの構造を示す図である。
【図２】本発明の抗体ライブラリ製造に用いられたファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘの遺伝子地図を示す図である。Ａ：ファージミド表面にＦａｂを表面発現（ｄｉｓｐｌａｙ）する場合、及びＢ：ファージミド表面にｓｃＦｖまたは二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）を表面発現する場合
【図３】本発明のＨＧＦ−結合クローンの培養の時、パニングを通じてＨＧＦに特異的に結合するＦａｂを表面発現するファージ群（ｐｏｏｌ）の増菌を示す図である。
【図４】本発明の精製されたＦａｂ切片をクマシブルーで染色した結果を示す図である。１：マーカー、２：非還元のクローン６８抗体（５０、０００Ｄａ）、及び３：還元のクローン６８抗体（２５、０００Ｄａ）
【図５】本発明の精製されたＦａｂ切片の発現有無を決定するためのウエスタンブロット分析結果を示す図である。
【図６】本発明のｃ−ＭＥＴに対する本発明の中和可能エピトープを含むファージの結合程度を示す図である。１：配列番号３２のペプチドを含むファージ、２：配列番号３３のペプチドを含むファージ、及び３及び４：配列番号３２及び３３のペプチドを含まない対照群ファージ、
【図７】本発明のクローン６１及び６８ＦａｂのＨＧＦに対する特異的結合を示す図である。
【図８】本発明のクローン６１及び６８により明らかにされた本発明の中和可能エピトープの形態依存性（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ）を示す図である。Ａ：クローン６１、Ｂ：クローン６８レーン１：非還元ＨＧＦ、レーン２：還元ＨＧＦ
【図９ａ】本発明の等級１〜６の範囲の細胞の分散程度を示す基準を示す図である。
【図９ｂ】本発明の添加されたＨＧＦの濃度に応じて抗ＨＧＦ Ｆａｂと抗ヒトＦａｂ抗体の分散程度が変わることを示す分散分析結果を示す図である。
【図１０】本発明のＣＭ５センサーチップ上に固定されたＨＧＦに結合するクローン６８抗体の量はクローン６８抗体の注入量に応じて増加することを示す図である。Ｉ：非特異的Ｆａｂ注入、ＩＩ：５０ｎＭクローン６８抗体注入、ＩＩＩ：１００ｎＭクローン６８抗体注入、ＩＶ：２００ｎＭクローン６８抗体注入、Ｖ：４００ｎＭクローン６８抗体注入、ＶＩ：６００ｎＭクローン６８抗体注入
【図１１】本発明のクローン６８抗体は、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す図である。Ｉ：５０ｎＭ ＨＧＦ注入、ＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、ＩＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに２５０ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、ＩＶ：５０ｎＭ ＨＧＦに５００ｎＭクローン６８抗体を混合・注入、Ｖ：５０ｎＭ ＨＧＦに１μＭクローン６８抗体を混合して注入、及びＶＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに１．５μＭクローン６８抗体を混合・注入、
【図１２】水溶性ｃ−Ｍｅｔは、ｃ−Ｍｅｔに対するＨＧＦの結合を抑制することを示す図である。Ｉ：５０ｎＭ ＨＧＦ注入、ＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに５０ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＩＩＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに１００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＩＶ：５０ｎＭ ＨＧＦに２００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、Ｖ：５０ｎＭ ＨＧＦに４００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入、ＶＩ：５０ｎＭ ＨＧＦに６００ｎＭ水溶性ｃ−Ｍｅｔを混合・注入
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor）がその受容体に結合することを抑制する、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を有するＨＧＦの中和可能エピトープ。
【請求項２】
請求項１に記載の中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３４の塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３５の塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の中和可能エピトープに特異的に結合する中和抗体。
【請求項６】
前記中和抗体がキメラ抗体、モノクローナル抗体及びヒト化抗体で構成された群から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記中和抗体が配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記中和抗体が配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含むことを特徴とする請求項４に記載の抗体。
【請求項９】
請求項５に記載の中和抗体を哺乳動物に投与することを含むＨＧＦ受容体に対するＨＧＦの結合により引き起こされる疾患を予防または治療する方法。
【請求項１０】
前記疾患が肝癌、前立線癌、大腸癌、乳房癌、脳癌、皮膚癌、マラリヤ及びアルツハイマー病であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１】
ＨＧＦ（肝細胞増殖因子hepatocyte growth factor）がその受容体に結合することを抑制する、配列番号３２または３３のアミノ酸配列を有するＨＧＦの中和可能エピトープ。
【請求項２】
請求項１に記載の中和可能エピトープをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３４の塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３５の塩基配列を有することを特徴とする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の中和可能エピトープに特異的に結合する中和抗体。
【請求項６】
前記中和抗体がキメラ抗体、モノクローナル抗体及びヒト化抗体で構成された群から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記中和抗体が配列番号２７のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号２８のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
前記中和抗体が配列番号２９のアミノ酸配列を有するＶＨ領域と配列番号３０のアミノ酸配列を有するＶＬ領域を含むことを特徴とする請求項４に記載の抗体。
【請求項９】
請求項５に記載の中和抗体を哺乳動物に投与することを含むＨＧＦ受容体に対するＨＧＦの結合により引き起こされる疾患を予防または治療する方法。
【請求項１０】
前記疾患が肝癌、前立線癌、大腸癌、乳房癌、脳癌、皮膚癌、マラリヤ及びアルツハイマー病であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５３２０９７（Ｐ２００７−５３２０９７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３９３７８（Ｐ２００６−５３９３７８）
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４８４８
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５０６１５９２１９）ナショナル・キャンサー・センター (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月９日（２００４．１１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００２８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０４４８４８
【国際公開日】平成１７年５月１９日（２００５．５．１９）
【出願人】（５０６１５９２１９）ナショナル・キャンサー・センター (3)
【氏名又は名称原語表記】ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＡＮＣＥＲ ＣＥＮＴＥＲ
【Ｆターム（参考）】
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