ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の製造方法
【課題】 ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質（すなわちＴＡＴ-ＨＯＸＢ４Ｈ）の改良された製造方法に関するものである。
【解決手段】 このＴＡＴ-ＨＯＸＢ４ＨのＣ−末端には、６個ないしそれ以上のヒスチジンからなるタグが含まれる。ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に少なくとも6個のヒスチジンのコーディングフラグメントを含むＤＮＡコンストラクトを構築し、宿主細胞に形質転換したのち、宿主細胞中でＣ−末端に少なくとも6個のヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を発現させ、組み換えタンパク質を精製する。この組み換えタンパク質が宿主細胞（大腸菌など）で産生されたのちに、タンパク質を精製する際の効率を３ないし５倍に高める。本発明は、製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を用いて生体外の幹細胞を増殖させる方法、およびその組成物の使用にも関連する。
【解決手段】 このＴＡＴ-ＨＯＸＢ４ＨのＣ−末端には、６個ないしそれ以上のヒスチジンからなるタグが含まれる。ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に少なくとも6個のヒスチジンのコーディングフラグメントを含むＤＮＡコンストラクトを構築し、宿主細胞に形質転換したのち、宿主細胞中でＣ−末端に少なくとも6個のヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を発現させ、組み換えタンパク質を精製する。この組み換えタンパク質が宿主細胞（大腸菌など）で産生されたのちに、タンパク質を精製する際の効率を３ないし５倍に高める。本発明は、製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を用いて生体外の幹細胞を増殖させる方法、およびその組成物の使用にも関連する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ−末端にヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）の作成に用いられるＤＮＡコンストラクトを構築することによって当該の組み換えタンパク質の精製効率を上げる方法に関するものであり、当該のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨはＣ−末端に６個またはそれ以上のヒスチジンタグを含む。本発明は、作成されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を用いて生体外の幹細胞を増殖させる方法、及びその組成物の使用に関し、一段の進歩をもたらすものである。
【背景技術】
【０００２】
臍帯血（umbilical cord blood;ＵＣＢ）は、嬰児の出生時に臍帯及び胎盤の内部に残留した血を指す。臍帯血は多くの「ゼロ歳」の原始幹細胞を含むが、その効用は骨髄に相当し、人体が製造する血液及び免疫系の主要な源である。臍帯血の幹細胞は全能細胞とも呼ばれ、胚に類似した「若い」かつ比較的未分化な細胞であることから、異なる形態の細胞や組織に発展することが可能であり、癌や血液疾病、さらには先天的な代謝疾病等の治療に用いることが可能である。臍帯血幹細胞の数と質は、いずれもその他の幹細胞と比較して優良であり、また臍帯血中の造血幹細胞及び母細胞の濃度は骨髄内の１０−２０倍であるため、その増殖能力も比較的高い。
【０００３】
その上、臍帯血の造血幹細胞は比較的未成熟（primitive; immature）なため、臍帯血中のT細胞は「自己」と「他者（non-self）」を弁別する能力が骨髄や末梢血の成熟した造血幹細胞に比べて低い傾向があり、よって移植片対宿主病（graft versus host disease; GVHD）や拒否反応（rejection）の発生を減少させることができ、少数派に対する移植の機会を増やすことが可能である。このほか、臍帯血幹細胞はペアリングに関する要求条件が比較的低い。非親族間の骨髄移植では６個の白血球抗原（ＨＬＡ）が全て符合していることが求められるが、臍帯血幹細胞移植では５個もしくは４個の抗原が一致すれば移植可能である。
【０００４】
臍帯血幹細胞の採集数量は有限であり、乳幼児に対する使用であれば良いが、成人に対する使用であればやや不足する。カナダ・モントリオール大学（University of Montreal）のGuy Sauvageau博士はかつて骨髄中の幹細胞の数が制限される現象について研究を行った。彼の研究はホメオボックス遺伝子（homeobox gene）であるＨＯＸＢ４が造血幹細胞の自己複製の調節に対して重要であり、骨髄中のコロニーの大きさを維持することができるということを示した。ＨＯＸ遺伝子が血球細胞で発現しうることを最初に証明したのは、ヒト及びラットの細胞株（cell line）を用いてのことである。いくつかのＨＯＸ遺伝子は異なる形態の細胞ではっきりと広範に発現し、また他のいくつかのＨＯＸ遺伝子は特定の細胞のみで活発に発現する。
【０００５】
例えば、ヒトのＨＯＸＢクラスター中の８個の遺伝子は、赤血球細胞の発育の初めに発現し、ＨＯＸＢ４及びＨＯＸＢ7を含むいくつかのＨＯＸＢ遺伝子はＴ細胞やＢ細胞でも発現する。Sauvageauらは、９個のＨＯＸＡ遺伝子、８個のＨＯＸＢ遺伝子及び４個のＨＯＸＣ遺伝子がＣＤ３４+骨髄細胞内で発現していること、またこのうちＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ９及びＨＯＸＡ１０がＣＤ３４+の細胞コロニー内の赤血球原始細胞において最も多く発現していることを証明した。このほか、実験結果によると、ＣＤ３４-細胞群においては、発現しているＨＯＸ遺伝子が全くないか、少数しか発現していないことも検出された。これにより、“ＨＯＸＢ４”タンパク質は生体外の造血幹細胞（ＨＳＣ）増殖に有効な刺激剤として最も常用されている。
【０００６】
遺伝子工学により作られた既知の組み換え“ＨＯＸＢ４”タンパク質は、タンパク質を細胞内に入れるため“ＨＯＸＢ４”タンパク質のＮ末端にＴＡＴ配列を結合している。このＴＡＴ配列は“ＨＯＸＢ４”タンパク質を細胞に入れた後、熱ショックタンパク９０（Ｈｓｐ９０）の助けによって“ＨＯＸＢ４”タンパク質を活性のある構造に折りたたむ。また、そのN−末端には６個のヒスチジン（Ｈｉｓ−６）からなるヒスチジンタグを含むことから、この組み換えタンパク質の精製及び回収を行う際に有利である。この外来性“ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４”組み換えタンパク質は造血幹細胞の増殖を２−６倍に促進しうる、ということが既に証明されている（Amsellem, S. et al., Nature Medicine 9, 1423-1427, 2003; Krosl, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003）。しかし、このＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質は、宿主である大腸菌からの純化回収率が低いため、幹細胞を増殖させるために十分な量のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質を得るためには、大量の大腸菌発現細胞を培養し、煩雑な精製工程を用いることが必要である。
【０００７】
そこで、本発明はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の回収量を向上させることについて解決策を提示したい。その骨子は、Ｃ−末端にヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）組み換えタンパク質を生産するためのコンストラクト（発現した組み換えＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質はＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジン残基タグを持つ）を構築することにより、当該組み換えタンパク質の精製効率を向上する方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ひとつには、本発明はＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の調製方法に関するものである。この方法には、ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジンコーディング配列を持つＤＮＡコンストラクト（得られたコンストラクトを形質転換した宿主細胞においてＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質が発現する）の構築、及びこの組み換えタンパク質を精製することが含まれる。
【０００９】
技術語“発現ベクター”、“ポリヌクレオチドベクター”、“ＤＮＡコンストラクト”及び“ベクターコンストラクト”は、この領域の技術を熟知している人が理解している通り、本文中で交換して使用されうる用語であり、遺伝子組み換えに用いられたいかなるコンストラクトをも指す。
技術語“Histidine tag（ヒスチジンタグ、His tag）”は本文中において、少なくとも６個のヒスチジン残基を指す。本発明における実際の方法では、Ｃ−末端に７個のヒスチジンコーディングフラグメントを導入したＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅し、さらにこのDNAフラグメントクローンを適当な宿主細胞の中に入れて発現を進行させる。また別の実際の方法では、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を発現するベクターをテンプレートとしてＰＣＲ法で増幅するときに、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のＣ−末端のヌクレオチド配列中に５個のヒスチジンからなるコーディング配列を導入し、最終的に発現するＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質のＣ−末端に７個のヒスチジンタグが含まれるようにする。このコンストラクトを大腸菌に形質転換することで発現、製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の精製後の産量は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質の場合と比べて３−５倍になる。
【００１０】
もうひとつには、本発明はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクトに関するものである。その特徴は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に導入された７個のヒスチジンタグにある。実際の方法においては、本発明のＤＮＡコンストラクトはプラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法を用いて製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、同様に幹細胞の増殖に用いることが可能である。このタンパク質は生体外で臍帯血幹細胞の増殖を６倍にし、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質と同様の効果があることが実験により証明されており、本発明の方法でＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質のＣ−末端に５個のヒスチジンを導入することで得られた改良型ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、宿主細胞からの精製効率（および精製後の産量）を増加させるのみならず、幹細胞の増殖にも有効であることを示している。
【００１２】
本発明のさらなる一面は、製造された新規ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４を含む組み換えタンパク質を用いて幹細胞増殖を行う際の幹細胞増殖用培地、及びその使用方法に関するものである。すなわち、幹細胞増殖に用いられる培地は、本発明の方法で得られた５−１００ｎＭのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質、及び幹細胞培養に適当な細胞栄養物質、細胞増殖因子及び抗生物質を含む。本発明における実際の方法では、増殖に用いられる幹細胞は臍帯血幹細胞であり、実際の方法で増殖に用いられる幹細胞は造血幹細胞である。
【００１３】
技術語“幹細胞”は、増殖・自己複製及び分化した次世代を大量に製造する能力を有する細胞を指す。幹細胞は分化、またはその他の細胞に変化する能力を持つ。このような細胞は通常胚の発育初期段階で得られ、適当な環境条件化で特定の組織と器官に変化することができる。
本申請の実施例による精製及び幹細胞増殖実験のデータが示すとおり、本発明の製造法により得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の精製効率（および精製後の産量）と比較して３−５倍高く、かつＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質に相当する幹細胞増殖促進能力を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に示した実施例は本発明の技術内容が達成できる効果を説明するものであるが、本発明を制約するものではない。本発明によって発生する如何なる均等な変化及び修飾も、全て本発明の特許請求の範囲が定める範疇に属する。
【００１５】
（実施例１：プラスミドｐＴＡＴ-ＨＯＸＢ４Ｈの構築）
プラスミドpTAT-HOXB4（Nature Medicine 9, 1428−1432（2003））を以下のような一対のプライマーを用いたPCR反応により増幅を進行させた。
5’−ctccatggctatgagttcttttttg−3’（配列：1）および
5’−atgatgatgatga tgatgatggagcgcgcgg−3’（配列：2）
この結果、HOXB4のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＣ-末端に４個の余剰ヒスチジン残基を含むフラグメント（図２）を得た。このように増幅して得たフラグメントを、再び以下の一対のプライマーを用いてPCR反応を行い、増幅した。
【００１６】
5’−ctccatggctatgagttcttttttg−3’（配列：1）および
5’−cagaattcctaatg atgatgatgatga−3’（配列：3）
この結果、３'末端に新たにＥｃｏＲＩの認識部位を有するフラグメントを得た。続いてこのフラグメントを制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、またこのサブクローンと同じ二つの制限酵素で処理をして回収された元のpＴＡＴ−ＨＯＸＢ４プラスミドの骨格（これをフラグメントのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位とつなぐ）とから、新規プラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを製造した。本発明では、上述した特性を備える組み換えpＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質をｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈと称する。
【００１７】
（実施例２：ＴＡＴ-ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質とＴＡＴ-ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質との精製及び産量の比較）
PＴＡＴ−ＨＯＸＢ４（もしくはｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）のベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）に形質転換した。形質転換を行った細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩経過後の培養物を、ＯＤ600（600nmにおける光密度値）が０．０５になるように希釈し、さらに３７℃でＯＤ600が０．５になるまで増殖させる。続いて1mMになるようにＩＰＴＧ（Isopropyl-秉och-D-thiogalactopyranoside）を加え、３７℃で３時間激しく振盪して発現を誘導する。誘導後、細胞を遠心分離法により収集し、さらに緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）、０．５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）および１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁する。
【００１８】
細胞懸濁液をフレンチプレス（French press）により三回破砕・圧搾し、細胞溶解液を２００００×ｇ、４℃条件下で３０分間遠心分離した。上清液にイミダゾールを１０ｍＭになるように調製して添加し、HisTrapキレーティングカラム（Amersham Pharmacia）に加えた。結合したタンパク質を５０、１００および２５０ｍＭの比率で緩衝液Ａ中に溶かしたイミダゾールによって溶出した。ＨＯＸＢ４（もしくはＨＯＸＢ４Ｈ）を含む溶出液を、緩衝液Ｂ（４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）の存在下でＭｏｎｏＳＰカラムに加え、１．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で溶出し、さらにＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムで脱塩した。ＰＢＳ（リン酸緩衝液）でＨＯＸＢ４（ＨＯＸＢ４Ｈ）タンパク質をＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムから溶出、溶出液の純度は＞９９％であった。全溶出物に１％のＢＳＡと１０％のグリセロールを加え、分注して−８０℃で急速冷凍した。
【００１９】
図３の電気泳動結果に示すとおり、本発明方法により生産されたＣ−末端に新たに５個のヒスチジンが付加されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、宿主である大腸菌からの回収産量が元のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量に比べて約３−５倍に増加している。ブラッドフォード法により組み換えタンパク質の産量を以下のように定量した。既知の濃度のＢＳＡのＯＤ595をプロットしたものを利用して標準曲線を描き、内挿法によりサンプル中のタンパク質含量を計算した結果、得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量は５．５ｍｇ／Ｌ、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量は１．２ｍｇ／Ｌであると判明した。
【００２０】
（実施例３：TAT-HOXB4H組み換えタンパク質の造血幹細胞の増殖に対する能力）
ヒト臍帯血中の赤血球を、４℃の０．１％炭酸水素ナトリウムを含む０．８３％塩化アンモニウム（ｐＨ７．０）溶液中で溶解し除去した。収集した白血球部分を、磁性ビーズを結合させた特定の抗体と共に培養した後、Ｓｔｅｍｓｅｐカラム分離法により磁性細胞分離を行い、ＣＤ３４+を持つ細胞を収集し、成熟ヒト白血球細胞を発現している部分を除去した。精製された細胞を幹細胞培地（ＤＭＥＭ、以下の物質を含む。１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＴＦ（幹細胞成長因子）、ペニシリン１００単位/ml、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中で２日間培養し、その後１５ｎＭ ＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）もしくは１％ＢＳＡを含む幹細胞培地中で４日間培養した。培養の３日目（処理当日を０日とする）に、４×１０5細胞／ｍｌとなるように、ＢＳＡもしくはＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）を補充した幹細胞培地中に再懸濁した。この後３時間ごとに新鮮なＢＳＡもしくはＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）タンパク質を添加した（総培地の５％に最初のタンパク質量の５０％が含まれている）。１２時間経過後、ＦＣＳと細胞因子を加え、希釈濃度が培地中に含まれる正確な量の２０％になるように校正する。２４時間経過後、目標タンパク質を含む新鮮培地中に細胞を再懸濁する。処理の０、２および４日目にＩＳＨＡＧＥ法（ＣＤ４５／ＣＤ３４染色と正面および側面からの散乱光）により幹細胞数を計測した。
【００２１】
図４の結果が証明するとおり、本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は臍帯血幹細胞の増殖を約６倍にすることができ、この効果は既知のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質に相当する。本発明により製造されたＣ−末端に付加された５個のヒスチジンを含むＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の幹細胞増生能力と比較して何らの影響がないことを示している。
【００２２】
このほか、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質との共培養を経て増殖したヒトＣＤ３４+臍帯血幹細胞（マウス一匹ごとに５０００個の細胞を与える）と、放射線照射を経た５×１０4個のＣＤ３４-補助細胞を、放射線照射（２．５Ｇｙ）を行ったNOD-LtSz-scid/scid（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスに合わせて注射した。移植後７週間経過したのち、移植を経た動物から得られた血液細胞中のヒトＣＤ４５+細胞の存在量をフローサイトメトリーによって分析した。結果、本発明によるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク処理を経た幹細胞が、ＢＳＡ処理を行った臍帯血幹細胞と同じ量だけＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄内に混入していた。さらに、このマウスの末梢血中のマウス白血球細胞に相当する部分に、０．０５％から０．０７％のヒトＣＤ４５陽性の白血球細胞が含まれていた。これは、増殖を経たこれらの幹細胞がなお多分化能（pluripotency）を保持していることを示している。
【００２３】
以上に示した産量分析および幹細胞増殖実験の結果は、本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質が宿主の大腸菌において高い精製率を得ることが可能であるのみならず、幹細胞増殖の能力に影響しないことも証明している。これは組み換えＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造・生産面において、極めて進歩性を備えたブレイクスルーであるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明であるC-末端に７個のヒスチジンタグを含むコンストラクトpTAT-HOXB4Hの構築過程を示す。
【図２】ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨコンストラクトのＤＮＡ配列（配列：４）。傍線（６）で示されているＣＡＴ配列は、ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈコンストラクト中のＣ−末端に添加されたヒスチジンタグのコーディング配列を示す。
【図３】本発明であるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈと既知のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４の精製後の産量の比較結果。矢印はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨおよびＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のタンパク質電気泳動の位置を指し、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈの精製後産量がＴＡＴ−ＨＯＸＢ４の約４倍に増加していることを示している。
【図４】ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ（白丸印）およびＴＡＴ−ＨＯＸＢ４（三角形）の生体外臍帯血幹細胞増殖促進の比較結果。ＣＤ３４+細胞数の測量値を表示した。コントロールはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）により処理した（黒丸印）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ−末端にヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）の作成に用いられるＤＮＡコンストラクトを構築することによって当該の組み換えタンパク質の精製効率を上げる方法に関するものであり、当該のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨはＣ−末端に６個またはそれ以上のヒスチジンタグを含む。本発明は、作成されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を用いて生体外の幹細胞を増殖させる方法、及びその組成物の使用に関し、一段の進歩をもたらすものである。
【背景技術】
【０００２】
臍帯血（umbilical cord blood;ＵＣＢ）は、嬰児の出生時に臍帯及び胎盤の内部に残留した血を指す。臍帯血は多くの「ゼロ歳」の原始幹細胞を含むが、その効用は骨髄に相当し、人体が製造する血液及び免疫系の主要な源である。臍帯血の幹細胞は全能細胞とも呼ばれ、胚に類似した「若い」かつ比較的未分化な細胞であることから、異なる形態の細胞や組織に発展することが可能であり、癌や血液疾病、さらには先天的な代謝疾病等の治療に用いることが可能である。臍帯血幹細胞の数と質は、いずれもその他の幹細胞と比較して優良であり、また臍帯血中の造血幹細胞及び母細胞の濃度は骨髄内の１０−２０倍であるため、その増殖能力も比較的高い。
【０００３】
その上、臍帯血の造血幹細胞は比較的未成熟（primitive; immature）なため、臍帯血中のT細胞は「自己」と「他者（non-self）」を弁別する能力が骨髄や末梢血の成熟した造血幹細胞に比べて低い傾向があり、よって移植片対宿主病（graft versus host disease; GVHD）や拒否反応（rejection）の発生を減少させることができ、少数派に対する移植の機会を増やすことが可能である。このほか、臍帯血幹細胞はペアリングに関する要求条件が比較的低い。非親族間の骨髄移植では６個の白血球抗原（ＨＬＡ）が全て符合していることが求められるが、臍帯血幹細胞移植では５個もしくは４個の抗原が一致すれば移植可能である。
【０００４】
臍帯血幹細胞の採集数量は有限であり、乳幼児に対する使用であれば良いが、成人に対する使用であればやや不足する。カナダ・モントリオール大学（University of Montreal）のGuy Sauvageau博士はかつて骨髄中の幹細胞の数が制限される現象について研究を行った。彼の研究はホメオボックス遺伝子（homeobox gene）であるＨＯＸＢ４が造血幹細胞の自己複製の調節に対して重要であり、骨髄中のコロニーの大きさを維持することができるということを示した。ＨＯＸ遺伝子が血球細胞で発現しうることを最初に証明したのは、ヒト及びラットの細胞株（cell line）を用いてのことである。いくつかのＨＯＸ遺伝子は異なる形態の細胞ではっきりと広範に発現し、また他のいくつかのＨＯＸ遺伝子は特定の細胞のみで活発に発現する。
【０００５】
例えば、ヒトのＨＯＸＢクラスター中の８個の遺伝子は、赤血球細胞の発育の初めに発現し、ＨＯＸＢ４及びＨＯＸＢ7を含むいくつかのＨＯＸＢ遺伝子はＴ細胞やＢ細胞でも発現する。Sauvageauらは、９個のＨＯＸＡ遺伝子、８個のＨＯＸＢ遺伝子及び４個のＨＯＸＣ遺伝子がＣＤ３４+骨髄細胞内で発現していること、またこのうちＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ９及びＨＯＸＡ１０がＣＤ３４+の細胞コロニー内の赤血球原始細胞において最も多く発現していることを証明した。このほか、実験結果によると、ＣＤ３４-細胞群においては、発現しているＨＯＸ遺伝子が全くないか、少数しか発現していないことも検出された。これにより、“ＨＯＸＢ４”タンパク質は生体外の造血幹細胞（ＨＳＣ）増殖に有効な刺激剤として最も常用されている。
【０００６】
遺伝子工学により作られた既知の組み換え“ＨＯＸＢ４”タンパク質は、タンパク質を細胞内に入れるため“ＨＯＸＢ４”タンパク質のＮ末端にＴＡＴ配列を結合している。このＴＡＴ配列は“ＨＯＸＢ４”タンパク質を細胞に入れた後、熱ショックタンパク９０（Ｈｓｐ９０）の助けによって“ＨＯＸＢ４”タンパク質を活性のある構造に折りたたむ。また、そのN−末端には６個のヒスチジン（Ｈｉｓ−６）からなるヒスチジンタグを含むことから、この組み換えタンパク質の精製及び回収を行う際に有利である。この外来性“ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４”組み換えタンパク質は造血幹細胞の増殖を２−６倍に促進しうる、ということが既に証明されている（Amsellem, S. et al., Nature Medicine 9, 1423-1427, 2003; Krosl, J. et al., Nature Medicine 9, 1428-1432, 2003）。しかし、このＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質は、宿主である大腸菌からの純化回収率が低いため、幹細胞を増殖させるために十分な量のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質を得るためには、大量の大腸菌発現細胞を培養し、煩雑な精製工程を用いることが必要である。
【０００７】
そこで、本発明はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の回収量を向上させることについて解決策を提示したい。その骨子は、Ｃ−末端にヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）組み換えタンパク質を生産するためのコンストラクト（発現した組み換えＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質はＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジン残基タグを持つ）を構築することにより、当該組み換えタンパク質の精製効率を向上する方法である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ひとつには、本発明はＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジンタグを含むＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の調製方法に関するものである。この方法には、ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＣ−末端に少なくとも６個のヒスチジンコーディング配列を持つＤＮＡコンストラクト（得られたコンストラクトを形質転換した宿主細胞においてＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質が発現する）の構築、及びこの組み換えタンパク質を精製することが含まれる。
【０００９】
技術語“発現ベクター”、“ポリヌクレオチドベクター”、“ＤＮＡコンストラクト”及び“ベクターコンストラクト”は、この領域の技術を熟知している人が理解している通り、本文中で交換して使用されうる用語であり、遺伝子組み換えに用いられたいかなるコンストラクトをも指す。
技術語“Histidine tag（ヒスチジンタグ、His tag）”は本文中において、少なくとも６個のヒスチジン残基を指す。本発明における実際の方法では、Ｃ−末端に７個のヒスチジンコーディングフラグメントを導入したＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅し、さらにこのDNAフラグメントクローンを適当な宿主細胞の中に入れて発現を進行させる。また別の実際の方法では、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を発現するベクターをテンプレートとしてＰＣＲ法で増幅するときに、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のＣ−末端のヌクレオチド配列中に５個のヒスチジンからなるコーディング配列を導入し、最終的に発現するＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質のＣ−末端に７個のヒスチジンタグが含まれるようにする。このコンストラクトを大腸菌に形質転換することで発現、製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の精製後の産量は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質の場合と比べて３−５倍になる。
【００１０】
もうひとつには、本発明はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクトに関するものである。その特徴は、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に導入された７個のヒスチジンタグにある。実際の方法においては、本発明のＤＮＡコンストラクトはプラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の方法を用いて製造されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、同様に幹細胞の増殖に用いることが可能である。このタンパク質は生体外で臍帯血幹細胞の増殖を６倍にし、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質と同様の効果があることが実験により証明されており、本発明の方法でＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質のＣ−末端に５個のヒスチジンを導入することで得られた改良型ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、宿主細胞からの精製効率（および精製後の産量）を増加させるのみならず、幹細胞の増殖にも有効であることを示している。
【００１２】
本発明のさらなる一面は、製造された新規ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４を含む組み換えタンパク質を用いて幹細胞増殖を行う際の幹細胞増殖用培地、及びその使用方法に関するものである。すなわち、幹細胞増殖に用いられる培地は、本発明の方法で得られた５−１００ｎＭのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質、及び幹細胞培養に適当な細胞栄養物質、細胞増殖因子及び抗生物質を含む。本発明における実際の方法では、増殖に用いられる幹細胞は臍帯血幹細胞であり、実際の方法で増殖に用いられる幹細胞は造血幹細胞である。
【００１３】
技術語“幹細胞”は、増殖・自己複製及び分化した次世代を大量に製造する能力を有する細胞を指す。幹細胞は分化、またはその他の細胞に変化する能力を持つ。このような細胞は通常胚の発育初期段階で得られ、適当な環境条件化で特定の組織と器官に変化することができる。
本申請の実施例による精製及び幹細胞増殖実験のデータが示すとおり、本発明の製造法により得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の精製効率（および精製後の産量）と比較して３−５倍高く、かつＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質に相当する幹細胞増殖促進能力を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に示した実施例は本発明の技術内容が達成できる効果を説明するものであるが、本発明を制約するものではない。本発明によって発生する如何なる均等な変化及び修飾も、全て本発明の特許請求の範囲が定める範疇に属する。
【００１５】
（実施例１：プラスミドｐＴＡＴ-ＨＯＸＢ４Ｈの構築）
プラスミドpTAT-HOXB4（Nature Medicine 9, 1428−1432（2003））を以下のような一対のプライマーを用いたPCR反応により増幅を進行させた。
5’−ctccatggctatgagttcttttttg−3’（配列：1）および
5’−atgatgatgatga tgatgatggagcgcgcgg−3’（配列：2）
この結果、HOXB4のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＣ-末端に４個の余剰ヒスチジン残基を含むフラグメント（図２）を得た。このように増幅して得たフラグメントを、再び以下の一対のプライマーを用いてPCR反応を行い、増幅した。
【００１６】
5’−ctccatggctatgagttcttttttg−3’（配列：1）および
5’−cagaattcctaatg atgatgatgatga−3’（配列：3）
この結果、３'末端に新たにＥｃｏＲＩの認識部位を有するフラグメントを得た。続いてこのフラグメントを制限酵素ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで切断したものと、またこのサブクローンと同じ二つの制限酵素で処理をして回収された元のpＴＡＴ−ＨＯＸＢ４プラスミドの骨格（これをフラグメントのＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位とつなぐ）とから、新規プラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈを製造した。本発明では、上述した特性を備える組み換えpＴＡＴ−ＨＯＸＢ４タンパク質をｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈと称する。
【００１７】
（実施例２：ＴＡＴ-ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質とＴＡＴ-ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質との精製及び産量の比較）
PＴＡＴ−ＨＯＸＢ４（もしくはｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）のベクターを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen）に形質転換した。形質転換を行った細胞を３７℃で一晩増殖させた。一晩経過後の培養物を、ＯＤ600（600nmにおける光密度値）が０．０５になるように希釈し、さらに３７℃でＯＤ600が０．５になるまで増殖させる。続いて1mMになるようにＩＰＴＧ（Isopropyl-秉och-D-thiogalactopyranoside）を加え、３７℃で３時間激しく振盪して発現を誘導する。誘導後、細胞を遠心分離法により収集し、さらに緩衝液Ａ（８Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid）、０．５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオスレイトール）および１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁する。
【００１８】
細胞懸濁液をフレンチプレス（French press）により三回破砕・圧搾し、細胞溶解液を２００００×ｇ、４℃条件下で３０分間遠心分離した。上清液にイミダゾールを１０ｍＭになるように調製して添加し、HisTrapキレーティングカラム（Amersham Pharmacia）に加えた。結合したタンパク質を５０、１００および２５０ｍＭの比率で緩衝液Ａ中に溶かしたイミダゾールによって溶出した。ＨＯＸＢ４（もしくはＨＯＸＢ４Ｈ）を含む溶出液を、緩衝液Ｂ（４Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）の存在下でＭｏｎｏＳＰカラムに加え、１．５Ｍ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）で溶出し、さらにＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムで脱塩した。ＰＢＳ（リン酸緩衝液）でＨＯＸＢ４（ＨＯＸＢ４Ｈ）タンパク質をＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムから溶出、溶出液の純度は＞９９％であった。全溶出物に１％のＢＳＡと１０％のグリセロールを加え、分注して−８０℃で急速冷凍した。
【００１９】
図３の電気泳動結果に示すとおり、本発明方法により生産されたＣ−末端に新たに５個のヒスチジンが付加されたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、宿主である大腸菌からの回収産量が元のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量に比べて約３−５倍に増加している。ブラッドフォード法により組み換えタンパク質の産量を以下のように定量した。既知の濃度のＢＳＡのＯＤ595をプロットしたものを利用して標準曲線を描き、内挿法によりサンプル中のタンパク質含量を計算した結果、得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量は５．５ｍｇ／Ｌ、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量は１．２ｍｇ／Ｌであると判明した。
【００２０】
（実施例３：TAT-HOXB4H組み換えタンパク質の造血幹細胞の増殖に対する能力）
ヒト臍帯血中の赤血球を、４℃の０．１％炭酸水素ナトリウムを含む０．８３％塩化アンモニウム（ｐＨ７．０）溶液中で溶解し除去した。収集した白血球部分を、磁性ビーズを結合させた特定の抗体と共に培養した後、Ｓｔｅｍｓｅｐカラム分離法により磁性細胞分離を行い、ＣＤ３４+を持つ細胞を収集し、成熟ヒト白血球細胞を発現している部分を除去した。精製された細胞を幹細胞培地（ＤＭＥＭ、以下の物質を含む。１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５ｎｇ／ｍｌインターロイキン−３、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−６、１００ｎｇ／ｍｌ ＳＴＦ（幹細胞成長因子）、ペニシリン１００単位/ml、及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）中で２日間培養し、その後１５ｎＭ ＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）もしくは１％ＢＳＡを含む幹細胞培地中で４日間培養した。培養の３日目（処理当日を０日とする）に、４×１０5細胞／ｍｌとなるように、ＢＳＡもしくはＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）を補充した幹細胞培地中に再懸濁した。この後３時間ごとに新鮮なＢＳＡもしくはＨＯＸＢ４（またはＨＯＸＢ４Ｈ）タンパク質を添加した（総培地の５％に最初のタンパク質量の５０％が含まれている）。１２時間経過後、ＦＣＳと細胞因子を加え、希釈濃度が培地中に含まれる正確な量の２０％になるように校正する。２４時間経過後、目標タンパク質を含む新鮮培地中に細胞を再懸濁する。処理の０、２および４日目にＩＳＨＡＧＥ法（ＣＤ４５／ＣＤ３４染色と正面および側面からの散乱光）により幹細胞数を計測した。
【００２１】
図４の結果が証明するとおり、本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は臍帯血幹細胞の増殖を約６倍にすることができ、この効果は既知のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質に相当する。本発明により製造されたＣ−末端に付加された５個のヒスチジンを含むＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質は、もとのＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の幹細胞増生能力と比較して何らの影響がないことを示している。
【００２２】
このほか、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質との共培養を経て増殖したヒトＣＤ３４+臍帯血幹細胞（マウス一匹ごとに５０００個の細胞を与える）と、放射線照射を経た５×１０4個のＣＤ３４-補助細胞を、放射線照射（２．５Ｇｙ）を行ったNOD-LtSz-scid/scid（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウスに合わせて注射した。移植後７週間経過したのち、移植を経た動物から得られた血液細胞中のヒトＣＤ４５+細胞の存在量をフローサイトメトリーによって分析した。結果、本発明によるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク処理を経た幹細胞が、ＢＳＡ処理を行った臍帯血幹細胞と同じ量だけＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの骨髄内に混入していた。さらに、このマウスの末梢血中のマウス白血球細胞に相当する部分に、０．０５％から０．０７％のヒトＣＤ４５陽性の白血球細胞が含まれていた。これは、増殖を経たこれらの幹細胞がなお多分化能（pluripotency）を保持していることを示している。
【００２３】
以上に示した産量分析および幹細胞増殖実験の結果は、本発明のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質が宿主の大腸菌において高い精製率を得ることが可能であるのみならず、幹細胞増殖の能力に影響しないことも証明している。これは組み換えＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈタンパク質の製造・生産面において、極めて進歩性を備えたブレイクスルーであるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明であるC-末端に７個のヒスチジンタグを含むコンストラクトpTAT-HOXB4Hの構築過程を示す。
【図２】ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨコンストラクトのＤＮＡ配列（配列：４）。傍線（６）で示されているＣＡＴ配列は、ｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈコンストラクト中のＣ−末端に添加されたヒスチジンタグのコーディング配列を示す。
【図３】本発明であるＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈと既知のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４の精製後の産量の比較結果。矢印はＴＡＴ−ＨＯＸＢ４ＨおよびＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のタンパク質電気泳動の位置を指し、ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈの精製後産量がＴＡＴ−ＨＯＸＢ４の約４倍に増加していることを示している。
【図４】ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ（白丸印）およびＴＡＴ−ＨＯＸＢ４（三角形）の生体外臍帯血幹細胞増殖促進の比較結果。ＣＤ３４+細胞数の測量値を表示した。コントロールはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）により処理した（黒丸印）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレーム中のＣ−末端に、少なくとも6個のヒスチジンのコーディングフラグメントを含むＤＮＡコンストラクトを構築し、得られたコンストラクトを宿主細胞に形質転換してＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を発現させ、宿主細胞の溶解産物から組み替えタンパク質を精製し、ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）を製造する方法。
【請求項２】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応により付加的な５個のヒスチジンのコーディング配列がＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ末端に追加されることを特徴とする請求項１に記載のＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を製造する方法。
【請求項３】
宿主細胞として大腸菌を用いることを特徴とする請求項１に記載のＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を製造する方法。
【請求項４】
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に７個のヒスチジンタグを導入していることを特徴とするＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
ＤＮＡコンストラクトがプラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈであることを特徴とする請求項4に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
５ｎＭ〜１００ｎＭの請求項１に述べた方法で得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質および幹細胞増殖に適した細胞栄養物質・細胞増殖因子と抗生物質を含む幹細胞増殖に用いられる培地。
【請求項７】
幹細胞が臍帯血幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞増殖に用いられる培地。
【請求項８】
幹細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞増殖に用いられる培地。
【請求項１】
ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレーム中のＣ−末端に、少なくとも6個のヒスチジンのコーディングフラグメントを含むＤＮＡコンストラクトを構築し、得られたコンストラクトを宿主細胞に形質転換してＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質を発現させ、宿主細胞の溶解産物から組み替えタンパク質を精製し、ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質（ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ）を製造する方法。
【請求項２】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、ポリメラーゼ連鎖反応により付加的な５個のヒスチジンのコーディング配列がＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ末端に追加されることを特徴とする請求項１に記載のＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を製造する方法。
【請求項３】
宿主細胞として大腸菌を用いることを特徴とする請求項１に記載のＨＯＸＢ４組み換えタンパク質を製造する方法。
【請求項４】
ＴＡＴ−ＨＯＸＢ４のオープンリーディングフレームのＣ−末端に７個のヒスチジンタグを導入していることを特徴とするＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
ＤＮＡコンストラクトがプラスミドｐＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈであることを特徴とする請求項4に記載のＴＡＴ−ＨＯＸＢ４組み換えタンパク質の産量の増加に用いられるＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
５ｎＭ〜１００ｎＭの請求項１に述べた方法で得られたＴＡＴ−ＨＯＸＢ４Ｈ組み換えタンパク質および幹細胞増殖に適した細胞栄養物質・細胞増殖因子と抗生物質を含む幹細胞増殖に用いられる培地。
【請求項７】
幹細胞が臍帯血幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞増殖に用いられる培地。
【請求項８】
幹細胞が造血幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の幹細胞増殖に用いられる培地。
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図２】
【図４】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５２５７３１（Ｐ２００９−５２５７３１Ａ）
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５３６００（Ｐ２００８−５５３６００）
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９０３１７
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０７２５３５０９）タイワン アドバンス バイオ―ファーム インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月１６日（２００９．７．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１１日（２００６．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２００６／０００６４６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９０３１７
【国際公開日】平成１９年８月１６日（２００７．８．１６）
【出願人】（５０７２５３５０９）タイワン アドバンス バイオ―ファーム インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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