ＩＬ−１７媒介性トランスフェクション法
本発明は、細胞生存及びタンパク質産生の優れた、向上した特性をもたらすＩＬ−１７媒介トランスフェクションのための組成物及び方法を含む。本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いて細胞株の特性を向上させ、細胞、細胞株又は細胞集団のサブクローニングを強化し、細胞株の選択を改善し、及び／又は選択された細胞株内における１種以上の外因性遺伝子の発現を向上させるための組成物及び方法を提供する。本発明により包含される方法及び組成物は、ＩＬ−１７を用いて細胞及び／又は細胞株の１つ以上の特徴及び／又は生物学的効果を向上させる新規な方法となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００８年１０月７日に出願された米国仮出願第６１／１９５，４３６号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体として細胞生物学、細胞培養及び分子生物学の分野に関する。本発明は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７）及び関連タンパク質を使用して遺伝子送達、細胞生存、コロニー成長及びタンパク質産生の優れた、改善された特性をもたらすための組成物及び方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
細胞生物学、細胞培養及び分子生物学の分野では、例えば増殖速度、生成クローン数、産生能などの特定の特徴を有する細胞株を選択することが望まれる。細胞株を生成させ、選択するための多くの方法が開発されているが、細胞株の性能、選択及び他の諸特性を改良することが現在もなお必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いて細胞株の特性を向上させ、細胞、細胞株又は細胞集団のサブクローニングを強化し、細胞株の選択を改善し、及び／又は選択された細胞株内における１種以上の外因性遺伝子の発現を向上させるための組成物及び方法を提供する。本発明により包含される方法及び組成物は、ＩＬ−１７を用いて細胞及び／又は細胞株の１つ以上の特徴及び／又は生物学的効果を向上させる新規な方法となる。こうしたＩＬ−１７を媒介させた方法及び組成物は、１つ以上の望ましい特性、特徴又は他の生物学的効果を示す細胞及び／又は細胞株を作製、サブクローニング及び／又は選択するのに有用である。さらに、ＩＬ−１７を既知の方法と組み合わせて用いると、細胞株の発現、選択、サブクローニング及び／又は有効性の中の１つ以上の特性が意外にも首尾良く改善される。例えば、本発明に包含される組成物及び方法は、必要とする患者に投与されることになる医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体の収量の増大をもたらす。さらに、本方法によって、治療用組成物の開発研究において以前はトランスフェクション抵抗性であった細胞株を使用することが可能となる。最後に、本方法により、選択された細胞の大規模かつ迅速で効率的なスクリーニングが可能となる。何故なら、ＩＬ−１７の使用によって効率、産生能及び／又は細胞選択速度、サブクローニング及び／又は単一細胞クローニング、外因性遺伝子発現並びに他の望ましい特性が向上するからである。従って、本発明によって提供される方法は、大がかりな薬剤開発に適用することができる。また、本明細書に提供された組成物及び方法は、細胞及び組織培養補助剤及び誘導体においても用いられる。
【０００５】
本明細書において提供された方法及び組成物により、細胞及び／又は細胞株、細胞選択、サブクローニング及び／又は細胞改変（例えば、細胞トランスフェクション）の１つ以上の特性が向上する。ＩＬ−１７の使用により向上する特性の例としては、増大した効率、向上した選択率（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度（即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様では、本明細書において提供される方法及び組成物により、上記特性の２つ以上の任意の組合せが向上する。
【０００６】
具体的には、本発明は、ＩＬ−１７を用いて細胞及び／又は細胞株産生、細胞及び／細胞株選択、サブクローニング、及び／又は核酸による細胞及び／又は細胞株トランスフェクションの特性を向上させる方法であって、細胞をＩＬ−１７と接触させる工程を含む方法を提供する。外因性ＩＬ−１７を作用させることによって、ＩＬ−１７を接触させない細胞の場合に比し、細胞の産生、選択、サブクローニング及び／又は上記核酸の発現を向上させることが好ましい。この外因性ＩＬ−１７は、例えば、ＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞からのものである。
【０００７】
本発明は、ＩＬ−１７を用いて細胞の産生、サブクローニング、単一細胞クローニング及び／又は選択の効果を向上させる組成物及び方法であって、培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程並びにこうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）をＩＬ−１７含有組成物と接触させて、例えば増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度 （即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性など、細胞及び／又は細胞株の特性を向上させる工程を含む組成物及び方法を提供する。任意選択的に、こうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）は、核酸と接触させて培地中で培養することによりこの核酸によりコードされたポリペプチドを発現させることで、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞及び／又は細胞株が生成される。こうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）は、これらが目的とするポリペプチドをコードしている上記核酸と接触させる前に、又は接触中にＩＬ−１７を作用させる。
【０００８】
さらに、本発明は、細胞改変の効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、（ｂ）１以上の細胞（単数又は複数）又は細胞株（単数又は複数）を核酸と接触させる工程、（ｃ）改変細胞を培地中で培養してこの核酸によりコードされているポリペプチドを発現させ、細胞は上記接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７を作用させるものとする工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、１以上の形質転換細胞又は細胞株を培地中で培養し、ＩＬ−１７と接触させるなどして作用させるサブクローニング及び／又は単一細胞クローニングの効果及び／又は産生能を向上させる方法であって、こうした接触させた細胞（単数又は複数）又は細胞株（単数又は複数）はサブクローニング及び／又は単一細胞クローニング向上した特性を示す方法を提供する。上記の組成物及び方法を用いることにより、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度（即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性など、サブクローニング及び／又は単一細胞クローニング特性が向上する。例えば、この方法を用いることによって１種以上の真核細胞、例えばヒト細胞のサブクローニング及び／又は単一細胞クローニングの効果、効率、産生能及び／又は選択が向上する。一部の実施態様では、こうした細胞（単数又は複数）は無血清培地、好ましくは既知組成培地中で培養する。本明細書において提供される方法は、極めて低い細胞株密度でも、例えば、１個／ｍＬ乃至１０，０００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５，０００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至２５０個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至１００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５０個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至２５個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至１２．５個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至６．２５個／ｍＬの範囲、又は１個／ｍＬ乃至３．１２５個／ｍＬの範囲でも真核細胞株をサブクローニングするのに有用である。
【００１０】
一実施態様では、こうした細胞及び／又は細胞株をＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている第二の核酸でトランスフェクションし、この細胞をこれらの第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に培養する。或いは、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている上記第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている上記第二の核酸を２種の細胞及び／又は細胞株にトランスフェクションし、これらの細胞を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に一緒に培養する。これらのＩＬ−１７トランスフェクトした細胞及び／又は細胞株では、ＩＬ−１７サイトカインを目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と共に同時発現させることによって、１種以上のトランスフェクション特性の向上、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性などがもたらされる。
【００１１】
さらに好ましい実施態様では、こうした細胞及び／又は細胞株をＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている第二の核酸でトランスフェクションし、この場合、ＩＬ−１７をコードしている核酸の発現は、例えば、誘導プロモーターの使用、ＣｒｅＬｏｘＰもしくはこれと同等物による不活化又は選択及び／又はサブクローニングプロセスの下流における亜鉛フィンガー不活化を含む当該技術分野において認知されている各種方法のいずれかによって調節するものとする。或いは、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている上記第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている上記第二の核酸を２種の細胞及び／又は細胞株にトランスフェクションし、これらの細胞を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に一緒に培養する。次に、これらの細胞及び／又は細胞株を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に培養する。
【００１２】
これらのＩＬ−１７トランスフェクトした細胞及び／又は細胞株では、ＩＬ−１７サイトカインを目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と共に同時調節発現させることによって、１種以上のトランスフェクション特性の向上、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性などがもたらされる。
【００１３】
本明細書において提供される組成物及び方法では、ＩＬ−１７の発現を、例えば、誘導プロモーターの使用、ＣｒｅＬｏｘＰもしくはこれと同等物による不活化又は選択及び／又はサブクローニングプロセスの下流における亜鉛フィンガー不活化を含む当該技術分野において認知されている各種方法のいずれかによって調節する。好適な誘導プロモーターとしては、例えば、ラパマイシン誘導性二量体化技術を用いるシステム、ステロイドホルモン受容体を利用するシステム、ＴＥＴシステムなどのテトラサイクリンシステム、ＰＩＰシステムなどのストレプトグラミンシステム、Ｅ．ＥＲＥＸシステムなどのマクロライドシステムなどの異種遺伝子発現調節システムが挙げられる。これらの異種遺伝子発現調節システムでは、調節配列は、ｈＣＭＶプロモーター又はＥｆ１アルファプロモーターのような強力なプロモーターの部分配列に融合させる。
【００１４】
ＩＬ−１７は、細胞選択及び／又は改変の前、中又は後に細胞と接触させる。或いは、又はさらに、ＩＬ−１７は細胞と連続的に接触させる。ＩＬ−１７を細胞に接触させるいくつかの手段が上記方法の内に想定されている。一実施態様では、ＩＬ−１７は、培養培地中に存在させることによって細胞と接触させる。別の実施態様では、ＩＬ−１７は細胞によって外因性に産生させる、例えば、このＩＬ−１７は、ＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞（単数又は複数）によって産生させる。関連の実施態様では、上記方法の核酸は、ＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む。さらに、ＩＬ−１７はこの核酸と同時的又は逐次的に産生させる。
【００１５】
上記方法は、選択圧下の細胞又は細胞株を含む。一実施態様では、この選択圧は、トランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）である。この細胞選択において、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの存在下に培地中のＭＳＸの濃度を（例えば、５０μＭ超に）増大させることで、選択圧を増大させると、産生能が増大した。ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの非存在下に選択圧を増大させると、クローンが存在しなくなった。従って、ＩＬ−１７Ｆを添加して選択圧を増大させることにより、本明細書において提供される方法の生産性が増大する。
【００１６】
選択圧を加える場合、上記改変は準安定的である。或いは、選択圧を加える場合、上記改変は安定的である。別の実施態様では、上記改変細胞は選択圧の非存在下に増殖し、従って、その改変は一過性なものである。
【００１７】
上記方法及び組成物は、本明細書においてＩＬ−１７サイトカインとも称するＩＬ−１７ポリペプチドを用いることによって細胞トランスフェクションの１種以上の特性を向上させる。本発明によって包含されるＩＬ−１７ポリペプチド類又はサイトカイン類の例としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥもしくはＩＬ−１７Ｆ及びこれらＩＬ−１７ポリペプチド類のヘテロダイマー、例えばＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロダイマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｆサイトカインを用いる。ＩＬ−１７ポリペプチド類は、例えば、本明細書に示したヒトＩＬ−１７配列類を含むヒトＩＬ−１７配列類である。一部の実施態様では、ＩＬ−１７ポリペプチド類及びＩＬ−１７組成物として、例えばラットＩＬ−１７配列などの非ヒト哺乳動物の配列を含む真核生物の配列が挙げられる。一実施態様では、細胞又は細胞株（単数又は複数）として、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７細胞が挙げられる。一部の実施態様では、上記方法の細胞又は細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。ＩＬ−１７受容体類（ＩＬ−１７Ｒｓ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の方法は、１種以上のＤＮＡ及び／又はＩＬ−１７組成物を受け入れ、選択圧下の培養で増殖してこれらの組成物を保持する細胞を含む。一実施態様では、この選択圧は、上記ＤＮＡ組成物を受け入れているトランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）である。別の実施態様では、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培養培地（ＨＴ培地：ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を用いることでＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）欠損トランスフェクトした細胞を選択する。一部の実施態様では、選択及び遺伝子増幅のための系においてメトトレキサート（ＭＴＸ：ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を用いる。
【００１９】
本発明の方法及び組成物はトランスフェクション特性を向上させる。本発明の方法及び組成物は細胞産生特性を向上させる。本発明の方法及び組成物は選択特性を向上させる。本発明の方法及び組成物はサブクローニング及び／又は単一細胞クローニング特性を向上させる。本方法によって向上する特性の例としては、トランスフェクション効率の増大、向上した選択率、トランスフェクション増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の方法は、１種以上の外因性遺伝子の発現を増強する。発現が増強されるメカニズムの例としては、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性トランスフェクション後の発現増大、増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み又は外因性ＤＮＡの増大した発現が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、準安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成されるものとする方法を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株を生成させるものとする方法を提供する。
【００２３】
本発明は、準安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物を生成させるものとする方法を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株を生成させるものとする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトＩＬ−１７Ｆと抗ＲＡＮＴＥＳモノクローナル抗体（国際公開第０９／０５４８７３号に記載されており、本明細書ではＮＩ−０７０１と称す）との間で、安定的トランスフェクションをコロニー出現の速度及び率について比較したグラフである。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図２】図２Ａは、ヒトＩＬ−１７Ｆを用いた安定的トランスフェクションをウェル当たりの複数のトランスフェクタントの存在について比較したグラフである。図２Ｂは、ＮＩ−０７０１を用いた安定的トランスフェクションをウェル当たりの複数のトランスフェクタントの存在について比較したグラフである。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−１７Ｆを発現する準安定的トランスフェクションプールの目視検査結果を示す一連の写真である。写真は各々の示された時点で１００倍の倍率の蛍光顕微鏡を用いて撮られたものである。
【図４】図４Ａは、組換えヒトＩＬ−１７Ｆを補充し、又は補充しなかったＡ６ＶＬ構築体の準安定的トランスフェクションをＧＦＰ発現について比較したグラフである。図４Ｂは、組換えヒトＩＬ−１７Ｆを補充し、又は補充しなかったＡ６ＶＬ構築体の準安定的トランスフェクションを細胞生存率について比較したグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びＡ６ＶＬ構築体との間で、安定的トランスフェクションをコロニー出現の速度及び率について比較したグラフである。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で安定的トランスフェクションを比較したグラフである。安定的トランスフェクションはコロニー出現の速度及び率について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。準安定的トランスフェクションはＧＦＰ発現について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。準安定的トランスフェクションは細胞生存率について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間でコロニー出現の速度及び率について評価して安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間でＧＦＰ発現について評価して準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で細胞生存率について評価して準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図８】図８Ａは、ピューロマイシン選択を利用した発現ベクター系（ｐＥＡＫ８、Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＣＨＯ細胞中へのＩＬ−１７ ＩＲＥＳ ＧＦＰ変異体間の安定的トランスフェクションを比較したグラフである。ＧＦＰ発現分析結果はＰＥＡＫ細胞においてトランスフェクション後２４時間にフローサイトメトリーを用いて測定した。図８Ｂは、図８Ａの説明に記載したトランスフェクション手順に続くピューロマイシンによる選択の３週間後のＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現を比較したグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後１乃至４週間における抗ＣＤ３モノクローナル抗体（国際公開第０５／１１８６３５号に記載されており、本明細書では１５Ｃ１ ＭＡｂと称する）の産生を比較したグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後２２及び２６日における９６−穴プレート当たり１個以上のコロニーを含むウェルの数を比較したグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後の２０クローンの各々の上清における１５Ｃ１ ＭＡｂの発現レベル（μｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＥＥ１４．４ ＬＳＣＤ３３ＨＩＳ ＡＶＩ ｈＩＬ−１７Ｆ ｎ １−７発現ベクターの模式図、即ち、マップである。
【図１１】図１１Ａは、２種のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株、即ちＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現する８Ｅ１１及び無関連のｍＡｂを発現するＣ６Ｃ５からの細胞をプレートした後３日に採取した単離クローンの定量結果を示すグラフである。図１１Ｂは、図１１Ａにおいて採取したサブクローンを示す図である。図１１Ｃは、図１１Ａにおいて採取したサブクローンを示す図である。
【図１２】図１２は、ＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現カセットでトランスフェクションし、５０μＭ又は１００μＭ ＭＳＸ選択圧下にプレートした細胞からのクローンにおけるＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本明細書に記載した実施例に用いたベクター構築体を示す一連のグラフである。
【図１４】図１４は、トランスフェクション後の種々の時間における安定的ＣＨＯＤＧ４４細胞クローンの出現を示したグラフである。
【図１５】図１５は、ＭＴＸ圧下選択の５週間後のＣＨＯＤＧ４４細胞におけるクローンＧＦＰ発現のレベルを示したグラフである。
【図１６】図１６は、トランスフェクション後の種々の時間における安定的ＣＨＯ細胞クローンの出現を示したグラフを示したグラフである。
【図１７】図１７は、トランスフェクション後４週における個々のクローンのＩｇＧ発現の平均レベルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いてトランスフェクション特性を向上させ、トランスフェクトした細胞株内における１種以上の外因性遺伝子の発現を増強するための組成物及び方法を提供する。本発明によって包含される方法は、ＩＬ−１７によって媒介される新規なトランスフェクション方法となる。さらに、ＩＬ−１７を既知の方法と組み合わせて用いると、トランスフェクション効果の１種以上の特性、例えば、生存、増殖及び／又は導入遺伝子発現が意外にも首尾良く改善される。
【００２７】
ＩＬ−１７組成物
ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上のポリヌクレオチド配列を含む。包含されるＩＬ−１７サイトカイン類としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆ（イソ型１及び２、ＭＬ−１とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましいＩＬ−１７サイトカイン類としては、ＩＬ−１７Ｆの２つのイソ型が挙げられる。ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカインを含む１種以上のポリペプチド配列を含む。さらに、ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカイン受容体（ＩＬ−１７Ｒ）を含む１種以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む。包含されるＩＬ−１７サイトカイン受容体類としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＩＬ−１７組成物は、本明細書に記載したＩＬ−１７サイトカイン類及び／又はＩＬ−１７Ｒ受容体類の中の１種以上に類似の構造を有するポリペプチド類及びタンパク質類を含む。また、ＩＬ−１７組成物は、本明細書に記載したＩＬ−１７サイトカイン類及び／又はＩＬ−１７Ｒ受容体類の中の１種以上の断片又はその他のプロセッシングされた部分、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、ＩＬ−１７Ｒ受容体及びこれらの任意のホモ二量体又はヘテロ二量体の細胞内プロセッシングに由来する断片を含む。本発明の一実施態様では、少なくとも１種のＩＬ−１７サイトカインを含む組成物を少なくとも１種のＩＬ−１７Ｒを発現し、過剰発現し、又はその発現を抑制する細胞又は細胞株に投与する。この実施態様では、組成物中に存在するＩＬ−１７サイトカインの適用量を増やすか減らして変更し、ＩＬ−１７Ｒの発現レベルを補償する。例えば、ＩＬ−１７Ｒの発現レベルが高い場合、組成物にはより低いレベルのＩＬ−１７サイトカインを少なくとも１種含める。逆に、少なくとも１種のＩＬ−１７Ｒの発現が低い場合、組成物にはより高いレベルのＩＬ−１７サイトカインを少なくとも１種含める。
【００２８】
包含されるヒトＩＬ−１７配列を以下に示したが、ＩＬ−１７組成物は非ヒト哺乳動物の配列を含む真核生物の配列を含む。さらに、ＩＬ−１７組成物はこれらの配列に沿った任意の点における１種以上の突然変異を含む。想定されている突然変異はＩＬ−１７サイトカインの１種以上の機能を妨害するものである。例えば、想定されている突然変異によってＩＬ−１７のＩＬ−１７受容体への結合又はＩＬ−１７受容体からの遊離が阻止される。或いは、又はさらに、想定されている突然変異によってＩＬ−１７の発現、翻訳、分泌、二量体化又は分解が阻止される。ＩＬ−１７の突然変異は細胞外又は細胞内にＩＬ−１７の集合体をもたらす。ポリヌクレオチドレベルにおける突然変異はサイレントであるか、読み枠シフト、置換、欠失、逆転、ミスセンス突然変異又は終結を含むポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化をもたらす。ポリペプチドレベルにおける突然変異はサイレントであるか、アミノ酸配列の変化、翻訳の阻止もしくは終結、三次構造の崩壊、誤った折り畳み、凝集、二量体化の崩壊、分解の中断、タンパク質の不安定性、他のポリペプチドとの相互作用の崩壊、又はポリペプチドとの新規な会合をもたらす。
【００２９】
好ましい実施態様では、ＩＬ−１７組成物は、ヒトｃＤＮＡ又はラットサイトカイン・インターロイキン１７Ｆ（ｒＩＬ−１７Ｆ：ｒａｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ Ｆ）から単離した後、ｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングしたヒトサイトカイン・インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ又はｈＩＬ−１７Ｆ：ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７Ｆ）を含む。この発現ベクターにおいて、同じＣＭＶプロモーターの制御下に第二のシストロンとしてｈＩＬ−１７Ｆ ｃＤＮＡの下流にＧＦＰをクローニングする。これら２種のシストロン（ＩＬ−１７Ｆ及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）によって隔てることにより上記第二の（ＧＦＰ）シストロンの翻訳が可能となる。また、このベクターは、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地中でのトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子を含む。
【００３０】
一部の実施態様では、本明細書に記載したベクターはタグその他のマーカ（又はタグもしくはマーカをコードしている核酸配列）、例えば、Ａｖｉタグ又はＨｉｓタグなども含む。他の実施態様では、こうしたベクターはタグ又はタグをコードしている核酸配列を含まない。
【００３１】
想定されているヒトＩＬ−１７サイトカインとして、例えば以下の配列を記載したが、これらに限定されるものではない。以下のｍＲＮＡ又はアミノ酸配列に沿った１箇所以上に突然変異が設計される。
【００３２】
ＩＬ−１７Ａは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２１９０及び配列番号１）によってコードされている：
【００３３】
【化１】
ＩＬ−１７Ａは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２１８１．１及び配列番号２）によってコードされている：
【００３４】
【化２】
ＩＬ−１７Ｂは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１５２０９８及び配列番号３）によってコードされている：
【００３５】
【化３】
ＩＬ−１７Ｂは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＦ２８１０４．１及び配列番号４）によってコードされている：
【００３６】
【化４】
ＩＬ−１７Ｃは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１３２７８及び配列番号５）によってコードされている：
【００３７】
【化５】
ＩＬ−１７Ｃは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３７４１０．１及び配列番号６）によってコードされている：
【００３８】
【化６】
ＩＬ−１７Ｄは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１３８２８４及び配列番号７）によってコードされている：
【００３９】
【化７】
ＩＬ−１７Ｄは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６１２１４１．１及び配列番号８）によってコードされている：
【００４０】
【化８】
ＩＬ−１７Ｅは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ３０５２００及び配列番号９）によってコードされている：
【００４１】
【化９】
ＩＬ−１７Ｅは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＧ４０８４８．１及び配列番号１０）によってコードされている：
【００４２】
【化１０】
ＩＬ−１７Ｆ、転写産物１、は以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０５２８７２及び配列番号１１）によってコードされている：
【００４３】
【化１１】
ＩＬ−１７Ｆ、転写産物１、は以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿４４３１０４．１及び配列番号１２）によってコードされている：
【００４４】
【化１２】
ＭＬ−１、ＩＬ−１７Ｆ転写産物２、は以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ３３２３８９及び配列番号１３）によってコードされている：
【００４５】
【化１３】
ＭＬ−１、ＩＬ−１７Ｆ転写産物２、は以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＬ１４４２７．１及び配列番号１４）によってコードされている：
【００４６】
【化１４】
ＤＮＡ組成物
本発明のＤＮＡ組成物は全てのポリヌクレオチド又はこれらの断片を含む。上記方法の想定されているＤＮＡ組成物は線状化ＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は組換えＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は環状又は線状化組換えＤＮＡ配列を含む。或いは、又はさらに、ＤＮＡ組成物はＭＡｂ組成物を含む。ＤＮＡ組成物は内因性又は外因性配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は導入遺伝子、例えば、ＩＬ−１７導入遺伝子を含む。
【００４７】
本方法のＤＮＡ組成物に含まれるＤＮＡ配列の例としては、ポリヌクレオチドをコードしている配列、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、干渉又はサイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリジオキシリボヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、モルホリノ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、シグナルタンパク質、Ｇタンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、細胞内発現抗体、ホルモン、受容体、細胞質タンパク質、膜結合タンパク質、分泌タンパク質及び／又は転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ組成物は少なくとも１種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。本発明のＭＡｂ組成物はＮＩ−０７０１発現ベクター又は１５Ｃ１抗体を含む発現ベクターを含む。この発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・ラムダ２定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体ＮＩ−０７０１の重及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、上記ＮＩ−０７０１ベクターはＳＶ４０プロモーターの制御下にグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子をも含む。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【００４９】
方法
本発明は核酸での細胞の改変の特性を向上させるためにＩＬ−１７を使用する方法であって、細胞をＩＬ−１７と接触させる工程を含む方法を提供する。この方法の別の実施態様では、ＩＬ−１７を作用させることがＩＬ−１７に接触させない細胞の場合に比し、核酸の発現を増強する。
【００５０】
さらに、本発明は、細胞改変の効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、（ｂ）１以上の細胞又は細胞株を核酸と接触させる工程、（ｃ）改変細胞を培地中で培養して該核酸によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、細胞は上記接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７を作用させるものとし、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される方法を提供する。
【００５１】
上記方法は、選択圧下の細胞又は細胞株を含む。一実施態様では、この選択圧は、トランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）である。この細胞選択において、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの存在下に培地中のＭＳＸの濃度を（例えば、５０μＭ超に）増大させることで、選択圧を増大させると、産生能が増大した。ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの非存在下に選択圧を増大させると、クローンが存在しなくなった。従って、ＩＬ−１７Ｆを添加して選択圧を増大させることにより、本明細書において提供された方法の生産性が増大する。
【００５２】
選択圧を加える場合、上記改変は準安定的である。或いは、選択圧を加える場合、上記改変は安定的である。別の実施態様では、上記改変細胞は選択圧の非存在下に増殖し、従って、その改変は一過性なものである。
【００５３】
上記方法の細胞又は細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。ＩＬ−１７受容体類（ＩＬ−１７Ｒ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施態様では、細胞又は細胞株（単数又は複数）として、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７細胞が挙げられる。本発明によって包含されるＩＬ−１７ポリペプチド類又はサイトカイン類の例としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥもしくはＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｆサイトカインを用いる。
【００５４】
本発明の想定されている細胞又は細胞株（単数又は複数）としては、例えば哺乳動物細胞を初めとする真核細胞が挙げられる。一部の実施態様では、上記細胞又は細胞株（単数又は複数）はヒト細胞を含む。別の実施態様では、本発明は幹細胞、全能細胞、多分化能細胞又は多能性細胞を含む。別の実施態様では、本発明は不死化細胞を含む。別の実施態様では、培養に一次細胞を用いる。さらに別の実施態様では、培養にハイブリドーマ細胞を用いる。本発明は、上記の諸細胞型又は諸細胞集団を単独又は混合物として用いることを含む。上記諸細胞型は同時に又は逐次的に使用する。上記の諸細胞型又は諸細胞集団の組合せは任意の組合せが想定されており、こうした組合せは本発明に包含される。
【００５５】
上記方法は多数の細胞改変方法を含む。細胞改変方法の例としては、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法、微量注入法、遺伝子銃法、エンドサイトーシス法、小胞融合法、及びリポフェクション法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。或いは、又はさらに、細胞改変は、例えばパルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びヘルペスウイルスをベースとしたベクターを含む種々のウイルスをベースとした遺伝子送達システムのいずれかを用いて行う。或いは、又はさらに、本発明の核酸は、この核酸の細胞又は細胞株内への輸送を促進する化合物に結合、連結、動作可能なように連結、融合又は係留させる。一実施態様では、カチオン性ポリマーに核酸を結合させる。別の実施態様では、ナノ粒子に核酸を連結させる。第三の実施態様では、リン酸カルシウムに核酸を結合させる。
【００５６】
上記方法は、細胞改変の１種以上の特性を向上させる。向上する特性の例としては、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
上記方法は、細胞をＩＬ−１７と接触させることにより上記核酸の発現を増強する。核酸発現特性の例としては、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本発明は、第１のプロモーター配列の制御下の１種以上のＩＬ−１７サイトカインポリヌクレオチド配列及び第１のプロモーター配列の制御下のＩＬ−１７サイトカイン配列の下流のレポータ遺伝子配列を含有する少なくとも１種の発現ベクターを含むＩＬ−１７組成物であって、上記のＩＬ−１７サイトカインとレポータ遺伝子配列とはウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列によって隔てられているものとし、上記発現ベクターは第２のプロモーター配列の制御下の選択遺伝子をさらに含むものとするＩＬ−１７組成物を提供する。
【００５９】
上記ＩＬ−１７サイトカイン配列は哺乳動物の配列である。ＩＬ−１７配列の哺乳動物供給源の例としては、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、このＩＬ−１７サイトカイン配列はラットの配列又はヒトの配列である。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆを含むＩＬ−１７サイトカインファミリーの全てのメンバーが想定されている。好ましい実施態様では、このＩＬ−１７サイトカイン配列はＩＬ−１７Ｆの１種以上のイソ型である。
【００６０】
一部の実施態様では、ＩＬ−１７組成物はレポータ遺伝子をも含む。想定されているレポータ遺伝子は検出可能なシグナルとなるポリペプチドをコードしている。或いは、又はさらに、レポータシグナルはＤＮＡ組成物に結合させる。例となる検出可能なシグナルは、ルシフェラーゼ（ルシフェリンとの反応を触媒する酵素）、蛍光タンパク質（緑、青、赤、黄又はシアン色）、β−ガラクトシダーゼ、磁性もしくは常磁性分子又は親油性色素（例えば、ＤｉＩ、ＤｉＤもしくはＤｉＯ）によって生じる。上記レポータ遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。レポータ遺伝子を含むこうしたＩＬ−１７組成物は、例えば診断及び／又は研究のツールとして有用である。
【００６１】
さらに、本発明は、抗体重鎖（可変及び定常ドメイン）をコードしているポリヌクレオチド配列並びに抗体軽鎖（可変及び定常ドメイン）をコードしているポリヌクレオチド配列をそれぞれに特有のプロモーター配列の制御下に含む少なくとも１種の発現ベクターを含むモノクローナル抗体（ＭＡｂ）組成物であって、この発現ベクターは第３のプロモーター配列の制御下に選択遺伝子をさらに含むものとする組成物を提供する。好ましい実施態様では、これら重鎖及び軽鎖配列は１５Ｃ１抗体（米国特許出願公開第２００８−００５０３６６号として公開された米国特許出願第１１／１５１，９１６号及び米国特許出願公開第２００６／０１６５６８６号として公開された米国特許出願第１１／３０１，３７３号に記載されており、その各々の内容は全体として本明細書に組み込まれている）をコードしているものである。さらに、本発明は、ヒト化、キメラ及び組換えモノクローナル抗体とこれらの断片並びにスキャフォールド分子及びＩｇＧ又はＩｇＧ様ドメインを含む他の分子を提供する。想定されているモノクローナル抗体としては、一本鎖又は二本鎖及びこれらの断片が挙げられる。或いは、又はさらに、本発明のモノクローナル抗体は細胞内発現抗体類及びこれらの断片である。
【００６２】
本発明のＩＬ−１７及びＭＡｂ組成物はＤＮＡ配列の発現を調節するためのプロモーターエレメントを含む。こうしたプロモーターエレメントは野生型である。或いは、又はさらに、プロモーターエレメントは特定の機能を果たすように設計又は選択される。例えば、あるプロモーターはＤＮＡ組成物の強力な発現を誘導するように設計又は選択される。別の例では、プロモーターは培養培地にある化学物質又は化合物を添加することで誘導可能となるように設計又は選択される。例えば、培養培地へのテトラサイクリンの添加及びこの培地からのテトラサイクリンの除去によって誘導可能なレポータをそれぞれ活性化及び抑制する。別の例では、プロモーターは構成的に活性である。好ましい一実施態様では、上記第１のプロモーター配列はｈＣＭＶである。別の実施態様では、この第１のプロモーターは細胞のプロモーターである。好ましい一実施態様では、この第１のプロモーターは延長因子１アルファ（ＥＦ−１α）である。別の好ましい実施態様では、上記第２のプロモーター配列はシミアンウイルス４０である（ＳＶ４０）。当該技術分野において認知されている他の哺乳動物発現ベクター及びウイルスプロモーター配列も本発明によって想定されており、包含される；Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年の１６及び１７章参照。
【００６３】
本発明のＩＬ−１７及びＭＡｂ組成物は、少なくとも１種の選択遺伝子を含む。本発明の選択遺伝子は特定の培養条件下での生存に必要なエレメントをコードしているものである。選択遺伝子の例としては、その産物が抗生物質耐性、必須栄養素、必須酵素、代謝酵素及び抗アポトーシス／オートファジーエレメントをもたらす遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様として、この選択遺伝子はグルタミン合成酵素をコードしている。
【００６４】
また、本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いてトランスフェクション特性を向上させ、１種以上の外因性遺伝子の１以上の細胞株内における発現を増強する方法であって、ＤＮＡ組成物を１以上の細胞株内に挿入することを含み、ＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と接触させるものとする方法を提供する。
【００６５】
一実施態様では、上記方法のＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入前に１以上の細胞と接触させる。或いは、又は上記第１の実施態様に加えて、ＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入時に１以上の細胞と接触させる。別の実施態様では、また、さらにこれまでの実施態様に加えて、ＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入後に１以上の細胞と接触させる。別の実施態様では、ＩＬ−１７組成物は連続的に１以上の細胞と接触させる。
【００６６】
上記方法のＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と細胞の細胞外表面で接触させる。或いは、又はさらに、このＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と細胞の細胞内表面で接触させる。別の実施態様では、本発明のＤＮＡ組成物はＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む。
【００６７】
好ましい実施態様では、上記方法の細胞株は選択圧下にあり、そのトランスフェクションは準安定的又は安定的である。或いは、細胞株は選択圧下になく、そのトランスフェクションは一過性である。本発明に包含されるトランスフェクション方法としては、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法、微量注入法、遺伝子銃法、ウイルス性形質導入法、エンドサイトーシス法、小胞融合法、リン酸カルシウム法、リポソーム法及びカチオン性ポリマーを媒介させる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
上記ＩＬ−１７組成物は１以上の細胞株にトランスフェクションする。さらに、このＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物と同時に又は逐次的にトランスフェクションする。さらに、このＩＬ−１７組成物は、１種以上の外因性遺伝子と同時発現される外因性性配列である。
【００６９】
或いは、又はさらに、上記ＩＬ−１７組成物はトランスフェクション前、中又は後のトランスフェクション培地中に存在させる。このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の細胞外タンパク質と結合させる。このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の膜貫通タンパク質と結合させる。一実施態様では、このＩＬ−１７組成物は、１種以上の外因性遺伝子を発現する１以上の細胞株によって取り込ませる。従って、このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の細胞内タンパク質と結合させる。
【００７０】
さらに、本発明は、準安定的トランスフェクションの効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞株を培養する工程、（ｂ）この細胞株（単数又は複数）を１種以上のＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切らせて１種以上のＤＮＡ組成物を輸送する工程、（ｄ）選択圧下の培地中でトランスフェクトした細胞を培養する工程及び（ｅ）トランスフェクトした細胞に、選択圧下にトランスフェクションＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成されるものとする方法を提供する。
【００７１】
また、本発明は、安定的トランスフェクションの効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞株を培養する工程、（ｂ）この細胞株（単数又は複数）を１種以上のＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切らせて１種以上のＤＮＡ組成物を輸送する工程、（ｄ）選択圧下の培地中でトランスフェクトした細胞を培養する工程及び（ｅ）トランスフェクトした細胞に、選択圧下にトランスフェクションＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成されるものとする方法を提供する。
【００７２】
上記準安定的及び安定的トランスフェクション方法のＤＮＡ組成物はＩＬ−１７をコードしている少なくとも１種の配列を含む。別の実施態様では、上記培養培地は少なくとも１種のＩＬ−１７ポリペプチドを含む。別の実施態様では、上記細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。本発明及び本方法により包含されるＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様では、上記細胞株は、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７、好中球、マクロファージ及びγ−Ｔ細胞を含む
上記方法のＩＬ−１７組成物は野生型又は変異体型であるＩＬ−１７ポリペプチドを含む。機能的には、上記方法のＩＬ−１７組成物は活性又は不活性であるＩＬ−１７ポリペプチドを含む。或いは、上記方法のＩＬ−１７組成物は不活性なＩＬ−１７変異体を含む。ＩＬ−１７ポリペプチドの例としては、ＩＬ−１７ファミリーの全てのメンバーが挙げられる。ＩＬ−１７サイトカインファミリーとしては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、上記方法のＩＬ−１７組成物はＩＬ−１７Ｆポリペプチドを含有する。ＩＬ−１７Ｆは２種のイソ型のうちの１つとして存在するが、これらのイソ型のいずれも本発明の組成物及び方法によって想定され、包含されている。ＩＬ−１７Ｆのイソ型２はＭＬ−１とも呼ばれ、本発明によって包含されている。
【００７３】
上記方法の細胞株（単数又は複数）は、例えば哺乳動物細胞を初めとする真核細胞を含む。一部の実施態様では、上記細胞又は細胞株（単数又は複数）はヒト細胞を含む。細胞株（単数又は複数）は、ヒト化細胞、ハイブリドーマ及び、例えばＢリンパ球などの不死化一次細胞を含む。一実施態様では、細胞株は幹細胞、全能細胞、多分化能細胞又は多能性細胞を含む。細胞株（単数又は複数）は胚、胎児、新生児、周産期、小児期又は成人細胞を含む。別の実施態様では、細胞株は不死化細胞を含む。細胞株は内皮、間葉又は中胚葉由来である。別の実施態様では、細胞株は培養物中の初代細胞を含む。さらに、細胞株は培養物中のハイブリドーマ細胞を含む。
【００７４】
細胞株（単数又は複数）は平滑又は横紋筋細胞を含む。一実施態様では、細胞株（単数又は複数）は心臓細胞を含む。
【００７５】
包含される細胞株としては、造血細胞、リンパ系細胞、骨髄系細胞、リンパ球前駆細胞、Ｂ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、形質細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞又は樹状細胞である免疫細胞が挙げられる。
【００７６】
包含される細胞株として、ニューロン、かご細胞、ベッツ細胞、中型有棘ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、投射神経細胞、レンショー細胞、顆粒状細胞、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、紡錘形ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、介在ニューロン、グリア細胞、放射状グリア細胞、アストロサイト／アストログリア（タイプ１又はタイプ２）、乏突起膠細胞、シュワン細胞又はバーグマングリア細胞である神経系細胞が挙げられる。また、想定されている細胞株として全ての型の上皮及び内皮細胞も挙げられる。
【００７７】
また、本発明の細胞株（単数又は複数）は全ての種類の癌細胞を含む。本発明によって包含される癌細胞としては、以下の例示的な状態に由来するものである。即ち、このような状態としては急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非メラノーマ）、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部グリオーマ、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍グリオーマ、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内メラノーマ、島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎（腎細胞）癌、腎癌、喉頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、メラノーマ、眼球内（眼）メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、境界悪性卵巣腫瘍、膵臓癌、島細胞膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞種及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（ｅｗｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓａｒｃｏｍａ ｔｕｍｏｒｓ）、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、松果体芽細胞種及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
上記方法に用いられる好ましい細胞は任意の齧歯動物の細胞株であり、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞が挙げられる。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞を用いる実施態様では、上記方法における好ましい培養培地は６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＣＤ−ＣＨＯである。他の細胞及び細胞株としては、例えばＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を含む、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＨｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩ−ＨＥＸ（登録商標））に用いられる細胞及び細胞株が挙げられる。
【００７９】
上記方法のＤＮＡ組成物は、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法又は遺伝子銃法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。或いは、上記方法のＤＮＡ組成物は、ウイルス性形質導入法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。さらに、上記方法のＤＮＡ組成物は、エンドサイトーシ法、小胞融合法又はリポソーム法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。上記方法のＤＮＡ組成物は、１以上の細胞株による取込みの確率が増大するようにカチオン性ポリマーに結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。カチオン性ポリマーの例としては、ポリリシン、ポリアミドアミン及びポリエチレンイミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。或いは、上記方法のＤＮＡ組成物は、ナノ粒子に連結させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。想定されているナノ粒子としては遺伝子銃によるトランスフェクションを可能にする不活性固体物質が挙げられ、このようなものとしては金が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、上記方法のＤＮＡ組成物は、１以上の細胞株による取込みを可能にするリン酸カルシウムに結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は、ウイルス性形質転換を可能にするウイルスに封入した１種以上のＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は、リポフェクション用のリポソームに取り込ませ、又は結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリポフェクションが遂行される。
【００８０】
上記方法のＤＮＡ組成物は線状化ＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は組換えＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は線状化組換えＤＮＡ配列を含む。或いは、又はさらに、ＤＮＡ組成物はＭＡｂ組成物を含む。ＤＮＡ組成物は内因性又は外因性配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は導入遺伝子、例えば、ＩＬ−１７導入遺伝子を含む。
【００８１】
本方法のＤＮＡ組成物に含有されるＤＮＡ配列の例としては、ポリリボヌクレオチドをコードしている配列、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、干渉又はサイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリジオキシリボヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、モルホリノ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、シグナルタンパク質、Ｇタンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、細胞内発現抗体、ホルモン、受容体、細胞質タンパク質、膜結合タンパク質、分泌タンパク質又は転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
定義
本発明に関連して用いた科学技術用語は、別に定義しない限り、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載した、細胞及び組織培養、分子生物学並びにタンパク質及びオリゴ／ポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して、またこれらの技術において用いた術語は、当該分野において公知であり、常用されているものである。組換えＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド合成並びに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）には標準的な技術を用いている。酵素反応及び精製技術は、メーカーの仕様に従い、又は当該分野で一般に実施されているように、又は本明細書に記載した方法で実施している。以上の技術及び手順は、概ね、当該分野で公知の常法に従い、また、本明細書全体にわたって引用し検討している各種の一般的及びより具体的な文献に記載されているのと同様にして実施している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載している分析化学、合成有機化学及び医薬品／製薬化学に関連して用いている術語並びにこれらの実験法及び技術は、当該分野で公知であり常用されているものである。化学合成、化学分析、製剤、処方、送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）及び患者の治療には標準的な方法が用いられている。
【００８３】
本開示に従って利用される場合、下記の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００８４】
本明細書において触れている「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれデオキシリボヌクレオチドであれ少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー性ボロン又はいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態を意味する。この用語はＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【００８５】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書ではポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片又は変異体を指す総称として用いている。従って、天然タンパク質の断片及び変異体はそのポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドとしてはサイトカイン及び抗体が挙げられる。
【００８６】
本明細書で用いている「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫反応を行う）抗原結合部位を含む分子のことをいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及び一本鎖抗体並びにＦａｂ発現ライブラリにおけるＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「特異的に結合する」又は「〜と免疫反応を行う」とは、抗体が所望の抗原の１箇所以上の抗原決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応（即ち、結合）しないか、他のポリペプチドとは極めて低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。
【００８７】
基本的な抗体構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０乃至７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約１００個乃至１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定している。ヒトの軽鎖はカッパ及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のイソ型をそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして規定している。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域とは約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合しており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸「Ｄ」領域をさらに含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ， Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成している。
【００８８】
本明細書で用いている「モノクローナル抗体（ＭＡｂ）」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物と特有の重鎖遺伝子産物とからなる１つの分子種の抗体のみを含む抗体分子の集団のことをいう。特に、このモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）はこの集団の全ての分子で同一である。従って、ＭＡｂは、抗原に対する特有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【００８９】
一般に、ヒトから得られる抗体分子はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤクラスのいずれかと関連があり、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスも存在する。さらに、ヒトでは軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖とすることができる。
【００９０】
本明細書で用いている「細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」という用語は細胞内抗体を含むポリペプチドを意味するものとする。細胞内発現抗体は分泌されない。細胞内発現抗体はポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を含む細胞内標的に結合する。細胞内発現抗体は全ての細胞コンパートメントに入る。
【００９１】
本明細書で用いている「これらの断片」という用語は、配列全体の長さより短いポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のセグメントを意味する。本明細書で用いている断片は機能的及び非機能的領域を含む。種々のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列からの断片を交換又は組合せることによりハイブリッド又は「キメラ」分子が創出される。また、断片は、ポリペプチドのポリヌクレオチド配列又は他のポリペプチドへの結合特性を調節するのに用いられる。
【００９２】
本明細書で用いている「プロモーター配列」という用語は、そこで転写の開始又は速度が制御される遺伝子の領域を含むポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位並びに他の正及び負調節エレメントの結合部位を含む。正調節エレメントはそのプロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を促進する。負調節エレメントはそのプロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を抑制する。本明細書で用いているプロモーター配列は、調節対象の遺伝子に対して上流又は内部に存在する。特に、「第２のプロモーター配列」に対する「第１のプロモーター配列」という用語は発現ベクター内のプロモーター配列の相対的な位置のことをいう。上記第１のプロモーター配列は上記第２のプロモーター配列の上流にある。
【００９３】
本明細書で用いている「選択遺伝子」という用語は、所与の培養条件における細胞の生存に必要なポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を意味するものとする。細胞が選択遺伝子と共に目的とする遺伝子を有する発現ベクターをうまく取り入れると、その細胞は不利な培養条件下で選択的に生存することを可能にするエレメントを産生することになる。「選択された」細胞とは、選択圧下に生存し、上記発現ベクターを取り入れたに違いない細胞である。本明細書で用いている「選択圧」という用語は、上記ＤＮＡ組成物を受容しない細胞の生存を阻害する細胞培養培地へのエレメントの添加を意味するものとする。
【００９４】
本明細書で用いている「内在性遺伝子」という用語は、細胞のゲノム配列内に含まれている遺伝子を意味するものとする。本明細書で用いている「外因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列内に含まれていない遺伝子を意味するものとする。外因性遺伝子は本方法によって細胞内に導入される。本明細書で用いている「導入遺伝子」という用語は１つの生物から別の生物に移された遺伝子を意味するものとする。
【００９５】
本明細書で用いている「トランスフェクション」という用語は、細胞内への１種以上のＤＮＡ組成物の細胞膜を横切る輸送又は挿入を意味するものとする。本明細書で用いている「安定的トランスフェクション」とは、選択圧下における単離タンパク質発現細胞株の生成を意味するものとする。本明細書で用いている「準安定的トランスフェクション」とは、選択圧下におけるタンパク質発現細胞株の混合物の生成を意味するものとする。本明細書で用いている「一過性トランスフェクション」とは、選択圧が加わらないでタンパク質発現細胞株が生成されることを意味するものとする。安定的及び準安定的トランスフェクションは選択圧によるゲノム内へのトランスフェクション配列の組込みをもたらす。一過性トランスフェクションはトランスフェクション配列のゲノムへの組込みをもたらさず、通常短期間こうした配列を保持させる。本明細書で用いている「トランスフェクション抵抗性」という用語は、既知の方法を用いて低い効率又は成功率でトランスフェクションされることを意味するものとする。
【００９６】
本明細書で用いている「向上した特性（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」という用語は、ＩＬ−１７の非存在下に測定された場合の同じパラメータに対して優れた特性のことを意味するものとする。
【００９７】
本明細書で用いている「レポータ遺伝子」という用語は、上記発現ベクター、従って目的とする遺伝子を取り込んだ細胞において物理的変化をもたらすポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を意味するものとする。物理的変化とは色変化又は蛍光発光である場合が多い。
【００９８】
本明細書で用いている「内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の内部からの翻訳開始という自然界の真核細胞では起こらないプロセスを可能にするポリヌクレオチド配列を意味するものとする。ＩＲＥＳが真核細胞ｍＲＮＡ分子内の２つの読み取り枠の間に配置されている（二シストロン性ｍＲＮＡと呼ばれる）と、このｍＲＮＡ分子の５’末端に結合している５’キャップ構造とは関係なく下流のタンパク質コード領域の翻訳が駆動される。その結果、その細胞内で両タンパク質が産生される。
【００９９】
本明細書で用いている２０種の通常のアミノ酸及びそれらの略語は慣用の語法に従っている。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照されたい。これら２０種の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸及び他の特殊アミノ酸も本発明のポリペプチドに適したアミノ酸であり得る。特殊アミノ酸の例としては、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の同様なアミノ酸並びにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で用いているポリペプチド表記法では、標準的な用法及び規則に従って、左手方向をアミノ末端方向、右手方向をカルボキシ末端方向としている。
【０１００】
同様に、特に他に明記されていない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は転写方向と称し、このＲＮＡと同じ配列を有し、このＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称し、同ＲＮＡと同じ配列を有し、同ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称する。
【０１０１】
サイレント又は保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸間の置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１０２】
サイレント又は保存的置換とは、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝的にコードされているアミノ酸は一般に以下のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩であり、（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としてはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、セリン及びスレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としてはアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。他のファミリーのアミノ酸としては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリン及びスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン並びに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、が挙げられる。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、スレオニンのセリンによる単一置換、或いはあるアミノ酸の構造上関連のあるアミノ酸による同様な置換では、特にフレーム部位内のアミノ酸がその置換に関与していない場合には、得られる分子の結合又は性質に大きな影響はないであろうと考えるのは理にかなっている。アミノ酸の変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかはこのポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることで容易に判定することができる。アッセイについては本明細書に詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又はアナログは当業者が容易に調製することができる。断片又はアナログのアミノ又はカルボキシ末端は機能ドメインの境界付近に存在することが好ましい。構造及び機能ドメインはヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公共又は企業の配列データベースと比較することによって特定することができる。コンピュータ化された比較方法を用いて、既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測タンパク質立体配座ドメインを特定することが好ましい。既知の３次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を特定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１年）。従って、前記の例から、当業者は本発明に従って構造及び機能ドメインを明確にするために用いることができる配列モチーフ及び構造の立体配座を認識することができることが分かる。
【０１０３】
サイレント又は保存的アミノ酸置換は親配列の構造上の特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は親配列に存在するヘリックスを壊したり、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を乱したりしやすくなってはならない）。当該技術分野において認知されているポリペプチドの二次及び三次構造の例については、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；並びにＴｈｏｒｎｔｏｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１年）に記載されている。
【０１０４】
本明細書中の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ （Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例示されているような、当該分野における慣用的用法に従って用いている。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：ＮＩ−０７０１二重遺伝子発現ベクター
ＮＩ−０７０１発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・ラムダ２の定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体ＮＩ−０７０１の重鎖及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、ＮＩ−０７０１ベクターはＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子をも含有する。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【０１０６】
ＮＩ−０７０１重鎖可変ドメインは以下の核酸配列（配列番号１５）によってコードされている：
【０１０７】
【化１５】
ＮＩ−０７０１重鎖可変ドメインは以下のアミノ酸配列（配列番号：１６）によってコードされている：
【０１０８】
【化１６】
ＮＩ−０７０１軽鎖可変ドメインは以下の核酸配列（配列番号１７）によってコードされている：
【０１０９】
【化１７】
ＮＩ−０７０１軽鎖可変ドメインは以下のアミノ酸配列（配列番号：１８）によってコードされている：
【０１１０】
【化１８】
ＮＩ−０７０１重鎖は以下のアミノ酸配列（配列番号１９）によってコードされている：
【０１１１】
【化１９】
ＮＩ−０７０１軽鎖は以下のアミノ酸配列（配列番号２０）によってコードされている：
【０１１２】
【化２０】
実施例２：ＩＬ−１７発現ベクターの作製
ヒト・インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ又はｈＩＬ−１７Ｆ）及び１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ又はｈＩＬ−１７Ａ）並びにラット・インターロイキンＩＬ−１７Ｆ（ラットＩＬ−１７Ｆ又はｒＩＬ−１７Ｆ）をヒト又はラットｃＤＮＡから単離し、次いでｈＣＭＶプロモーター制御下に発現ベクターにサブクローニングした。第２のシストロンとしてＧＦＰを同じＣＭＶプロモーターの制御下にｈＩＬ−１７ｃＤＮＡの下流にクローニングした。これら２種のシストロン（ＩＬ−１７及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。また、このベクターに、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地におけるトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のＧＳ遺伝子を含有させた。図１０はＩＬ−１７発現ベクターのマップである。
【０１１３】
上記ＩＬ−１７発現ベクターは以下の核酸配列（配列番号２１）によってコードされている：
【０１１４】
【化２１−１】
【０１１５】
【化２１−２】
【０１１６】
【化２１−３】
【０１１７】
【化２１−４】
実施例３：Ａ６ ＶＬ発現ベクターの作製
ＩＬ−１７サイトカインと同様な分子量の対照タンパク質を作製するために、ＮＩ−０５０１モノクローナル抗体（国際公開第０６／１０９１９１号に開示されている抗ＩＦＮγモノクローナル抗体）の軽鎖（可変領域及び定常領域）をｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクターにサブクローニングした。第２のシストロンとしてＧＦＰを同じＣＭＶプロモーターの制御下にＡ６ ＶＬ ｃＤＮＡの下流にクローニングした。これら２種のシストロン（Ａ６ ＶＬ及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。また、このベクターに、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地におけるトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のＧＳ遺伝子を含有させた。
【０１１８】
実施例４：天然ヒトＩＬ−１７Ｆに対するＮＩ−０７０１ベクターのトランスフェクション
Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｐｌｃのＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株を用いてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＮＩ−０７０１の産生のための準安定的トランスフェクションによるプール又は安定的トランスフェクションによる細胞株を作製した。本明細書で用いている「トランスフェクション」という語は線状化ＤＮＡを電気穿孔法によって細胞内に導入することを述べたものである。「準安定的トランスフェクション」という表現は、選択圧下に組換えタンパク質発現プール、即ち、細胞株の混合物を作製することを意味する。「安定的トランスフェクション」という表現は、選択圧下に単離組換えタンパク質産生細胞株を作製することを意味する。
【０１１９】
つまり、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した培地ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の指数関数的に増殖している細胞を以下の条件下に電気穿孔した：０．４ｃｍキュベットにおいて、７００μＬの新鮮ＣＤ−ＣＨＯ中の１．０×１０７個の生細胞をｐＨ７．４のトリスＥＤＴＡ緩衝溶液１００μＬ中４０μｇのＤＮＡと穏やかに混合した後、直ちに３００ボルト、９００μＦの単一パルスを与えた。
【０１２０】
各ＤＮＡ構築のために、直ちに４個のキュベットの内容物を予熱した新鮮なＣＤ−ＣＨＯ２００ｍＬ中に移した。次に、この細胞懸濁物を３個の組織培養処理Ｔ７５フラスコに分配して３つの５０ｍＬ準安定的プールを作製し、残りの細胞懸濁物５０ｍＬを用いて１０枚の９６−穴プレート（ウェル当たり５０μＬ）における限界希釈によって安定的細胞株を作製した。その後、上記のＴ７５フラスコ及び９６−穴プレートを空気中ＣＯ２１０％及び温度３７℃に設定した加湿インキュベータ内に設置した。
【０１２１】
トランスフェクションの約２４時間後に、安定的及び準安定的トランスフェクションの両方に（５０μＭのＭＳＸ補充により）選択圧を加え、Ｔ７５フラスコにはＰＢＳ中ＭＳＸの１００ｍＭ原液２５μＬを添加し、９６−穴プレートには６６．６μＭのＭＳＸを補充した予熱したＣＤ−ＣＨＯをウェル当たり１５０μＬ分注した。最後に、プレート及びフラスコを速やかにインキュベータに戻した。
【０１２２】
安定的トランスフェクションのプレートでは、細胞株の出現は、プレートの底を都合良く表示するために鏡を用いて頻繁に目視観察することにより評価した。「陽性のウェル」は、１個以上のトランスフェクタントコロニーを示すウェルと定義する。図１から、ヒトＩＬ−１７Ｆを用いて安定的にトランスフェクションさせた細胞を接種したウェルプレートは、トランスフェクション後２週目に始まり、５週目まで持続する１個以上のトランスフェクタントコロニーを示す一貫してより高い割合の陽性ウェルを有することが分かる。ＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞の成功は、対照のＮＩ−０７０１トランスフェクトした細胞に対しておよそ１６倍の向上を示している。
【０１２３】
図２から、ＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞を接種したウェルプレートはＮＩ−０７０１トランスフェクトした細胞の場合に比し、ウェル当たりの単一種コロニーよりもウェル当たりの複数コロニーの割合が大きいことが分かる。百分率値は２回の独立した実験の平均を示したものである。「複数コロニー」ウェルは２個以上のいくつかのコロニーを示す陽性ウェルと定義され、これに対して、「単一種コロニー」ウェルは一つの単離されたトランスフェクタントコロニーを示す陽性ウェルからなる。
【０１２４】
図１及び図２のデータを総合すると、ＩＬ−１７Ｆ媒介トランスフェクションはＮＩ−０７０１媒介安定的トランスフェクションよりも効果的であることが分かる。ＩＬ−１７Ｆの発現は選択圧に抵抗性のトランスフェクトした細胞の出現速度及び数を大きく増加させる。
【０１２５】
準安定プールでは、細胞増殖及びＧＦＰ導入遺伝子発現は蛍光顕微鏡を用いた目視検査により周期的に観察される。選択圧に抵抗性の細胞の大部分は、明視野照明の場合に比し、トランスフェクション後６、１５及び２３日にＧＦＰ発現に関して陽性であり、抵抗性細胞株はヒトＩＬ−１７Ｆを発現していることが示唆される（図３）。
【０１２６】
実施例５：トランスフェクション効果に対する外因性ヒトＩＬ−１７Ｆの影響の評価
外因性組換えヒトＩＬ−１７Ｆを含有又は非含有の培養培地の存在下にＡ６ ＶＬ構築体（Ａ６ＶＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞内への準安定的トランスフェクションを行った。７、１４、１７及び２１日目にＦＡＣＳ分析により準安定的プールのＧＦＰ発現について分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。得られたデータから、１４、１７及び２１日目において、ＩＬ−１７Ｆを作用させた細胞はＩＬ−１７Ｆを作用させなかった細胞よりも高いレベルのＧＦＰを発現したことが分かる（図４Ａ）。さらに、ＩＬ−１７Ｆの添加により全体的な細胞生存率が特に１７日目に増大した（図４Ｂ）。
【０１２７】
実施例６：ＩＬ−１７サイトカインファミリーの他のメンバーのトランスフェクション
ＩＬ−１７ファミリーとしては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。評価すべき最初のＩＬ−１７ファミリーメンバーはＩＬ−１７Ａである。何故なら、ＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７Ａとはアミノ酸配列の最も高い相同性及び同一性を共有しているからである。Ａ６ ＶＬ、ＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａ構築体はＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において安定的にトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞はトランスフェクションの１４、２２、２８及び３５日後に陽性ウェルの数について評価した。図５から、２２、２８及び３５目では、９６−穴プレート当たりの陽性ウェルの平均数はＡ６ＶＬトランスフェクトした細胞の場合よりもＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞でより大きいことが分かる。従って、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆはいずれも陽性ウェルの出現時間を短縮（即ち、出現速度を増大）させ、その数を増加させた。
【０１２８】
実施例７：ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆの比較
ラットＩＬ−１７Ｆはそのヒト相同体と高い配列相同性を有する。そこで、ラット及びヒトＩＬ−１７Ｆのトランスフェクション能に対する個々の効果を測定した。ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体をＣＨＯＫ１ＳＶ細胞中に安定的又は準安定的にトランスフェクションした。安定的トランスフェクションについては、トランスフェクションの１４、２２、２８及び３５日後に陽性ウェルの数を評価した。準安定的プールについてはＦＡＣＳ分析によりＧＦＰの発現を分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。図６Ａから、２２、２８及び３５日後では９６−穴プレート当たりの陽性ウェルの平均数はＡ６ＶＬトランスフェクトした細胞の場合よりもヒトＩＬ−１７Ｆ及びラットＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞でより大きいことが分かる。図６Ｂからは、１４、１７及び２１日目ではヒト又はラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞はＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞よりも高いレベルのＧＦＰを発現した。さらに、ヒトＩＬ−１７Ｆ又はラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞は同じ日にＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞よりも１４及び１７日目に高い生存率を示している（図６Ｃ）。従って、ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションすると、安定的トランスフェクションにおいて陽性ウェルの出現時間が短縮（即ち、出現速度を増大）し、その数が増加した。さらに、ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションすると、ＧＦＰ発現のレベルで評価される組換えタンパク質発現のレベルが増大した。
【０１２９】
実施例８：他のＣＨＯ細胞株におけるＩＬ−１７Ｆのトランスフェクション
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に対してみられる効果がこの細胞株に特有のものでないかどうかを明らかにするために、最初の実験をＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて再現した。ヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体をＣＨＯ−Ｓ細胞中に安定的又は準安定的にトランスフェクションした。安定的トランスフェクションについては、トランスフェクションの２２、２８、３５日及び４２日後に陽性ウェルの数を評価した。準安定的プールについては１、２、３、４及び６週後にＦＡＣＳ分析によりＧＦＰの発現を分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。図７Ａから、陽性ウェルの数は、Ａ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞の場合に比し、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞では５倍増加したことが分かる。準安定的トランスフェクションに関しては、図７Ｂから、３、４及び６週後の平均ＧＦＰ発現レベルはＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞の場合に比し、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞では４倍増加した。さらに、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞の生存率はＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞に比し、４週後に有意に増加した。従って、ＩＬ−１７ＦはＣＨＯ−Ｓ及びＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に対して同様な効果を示した。
【０１３０】
実施例９：ピューロマイシン選択を利用した発現ベクター系を用いたＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰ変異体によるＣＨＯ細胞の安定的トランスフェクション
ヒト・ランテス、ラットＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７ＦをＥＦ１−アルファプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングした。ＧＦＰは第２のシストロンとして同じＥＦ１−アルファプロモーターの制御下にヒト・ランテス、ラットＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆ配列の下流にサブクローニングした。これら２種のシストロンをウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。このベクターにはピューロマイシン耐性遺伝子も含有させた。ＣＨＯ細胞又はＰＥＡＫ細胞を６穴培養皿中に４．０×１０５個／ウェルの密度において３７℃で一夜プレートした。翌日、Ｍｉｒｉｕｓ ｂｉｏ社製ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬をメーカーのガイドラインに従って用い、ウェル当たり２μｇのＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、ＤＮＡ／Ｍｉｒｉｕｓ複合体の品質管理としてＰＥＡＫ細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した（図８Ａ）。この実験において各構築体のＧＦＰ発現を確認した。
【０１３１】
並行して、ＣＨＯトランスフェクトした細胞をピューロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）選択下の静置培養状態に置いた。必要に応じて新鮮培地を補充し、目視検査によりクローンの出現をモニターした。この実験期間中を通じて、試験した各種発現ベクターでクローンの出現率又はクローンの増殖に差は認められなかった。トランスフェクションの３週後に、クローンをプールし、図８Ｂに示したように、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した。ＩＬ−１７（ヒト又はラット、Ａ又はＦイソ型）の発現はＧＦＰの発現レベルに著しい影響を及ぼしている。
【０１３２】
実施例１０：１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター
１５Ｃ１発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・カッパの定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体１５Ｃ１の重鎖及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、１５Ｃ１ベクターはＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子をも含有する。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【０１３３】
マウス１５Ｃ１抗体の可変軽鎖配列は以下の核酸配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＳ６４５１６３及び配列番号２２によってコードされている：
【０１３４】
【化２２】
マウス１５Ｃ１抗体の可変重鎖配列は以下の核酸配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＳ６４５１５８及び配列番号２３によってコードされている：
【０１３５】
【化２３】
実施例１１：１５Ｃ１二重遺伝子発現ベクター及びヒトＩＬ−１７Ｆ発現ベクターの共トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＩｇＧ発現レベルに対するＩＬ−１７Ｆの効果を判定するために、１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとヒトＩＬ−１７Ｆ発現ベクターとの共トランスフェクションを行った。
【０１３６】
ヒトＩＬ−１７Ｆ及び１５Ｃ１構築体は電気穿孔法によって共トランスフェクションした。細胞は、安定的クローンを得るために９６−穴プレート中でプレートするか、Ｔ７５フラスコ中に細胞のポリクローナルプールとして保持した。参照基準として、１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターを単独でもトランスフェクションし、得られたトランスフェクトした細胞を同様に処理した。
【０１３７】
９６−穴プレートにおいてプレートしたトランスフェクションＣＨＯ細胞に関して、単一の増殖コロニーの存在をトランスフェクションの２２及び２８日後に目でみることができるウェルの数を評価した。各トランスフェクション条件について、同様なサイズ及び健全な出現を示した２０個のコロニーの上清を採取し、ヒトＩｇＧ／Ｋの濃度を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。トランスフェクションプールに関しても、ヒトＩｇＧ／Ｋの濃度をトランスフェクションの７、１４、２１及び２８日後にＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に言うと、上記上清中に存在する全ヒトＩｇＧ／Ｋの捕獲のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００５−０９８）及び検出のためのＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ−７１６４）を用いたＥＬＩＳＡによって１５Ｃ１抗体の濃度を評価した。
【０１３８】
図９Ａは、トランスフェクション後１、２、３又は４週のトランスフェクションプールからの上清における１５Ｃ１ヒトＩｇＧ１／カッパ濃度を示したものである。このデータから、トランスフェクション後４週では１５Ｃ１ ＭＡｂの濃度は１５Ｃ１単独のトランスフェクションの場合に比し、上記共トランスフェクション状態では２倍高いことが分かる。従って、このデータから、ＩＬ−１７Ｆは１５Ｃ１産生に対して明白な効果を示したことが分かる。
【０１３９】
図９Ｂは、共トランスフェクション（１５Ｃ１ ＭＡｂ及びヒトＩＬ−１７Ｆ）又は単一トランスフェクション（１５Ｃ１ ＭＡｂ）後２２及び２８日の９６−穴プレート当たりの１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである このデータから、トランスフェクション後２２及び２８日において、共トランスフェクション状態で得られたクローンの数は単一トランスフェクション状態の場合に比し、それぞれ５及び１０倍増加したことが分かる。
【０１４０】
図９Ｃは、各２０個の個々のクローンの上清における１５Ｃ１ ＭＡｂの発現レベルを示したものである。このデータから、高産生クローン（ＥＬＩＳＡにおける領域信号の範囲外のもの）の数は１５Ｃ１単独状態の場合よりも共トランスフェクション状態の場合で２．５倍高くなることが分かる。さらに、２０クローン全ての平均抗体価は１５Ｃ１単独の場合に比し、共トランスフェクション状態で２倍高い。共トランスフェクション状態では、２０個のクローンの全てが、蛍光顕微鏡による評価においてバラツキはあるが強いレベルでＧＦＰを発現した。ＧＦＰ染色の存在は全てのクローンによるヒトＩＬ−１７Ｆの強力な発現の正確な指標である。何故なら、ＩＬ−１７ＦベクターはＩＬ−１７Ｆの下流にＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列を含み、二シストロン性発現を行うからである（実施例２参照）。
【０１４１】
実施例１２：ＩＬ−１７Ｆの存在は細胞のよりしっかりとしたサブクローニングをもたらす。
【０１４２】
図１１Ａ乃至１２に示したように、ＩＬ−１７Ｆの存在によって細胞のサブクローニングのプロセスはよりしっかりしたものになる。図１１Ａ乃至１１Ｃでは、２種のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株、即ち、ＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現する８Ｅ１１及び無関連のｍＡｂを発現するＣ６Ｃ５を６−穴プレートの半固形培地（ＯｐｔｉＣＨＯ及び馴化ＣＨＯ上清を含む酢酸セルロース）中でプレートした。プレート後３日に直径＞０．２ｕｍのクローンを採取し、単離したクローンをＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬにより分析し、定量した。
【０１４３】
実施例１３． ＩＬ−１７Ｆの存在はトランスフェクトした細胞に対する選択圧の増大とそれによる導入遺伝子の生産能の上昇を可能にする。
【０１４４】
図１２では、細胞をＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰ発現カセットを用いてトランスフェクションし、９６−穴プレートにおいて図に示したように５０μＭ又は１００μＭのＭＳＸ選択圧下にプレートした。クローンがトランスフェクションの３乃至５週後に出現したので、次いでＦＡＣＳ分析によりＧＦＰ発現を分析した。
【０１４５】
実施例１４． ＤＨＦＲ選択を利用した発現系を用いた、ＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰによるＣＨＯＤＧ４４の安定的トランスフェクション
ヒトＩＬ−１７Ｆ遺伝子又は適切でないタンパク質及びＧＦＰ遺伝子からなる２種のシストロンをｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングした。これら２種のシストロンはウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てた。上記ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＯｐｔｉＶＥＣ）には上記クローニング部位の下流にＩＲＥＳ配列とこれの後にＤＨＦＲ遺伝子をも含有させた。従って、この構築により三シストロン性ｍＲＮＡからのＩＬ−１７Ｆ、ＧＦＰ及び選択マーカ（ＤＨＦＲ）の発現が可能となる（図１３）。
【０１４６】
ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）は、ＤＮＡ合成に必須である５，６−ジヒドロ葉酸塩の５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸塩への還元を触媒する。ＣＨＯＤＧ４４細胞株はＤＨＦＲ活性を欠くため、プリン前駆体ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）を補充した培地で培養しなければならない。メトトレキサート（ＭＴＸ）はＤＨＦＲ活性を阻害する葉酸拮抗剤である。選択条件としてはＨＴを含有せず、ＭＴＸを補充した培地を使用した。ＣＨＯＤＧ４４細胞は、ＨＴを含む培地（００１２４／００１２５）で標準的な電気穿孔法プロトコルを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、培養培地を、ＨＴを含有せず、５００又は１０００ｎＭのＭＴＸを含有する培地で置換した。トランスフェクトした細胞は４倍希釈して９６−穴プレートにプレートした。クローン出現率は目視観察により評価し、単離クローンのＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０１４７】
図１４は、トランスフェクション後３、４及び５週目における９６−穴プレート当たり１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである。このデータから、ＩＬ−１７Ｆは対照に比し、１個以上のトランスフェクタントコロニーを呈示するウェルの数を５倍増加させることが分かる。また、ＩＬ−１７Ｆはより高い（２倍の）レベルの選択剤での選択を可能にすることも分かる。
【０１４８】
図１５は、トランスフェクション後５週目における個々のクローンのＧＦＰ発現レベルを示したものである。このデータから、５００ｎＭのＭＴＸでは高度及び極めて高度のＧＦＰ産生クローンの割合が高くなることが分かる。選択圧を（５００ｎＭから１，０００ｎＭのＭＴＸへ）上げることで、ＩＬ−１７Ｆは低度のＧＦＰ産生クローンの割合の低下を可能にし、極めて高度のＧＦＰ産生クローンの割合を高める。
【０１４９】
実施例１５：ＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１７Ｆ及び完全なＩｇＧの同時発現
同時二シストロン性発現カセットを含有するプラスミドを作製した。第１の発現カセットは、ＩｇＧ軽鎖配列に続いてＩＲＥＳとこれの後にＧＦＰ遺伝子を有する二重シストロン性遺伝子で構成した。第２の発現カセットは、ＩｇＧ重鎖配列に続いてＩＲＥＳとこれの後にヒトＩＬ−１７Ｆ遺伝子又は適切でないタンパク質遺伝子で構成した。こうした構築により、単一プラスミドで組立ＩｇＧタンパク質、ＧＦＰ及びヒトＩＬ−１７Ｆ又は無関連タンパク質の産生が可能となる。これらの「二重二重（ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ）遺伝子」ベクターを標準的な電気穿孔法プロトコルを用いてＣＨＯＫ１ＳＶ中にトランスフェクションした。
【０１５０】
図１６は、トランスフェクション後３、４及び５週目における９６−穴プレート当たりの１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである。このデータから、ＩＬ−１７Ｆはクローンの出現を高めることが分かる。
【０１５１】
図１７は、トランスフェクション後４週目における個々のクローンのＩｇＧの平均レベルを示したものである。このデータから、完全なＩｇＧタンパク質と共にヒトＩＬ−１７Ｆを発現させると、高度ＩｇＧ産生クローンの選択が強化されることが分かる。
【０１５２】
実施例１６：ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ技術を用いたクローン選択に対するＩＬ−１７Ｆの効果
種々のレベル（おおよそのＩＬ−１７Ｆ発現レベルに対応して適宜「高」、「中」及び「低」と呼ぶ）のヒトＩＬ−１７Ｆタンパク質を安定的に発現するＣＨＯ細胞株を選択した。（馴化培地を含むか、含まない）半固形培地を含有する６−穴プレートに種々の濃度（５０、５００及び５，０００個／ｍＬ）の細胞を接種した。細胞は９日間培養した。単一増殖コロニーの数は、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬイメージングステーションを用いた白色光学顕微鏡により５及び９日目に評価した。
【０１５３】
３濃度のＩＬ−１７Ｆ発現ＣＨＯ細胞を接種した３ウェルからの増殖コロニーの総数を測定した。このデータから、ＩＬ−１７Ｆは馴化培地ではなく補充培地において単一増殖クローンの数を増加させることが分かった。クローン数に対するＩＬ−１７Ｆの効果は用量依存性であった。
他の実施態様
本発明についてその詳細な記述と併せて記載したが、前述の記載は例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、その範囲は添付した「特許請求の範囲」の範囲によって決定される。他の態様、利点及び変形は添付の「特許請求の範囲」内にある。
【０１５４】
本明細書において参照された特許及び科学文献は、当業者にとって入手可能な知識を確立する。本明細書において引用された全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用された公開された外国の特許及び特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用されたアクセッション番号で示されたジェンバンク及びＮＣＢＩ提出物は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用された他の全ての公開された参考文献、文書、原稿、及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５５】
本発明を、その好ましい実施態様を参照して詳細に図示して説明してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び細部のさまざまな変更が可能なことは理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００８年１０月７日に出願された米国仮出願第６１／１９５，４３６号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体として細胞生物学、細胞培養及び分子生物学の分野に関する。本発明は、インターロイキン１７（ＩＬ−１７：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７）及び関連タンパク質を使用して遺伝子送達、細胞生存、コロニー成長及びタンパク質産生の優れた、改善された特性をもたらすための組成物及び方法を含む。
【背景技術】
【０００３】
細胞生物学、細胞培養及び分子生物学の分野では、例えば増殖速度、生成クローン数、産生能などの特定の特徴を有する細胞株を選択することが望まれる。細胞株を生成させ、選択するための多くの方法が開発されているが、細胞株の性能、選択及び他の諸特性を改良することが現在もなお必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いて細胞株の特性を向上させ、細胞、細胞株又は細胞集団のサブクローニングを強化し、細胞株の選択を改善し、及び／又は選択された細胞株内における１種以上の外因性遺伝子の発現を向上させるための組成物及び方法を提供する。本発明により包含される方法及び組成物は、ＩＬ−１７を用いて細胞及び／又は細胞株の１つ以上の特徴及び／又は生物学的効果を向上させる新規な方法となる。こうしたＩＬ−１７を媒介させた方法及び組成物は、１つ以上の望ましい特性、特徴又は他の生物学的効果を示す細胞及び／又は細胞株を作製、サブクローニング及び／又は選択するのに有用である。さらに、ＩＬ−１７を既知の方法と組み合わせて用いると、細胞株の発現、選択、サブクローニング及び／又は有効性の中の１つ以上の特性が意外にも首尾良く改善される。例えば、本発明に包含される組成物及び方法は、必要とする患者に投与されることになる医薬組成物に使用されるモノクローナル抗体の収量の増大をもたらす。さらに、本方法によって、治療用組成物の開発研究において以前はトランスフェクション抵抗性であった細胞株を使用することが可能となる。最後に、本方法により、選択された細胞の大規模かつ迅速で効率的なスクリーニングが可能となる。何故なら、ＩＬ−１７の使用によって効率、産生能及び／又は細胞選択速度、サブクローニング及び／又は単一細胞クローニング、外因性遺伝子発現並びに他の望ましい特性が向上するからである。従って、本発明によって提供される方法は、大がかりな薬剤開発に適用することができる。また、本明細書に提供された組成物及び方法は、細胞及び組織培養補助剤及び誘導体においても用いられる。
【０００５】
本明細書において提供された方法及び組成物により、細胞及び／又は細胞株、細胞選択、サブクローニング及び／又は細胞改変（例えば、細胞トランスフェクション）の１つ以上の特性が向上する。ＩＬ−１７の使用により向上する特性の例としては、増大した効率、向上した選択率（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度（即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施態様では、本明細書において提供される方法及び組成物により、上記特性の２つ以上の任意の組合せが向上する。
【０００６】
具体的には、本発明は、ＩＬ−１７を用いて細胞及び／又は細胞株産生、細胞及び／細胞株選択、サブクローニング、及び／又は核酸による細胞及び／又は細胞株トランスフェクションの特性を向上させる方法であって、細胞をＩＬ−１７と接触させる工程を含む方法を提供する。外因性ＩＬ−１７を作用させることによって、ＩＬ−１７を接触させない細胞の場合に比し、細胞の産生、選択、サブクローニング及び／又は上記核酸の発現を向上させることが好ましい。この外因性ＩＬ−１７は、例えば、ＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞からのものである。
【０００７】
本発明は、ＩＬ−１７を用いて細胞の産生、サブクローニング、単一細胞クローニング及び／又は選択の効果を向上させる組成物及び方法であって、培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程並びにこうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）をＩＬ−１７含有組成物と接触させて、例えば増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度 （即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性など、細胞及び／又は細胞株の特性を向上させる工程を含む組成物及び方法を提供する。任意選択的に、こうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）は、核酸と接触させて培地中で培養することによりこの核酸によりコードされたポリペプチドを発現させることで、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞及び／又は細胞株が生成される。こうした細胞（単数又は複数）及び／又は細胞株（単数又は複数）は、これらが目的とするポリペプチドをコードしている上記核酸と接触させる前に、又は接触中にＩＬ−１７を作用させる。
【０００８】
さらに、本発明は、細胞改変の効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、（ｂ）１以上の細胞（単数又は複数）又は細胞株（単数又は複数）を核酸と接触させる工程、（ｃ）改変細胞を培地中で培養してこの核酸によりコードされているポリペプチドを発現させ、細胞は上記接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７を作用させるものとする工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される方法を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、１以上の形質転換細胞又は細胞株を培地中で培養し、ＩＬ−１７と接触させるなどして作用させるサブクローニング及び／又は単一細胞クローニングの効果及び／又は産生能を向上させる方法であって、こうした接触させた細胞（単数又は複数）又は細胞株（単数又は複数）はサブクローニング及び／又は単一細胞クローニング向上した特性を示す方法を提供する。上記の組成物及び方法を用いることにより、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度（即ち、選択細胞の最初の出現までに要する時間）、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性など、サブクローニング及び／又は単一細胞クローニング特性が向上する。例えば、この方法を用いることによって１種以上の真核細胞、例えばヒト細胞のサブクローニング及び／又は単一細胞クローニングの効果、効率、産生能及び／又は選択が向上する。一部の実施態様では、こうした細胞（単数又は複数）は無血清培地、好ましくは既知組成培地中で培養する。本明細書において提供される方法は、極めて低い細胞株密度でも、例えば、１個／ｍＬ乃至１０，０００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５，０００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至２５０個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至１００個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至５０個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至２５個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至１２．５個／ｍＬの範囲、１個／ｍＬ乃至６．２５個／ｍＬの範囲、又は１個／ｍＬ乃至３．１２５個／ｍＬの範囲でも真核細胞株をサブクローニングするのに有用である。
【００１０】
一実施態様では、こうした細胞及び／又は細胞株をＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている第二の核酸でトランスフェクションし、この細胞をこれらの第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に培養する。或いは、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている上記第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている上記第二の核酸を２種の細胞及び／又は細胞株にトランスフェクションし、これらの細胞を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に一緒に培養する。これらのＩＬ−１７トランスフェクトした細胞及び／又は細胞株では、ＩＬ−１７サイトカインを目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と共に同時発現させることによって、１種以上のトランスフェクション特性の向上、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性などがもたらされる。
【００１１】
さらに好ましい実施態様では、こうした細胞及び／又は細胞株をＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている第二の核酸でトランスフェクションし、この場合、ＩＬ−１７をコードしている核酸の発現は、例えば、誘導プロモーターの使用、ＣｒｅＬｏｘＰもしくはこれと同等物による不活化又は選択及び／又はサブクローニングプロセスの下流における亜鉛フィンガー不活化を含む当該技術分野において認知されている各種方法のいずれかによって調節するものとする。或いは、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆをコードしている上記第一の核酸及び目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードしている上記第二の核酸を２種の細胞及び／又は細胞株にトランスフェクションし、これらの細胞を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に一緒に培養する。次に、これらの細胞及び／又は細胞株を上記第一及び第二の核酸の発現に適した条件下に培養する。
【００１２】
これらのＩＬ−１７トランスフェクトした細胞及び／又は細胞株では、ＩＬ−１７サイトカインを目的とするペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と共に同時調節発現させることによって、１種以上のトランスフェクション特性の向上、例えば、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性及び／又は増大した細胞株の安定性などがもたらされる。
【００１３】
本明細書において提供される組成物及び方法では、ＩＬ−１７の発現を、例えば、誘導プロモーターの使用、ＣｒｅＬｏｘＰもしくはこれと同等物による不活化又は選択及び／又はサブクローニングプロセスの下流における亜鉛フィンガー不活化を含む当該技術分野において認知されている各種方法のいずれかによって調節する。好適な誘導プロモーターとしては、例えば、ラパマイシン誘導性二量体化技術を用いるシステム、ステロイドホルモン受容体を利用するシステム、ＴＥＴシステムなどのテトラサイクリンシステム、ＰＩＰシステムなどのストレプトグラミンシステム、Ｅ．ＥＲＥＸシステムなどのマクロライドシステムなどの異種遺伝子発現調節システムが挙げられる。これらの異種遺伝子発現調節システムでは、調節配列は、ｈＣＭＶプロモーター又はＥｆ１アルファプロモーターのような強力なプロモーターの部分配列に融合させる。
【００１４】
ＩＬ−１７は、細胞選択及び／又は改変の前、中又は後に細胞と接触させる。或いは、又はさらに、ＩＬ−１７は細胞と連続的に接触させる。ＩＬ−１７を細胞に接触させるいくつかの手段が上記方法の内に想定されている。一実施態様では、ＩＬ−１７は、培養培地中に存在させることによって細胞と接触させる。別の実施態様では、ＩＬ−１７は細胞によって外因性に産生させる、例えば、このＩＬ−１７は、ＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞（単数又は複数）によって産生させる。関連の実施態様では、上記方法の核酸は、ＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む。さらに、ＩＬ−１７はこの核酸と同時的又は逐次的に産生させる。
【００１５】
上記方法は、選択圧下の細胞又は細胞株を含む。一実施態様では、この選択圧は、トランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ：ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｐｈｏｘｉｍｉｎｅ）である。この細胞選択において、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの存在下に培地中のＭＳＸの濃度を（例えば、５０μＭ超に）増大させることで、選択圧を増大させると、産生能が増大した。ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの非存在下に選択圧を増大させると、クローンが存在しなくなった。従って、ＩＬ−１７Ｆを添加して選択圧を増大させることにより、本明細書において提供される方法の生産性が増大する。
【００１６】
選択圧を加える場合、上記改変は準安定的である。或いは、選択圧を加える場合、上記改変は安定的である。別の実施態様では、上記改変細胞は選択圧の非存在下に増殖し、従って、その改変は一過性なものである。
【００１７】
上記方法及び組成物は、本明細書においてＩＬ−１７サイトカインとも称するＩＬ−１７ポリペプチドを用いることによって細胞トランスフェクションの１種以上の特性を向上させる。本発明によって包含されるＩＬ−１７ポリペプチド類又はサイトカイン類の例としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥもしくはＩＬ−１７Ｆ及びこれらＩＬ−１７ポリペプチド類のヘテロダイマー、例えばＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロダイマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｆサイトカインを用いる。ＩＬ−１７ポリペプチド類は、例えば、本明細書に示したヒトＩＬ−１７配列類を含むヒトＩＬ−１７配列類である。一部の実施態様では、ＩＬ−１７ポリペプチド類及びＩＬ−１７組成物として、例えばラットＩＬ−１７配列などの非ヒト哺乳動物の配列を含む真核生物の配列が挙げられる。一実施態様では、細胞又は細胞株（単数又は複数）として、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７細胞が挙げられる。一部の実施態様では、上記方法の細胞又は細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。ＩＬ−１７受容体類（ＩＬ−１７Ｒｓ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明の方法は、１種以上のＤＮＡ及び／又はＩＬ−１７組成物を受け入れ、選択圧下の培養で増殖してこれらの組成物を保持する細胞を含む。一実施態様では、この選択圧は、上記ＤＮＡ組成物を受け入れているトランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）である。別の実施態様では、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培養培地（ＨＴ培地：ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を用いることでＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）欠損トランスフェクトした細胞を選択する。一部の実施態様では、選択及び遺伝子増幅のための系においてメトトレキサート（ＭＴＸ：ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を用いる。
【００１９】
本発明の方法及び組成物はトランスフェクション特性を向上させる。本発明の方法及び組成物は細胞産生特性を向上させる。本発明の方法及び組成物は選択特性を向上させる。本発明の方法及び組成物はサブクローニング及び／又は単一細胞クローニング特性を向上させる。本方法によって向上する特性の例としては、トランスフェクション効率の増大、向上した選択率、トランスフェクション増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の方法は、１種以上の外因性遺伝子の発現を増強する。発現が増強されるメカニズムの例としては、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ）、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性トランスフェクション後の発現増大、増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み又は外因性ＤＮＡの増大した発現が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、準安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成されるものとする方法を提供する。
【００２２】
さらに、本発明は、安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株を生成させるものとする方法を提供する。
【００２３】
本発明は、準安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物を生成させるものとする方法を提供する。
【００２４】
さらに、本発明は、安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる方法であって、（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、（ｂ）このＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、（ｄ）ＭＳＸを、例えば５０μＭ ＭＳＸもしくは１００μＭ ＭＳＸの濃度、５０μＭ ＭＳＸ乃至１００μＭ ＭＳＸの範囲の濃度、又は１００μＭ ＭＳＸ超の濃度で培地に添加することによる選択圧下のグルタミン枯渇培地で、トランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされたＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株を生成させるものとする方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒトＩＬ−１７Ｆと抗ＲＡＮＴＥＳモノクローナル抗体（国際公開第０９／０５４８７３号に記載されており、本明細書ではＮＩ−０７０１と称す）との間で、安定的トランスフェクションをコロニー出現の速度及び率について比較したグラフである。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図２】図２Ａは、ヒトＩＬ−１７Ｆを用いた安定的トランスフェクションをウェル当たりの複数のトランスフェクタントの存在について比較したグラフである。図２Ｂは、ＮＩ−０７０１を用いた安定的トランスフェクションをウェル当たりの複数のトランスフェクタントの存在について比較したグラフである。
【図３】図３は、ヒトＩＬ−１７Ｆを発現する準安定的トランスフェクションプールの目視検査結果を示す一連の写真である。写真は各々の示された時点で１００倍の倍率の蛍光顕微鏡を用いて撮られたものである。
【図４】図４Ａは、組換えヒトＩＬ−１７Ｆを補充し、又は補充しなかったＡ６ＶＬ構築体の準安定的トランスフェクションをＧＦＰ発現について比較したグラフである。図４Ｂは、組換えヒトＩＬ−１７Ｆを補充し、又は補充しなかったＡ６ＶＬ構築体の準安定的トランスフェクションを細胞生存率について比較したグラフである。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びＡ６ＶＬ構築体との間で、安定的トランスフェクションをコロニー出現の速度及び率について比較したグラフである。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ａ】図６Ａは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で安定的トランスフェクションを比較したグラフである。安定的トランスフェクションはコロニー出現の速度及び率について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。準安定的トランスフェクションはＧＦＰ発現について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。準安定的トランスフェクションは細胞生存率について評価した。エラーバーは２つの独立した実験の標準偏差を表す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間でコロニー出現の速度及び率について評価して安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間でＧＦＰ発現について評価して準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＣＨＯ−Ｓ細胞株においてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体との間で細胞生存率について評価して準安定的トランスフェクションを比較したグラフである。
【図８】図８Ａは、ピューロマイシン選択を利用した発現ベクター系（ｐＥＡＫ８、Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＣＨＯ細胞中へのＩＬ−１７ ＩＲＥＳ ＧＦＰ変異体間の安定的トランスフェクションを比較したグラフである。ＧＦＰ発現分析結果はＰＥＡＫ細胞においてトランスフェクション後２４時間にフローサイトメトリーを用いて測定した。図８Ｂは、図８Ａの説明に記載したトランスフェクション手順に続くピューロマイシンによる選択の３週間後のＣＨＯ細胞におけるＧＦＰ発現を比較したグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後１乃至４週間における抗ＣＤ３モノクローナル抗体（国際公開第０５／１１８６３５号に記載されており、本明細書では１５Ｃ１ ＭＡｂと称する）の産生を比較したグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後２２及び２６日における９６−穴プレート当たり１個以上のコロニーを含むウェルの数を比較したグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＩＬ−１７Ｆ発現ベクターと１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとの組合せ又は１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター単独を用いたＣＨＯ細胞のトランスフェクション後の２０クローンの各々の上清における１５Ｃ１ ＭＡｂの発現レベル（μｇ／ｍＬ）を比較したグラフである。
【図１０】図１０は、ｐＥＥ１４．４ ＬＳＣＤ３３ＨＩＳ ＡＶＩ ｈＩＬ−１７Ｆ ｎ １−７発現ベクターの模式図、即ち、マップである。
【図１１】図１１Ａは、２種のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株、即ちＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現する８Ｅ１１及び無関連のｍＡｂを発現するＣ６Ｃ５からの細胞をプレートした後３日に採取した単離クローンの定量結果を示すグラフである。図１１Ｂは、図１１Ａにおいて採取したサブクローンを示す図である。図１１Ｃは、図１１Ａにおいて採取したサブクローンを示す図である。
【図１２】図１２は、ＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ発現カセットでトランスフェクションし、５０μＭ又は１００μＭ ＭＳＸ選択圧下にプレートした細胞からのクローンにおけるＧＦＰ発現を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本明細書に記載した実施例に用いたベクター構築体を示す一連のグラフである。
【図１４】図１４は、トランスフェクション後の種々の時間における安定的ＣＨＯＤＧ４４細胞クローンの出現を示したグラフである。
【図１５】図１５は、ＭＴＸ圧下選択の５週間後のＣＨＯＤＧ４４細胞におけるクローンＧＦＰ発現のレベルを示したグラフである。
【図１６】図１６は、トランスフェクション後の種々の時間における安定的ＣＨＯ細胞クローンの出現を示したグラフを示したグラフである。
【図１７】図１７は、トランスフェクション後４週における個々のクローンのＩｇＧ発現の平均レベルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いてトランスフェクション特性を向上させ、トランスフェクトした細胞株内における１種以上の外因性遺伝子の発現を増強するための組成物及び方法を提供する。本発明によって包含される方法は、ＩＬ−１７によって媒介される新規なトランスフェクション方法となる。さらに、ＩＬ−１７を既知の方法と組み合わせて用いると、トランスフェクション効果の１種以上の特性、例えば、生存、増殖及び／又は導入遺伝子発現が意外にも首尾良く改善される。
【００２７】
ＩＬ−１７組成物
ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上のポリヌクレオチド配列を含む。包含されるＩＬ−１７サイトカイン類としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆ（イソ型１及び２、ＭＬ−１とも呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましいＩＬ−１７サイトカイン類としては、ＩＬ−１７Ｆの２つのイソ型が挙げられる。ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカインを含む１種以上のポリペプチド配列を含む。さらに、ＩＬ−１７組成物は、ＩＬ−１７サイトカイン受容体（ＩＬ−１７Ｒ）を含む１種以上のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む。包含されるＩＬ−１７サイトカイン受容体類としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、ＩＬ−１７組成物は、本明細書に記載したＩＬ−１７サイトカイン類及び／又はＩＬ−１７Ｒ受容体類の中の１種以上に類似の構造を有するポリペプチド類及びタンパク質類を含む。また、ＩＬ−１７組成物は、本明細書に記載したＩＬ−１７サイトカイン類及び／又はＩＬ−１７Ｒ受容体類の中の１種以上の断片又はその他のプロセッシングされた部分、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、ＩＬ−１７Ｒ受容体及びこれらの任意のホモ二量体又はヘテロ二量体の細胞内プロセッシングに由来する断片を含む。本発明の一実施態様では、少なくとも１種のＩＬ−１７サイトカインを含む組成物を少なくとも１種のＩＬ−１７Ｒを発現し、過剰発現し、又はその発現を抑制する細胞又は細胞株に投与する。この実施態様では、組成物中に存在するＩＬ−１７サイトカインの適用量を増やすか減らして変更し、ＩＬ−１７Ｒの発現レベルを補償する。例えば、ＩＬ−１７Ｒの発現レベルが高い場合、組成物にはより低いレベルのＩＬ−１７サイトカインを少なくとも１種含める。逆に、少なくとも１種のＩＬ−１７Ｒの発現が低い場合、組成物にはより高いレベルのＩＬ−１７サイトカインを少なくとも１種含める。
【００２８】
包含されるヒトＩＬ−１７配列を以下に示したが、ＩＬ−１７組成物は非ヒト哺乳動物の配列を含む真核生物の配列を含む。さらに、ＩＬ−１７組成物はこれらの配列に沿った任意の点における１種以上の突然変異を含む。想定されている突然変異はＩＬ−１７サイトカインの１種以上の機能を妨害するものである。例えば、想定されている突然変異によってＩＬ−１７のＩＬ−１７受容体への結合又はＩＬ−１７受容体からの遊離が阻止される。或いは、又はさらに、想定されている突然変異によってＩＬ−１７の発現、翻訳、分泌、二量体化又は分解が阻止される。ＩＬ−１７の突然変異は細胞外又は細胞内にＩＬ−１７の集合体をもたらす。ポリヌクレオチドレベルにおける突然変異はサイレントであるか、読み枠シフト、置換、欠失、逆転、ミスセンス突然変異又は終結を含むポリヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化をもたらす。ポリペプチドレベルにおける突然変異はサイレントであるか、アミノ酸配列の変化、翻訳の阻止もしくは終結、三次構造の崩壊、誤った折り畳み、凝集、二量体化の崩壊、分解の中断、タンパク質の不安定性、他のポリペプチドとの相互作用の崩壊、又はポリペプチドとの新規な会合をもたらす。
【００２９】
好ましい実施態様では、ＩＬ−１７組成物は、ヒトｃＤＮＡ又はラットサイトカイン・インターロイキン１７Ｆ（ｒＩＬ−１７Ｆ：ｒａｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ Ｆ）から単離した後、ｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングしたヒトサイトカイン・インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ又はｈＩＬ−１７Ｆ：ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７Ｆ）を含む。この発現ベクターにおいて、同じＣＭＶプロモーターの制御下に第二のシストロンとしてｈＩＬ−１７Ｆ ｃＤＮＡの下流にＧＦＰをクローニングする。これら２種のシストロン（ＩＬ−１７Ｆ及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）によって隔てることにより上記第二の（ＧＦＰ）シストロンの翻訳が可能となる。また、このベクターは、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地中でのトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子を含む。
【００３０】
一部の実施態様では、本明細書に記載したベクターはタグその他のマーカ（又はタグもしくはマーカをコードしている核酸配列）、例えば、Ａｖｉタグ又はＨｉｓタグなども含む。他の実施態様では、こうしたベクターはタグ又はタグをコードしている核酸配列を含まない。
【００３１】
想定されているヒトＩＬ−１７サイトカインとして、例えば以下の配列を記載したが、これらに限定されるものではない。以下のｍＲＮＡ又はアミノ酸配列に沿った１箇所以上に突然変異が設計される。
【００３２】
ＩＬ−１７Ａは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００２１９０及び配列番号１）によってコードされている：
【００３３】
【化１】
ＩＬ−１７Ａは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００２１８１．１及び配列番号２）によってコードされている：
【００３４】
【化２】
ＩＬ−１７Ｂは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ１５２０９８及び配列番号３）によってコードされている：
【００３５】
【化３】
ＩＬ−１７Ｂは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＦ２８１０４．１及び配列番号４）によってコードされている：
【００３６】
【化４】
ＩＬ−１７Ｃは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０１３２７８及び配列番号５）によってコードされている：
【００３７】
【化５】
ＩＬ−１７Ｃは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３７４１０．１及び配列番号６）によってコードされている：
【００３８】
【化６】
ＩＬ−１７Ｄは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１３８２８４及び配列番号７）によってコードされている：
【００３９】
【化７】
ＩＬ−１７Ｄは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿６１２１４１．１及び配列番号８）によってコードされている：
【００４０】
【化８】
ＩＬ−１７Ｅは以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ３０５２００及び配列番号９）によってコードされている：
【００４１】
【化９】
ＩＬ−１７Ｅは以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＧ４０８４８．１及び配列番号１０）によってコードされている：
【００４２】
【化１０】
ＩＬ−１７Ｆ、転写産物１、は以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿０５２８７２及び配列番号１１）によってコードされている：
【００４３】
【化１１】
ＩＬ−１７Ｆ、転写産物１、は以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿４４３１０４．１及び配列番号１２）によってコードされている：
【００４４】
【化１２】
ＭＬ−１、ＩＬ−１７Ｆ転写産物２、は以下のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＦ３３２３８９及び配列番号１３）によってコードされている：
【００４５】
【化１３】
ＭＬ−１、ＩＬ−１７Ｆ転写産物２、は以下のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＬ１４４２７．１及び配列番号１４）によってコードされている：
【００４６】
【化１４】
ＤＮＡ組成物
本発明のＤＮＡ組成物は全てのポリヌクレオチド又はこれらの断片を含む。上記方法の想定されているＤＮＡ組成物は線状化ＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は組換えＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は環状又は線状化組換えＤＮＡ配列を含む。或いは、又はさらに、ＤＮＡ組成物はＭＡｂ組成物を含む。ＤＮＡ組成物は内因性又は外因性配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は導入遺伝子、例えば、ＩＬ−１７導入遺伝子を含む。
【００４７】
本方法のＤＮＡ組成物に含まれるＤＮＡ配列の例としては、ポリヌクレオチドをコードしている配列、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、干渉又はサイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリジオキシリボヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、モルホリノ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、シグナルタンパク質、Ｇタンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、細胞内発現抗体、ホルモン、受容体、細胞質タンパク質、膜結合タンパク質、分泌タンパク質及び／又は転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
好ましい実施態様では、上記ＤＮＡ組成物は少なくとも１種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。本発明のＭＡｂ組成物はＮＩ−０７０１発現ベクター又は１５Ｃ１抗体を含む発現ベクターを含む。この発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・ラムダ２定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体ＮＩ−０７０１の重及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、上記ＮＩ−０７０１ベクターはＳＶ４０プロモーターの制御下にグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子をも含む。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【００４９】
方法
本発明は核酸での細胞の改変の特性を向上させるためにＩＬ−１７を使用する方法であって、細胞をＩＬ−１７と接触させる工程を含む方法を提供する。この方法の別の実施態様では、ＩＬ−１７を作用させることがＩＬ−１７に接触させない細胞の場合に比し、核酸の発現を増強する。
【００５０】
さらに、本発明は、細胞改変の効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、（ｂ）１以上の細胞又は細胞株を核酸と接触させる工程、（ｃ）改変細胞を培地中で培養して該核酸によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、細胞は上記接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７を作用させるものとし、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される方法を提供する。
【００５１】
上記方法は、選択圧下の細胞又は細胞株を含む。一実施態様では、この選択圧は、トランスフェクトした細胞は生存するが非トランスフェクトした細胞は死に至る、特異的グルタミン合成酵素阻害剤を含む培地中でトランスフェクトした細胞を増殖させることによって加える。好ましい実施態様では、上記特異的グルタミン合成酵素阻害剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）である。この細胞選択において、例えば、ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの存在下に培地中のＭＳＸの濃度を（例えば、５０μＭ超に）増大させることで、選択圧を増大させると、産生能が増大した。ＩＬ−１７サイトカイン、好ましくはＩＬ−１７Ｆの非存在下に選択圧を増大させると、クローンが存在しなくなった。従って、ＩＬ−１７Ｆを添加して選択圧を増大させることにより、本明細書において提供された方法の生産性が増大する。
【００５２】
選択圧を加える場合、上記改変は準安定的である。或いは、選択圧を加える場合、上記改変は安定的である。別の実施態様では、上記改変細胞は選択圧の非存在下に増殖し、従って、その改変は一過性なものである。
【００５３】
上記方法の細胞又は細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。ＩＬ−１７受容体類（ＩＬ−１７Ｒ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施態様では、細胞又は細胞株（単数又は複数）として、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７細胞が挙げられる。本発明によって包含されるＩＬ−１７ポリペプチド類又はサイトカイン類の例としては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７ＥもしくはＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、ＩＬ−１７Ｆサイトカインを用いる。
【００５４】
本発明の想定されている細胞又は細胞株（単数又は複数）としては、例えば哺乳動物細胞を初めとする真核細胞が挙げられる。一部の実施態様では、上記細胞又は細胞株（単数又は複数）はヒト細胞を含む。別の実施態様では、本発明は幹細胞、全能細胞、多分化能細胞又は多能性細胞を含む。別の実施態様では、本発明は不死化細胞を含む。別の実施態様では、培養に一次細胞を用いる。さらに別の実施態様では、培養にハイブリドーマ細胞を用いる。本発明は、上記の諸細胞型又は諸細胞集団を単独又は混合物として用いることを含む。上記諸細胞型は同時に又は逐次的に使用する。上記の諸細胞型又は諸細胞集団の組合せは任意の組合せが想定されており、こうした組合せは本発明に包含される。
【００５５】
上記方法は多数の細胞改変方法を含む。細胞改変方法の例としては、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法、微量注入法、遺伝子銃法、エンドサイトーシス法、小胞融合法、及びリポフェクション法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。或いは、又はさらに、細胞改変は、例えばパルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びヘルペスウイルスをベースとしたベクターを含む種々のウイルスをベースとした遺伝子送達システムのいずれかを用いて行う。或いは、又はさらに、本発明の核酸は、この核酸の細胞又は細胞株内への輸送を促進する化合物に結合、連結、動作可能なように連結、融合又は係留させる。一実施態様では、カチオン性ポリマーに核酸を結合させる。別の実施態様では、ナノ粒子に核酸を連結させる。第三の実施態様では、リン酸カルシウムに核酸を結合させる。
【００５６】
上記方法は、細胞改変の１種以上の特性を向上させる。向上する特性の例としては、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、培地枯渇に対する低下した感受性又は増大した細胞株の安定性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
上記方法は、細胞をＩＬ−１７と接触させることにより上記核酸の発現を増強する。核酸発現特性の例としては、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
本発明は、第１のプロモーター配列の制御下の１種以上のＩＬ−１７サイトカインポリヌクレオチド配列及び第１のプロモーター配列の制御下のＩＬ−１７サイトカイン配列の下流のレポータ遺伝子配列を含有する少なくとも１種の発現ベクターを含むＩＬ−１７組成物であって、上記のＩＬ−１７サイトカインとレポータ遺伝子配列とはウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列によって隔てられているものとし、上記発現ベクターは第２のプロモーター配列の制御下の選択遺伝子をさらに含むものとするＩＬ−１７組成物を提供する。
【００５９】
上記ＩＬ−１７サイトカイン配列は哺乳動物の配列である。ＩＬ−１７配列の哺乳動物供給源の例としては、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ及び非ヒト霊長類（例えば、チンパンジー）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、このＩＬ−１７サイトカイン配列はラットの配列又はヒトの配列である。ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆを含むＩＬ−１７サイトカインファミリーの全てのメンバーが想定されている。好ましい実施態様では、このＩＬ−１７サイトカイン配列はＩＬ−１７Ｆの１種以上のイソ型である。
【００６０】
一部の実施態様では、ＩＬ−１７組成物はレポータ遺伝子をも含む。想定されているレポータ遺伝子は検出可能なシグナルとなるポリペプチドをコードしている。或いは、又はさらに、レポータシグナルはＤＮＡ組成物に結合させる。例となる検出可能なシグナルは、ルシフェラーゼ（ルシフェリンとの反応を触媒する酵素）、蛍光タンパク質（緑、青、赤、黄又はシアン色）、β−ガラクトシダーゼ、磁性もしくは常磁性分子又は親油性色素（例えば、ＤｉＩ、ＤｉＤもしくはＤｉＯ）によって生じる。上記レポータ遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ：ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。レポータ遺伝子を含むこうしたＩＬ−１７組成物は、例えば診断及び／又は研究のツールとして有用である。
【００６１】
さらに、本発明は、抗体重鎖（可変及び定常ドメイン）をコードしているポリヌクレオチド配列並びに抗体軽鎖（可変及び定常ドメイン）をコードしているポリヌクレオチド配列をそれぞれに特有のプロモーター配列の制御下に含む少なくとも１種の発現ベクターを含むモノクローナル抗体（ＭＡｂ）組成物であって、この発現ベクターは第３のプロモーター配列の制御下に選択遺伝子をさらに含むものとする組成物を提供する。好ましい実施態様では、これら重鎖及び軽鎖配列は１５Ｃ１抗体（米国特許出願公開第２００８−００５０３６６号として公開された米国特許出願第１１／１５１，９１６号及び米国特許出願公開第２００６／０１６５６８６号として公開された米国特許出願第１１／３０１，３７３号に記載されており、その各々の内容は全体として本明細書に組み込まれている）をコードしているものである。さらに、本発明は、ヒト化、キメラ及び組換えモノクローナル抗体とこれらの断片並びにスキャフォールド分子及びＩｇＧ又はＩｇＧ様ドメインを含む他の分子を提供する。想定されているモノクローナル抗体としては、一本鎖又は二本鎖及びこれらの断片が挙げられる。或いは、又はさらに、本発明のモノクローナル抗体は細胞内発現抗体類及びこれらの断片である。
【００６２】
本発明のＩＬ−１７及びＭＡｂ組成物はＤＮＡ配列の発現を調節するためのプロモーターエレメントを含む。こうしたプロモーターエレメントは野生型である。或いは、又はさらに、プロモーターエレメントは特定の機能を果たすように設計又は選択される。例えば、あるプロモーターはＤＮＡ組成物の強力な発現を誘導するように設計又は選択される。別の例では、プロモーターは培養培地にある化学物質又は化合物を添加することで誘導可能となるように設計又は選択される。例えば、培養培地へのテトラサイクリンの添加及びこの培地からのテトラサイクリンの除去によって誘導可能なレポータをそれぞれ活性化及び抑制する。別の例では、プロモーターは構成的に活性である。好ましい一実施態様では、上記第１のプロモーター配列はｈＣＭＶである。別の実施態様では、この第１のプロモーターは細胞のプロモーターである。好ましい一実施態様では、この第１のプロモーターは延長因子１アルファ（ＥＦ−１α）である。別の好ましい実施態様では、上記第２のプロモーター配列はシミアンウイルス４０である（ＳＶ４０）。当該技術分野において認知されている他の哺乳動物発現ベクター及びウイルスプロモーター配列も本発明によって想定されており、包含される；Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ． 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年の１６及び１７章参照。
【００６３】
本発明のＩＬ−１７及びＭＡｂ組成物は、少なくとも１種の選択遺伝子を含む。本発明の選択遺伝子は特定の培養条件下での生存に必要なエレメントをコードしているものである。選択遺伝子の例としては、その産物が抗生物質耐性、必須栄養素、必須酵素、代謝酵素及び抗アポトーシス／オートファジーエレメントをもたらす遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様として、この選択遺伝子はグルタミン合成酵素をコードしている。
【００６４】
また、本発明は、ＩＬ−１７組成物を用いてトランスフェクション特性を向上させ、１種以上の外因性遺伝子の１以上の細胞株内における発現を増強する方法であって、ＤＮＡ組成物を１以上の細胞株内に挿入することを含み、ＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と接触させるものとする方法を提供する。
【００６５】
一実施態様では、上記方法のＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入前に１以上の細胞と接触させる。或いは、又は上記第１の実施態様に加えて、ＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入時に１以上の細胞と接触させる。別の実施態様では、また、さらにこれまでの実施態様に加えて、ＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物の挿入後に１以上の細胞と接触させる。別の実施態様では、ＩＬ−１７組成物は連続的に１以上の細胞と接触させる。
【００６６】
上記方法のＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と細胞の細胞外表面で接触させる。或いは、又はさらに、このＩＬ−１７組成物は１以上の細胞と細胞の細胞内表面で接触させる。別の実施態様では、本発明のＤＮＡ組成物はＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む。
【００６７】
好ましい実施態様では、上記方法の細胞株は選択圧下にあり、そのトランスフェクションは準安定的又は安定的である。或いは、細胞株は選択圧下になく、そのトランスフェクションは一過性である。本発明に包含されるトランスフェクション方法としては、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法、微量注入法、遺伝子銃法、ウイルス性形質導入法、エンドサイトーシス法、小胞融合法、リン酸カルシウム法、リポソーム法及びカチオン性ポリマーを媒介させる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
上記ＩＬ−１７組成物は１以上の細胞株にトランスフェクションする。さらに、このＩＬ−１７組成物は上記ＤＮＡ組成物と同時に又は逐次的にトランスフェクションする。さらに、このＩＬ−１７組成物は、１種以上の外因性遺伝子と同時発現される外因性性配列である。
【００６９】
或いは、又はさらに、上記ＩＬ−１７組成物はトランスフェクション前、中又は後のトランスフェクション培地中に存在させる。このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の細胞外タンパク質と結合させる。このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の膜貫通タンパク質と結合させる。一実施態様では、このＩＬ−１７組成物は、１種以上の外因性遺伝子を発現する１以上の細胞株によって取り込ませる。従って、このＩＬ−１７組成物は１種以上の外因性遺伝子を発現する細胞と関連づけられる１種以上の細胞内タンパク質と結合させる。
【００７０】
さらに、本発明は、準安定的トランスフェクションの効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞株を培養する工程、（ｂ）この細胞株（単数又は複数）を１種以上のＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切らせて１種以上のＤＮＡ組成物を輸送する工程、（ｄ）選択圧下の培地中でトランスフェクトした細胞を培養する工程及び（ｅ）トランスフェクトした細胞に、選択圧下にトランスフェクションＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成されるものとする方法を提供する。
【００７１】
また、本発明は、安定的トランスフェクションの効果を向上させる方法であって、（ａ）培地中で１以上の細胞株を培養する工程、（ｂ）この細胞株（単数又は複数）を１種以上のＤＮＡ組成物と混合する工程、（ｃ）少なくとも１種の細胞株の形質膜を横切らせて１種以上のＤＮＡ組成物を輸送する工程、（ｄ）選択圧下の培地中でトランスフェクトした細胞を培養する工程及び（ｅ）トランスフェクトした細胞に、選択圧下にトランスフェクションＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成されるものとする方法を提供する。
【００７２】
上記準安定的及び安定的トランスフェクション方法のＤＮＡ組成物はＩＬ−１７をコードしている少なくとも１種の配列を含む。別の実施態様では、上記培養培地は少なくとも１種のＩＬ−１７ポリペプチドを含む。別の実施態様では、上記細胞株（単数又は複数）は少なくとも１種のＩＬ−１７受容体を発現する。本発明及び本方法により包含されるＩＬ−１７受容体（ＩＬ−１７Ｒ）の例としては、ＩＬ−１７ＲＡ、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−１７ＲＣ、ＩＬ−１７ＲＤ及びＩＬ−１７ＲＥが挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様では、上記細胞株は、ＩＬ−１７ポリペプチドを分泌するＴｈ１７、好中球、マクロファージ及びγ−Ｔ細胞を含む
上記方法のＩＬ−１７組成物は野生型又は変異体型であるＩＬ−１７ポリペプチドを含む。機能的には、上記方法のＩＬ−１７組成物は活性又は不活性であるＩＬ−１７ポリペプチドを含む。或いは、上記方法のＩＬ−１７組成物は不活性なＩＬ−１７変異体を含む。ＩＬ−１７ポリペプチドの例としては、ＩＬ−１７ファミリーの全てのメンバーが挙げられる。ＩＬ−１７サイトカインファミリーとしては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施態様では、上記方法のＩＬ−１７組成物はＩＬ−１７Ｆポリペプチドを含有する。ＩＬ−１７Ｆは２種のイソ型のうちの１つとして存在するが、これらのイソ型のいずれも本発明の組成物及び方法によって想定され、包含されている。ＩＬ−１７Ｆのイソ型２はＭＬ−１とも呼ばれ、本発明によって包含されている。
【００７３】
上記方法の細胞株（単数又は複数）は、例えば哺乳動物細胞を初めとする真核細胞を含む。一部の実施態様では、上記細胞又は細胞株（単数又は複数）はヒト細胞を含む。細胞株（単数又は複数）は、ヒト化細胞、ハイブリドーマ及び、例えばＢリンパ球などの不死化一次細胞を含む。一実施態様では、細胞株は幹細胞、全能細胞、多分化能細胞又は多能性細胞を含む。細胞株（単数又は複数）は胚、胎児、新生児、周産期、小児期又は成人細胞を含む。別の実施態様では、細胞株は不死化細胞を含む。細胞株は内皮、間葉又は中胚葉由来である。別の実施態様では、細胞株は培養物中の初代細胞を含む。さらに、細胞株は培養物中のハイブリドーマ細胞を含む。
【００７４】
細胞株（単数又は複数）は平滑又は横紋筋細胞を含む。一実施態様では、細胞株（単数又は複数）は心臓細胞を含む。
【００７５】
包含される細胞株としては、造血細胞、リンパ系細胞、骨髄系細胞、リンパ球前駆細胞、Ｂ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、形質細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞又は樹状細胞である免疫細胞が挙げられる。
【００７６】
包含される細胞株として、ニューロン、かご細胞、ベッツ細胞、中型有棘ニューロン、プルキンエ細胞、錐体細胞、投射神経細胞、レンショー細胞、顆粒状細胞、運動ニューロン、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、紡錘形ニューロン、神経前駆細胞、神経幹細胞、介在ニューロン、グリア細胞、放射状グリア細胞、アストロサイト／アストログリア（タイプ１又はタイプ２）、乏突起膠細胞、シュワン細胞又はバーグマングリア細胞である神経系細胞が挙げられる。また、想定されている細胞株として全ての型の上皮及び内皮細胞も挙げられる。
【００７７】
また、本発明の細胞株（単数又は複数）は全ての種類の癌細胞を含む。本発明によって包含される癌細胞としては、以下の例示的な状態に由来するものである。即ち、このような状態としては急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非メラノーマ）、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部グリオーマ、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼球内メラノーマ、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍グリオーマ、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内メラノーマ、島細胞腫瘍（膵臓内分泌腺）、カポジ肉腫、腎（腎細胞）癌、腎癌、喉頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇癌及び口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、肺小細胞癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、メラノーマ、眼球内（眼）メラノーマ、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、境界悪性卵巣腫瘍、膵臓癌、島細胞膵臓癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽細胞種及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂及び尿管、移行細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍（ｅｗｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｓａｒｃｏｍａ ｔｕｍｏｒｓ）、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（メラノーマ）、メルケル細胞皮膚癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃（胃（ｇａｓｔｒｉｃ））癌、松果体芽細胞種及びテント上方未分化神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮内子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌及びウィルムス腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
上記方法に用いられる好ましい細胞は任意の齧歯動物の細胞株であり、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞が挙げられる。ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞又はＣＨＯ−Ｓ細胞を用いる実施態様では、上記方法における好ましい培養培地は６ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＣＤ−ＣＨＯである。他の細胞及び細胞株としては、例えばＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を含む、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＩｎｇｅｌｈｅｉｍのＨｉｇｈ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩ−ＨＥＸ（登録商標））に用いられる細胞及び細胞株が挙げられる。
【００７９】
上記方法のＤＮＡ組成物は、電気穿孔法、熱ショック法、マグネットフェクション法又は遺伝子銃法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。或いは、上記方法のＤＮＡ組成物は、ウイルス性形質導入法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。さらに、上記方法のＤＮＡ組成物は、エンドサイトーシ法、小胞融合法又はリポソーム法によって細胞膜を横切らせて輸送するか、挿入する。上記方法のＤＮＡ組成物は、１以上の細胞株による取込みの確率が増大するようにカチオン性ポリマーに結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。カチオン性ポリマーの例としては、ポリリシン、ポリアミドアミン及びポリエチレンイミンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。或いは、上記方法のＤＮＡ組成物は、ナノ粒子に連結させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。想定されているナノ粒子としては遺伝子銃によるトランスフェクションを可能にする不活性固体物質が挙げられ、このようなものとしては金が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、上記方法のＤＮＡ組成物は、１以上の細胞株による取込みを可能にするリン酸カルシウムに結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は、ウイルス性形質転換を可能にするウイルスに封入した１種以上のＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は、リポフェクション用のリポソームに取り込ませ、又は結合させた１種以上のＤＮＡ配列を含む。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてリポフェクションが遂行される。
【００８０】
上記方法のＤＮＡ組成物は線状化ＤＮＡ配列を含む。さらに、ＤＮＡ組成物は組換えＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は線状化組換えＤＮＡ配列を含む。或いは、又はさらに、ＤＮＡ組成物はＭＡｂ組成物を含む。ＤＮＡ組成物は内因性又は外因性配列を含む。好ましい実施態様では、ＤＮＡ組成物は導入遺伝子、例えば、ＩＬ−１７導入遺伝子を含む。
【００８１】
本方法のＤＮＡ組成物に含有されるＤＮＡ配列の例としては、ポリリボヌクレオチドをコードしている配列、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、干渉又はサイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ポリジオキシリボヌクレオチド、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、モルホリノ、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、シグナルタンパク質、Ｇタンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、細胞内発現抗体、ホルモン、受容体、細胞質タンパク質、膜結合タンパク質、分泌タンパク質又は転写因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
定義
本発明に関連して用いた科学技術用語は、別に定義しない限り、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載した、細胞及び組織培養、分子生物学並びにタンパク質及びオリゴ／ポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して、またこれらの技術において用いた術語は、当該分野において公知であり、常用されているものである。組換えＤＮＡ及びオリゴヌクレオチド合成並びに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）には標準的な技術を用いている。酵素反応及び精製技術は、メーカーの仕様に従い、又は当該分野で一般に実施されているように、又は本明細書に記載した方法で実施している。以上の技術及び手順は、概ね、当該分野で公知の常法に従い、また、本明細書全体にわたって引用し検討している各種の一般的及びより具体的な文献に記載されているのと同様にして実施している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載している分析化学、合成有機化学及び医薬品／製薬化学に関連して用いている術語並びにこれらの実験法及び技術は、当該分野で公知であり常用されているものである。化学合成、化学分析、製剤、処方、送達（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）及び患者の治療には標準的な方法が用いられている。
【００８３】
本開示に従って利用される場合、下記の用語は、特に示さない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００８４】
本明細書において触れている「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれデオキシリボヌクレオチドであれ少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー性ボロン又はいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態を意味する。この用語はＤＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を含む。
【００８５】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書ではポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片又は変異体を指す総称として用いている。従って、天然タンパク質の断片及び変異体はそのポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドとしてはサイトカイン及び抗体が挙げられる。
【００８６】
本明細書で用いている「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ：ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原と特異的に結合する（免疫反応を行う）抗原結合部位を含む分子のことをいう。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ及び一本鎖抗体並びにＦａｂ発現ライブラリにおけるＦａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「特異的に結合する」又は「〜と免疫反応を行う」とは、抗体が所望の抗原の１箇所以上の抗原決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応（即ち、結合）しないか、他のポリペプチドとは極めて低い親和性（Ｋｄ＞１０−６）で結合することを意味する。
【００８７】
基本的な抗体構造単位は四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一対のポリペプチド鎖で構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０乃至７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約１００個乃至１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定している。ヒトの軽鎖はカッパ及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のイソ型をそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして規定している。軽鎖及び重鎖内では、可変領域と定常領域とは約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合しており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸「Ｄ」領域をさらに含む。一般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ， Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は抗体の結合部位を形成している。
【００８８】
本明細書で用いている「モノクローナル抗体（ＭＡｂ）」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物と特有の重鎖遺伝子産物とからなる１つの分子種の抗体のみを含む抗体分子の集団のことをいう。特に、このモノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）はこの集団の全ての分子で同一である。従って、ＭＡｂは、抗原に対する特有の結合親和性により特徴付けられる抗原の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【００８９】
一般に、ヒトから得られる抗体分子はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤクラスのいずれかと関連があり、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いに異なる。特定のクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２などのサブクラスも存在する。さらに、ヒトでは軽鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖とすることができる。
【００９０】
本明細書で用いている「細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」という用語は細胞内抗体を含むポリペプチドを意味するものとする。細胞内発現抗体は分泌されない。細胞内発現抗体はポリヌクレオチド及びポリペプチド配列を含む細胞内標的に結合する。細胞内発現抗体は全ての細胞コンパートメントに入る。
【００９１】
本明細書で用いている「これらの断片」という用語は、配列全体の長さより短いポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列のセグメントを意味する。本明細書で用いている断片は機能的及び非機能的領域を含む。種々のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列からの断片を交換又は組合せることによりハイブリッド又は「キメラ」分子が創出される。また、断片は、ポリペプチドのポリヌクレオチド配列又は他のポリペプチドへの結合特性を調節するのに用いられる。
【００９２】
本明細書で用いている「プロモーター配列」という用語は、そこで転写の開始又は速度が制御される遺伝子の領域を含むポリヌクレオチド配列を意味する。プロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位並びに他の正及び負調節エレメントの結合部位を含む。正調節エレメントはそのプロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を促進する。負調節エレメントはそのプロモーター配列の制御下の遺伝子の発現を抑制する。本明細書で用いているプロモーター配列は、調節対象の遺伝子に対して上流又は内部に存在する。特に、「第２のプロモーター配列」に対する「第１のプロモーター配列」という用語は発現ベクター内のプロモーター配列の相対的な位置のことをいう。上記第１のプロモーター配列は上記第２のプロモーター配列の上流にある。
【００９３】
本明細書で用いている「選択遺伝子」という用語は、所与の培養条件における細胞の生存に必要なポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を意味するものとする。細胞が選択遺伝子と共に目的とする遺伝子を有する発現ベクターをうまく取り入れると、その細胞は不利な培養条件下で選択的に生存することを可能にするエレメントを産生することになる。「選択された」細胞とは、選択圧下に生存し、上記発現ベクターを取り入れたに違いない細胞である。本明細書で用いている「選択圧」という用語は、上記ＤＮＡ組成物を受容しない細胞の生存を阻害する細胞培養培地へのエレメントの添加を意味するものとする。
【００９４】
本明細書で用いている「内在性遺伝子」という用語は、細胞のゲノム配列内に含まれている遺伝子を意味するものとする。本明細書で用いている「外因性遺伝子」とは、細胞のゲノム配列内に含まれていない遺伝子を意味するものとする。外因性遺伝子は本方法によって細胞内に導入される。本明細書で用いている「導入遺伝子」という用語は１つの生物から別の生物に移された遺伝子を意味するものとする。
【００９５】
本明細書で用いている「トランスフェクション」という用語は、細胞内への１種以上のＤＮＡ組成物の細胞膜を横切る輸送又は挿入を意味するものとする。本明細書で用いている「安定的トランスフェクション」とは、選択圧下における単離タンパク質発現細胞株の生成を意味するものとする。本明細書で用いている「準安定的トランスフェクション」とは、選択圧下におけるタンパク質発現細胞株の混合物の生成を意味するものとする。本明細書で用いている「一過性トランスフェクション」とは、選択圧が加わらないでタンパク質発現細胞株が生成されることを意味するものとする。安定的及び準安定的トランスフェクションは選択圧によるゲノム内へのトランスフェクション配列の組込みをもたらす。一過性トランスフェクションはトランスフェクション配列のゲノムへの組込みをもたらさず、通常短期間こうした配列を保持させる。本明細書で用いている「トランスフェクション抵抗性」という用語は、既知の方法を用いて低い効率又は成功率でトランスフェクションされることを意味するものとする。
【００９６】
本明細書で用いている「向上した特性（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｒｏｐｅｒｔｙ）」という用語は、ＩＬ−１７の非存在下に測定された場合の同じパラメータに対して優れた特性のことを意味するものとする。
【００９７】
本明細書で用いている「レポータ遺伝子」という用語は、上記発現ベクター、従って目的とする遺伝子を取り込んだ細胞において物理的変化をもたらすポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を意味するものとする。物理的変化とは色変化又は蛍光発光である場合が多い。
【００９８】
本明細書で用いている「内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の内部からの翻訳開始という自然界の真核細胞では起こらないプロセスを可能にするポリヌクレオチド配列を意味するものとする。ＩＲＥＳが真核細胞ｍＲＮＡ分子内の２つの読み取り枠の間に配置されている（二シストロン性ｍＲＮＡと呼ばれる）と、このｍＲＮＡ分子の５’末端に結合している５’キャップ構造とは関係なく下流のタンパク質コード領域の翻訳が駆動される。その結果、その細胞内で両タンパク質が産生される。
【００９９】
本明細書で用いている２０種の通常のアミノ酸及びそれらの略語は慣用の語法に従っている。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ Ｍａｓｓ．（１９９１年））を参照されたい。これら２０種の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸及び他の特殊アミノ酸も本発明のポリペプチドに適したアミノ酸であり得る。特殊アミノ酸の例としては、４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の同様なアミノ酸並びにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書で用いているポリペプチド表記法では、標準的な用法及び規則に従って、左手方向をアミノ末端方向、右手方向をカルボキシ末端方向としている。
【０１００】
同様に、特に他に明記されていない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向は転写方向と称し、このＲＮＡと同じ配列を有し、このＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称し、同ＲＮＡと同じ配列を有し、同ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’側にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称する。
【０１０１】
サイレント又は保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基が交換可能であることをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸間の置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１０２】
サイレント又は保存的置換とは、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝的にコードされているアミノ酸は一般に以下のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩であり、（２）塩基性アミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸はグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としてはアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、セリン及びスレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としてはアラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。他のファミリーのアミノ酸としては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリン及びスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギン及びグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン並びに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン、が挙げられる。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、スレオニンのセリンによる単一置換、或いはあるアミノ酸の構造上関連のあるアミノ酸による同様な置換では、特にフレーム部位内のアミノ酸がその置換に関与していない場合には、得られる分子の結合又は性質に大きな影響はないであろうと考えるのは理にかなっている。アミノ酸の変化が機能性ペプチドをもたらすかどうかはこのポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることで容易に判定することができる。アッセイについては本明細書に詳細に記載されている。抗体又は免疫グロブリン分子の断片又はアナログは当業者が容易に調製することができる。断片又はアナログのアミノ又はカルボキシ末端は機能ドメインの境界付近に存在することが好ましい。構造及び機能ドメインはヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データを公共又は企業の配列データベースと比較することによって特定することができる。コンピュータ化された比較方法を用いて、既知の構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測タンパク質立体配座ドメインを特定することが好ましい。既知の３次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を特定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４（１９９１年）。従って、前記の例から、当業者は本発明に従って構造及び機能ドメインを明確にするために用いることができる配列モチーフ及び構造の立体配座を認識することができることが分かる。
【０１０３】
サイレント又は保存的アミノ酸置換は親配列の構造上の特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、置換アミノ酸は親配列に存在するヘリックスを壊したり、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を乱したりしやすくなってはならない）。当該技術分野において認知されているポリペプチドの二次及び三次構造の例については、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ及びＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；並びにＴｈｏｒｎｔｏｎほか、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５（１９９１年）に記載されている。
【０１０４】
本明細書中の他の化学用語は、Ｔｈｅ ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｓ （Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例示されているような、当該分野における慣用的用法に従って用いている。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：ＮＩ−０７０１二重遺伝子発現ベクター
ＮＩ−０７０１発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・ラムダ２の定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体ＮＩ−０７０１の重鎖及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、ＮＩ−０７０１ベクターはＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）遺伝子をも含有する。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【０１０６】
ＮＩ−０７０１重鎖可変ドメインは以下の核酸配列（配列番号１５）によってコードされている：
【０１０７】
【化１５】
ＮＩ−０７０１重鎖可変ドメインは以下のアミノ酸配列（配列番号：１６）によってコードされている：
【０１０８】
【化１６】
ＮＩ−０７０１軽鎖可変ドメインは以下の核酸配列（配列番号１７）によってコードされている：
【０１０９】
【化１７】
ＮＩ−０７０１軽鎖可変ドメインは以下のアミノ酸配列（配列番号：１８）によってコードされている：
【０１１０】
【化１８】
ＮＩ−０７０１重鎖は以下のアミノ酸配列（配列番号１９）によってコードされている：
【０１１１】
【化１９】
ＮＩ−０７０１軽鎖は以下のアミノ酸配列（配列番号２０）によってコードされている：
【０１１２】
【化２０】
実施例２：ＩＬ−１７発現ベクターの作製
ヒト・インターロイキン１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ又はｈＩＬ−１７Ｆ）及び１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ又はｈＩＬ−１７Ａ）並びにラット・インターロイキンＩＬ−１７Ｆ（ラットＩＬ−１７Ｆ又はｒＩＬ−１７Ｆ）をヒト又はラットｃＤＮＡから単離し、次いでｈＣＭＶプロモーター制御下に発現ベクターにサブクローニングした。第２のシストロンとしてＧＦＰを同じＣＭＶプロモーターの制御下にｈＩＬ−１７ｃＤＮＡの下流にクローニングした。これら２種のシストロン（ＩＬ−１７及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。また、このベクターに、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地におけるトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のＧＳ遺伝子を含有させた。図１０はＩＬ−１７発現ベクターのマップである。
【０１１３】
上記ＩＬ−１７発現ベクターは以下の核酸配列（配列番号２１）によってコードされている：
【０１１４】
【化２１−１】
【０１１５】
【化２１−２】
【０１１６】
【化２１−３】
【０１１７】
【化２１−４】
実施例３：Ａ６ ＶＬ発現ベクターの作製
ＩＬ−１７サイトカインと同様な分子量の対照タンパク質を作製するために、ＮＩ−０５０１モノクローナル抗体（国際公開第０６／１０９１９１号に開示されている抗ＩＦＮγモノクローナル抗体）の軽鎖（可変領域及び定常領域）をｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクターにサブクローニングした。第２のシストロンとしてＧＦＰを同じＣＭＶプロモーターの制御下にＡ６ ＶＬ ｃＤＮＡの下流にクローニングした。これら２種のシストロン（Ａ６ ＶＬ及びＧＦＰ）をウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。また、このベクターに、ＭＳＸを用いた無グルタミン培地におけるトランスフェクトした細胞の選択のためにＳＶ４０プロモーター制御下のＧＳ遺伝子を含有させた。
【０１１８】
実施例４：天然ヒトＩＬ−１７Ｆに対するＮＩ−０７０１ベクターのトランスフェクション
Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｐｌｃのＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株を用いてヒトＩＬ−１７Ｆ及びＮＩ−０７０１の産生のための準安定的トランスフェクションによるプール又は安定的トランスフェクションによる細胞株を作製した。本明細書で用いている「トランスフェクション」という語は線状化ＤＮＡを電気穿孔法によって細胞内に導入することを述べたものである。「準安定的トランスフェクション」という表現は、選択圧下に組換えタンパク質発現プール、即ち、細胞株の混合物を作製することを意味する。「安定的トランスフェクション」という表現は、選択圧下に単離組換えタンパク質産生細胞株を作製することを意味する。
【０１１９】
つまり、６ｍＭのＬ−グルタミンを補充した培地ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の指数関数的に増殖している細胞を以下の条件下に電気穿孔した：０．４ｃｍキュベットにおいて、７００μＬの新鮮ＣＤ−ＣＨＯ中の１．０×１０７個の生細胞をｐＨ７．４のトリスＥＤＴＡ緩衝溶液１００μＬ中４０μｇのＤＮＡと穏やかに混合した後、直ちに３００ボルト、９００μＦの単一パルスを与えた。
【０１２０】
各ＤＮＡ構築のために、直ちに４個のキュベットの内容物を予熱した新鮮なＣＤ−ＣＨＯ２００ｍＬ中に移した。次に、この細胞懸濁物を３個の組織培養処理Ｔ７５フラスコに分配して３つの５０ｍＬ準安定的プールを作製し、残りの細胞懸濁物５０ｍＬを用いて１０枚の９６−穴プレート（ウェル当たり５０μＬ）における限界希釈によって安定的細胞株を作製した。その後、上記のＴ７５フラスコ及び９６−穴プレートを空気中ＣＯ２１０％及び温度３７℃に設定した加湿インキュベータ内に設置した。
【０１２１】
トランスフェクションの約２４時間後に、安定的及び準安定的トランスフェクションの両方に（５０μＭのＭＳＸ補充により）選択圧を加え、Ｔ７５フラスコにはＰＢＳ中ＭＳＸの１００ｍＭ原液２５μＬを添加し、９６−穴プレートには６６．６μＭのＭＳＸを補充した予熱したＣＤ−ＣＨＯをウェル当たり１５０μＬ分注した。最後に、プレート及びフラスコを速やかにインキュベータに戻した。
【０１２２】
安定的トランスフェクションのプレートでは、細胞株の出現は、プレートの底を都合良く表示するために鏡を用いて頻繁に目視観察することにより評価した。「陽性のウェル」は、１個以上のトランスフェクタントコロニーを示すウェルと定義する。図１から、ヒトＩＬ−１７Ｆを用いて安定的にトランスフェクションさせた細胞を接種したウェルプレートは、トランスフェクション後２週目に始まり、５週目まで持続する１個以上のトランスフェクタントコロニーを示す一貫してより高い割合の陽性ウェルを有することが分かる。ＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞の成功は、対照のＮＩ−０７０１トランスフェクトした細胞に対しておよそ１６倍の向上を示している。
【０１２３】
図２から、ＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞を接種したウェルプレートはＮＩ−０７０１トランスフェクトした細胞の場合に比し、ウェル当たりの単一種コロニーよりもウェル当たりの複数コロニーの割合が大きいことが分かる。百分率値は２回の独立した実験の平均を示したものである。「複数コロニー」ウェルは２個以上のいくつかのコロニーを示す陽性ウェルと定義され、これに対して、「単一種コロニー」ウェルは一つの単離されたトランスフェクタントコロニーを示す陽性ウェルからなる。
【０１２４】
図１及び図２のデータを総合すると、ＩＬ−１７Ｆ媒介トランスフェクションはＮＩ−０７０１媒介安定的トランスフェクションよりも効果的であることが分かる。ＩＬ−１７Ｆの発現は選択圧に抵抗性のトランスフェクトした細胞の出現速度及び数を大きく増加させる。
【０１２５】
準安定プールでは、細胞増殖及びＧＦＰ導入遺伝子発現は蛍光顕微鏡を用いた目視検査により周期的に観察される。選択圧に抵抗性の細胞の大部分は、明視野照明の場合に比し、トランスフェクション後６、１５及び２３日にＧＦＰ発現に関して陽性であり、抵抗性細胞株はヒトＩＬ−１７Ｆを発現していることが示唆される（図３）。
【０１２６】
実施例５：トランスフェクション効果に対する外因性ヒトＩＬ−１７Ｆの影響の評価
外因性組換えヒトＩＬ−１７Ｆを含有又は非含有の培養培地の存在下にＡ６ ＶＬ構築体（Ａ６ＶＬ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞内への準安定的トランスフェクションを行った。７、１４、１７及び２１日目にＦＡＣＳ分析により準安定的プールのＧＦＰ発現について分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。得られたデータから、１４、１７及び２１日目において、ＩＬ−１７Ｆを作用させた細胞はＩＬ−１７Ｆを作用させなかった細胞よりも高いレベルのＧＦＰを発現したことが分かる（図４Ａ）。さらに、ＩＬ−１７Ｆの添加により全体的な細胞生存率が特に１７日目に増大した（図４Ｂ）。
【０１２７】
実施例６：ＩＬ−１７サイトカインファミリーの他のメンバーのトランスフェクション
ＩＬ−１７ファミリーとしては、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆが挙げられるが、これらに限定されるものではない。評価すべき最初のＩＬ−１７ファミリーメンバーはＩＬ−１７Ａである。何故なら、ＩＬ−１７ＦとＩＬ−１７Ａとはアミノ酸配列の最も高い相同性及び同一性を共有しているからである。Ａ６ ＶＬ、ＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａ構築体はＣＨＯＫ１ＳＶ細胞において安定的にトランスフェクトされた。トランスフェクトした細胞はトランスフェクションの１４、２２、２８及び３５日後に陽性ウェルの数について評価した。図５から、２２、２８及び３５目では、９６−穴プレート当たりの陽性ウェルの平均数はＡ６ＶＬトランスフェクトした細胞の場合よりもＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞でより大きいことが分かる。従って、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆはいずれも陽性ウェルの出現時間を短縮（即ち、出現速度を増大）させ、その数を増加させた。
【０１２８】
実施例７：ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆの比較
ラットＩＬ−１７Ｆはそのヒト相同体と高い配列相同性を有する。そこで、ラット及びヒトＩＬ−１７Ｆのトランスフェクション能に対する個々の効果を測定した。ヒトＩＬ−１７Ｆ、ラットＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体をＣＨＯＫ１ＳＶ細胞中に安定的又は準安定的にトランスフェクションした。安定的トランスフェクションについては、トランスフェクションの１４、２２、２８及び３５日後に陽性ウェルの数を評価した。準安定的プールについてはＦＡＣＳ分析によりＧＦＰの発現を分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。図６Ａから、２２、２８及び３５日後では９６−穴プレート当たりの陽性ウェルの平均数はＡ６ＶＬトランスフェクトした細胞の場合よりもヒトＩＬ−１７Ｆ及びラットＩＬ−１７Ｆトランスフェクトした細胞でより大きいことが分かる。図６Ｂからは、１４、１７及び２１日目ではヒト又はラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞はＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞よりも高いレベルのＧＦＰを発現した。さらに、ヒトＩＬ−１７Ｆ又はラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞は同じ日にＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞よりも１４及び１７日目に高い生存率を示している（図６Ｃ）。従って、ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションすると、安定的トランスフェクションにおいて陽性ウェルの出現時間が短縮（即ち、出現速度を増大）し、その数が増加した。さらに、ヒト及びラットＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションすると、ＧＦＰ発現のレベルで評価される組換えタンパク質発現のレベルが増大した。
【０１２９】
実施例８：他のＣＨＯ細胞株におけるＩＬ−１７Ｆのトランスフェクション
ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に対してみられる効果がこの細胞株に特有のものでないかどうかを明らかにするために、最初の実験をＣＨＯ−Ｓ細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて再現した。ヒトＩＬ−１７Ｆ及びＡ６ＶＬ構築体をＣＨＯ−Ｓ細胞中に安定的又は準安定的にトランスフェクションした。安定的トランスフェクションについては、トランスフェクションの２２、２８、３５日及び４２日後に陽性ウェルの数を評価した。準安定的プールについては１、２、３、４及び６週後にＦＡＣＳ分析によりＧＦＰの発現を分析した。準安定的プール内の細胞の全体的生存率をトリパンブルー染色後自動血球計数器により測定した。図７Ａから、陽性ウェルの数は、Ａ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞の場合に比し、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞では５倍増加したことが分かる。準安定的トランスフェクションに関しては、図７Ｂから、３、４及び６週後の平均ＧＦＰ発現レベルはＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞の場合に比し、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞では４倍増加した。さらに、ＩＬ−１７Ｆを用いてトランスフェクションした細胞の生存率はＡ６ＶＬを用いてトランスフェクションした細胞に比し、４週後に有意に増加した。従って、ＩＬ−１７ＦはＣＨＯ−Ｓ及びＣＨＯＫ１ＳＶ細胞に対して同様な効果を示した。
【０１３０】
実施例９：ピューロマイシン選択を利用した発現ベクター系を用いたＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰ変異体によるＣＨＯ細胞の安定的トランスフェクション
ヒト・ランテス、ラットＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７ＦをＥＦ１−アルファプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングした。ＧＦＰは第２のシストロンとして同じＥＦ１−アルファプロモーターの制御下にヒト・ランテス、ラットＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆ配列の下流にサブクローニングした。これら２種のシストロンをウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てることにより上記第２（ＧＦＰ）のシストロンの翻訳を可能にした。このベクターにはピューロマイシン耐性遺伝子も含有させた。ＣＨＯ細胞又はＰＥＡＫ細胞を６穴培養皿中に４．０×１０５個／ウェルの密度において３７℃で一夜プレートした。翌日、Ｍｉｒｉｕｓ ｂｉｏ社製ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬をメーカーのガイドラインに従って用い、ウェル当たり２μｇのＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に、ＤＮＡ／Ｍｉｒｉｕｓ複合体の品質管理としてＰＥＡＫ細胞のＧＦＰ発現をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した（図８Ａ）。この実験において各構築体のＧＦＰ発現を確認した。
【０１３１】
並行して、ＣＨＯトランスフェクトした細胞をピューロマイシン（１０μｇ／ｍＬ）選択下の静置培養状態に置いた。必要に応じて新鮮培地を補充し、目視検査によりクローンの出現をモニターした。この実験期間中を通じて、試験した各種発現ベクターでクローンの出現率又はクローンの増殖に差は認められなかった。トランスフェクションの３週後に、クローンをプールし、図８Ｂに示したように、細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって分析した。ＩＬ−１７（ヒト又はラット、Ａ又はＦイソ型）の発現はＧＦＰの発現レベルに著しい影響を及ぼしている。
【０１３２】
実施例１０：１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクター
１５Ｃ１発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１及びヒト・カッパの定常領域カセットとそれぞれ融合した抗体１５Ｃ１の重鎖及び軽鎖可変領域を含む「二重遺伝子」ベクターである。各抗体鎖の発現は強力なｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。また、１５Ｃ１ベクターはＳＶ４０プロモーター制御下のグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子をも含有する。ＧＳはグルタミン酸、アンモニア及びＡＴＰからの必須アミノ酸グルタミンの合成を触媒する。従って、内因性ＧＳ活性を示す細胞株、例えばＣＨＯＫ１ＳＶに対してグルタミンの非存在下、ひいては特異的ＧＳ阻害剤メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）の存在下に選択制限を適用する。
【０１３３】
マウス１５Ｃ１抗体の可変軽鎖配列は以下の核酸配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＳ６４５１６３及び配列番号２２によってコードされている：
【０１３４】
【化２２】
マウス１５Ｃ１抗体の可変重鎖配列は以下の核酸配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＳ６４５１５８及び配列番号２３によってコードされている：
【０１３５】
【化２３】
実施例１１：１５Ｃ１二重遺伝子発現ベクター及びヒトＩＬ−１７Ｆ発現ベクターの共トランスフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
ＩｇＧ発現レベルに対するＩＬ−１７Ｆの効果を判定するために、１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターとヒトＩＬ−１７Ｆ発現ベクターとの共トランスフェクションを行った。
【０１３６】
ヒトＩＬ−１７Ｆ及び１５Ｃ１構築体は電気穿孔法によって共トランスフェクションした。細胞は、安定的クローンを得るために９６−穴プレート中でプレートするか、Ｔ７５フラスコ中に細胞のポリクローナルプールとして保持した。参照基準として、１５Ｃ１ ＭＡｂ二重遺伝子発現ベクターを単独でもトランスフェクションし、得られたトランスフェクトした細胞を同様に処理した。
【０１３７】
９６−穴プレートにおいてプレートしたトランスフェクションＣＨＯ細胞に関して、単一の増殖コロニーの存在をトランスフェクションの２２及び２８日後に目でみることができるウェルの数を評価した。各トランスフェクション条件について、同様なサイズ及び健全な出現を示した２０個のコロニーの上清を採取し、ヒトＩｇＧ／Ｋの濃度を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。トランスフェクションプールに関しても、ヒトＩｇＧ／Ｋの濃度をトランスフェクションの７、１４、２１及び２８日後にＥＬＩＳＡにより測定した。簡単に言うと、上記上清中に存在する全ヒトＩｇＧ／Ｋの捕獲のためのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００５−０９８）及び検出のためのＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ−７１６４）を用いたＥＬＩＳＡによって１５Ｃ１抗体の濃度を評価した。
【０１３８】
図９Ａは、トランスフェクション後１、２、３又は４週のトランスフェクションプールからの上清における１５Ｃ１ヒトＩｇＧ１／カッパ濃度を示したものである。このデータから、トランスフェクション後４週では１５Ｃ１ ＭＡｂの濃度は１５Ｃ１単独のトランスフェクションの場合に比し、上記共トランスフェクション状態では２倍高いことが分かる。従って、このデータから、ＩＬ−１７Ｆは１５Ｃ１産生に対して明白な効果を示したことが分かる。
【０１３９】
図９Ｂは、共トランスフェクション（１５Ｃ１ ＭＡｂ及びヒトＩＬ−１７Ｆ）又は単一トランスフェクション（１５Ｃ１ ＭＡｂ）後２２及び２８日の９６−穴プレート当たりの１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである このデータから、トランスフェクション後２２及び２８日において、共トランスフェクション状態で得られたクローンの数は単一トランスフェクション状態の場合に比し、それぞれ５及び１０倍増加したことが分かる。
【０１４０】
図９Ｃは、各２０個の個々のクローンの上清における１５Ｃ１ ＭＡｂの発現レベルを示したものである。このデータから、高産生クローン（ＥＬＩＳＡにおける領域信号の範囲外のもの）の数は１５Ｃ１単独状態の場合よりも共トランスフェクション状態の場合で２．５倍高くなることが分かる。さらに、２０クローン全ての平均抗体価は１５Ｃ１単独の場合に比し、共トランスフェクション状態で２倍高い。共トランスフェクション状態では、２０個のクローンの全てが、蛍光顕微鏡による評価においてバラツキはあるが強いレベルでＧＦＰを発現した。ＧＦＰ染色の存在は全てのクローンによるヒトＩＬ−１７Ｆの強力な発現の正確な指標である。何故なら、ＩＬ−１７ＦベクターはＩＬ−１７Ｆの下流にＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列を含み、二シストロン性発現を行うからである（実施例２参照）。
【０１４１】
実施例１２：ＩＬ−１７Ｆの存在は細胞のよりしっかりとしたサブクローニングをもたらす。
【０１４２】
図１１Ａ乃至１２に示したように、ＩＬ−１７Ｆの存在によって細胞のサブクローニングのプロセスはよりしっかりしたものになる。図１１Ａ乃至１１Ｃでは、２種のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞株、即ち、ＩＬ−１７Ｆ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを発現する８Ｅ１１及び無関連のｍＡｂを発現するＣ６Ｃ５を６−穴プレートの半固形培地（ＯｐｔｉＣＨＯ及び馴化ＣＨＯ上清を含む酢酸セルロース）中でプレートした。プレート後３日に直径＞０．２ｕｍのクローンを採取し、単離したクローンをＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬにより分析し、定量した。
【０１４３】
実施例１３． ＩＬ−１７Ｆの存在はトランスフェクトした細胞に対する選択圧の増大とそれによる導入遺伝子の生産能の上昇を可能にする。
【０１４４】
図１２では、細胞をＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰ発現カセットを用いてトランスフェクションし、９６−穴プレートにおいて図に示したように５０μＭ又は１００μＭのＭＳＸ選択圧下にプレートした。クローンがトランスフェクションの３乃至５週後に出現したので、次いでＦＡＣＳ分析によりＧＦＰ発現を分析した。
【０１４５】
実施例１４． ＤＨＦＲ選択を利用した発現系を用いた、ＩＬ−１７Ｆ ＩＲＥＳ ＧＦＰによるＣＨＯＤＧ４４の安定的トランスフェクション
ヒトＩＬ−１７Ｆ遺伝子又は適切でないタンパク質及びＧＦＰ遺伝子からなる２種のシストロンをｈＣＭＶプロモーターの制御下に発現ベクター中にサブクローニングした。これら２種のシストロンはウイルスの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てた。上記ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｐＯｐｔｉＶＥＣ）には上記クローニング部位の下流にＩＲＥＳ配列とこれの後にＤＨＦＲ遺伝子をも含有させた。従って、この構築により三シストロン性ｍＲＮＡからのＩＬ−１７Ｆ、ＧＦＰ及び選択マーカ（ＤＨＦＲ）の発現が可能となる（図１３）。
【０１４６】
ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素）は、ＤＮＡ合成に必須である５，６−ジヒドロ葉酸塩の５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸塩への還元を触媒する。ＣＨＯＤＧ４４細胞株はＤＨＦＲ活性を欠くため、プリン前駆体ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）を補充した培地で培養しなければならない。メトトレキサート（ＭＴＸ）はＤＨＦＲ活性を阻害する葉酸拮抗剤である。選択条件としてはＨＴを含有せず、ＭＴＸを補充した培地を使用した。ＣＨＯＤＧ４４細胞は、ＨＴを含む培地（００１２４／００１２５）で標準的な電気穿孔法プロトコルを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後に、培養培地を、ＨＴを含有せず、５００又は１０００ｎＭのＭＴＸを含有する培地で置換した。トランスフェクトした細胞は４倍希釈して９６−穴プレートにプレートした。クローン出現率は目視観察により評価し、単離クローンのＧＦＰ発現をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０１４７】
図１４は、トランスフェクション後３、４及び５週目における９６−穴プレート当たり１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである。このデータから、ＩＬ−１７Ｆは対照に比し、１個以上のトランスフェクタントコロニーを呈示するウェルの数を５倍増加させることが分かる。また、ＩＬ−１７Ｆはより高い（２倍の）レベルの選択剤での選択を可能にすることも分かる。
【０１４８】
図１５は、トランスフェクション後５週目における個々のクローンのＧＦＰ発現レベルを示したものである。このデータから、５００ｎＭのＭＴＸでは高度及び極めて高度のＧＦＰ産生クローンの割合が高くなることが分かる。選択圧を（５００ｎＭから１，０００ｎＭのＭＴＸへ）上げることで、ＩＬ−１７Ｆは低度のＧＦＰ産生クローンの割合の低下を可能にし、極めて高度のＧＦＰ産生クローンの割合を高める。
【０１４９】
実施例１５：ＣＨＯ細胞におけるＩＬ−１７Ｆ及び完全なＩｇＧの同時発現
同時二シストロン性発現カセットを含有するプラスミドを作製した。第１の発現カセットは、ＩｇＧ軽鎖配列に続いてＩＲＥＳとこれの後にＧＦＰ遺伝子を有する二重シストロン性遺伝子で構成した。第２の発現カセットは、ＩｇＧ重鎖配列に続いてＩＲＥＳとこれの後にヒトＩＬ−１７Ｆ遺伝子又は適切でないタンパク質遺伝子で構成した。こうした構築により、単一プラスミドで組立ＩｇＧタンパク質、ＧＦＰ及びヒトＩＬ−１７Ｆ又は無関連タンパク質の産生が可能となる。これらの「二重二重（ｄｏｕｂｌｅ ｄｏｕｂｌｅ）遺伝子」ベクターを標準的な電気穿孔法プロトコルを用いてＣＨＯＫ１ＳＶ中にトランスフェクションした。
【０１５０】
図１６は、トランスフェクション後３、４及び５週目における９６−穴プレート当たりの１個以上のコロニーを含むウェルの数を示したものである。このデータから、ＩＬ−１７Ｆはクローンの出現を高めることが分かる。
【０１５１】
図１７は、トランスフェクション後４週目における個々のクローンのＩｇＧの平均レベルを示したものである。このデータから、完全なＩｇＧタンパク質と共にヒトＩＬ−１７Ｆを発現させると、高度ＩｇＧ産生クローンの選択が強化されることが分かる。
【０１５２】
実施例１６：ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬ技術を用いたクローン選択に対するＩＬ−１７Ｆの効果
種々のレベル（おおよそのＩＬ−１７Ｆ発現レベルに対応して適宜「高」、「中」及び「低」と呼ぶ）のヒトＩＬ−１７Ｆタンパク質を安定的に発現するＣＨＯ細胞株を選択した。（馴化培地を含むか、含まない）半固形培地を含有する６−穴プレートに種々の濃度（５０、５００及び５，０００個／ｍＬ）の細胞を接種した。細胞は９日間培養した。単一増殖コロニーの数は、ＣｌｏｎｅＰｉｘＦＬイメージングステーションを用いた白色光学顕微鏡により５及び９日目に評価した。
【０１５３】
３濃度のＩＬ−１７Ｆ発現ＣＨＯ細胞を接種した３ウェルからの増殖コロニーの総数を測定した。このデータから、ＩＬ−１７Ｆは馴化培地ではなく補充培地において単一増殖クローンの数を増加させることが分かった。クローン数に対するＩＬ−１７Ｆの効果は用量依存性であった。
他の実施態様
本発明についてその詳細な記述と併せて記載したが、前述の記載は例示することを意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、その範囲は添付した「特許請求の範囲」の範囲によって決定される。他の態様、利点及び変形は添付の「特許請求の範囲」内にある。
【０１５４】
本明細書において参照された特許及び科学文献は、当業者にとって入手可能な知識を確立する。本明細書において引用された全ての米国特許及び公開又は未公開の米国特許出願は、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用された公開された外国の特許及び特許出願は全て、参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用されたアクセッション番号で示されたジェンバンク及びＮＣＢＩ提出物は参照により本明細書に組み込まれている。本明細書において引用された他の全ての公開された参考文献、文書、原稿、及び科学文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５５】
本発明を、その好ましい実施態様を参照して詳細に図示して説明してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態及び細部のさまざまな変更が可能なことは理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸での細胞の改変の特性を向上させるためにＩＬ−１７を使用する方法であって、該細胞を該ＩＬ−１７と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−１７への曝露が、ＩＬ−１７に接触させない細胞と比べて、前記核酸の増強された発現を引き起こす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−１７が前記改変前、該改変中、該改変後及びこれらの組合せから選択される時期に細胞と接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−１７が細胞と連続的に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−１７が培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ｆである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が選択圧下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変が準安定的又は安定的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１７が前記核酸と同時又は逐次的に産生される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１７が誘導プロモーターの制御下にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が哺乳動物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がヒト細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中の初代細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変の増強した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
１種以上の外因性遺伝子の増強した発現が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞改変の効果を向上させる方法であって、
（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、
（ｂ）１以上の細胞又は細胞株を核酸と接触させる工程、
（ｃ）改変細胞を培地中で培養して該核酸によりコードされているポリペプチドを発現させる工程であって、細胞は、該接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７に曝露される、工程
を含み、
トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される、方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−１７への曝露が、ＩＬ−１７に接触させない細胞と比べて、前記核酸の増強された発現を引き起こす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−１７が前記改変前、該改変中、該改変後及びこれらの組合せから選択される時期に細胞と接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１７が細胞と連続的に接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＬ−１７が前記培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸がＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ｆである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が選択圧下にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記改変が準安定的又は安定的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記改変が一過性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１７が該核酸と同時又は逐次的に産生される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が哺乳動物細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がヒト細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中の初代細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変の増強した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
１種以上の外因性遺伝子の増強した発現が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現である、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
サブクローニング又は単一細胞クローニングの特性を向上させる方法であって、
（ａ）培地中で１以上のクローン化細胞又は細胞株を培養する工程、
（ｂ）該１以上のクローン化細胞又は細胞株をＩＬ−１７組成物と接触させる工程
を含み、
該１以上のクローン化細胞又は細胞株が該ＩＬ−１７組成物との接触後に向上した特性を示す、方法。
【請求項４２】
前記ＩＬ−１７組成物が細胞と連続的に接触する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＩＬ−１７が前記培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆから選択されるＩＬ−１７サイトカインを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＩＬ−１７組成物がＩＬ−１７Ｆを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が選択圧下にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記クローン化細胞又は細胞株が哺乳動物細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記クローン化細胞又は細胞株がヒト細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記クローン化細胞又は細胞株が培養物中の初代細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記クローン化細胞又は細胞株が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞又は細胞株がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記向上した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
準安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、
（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、
（ｂ）該ＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、
（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、
（ｄ）ＭＳＸを該培地に添加することによる選択圧下の該グルタミン枯渇培地でトランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに
（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされた該ＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、
トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成される、方法。
【請求項５５】
前記トランスフェクションが安定的であり、かつ、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
準安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記トランスフェクションが安定的であり、かつ、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成される、請求項５６に記載の方法。
【請求項１】
核酸での細胞の改変の特性を向上させるためにＩＬ−１７を使用する方法であって、該細胞を該ＩＬ−１７と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記ＩＬ−１７への曝露が、ＩＬ−１７に接触させない細胞と比べて、前記核酸の増強された発現を引き起こす請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＬ−１７が前記改変前、該改変中、該改変後及びこれらの組合せから選択される時期に細胞と接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ−１７が細胞と連続的に接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−１７が培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ｆである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が選択圧下にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変が準安定的又は安定的である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１７が前記核酸と同時又は逐次的に産生される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１７が誘導プロモーターの制御下にある、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が哺乳動物細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がヒト細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中の初代細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変の増強した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
１種以上の外因性遺伝子の増強した発現が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
細胞改変の効果を向上させる方法であって、
（ａ）培地中で１以上の細胞又は細胞株を培養する工程、
（ｂ）１以上の細胞又は細胞株を核酸と接触させる工程、
（ｃ）改変細胞を培地中で培養して該核酸によりコードされているポリペプチドを発現させる工程であって、細胞は、該接触工程の前又は接触工程中にＩＬ−１７に曝露される、工程
を含み、
トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する１以上の細胞株が生成される、方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−１７への曝露が、ＩＬ−１７に接触させない細胞と比べて、前記核酸の増強された発現を引き起こす、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−１７が前記改変前、該改変中、該改変後及びこれらの組合せから選択される時期に細胞と接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＬ−１７が細胞と連続的に接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＬ−１７が前記培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸がＩＬ−１７サイトカインをコードしている１種以上の配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ又はＩＬ−１７Ｆである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ｆである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が選択圧下にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記改変が準安定的又は安定的である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記改変が一過性である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−１７が該核酸と同時又は逐次的に産生される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が哺乳動物細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がヒト細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中の初代細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞又は細胞株（単数又は複数）がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
前記改変の増強した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
１種以上の外因性遺伝子の増強した発現が、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の増大した比産生速度、上昇したＭＡｂ力価、向上した産物の品質、ＩＬ−１７発現のＭＡｂ力価との相関、トランスフェクション抵抗性細胞株の一過性改変後の増大した発現、又は増大した導入遺伝子生産能、ゲノム配列への外因性ＤＮＡの増大した組込み、外因性ＤＮＡの増大した保持、ＤＮＡの増大した取り込み、もしくは外因性ＤＮＡの増大した発現である、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
サブクローニング又は単一細胞クローニングの特性を向上させる方法であって、
（ａ）培地中で１以上のクローン化細胞又は細胞株を培養する工程、
（ｂ）該１以上のクローン化細胞又は細胞株をＩＬ−１７組成物と接触させる工程
を含み、
該１以上のクローン化細胞又は細胞株が該ＩＬ−１７組成物との接触後に向上した特性を示す、方法。
【請求項４２】
前記ＩＬ−１７組成物が細胞と連続的に接触する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＩＬ−１７が前記培養培地中に存在することによって細胞と接触する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＩＬ−１７がＩＬ−１７を発現するように形質転換された細胞によって産生される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＩＬ−１７がＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ及びＩＬ−１７Ｆから選択されるＩＬ−１７サイトカインを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＩＬ−１７組成物がＩＬ−１７Ｆを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が選択圧下にある、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記クローン化細胞又は細胞株が哺乳動物細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記クローン化細胞又は細胞株がヒト細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
前記クローン化細胞又は細胞株が培養物中の初代細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５１】
前記クローン化細胞又は細胞株が培養物中のハイブリドーマ細胞を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞又は細胞株がＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞株であるか、又はＣＨＯ細胞もしくはＣＨＯ細胞株に由来する、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記向上した特性が、増大した効率、向上した選択率、増大した細胞増殖、選択した細胞の増大した出現速度、選択した細胞株の増大した数、選択した細胞の増強した倍加時間、増大した細胞生存度、増大した細胞株の安定性、培地枯渇に対する低下した感受性及びこれらの組合せから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５４】
準安定的トランスフェクションの選択率を向上させる方法であって、
（ａ）無血清懸濁物適応チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株をグルタミン枯渇培地で培養する工程、
（ｂ）該ＣＨＯ細胞株をヒトＩＬ−１７Ｆ及びグルタミン合成酵素遺伝子をコードしている配列を含むＤＮＡ組成物と混合する工程、
（ｃ）１種以上のＤＮＡ組成物を電気穿孔法により少なくとも１の細胞株の形質膜を横切って輸送させる工程、
（ｄ）ＭＳＸを該培地に添加することによる選択圧下の該グルタミン枯渇培地でトランスフェクトした細胞を培養する工程、並びに
（ｅ）トランスフェクトした細胞に選択圧下トランスフェクトされた該ＤＮＡ組成物によりコードされているポリペプチドを発現させる工程を含み、
トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する細胞株の混合物が生成される、方法。
【請求項５５】
前記トランスフェクションが安定的であり、かつ、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
準安定的トランスフェクションの選択した細胞の数を増大させる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記トランスフェクションが安定的であり、かつ、トランスフェクションの向上した特性を示す、１種以上のポリペプチドを発現する単離された細胞株が生成される、請求項５６に記載の方法。
【図８】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１０】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公表番号】特表２０１２−５０４９５３（Ｐ２０１２−５０４９５３Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０５８９（Ｐ２０１１−５３０５８９）
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７２３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４１１４５
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０６１９８５６２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月７日（２００９．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００７２３５
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４１１４５
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５０６１９８５６２）
【Ｆターム（参考）】
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