Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法
【課 題】 ３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから優先的にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを工業的有利に生産すること。
【解決手段】 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【解決手段】 リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品として有用なことが知られている光学活性Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳと略記する。）を製造する方法に関する。さらに詳しくは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを生産することのできる酵素を産生する微生物菌体あるいはその調製物により、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳを選択的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳの合成は、以下の方法により行なわれていた。即ち、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ基部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する方法である（化学合成法）。
しかし、上記ベンズアルデヒド誘導体とグリシンからの化学合成法では、高立体選択的な合成が困難なため、スレオ／エリスロ体、Ｄ／Ｌ体の４種類の異性体が生成し、目的のＬ−スレオ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程が必要となるばかりでなく、Ｄ／Ｌ体の光学分割にはキニン、ブルシン等の非常に高価な光学分割剤を用いなければならない等の問題点がある。
【０００３】
また、エシェリヒア属に属する微生物等により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼや、バチルス属に属する微生物により得られるフェニルセリンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている（特許文献１〜特許文献５、非特許文献１）。しかし、これらの酵素を用いた場合も、Ｌ−スレオ−フェニルセリン誘導体ばかりではなく、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン誘導体がかなりの割合で副生し、これらのＬ−エリスロ体を除去しなければならないという問題点があった。非特許文献１によるとエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼを用いて、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンからＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は、−５０〜４６％ｄ．ｅ．であった。
【０００４】
さらに、シュードモナス属に属する微生物により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を、選択性５７．５〜１００％ｄ．ｅ．で（非特許文献２参照）、アエロモナス属に属する微生物により得られるＬ−アロ−スレオニンアルドラーゼにベンズアルデヒドとグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリンを選択性７３．２％ｄ．ｅ．で（非特許文献３参照）で得る方法が知られているが、その他の微生物での報告はなかった。
尚、選択性を表わす指標過剰率（％ｄ．ｅ．）は次の計算式により算出される。Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）＝｛（Ｌ−スレオ体−Ｌ−エリスロ体）÷（Ｌ−スレオ体＋Ｌ−エリスロ体）｝×１００
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リウ・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ）他５名、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題を解決し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを得ることのできる新たな微生物を用いたＬ−スレオ−ＤＯＰＳの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する菌株のスクリーニングを行なった結果、リゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属す微生物が、高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成することを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
［２］微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から選択される種に属することを特徴とする前項［１］記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、および
［３］微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）｛独立行政法人製品評価技術基盤機構、生物遺伝資源部門保存カタログ番号（ＮＢＲＣ生物資源カタログ）：ＮＢＲＣ１５２９６｝、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００またはＮＢＲＣ１５２０１）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８７）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８３）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８４）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７８２）から選択される微生物の菌株であることを特徴とする前項［１］記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により見出されたリゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属す微生物は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する能力を有していることから、これらに属する微生物種を使用することにより、医薬品として有用なことが知られているＬ−スレオ−ＤＯＰＳを効率良く安価に製造する事が出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いる微生物は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する為の酵素であるＬ−スレオニンアルドラーゼを菌体内に有する。Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素である。また、Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、前記の逆反応でグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンを生成する反応も触媒する酵素である。さらにまた、該酵素はアセトアルデヒドばかりではなく、他のアルデヒドでも上記触媒反応を進行させる。従って、該酵素による上記の逆反応を利用し、アルデヒド化合物として３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンとの反応によりＬ−スレオ−ＤＯＰＳを効率良く合成することができると考えられる。
【００１０】
本発明に使用される微生物としては、リゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属等に属する微生物であって、Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生しうる微生物が好ましく挙げられる。
リゾビウム属に属す微生物としては、例えばリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）種に属する独立行政法人製品評価技術基盤機構（以下、同機構と略記することもある。）、生物遺伝資源部門生物資源カタログ番号ＮＢＲＣ３０５８，ＮＢＲＣ１２６０７，ＮＢＲＣ１２６６４，ＮＢＲＣ１２６６５，ＮＢＲＣ１３５３２，ＮＢＲＣ１３５３３，ＮＢＲＣ１４５５４，ＮＢＲＣ１４５５５，ＮＢＲＣ１５１８８，ＮＢＲＣ１５１８９，ＮＢＲＣ１５１９０，ＮＢＲＣ１５１９１，ＮＢＲＣ１５１９２，ＮＢＲＣ１５１９３，ＮＢＲＣ１５１９４，ＮＢＲＣ１５１９５，ＮＢＲＣ１５２９２，ＮＢＲＣ１５２９３，ＮＢＲＣ１５２９４，ＮＢＲＣ１５２９５，ＮＢＲＣ１５２９６またはＮＢＲＣ１５２９７等や，リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７９３，ＮＢＲＣ１５１９６，ＮＢＲＣ１５１９７，ＮＢＲＣ１５１９８，ＮＢＲＣ１５１９９，ＮＢＲＣ１５２００，ＮＢＲＣ１５２０１またはＮＢＲＣ１５２０２等が好ましく挙げられる。
【００１１】
メソリゾビウム属に属す微生物としては、例えばメソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８９等，メソリゾビウム・フワクイ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈｕａｋｕｉｉ）種に属す同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１５２４３またはＮＢＲＣ１５２４４等，あるいはメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１３３３６，ＮＢＲＣ１４９９６，ＮＢＲＣ１４９９７，ＮＢＲＣ１４９９８，ＮＢＲＣ１４９９９またはＮＢＲＣ１５０００等が好ましく挙げられる。
オクロバクトラム属に属す微生物としては、例えばオクロバクトラム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１５８１９等，オクロバクトラム・インターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１２９５１，ＮＢＲＣ１３６９４またはＮＢＲＣ１５８２０等，あるいはオクロバクトラム・エスピー（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｓｐ．）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１２９５０，ＮＢＲＣ１２９５２またはＮＢＲＣ１２９５３等が好ましく挙げられる。
シュードアミノバクター属に属す微生物としては、例えばシュードアミノバクター・デフルビ（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｆｌｕｖｉｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４５７０等が好ましく挙げられる。
エンシファー属に属す微生物としては、例えばエンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８７またはＮＢＲＣ１００３８８等，エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８３等，エンシファー・フレディ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｆｒｅｄｉｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７８０等，エンシファー・コスティエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｋｏｓｔｉｅｎｓｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８２等，エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８４等，エンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７８２等，エンシファー・サヘリ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓａｈｅｌｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８６等，またはエンシファー・キシンジアンエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１０００１８等が好ましく挙げられる。
これらの微生物の中でもリゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、エンシファー・アドヘレンス、エンシファー・アルボリス、エンシファー・メディカまたはエンシファー・メリロティがより好ましく、ＮＢＲＣ１５２９６、ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００、ＮＢＲＣ１５２０１、ＮＢＲＣ１００３８７、ＮＢＲＣ１００３８３、ＮＢＲＣ１００３８４またはＮＢＲＣ１４７８２が特に好ましい。
また、これら微生物は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を一緒に使用してもよい。
尚、これらの微生物は独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本、木更津）に保存されている菌株であり、誰にでも容易に入手することができる。
【００１２】
本発明に用いられるリゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属する菌株（微生物）は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段で変異させられる場合があるが、このような変異株（変異微生物）であっても本発明の対象とする３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する能力を有するかぎり、全て本発明に使用することが出来る。
【００１３】
微生物は下記する微生物培養培地等で、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のpH約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００１４】
微生物の調製物としては、例えば凍結乾燥やアセトン処理等による乾燥菌体、微生物から分離、精製して調製した酵素（Ｌ−スレオニンアルドラーゼ）、担体に微生物または酵素を結合させた固定化微生物または固定化酵素等が挙げられる。酵素の精製法は、菌体（微生物）を超音波やガラスビーズで破砕した後、例えば硫安沈殿、イオン交換またはゲルろ過カラムクロマトグラフィー等といった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００１５】
担体としては、通常微生物や酵素の固定化に使用される担体、例えばセライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体 、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリルアミド、カラギーナン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられ、公知の方法、例えば吸着法、イオン結合法、共有結合法または生化学的特異結合法等により前記担体に、微生物や酵素等の微生物調製物を固定化できる。
【００１６】
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液（以下、反応液と略記する。）の基礎となる溶液としては、本発明に使用される微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素の働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液等が好ましく挙げられる。
【００１７】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００１８】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００１９】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
【００２０】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００２１】
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００２２】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００２３】
反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドはＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常反応液の０．１〜１０％(ｗｔ)程度である。またその供給方法としては、反応液へ分割添加や連続的に添加する方法等で行うことが出来る。
【００２４】
反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％(ｗｔ)程度を反応液中に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドに対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと同様に反応液に添加できる。
【００２５】
尚、本発明の３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する反応（以下、単に反応ということもある）を触媒する酵素（Ｌ−スレオニンアルドラーゼ）は構成酵素と考えられるので、反応液中に必ずしもスレオニンあるいは本発明の目的物質（Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ）等を添加する必要がないが、場合によりスレオニンやその類似物質を添加してもよい。これらを添加することにより、より触媒活性が高められることがある。
【００２６】
反応液と微生物との接触は、例えば培養した微生物を遠心分離機やろ過等で集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズ等で破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を反応液と接触させても良い。
反応液と微生物またはその調製物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。また、反応液と微生物をフィルターなどにより分離し、微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００２７】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめる。反応時間としては、通常約１〜４８時間の範囲で実施できる。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、反応液と微生物の反応は、微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００２８】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸等を添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
【００２９】
かくして反応せしめた反応液中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−スレオ−ＤＯＰＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜８０％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し得る。
反応液中から合成されたＬ−スレオ−ＤＯＰＳの採取および精製は、イオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲル等のクロマト分離、酢酸エチルやトルエン等の有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化等を組み合わせて行なうことができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例１】
【００３１】
表１に示した微生物をそれぞれ下記の培地Ａまたは培地Ｂ１０ｍＬで、３０℃、１〜４日間（表１に詳記）振とう培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で３回洗浄後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに懸濁し、直径０．１ｍｍのガラスビーズ１ｍＬを加え、ビーズホモジナイザー（モデルＢＣ−２０，セントラル科学貿易社製）で２，０００ｒｐｍ、３分間の細胞粉砕処理を二回繰り返した後、遠心分離により無細胞抽出液を得た。
培地Ａ：
ポリペプトン１．０％，酵母エキス０．２％，硫酸マグネシウム０．１％，ビリドキシン０．０５％，ｐＨ７．０
培地Ｂ：
グルコース１．０％，ポリペプトン１．０％，酵母エキス０．２％，硫酸マグネシウム０．１％，ビリドキシン０．０５％，ｐＨ７．０
反応は以下の条件で行なった。
反応液組成：
３０ｍｇ／ｍＬ ３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド
と３００ｍｇ／ｍＬ グリシン混合溶液 ３３３μＬ
０．６ｍｇ／ｍＬ ビリドキサール−６−リン酸 ２５μＬ
２−メルカプトエタノール １μＬ
無細胞抽出液 １４１μＬ
反応温度： ３７℃
反応時間： ３時間
反応終了後、反応液に１．５ｍＬのメタノールを添加し攪拌混合し反応を停止させ、遠心分離により沈殿を除去した上清の反応混合物中に存在するＬ−スレオ／エリスロ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析・定量した。
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
カラム：コスモシル５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
移動相：０．１％１−ヘプタンスルホン酸（リン酸でｐＨ２．５に調整）／メタノール／１，４−ジオキサン＝５００／５０／１５
流速：０．７５ｍＬ／分
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
【００３２】
結果を表１に表示する。尚、立体選択性は以下の計算式により算出した。
【数１】
表１の結果から、本発明の方法に使用される微生物を用いて３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、両化合物の反応生成物として、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳが、エリスロ体に比べて高選択的に生成されることが明らかとなった。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００３３】
医薬品として有用なＬ−スレオ−ＤＯＰＳの製造を煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に実施できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品として有用なことが知られている光学活性Ｌ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン（以下Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳと略記する。）を製造する方法に関する。さらに詳しくは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを生産することのできる酵素を産生する微生物菌体あるいはその調製物により、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳを選択的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳの合成は、以下の方法により行なわれていた。即ち、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ−スレオ／エリスロ−フェニルセリン誘導体を得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行い、得られたラセミ−スレオ−フェニルセリン誘導体のアミノ基部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去する方法である（化学合成法）。
しかし、上記ベンズアルデヒド誘導体とグリシンからの化学合成法では、高立体選択的な合成が困難なため、スレオ／エリスロ体、Ｄ／Ｌ体の４種類の異性体が生成し、目的のＬ−スレオ−ＤＯＰＳを得るためには繁雑な分離工程が必要となるばかりでなく、Ｄ／Ｌ体の光学分割にはキニン、ブルシン等の非常に高価な光学分割剤を用いなければならない等の問題点がある。
【０００３】
また、エシェリヒア属に属する微生物等により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼや、バチルス属に属する微生物により得られるフェニルセリンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を得る方法が知られている（特許文献１〜特許文献５、非特許文献１）。しかし、これらの酵素を用いた場合も、Ｌ−スレオ−フェニルセリン誘導体ばかりではなく、Ｌ−エリスロ−フェニルセリン誘導体がかなりの割合で副生し、これらのＬ−エリスロ体を除去しなければならないという問題点があった。非特許文献１によるとエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−スレオニンアルドラーゼを用いて、ベンズアルデヒド誘導体とグリシンからＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を合成する場合の選択性は、−５０〜４６％ｄ．ｅ．であった。
【０００４】
さらに、シュードモナス属に属する微生物により得られるＬ−スレオニンアルドラーゼにアルデヒド誘導体とグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリン誘導体を、選択性５７．５〜１００％ｄ．ｅ．で（非特許文献２参照）、アエロモナス属に属する微生物により得られるＬ−アロ−スレオニンアルドラーゼにベンズアルデヒドとグリシンを作用させてＬ−スレオ−フェニルセリンを選択性７３．２％ｄ．ｅ．で（非特許文献３参照）で得る方法が知られているが、その他の微生物での報告はなかった。
尚、選択性を表わす指標過剰率（％ｄ．ｅ．）は次の計算式により算出される。Ｌ−スレオ体過剰率（％ｄ．ｅ．）＝｛（Ｌ−スレオ体−Ｌ−エリスロ体）÷（Ｌ−スレオ体＋Ｌ−エリスロ体）｝×１００
【特許文献１】特公昭５２−４６３１３号公報
【特許文献２】特公昭５１−６２３９号公報
【特許文献３】特公昭５４−３９５２号公報
【特許文献４】特公昭５４−１２５５４号公報
【特許文献５】特開平９−２３８６８０号公報
【非特許文献１】キムラ・ティー（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．）他３名、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９７年、第１１９巻、ｐ．１１７３４−１１７４２
【非特許文献２】リウ・ジェイ・キュー（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｑ）他５名、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）、１９９８年、第４９巻、ｐ．７０２−７０８
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、１９９８年、第７２（５）巻、ｐ．７４６−７４７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題を解決し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを得ることのできる新たな微生物を用いたＬ−スレオ−ＤＯＰＳの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する菌株のスクリーニングを行なった結果、リゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属す微生物が、高選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成することを見出し、本発明に到達した。
【０００７】
すなわち、本発明は、
［１］リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
［２］微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から選択される種に属することを特徴とする前項［１］記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、および
［３］微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）｛独立行政法人製品評価技術基盤機構、生物遺伝資源部門保存カタログ番号（ＮＢＲＣ生物資源カタログ）：ＮＢＲＣ１５２９６｝、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００またはＮＢＲＣ１５２０１）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８７）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８３）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８４）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７８２）から選択される微生物の菌株であることを特徴とする前項［１］記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法、
に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により見出されたリゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属す微生物は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから選択的にＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する能力を有していることから、これらに属する微生物種を使用することにより、医薬品として有用なことが知られているＬ−スレオ−ＤＯＰＳを効率良く安価に製造する事が出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に用いる微生物は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する為の酵素であるＬ−スレオニンアルドラーゼを菌体内に有する。Ｌ−スレオニンアルドラーゼは主としてＬ−スレオニンからグリシンとアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素である。また、Ｌ−スレオニンアルドラーゼは、前記の逆反応でグリシンとアセトアルデヒドからＬ−スレオニンを生成する反応も触媒する酵素である。さらにまた、該酵素はアセトアルデヒドばかりではなく、他のアルデヒドでも上記触媒反応を進行させる。従って、該酵素による上記の逆反応を利用し、アルデヒド化合物として３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンとの反応によりＬ−スレオ−ＤＯＰＳを効率良く合成することができると考えられる。
【００１０】
本発明に使用される微生物としては、リゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属等に属する微生物であって、Ｌ−スレオニンアルドラーゼを産生しうる微生物が好ましく挙げられる。
リゾビウム属に属す微生物としては、例えばリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）種に属する独立行政法人製品評価技術基盤機構（以下、同機構と略記することもある。）、生物遺伝資源部門生物資源カタログ番号ＮＢＲＣ３０５８，ＮＢＲＣ１２６０７，ＮＢＲＣ１２６６４，ＮＢＲＣ１２６６５，ＮＢＲＣ１３５３２，ＮＢＲＣ１３５３３，ＮＢＲＣ１４５５４，ＮＢＲＣ１４５５５，ＮＢＲＣ１５１８８，ＮＢＲＣ１５１８９，ＮＢＲＣ１５１９０，ＮＢＲＣ１５１９１，ＮＢＲＣ１５１９２，ＮＢＲＣ１５１９３，ＮＢＲＣ１５１９４，ＮＢＲＣ１５１９５，ＮＢＲＣ１５２９２，ＮＢＲＣ１５２９３，ＮＢＲＣ１５２９４，ＮＢＲＣ１５２９５，ＮＢＲＣ１５２９６またはＮＢＲＣ１５２９７等や，リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７９３，ＮＢＲＣ１５１９６，ＮＢＲＣ１５１９７，ＮＢＲＣ１５１９８，ＮＢＲＣ１５１９９，ＮＢＲＣ１５２００，ＮＢＲＣ１５２０１またはＮＢＲＣ１５２０２等が好ましく挙げられる。
【００１１】
メソリゾビウム属に属す微生物としては、例えばメソリゾビウム・シセリ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｃｉｃｅｒｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８９等，メソリゾビウム・フワクイ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈｕａｋｕｉｉ）種に属す同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１５２４３またはＮＢＲＣ１５２４４等，あるいはメソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１３３３６，ＮＢＲＣ１４９９６，ＮＢＲＣ１４９９７，ＮＢＲＣ１４９９８，ＮＢＲＣ１４９９９またはＮＢＲＣ１５０００等が好ましく挙げられる。
オクロバクトラム属に属す微生物としては、例えばオクロバクトラム・アントロピ（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ａｎｔｈｒｏｐｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１５８１９等，オクロバクトラム・インターメディウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１２９５１，ＮＢＲＣ１３６９４またはＮＢＲＣ１５８２０等，あるいはオクロバクトラム・エスピー（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ ｓｐ．）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１２９５０，ＮＢＲＣ１２９５２またはＮＢＲＣ１２９５３等が好ましく挙げられる。
シュードアミノバクター属に属す微生物としては、例えばシュードアミノバクター・デフルビ（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｄｅｆｌｕｖｉｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４５７０等が好ましく挙げられる。
エンシファー属に属す微生物としては、例えばエンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８７またはＮＢＲＣ１００３８８等，エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８３等，エンシファー・フレディ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｆｒｅｄｉｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７８０等，エンシファー・コスティエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｋｏｓｔｉｅｎｓｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８２等，エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８４等，エンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１４７８２等，エンシファー・サヘリ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｓａｈｅｌｉ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１００３８６等，またはエンシファー・キシンジアンエンシス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）種に属する同機構保存菌株番号ＮＢＲＣ１０００１８等が好ましく挙げられる。
これらの微生物の中でもリゾビウム・ラジオバクター、リゾビウム・リゾゲネス、エンシファー・アドヘレンス、エンシファー・アルボリス、エンシファー・メディカまたはエンシファー・メリロティがより好ましく、ＮＢＲＣ１５２９６、ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００、ＮＢＲＣ１５２０１、ＮＢＲＣ１００３８７、ＮＢＲＣ１００３８３、ＮＢＲＣ１００３８４またはＮＢＲＣ１４７８２が特に好ましい。
また、これら微生物は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を一緒に使用してもよい。
尚、これらの微生物は独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本、木更津）に保存されている菌株であり、誰にでも容易に入手することができる。
【００１２】
本発明に用いられるリゾビウム属、メソリゾビウム属、オクロバクトラム属、シュードアミノバクター属またはエンシファー属に属する菌株（微生物）は、紫外線、エックス線または薬品等を用いる人工的な変異手段で変異させられる場合があるが、このような変異株（変異微生物）であっても本発明の対象とする３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する能力を有するかぎり、全て本発明に使用することが出来る。
【００１３】
微生物は下記する微生物培養培地等で、培養温度約２０〜４０℃、培養時間約１〜７日間、培地のpH約５．０〜８．０程度で培養されることが好ましい。
【００１４】
微生物の調製物としては、例えば凍結乾燥やアセトン処理等による乾燥菌体、微生物から分離、精製して調製した酵素（Ｌ−スレオニンアルドラーゼ）、担体に微生物または酵素を結合させた固定化微生物または固定化酵素等が挙げられる。酵素の精製法は、菌体（微生物）を超音波やガラスビーズで破砕した後、例えば硫安沈殿、イオン交換またはゲルろ過カラムクロマトグラフィー等といった通常酵素精製に用いられる精製法を組み合わせて行なうことができる。
【００１５】
担体としては、通常微生物や酵素の固定化に使用される担体、例えばセライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、炭酸カルシウム、セラミックス等の無機担体 、セラミックスパウダー、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリルアミド、カラギーナン、キトサン、イオン交換樹脂、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子等が挙げられ、公知の方法、例えば吸着法、イオン結合法、共有結合法または生化学的特異結合法等により前記担体に、微生物や酵素等の微生物調製物を固定化できる。
【００１６】
３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液（以下、反応液と略記する。）の基礎となる溶液としては、本発明に使用される微生物の生育やＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素の働きを阻害しない溶液であれば特に制限はなく、例えば微生物培養培地または緩衝液等が好ましく挙げられる。
【００１７】
微生物培養培地は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば好ましく用いることができ、例えば炭素源、窒素源、無機塩類およびその他の栄養物質等を含有する天然培地または合成培地等が用いられる。
炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、シュークロース、マンノース、マルトース、マンニトール、キシロース、ガラクトース、澱粉、糖蜜、ソルビトールまたはグリセリン等の糖質および糖アルコール、酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸またはグルコン酸等の有機酸、エタノールまたはプロパノール等のアルコール等が挙げられる。また、所望によりノルマルパラフィン等の炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
これら炭素源の培地における濃度は通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００１８】
窒素源としては、窒素化合物、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機もしくは有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウムまたは硝酸カリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。また、コーンスティープリカー、肉エキス、ペプトン、ＮＺ−アミン、蛋白質加水分解物またはアミノ酸等の含窒素有機化合物等も使用可能である。窒素源は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
窒素源の培地濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００１９】
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルトまたは炭酸カルシウム等が挙げられる。これら無機塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を混合して使用してもよい。
無機塩類の培地濃度は、使用する無機塩によっても異なるが、通常約０．０１〜１．０％（ｗｔ）程度である。
【００２０】
栄養物質としては、例えば肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物または動植物若しくは微生物菌体のエキスやそれらの分解物等が挙げられる。
栄養物質の培地濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常約０．１〜１０％（ｗｔ）程度である。
【００２１】
培地のｐＨは約５．０〜８．０程度が好ましい。
【００２２】
緩衝液としては、例えばリン酸バッファー、トリスバッファー、リン酸緩衝食塩水、酢酸緩衝液等が挙げられる。緩衝液のｐＨは、通常約５〜１０、さらに約６．５〜８．５が好ましい。
【００２３】
反応液中に含まれる３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドはＬ−スレオニンアルドラーゼの酵素活性を阻害しない程度の濃度で用いられ、通常反応液の０．１〜１０％(ｗｔ)程度である。またその供給方法としては、反応液へ分割添加や連続的に添加する方法等で行うことが出来る。
【００２４】
反応液中に含まれる他方の反応基質であるグリシンは、通常約０．１〜３０％(ｗｔ)程度を反応液中に存在せしめて使用されるが、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドに対しては等モル以上で使用することが好ましい。グリシンは、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドと同様に反応液に添加できる。
【００２５】
尚、本発明の３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−ＤＯＰＳを合成する反応（以下、単に反応ということもある）を触媒する酵素（Ｌ−スレオニンアルドラーゼ）は構成酵素と考えられるので、反応液中に必ずしもスレオニンあるいは本発明の目的物質（Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ）等を添加する必要がないが、場合によりスレオニンやその類似物質を添加してもよい。これらを添加することにより、より触媒活性が高められることがある。
【００２６】
反応液と微生物との接触は、例えば培養した微生物を遠心分離機やろ過等で集め、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する反応液に加えて接触せしめてもよく、また集めた微生物を例えば水媒体中で超音波やガラスビーズ等で破砕した後のＬ−スレオニンアルドラーゼを含む遠心分離上清または該上清から精製したＬ−スレオニンアルドラーゼを反応液に加える方法であってもよい。また、固定化微生物や固定化酵素を反応液と接触させても良い。
反応液と微生物またはその調製物との接触方法は、公知の方法、例えばバッチ方式または連続方式（例えば、カラム法、固定化微生物、固定化酵素法等）など、いずれの方法も用いることができる。また、反応液と微生物をフィルターなどにより分離し、微生物を連続的に回収し、繰り返し再使用することもできる。
【００２７】
本発明の反応は、ｐＨ約５〜１０、特に好ましくは約６．５〜８．５において、温度約５〜６０℃、特に約１０〜５０℃で静置若しくは攪拌下に反応を進行せしめる。反応時間としては、通常約１〜４８時間の範囲で実施できる。
また、本発明の反応は、好気、嫌気いずれの条件でも行なうことができる。また、反応液と微生物の反応は、微生物が生存できる条件、例えば上記微生物の培養における条件と同様の条件で実施することが好ましい。
【００２８】
本酵素系には補酵素としてビタミンＢ６が要求されるため、反応液には、例えばピリドキシン、ピリドキサールまたはピリドキサール−５’−リン酸等を添加することが好ましい。該補酵素を添加することにより反応が高められ得る。
また。反応液には、所望により例えば２−メルカプトエタノールのような還元剤を添加することもできる。
【００２９】
かくして反応せしめた反応液中には、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから両化合物の反応生成物であるＬ−スレオ−ＤＯＰＳが高選択的にかつ高収率（反応条件により一概にはいえないが、約１５％ｄ．ｅ．以上、好ましくは約２０％ｄ．ｅ．以上、より好ましくは約２０〜８０％ｄ．ｅ．程度である。）に生成し得る。
反応液中から合成されたＬ−スレオ−ＤＯＰＳの採取および精製は、イオン交換樹脂、吸着樹脂やシリカゲル等のクロマト分離、酢酸エチルやトルエン等の有機溶媒を用いた溶媒抽出、溶解度の差を利用した分別結晶化等を組み合わせて行なうことができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例１】
【００３１】
表１に示した微生物をそれぞれ下記の培地Ａまたは培地Ｂ１０ｍＬで、３０℃、１〜４日間（表１に詳記）振とう培養した。培養液から遠心分離により菌体を集め、生理食塩水で３回洗浄後、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに懸濁し、直径０．１ｍｍのガラスビーズ１ｍＬを加え、ビーズホモジナイザー（モデルＢＣ−２０，セントラル科学貿易社製）で２，０００ｒｐｍ、３分間の細胞粉砕処理を二回繰り返した後、遠心分離により無細胞抽出液を得た。
培地Ａ：
ポリペプトン１．０％，酵母エキス０．２％，硫酸マグネシウム０．１％，ビリドキシン０．０５％，ｐＨ７．０
培地Ｂ：
グルコース１．０％，ポリペプトン１．０％，酵母エキス０．２％，硫酸マグネシウム０．１％，ビリドキシン０．０５％，ｐＨ７．０
反応は以下の条件で行なった。
反応液組成：
３０ｍｇ／ｍＬ ３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド
と３００ｍｇ／ｍＬ グリシン混合溶液 ３３３μＬ
０．６ｍｇ／ｍＬ ビリドキサール−６−リン酸 ２５μＬ
２−メルカプトエタノール １μＬ
無細胞抽出液 １４１μＬ
反応温度： ３７℃
反応時間： ３時間
反応終了後、反応液に１．５ｍＬのメタノールを添加し攪拌混合し反応を停止させ、遠心分離により沈殿を除去した上清の反応混合物中に存在するＬ−スレオ／エリスロ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析・定量した。
ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りである。
カラム：コスモシル５Ｃ１８−ＭＳ（Φ４．６×１５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃
移動相：０．１％１−ヘプタンスルホン酸（リン酸でｐＨ２．５に調整）／メタノール／１，４−ジオキサン＝５００／５０／１５
流速：０．７５ｍＬ／分
検出器：ＵＶ２２０ｎｍ
【００３２】
結果を表１に表示する。尚、立体選択性は以下の計算式により算出した。
【数１】
表１の結果から、本発明の方法に使用される微生物を用いて３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンから、両化合物の反応生成物として、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳが、エリスロ体に比べて高選択的に生成されることが明らかとなった。
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００３３】
医薬品として有用なＬ−スレオ−ＤＯＰＳの製造を煩雑な分離精製工程を行うこともなく工業的に有利に実施できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項２】
微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から選択される種に属することを特徴とする請求項１記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項３】
微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）｛独立行政法人製品評価技術基盤機構、生物遺伝資源部門保存カタログ番号（ＮＢＲＣ生物資源カタログ）：ＮＢＲＣ１５２９６｝、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００またはＮＢＲＣ１５２０１）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８７）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８３）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８４）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７８２）から選択される微生物の菌株であることを特徴とする請求項１記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項１】
リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、メソリゾビウム（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、オクロバクトラム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属、シュードアミノバクター（Ｐｓｅｕｄａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属およびエンシファー属（Ｅｎｓｉｆｅｒ）から選択される属に属し、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンからＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生産する能力を有する微生物またはその調製物を、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドとグリシンを含有する液と接触せしめ、前記液中にＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項２】
微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）から選択される種に属することを特徴とする請求項１記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【請求項３】
微生物がリゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）｛独立行政法人製品評価技術基盤機構、生物遺伝資源部門保存カタログ番号（ＮＢＲＣ生物資源カタログ）：ＮＢＲＣ１５２９６｝、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７９３、ＮＢＲＣ１５１９６、ＮＢＲＣ１５１９８、ＮＢＲＣ１５１９９、ＮＢＲＣ１５２００またはＮＢＲＣ１５２０１）、エンシファー・アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｄｈａｅｒｅｎｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８７）、エンシファー・アルボリス（Ｅｎｓｉｆｅｒ ａｒｂｏｒｉｓ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８３）、エンシファー・メディカ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｄｉｃａｅ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１００３８４）およびエンシファー・メリロティ（Ｅｎｓｉｆｅｒ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（同カタログ番号：ＮＢＲＣ１４７８２）から選択される微生物の菌株であることを特徴とする請求項１記載のＬ−スレオ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリンの製造法。
【公開番号】特開２００７−５４０１１（Ｐ２００７−５４０１１Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４５８６５（Ｐ２００５−２４５８６５）
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月２６日（２００５．８．２６）
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（３０１０３７２１３）独立行政法人製品評価技術基盤機構 (25)
【Ｆターム（参考）】
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