Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法
【課題】本発明は、簡便に、且つ、精度良くＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する方法を提供する。
【解決手段】Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
【解決手段】Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼノプシン関連ペプチド（非特許文献１及び２）は、神経伝達物質、神経修飾物質及び局所ホルモンとして機能する。特に、近年、局所ホルモンとしての機能について注目されている。
【０００３】
局所ホルモンとしてのゼノプシン関連ペプチドは、胃の調整機能（例えば哺乳動物の食物摂取量をコントロールする機能）を有する点で重要な化合物であり、肥満治療等に有効であると考えられている。
【０００４】
このようなゼノプシン関連ペプチドは、哺乳類の胃等からの抽出物に含まれる、Ｃ末端からのアミノ酸配列が互いに同一又は同類のゼノプシン及び複数種のゼノプシン関連ペプチドからなるペプチド混合物中に存在することがすでに知られている（例えば、ねずみの胃、肝臓及び脳からの抽出物（非特許文献３）、鳥の組織からの抽出物（非特許文献４）、犬からの抽出物（非特許文献５））。
【０００５】
従って、このペプチド混合物に含まれる特定のゼノプシン関連ペプチドを、簡便に、且つ、精度良く 定量することは極めて重要である。
【０００６】
従来より、種々のクロマトグラフィー法によってペプチド混合物を精製した後、精製したペプチド混合物を免疫定量法により検査する方法がある。免疫定量法は、大きく異なるアミノ酸配列を持つペプチドに関しては高い感度を示す。
【０００７】
しかしながら、前記抽出物に含まれるゼノプシン及び複数種のゼノプシン関連ペプチドは、Ｃ末端からのアミノ酸配列が互いに同一又は類似の関係にあるため、免疫定量法により検査する場合、特定のゼノプシン関連ペプチドを他のペプチド化合物と区別して、精度良く定量することは困難である。
【非特許文献１】Sures, I.; Crippa, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984, 81, p380
【非特許文献２】Bevins, C.L.; Zasloff, M. Annu. Rev. Biochem. 1990, 59, p395
【非特許文献３】Carraway, R.E.; Mitra, S.P.; Muraki, K. Regul. Pept. 1990, 29, p229-239
【非特許文献４】Carraway, R.E.;Cochrane, D.E.; Mitra, S.P. Regul. Pept. 1988, 22, p303-314
【非特許文献５】Carraway, R.E.; Mitra, S.P. Peptides. 1990, 11, p747-752
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主な目的は、簡便に、且つ、精度良くＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記のような従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の定量方法により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記のＮ−末端にフェニルアラニンを有するペプチド化合物の定量方法に係る。
１． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
２． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する上記項１に記載の定量方法。
３． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物が、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである上記項１又は２に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の定量方法によれば、簡便に、且つ、精度良く（誤差１〜２％程度で）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量することができる。すなわち、本発明の定量方法は、Ｎ末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物とキューカービチュリル［７］とが反応する（錯体を形成する）ことにより発生する熱量を利用して前記ペプチド化合物を定量するものである。
【００１２】
本発明の定量方法によれば、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を精度良く定量できる。
【００１３】
例えば、本発明の定量方法によれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列が同一又は類似するＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−１）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−２）、ニューロテンシン、これらの関連神経ペプチド等からなるペプチド混合物に含まれるＸＰ−２を精度良く定量できる。ＸＰ−２は、人間や他の動物が満腹のとき、胃粘膜から分泌されるペプチド化合物である。ＸＰ−２は、胃の調整機能（例えば哺乳動物の食物摂取量をコントロールする機能）を有する点で重要な化合物であり、肥満治療等に有効であると考えられている。
【００１４】
本発明の定量方法は、ペプチド混合物中におけるＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の含有割合が小さい場合（例えばペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物のモル百分率が１％程度）であっても、精度良く、定量することができる。
【００１５】
本発明の定量方法によれば、ゼノプシン関連ペプチド（例えばＸＰ−２）を含む薬剤の品質管理を好適に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法は、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む。
【００１７】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物（以下「ペプチド化合物Ａ」ということがある）としては、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するオリゴペプチド、ポリペプチド等であればよく特に限定されない。ペプチド化合物Ａとしては、例えばＰｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−２）、インシュリン、人間のニューロメディンＵ−２５、豚のニューロメディンＵ−２５等が挙げられる。
【００１８】
キューカービチュリル［７］
キューカービチュリル［７］（以下「ＣＢ［７］ということがある」）は、図１に示す樽状の分子である。
【００１９】
ＣＢ［７］を混合することにより、ペプチド化合物ＡがＣＢ［７］と反応し（錯体を形成し）、発熱する。
【００２０】
キューカービチュリル［７］以外のキューカービチュリル［６］、キューカービチュリル［８］等を用いる場合、ペプチド化合物Ａを精度良く定量できない。
【００２１】
金属イオン
金属イオンを混合することにより、ペプチド混合物中のペプチド化合物ＡとＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を好適に促すことができる。より具体的には、金属イオンがＣＢ［７］に結合することにより、ペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物とＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を効果的に抑制しつつ、ペプチド化合物ＡとＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を促すことができる。
【００２２】
金属イオンとしては、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋等のアルカリ金属イオン、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋等のアルカリ土類金属イオン等が挙げられる。
【００２３】
定量
本発明の定量方法は、ペプチド化合物Ａ、ＣＢ［７］及び金属イオンを溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む。
本発明の定量方法によれば、ペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のペプチド化合物Ａがキューカービチュリル［７］と反応する（錯体を形成する）ことにより発生する熱量を測定し、得られた熱量からペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量することができる。
本発明の定量方法では、ペプチド混合物中、ペプチド化合物Ａは１種又は２種以上で存在していてもよい。ペプチド化合物Ａが２種以上で存在する場合、これらペプチド化合物Ａの混合物として定量できる。
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物としては、例えばＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−１）、ニューロテンシン等及びそれらの関連ペプチドが挙げられる。
【００２４】
すなわち、本発明の定量方法によれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列が同一又は類似する複数のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のペプチド化合物Ａを精度良く定量できる。
【００２５】
本発明の定量方法は、ペプチド化合物のＣ末端に着目した従来の方法とは異なり、ペプチド化合物のＮ末端に着目した定量方法である。
本発明の定量方法において、溶液中のペプチド混合物の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
本発明の定量方法において、溶液中で溶解させるペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率は特に限定されない。特に、本発明の定量方法によれば、ペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率が１％程度であっても、精度よくペプチド化合物Ａを定量することができる。
【００２６】
溶液中におけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．３〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００２７】
金属イオンは、例えば上記例示の金属イオンの塩を溶液中に溶解させることにより生成する。
【００２８】
塩としては、特に限定されないが、溶液に溶解して中性を呈する塩、弱酸性を呈する塩及び溶液に溶解して弱塩基性を呈する塩が好ましい。
中性を呈する塩としては、例えば、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４等が挙げられる。
弱酸性を呈する塩としては、例えば、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等が挙げられる。
弱塩基性を呈する塩としては、例えば、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ＣＨ３ＣＯＯＫ等が挙げられる。
これらの塩は１種又は２種以上で用いることができる。
【００２９】
溶液中における塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
上記ペプチド混合物、ＣＢ［７］及び金属イオンを混合するための溶媒としては、特に限定されず、例えば水、エタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。これらは１種又は２種以上で用いることができる。本発明においては、溶媒として水を用いることが好ましい。
【００３０】
特に、本発明の定量方法では、溶媒として水、塩としてＮａＣｌを用い、且つ、ＮａＣｌの濃度が０．９％程度（すなわち生理食塩水）の場合を好ましい態様として挙げることができる。
【００３１】
上記ペプチド混合物、ＣＢ［７］及び金属イオンを混合した溶液のｐＨは限定的ではないが、１〜８が好ましく、３〜７がより好ましく、６〜７が最も好ましい。特に、ｐＨを３以上とすることにより、ペプチド化合物の分解を有効に防止できる。
【００３２】
ペプチド化合物Ａ、キューカービチュリル［７］及び金属イオンを溶液中で混合することにより発生する熱量の測定には、公知の熱量計を用いればよい。特に、本発明においては、等温滴定熱量計を用いて熱量を測定することが好ましい。
【００３３】
以下、等温滴定熱量計を用いる場合を代表例として本発明の定量方法について具体的に説明する。
【００３４】
＜検量線の作成＞
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量するに先立って、予め、純粋なペプチド化合物Ａを混合する場合に発生する熱量を測定する。
【００３５】
等温滴定熱量計の操作は、従来の方法に従って行えばよい。具体的には、ペプチド化合物Ａ含有溶液及びＣＢ［７］含有溶液を調製した後、熱平衡下、ＣＢ［７］含有溶液を一定量ずつ（例えば０．０１ｍｌずつ）、ペプチド化合物Ａ含有溶液に滴下すればよい。
【００３６】
ペプチド化合物Ａと滴下したＣＢ［７］のモル比を横軸とし、滴下するごとに発生する熱量を縦軸としてプロットすることにより検量線を作成することができる。
【００３７】
検量線上の熱量を合算することにより、純粋なペプチド化合物Ａを混合する場合に発生する熱量を求めることができる。
【００３８】
ペプチド化合物Ａ含有溶液及びＣＢ［７］含有溶液を調製する際、ペプチド化合物Ａ含有溶液及び／又はＣＢ［７］含有溶液に上記塩を溶解させておけばよい。これにより、上記滴下によって、１）ペプチド化合物Ａ、２）ＣＢ［７］及び３）金属イオンを混合することができる。
【００３９】
ペプチド化合物Ａ含有溶液は、ペプチド化合物Ａを上記溶媒に溶解させることにより調製できる。
【００４０】
ペプチド化合物Ａ含有溶液におけるペプチド化合物Ａの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４１】
ペプチド化合物Ａ含有溶液に塩を溶解させる場合、塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４２】
ＣＢ［７］含有溶液は、ＣＢ［７］を上記溶媒に溶解させることにより調製することができる。
【００４３】
ＣＢ［７］含有溶液におけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．５〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４４】
ＣＢ［７］含有溶液には、塩を溶解させることが好ましい。塩を溶解させることにより、ＣＢ［７］を好適に溶解させることができる。
【００４５】
ＣＢ［７］含有溶液における塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４６】
＜ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａの定量＞
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量する。具体的には、ペプチド化合物Ａ含有溶液の代わりに、ペプチド混合物を上記溶媒に溶解させることにより調製したペプチド混合物含有溶液を用いる以外は、上記「検量線の作成」と同様の方法により行えばよい。
【００４７】
ペプチド混合物含有溶液におけるペプチド混合物の濃度は、上記検量線の作成におけるペプチド化合物Ａ含有溶液の濃度と同程度にすればよく、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４８】
ＣＢ［７］含有溶液を滴下するごとに発生する熱量を合算した値を、検量線上の熱量の合算値で除することにより、ペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率を算出することができる。
【００４９】
以上の方法により、ペプチド化合物Ａを定量することができる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。
【００５１】
実施例１
検量線の作成
０．１ｍｇのＸＰ−２を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液１．５ｍｌに溶解させることにより０．０５６ｍｍｏｌ／ｌのＸＰ−２含有水溶液を調製した。
【００５２】
また、ＣＢ［７］を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液に溶解させることにより０．５ｍｍｏｌ／ｌのＣＢ［７］含有水溶液を調製した。
【００５３】
ＸＰ−２含有水溶液１．５ｍｌを超高感度等温滴定型カロリメータＶＰ−ＩＴＣ（マイクロキャル社製）の反応セルの中に入れた。また、ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
【００５４】
カロリメータを熱平衡にした後、反応セルの中へ、ＣＢ［７］含有水溶液を０．０１ｍｌずつ、計２５回加えた。発生した熱量のデータを図２に示す。
【００５５】
得られたデータをＯＲＩＧＩＮ７．０（マイクロキャル社製）によって自動積分した。結果を図３に示す。図３の各プロットの熱量を合計すると、１３５であった。すなわち、０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液中におけるＸＰ−２の濃度が０．０５６ｍｍｏｌ／ｌの場合、発生する熱量は１３５ｋｃａｌであることがわかった。
【００５６】
ペプチド混合物に含まれるＸＰ−２の定量
次に、ＸＰ−２のモル百分率が４％であるゼノプシン混合物（ペプチド混合物）を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液に溶解させることにより０．０５６ｍｍｏｌ／ｌの混合溶液を調製した。調製した混合溶液を上記カロリメータの反応セルの中に入れた。また、上記ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
【００５７】
そして、上記と同様の方法により、熱量を測定し、得られたデータを自動積分した。結果を図４の左側に示す。各プロットの熱量を合計すると、６ｋｃａｌであった。なお、比較のため、図３のプロットも併せて図４の右側に示す。
【００５８】
６／１３５＝０．０４４よりゼノプシン混合物中のＸＰ−２のモル百分率が４．４％であることを確認できた。
【００５９】
この結果から、本発明の定量方法によれば、ＸＰ−２を高い精度で定量できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、キューカービチュリル［７］の化学構造を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の検量線の作成において発生した熱量のデータを示す図である。
【図３】図３は、図２のデータを自動積分することにより得られた熱量をプロットした図である。
【図４】図４は、実施例１のペプチド混合物に含まれるＸＰ−２の定量において発生した熱量のデータを自動積分することにより得られた熱量をプロットし、且つ、図３のプロットを併せて示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼノプシン関連ペプチド（非特許文献１及び２）は、神経伝達物質、神経修飾物質及び局所ホルモンとして機能する。特に、近年、局所ホルモンとしての機能について注目されている。
【０００３】
局所ホルモンとしてのゼノプシン関連ペプチドは、胃の調整機能（例えば哺乳動物の食物摂取量をコントロールする機能）を有する点で重要な化合物であり、肥満治療等に有効であると考えられている。
【０００４】
このようなゼノプシン関連ペプチドは、哺乳類の胃等からの抽出物に含まれる、Ｃ末端からのアミノ酸配列が互いに同一又は同類のゼノプシン及び複数種のゼノプシン関連ペプチドからなるペプチド混合物中に存在することがすでに知られている（例えば、ねずみの胃、肝臓及び脳からの抽出物（非特許文献３）、鳥の組織からの抽出物（非特許文献４）、犬からの抽出物（非特許文献５））。
【０００５】
従って、このペプチド混合物に含まれる特定のゼノプシン関連ペプチドを、簡便に、且つ、精度良く 定量することは極めて重要である。
【０００６】
従来より、種々のクロマトグラフィー法によってペプチド混合物を精製した後、精製したペプチド混合物を免疫定量法により検査する方法がある。免疫定量法は、大きく異なるアミノ酸配列を持つペプチドに関しては高い感度を示す。
【０００７】
しかしながら、前記抽出物に含まれるゼノプシン及び複数種のゼノプシン関連ペプチドは、Ｃ末端からのアミノ酸配列が互いに同一又は類似の関係にあるため、免疫定量法により検査する場合、特定のゼノプシン関連ペプチドを他のペプチド化合物と区別して、精度良く定量することは困難である。
【非特許文献１】Sures, I.; Crippa, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984, 81, p380
【非特許文献２】Bevins, C.L.; Zasloff, M. Annu. Rev. Biochem. 1990, 59, p395
【非特許文献３】Carraway, R.E.; Mitra, S.P.; Muraki, K. Regul. Pept. 1990, 29, p229-239
【非特許文献４】Carraway, R.E.;Cochrane, D.E.; Mitra, S.P. Regul. Pept. 1988, 22, p303-314
【非特許文献５】Carraway, R.E.; Mitra, S.P. Peptides. 1990, 11, p747-752
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主な目的は、簡便に、且つ、精度良くＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記のような従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の定量方法により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記のＮ−末端にフェニルアラニンを有するペプチド化合物の定量方法に係る。
１． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
２． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する上記項１に記載の定量方法。
３． Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物が、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである上記項１又は２に記載の定量方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の定量方法によれば、簡便に、且つ、精度良く（誤差１〜２％程度で）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量することができる。すなわち、本発明の定量方法は、Ｎ末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物とキューカービチュリル［７］とが反応する（錯体を形成する）ことにより発生する熱量を利用して前記ペプチド化合物を定量するものである。
【００１２】
本発明の定量方法によれば、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を精度良く定量できる。
【００１３】
例えば、本発明の定量方法によれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列が同一又は類似するＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−１）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−２）、ニューロテンシン、これらの関連神経ペプチド等からなるペプチド混合物に含まれるＸＰ−２を精度良く定量できる。ＸＰ−２は、人間や他の動物が満腹のとき、胃粘膜から分泌されるペプチド化合物である。ＸＰ−２は、胃の調整機能（例えば哺乳動物の食物摂取量をコントロールする機能）を有する点で重要な化合物であり、肥満治療等に有効であると考えられている。
【００１４】
本発明の定量方法は、ペプチド混合物中におけるＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の含有割合が小さい場合（例えばペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物のモル百分率が１％程度）であっても、精度良く、定量することができる。
【００１５】
本発明の定量方法によれば、ゼノプシン関連ペプチド（例えばＸＰ−２）を含む薬剤の品質管理を好適に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法は、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む。
【００１７】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物（以下「ペプチド化合物Ａ」ということがある）としては、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するオリゴペプチド、ポリペプチド等であればよく特に限定されない。ペプチド化合物Ａとしては、例えばＰｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−２）、インシュリン、人間のニューロメディンＵ−２５、豚のニューロメディンＵ−２５等が挙げられる。
【００１８】
キューカービチュリル［７］
キューカービチュリル［７］（以下「ＣＢ［７］ということがある」）は、図１に示す樽状の分子である。
【００１９】
ＣＢ［７］を混合することにより、ペプチド化合物ＡがＣＢ［７］と反応し（錯体を形成し）、発熱する。
【００２０】
キューカービチュリル［７］以外のキューカービチュリル［６］、キューカービチュリル［８］等を用いる場合、ペプチド化合物Ａを精度良く定量できない。
【００２１】
金属イオン
金属イオンを混合することにより、ペプチド混合物中のペプチド化合物ＡとＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を好適に促すことができる。より具体的には、金属イオンがＣＢ［７］に結合することにより、ペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物とＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を効果的に抑制しつつ、ペプチド化合物ＡとＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を促すことができる。
【００２２】
金属イオンとしては、例えば、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋等のアルカリ金属イオン、Ｂｅ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋等のアルカリ土類金属イオン等が挙げられる。
【００２３】
定量
本発明の定量方法は、ペプチド化合物Ａ、ＣＢ［７］及び金属イオンを溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む。
本発明の定量方法によれば、ペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のペプチド化合物Ａがキューカービチュリル［７］と反応する（錯体を形成する）ことにより発生する熱量を測定し、得られた熱量からペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量することができる。
本発明の定量方法では、ペプチド混合物中、ペプチド化合物Ａは１種又は２種以上で存在していてもよい。ペプチド化合物Ａが２種以上で存在する場合、これらペプチド化合物Ａの混合物として定量できる。
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａ以外のペプチド化合物としては、例えばＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＸＰ−１）、ニューロテンシン等及びそれらの関連ペプチドが挙げられる。
【００２４】
すなわち、本発明の定量方法によれば、Ｃ末端からのアミノ酸配列が同一又は類似する複数のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のペプチド化合物Ａを精度良く定量できる。
【００２５】
本発明の定量方法は、ペプチド化合物のＣ末端に着目した従来の方法とは異なり、ペプチド化合物のＮ末端に着目した定量方法である。
本発明の定量方法において、溶液中のペプチド混合物の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
本発明の定量方法において、溶液中で溶解させるペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率は特に限定されない。特に、本発明の定量方法によれば、ペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率が１％程度であっても、精度よくペプチド化合物Ａを定量することができる。
【００２６】
溶液中におけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．３〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００２７】
金属イオンは、例えば上記例示の金属イオンの塩を溶液中に溶解させることにより生成する。
【００２８】
塩としては、特に限定されないが、溶液に溶解して中性を呈する塩、弱酸性を呈する塩及び溶液に溶解して弱塩基性を呈する塩が好ましい。
中性を呈する塩としては、例えば、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４等が挙げられる。
弱酸性を呈する塩としては、例えば、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等が挙げられる。
弱塩基性を呈する塩としては、例えば、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ＣＨ３ＣＯＯＫ等が挙げられる。
これらの塩は１種又は２種以上で用いることができる。
【００２９】
溶液中における塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
上記ペプチド混合物、ＣＢ［７］及び金属イオンを混合するための溶媒としては、特に限定されず、例えば水、エタノール、酢酸、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。これらは１種又は２種以上で用いることができる。本発明においては、溶媒として水を用いることが好ましい。
【００３０】
特に、本発明の定量方法では、溶媒として水、塩としてＮａＣｌを用い、且つ、ＮａＣｌの濃度が０．９％程度（すなわち生理食塩水）の場合を好ましい態様として挙げることができる。
【００３１】
上記ペプチド混合物、ＣＢ［７］及び金属イオンを混合した溶液のｐＨは限定的ではないが、１〜８が好ましく、３〜７がより好ましく、６〜７が最も好ましい。特に、ｐＨを３以上とすることにより、ペプチド化合物の分解を有効に防止できる。
【００３２】
ペプチド化合物Ａ、キューカービチュリル［７］及び金属イオンを溶液中で混合することにより発生する熱量の測定には、公知の熱量計を用いればよい。特に、本発明においては、等温滴定熱量計を用いて熱量を測定することが好ましい。
【００３３】
以下、等温滴定熱量計を用いる場合を代表例として本発明の定量方法について具体的に説明する。
【００３４】
＜検量線の作成＞
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量するに先立って、予め、純粋なペプチド化合物Ａを混合する場合に発生する熱量を測定する。
【００３５】
等温滴定熱量計の操作は、従来の方法に従って行えばよい。具体的には、ペプチド化合物Ａ含有溶液及びＣＢ［７］含有溶液を調製した後、熱平衡下、ＣＢ［７］含有溶液を一定量ずつ（例えば０．０１ｍｌずつ）、ペプチド化合物Ａ含有溶液に滴下すればよい。
【００３６】
ペプチド化合物Ａと滴下したＣＢ［７］のモル比を横軸とし、滴下するごとに発生する熱量を縦軸としてプロットすることにより検量線を作成することができる。
【００３７】
検量線上の熱量を合算することにより、純粋なペプチド化合物Ａを混合する場合に発生する熱量を求めることができる。
【００３８】
ペプチド化合物Ａ含有溶液及びＣＢ［７］含有溶液を調製する際、ペプチド化合物Ａ含有溶液及び／又はＣＢ［７］含有溶液に上記塩を溶解させておけばよい。これにより、上記滴下によって、１）ペプチド化合物Ａ、２）ＣＢ［７］及び３）金属イオンを混合することができる。
【００３９】
ペプチド化合物Ａ含有溶液は、ペプチド化合物Ａを上記溶媒に溶解させることにより調製できる。
【００４０】
ペプチド化合物Ａ含有溶液におけるペプチド化合物Ａの濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４１】
ペプチド化合物Ａ含有溶液に塩を溶解させる場合、塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４２】
ＣＢ［７］含有溶液は、ＣＢ［７］を上記溶媒に溶解させることにより調製することができる。
【００４３】
ＣＢ［７］含有溶液におけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．５〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．５〜１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４４】
ＣＢ［７］含有溶液には、塩を溶解させることが好ましい。塩を溶解させることにより、ＣＢ［７］を好適に溶解させることができる。
【００４５】
ＣＢ［７］含有溶液における塩の濃度は、用いる塩の溶解度等に応じて適宜設定すればよいが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４６】
＜ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａの定量＞
ペプチド混合物に含まれるペプチド化合物Ａを定量する。具体的には、ペプチド化合物Ａ含有溶液の代わりに、ペプチド混合物を上記溶媒に溶解させることにより調製したペプチド混合物含有溶液を用いる以外は、上記「検量線の作成」と同様の方法により行えばよい。
【００４７】
ペプチド混合物含有溶液におけるペプチド混合物の濃度は、上記検量線の作成におけるペプチド化合物Ａ含有溶液の濃度と同程度にすればよく、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０３〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
【００４８】
ＣＢ［７］含有溶液を滴下するごとに発生する熱量を合算した値を、検量線上の熱量の合算値で除することにより、ペプチド混合物中のペプチド化合物Ａのモル百分率を算出することができる。
【００４９】
以上の方法により、ペプチド化合物Ａを定量することができる。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。
【００５１】
実施例１
検量線の作成
０．１ｍｇのＸＰ−２を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液１．５ｍｌに溶解させることにより０．０５６ｍｍｏｌ／ｌのＸＰ−２含有水溶液を調製した。
【００５２】
また、ＣＢ［７］を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液に溶解させることにより０．５ｍｍｏｌ／ｌのＣＢ［７］含有水溶液を調製した。
【００５３】
ＸＰ−２含有水溶液１．５ｍｌを超高感度等温滴定型カロリメータＶＰ−ＩＴＣ（マイクロキャル社製）の反応セルの中に入れた。また、ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
【００５４】
カロリメータを熱平衡にした後、反応セルの中へ、ＣＢ［７］含有水溶液を０．０１ｍｌずつ、計２５回加えた。発生した熱量のデータを図２に示す。
【００５５】
得られたデータをＯＲＩＧＩＮ７．０（マイクロキャル社製）によって自動積分した。結果を図３に示す。図３の各プロットの熱量を合計すると、１３５であった。すなわち、０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液中におけるＸＰ−２の濃度が０．０５６ｍｍｏｌ／ｌの場合、発生する熱量は１３５ｋｃａｌであることがわかった。
【００５６】
ペプチド混合物に含まれるＸＰ−２の定量
次に、ＸＰ−２のモル百分率が４％であるゼノプシン混合物（ペプチド混合物）を０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ水溶液に溶解させることにより０．０５６ｍｍｏｌ／ｌの混合溶液を調製した。調製した混合溶液を上記カロリメータの反応セルの中に入れた。また、上記ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
【００５７】
そして、上記と同様の方法により、熱量を測定し、得られたデータを自動積分した。結果を図４の左側に示す。各プロットの熱量を合計すると、６ｋｃａｌであった。なお、比較のため、図３のプロットも併せて図４の右側に示す。
【００５８】
６／１３５＝０．０４４よりゼノプシン混合物中のＸＰ−２のモル百分率が４．４％であることを確認できた。
【００５９】
この結果から、本発明の定量方法によれば、ＸＰ−２を高い精度で定量できることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、キューカービチュリル［７］の化学構造を示す図である。
【図２】図２は、実施例１の検量線の作成において発生した熱量のデータを示す図である。
【図３】図３は、図２のデータを自動積分することにより得られた熱量をプロットした図である。
【図４】図４は、実施例１のペプチド混合物に含まれるＸＰ−２の定量において発生した熱量のデータを自動積分することにより得られた熱量をプロットし、且つ、図３のプロットを併せて示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
【請求項２】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物が、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである請求項１又は２に記載の定量方法。
【請求項１】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法であって、
１）Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物、
２）キューカービチュリル［７］、及び
３）金属イオン
を溶液中で混合することにより発生する熱量を測定する工程を含む、Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物の定量方法。
【請求項２】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物以外のペプチド化合物を含むペプチド混合物中のＮ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物を定量する請求項１に記載の定量方法。
【請求項３】
Ｎ−末端にフェニルアラニン残基を有するペプチド化合物が、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨである請求項１又は２に記載の定量方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１０７１１４（Ｐ２００８−１０７１１４Ａ）
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８８０００（Ｐ２００６−２８８０００）
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年５月８日（２００８．５．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月２３日（２００６．１０．２３）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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