ＮＫ型ＬＤＧＬのような免疫増殖性障害を処置するための組成物および方法
本発明は、増殖性障害、とりわけＮＫ型ＬＤＧＬのような免疫増殖性障害を処置する方法、およびかかる障害を処置するための処置計画において使用するための抗体を生成する方法に関する。一般的に本方法は、障害の基礎となる増殖細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する抗体の使用を包含する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性障害、とりわけＮＫ型ＬＤＧＬのような免疫増殖性障害を処置する方法、およびかかる障害を処置するための処置計画において使用するための抗体を生成する方法に関する。一般的に、本方法は、障害の基礎となる増殖細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する抗体の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非従来的免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性には、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７のような表面抗原の発現、および細胞表面に発現されるアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在；特異的細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、そして死滅させる能力；ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する腫瘍細胞またはその他の疾患細胞を死滅させる能力；ならびに免疫応答を刺激または阻止するサイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力が含まれる。
【０００３】
ＮＫ細胞活性は、活性化および阻止シグナルの双方を包含する複合的なメカニズムにより調節される。ＮＫ細胞媒介のＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の認識および死滅に重要な役割を果たすいくつかの異なるクラスのＮＫ特異的受容体が同定されている。かかるクラスの受容体の１つである、ＮＣＲ（ナチュラル細胞毒性受容体）にはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ４４が含まれ、これらはすべて免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。特異的モノクローナル抗体により誘起されるその架橋は、ＮＫ細胞を強く活性化して、細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇、細胞毒性の誘発、およびリンホカイン放出を招く。
【０００４】
２つの更なるＮＫ細胞受容体のファミリーは、ＫＩＲ受容体（Killer Cell Immunoglobulin-like Recepteors：キラー細胞免疫グロブリン様受容体）およびＣＤ９４／ＮＫＧ２である。これらのファミリーの各々は、活性化および阻止受容体の双方を含有する。ＫＩＲ遺伝子は、ＮＫ細胞に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの多様な多型群を示し、そして２つまたは３つのいずれかの細胞外免疫グロブリン様ドメインを有している。ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３を含むファミリーの阻止メンバーの細胞質ドメインは、ＩＴＩＭ配列を含有し、対照的にＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性化メンバーの細胞質ドメインは、通常荷電した残基を含有する。ＫＩＲファミリーの阻止メンバーは、ＨＬＡクラスＩ分子の阻止効果を媒介する。ＫＩＲ受容体ファミリー内で認められる多型性は、インビボで特定のＮＫ細胞の個体とクローンエクスパンション（expansion）間の遺伝的多様性を招く。概説に関しては例えばTrowsdaleおよびParham、Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002)参照。
【０００５】
ＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ９４は、ＮＫ細胞において優先的に発現され、そしてそれ自体少なくとも５０％のＮＫ細胞において発現されるＮＫＧ２ＡのようなＮＫＧ２ファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２Ａは、２ＩＴＩＭドメインを含有し、そしてＣＤ９４と一緒に非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｅ（ヒトにおいて；マウスではＱａ−１ｂ）に結合するヘテロ二量体阻止受容体を形成する（例えばＯＭＩＭ６０２８９４；BraudらNature 391: 795-799(1998); Changら、Europ.J.Immun 25: 2433-2437(1995); LazeticらImmun 157: 4741-4745(1996); Rodriguezら、Immunogenetics 47: 305-309(1998)参照）。
【０００６】
ＮＫ−ＬＤＧＬ（顆粒性リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患；代替的にＮＫ−ＬＧＬとも称される）は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、すなわち表面抗原発現の特徴的な組み合わせ（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋等；例えばLoughran、Blood 82: 1(1993)参照）を示す大型顆粒性リンパ球のクローンエクスパンション（expansion）により引き起こされる増殖性障害のクラスを意味する。これらの障害の基礎となる細胞増殖は、ある患者で認められる穏やかな病徴からＮＫ−ＬＤＧＬ白血病と称される攻撃的でしばしば致命的な形態にわたる様々な影響を有し得る。このクラスの障害の病徴は、発熱、穏やかな好中球減少症、血小板減少症、貧血、リンパ球増加症、脾腫、肝腫大、リンパ節症、骨髄浸潤他（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）を含み得る。化学療法剤を包含するＮＫ−ＬＤＧＬ白血病のための処置はしばしば攻撃的であり、そして疾患は、しばしば致命的であり、凝血および多臓器不全に随伴され、そして多くの器官のＬＧＬ浸潤を包含する。
【０００７】
モノクローナル抗体基盤の処置が今日利用可能であるか、または特定の疾患、とりわけ非ホジキンリンパ腫および乳癌のような癌のための臨床試験中である。かかる処置に用いられる抗体は、一般的にヒト以外の動物から誘導され、そして次にそれらをヒトにおいて使用するのに適切なものにするために「ヒト化」または「キメラ化」される。典型的には、癌またはその他の増殖性障害を処置するために、抗体は、悪性細胞の表面に特異的に存在する受容体に特異的である。リツキサン（非ホジキンリンパ腫の処置用）、ヘルセプチン（乳ガンの処置用）、キャンパス（Ｂ−ＣＬＬの処置用）のような単独で用いられるモノクローナル抗体もあり、それらは標的細胞の成長を緩徐化または停止のいずれか、その活性の阻止、アポトーシスの誘発、または免疫系による破壊のためのそれらのマーキングを行うことができる。対照的にその他の抗体を放射性同位元素のような毒性部分に結合させて、単に標的受容体に結合させることにより標的細胞を直接死滅させる。かかる抗体の実例には、ゼバリン、ベキサール、およびオンコリン（すべて非ホジキンリンパ腫の処置用）が含まれる。
【０００８】
ＮＫ−ＬＤＧＬおよびその他の免疫増殖性障害のための有効な処置の相対的な不足に鑑みて、これらの障害の基礎となるＬＧＬ増殖を制限および逆行させるための新しいおよび革新的な処置計画に関する大きな必要性が当技術分野に存在するのは明白である。本発明は、これらのおよびその他の必要性に対処する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ＮＫ型ＬＤＧＬのような増殖性障害、とりわけ免疫増殖性障害の処置に有用な抗体を生成するための方法を提供する。本方法を用いて生成される抗体は、ＮＫ型ＬＤＧＬのエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞のようなかかる障害の基礎となるエクスパンションした（expanded）細胞を特異的に標的とすることができる。抗体は、例えば単独で結合することによりエクスパンションした（expanded）細胞の影響を中和することにより、免疫系による破壊のためにそれらを標的化することにより、または放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞毒性薬剤とそれらを接触させることにより直接的に細胞を死滅させることにより、細胞増殖の病理学的影響を制限することができる。多くの増殖性障害のいずれか、好ましくは、ＮＫ型ＬＤＧＬの処置のために抗体を使用する方法もまた提供され、本明細書に記載した抗体を含むキットおよびその使用のための指示書も同様に提供される。
【００１０】
したがって、本発明は、ＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者を処置する方法を提供する。本発明はまた、ａ）患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体の状態を決定すること、およびｂ）ＮＫ細胞において顕著に発現されるＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者を処置する方法をも提供する。
【００１１】
本発明の方法の一実施態様では、ＮＫ受容体は活性化受容体である。別の実施態様では、受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１（アクセッション番号ＮＰ＿０５５０３３）、ＫＩＲ２ＤＳ１（アクセッション番号Ｘ８９８９２）、ＫＩＲ２ＤＬ２（アクセッション番号ＮＰ＿０５５０３４）、ＫＩＲ２ＤＬ３（アクセッション番号ＮＰ＿０５６９５２）、ＫＩＲ２ＤＳ４（アクセッション番号Ｌ７６６７１）、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａ（アクセッション番号ＡＡＢ１７１３３）から成る群より選択される。別の実施態様では、受容体は、ＮＫｐ３０（アクセッション番号ＮＰ＿６６７３４１）、ＮＫｐ４４（アクセッション番号ＣＡＢ３９１６８）、またはＮＫｐ４６（アクセッション番号ＮＰ＿００４８２０）のようなＮＣＲである。先に述べたアクセッション番号に相当するＧｅｎｂａｎｋファイルの開示は参照として本明細書に組み入れられる。別の実施態様では、抗体は、単一のＮＫ受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、免疫学的アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、ＮＫ細胞に存在するＮＫ受容体の活性を決定するための機能的アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は遺伝子型決定アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、細胞においてＮＫ受容体コード化ｍＲＮＡを検出するアッセイを用いて決定される。別の実施態様では、受容体は、少なくとも５０％のＮＫ細胞に検出可能なように存在する。
【００１２】
別の実施態様では、抗体は、抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、細胞毒性抗体である。別の実施態様では、抗体は、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子から成る群より選択されるエレメントを含む。別の実施態様では、抗体は、ヒト化されているかまたはキメラである。別の実施態様では、放射性同位元素、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗体に直接結合している。別の実施態様では、抗体は、上記ＮＫ受容体のマウスまたは霊長類相同体に結合する。別の実施態様では、抗体は、複数のＫＩＲ受容体に結合する。別の実施態様では、細胞毒性抗体は、免疫学的アッセイにおいて上記ＮＫ受容体状態を決定するために用いられた同一の抗体から誘導される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ｉ）１つ以上のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；ｉｉ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する抗体の各々の能力を試験すること；ｉｉｉ）一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する複数の抗体から１つを選択すること；およびｉｖ）ヒト投与に適切な抗体を作成することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬの処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法を提供する。
【００１４】
一実施態様では、抗体は、活性化ＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａから成る群より選択される受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のようなＮＣＲに特異的に結合する。別の実施態様では、抗体を、ヒト化またはキメラ化することによりヒト投与に適切なものにする。
【００１５】
別の実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を抗体に連結させる工程を含む。別の実施態様では、細胞毒性薬剤は放射性同位元素、毒性ポリペプチドまたは毒性小分子である。別の実施態様では、細胞毒性薬剤は、抗体に直接連結される。別の実施態様では、抗体は、抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも６０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも７０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも８０％に結合する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する方法のいずれかを用いて生成された抗体を提供する。本発明はまた、実質的に同一の抗原特異性および活性（例えばこれは親抗体と同一の抗原に結合できる）を有する抗体のフラグメントおよび誘導体を包含する。かかるフラグメントには、限定するものではないがＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖが含まれる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するいずれか１つ以上の抗体を含むキットを提供する。一実施態様では、キットは少なくとも１つの診断用抗体および少なくとも１つの処置用（例えば細胞毒性）抗体を含む。別の実施態様では、診断用抗体および処置用抗体は、同一のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、キットはまた本発明の方法による抗体を用いるための指示書を含む。
【００１８】
本発明はまた、１つ以上の本抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を含む。
【００１９】
発明の詳細な説明
序文
本発明は、顆粒性リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患（ＮＫ−ＬＤＧＬ）のような増殖性、とりわけ免疫増殖性障害を処置するのに適切な抗体を生成および使用するための新規方法を提供する。本明細書に記載する方法を用いて生成される抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントが包含され、抗体を用いて患者を処置する方法もまた包含される。特に本発明は、１つ以上のＮＫ細胞受容体が増殖細胞で顕著に提示されることを決定するために、これらの障害の基礎となる増殖性ＮＫまたはＮＫ様細胞を分類すること、および次いで同一の受容体または受容体群に特異的に結合する抗体を用いて患者を処置することを包含する。
【００２０】
ＮＫ−ＬＤＧＬおよびその他の免疫増殖性障害は、しばしば１つまたは少数のＮＫまたはＮＫ様細胞のクローンエクスパンションを特徴とする。したがって個々のＮＫ細胞は、一般的にＮＫ細胞受容体のサブセットのみを発現するので、これらの障害の基礎となる過剰増殖細胞のかなりの部分は、少数のＮＫ細胞受容体を発現する。したがって本発明は、既定の患者の増殖細胞において発現される特定の受容体または受容体群を同定し、そして次に細胞毒性抗体を用いて該受容体または受容体群を発現するこれらの細胞を特異的に標的化することによりこれらの障害を処置する方法を提供する。このように過剰増殖細胞の数が特異的に減少するが、その他の免疫および非免疫細胞を容認する。
【００２１】
一般に、本方法は、ＫＩＲ受容体、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体の１つまたはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４もしくはＮＫｐ４６のようなＮＣＲのような１つのまたは少数のＮＫ細胞受容体に各々特異的であるモノクローナル抗体のパネルの使用を包含する。しばしば抗体の２つのセットを用いる。直接的または間接的に標識された抗体を含む１つのセットは、本来は診断用であり、そして特定のＮＫ細胞受容体または受容体群が既定の患者のＮＫ細胞において発現されることを決定するために用いられる。第２のセットは、処置に用いられ、一般にヒト以外の動物で産生されるが、これはヒトにおける使用に適切なものにされており、例えばヒト化またはキメラ化されているモノクローナル抗体に相当する。特定の実施態様では、抗体は、更に細胞毒性薬剤で直接的または間接的に誘導体化されて、受容体または受容体群を発現する細胞を死滅させるようになる。例えば抗体を放射性同位元素、細胞毒性ポリペプチド、または細胞毒性小分子に連結させることができる。
【００２２】
定義
本明細書で用いる以下の用語は、特記しない場合それらが属する意味を有する。
本明細書で用いる「ＮＫ」細胞とは、非従来的免疫に関与するリンパ球の亜集団を意味する。ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在、特異的細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、そして死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞またはその他の疾患細胞を死滅させる能力、ならびに免疫応答を刺激または阻止するサイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力のような特定の特徴および生物学的特性によりＮＫ細胞を同定することができる。これらの特徴および活性のいずれかを用いて、当技術分野において周知の方法を用いてＮＫ細胞を同定することができる。
【００２３】
「ＮＫ細胞受容体」なる用語は、ＮＫ細胞のすべてまたは一部で一貫して見出される任意の細胞表面分子を意味する。好ましくは、ＮＫ細胞受容体は、ＮＫ細胞（静止または活性化）において独占的に発現されるが、該用語はまた、その他の細胞型においても発現される受容体を包含する。ＮＫ細胞受容体の実例には、ＫＩＲ受容体ファミリーのメンバー、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲ受容体、ＬＩＲ−１他が含まれる（例えばTrowsdaleおよびParham Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002); OMIM 602894; Braudら、Nature 391: 795-799(1998); Changら、Europ.J.Immun 25: 2433-2437(1995); Lazeticら、Immun 157: 4741-4745(1996); Rodriguezら、Immunogenetics 47: 305-309(1998); OMIM 161555; Houchinsら、J.Exp.Med.173: 1017-1020(1991); Adamkiewiczら、Immunogenetics 39: 218(1994); Renedoら、Immunogenetics 46: 307-311(1997); Ravetchら、Science 290: 84-89(2000); PCT 国際公開公報第01/36630号; Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998); Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Pessinoら、J.Exp.Med.188: 953-960(1998)(その各々の開示は、参照として本明細書に組み入れられる)参照）。
【００２４】
本明細書で用いる「ＮＫ受容体状態」とは、個体、例えばＮＫ−ＬＤＧＬ患者から採取されたＮＫまたはその他の細胞で発現される種々のＮＫ細胞受容体の同一性および顕著さを意味する。例えば患者から採取されたＮＫ細胞の試験により、特定のＮＫ細胞受容体、例えばＫＩＲ２ＤＳ２が細胞の７０％で発現され、別の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＬ１は、細胞の４０％で発現され、別の受容体、例えばＣＤ９４は、細胞の８０％で発現される等を見出すことができる。かかる情報は、どの細胞毒性抗体を本方法で用いるかを決定するのに有用である。複数のＮＫ細胞受容体に関する発現情報を有することは明らかに有用であるが、ＮＫ受容体状態は、単一の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＳ２または少数の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＬ２／３、およびＫＩＲ２ＤＳ２の発現レベルまたは顕著さに言及することもできる。
【００２５】
「ＬＧＬ」すなわち「大型顆粒性リンパ球」とは、リンパ球様細胞の形態学的に異なる集団を意味し、これは末梢血単核細胞の１０〜１５％を占める。ＬＧＬは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の双方を含むことができ（例えばLoughran、Blood 82: 1-14(1993)参照）、これは特定のマーカー、例えばＣＤ３発現（ＮＫ細胞では、ＣＤ３−そしてＴ細胞ではＣＤ３＋である）により区別することができる。好ましくは、本発明の目的のために、ＬＧＬ細胞は、ＣＤ３−である。しかしながら、本発明の特定の実施態様では、ＰＢＬは、患者から採取され、そしていずれかの細胞型、好ましくは、ＬＧＬ、特にＣＤ３−ＬＧＬがエクスパンションする（expanded）かどうかを知るために試験される。一般に任意のエクスパンションした（expanded）細胞型を試験して特定のＮＫ細胞受容体がその表面に顕著に発現されるかどうかを決定することができる。
【００２６】
「顕著に発現される」とは、既定の患者から採取された相当数のＬＧＬ（例えばＮＫまたはＮＫ様）細胞で発現されるＮＫ細胞受容体を意味する。「顕著に発現される」なる用語の定義は、正確なパーセンテージの値に縛られるものではなく、たいていの場合、患者から採取されたＬＧＬまたはその他の過剰増殖細胞の少なくとも３０％、４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれより多くで存在する受容体が「顕著に発現される」と称される。
【００２７】
本明細書で用いる「抗体」なる用語は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を意味する。重鎖の定常ドメインの型に依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のようなサブクラスまたはアイソタイプに分けられる。免疫グロブリン（抗体）構造単位の実例には四量体が含まれる。各々の四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から成り、各対は、１つの「軽」（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に寄与する約１００から１１０またはそれより多い可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、各々これらの軽および重鎖を意味する。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」、および「ミュー」と称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、生理学的な状況で最も通例的な抗体であり、そして実験室設定で最も容易に作成されるので、本発明で用いる抗体の好ましいクラスであり、ＩｇＧが特に好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化、キメラ化、ヒト、またはそれ以外のヒトに適切な抗体である。「抗体」はまた、本明細書で記載される抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体を含む。
【００２８】
「特異的に結合する」なる用語は、単離されたＮＫまたは関連標的細胞の表面に存在するタンパク質の組換え形態、そのエピトープまたは元来のタンパク質のいずれかを用いて評価されるように、抗体が好ましくは、競合結合アッセイにおいて結合パートナー、例えば活性化ＫＩＲ受容体のようなＮＫ細胞受容体に結合することができることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するためのその他の方法を更に以下で記載し、そして当技術分野において周知である。
【００２９】
「ヒトに適切な」抗体とは、例えば本明細書に記載する処置方法のためにヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化抗体、または抗体フラグメントを意味する。ヒトに適切な抗体には、すべての型のヒト化、キメラ、または完全ヒト抗体、または抗体の少なくとも一部がヒトから誘導されるかもしくはそうでなければ一般に人以外の元来の抗体を用いた場合に誘発される免疫応答を回避するように修飾されている任意の抗体が含まれる。
【００３０】
「毒性」または「細胞毒性」ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を遅延化、停止、もしくは逆行させる、任意の検出可能な方式でその活性（例えばＮＫ細胞の細胞溶解活性）を低下させる、あるいは直接的または間接的にそれらを死滅させることができる任意の化合物を包含する。好ましくは、毒性または細胞毒性化合物は、細胞を直接死滅させることにより、アポトーシスの誘発他により作用する。本明細書で用いる毒性「ペプチド」とは、ペプチドもしくは非天然アミノ酸または修飾された連結を有するポリペプチド誘導体を含む任意のペプチド、ポリペプチド、またはそのような誘導体を含み得る。毒性「小分子」は、好ましくは、１０ｋＤ未満、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄまたはより小さい大きさの任意の毒性化合物もしくはエレメントを含み得る。
【００３１】
「免疫原性フラグメント」とは、本明細書では、（ｉ）膜結合受容体およびそこから誘導される変異体を含む上記フラグメントに結合する、および／または上記フラグメントを含む任意の形態の分子に結合する抗体の作成；（ｉｉ）任意のＭＨＣ分子および上記フラグメントから誘導されるペプチドを含む二分子複合体と反応するＴ細胞を包含するＴ細胞応答の刺激；（ｉｉｉ）哺乳動物免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージまたは細菌のようなトランスフェクトされた媒体の結合；のような免疫応答を引き出すことができる任意のポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。あるいは、免疫原性フラグメントはまた、先に定義したような免疫応答を引き出すことができる、共有結合によりキャリヤタンパク質に抱合されたペプチドフラグメント、上記ペプチドフラグメントをそのアミノ酸配列内に含むキメラ組換えポリペプチド構築物のような任意の構築物を意味し、そして具体的には、配列が上記フラグメントをコードする一部を含むｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００３２】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体とは、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合されている抗体を意味する。かかるヒト化抗体は、結合領域が誘導されたヒト以外の動物の結合特異性を維持するが、ヒト以外の抗体に対する免疫反応を回避するように設計されている。
【００３３】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したクラス、エフェクター機能、および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等に連結されるように、定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されている；または（ｂ）可変領域またはその一部が異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置換、または交換されている；抗体分子である。
【００３４】
「ヒト」抗体は、抗原誘発に応答して特異的ヒト抗体を生成するために「操作され」ているトランスジェニックマウスまたはその他の動物から得られた抗体である（例えばGreenら、Nature Genet 7: 13(1994); Lonbergら、Nature 368: 856(1994); Taylorら、Int Immun 6: 579(1994)（その全教示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。そのすべてが当技術分野において公知である遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイテクノロジーにより完全ヒト抗体を構築することもできる（例えばMcCaffertyら、Nature 348: 552-553(1990)参照）。インビトロ活性化Ｂ細胞によりヒト抗体を作成することもできる（例えば米国特許第５５６７６１０号および第５２２９２７５号参照（その全体が参照として本明細書に組み入れられる））。
【００３５】
本発明の局面で、「活性」または「活性化」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、更にとりわけ標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を称する。例えば「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、そして「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない（ＫＩＲ−不適合細胞）細胞を死滅させることができる。再指向死滅アッセイ（redirected killing assay）で使用するのに適切な標的細胞の実例は、Ｐ８１５およびＫ５６２細胞であるが、多くの細胞型のいずれかを用いることができ、そして当技術分野において周知である（例えばSivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998); Pessinoら、J.Exp.Med.188: 953-960(1998); Neriら、Chin.Diag.Lab.Immun.8: 1131-1135(2001)参照）。「活性」または「活性化」細胞を、細胞内遊離カルシウムレベル上昇におけるサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）生成のようなＮＫ活性に随伴されるとして当技術分野において公知の任意のその他の特性または活性により、同定することもできる。
【００３６】
本明細書で用いるＮＫ−ＬＤＧＬなる用語は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、例えば特徴的な表面抗原のセット（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）を有する大型顆粒性リンパ球のクローンエクスパンション（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran、Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）または本明細書で定義するような任意のＮＫ細胞受容体の発現を特徴とする任意の増殖性障害を意味する。ＮＫ−ＬＤＧＬの病徴には、とりわけ発熱、穏やかな好中球減少症、血小板減少症、貧血、リンパ球増加症、脾腫、肝腫大、リンパ節症、および骨髄浸潤（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran、Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）が含まれ得る。
【００３７】
「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋」なる用語は、通常その元来の状態で見出されるように随伴される成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質が、実質的に精製される。
【００３８】
本明細書で用いる「生物学的試料」なる用語には、限定するものではないが、生物学的液体（例えば血清、リンパ、血液）、細胞試料または組織試料（例えば骨髄）が含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然発生アミノ酸の人工的化学的擬似物質であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然発生アミノ酸ポリマーおよび非天然発生アミノ酸ポリマーに適用される。
【００３９】
「組換え」なる用語は、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種性核酸もしくはタンパク質の導入または元来の核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されているかまたは細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示している。したがって、例えば組換え細胞は、元来の（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、発現不足であるか、または全く発現されない元来の遺伝子を発現する。
【００４０】
ＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体の生成
本発明は、ヒトにおいて使用するの適切であり、そして１つまたは少数のＮＫ細胞受容体を標的とする抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の生成および使用を包含する。本発明の抗体をいずれかの種々の当技術分野において公知の技術により生成することができる。典型的にはヒト以外の動物、好ましくは、マウスをＮＫ細胞の表面に存在する受容体を含む免疫原で免疫することによりこれらを生成する。受容体は、全ＮＫ細胞もしくは細胞膜、ＮＫ細胞受容体の全長配列、または任意のＮＫ細胞受容体のフラグメントもしくは誘導体、典型的には、免疫原フラグメント、すなわち受容体を発現する細胞の表面に暴露されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含むことができる。かかるフラグメントは、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７個の連続アミノ酸、なお更に好ましくは、それの少なくとも１０個の連続アミノ酸を含有する。これらは本質的には、受容体の細胞外ドメインから誘導される。数人のまたはすべての患者のＮＫ細胞のすべてまたは一部の表面にしばしばまたはいつも存在する任意の受容体、任意のその他の受容体を抗体の作成に用いることができることは理解される。好ましい実施態様では、抗体を作成するために用いられる活性化ＮＫ細胞は、ヒト受容体である。
【００４１】
最も好ましい実施態様では、免疫原は、脂質膜において、典型的には細胞の表面に野生型ヒトＮＫ受容体ポリペプチドを含む。具体的な実施態様では、免疫原は、無傷のＮＫ細胞、特に無傷のヒトＮＫ細胞を含むが、場合により処理または溶解されている。ＮＫ細胞の表面に存在する任意のタンパク質または分子、好ましくは、ＮＫ細胞受容体、更に好ましくは、ＫＩＲ受容体、ＬＩＲ−１ようなＬＩＲ受容体、Ｌｙ４９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲからなる群から選択されるＮＫ細胞受容体、ならびに最も好ましくは、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性化ＮＫ細胞受容体に対して抗体を調製することができる（例えばTrowsdaleおよびParham、Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002)（その各々の全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００４２】
一実施態様では、抗体は、１つ以上のＮＫ細胞受容体を認識する１つ以上の既存のモノクローナル抗体、例えばＥＢ６ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１を認識する）、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＳ２）、ＦＥＳ１７２（ＫＩＲ２ＤＳ４）、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＸＡ１８５（ＣＤ９４）、Ｚ１９９およびＺ２７０（ＮＫＧ２Ａ）、Ｆ２７８（ＬＩＲ−１）；）、ＢＡＢ２８１（ＮＫｐ４６）、ＡＺ２０（ＮＫｐ３０）、またはＺ２３１（ＮＫｐ４４）から誘導される。例えばＺ１９９およびＺ２７０に関してはZambelloら、Blood 102: 1797-1805(2003)およびMorettaら、J.Exp.Med.180: 545(1994)参照。Bab281は、Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997)に記載されており、; Z231はVitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998)に記載されており；Ｚ２５およびＡＺ２０はまた、Pendeら、J Exp Med.190(10): 1505-1516(1999)に記載されており、そして2000年11月8日にI-2576の番号の下でC.N.C.M.（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．、パスツール研究所、２５番地、ドクトル・ルー通り、Ｆ−７５７２４、パリ、セデックス１５、フランス）に寄託された。患者のＮＫ受容体状態を決定するために本明細書で前記した分類工程のための診断用抗体として使用するために、かかる抗体を直接的または間接的に標識する（すなわち標識二次抗体と共に用いる）ことができる。加えて、抗体をヒト投与に適切なものにし、そして場合により本処置方法において細胞毒性抗体として使用するために本明細書に記載するように毒性にすることができる。
【００４３】
本診断用または処置用（細胞毒性）抗体は、全長抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体でよい。抗体フラグメントの実例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；会合する重鎖部分を含まない、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント；会合する軽鎖部分を含まない、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチドまたは重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。かかるフラグメントおよび誘導体ならびにそれらを調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィドリンケージより下で抗体を消化して、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂの二量体のＦ（ａｂ’）２を生成する。穏やかな条件下でＦ（ａｂ’）２を還元してヒンジ領域のジスルフィドリンケージを切断し、それによりＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Fundamental Immunology(Paul編、第3版、1993)参照）。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化に関して定義されているが、かかるフラグメントをデノボで化学的にか、または組換えＤＮＡ方法論を用いるかのいずれかで合成できることは当業者には理解される。
【００４４】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製は、当技術分野において周知であり、そして多くの利用可能な技術のいずれかを用いることができる（例えばKohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497(1975); Kozborら、Immunology Today 4: 72(1983); Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77〜96頁(1985)参照）。一本鎖抗体の生成のための技術（米国特許第４９４６７７８号）を適合させて望ましいポリペプチド、例えばＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５およびＫＩＲ３ＤＳ１のようなＮＫ細胞受容体に対する抗体を生成することができる。また、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳動物のようなその他の生物を用いてヒト化、キメラ、または同様に修飾された抗体を発現させることができる。あるいは、ファージディスプレイテクノロジーを用いて選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えばMcCaffertyら、Nature 348: 552-554(1990); Marksら、Biotechnology 10: 779-783(1992)参照）。一実施態様では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも１つのＮＫ受容体と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を選択することを含む。例えばレパートリーは、場合により任意の適切な構造（例えばファージ、細菌、合成複合体等）により提示される抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーでよい。
【００４５】
ヒト以外の哺乳動物を抗原で免疫する工程は、当技術分野において周知の任意の様式で実施することができる（例えばE.HarlowおよびD.Lane、Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Hobor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州（1988）参照）。一般に免疫原を、場合により完全フロイントアジュバントのようなアジュバントを含むバッファーに懸濁または溶解させる。免疫原の量、バッファーの型、およびアジュバントの量を決定するための方法は、当業者に周知であり、そして本発明でいかなるようにも限定するものではない。
【００４６】
同様に、抗体の生成を刺激するのに十分な免疫の場所および頻度は、当技術分野において周知である。典型的な免疫プロトコールでは、ヒト以外の動物を抗原で腹腔内注射し、そして約１週間後に再度注射する。これに続いておよそ２０日に、場合により不完全フロイントアジュバントのようなアジュバントを伴って抗原のリコール注射を行う。リコール注射は、静脈内に実施し、そして数日間連続して繰り返すことができる。これに続いて４０日に静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的には、アジュバントを伴わずにブースター注射を行う。このプロトコールにより、結果的に約４０日後に抗原特異的抗体生成Ｂ細胞が生成される。結果的に免疫に用いられた抗原に対して指向する抗体を発現するＢ細胞を生成する限り、その他のプロトコールを用いることもできる。
別の実施態様では、非免疫のヒト以外の動物からのリンパ球を単離し、インビトロで成長させ、そして次に細胞培養中に免疫原に暴露する。次いでリンパ球を回収し、そして以下に記載する融合工程を実施する。
【００４７】
本発明の目的に好ましいモノクローナル抗体に関しては、次の工程は、免疫されたヒト以外の哺乳動物からの細胞、例えばリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞の単離、および続く抗体生成ハイブリドーマを形成するためのこれらの脾細胞またはＢ細胞またはリンパ球の不死化細胞との融合である。したがって、本明細書で用いる「免疫動物からの抗体の調製」なる用語は、免疫動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を得ること、およびこれらの細胞を用いて抗体を発現するハイブリドーマを生成すること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を得ることを含む。例えばヒト以外の哺乳動物からの脾細胞の単離は、当技術分野において周知であり、例えば麻酔されたヒト以外の哺乳動物から脾臓を取り出すこと、それを小片に切断すること、および脾臓莢膜からの脾細胞を圧搾し、そして細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して適切なバッファー中に入れて単一の細胞懸濁液を生成することを包含する。細胞を洗浄し、遠心し、そして任意の赤血球を溶解するバッファーに再懸濁する。溶液を再度遠心し、そしてペレットの残りのリンパ球を最終的に新鮮バッファーに再懸濁する。
【００４８】
一度単離され、そして単一の細胞懸濁液に存在すると、抗体生成細胞を不死細胞系に融合させる。これは典型的には、マウス骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマを創成するのに有用な多くのその他の不死細胞系が当技術分野において公知である。好ましいネズミ骨髄腫系には、限定するものではないが、サルク研究所細胞ディストリビューションセンター（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州、米国）から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ−２から誘導されるものが含まれる。ポリエチレングリコール等を用いて融合を行う。次いで得られたハイブリドーマを未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻止する１つ以上の物質を含有する選択培地で成長させる。例えば親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如する場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。
【００４９】
ハイブリドーマをマクロファージのフィーダー層で成長させることができる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するのに用いたヒト以外の哺乳動物の同腹仔に由来し、そして典型的には、不完全フロイントアジュバント等でプライミングされ（primed）、数日後にハイブリドーマをプレートする。融合方法は、例えば（Goding、「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」59〜103頁（アカデミックプレス、1986））に記載されており、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００５０】
コロニー形成および抗体生成に十分な時間選択培地中で細胞を成長させる。これは、通常７日と１４日の間である。次いでハイブリドーマコロニーを、望ましい基質例えばＫＩＲ２ＤＳ２のようなＮＫ細胞受容体を特異的に認識する抗体の生成に関して検定する。アッセイは、典型的には、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマがその中で成長するウェルに適合させることができる任意のアッセイを用いることができる。その他のアッセイには、免疫沈殿およびラジオイムノアッセイが含まれる。望ましい抗体生成に関して陽性であるウェルを試験して、１つ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１つ以上のコロニーが存在する場合、細胞を再クローン化し、そして成長させて、単一の細胞のみが望ましい抗体を生成するコロニーを生じさせたことを確認する。単一の明確なコロニーを有する陽性ウェルを典型的には、再クローン化し、そして再検定して、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、そして生成されていることを確認する。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体を生成することが確認されたハイブリドーマを次いでＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０のような適切な培地中で大量に成長させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞をインビボで動物の腹水腫瘍として成長させることができる。
十分に成長させて望ましいモノクローナル抗体を生成させた後、モノクローナル抗体（または腹水）を含有する成長培地を細胞から分離し、そしてそこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧセファロースを用いるクロマトグラフィー、またはアガロースもしくはセファロースビーズのような固体支持体に結合させた抗マウス免疫グロブリンにより達成される（すべて、例えばAntibody Purification Handbook、アメルシャムバイオサイエンシズ（Amersham Biosciences）、出版番号１８−１０３７−４６、ＡＣ版に記載されており、その開示は参照として本明細書に組み入れられる）。結合抗体は、典型的には、低ｐＨバッファーを用いることによりプロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出され（グリシンまたはアセテートバッファｐＨ３．０以下）、即座に抗体含有分画を中和する。これらの分画をプールし、透析し、そして必要により濃縮する。
【００５２】
好ましい実施態様では、ＮＫ細胞受容体に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主にトランスフェクトするための適切な発現ベクターに入れる。次いで宿主を用いて抗体、その変種、その活性フラグメント、または抗体の抗原認識部分を含むヒト化もしくはキメラ抗体を組換え生成する。好ましくは、この実施態様で用いるＤＮＡは、１つ以上のヒトＮＫ受容体、とりわけＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者のかなりの割合の分画からのＬＧＬ細胞で優勢に提示されるＮＫ受容体に存在する決定基を認識する抗体をコードする。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、そして従来の手順を用いて（例えばネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）シークエンシングすることができる。一度単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させるために、これを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトする。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は、当技術分野において周知である（Skerraら、Curr.Op.Immunol.5: 256(1993); およびPluckthun、Immunol.Revs.130: 151(1992)参照）。また例えばWardら、Nature 341: 544(1989)に開示されるように、抗体を免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により生成することもできる。
【００５４】
具体的な実施態様では、抗体は、本質的には、モノクローナル抗体ＥＢ６ｂ、ＧＬ１８３、ＦＥＳ１７２、Ｚ２７、Ｑ６６、ＸＡ１８５、Ｚ１９９またはＦ２７８（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003)（その全開示を参照として本明細書に組み入れられる）参照）の１つと同一のエピトープすなわち決定基に結合する。モノクローナル抗体Ｘと「実質的に同一のエピトープすなわち決定基に結合する」なる用語は、抗体がＸ（ここでＸはＥＢ６ｂ等）と「競合することができる」ことを意味する。問題のモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープと結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合を評価することができる種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて容易に決定することができる。かかるアッセイは、当技術分野においては日常的である（例えば米国特許第５６６０８２７号（これは参照として本明細書に組み入れられる）参照）。抗体が結合するエピトープの実際の決定は、問題のモノクローナル抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定する必要は全くないことは理解される。
【００５５】
例えば、試験される被験抗体が異なる供給源の動物から入手されるか、またはまさに異なる免疫グロブリンアイソタイプのものである場合、対照（例えばＧＬ１８３）および被験抗体を混合し（または予め吸収させる）、そしてエピトープ含有タンパク質、例えばＧＬ１８３の場合ＫＩＲ２ＤＳ２を含有する試料に適用する単純な競合アッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、およびビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）の使用（例えば実施例のセクションで記載するように）に基づくプロトコールはかかる単純な競合研究における使用に適切であり、そして当技術分野において周知である。
【００５６】
特定の実施態様では、抗原（例えばＫＩＲ２ＤＳ２エピトープ）含有試料に適用する前に一定の時間、対照抗体（例えばＧＬ１８３）を種々の量の被験抗体（例えば１：１０または１：１００）と予め混合する。その他の実施態様では、抗原に試料を暴露する間、対照および種々の量の被験抗体を単純に混合することができる。遊離抗体から結合を（例えば非結合抗体を排除するための分離または洗浄技術を用いることにより）、および被験抗体から対照抗体を（例えば種もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を用いることにより、または対照抗体を検出可能な標識で特異的に標識することにより）区別できる限り、被験抗体が対照抗体の抗原に対する結合を低減させるかどうかを決定することができ、これは、被験抗体が対照と実質的に同一のエピトープを認識することを示している。全く無関係の抗体の不在下での（標識された）対照抗体の結合は、高値対照である。低値対照は、標識した対照抗体（例えばＧＬ１８３）を正確に同一の型の未標識抗体（例えばＧＬ１８３）と共にインキュベートすることにより得られ、ここで競合が生じ、そして標識抗体の結合は、低減される。試験アッセイでは、被験抗体の存在下での標識抗体反応性の有意な低下は、同一のエピトープを認識する被験抗体、すなわち標識対照抗体と「交差反応する」ものの指標である。約１：１０と約１：１００との間の対照：被験抗体の任意の比率で、標識対照の各抗原に対する結合を少なくとも５０％まで、更に好ましくは、７０％まで低下する任意の被験抗体は、対照と実質的に同一のエピトープまたは決定基と結合する抗体であると考えられる。好ましくは、かかる被験抗体は、対照の抗原に対する結合を少なくとも９０％まで低下させる。
【００５７】
一実施態様では、フローサイトメトリー試験により競合を評価することができる。既定の活性化受容体を担持する細胞を最初に受容体に特異的に結合することが解っている対照抗体と共に（例えばＫＩＲ２ＤＬ２を発現するＮＫ細胞、およびＧＬ１８３抗体）、そして次に例えば蛍光色素またはビオチンで標識した被験抗体と共にインキュベートする。飽和量の対照抗体とプレインキュベートして得られた結合（蛍光の平均）が、対照とプレインキュベートせずに抗体により得られた結合の８０％、好ましくは、５０、４０またはそれより少ない場合、被験抗体は、対照と競合すると考えられる。あるいは、飽和量の被験抗体とプレインキュベートした細胞において標識対照（蛍光色素またはビオチンにより）で得られた結合が、抗体とプレインキュベートせずに得られた結合の８０％、好ましくは、５０％、４０％、またはそれより少ない場合、被験抗体は、対照と競合すると考えられる。
【００５８】
１つの好ましい実例では、被験抗体を予め吸収させ、そして抗体結合のための基質、例えばＧＬ１８３が結合することが解っているＫＩＲ２ＤＳ２タンパク質またはそのエピトープ含有部分が固定されている表面に飽和濃度で適用する単純競合アッセイを用いることができる。表面は、好ましくは、ビアコアチップである。次いで対照抗体（例えばＧＬ１８３）を基質飽和濃度で表面と接触させ、そして対照抗体の基質表面結合を測定する。この対照抗体の結合を、被験抗体不在下で基質含有表面に対する対照抗体の結合と比較する。試験アッセイでは、被験抗体の存在下での対照抗体による基質含有表面の結合の有意な低下は、同一エピトープを認識する被験抗体、すなわち対照抗体と「交差反応する」ものの指標である。対照抗体の抗原含有基質に対する結合を少なくとも３０％まで、または更に好ましくは、４０％まで低下させる任意の被験抗体は、対照抗体と実質的に同一のエピトープすなわち決定基に結合する抗体であると考えられる。好ましくは、かかる被験抗体は、基質に対する対照抗体の結合を少なくとも５０％まで低下させる。対照および被験抗体の順序を逆にすることができる、すなわち対照抗体を最初に表面に結合させ、その後被験抗体を表面と接触させる。好ましくは、基質抗原に高い親和性を有する抗体を最初に基質含有表面に結合させるが、第２の抗体で認められる結合の低下（抗体は、交差反応していると仮定する）の幅が大きくなると予測されるためである。かかるアッセイの更なる実例は、実施例およびSaunalら、J.Immunol.Meth 183: 33-41(1995)（その開示は参照として本明細書に組み入れられる）で提供される。
【００５９】
一実施態様では、特にその他の無関係なタンパク質と過剰な交差反応を示さないことが確実である場合、ＮＫ細胞表面の複数の受容体と相互作用することができる抗体、例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、もしくはＫＩＲ３ＤＬ２のような２つ以上ＮＫ細胞受容体の任意の組み合わせ、またはこれらの受容体および任意の更なるＮＫ細胞受容体もしくは受容体群を包含する任意の組み合わせを得ることができる。好ましくは、ＮＫ細胞受容体からのエピトープ、例えばＫＩＲ２ＤＬ２エピトープを認識するモノクローナル抗体は、特にＮＫ−ＬＤＧＬ患者の、かなりのパーセンテージのＮＫ細胞に存在するエピトープと反応するが、ＣＤ３＋Ｔ細胞と、ＣＤ２０＋Ｂ細胞と、またはその他の免疫もしくは非免疫細胞とは有意に反応しない。好ましい実施態様では、抗体は、単球、顆粒球、血小板、および赤血球とも非反応性である。好ましい実施態様では、抗体は、単一のＮＫ細胞受容体のみを認識し、それにより処置用（例えば細胞毒性）抗体の、障害の基礎となる過剰増殖細胞への影響をできるだけ制限する。
【００６０】
一度ＮＫ細胞、好ましくは、ヒトＮＫ細胞の１つのまたは恐らく少数の受容体を特異的に認識する抗体を同定すると、ＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害を有する患者から採取したＬＧＬ（好ましくは、ＮＫ）細胞に結合するその能力に関してそれを試験することができる。
【００６１】
典型的には、抗体は、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者から採取したＮＫ細胞に結合するその能力を試験するために免疫測定法で確認される。例えば多くの患者から採取した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびＮＫ細胞は、ＣＤ３のようなＮＫ細胞に存在する受容体に対する抗体を用いてＰＢＬから富化される（例えばＺａｍｂｅｌｌｏら、Ｂｌｏｏｄ １０２：１７９７（２００３）参照）。次いで既定の抗体のＮＫ細胞に結合する能力を当業者に周知の標準的な方法を用いて評価する。一実施態様では、細胞の各試料を、特定のＮＫ細胞受容体に各々特異的である種々の抗体と共に個別にインキュベートする。有意なパーセンテージの（例えば５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより多い）患者からのかなりの比率の（例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれより多い）ＮＫ細胞に結合することが見出された抗体は、本明細書で記載するＮＫ受容体状態分類工程の間の診断目的のため、または本明細書に記載する処置方法での使用、例えばヒトに適切な細胞毒性抗体を形成する誘導体化のための双方で本発明で使用するのに適切である。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体を直接的かまたは間接的のいずれかで標識することができる。間接的に標識する場合、典型的には、二次標識抗体を加える。次いで例えばサイトフローメーター分析（例えばファックスキャン）を用いて抗体の細胞への結合を検出することができる。例えばZanibelloら、Blood 102: 1797(2003)または任意のその他の標準的な方法を参照。
【００６２】
少数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の抗体が、ＮＫ−ＬＤＧＬのような障害を有するほとんどの患者のほとんどの過剰増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞を検出および標的化するのに十分であることが予測される。したがって本方法を用いて実際にすべての患者を分類および処置するのに一般に十分である診断用（直接的または間接的に標識された）および処置用（ヒトに適切な、場合により毒性）抗体の小型パネルを組み立てることが可能である。かかるパネルは、最終的には、キットとして利用可能になり、好ましくは、抗体を用いるための装置を伴って完成する。
【００６３】
したがって、本発明に従って生成された抗体のパネルは、１つまたは少数のＮＫ受容体型に特異的であるものを含む。加えて、いくつかの実施態様では、既定の受容体に対して複数の抗体を調製して、インビボで全患者における受容体発現細胞の最大標的化を確実にし、そしてまた最大数の患者において多型受容体が有効に標的化されることを確実にする。
【００６４】
ヒトにおいて使用するのに適切な抗体の生成
一度、一般的にヒト以外の動物においてＮＫ−ＬＤＧＬ患者のＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞に通例的に存在する１つ以上のＮＫ受容体に特異的に結合することができるモノクローナル抗体が生成されると、抗体は、一般的にそれらをヒトにおける治療的使用に適切なものにするために修飾される。例えばそれらをヒト化、キメラ化、または当技術分野において周知の方法を用いてヒト抗体のライブラリーから選択することができる。かかるヒトに適切な抗体を本処置方法において直接使用するか、または該方法での使用のために前記したように更に細胞毒性抗体に誘導体化することができる。
【００６５】
１つの好ましい実施態様では、本発明の抗体、例えばＧＬ１８３様抗体を生成するハイブリドーマのＤＮＡを、発現ベクターへの挿入の前に、例えばヒト以外の相同配列に代えてヒト重および軽鎖定常ドメインに関するコード化配列を代用することにより（例えばMorrisonら、PNAS 81: 6851(1984)）、また免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列のすべてまたは部分を共有結合させることにより修飾することができる。その様式では、元来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。典型的には、本発明の抗体の定常ドメインに代えてかかる非免疫グロブリンポリペプチドを代用する。
【００６６】
１つの特に好ましい実施態様では、本発明の抗体をヒト化する。本発明による抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいはその他の抗体の抗原結合部分配列のような）そのフラグメントであり、これらはネズミまたはその他のヒト以外の免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する。大部分でヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、元来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されているが、元来の抗体の望ましい特異性、親和性、および能力は、維持している。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応するヒト以外の残基により置換することができる場合もある。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。抗体の性能を更に精密化および最適化するためにこれらの修飾を行う。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および典型的には、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで元来の抗体のものに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべて、およびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。更に詳細な記載に関しては、Jonesら、Nature 321: 522(1986); Reichmannら、Nature 332: 323(1988); Verhoeyenら、(1988)Science 239: 1534(1988); Presta、Curr.Op.Struct.Biol.2: 593(1992)（その各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照。
【００６７】
ヒト化抗体を作成するのに用いるための軽および重双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いでマウスの配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Simsら、J.Immun.151: 2296(1993); ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.196: 901(1987)）。別の方法は、軽または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同一のフレームワークを用いることができる（Carterら、PNAS 89: 4285(1992); Prestaら、J.Immunol.51: 1993(1993)）。
【００６８】
抗体がヒト化されるが、１つ以上のＮＫ細胞受容体、好ましくは、ヒト受容体に関する高い親和性、およびその他の有益な生物学的特性を保持していることは更に重要である。好ましい方法に従ってこの目標を達成するために、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の理論的ヒト化生成物の分析方法によりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは通例的に入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元コンフォメーション構造を説明および提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの提示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このように、標的抗原に関する親和性の増加のような望ましい抗体の特徴が達成されるようにＦＲ残基をコンセンサスおよび移入配列から選択し、そして組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的におよび最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【００６９】
また免疫化のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作されているその他のトランスジェニック動物を用いることによるような種々のその他の技術に従ってヒト抗体を生成することもできる。この技術では、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座が標的破壊されたマウスまたはその他の動物に導入する（例えばJakobovitzら、Nature 362: 255(1993); Greenら、Nature Genet.7: 13(1994); Lonbergら、Nature 368: 856(1994); Taylorら、Int.Immun.6: 579(1994)（そのすべての開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。あるいは、遺伝子または染色体トランスフェクション方法により、またはファージディスプレイ方法を用いる抗体レパートリーの選択を介してヒト抗体を構築することができる。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を繊維状バクテリオファージの大または小のいずれかのコートタンパク質遺伝子にフレーム内でクローン化し、そしてファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示させる。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択もまた結果的にこれらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択に至る。このように、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を擬似する（例えばJohnsonら、Curr Op Struct Biol 3: 5564-571(1993); McCaffertyら、Nature 348: 552-553(1990)（その全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。またヒト抗体をインビトロ活性化Ｂ細胞により作成することもできる（例えば米国特許第５５６７６１０号および第５２２９２７５号（その開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００７０】
一実施態様では、免疫化にＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（アブゲニックス、フレモント、カリフォルニア州）のような動物を用いて「ヒト化」モノクローナル抗体を作成する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されたその免疫グロブリン遺伝子を有するネズミ宿主である。したがって、このマウスにより生成された、またはこのマウスのＢ細胞から作成されたハイブリドーマの抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６１６２９６３号に記載されており、これはそのすべてが参照として本明細書に組み入れられる。ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ））を用いて類似の方法を達成することができる。
【００７１】
本発明の抗体を「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に誘導体化することもでき、ここで重および／または軽鎖の一部は、元来の抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖の残りは、望ましい生物学的活性を呈する限り、別の種から誘導された、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびかかる抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるかまたは相同である（例えばMorrisonら、PNAS 81: 6851(1984)；米国特許第４８１６５６７号参照）。
【００７２】
とりわけＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の、非誘導体化または非修飾形態の抗体は、過剰増殖ＮＫ細胞の増殖を阻止するか、またはＮＫ−ＬＤＧＬ患者からのもののような過剰増殖ＮＫ細胞に対して細胞毒性であると予測されるが、それらを細胞毒性にするために誘導体化された抗体を調製することも可能である。一実施態様では、一度ＮＫ細胞受容体特異的抗体を単離し、そしてヒトにおける使用に適切なものにすると、それらを細胞に対して毒性になるように誘導体化する。このように、ＮＫ−ＬＤＧＬ患者への抗体の投与により抗体の過剰増殖ＮＫ細胞への相対的特異的結合に至り、それにより障害の基礎となる細胞を直接的に死滅させるかまたは阻止する。処置の特異性のために、ほとんどのその他のＮＫ細胞および免疫系のその他の細胞を含む身体のその他の非過剰増殖細胞は、それほど処置の影響を受けない。
【００７３】
多くの毒性部分または計画のいずれかを用いて、かかる抗体を生成することができる。特定の好ましい実施態様では、抗体を放射性同位元素またはその他の毒性化合物で直接的に誘導体化する。そのような場合、標識された単一特異的抗体を患者に注射することができ、ここでそれは次に標的抗原を発現する細胞に結合しそして死滅させ、非結合抗体は、簡単に身体から除去される。また「親和性増強系」（ＡＥＳ）（例えば米国特許第５２５６３９５号；Barbetら、Cancer Biother Radiopharm 14: 153-166(1999)（その全開示は、参照として本明細書に組み入れられる）参照）のような間接的計画を用いることもできる。この特定の研究法は、放射性標識されたハプテン、ならびにＮＫ細胞受容体および放射活性ハプテンの双方を認識する抗体の使用を包含する。この場合、抗体は、最初に患者に注射され、そして標的細胞に結合することが可能になり、そして次に一度非結合抗体が血流から除去されることが可能になると、放射標識されたハプテンが投与される。ハプテンは、過剰増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞で抗体−抗原複合体に結合し、それによりそれらを死滅させ、非結合抗体ハプテンは、身体から除去される。
【００７４】
細胞毒性または細胞阻止効果を有する任意の型の部分を本抗体と組み合わせて用いて特異的ＮＫ受容体発現細胞を阻止または死滅させることができ、薬物、毒素、免疫モジュレーター、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、処置用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タクサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害剤、ＳＮ−３８、抗分裂剤、抗血管形成およびアポトーシス剤、とりわけドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ配位錯体、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素他のような放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子を含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第19版（マック出版社、1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics（マックグロウヒル(McGraw Hill)、2001); Pastanら、Cell 47: 641(1986); Goldenberg、Cancer Journal for Clinicians 44: 43(1994)；米国特許第６０７７４９９号（その全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。毒素は、動物、植物、菌類、または微生物起源でよいか、または化学合成によりデノボ創成できることは理解される。
【００７５】
多くの利用可能な方法を用いて毒素またはその他の化合物を抗体に直接的かまたは間接的に連結させることができる。例えばＮ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のような架橋剤を用いて、または抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介して、薬剤を還元抗体成分のヒンジ領域でジスルフィド結合形成を介して結合させることができる（例えばYuら、Int.J.Cancer 56: 244(1994); Wong、Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking（シーアールシープレス（CRC Press)、1991); Upeslacisら、「Modification of Antibodies by chemical Methods」in Monoclonal antibodies: principles and applications、Birchら（編）187〜230頁（ワイリー・リス社（Wiley-Liss,Inc)、1995); Price、「Production and Charactorization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」in Monoclonal antibodies: Production,engineering and clinical application、Ritterら(編)、60〜84頁（ケンブリッジ大学プレス（Cambridge University Press)、1995); Cattelら、Chemistry today 7: 51-58(1989); Delprinoら、J.Pharm.Sci 82: 699-704(1993); Arpiccoら、Bioconjugate Chemistry 8: 3(1997); Reisfeldら、Antibody,Immunicon.Radiopharm.2: 217(1989)（その各々の全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００７６】
１つの好ましい実施態様では、抗体は、Ｉ−１３１のような放射性同位元素で誘導体化される。限定するものではないが、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラソジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、および鉛−２１１を含むいずれかの多くの適切な放射性同位元素を用いることができる。一般的に放射性核種は、好ましくは、２０から６０００ｋｅＶの範囲、オージェ放射体に関しては、好ましくは、６０から２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体に関しては、１００から２５００ｋｅＶ、およびアルファ放射体に関しては、４０００から６０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有している。また実質的にアルファ粒子の作成を伴って崩壊する放射性核種もまた好ましい。
【００７７】
本方法に含まれる細胞毒性部分を選択する場合、該部分が、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、胸腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒト身体におけるその他の生命維持器官もしくは組織から選択される１つ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して有意なインビボ副作用を呈さないことを確実にすることが望ましい。本明細書で用いる「有意な副作用」なる用語は、インビボで投与された場合、化学療法の間に通常的に遭遇するもののような、無視できるかまたは臨床的に管理できる副作用しか生じない抗体、リガンド、または抗体抱合体を意味する。
【００７８】
結合および細胞毒性活性に関する細胞毒性抗体の試験
一度、ＮＫ−ＬＤＧＬまたは関連する障害を有する患者からの細胞のＮＫ細胞受容体に特異的に結合することが解っており、そしてヒトにおいて使用するのに適切なものになっており、そして場合により毒性部分を含むように誘導体化されている抗体が得られると、一般的にこれらは標的細胞と相互作用し、その活性に影響し、そして／または死滅させるその能力に関して評価される。一般的に、競合基盤のアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ビアコア基盤のアッセイ、およびフローサイトメトリーを含む、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体を検出するための先に記載したアッセイを同様に適用して、細胞毒性抗体のようなヒト化、キメラ、またはその他のヒトに適切なＮＫ細胞抗体の、その標的細胞との相互作用を検出することができる。典型的には、標的細胞は、ＬＧＬ細胞、好ましくは、ＮＫ−ＬＤＧＬまたは別の免疫増殖性障害を有する患者から採取したＮＫ細胞である。
【００７９】
本アッセイでは、ヒト化またはヒトに適切な処置用（例えば細胞毒性）抗体の標的細胞またはヒトＮＫ細胞受容体に結合する能力を、対照タンパク質、例えば構造的に無関係の抗原に対して産生された抗体、または非免疫グロブリンペプチドもしくはタンパク質の同一標的に結合する能力と比較する。任意の適切なアッセイを用いて、対照タンパク質に相対して２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％、またはそれより高い親和性の上昇を伴って標的細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体またはフラグメントは、標的と「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」と考えられ、そして以下に記載する処置方法において使用するのが好ましい。
【００８０】
結合に加えて、標的細胞の増殖を阻止する、または好ましくは、標的細胞を死滅させる抗体の能力を評価することができる。一実施態様では、１つ以上の関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞、例えばＮＫ−ＬＤＧＬ患者から採取したＬＧＬまたはＮＫ細胞をプレート、例えば９６ウェルプレートに導入し、そして種々の量の関連抗体に暴露する。アラマーブルー（バイオソースインターナショナル、カマリロ、カリフォルニア州）のような生体染色色素、すなわち無傷の細胞に取り込まれる色素を加え、そして洗浄して過剰の色素除去することにより、光学密度により生存細胞の数を測定することができる（抗体により死滅した細胞が多いほど、光学密度が低くなる）（例えばConnollyら、J Pharm Exp Ther 298: 25-33(2001)（その開示は、そのすべてが参照として本明細書に組み入れられる）参照）。任意のその他の適切なインビトロ細胞毒性アッセイ、細胞増殖もしくは生存を測定するアッセイ、またはＮＫ細胞活性を検出するアッセイを同様に用いることができ、インビボアッセイ、例えば関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞を含有する動物モデル、例えばマウスに抗体を投与すること、およびヒトＮＫ細胞の生存または活性に及ぼす抗体投与の影響を経時的に検出することもまた同様に用いることができる。また、抗体がヒト以外の受容体、例えば霊長類ＮＫ細胞受容体と交差反応する場合、処置用抗体をインビトロまたはインビボで用いて、抗体が関連受容体を発現する動物からのＮＫ細胞に結合し、そして／またはそれを死滅させる能力を評価することができる。
【００８１】
インビトロまたはインビボで過剰増殖ＮＫ細胞の増殖を検出可能なように遅延化、停止または逆行させることができる任意の抗体、好ましくは、ヒトに適切な抗体、例えば細胞毒性抗体を本方法において用いることができる。好ましくは、抗体は、増殖を停止させることが可能であり（例えばインビトロまたはインビボで標的ＮＫ細胞受容体を発現するＮＫ細胞の数の増加を妨げる）、そして最も好ましくは、抗体は、増殖を逆行させてかかる細胞の全数の低下を導くことができる。特定の実施態様では、抗体は、標的受容体を発現するＮＫ細胞の数において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少を生じることが可能である。
【００８２】
１つの好ましい実施態様では、したがって本発明は、以下の工程：ａ）ＮＫ細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；ｂ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する抗体の能力を試験すること；ｃ）一人以上の上記患者から採取したＮＫ細胞の相当数に結合する上記複数の抗体から１つを選択すること；およびｄ）上記抗体をヒト投与に適切なものにすること；を含む、ＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害の処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を上記抗体に連結させる工程を含む。かかる方法では、「相当数」とは、細胞の例えば３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより高いパーセンテージを意味し得る。
【００８３】
本発明はまた、以下の工程：ａ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に特異的に結合する抗体を提供すること；ｂ）抗体のＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する能力を試験すること；およびｃ）抗体が、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の相当数に結合する場合、該抗体をヒト投与に適切なものにすること；を含む関連する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を該抗体に連結させる工程を含む。かかる方法および先行のパラグラフを含む本明細書で別に記載する方法を、ＮＫ細胞以外の細胞、例えばＬＧＬ細胞を用いて、そしてＮＫ−ＬＤＧＬ以外の障害、例えばＴ細胞ＬＤＧＬまたはその他の免疫増殖性障害の処置のために同様に実施することができることは理解される。
【００８４】
均等の方法を用いて動物を処置する、または動物モデルにおいて試験するのに適切な抗体を生成することができる。その場合、抗体は、関連動物からの、およびＮＫまたはその他の細胞のクローンエクスパンションを包含する動物疾患においてよく見られるＮＫ細胞受容体を特異的に認識することができることを確実にする。同様に、特定の動物への投与に適切であるように抗体を修飾する。
【００８５】
処置方法のための抗体の投与
本方法を用いて生成された抗体は、増殖性障害、特に免疫増殖性障害、更にとりわけＮＫ−ＬＤＧＬの処置においてとりわけ有効である。一般的に本方法を用いて１つまたは少数のＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞の存在または過剰により引き起こされる任意の障害を処置することができ、そしてしたがって特定のＮＫ細胞受容体を発現する細胞を選択的に死滅させるかまたは阻止することによりそれを有効に処置することができる。その他の適切な疾患には、Ｔ細胞型ＬＤＧＬ、自己免疫障害、およびＮＫまたは関係する細胞を包含する任意のその他の免疫増殖性もしくは悪性障害が含まれる。
【００８６】
本処置方法の重要な構成要素は、患者のエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞の優勢な受容体または受容体群を同定する分類工程である。一般的にこの工程では、ＮＫ細胞またはＬＧＬを患者から採取し、そして例えば免疫測定法を用いて試験して細胞の種々ＮＫ細胞受容体の相対的な優勢を測定する。この方法に関しては、ＮＫ細胞が好ましいが、ＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞型を使用できることは理解される。理想的には、直接的かもしくは間接的のいずれかで標識された、最も通例的にＮＫ−ＬＤＧＬまたは関連障害における増殖ＮＫ細胞において見出される種々のＮＫ細胞受容体を一緒に認識する抗体のパネルを含有するキットを用いてこの工程を実施する。しばしば１つのまたは少数の受容体が相当数の、例えば３０％、４０％、５０％の細胞、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上に存在することが見出される。この場合、次いで単一のまたは少数の処置用（例えば細胞毒性）抗体または抗体群、すなわち検出される受容体または受容体群に対して特異的に指向するものを投与することができる。このように、過剰増殖細胞が特異的に標的化される。
【００８７】
先に記載した免疫学的アッセイに加えて、またその他の方法を用いて患者から採取したＬＧＬまたはＮＫ細胞の種々のＮＫ細胞受容体の同一性および相対的発現レベルを決定することもできる。例えばＲＮＡ基盤の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングを用いて患者から採取した細胞における種々のＮＫ細胞受容体の相対転写レベルを試験することができる。多くの場合、単一または少数の受容体特異的転写物が優勢であり、それにより転写物によりコードされる特定の受容体群に特異的な細胞毒性抗体を用いる患者の処置が可能になる。
【００８８】
別の実施態様では、患者の増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞で発現されるＮＫ細胞受容体の同一性への洞察は、遺伝子型決定により得ることができる。例えば２０またはそれ以上の異なるＫＩＲハロタイプおよび少なくとも４０の異なる遺伝子型（例えばＨｓｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１９０：４０−５２（２００２）（これはそのすべてが参照として本明細書に組み入れられる）参照）が同定されている。これらのハロタイプおよび遺伝子型のいくつかはＫＩＲ受容体発現の活性化または阻止に随伴される。したがって、患者が特定のハロタイプまたは特定の遺伝子型を有していることの決定により、しばしばどの受容体が患者のＮＫ細胞において発現される可能性が最も高いかを示すことができる。患者の特定のハロタイプまたは遺伝子型が確実に特定の発現パターンまたはＮＫ受容体状態に随伴され得て、それにより本処置方法における使用のために特定の処置用（例えば細胞毒性）抗体の選択が可能になる場合もある。
【００８９】
別の実施態様では、患者におけるＬＧＬ（好ましくは、ＮＫ）細胞の活性を評価するための機能的アッセイを単独で、またはその他の方法、例えば免疫学的、ＲＮＡ基盤または遺伝子型決定方法と組み合わせて用いる。１つ以上の活性化ＮＫ細胞受容体が多くの患者で優勢であり得るので、特定の患者から採取した細胞がとりわけ活性である（任意の標準的なアッセイ、例えば細胞溶解アッセイ、サイトカイン生成、細胞内遊離カルシウム等を用いて決定されるように）という知見は、受容体が増殖細胞において発現され得るということについての重要な情報を提供する。かかる情報は、とりわけその他の結果と組み合わせた場合に、細胞毒性抗体または抗体群を用いてほとんどの特異的処置計画を達成することを決定するために用いることができる。例えば、特定のＮＫ−ＬＤＧＬ患者からの大部分のＮＫ細胞がＧＬ１８３抗体（阻止ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体ならびに活性化ＫＩＲ２ＤＳ２受容体の双方を認識する）により特異的に認識されるという知見は、ほとんどのＮＫ細胞もまた活性であるという知見と組み合わせて用いて、理想的な処置は、ＮＫＲ２ＤＳ２に特異的であるが、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３には特異的でない単一の細胞毒性抗体を包含すると結論づけることができる。理想的には、本処置方法は、最低数の処置抗体を用いて最大比率の過剰増殖ＮＫまたはＮＫ様細胞を標的とする。
【００９０】
理想的には、本抗体、それを用いるための方法およびキットの開発において、異なるＮＫ細胞に対して指向する多くの異なる抗体で多くの患者をスクリーニングする。そのように、ほとんどの患者のエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞の大部分を網羅する診断用および処置用（例えば細胞毒性）抗体のパネルを組み立てることができる。例えばＫＩＲ受容体の１つ（例えばＫＩＲ２ＤＳ２）がＮＫ−ＬＤＧＬを有するかなりのパーセンテージ（例えば２５％、５０％、またはそれより高い）の患者のエクスパンションした（expanded）細胞の少なくとも５０％で発現されることが決定される場合、次いで本発明に従って生成されたキットは一般的にその受容体に対する少なくとも１つの診断用抗体、および受容体に対する１つ以上の処置用抗体を含む。受容体がＮＫ細胞に特異的である、すなわち他のどの細胞型でも発現されない場合にこれはとりわけ真実であるが、その他の細胞型においても発現される受容体を含めることもできる。特に、それが患者のかなりのＮＫ細胞を標的するための唯一の方式である場合、非ＮＫ細胞特異性である受容体に特異的に結合する処置用抗体を用いることができる。包含される非ＮＫ細胞の型に依存して、ＮＫ細胞とのその相互作用を最大にし、そして非ＮＫ細胞型との相互作用を最低にするために（例えば受容体が未成熟ＢまたはＴ細胞においても発現される場合、骨髄または胸腺とのその接触を最大にするように抗体を投与すること）処置用抗体の投与の形態または時期を具体的にあつらえることができる。
【００９１】
本発明のキットは、任意の数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０の診断用および／もしくは処置用抗体または任意のその他の数の診断用および／もしくは処置用抗体を含有することができる。かかるキットでは、診断用抗体は、しばしば直接的かまたは間接的に（例えば二次抗体を用いて）標識される。処置用抗体は未修飾でよく、すなわち連結された細胞毒性またはその他の部分を何ら含まず、例えば標的細胞への単純な結合により作用し、そしてそれにより、それらを不活性化するか、細胞死を誘発するか、または免疫系によりそれらを破壊させる。その他の実施態様では、処置用抗体は、１つ以上の細胞毒性部分に連結される。キットの内容のこの記載はいかなるようにも制限するものではないことは理解される。例えば処置用抗体用には、キットは任意の組み合わせの未修飾または細胞毒性抗体を含有し得る。加えて、キットは化学療法剤または抗腫瘍薬のようなその他の型の処置用化合物を同様に含有できる。好ましくは、キットはまた抗体を使用する、例えば患者のＮＫ受容体状態を分類するための本明細書に記載する方法を詳記し、そしてそれに従って処置用抗体を投与するための指示書を含む。
【００９２】
処置用抗体の投与は、必要に応じて、特に前記した分類工程で決定されるようなＮＫ受容体状態に鑑みて、単一または複数のＮＫ細胞受容体に対して指向する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または任意の数の異なる抗体の投与を包含し得ることは理解される。例えば各々の抗体の相対的毒性、患者のＮＫ受容体状態またはその他の因子に依存して、かかる抗体の組み合わせを一緒に、または別個に投与することができる。
【００９３】
加えて、処置は、複数回の一連の処置用（例えば細胞毒性）抗体投与を包含し得る。例えば最初の一連の抗体投与の後、一般に患者のＮＫまたはＬＧＬ全数を再測定し、そして依然高い場合、更なる一連のＮＫ受容体状態分類を実施し、続いて更なる一連の処置用抗体投与を実施することができる。この更なる一連の投与で投与される細胞毒性抗体は、最初の一巡で用いるものと同一である必要はないが、主に更なる分類工程の結果に依存する。このように、複数回の一連のＮＫ受容体状態分類および処置用抗体投与を例えばＬＧＬまたはＮＫ細胞増殖が制御下に入るまで実施することができる。
【００９４】
本発明はまた、例えばそのフラグメントおよびその誘導体を含むいずれかの本抗体を任意の適切なベヒクル中、患者における標的ＮＫ細胞受容体を発現する細胞の増殖もしくは活性を阻止するか、またはそれを死滅させるのに有効な量で含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。一般に組成物は、更に医薬的に許容される担体を含む。抗体および組成物を患者に投与する本方法を用いて動物を処置するか、またはヒト疾患のための動物モデルにおいて本明細書に記載するいずれかの方法または組成物の有効性を試験することもできることは理解される。
【００９５】
これらの組成物で用いることができる医薬的に許容される担体には、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩または電解質、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基盤物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれる。
【００９６】
本発明の組成物を経口的、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、または移植されたリザーバーを介して投与することができる。本明細書で用いる「非経口的」なる用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、包膜内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。好ましくは、組成物を経口的、腹腔内または静脈内に投与する。
【００９７】
本発明の組成物の滅菌注射用形態は、水性または油性懸濁液でよい。適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて当技術分野において公知の技術に従ってこれらの懸濁液を調製することができる。滅菌注射用調製物はまた、無毒の非経口用に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としてでもよい。許容されるベヒクルおよび溶媒のうち、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液を用いることができる。加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁溶媒として都合良く用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の混合不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注射用調製物に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油のような天然の医薬的に許容される油、特にそのポリオキシエチル化されたものも同様である。これらの油溶液または懸濁液はまた、カルボキシメチルセルロースまたは、エマルジョンおよび懸濁液を含む医薬的に許容される投与形態の処方で通例的に用いられる類似の分散剤のような、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有することもできる。その他の通例的に用いられる、トゥイーン、スパンのような界面活性剤、およびその他の乳化剤または医薬的に許容される固体、液体もしくはその他の投与形態の製造において通例的に用いられるバイオアベイラビリティー強化剤もまた処方の目的で使用することができる。
【００９８】
本発明の組成物を、限定するものではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む任意の経口用に許容される投与形態で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、通例的に用いられる担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤もまた加えられる。カプセル形態で経口投与するために、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場合、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望により、特定の甘味剤、着香剤、または着色剤を加えることもできる。
【００９９】
あるいは、本発明の組成物を直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。薬剤を、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、そしてしたがって直腸で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによりこれを調製することができる。かかる材料にはココアバター、ミツロウ、およびポリエチレングリコールが含まれる。また本発明の組成物を局所的に、眼科的に、鼻用エアロゾルまたは吸入により投与することもできる。医薬用処方の分野において周知の技術に従ってかかる組成物を調製する。
【０１００】
一実施態様では、本発明の抗体を単独でまたは患者もしくは動物に標的分配するための別の物質と一緒にリポソーム（「免疫リポソーム」）に組み込むことができる。かかるその他の物質には、遺伝子処置のための遺伝子の分配のための、またはＮＫ細胞の遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、もしくはｓｉＲＮＡの分配のための核酸、またはその他の手段によるＮＫ細胞の活性化のための毒素もしくは薬物、または本明細書に記載する、ＮＫ細胞の活性化または腫瘍もしくは感染細胞の標的化に有用であり得る任意のその他の薬剤が含まれ得る。
【０１０１】
別の実施態様では、本発明の抗体を修飾してそのバイオアベイラビリティー、インビボ半減期等を改善することができる。例えば多くの形態のポリエチレングリコールのいずれかおよび当技術分野において公知の結合の方法を用いて抗体をペグ化することができる（例えばLeeら、Bioconjug Chem.14(3): 546-53(2003); Harrisら、Nat Rev Drug Discoy.2(3): 214-21(2003); Deckertら、Int J Cancer.87(3): 382-90(2000)参照）。
【０１０２】
リツキサン（リツキシマブ）、ヘルセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリムのようないくつかのモノクローナル抗体は、臨床症状において有効であることが示されており、そして類似の投与計画（すなわち処方および／または用量および／または投与プロトコール）を本発明の抗体で用いることができる。投与のためのスケジュールおよび用量をこれらの製品に関する公知の方法に従って、例えば製造者の指示書を用いて決定することができる。例えばモノクローナル抗体を１００ｍｇ（１０ｍｌ）または５００ｍｇ（５０ｍｌ）のいずれかの使い捨てバイアル中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で供給することができる。静脈内投与用に９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０および注射用滅菌水中で製品を処方する。ｐＨを６．５に調整する。本発明の抗体のための適切な用量範囲の実例は、約１０ｍｇ／ｍ２と５００ｍｇ／ｍ２の間でよい。しかしながら、これらのスケジュールは実例であり、そして臨床試験で決定されなければならない最適なスケジュールおよび投与計画は、抗体の親和性および抗体の耐用性を考慮に入れて適合させることができることは理解される。ＮＫ細胞を２４時間、４８時間、７２時間、または１週間もしくは１か月間飽和させるＮＫ細胞受容体に対する抗体の注射の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメーターを考慮して決定される。
【０１０３】
別の実施態様に従って、本発明の抗体組成物は、更に抗体が投与される特定の処置目的で通常利用される薬剤を含む、１つ以上の更なる処置剤を含み得る。通常更なる処置剤は、組成物で、典型的にはその薬剤が処置される特定の疾患または症状のための単剤療法で用いられる量で存在する。かかる処置剤には、限定するものではないが癌の処置で用いられる処置剤、感染疾患を処置するために用いられる処置剤、その他の免疫処置で用いられる処置剤、（ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような）サイトカイン、その他の抗体およびその他の抗体のフラグメントが含まれる。特定の処置研究法がそれ自体患者の症状に有害であることが解っていない限り、そしてＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置に有意に対抗しない限り、本発明とのその組み合わせが企図される。
【０１０４】
充実性腫瘍の処置と関連して、本発明を外科的手術、放射線処置、化学療法等のような古典的研究法と組み合わせて用いることができる。したがって本発明は、ＮＫ細胞受容体に対するヒト化またはヒトに適切な抗体を外科的手術もしくは放射線処置と同時に、前にもしくは後に用いるか；または従来の化学療法、放射線処置もしくは抗血管形成剤または標的免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）と共に、前にもしくは後に投与する組み合わせ処置を提供する。ＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置および抗癌剤を単一の組成物で、または異なる投与経路を用いる２つの別個の組成物としてのいずれかで患者に同時に投与することができる。
【０１０５】
１つ以上の薬剤（例えば抗癌またはその他の抗ＮＫ ＬＤＧＬ剤）を本抗体基盤処置と組み合わせて用いる場合、組み合わせの結果が、各々の処置が別個に行われたときに観察される効果に付加的であることは要求されない。一般的に少なくとも付加的な効果が望ましいが、単一の処置の１つを超えて上昇した任意の抗ＮＫ細胞増殖効果が有益である。また、組み合わせ処置が相乗効果を奏することを特に要求されるわけではないが、これは確かに可能であり、そして有利である。処置用ＮＫ受容体基盤の処置は、例えば数分から数週間および数ヶ月の範囲の間隔で、その他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤処置に先行または追随してよい。処置用ＮＫ細胞受容体抗体基盤の組成物またはその他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤のいずれかの１回以上の投与が利用されることも想定される。薬剤を交互に、隔日または隔週に投与することができるか；またはＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置の１サイクルを行い、続いてその他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤処置の１サイクルを行うことができる。いずれにしても、組み合わせ処置を用いてＮＫ細胞過剰増殖の阻止を達成するために、必要なことは双方の薬剤を、投与回数に関わらず、抗増殖性効果を奏するのに有効な組み合わせた量で送達することである。
【０１０６】
別の態様では、免疫モデュレトリー化合物または投与計画を本発明と組み合わせて実行することができる。好ましい実例には、サイトカインとの処置が含まれる。種々のサイトカインをかかる組み合わせ研究法において用いることができる。サイトカインの実例には、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＬＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマが含まれる。患者の症状およびサイトカインの相対的毒性のような臨床適応に一致する標準的な投与計画に従ってサイトカインを投与する。
【０１０７】
本発明のものと組み合わせて実行できる化合物または投与計画のその他の好ましい実例には、ＮＫ細胞の活性をモデュレーションする組成物が含まれる。例えば、特定の好ましい実施態様では、本発明の抗体を、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体またはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ２のような阻止ＫＩＲ受容体の活性を刺激することができる天然リガンド、抗体、または小分子のような阻止ＮＫ細胞受容体を刺激することができる化合物と併せて投与する（例えばYawataら、Crit Rev Immunol.22(5-6): 463-82(2002); Middletonら、Transpl Immunol.10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol.20: 217-51(2002); またはLongら、Immunol Rev.181: 223-33(2001)（その各々の開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照）。あるいは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のような活性化ＮＫ細胞受容体の阻害剤を用いることもできる。
【０１０８】
化学療法は、しばしばＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害、特にＮＫ−ＬＤＧＬ白血病を処置するために用いられるので、本発明のＮＫ細胞受容体抗体処置用組成物をその他の化学療法剤またはホルモン処置剤と組み合わせて投与することができる。種々のホルモン処置および化学療法剤を本明細書に開示する処置方法と組み合わせて用いることができる。企図される化学療法剤の実例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗体、ビンカアルカロイド、例えばアドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテレ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（類）ならびにその誘導体およびプロドラッグが含まれる。ホルモン様薬剤には、例えばロイプロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリンのようなＬＨＲＨアゴニスト；タモキシフェンおよびトレミフェンのような抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、およびビカルタミドのような抗アンドロゲン；アナストロゾール、エクセメスタン、レトロゾール、およびファドロゾールのようなアルマターゼ阻害剤；ならびにメドロキシ、クロルマジノン、およびメゲストロールのような黄体ホルモン剤が含まれる。
【０１０９】
当業者には理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独でまたはその他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床処置において既に用いられている用量に近い。ただ実例としては、シスプラチンのような薬剤およびその他のＤＮＡアルキル化剤を用いることができる。シスプラチンは、癌の処置に広く用いられており、臨床適用において用いられる有効用量は、２０ｍｇ／ｍ２、３週毎に５日間で、全部で３コースである。シスプラチンは、経口では吸収されず、そしてしたがって注射により静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内に送達されなければならない。
【０１１０】
更に有用な薬剤には、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化合物が含まれ、そしてポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤を用いることもできる。組み合わせ処置のための化学療法剤の多くの実例が米国特許第６５２４５８３号の表Ｃに列挙されている（その薬剤および指示の開示は具体的に参照として本明細書に組み入れられる）。列挙された薬剤の各々は、実例であり、そして限定するものではない。別の有用な供給源は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、33章、特に624〜652頁である。用量の変更は、処置される症状に依存して生じる可能性がある。処置を投与する医師は、個々の対象のために適切な用量を決定することができる。
【０１１１】
本抗体を任意の１つ以上の抗血管形成処置と組み合わせて用いることもできる。かかる薬剤の実例には、中和抗体アンチセンス計画、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイムが含まれる（米国特許第６５２４５８３号（その開示は参照として本明細書に組み入れられる））。国際公開公報第９８／１６５５１号（具体的に参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるように抗血管形成特性を有するＶＥＧＦの変種もまた用いることができる。組み合わせ処置に関連して有用な抗血管形成剤の更なる実例は、米国特許第６５２４５８３号の表Ｄに列挙されている（その薬剤および指示の開示は具体的に参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１２】
またＮＫ細胞受容体抗体を、アポトーシスを誘起する方法と有利に組み合わせることもできる。例えばアポトーシスまたはプログラム細胞死を阻止する多くの発癌遺伝子が同定されている。このカテゴリーの発癌遺伝子の実例には、限定するものではないがｂｃｒ−ａｂ１、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１とは区別される；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５６５０４９１号；および第５５３９０９４号（各々は参照として本明細書に組み入れられる））およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバーが含まれる。ｂｃｌ−２の過剰増殖は最初にＴ細胞リンパ腫において見出された。ｂｃｌ−２は、アポトーシス経路のタンパク質であるＢａｘに結合し、そして不活性化することにより発癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能の阻止は、Ｂａｘの不活性化を妨げ、そしてアポトーシス経路を進行させることを可能にする。例えばアンチセンスヌクレオチド配列または小分子化学的化合物を用いるこのクラスの発癌遺伝子の阻止がアポトーシスを強化するための本発明における使用のために企図される（米国特許第５６５０４９１号；第５５３９０９４号；および第５５８３０３４号（各々参照として本明細書に組み入れられる））。
【０１１３】
またＮＫ細胞抗体を包含する処置を補助化合物と組み合わせて用いることもできる。補助化合物は、実例としては、セロトニンアンタゴニストのような制吐薬およびフェノチアジン、置換ベンズアミド、抗ヒスタミン、ブチロフェノン、コルチコステロイド、ベンゾジアゼピン、およびカンナビノイドのような処置；ゾレドロン酸およびパミドロン酸のようなビスホスホネート；ならびにエリトロポイエチンおよびＧ−ＣＳＦのような造血成長因子、例えばフィルグラスチム、レノグラスチム、およびダルベポエチンが含まれ得る。
本発明の更なる態様および利点を以下の実験のセクションで開示し、これは説明と見なされるべきであり、そして本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１４】
ＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体の作成
例えばMorettaら、J Exp Med.172(6): 1589-98(1990)に記載されるように、５週齢Ｂａｌｂ Ｃマウスを活性化ポリクローナルまたはモノクローナルＮＫ細胞系で免疫することにより新規モノクローナル抗体を作成する。様々な細胞融合の後、最初にＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６等のような１つ以上のＮＫ細胞受容体を特異的に認識するその能力に関してモノクローナル抗体を選択する。陽性モノクローナル抗体を更にＮＫ−ＬＤＧＬまたは類似する免疫増殖性障害を有する患者から採取したＮＫ細胞に特異的に結合するその能力に関してスクリーニングする。
【実施例２】
【０１１５】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の精製およびポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞集団の作成
フィコール・ハイパック濃度勾配およびプラスチック付着細胞の消耗により末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＮＫ−ＬＤＧＬ患者または健常ドナーから誘導する。富化されたＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）、および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）モノクローナル抗体と共にインキュベートし（４℃で３０分間）、続いてヤギ抗マウスでコートしたダイナビーズ（ダイナル、オスロ、ノルウェイ）共にインキュベートし（４℃で３０分間）、そして免疫磁性による消耗を行う（Pendeら、Eur.J.Inmmunol.28: 2384-2394(1998); Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998)）。ＣＤ３−４−ＤＲ−細胞を細胞溶解アッセイで用いるか、またはポリクローナルＮＫ細胞集団、または限界希釈後にＮＫ細クローン（Moretta、Eur.J.Immunol.151: 148-155(1985)）を得るために、１００Ｕ／ｍｌ ｒｌＬ−２（プロリューキン、カイロン社、エメリービル、米国）および１．５ｎｇ／ｍｌ ＰＨＡ（ギブコリミテッド、ペイズリー、スコットランド）の存在下、放射線照射したフィーダー細胞上で培養する。
【実施例３】
【０１１６】
フロー細胞蛍光分析
患者の細胞および対照細胞を、直接標識されているか、または続くＰＥ−もしくはＦＩＴＣ−コンジュゲーションしたアイソタイプ特異的ヤギ抗マウス二次試薬（サザンバイオテクノロジーアソシエーテッド、バーミングハム、アラバマ州）のいずれかである種々のＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体で染色する。１色または２色細胞蛍光分析（ファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）、ベクトンディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）、マウンテンビュー、カリフォルニア州）により試料を分析する（Ｍｏｒｅｔｔａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５−７１４（１９９０））。
【実施例４】
【０１１７】
抗体−基質相互作用のビアコア分析
組換えタンパク質の生成および精製
大腸菌で組換えタンパク質を生成する。標準的な方法を用いてＰＣＲによりＮＫ細胞受容体の全細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを増幅する。核酸配列を、ｐＭＬ１発現ベクターにビオチン化シグナルをコードする配列と共にフレーム内でクローン化する（Saulquinら、2003)。ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（インビトローゲン）でタンパク質発現を実施する。トランスフェクトされた細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した培地中、３７℃でＯＤ６００＝０．６まで成長させ、そして１ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘起する。変性条件下（８Ｍ尿素）で封入体からタンパク質を回収する。Ｌ−アルギニン（４００ｍＭ、シグマ）およびβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する２０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、ＮａＣｌ １５０ｍＭバッファー中室温で６工程透析（各々４、３、２、１、０．５、および０Ｍ尿素）で尿素濃度を低下させることにより組換えタンパク質のリフォールディングを行う。０．５および０Ｍ尿素透析工程の間で還元および酸化グルタチオン（各々５ｍＭおよび０．５ｍＭ、シグマ）を加える。最後に、タンパク質を１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ １５０ｍＭバッファーに対して十分に透析する。可溶性のリフォールディングされたタンパク質が濃縮され、そして次にスーパーデックス（Superdex）２００サイズ排除カラム（ファルマシア（Pharmacia）；ＡＫＴＡシステム）で精製される。ビアコア装置（ビアコア）で表面プラスモン共鳴測定をで実施する。すべてのビアコア実験でランニングバッファーとして０．０５％界面活性剤Ｐ２０を補充したＨＢＳバッファーを供給する。
【０１１８】
タンパク質固定
先に記載したように生成された組換え基質タンパク質をセンサーチップＣＭ５（ビアコア）のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定する。センサーチップ表面は、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドデヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミド、ビアコア）で活性化する。カップリングバッファー（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５）中タンパク質を注射した。１００ｍＭエタノールアミン（ｐＨ８）（ビアコア）を用いて残りの活性化基を失活させた。
【０１１９】
親和性測定
動態学測定のために、種々の濃度の可溶性抗体（１×１０−７〜４×１０−１０Ｍ）を固定基質アンプルに適用する。連続流速２０μｌ／分で測定を実施する。各サイクルで、センサーチップの表面を１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１１）の５μｌの注射により再生する。データ分析にはビアログ動態評価プログラム（ビアエバリュエーション３．１、ビアコア）を用いる。ＨＢＳバッファー中可溶性分析物（種々濃度で４０μｌ）を２０μｌ／分の流速で、例えば５００反射単位（ＲＵ）および１０００ＲＵの基質を含有するデキストラン層に注射する。
【０１２０】
本明細書に引用したすべての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、具体的におよび個別に、参照として本明細書に組み入れられると示されているかのように、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
上述の本発明は、理解を明確にする目的のために説明および実例によりいくらか詳細に記載してきたが、本発明の教示に鑑みて、当業者は、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、それに特定の変更および修飾を行うことができることは容易に明白になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性障害、とりわけＮＫ型ＬＤＧＬのような免疫増殖性障害を処置する方法、およびかかる障害を処置するための処置計画において使用するための抗体を生成する方法に関する。一般的に、本方法は、障害の基礎となる増殖細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する抗体の使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、非従来的免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性には、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７のような表面抗原の発現、および細胞表面に発現されるアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在；特異的細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、そして死滅させる能力；ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する腫瘍細胞またはその他の疾患細胞を死滅させる能力；ならびに免疫応答を刺激または阻止するサイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力が含まれる。
【０００３】
ＮＫ細胞活性は、活性化および阻止シグナルの双方を包含する複合的なメカニズムにより調節される。ＮＫ細胞媒介のＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の認識および死滅に重要な役割を果たすいくつかの異なるクラスのＮＫ特異的受容体が同定されている。かかるクラスの受容体の１つである、ＮＣＲ（ナチュラル細胞毒性受容体）にはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ４４が含まれ、これらはすべて免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。特異的モノクローナル抗体により誘起されるその架橋は、ＮＫ細胞を強く活性化して、細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇、細胞毒性の誘発、およびリンホカイン放出を招く。
【０００４】
２つの更なるＮＫ細胞受容体のファミリーは、ＫＩＲ受容体（Killer Cell Immunoglobulin-like Recepteors：キラー細胞免疫グロブリン様受容体）およびＣＤ９４／ＮＫＧ２である。これらのファミリーの各々は、活性化および阻止受容体の双方を含有する。ＫＩＲ遺伝子は、ＮＫ細胞に発現される免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの多様な多型群を示し、そして２つまたは３つのいずれかの細胞外免疫グロブリン様ドメインを有している。ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、およびＫＩＲ３ＤＬ３を含むファミリーの阻止メンバーの細胞質ドメインは、ＩＴＩＭ配列を含有し、対照的にＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性化メンバーの細胞質ドメインは、通常荷電した残基を含有する。ＫＩＲファミリーの阻止メンバーは、ＨＬＡクラスＩ分子の阻止効果を媒介する。ＫＩＲ受容体ファミリー内で認められる多型性は、インビボで特定のＮＫ細胞の個体とクローンエクスパンション（expansion）間の遺伝的多様性を招く。概説に関しては例えばTrowsdaleおよびParham、Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002)参照。
【０００５】
ＣＤ９４およびＮＫＧ２タンパク質は、Ｃ型レクチンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ９４は、ＮＫ細胞において優先的に発現され、そしてそれ自体少なくとも５０％のＮＫ細胞において発現されるＮＫＧ２ＡのようなＮＫＧ２ファミリーメンバーとヘテロ二量体を形成する。ＮＫＧ２Ａは、２ＩＴＩＭドメインを含有し、そしてＣＤ９４と一緒に非古典的ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ｅ（ヒトにおいて；マウスではＱａ−１ｂ）に結合するヘテロ二量体阻止受容体を形成する（例えばＯＭＩＭ６０２８９４；BraudらNature 391: 795-799(1998); Changら、Europ.J.Immun 25: 2433-2437(1995); LazeticらImmun 157: 4741-4745(1996); Rodriguezら、Immunogenetics 47: 305-309(1998)参照）。
【０００６】
ＮＫ−ＬＤＧＬ（顆粒性リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患；代替的にＮＫ−ＬＧＬとも称される）は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、すなわち表面抗原発現の特徴的な組み合わせ（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋等；例えばLoughran、Blood 82: 1(1993)参照）を示す大型顆粒性リンパ球のクローンエクスパンション（expansion）により引き起こされる増殖性障害のクラスを意味する。これらの障害の基礎となる細胞増殖は、ある患者で認められる穏やかな病徴からＮＫ−ＬＤＧＬ白血病と称される攻撃的でしばしば致命的な形態にわたる様々な影響を有し得る。このクラスの障害の病徴は、発熱、穏やかな好中球減少症、血小板減少症、貧血、リンパ球増加症、脾腫、肝腫大、リンパ節症、骨髄浸潤他（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）を含み得る。化学療法剤を包含するＮＫ−ＬＤＧＬ白血病のための処置はしばしば攻撃的であり、そして疾患は、しばしば致命的であり、凝血および多臓器不全に随伴され、そして多くの器官のＬＧＬ浸潤を包含する。
【０００７】
モノクローナル抗体基盤の処置が今日利用可能であるか、または特定の疾患、とりわけ非ホジキンリンパ腫および乳癌のような癌のための臨床試験中である。かかる処置に用いられる抗体は、一般的にヒト以外の動物から誘導され、そして次にそれらをヒトにおいて使用するのに適切なものにするために「ヒト化」または「キメラ化」される。典型的には、癌またはその他の増殖性障害を処置するために、抗体は、悪性細胞の表面に特異的に存在する受容体に特異的である。リツキサン（非ホジキンリンパ腫の処置用）、ヘルセプチン（乳ガンの処置用）、キャンパス（Ｂ−ＣＬＬの処置用）のような単独で用いられるモノクローナル抗体もあり、それらは標的細胞の成長を緩徐化または停止のいずれか、その活性の阻止、アポトーシスの誘発、または免疫系による破壊のためのそれらのマーキングを行うことができる。対照的にその他の抗体を放射性同位元素のような毒性部分に結合させて、単に標的受容体に結合させることにより標的細胞を直接死滅させる。かかる抗体の実例には、ゼバリン、ベキサール、およびオンコリン（すべて非ホジキンリンパ腫の処置用）が含まれる。
【０００８】
ＮＫ−ＬＤＧＬおよびその他の免疫増殖性障害のための有効な処置の相対的な不足に鑑みて、これらの障害の基礎となるＬＧＬ増殖を制限および逆行させるための新しいおよび革新的な処置計画に関する大きな必要性が当技術分野に存在するのは明白である。本発明は、これらのおよびその他の必要性に対処する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ＮＫ型ＬＤＧＬのような増殖性障害、とりわけ免疫増殖性障害の処置に有用な抗体を生成するための方法を提供する。本方法を用いて生成される抗体は、ＮＫ型ＬＤＧＬのエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞のようなかかる障害の基礎となるエクスパンションした（expanded）細胞を特異的に標的とすることができる。抗体は、例えば単独で結合することによりエクスパンションした（expanded）細胞の影響を中和することにより、免疫系による破壊のためにそれらを標的化することにより、または放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞毒性薬剤とそれらを接触させることにより直接的に細胞を死滅させることにより、細胞増殖の病理学的影響を制限することができる。多くの増殖性障害のいずれか、好ましくは、ＮＫ型ＬＤＧＬの処置のために抗体を使用する方法もまた提供され、本明細書に記載した抗体を含むキットおよびその使用のための指示書も同様に提供される。
【００１０】
したがって、本発明は、ＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者を処置する方法を提供する。本発明はまた、ａ）患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体の状態を決定すること、およびｂ）ＮＫ細胞において顕著に発現されるＮＫ受容体に特異的に結合する抗体を患者に投与することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者を処置する方法をも提供する。
【００１１】
本発明の方法の一実施態様では、ＮＫ受容体は活性化受容体である。別の実施態様では、受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１（アクセッション番号ＮＰ＿０５５０３３）、ＫＩＲ２ＤＳ１（アクセッション番号Ｘ８９８９２）、ＫＩＲ２ＤＬ２（アクセッション番号ＮＰ＿０５５０３４）、ＫＩＲ２ＤＬ３（アクセッション番号ＮＰ＿０５６９５２）、ＫＩＲ２ＤＳ４（アクセッション番号Ｌ７６６７１）、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａ（アクセッション番号ＡＡＢ１７１３３）から成る群より選択される。別の実施態様では、受容体は、ＮＫｐ３０（アクセッション番号ＮＰ＿６６７３４１）、ＮＫｐ４４（アクセッション番号ＣＡＢ３９１６８）、またはＮＫｐ４６（アクセッション番号ＮＰ＿００４８２０）のようなＮＣＲである。先に述べたアクセッション番号に相当するＧｅｎｂａｎｋファイルの開示は参照として本明細書に組み入れられる。別の実施態様では、抗体は、単一のＮＫ受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、免疫学的アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、ＮＫ細胞に存在するＮＫ受容体の活性を決定するための機能的アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は遺伝子型決定アッセイを用いて決定される。別の実施態様では、ＮＫ受容体状態は、細胞においてＮＫ受容体コード化ｍＲＮＡを検出するアッセイを用いて決定される。別の実施態様では、受容体は、少なくとも５０％のＮＫ細胞に検出可能なように存在する。
【００１２】
別の実施態様では、抗体は、抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、細胞毒性抗体である。別の実施態様では、抗体は、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子から成る群より選択されるエレメントを含む。別の実施態様では、抗体は、ヒト化されているかまたはキメラである。別の実施態様では、放射性同位元素、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗体に直接結合している。別の実施態様では、抗体は、上記ＮＫ受容体のマウスまたは霊長類相同体に結合する。別の実施態様では、抗体は、複数のＫＩＲ受容体に結合する。別の実施態様では、細胞毒性抗体は、免疫学的アッセイにおいて上記ＮＫ受容体状態を決定するために用いられた同一の抗体から誘導される。
【００１３】
別の態様では、本発明は、ｉ）１つ以上のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；ｉｉ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する抗体の各々の能力を試験すること；ｉｉｉ）一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する複数の抗体から１つを選択すること；およびｉｖ）ヒト投与に適切な抗体を作成することを含む、ＮＫ−ＬＤＧＬの処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法を提供する。
【００１４】
一実施態様では、抗体は、活性化ＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、およびＮＫＧ２Ａから成る群より選択される受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のようなＮＣＲに特異的に結合する。別の実施態様では、抗体を、ヒト化またはキメラ化することによりヒト投与に適切なものにする。
【００１５】
別の実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を抗体に連結させる工程を含む。別の実施態様では、細胞毒性薬剤は放射性同位元素、毒性ポリペプチドまたは毒性小分子である。別の実施態様では、細胞毒性薬剤は、抗体に直接連結される。別の実施態様では、抗体は、抗体フラグメントである。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも６０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも７０％に結合する。別の実施態様では、抗体は、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも８０％に結合する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載する方法のいずれかを用いて生成された抗体を提供する。本発明はまた、実質的に同一の抗原特異性および活性（例えばこれは親抗体と同一の抗原に結合できる）を有する抗体のフラグメントおよび誘導体を包含する。かかるフラグメントには、限定するものではないがＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖが含まれる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載するいずれか１つ以上の抗体を含むキットを提供する。一実施態様では、キットは少なくとも１つの診断用抗体および少なくとも１つの処置用（例えば細胞毒性）抗体を含む。別の実施態様では、診断用抗体および処置用抗体は、同一のＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施態様では、キットはまた本発明の方法による抗体を用いるための指示書を含む。
【００１８】
本発明はまた、１つ以上の本抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体および医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を含む。
【００１９】
発明の詳細な説明
序文
本発明は、顆粒性リンパ球のＮＫ型リンパ増殖性疾患（ＮＫ−ＬＤＧＬ）のような増殖性、とりわけ免疫増殖性障害を処置するのに適切な抗体を生成および使用するための新規方法を提供する。本明細書に記載する方法を用いて生成される抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントが包含され、抗体を用いて患者を処置する方法もまた包含される。特に本発明は、１つ以上のＮＫ細胞受容体が増殖細胞で顕著に提示されることを決定するために、これらの障害の基礎となる増殖性ＮＫまたはＮＫ様細胞を分類すること、および次いで同一の受容体または受容体群に特異的に結合する抗体を用いて患者を処置することを包含する。
【００２０】
ＮＫ−ＬＤＧＬおよびその他の免疫増殖性障害は、しばしば１つまたは少数のＮＫまたはＮＫ様細胞のクローンエクスパンションを特徴とする。したがって個々のＮＫ細胞は、一般的にＮＫ細胞受容体のサブセットのみを発現するので、これらの障害の基礎となる過剰増殖細胞のかなりの部分は、少数のＮＫ細胞受容体を発現する。したがって本発明は、既定の患者の増殖細胞において発現される特定の受容体または受容体群を同定し、そして次に細胞毒性抗体を用いて該受容体または受容体群を発現するこれらの細胞を特異的に標的化することによりこれらの障害を処置する方法を提供する。このように過剰増殖細胞の数が特異的に減少するが、その他の免疫および非免疫細胞を容認する。
【００２１】
一般に、本方法は、ＫＩＲ受容体、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体の１つまたはＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４もしくはＮＫｐ４６のようなＮＣＲのような１つのまたは少数のＮＫ細胞受容体に各々特異的であるモノクローナル抗体のパネルの使用を包含する。しばしば抗体の２つのセットを用いる。直接的または間接的に標識された抗体を含む１つのセットは、本来は診断用であり、そして特定のＮＫ細胞受容体または受容体群が既定の患者のＮＫ細胞において発現されることを決定するために用いられる。第２のセットは、処置に用いられ、一般にヒト以外の動物で産生されるが、これはヒトにおける使用に適切なものにされており、例えばヒト化またはキメラ化されているモノクローナル抗体に相当する。特定の実施態様では、抗体は、更に細胞毒性薬剤で直接的または間接的に誘導体化されて、受容体または受容体群を発現する細胞を死滅させるようになる。例えば抗体を放射性同位元素、細胞毒性ポリペプチド、または細胞毒性小分子に連結させることができる。
【００２２】
定義
本明細書で用いる以下の用語は、特記しない場合それらが属する意味を有する。
本明細書で用いる「ＮＫ」細胞とは、非従来的免疫に関与するリンパ球の亜集団を意味する。ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面のアルファ／ベータまたはガンマ／デルタＴＣＲ複合体の不在、特異的細胞溶解酵素の活性化により「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、そして死滅させる能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞またはその他の疾患細胞を死滅させる能力、ならびに免疫応答を刺激または阻止するサイトカインと称されるタンパク質分子を放出する能力のような特定の特徴および生物学的特性によりＮＫ細胞を同定することができる。これらの特徴および活性のいずれかを用いて、当技術分野において周知の方法を用いてＮＫ細胞を同定することができる。
【００２３】
「ＮＫ細胞受容体」なる用語は、ＮＫ細胞のすべてまたは一部で一貫して見出される任意の細胞表面分子を意味する。好ましくは、ＮＫ細胞受容体は、ＮＫ細胞（静止または活性化）において独占的に発現されるが、該用語はまた、その他の細胞型においても発現される受容体を包含する。ＮＫ細胞受容体の実例には、ＫＩＲ受容体ファミリーのメンバー、ＣＤ９４、ＮＫＧ２受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲ受容体、ＬＩＲ−１他が含まれる（例えばTrowsdaleおよびParham Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002); OMIM 602894; Braudら、Nature 391: 795-799(1998); Changら、Europ.J.Immun 25: 2433-2437(1995); Lazeticら、Immun 157: 4741-4745(1996); Rodriguezら、Immunogenetics 47: 305-309(1998); OMIM 161555; Houchinsら、J.Exp.Med.173: 1017-1020(1991); Adamkiewiczら、Immunogenetics 39: 218(1994); Renedoら、Immunogenetics 46: 307-311(1997); Ravetchら、Science 290: 84-89(2000); PCT 国際公開公報第01/36630号; Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998); Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Pessinoら、J.Exp.Med.188: 953-960(1998)(その各々の開示は、参照として本明細書に組み入れられる)参照）。
【００２４】
本明細書で用いる「ＮＫ受容体状態」とは、個体、例えばＮＫ−ＬＤＧＬ患者から採取されたＮＫまたはその他の細胞で発現される種々のＮＫ細胞受容体の同一性および顕著さを意味する。例えば患者から採取されたＮＫ細胞の試験により、特定のＮＫ細胞受容体、例えばＫＩＲ２ＤＳ２が細胞の７０％で発現され、別の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＬ１は、細胞の４０％で発現され、別の受容体、例えばＣＤ９４は、細胞の８０％で発現される等を見出すことができる。かかる情報は、どの細胞毒性抗体を本方法で用いるかを決定するのに有用である。複数のＮＫ細胞受容体に関する発現情報を有することは明らかに有用であるが、ＮＫ受容体状態は、単一の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＳ２または少数の受容体、例えばＫＩＲ２ＤＬ２／３、およびＫＩＲ２ＤＳ２の発現レベルまたは顕著さに言及することもできる。
【００２５】
「ＬＧＬ」すなわち「大型顆粒性リンパ球」とは、リンパ球様細胞の形態学的に異なる集団を意味し、これは末梢血単核細胞の１０〜１５％を占める。ＬＧＬは、ＮＫ細胞およびＴ細胞の双方を含むことができ（例えばLoughran、Blood 82: 1-14(1993)参照）、これは特定のマーカー、例えばＣＤ３発現（ＮＫ細胞では、ＣＤ３−そしてＴ細胞ではＣＤ３＋である）により区別することができる。好ましくは、本発明の目的のために、ＬＧＬ細胞は、ＣＤ３−である。しかしながら、本発明の特定の実施態様では、ＰＢＬは、患者から採取され、そしていずれかの細胞型、好ましくは、ＬＧＬ、特にＣＤ３−ＬＧＬがエクスパンションする（expanded）かどうかを知るために試験される。一般に任意のエクスパンションした（expanded）細胞型を試験して特定のＮＫ細胞受容体がその表面に顕著に発現されるかどうかを決定することができる。
【００２６】
「顕著に発現される」とは、既定の患者から採取された相当数のＬＧＬ（例えばＮＫまたはＮＫ様）細胞で発現されるＮＫ細胞受容体を意味する。「顕著に発現される」なる用語の定義は、正確なパーセンテージの値に縛られるものではなく、たいていの場合、患者から採取されたＬＧＬまたはその他の過剰増殖細胞の少なくとも３０％、４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれより多くで存在する受容体が「顕著に発現される」と称される。
【００２７】
本明細書で用いる「抗体」なる用語は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を意味する。重鎖の定常ドメインの型に依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの１つに割り当てられる。これらのうちのいくつかは、更にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のようなサブクラスまたはアイソタイプに分けられる。免疫グロブリン（抗体）構造単位の実例には四量体が含まれる。各々の四量体は、２つの同一のポリペプチド鎖の対から成り、各対は、１つの「軽」（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に寄与する約１００から１１０またはそれより多い可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）なる用語は、各々これらの軽および重鎖を意味する。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、各々「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」、および「ミュー」と称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは、生理学的な状況で最も通例的な抗体であり、そして実験室設定で最も容易に作成されるので、本発明で用いる抗体の好ましいクラスであり、ＩｇＧが特に好ましい。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。特に好ましいのは、ヒト化、キメラ化、ヒト、またはそれ以外のヒトに適切な抗体である。「抗体」はまた、本明細書で記載される抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体を含む。
【００２８】
「特異的に結合する」なる用語は、単離されたＮＫまたは関連標的細胞の表面に存在するタンパク質の組換え形態、そのエピトープまたは元来のタンパク質のいずれかを用いて評価されるように、抗体が好ましくは、競合結合アッセイにおいて結合パートナー、例えば活性化ＫＩＲ受容体のようなＮＫ細胞受容体に結合することができることを意味する。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するためのその他の方法を更に以下で記載し、そして当技術分野において周知である。
【００２９】
「ヒトに適切な」抗体とは、例えば本明細書に記載する処置方法のためにヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化抗体、または抗体フラグメントを意味する。ヒトに適切な抗体には、すべての型のヒト化、キメラ、または完全ヒト抗体、または抗体の少なくとも一部がヒトから誘導されるかもしくはそうでなければ一般に人以外の元来の抗体を用いた場合に誘発される免疫応答を回避するように修飾されている任意の抗体が含まれる。
【００３０】
「毒性」または「細胞毒性」ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を遅延化、停止、もしくは逆行させる、任意の検出可能な方式でその活性（例えばＮＫ細胞の細胞溶解活性）を低下させる、あるいは直接的または間接的にそれらを死滅させることができる任意の化合物を包含する。好ましくは、毒性または細胞毒性化合物は、細胞を直接死滅させることにより、アポトーシスの誘発他により作用する。本明細書で用いる毒性「ペプチド」とは、ペプチドもしくは非天然アミノ酸または修飾された連結を有するポリペプチド誘導体を含む任意のペプチド、ポリペプチド、またはそのような誘導体を含み得る。毒性「小分子」は、好ましくは、１０ｋＤ未満、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄまたはより小さい大きさの任意の毒性化合物もしくはエレメントを含み得る。
【００３１】
「免疫原性フラグメント」とは、本明細書では、（ｉ）膜結合受容体およびそこから誘導される変異体を含む上記フラグメントに結合する、および／または上記フラグメントを含む任意の形態の分子に結合する抗体の作成；（ｉｉ）任意のＭＨＣ分子および上記フラグメントから誘導されるペプチドを含む二分子複合体と反応するＴ細胞を包含するＴ細胞応答の刺激；（ｉｉｉ）哺乳動物免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージまたは細菌のようなトランスフェクトされた媒体の結合；のような免疫応答を引き出すことができる任意のポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。あるいは、免疫原性フラグメントはまた、先に定義したような免疫応答を引き出すことができる、共有結合によりキャリヤタンパク質に抱合されたペプチドフラグメント、上記ペプチドフラグメントをそのアミノ酸配列内に含むキメラ組換えポリペプチド構築物のような任意の構築物を意味し、そして具体的には、配列が上記フラグメントをコードする一部を含むｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞を含む。
【００３２】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体とは、１つ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合されている抗体を意味する。かかるヒト化抗体は、結合領域が誘導されたヒト以外の動物の結合特異性を維持するが、ヒト以外の抗体に対する免疫反応を回避するように設計されている。
【００３３】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるかまたは変化したクラス、エフェクター機能、および／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する全く異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物等に連結されるように、定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されている；または（ｂ）可変領域またはその一部が異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化、置換、または交換されている；抗体分子である。
【００３４】
「ヒト」抗体は、抗原誘発に応答して特異的ヒト抗体を生成するために「操作され」ているトランスジェニックマウスまたはその他の動物から得られた抗体である（例えばGreenら、Nature Genet 7: 13(1994); Lonbergら、Nature 368: 856(1994); Taylorら、Int Immun 6: 579(1994)（その全教示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。そのすべてが当技術分野において公知である遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイテクノロジーにより完全ヒト抗体を構築することもできる（例えばMcCaffertyら、Nature 348: 552-553(1990)参照）。インビトロ活性化Ｂ細胞によりヒト抗体を作成することもできる（例えば米国特許第５５６７６１０号および第５２２９２７５号参照（その全体が参照として本明細書に組み入れられる））。
【００３５】
本発明の局面で、「活性」または「活性化」ＮＫ細胞は、生物学的に活性なＮＫ細胞、更にとりわけ標的細胞を溶解する能力を有するＮＫ細胞を称する。例えば「活性」ＮＫ細胞は、ＮＫ活性化受容体−リガンドを発現し、そして「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない（ＫＩＲ−不適合細胞）細胞を死滅させることができる。再指向死滅アッセイ（redirected killing assay）で使用するのに適切な標的細胞の実例は、Ｐ８１５およびＫ５６２細胞であるが、多くの細胞型のいずれかを用いることができ、そして当技術分野において周知である（例えばSivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998); Pessinoら、J.Exp.Med.188: 953-960(1998); Neriら、Chin.Diag.Lab.Immun.8: 1131-1135(2001)参照）。「活性」または「活性化」細胞を、細胞内遊離カルシウムレベル上昇におけるサイトカイン（例えばＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）生成のようなＮＫ活性に随伴されるとして当技術分野において公知の任意のその他の特性または活性により、同定することもできる。
【００３６】
本明細書で用いるＮＫ−ＬＤＧＬなる用語は、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞、例えば特徴的な表面抗原のセット（例えばＣＤ３−、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６＋）を有する大型顆粒性リンパ球のクローンエクスパンション（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran、Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）または本明細書で定義するような任意のＮＫ細胞受容体の発現を特徴とする任意の増殖性障害を意味する。ＮＫ−ＬＤＧＬの病徴には、とりわけ発熱、穏やかな好中球減少症、血小板減少症、貧血、リンパ球増加症、脾腫、肝腫大、リンパ節症、および骨髄浸潤（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003); Loughran、Blood 82: 1(1993); Epling-Burnetteら、Blood-2003-02-400(2004)参照）が含まれ得る。
【００３７】
「単離された」「精製された」または「生物学的に純粋」なる用語は、通常その元来の状態で見出されるように随伴される成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。純度および均質性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質が、実質的に精製される。
【００３８】
本明細書で用いる「生物学的試料」なる用語には、限定するものではないが、生物学的液体（例えば血清、リンパ、血液）、細胞試料または組織試料（例えば骨髄）が含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを意味する。用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然発生アミノ酸の人工的化学的擬似物質であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然発生アミノ酸ポリマーおよび非天然発生アミノ酸ポリマーに適用される。
【００３９】
「組換え」なる用語は、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる場合、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが異種性核酸もしくはタンパク質の導入または元来の核酸もしくはタンパク質の変化により修飾されているかまたは細胞がそのように修飾された細胞から誘導されることを示している。したがって、例えば組換え細胞は、元来の（非組換え）形態の細胞内で見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、発現不足であるか、または全く発現されない元来の遺伝子を発現する。
【００４０】
ＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体の生成
本発明は、ヒトにおいて使用するの適切であり、そして１つまたは少数のＮＫ細胞受容体を標的とする抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の生成および使用を包含する。本発明の抗体をいずれかの種々の当技術分野において公知の技術により生成することができる。典型的にはヒト以外の動物、好ましくは、マウスをＮＫ細胞の表面に存在する受容体を含む免疫原で免疫することによりこれらを生成する。受容体は、全ＮＫ細胞もしくは細胞膜、ＮＫ細胞受容体の全長配列、または任意のＮＫ細胞受容体のフラグメントもしくは誘導体、典型的には、免疫原フラグメント、すなわち受容体を発現する細胞の表面に暴露されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含むことができる。かかるフラグメントは、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７個の連続アミノ酸、なお更に好ましくは、それの少なくとも１０個の連続アミノ酸を含有する。これらは本質的には、受容体の細胞外ドメインから誘導される。数人のまたはすべての患者のＮＫ細胞のすべてまたは一部の表面にしばしばまたはいつも存在する任意の受容体、任意のその他の受容体を抗体の作成に用いることができることは理解される。好ましい実施態様では、抗体を作成するために用いられる活性化ＮＫ細胞は、ヒト受容体である。
【００４１】
最も好ましい実施態様では、免疫原は、脂質膜において、典型的には細胞の表面に野生型ヒトＮＫ受容体ポリペプチドを含む。具体的な実施態様では、免疫原は、無傷のＮＫ細胞、特に無傷のヒトＮＫ細胞を含むが、場合により処理または溶解されている。ＮＫ細胞の表面に存在する任意のタンパク質または分子、好ましくは、ＮＫ細胞受容体、更に好ましくは、ＫＩＲ受容体、ＬＩＲ−１ようなＬＩＲ受容体、Ｌｙ４９、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａの、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６のようなＮＣＲからなる群から選択されるＮＫ細胞受容体、ならびに最も好ましくは、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、およびＫＩＲ３ＤＳ１のような活性化ＮＫ細胞受容体に対して抗体を調製することができる（例えばTrowsdaleおよびParham、Eur J Immunol 34(1): 7-17(2004); Yawataら、Crit Rev Immunol 22(5-6): 463-82(2002); Hsuら、Immunol Rev 190: 40-52(2002); Middletonら、Transpl Immunol 10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol 20: 217-51(2002)（その各々の全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００４２】
一実施態様では、抗体は、１つ以上のＮＫ細胞受容体を認識する１つ以上の既存のモノクローナル抗体、例えばＥＢ６ｂ（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１を認識する）、ＧＬ１８３（ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＩＲ２ＤＳ２）、ＦＥＳ１７２（ＫＩＲ２ＤＳ４）、Ｚ２７（ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１）、Ｑ６６（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＸＡ１８５（ＣＤ９４）、Ｚ１９９およびＺ２７０（ＮＫＧ２Ａ）、Ｆ２７８（ＬＩＲ−１）；）、ＢＡＢ２８１（ＮＫｐ４６）、ＡＺ２０（ＮＫｐ３０）、またはＺ２３１（ＮＫｐ４４）から誘導される。例えばＺ１９９およびＺ２７０に関してはZambelloら、Blood 102: 1797-1805(2003)およびMorettaら、J.Exp.Med.180: 545(1994)参照。Bab281は、Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997)に記載されており、; Z231はVitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998)に記載されており；Ｚ２５およびＡＺ２０はまた、Pendeら、J Exp Med.190(10): 1505-1516(1999)に記載されており、そして2000年11月8日にI-2576の番号の下でC.N.C.M.（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．、パスツール研究所、２５番地、ドクトル・ルー通り、Ｆ−７５７２４、パリ、セデックス１５、フランス）に寄託された。患者のＮＫ受容体状態を決定するために本明細書で前記した分類工程のための診断用抗体として使用するために、かかる抗体を直接的または間接的に標識する（すなわち標識二次抗体と共に用いる）ことができる。加えて、抗体をヒト投与に適切なものにし、そして場合により本処置方法において細胞毒性抗体として使用するために本明細書に記載するように毒性にすることができる。
【００４３】
本診断用または処置用（細胞毒性）抗体は、全長抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体でよい。抗体フラグメントの実例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；会合する重鎖部分を含まない、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント；会合する軽鎖部分を含まない、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチドまたは重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメント；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれる。かかるフラグメントおよび誘導体ならびにそれらを調製する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィドリンケージより下で抗体を消化して、それ自体ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂの二量体のＦ（ａｂ’）２を生成する。穏やかな条件下でＦ（ａｂ’）２を還元してヒンジ領域のジスルフィドリンケージを切断し、それによりＦ（ａｂ’）２二量体をＦａｂ’単量体に変換することができる。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Fundamental Immunology(Paul編、第3版、1993)参照）。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化に関して定義されているが、かかるフラグメントをデノボで化学的にか、または組換えＤＮＡ方法論を用いるかのいずれかで合成できることは当業者には理解される。
【００４４】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製は、当技術分野において周知であり、そして多くの利用可能な技術のいずれかを用いることができる（例えばKohlerおよびMilstein、Nature 256: 495-497(1975); Kozborら、Immunology Today 4: 72(1983); Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77〜96頁(1985)参照）。一本鎖抗体の生成のための技術（米国特許第４９４６７７８号）を適合させて望ましいポリペプチド、例えばＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５およびＫＩＲ３ＤＳ１のようなＮＫ細胞受容体に対する抗体を生成することができる。また、トランスジェニックマウスまたはその他の哺乳動物のようなその他の生物を用いてヒト化、キメラ、または同様に修飾された抗体を発現させることができる。あるいは、ファージディスプレイテクノロジーを用いて選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを同定することができる（例えばMcCaffertyら、Nature 348: 552-554(1990); Marksら、Biotechnology 10: 779-783(1992)参照）。一実施態様では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも１つのＮＫ受容体と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を選択することを含む。例えばレパートリーは、場合により任意の適切な構造（例えばファージ、細菌、合成複合体等）により提示される抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーでよい。
【００４５】
ヒト以外の哺乳動物を抗原で免疫する工程は、当技術分野において周知の任意の様式で実施することができる（例えばE.HarlowおよびD.Lane、Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Hobor Laboratory Press）、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州（1988）参照）。一般に免疫原を、場合により完全フロイントアジュバントのようなアジュバントを含むバッファーに懸濁または溶解させる。免疫原の量、バッファーの型、およびアジュバントの量を決定するための方法は、当業者に周知であり、そして本発明でいかなるようにも限定するものではない。
【００４６】
同様に、抗体の生成を刺激するのに十分な免疫の場所および頻度は、当技術分野において周知である。典型的な免疫プロトコールでは、ヒト以外の動物を抗原で腹腔内注射し、そして約１週間後に再度注射する。これに続いておよそ２０日に、場合により不完全フロイントアジュバントのようなアジュバントを伴って抗原のリコール注射を行う。リコール注射は、静脈内に実施し、そして数日間連続して繰り返すことができる。これに続いて４０日に静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的には、アジュバントを伴わずにブースター注射を行う。このプロトコールにより、結果的に約４０日後に抗原特異的抗体生成Ｂ細胞が生成される。結果的に免疫に用いられた抗原に対して指向する抗体を発現するＢ細胞を生成する限り、その他のプロトコールを用いることもできる。
別の実施態様では、非免疫のヒト以外の動物からのリンパ球を単離し、インビトロで成長させ、そして次に細胞培養中に免疫原に暴露する。次いでリンパ球を回収し、そして以下に記載する融合工程を実施する。
【００４７】
本発明の目的に好ましいモノクローナル抗体に関しては、次の工程は、免疫されたヒト以外の哺乳動物からの細胞、例えばリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞の単離、および続く抗体生成ハイブリドーマを形成するためのこれらの脾細胞またはＢ細胞またはリンパ球の不死化細胞との融合である。したがって、本明細書で用いる「免疫動物からの抗体の調製」なる用語は、免疫動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を得ること、およびこれらの細胞を用いて抗体を発現するハイブリドーマを生成すること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を得ることを含む。例えばヒト以外の哺乳動物からの脾細胞の単離は、当技術分野において周知であり、例えば麻酔されたヒト以外の哺乳動物から脾臓を取り出すこと、それを小片に切断すること、および脾臓莢膜からの脾細胞を圧搾し、そして細胞ストレーナーのナイロンメッシュを通して適切なバッファー中に入れて単一の細胞懸濁液を生成することを包含する。細胞を洗浄し、遠心し、そして任意の赤血球を溶解するバッファーに再懸濁する。溶液を再度遠心し、そしてペレットの残りのリンパ球を最終的に新鮮バッファーに再懸濁する。
【００４８】
一度単離され、そして単一の細胞懸濁液に存在すると、抗体生成細胞を不死細胞系に融合させる。これは典型的には、マウス骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマを創成するのに有用な多くのその他の不死細胞系が当技術分野において公知である。好ましいネズミ骨髄腫系には、限定するものではないが、サルク研究所細胞ディストリビューションセンター（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州、米国）から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３およびＳＰ−２から誘導されるものが含まれる。ポリエチレングリコール等を用いて融合を行う。次いで得られたハイブリドーマを未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻止する１つ以上の物質を含有する選択培地で成長させる。例えば親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如する場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨げる。
【００４９】
ハイブリドーマをマクロファージのフィーダー層で成長させることができる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するのに用いたヒト以外の哺乳動物の同腹仔に由来し、そして典型的には、不完全フロイントアジュバント等でプライミングされ（primed）、数日後にハイブリドーマをプレートする。融合方法は、例えば（Goding、「Monoclonal Antibodies: Principles and Practice」59〜103頁（アカデミックプレス、1986））に記載されており、その開示は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００５０】
コロニー形成および抗体生成に十分な時間選択培地中で細胞を成長させる。これは、通常７日と１４日の間である。次いでハイブリドーマコロニーを、望ましい基質例えばＫＩＲ２ＤＳ２のようなＮＫ細胞受容体を特異的に認識する抗体の生成に関して検定する。アッセイは、典型的には、比色分析ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマがその中で成長するウェルに適合させることができる任意のアッセイを用いることができる。その他のアッセイには、免疫沈殿およびラジオイムノアッセイが含まれる。望ましい抗体生成に関して陽性であるウェルを試験して、１つ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１つ以上のコロニーが存在する場合、細胞を再クローン化し、そして成長させて、単一の細胞のみが望ましい抗体を生成するコロニーを生じさせたことを確認する。単一の明確なコロニーを有する陽性ウェルを典型的には、再クローン化し、そして再検定して、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、そして生成されていることを確認する。
【００５１】
本発明のモノクローナル抗体を生成することが確認されたハイブリドーマを次いでＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０のような適切な培地中で大量に成長させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞をインビボで動物の腹水腫瘍として成長させることができる。
十分に成長させて望ましいモノクローナル抗体を生成させた後、モノクローナル抗体（または腹水）を含有する成長培地を細胞から分離し、そしてそこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡもしくはプロテインＧセファロースを用いるクロマトグラフィー、またはアガロースもしくはセファロースビーズのような固体支持体に結合させた抗マウス免疫グロブリンにより達成される（すべて、例えばAntibody Purification Handbook、アメルシャムバイオサイエンシズ（Amersham Biosciences）、出版番号１８−１０３７−４６、ＡＣ版に記載されており、その開示は参照として本明細書に組み入れられる）。結合抗体は、典型的には、低ｐＨバッファーを用いることによりプロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出され（グリシンまたはアセテートバッファｐＨ３．０以下）、即座に抗体含有分画を中和する。これらの分画をプールし、透析し、そして必要により濃縮する。
【００５２】
好ましい実施態様では、ＮＫ細胞受容体に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主にトランスフェクトするための適切な発現ベクターに入れる。次いで宿主を用いて抗体、その変種、その活性フラグメント、または抗体の抗原認識部分を含むヒト化もしくはキメラ抗体を組換え生成する。好ましくは、この実施態様で用いるＤＮＡは、１つ以上のヒトＮＫ受容体、とりわけＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者のかなりの割合の分画からのＬＧＬ細胞で優勢に提示されるＮＫ受容体に存在する決定基を認識する抗体をコードする。
【００５３】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、そして従来の手順を用いて（例えばネズミ抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）シークエンシングすることができる。一度単離されると、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成させるために、これを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他に免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトする。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は、当技術分野において周知である（Skerraら、Curr.Op.Immunol.5: 256(1993); およびPluckthun、Immunol.Revs.130: 151(1992)参照）。また例えばWardら、Nature 341: 544(1989)に開示されるように、抗体を免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により生成することもできる。
【００５４】
具体的な実施態様では、抗体は、本質的には、モノクローナル抗体ＥＢ６ｂ、ＧＬ１８３、ＦＥＳ１７２、Ｚ２７、Ｑ６６、ＸＡ１８５、Ｚ１９９またはＦ２７８（例えばZambelloら、Blood 102: 1797(2003)（その全開示を参照として本明細書に組み入れられる）参照）の１つと同一のエピトープすなわち決定基に結合する。モノクローナル抗体Ｘと「実質的に同一のエピトープすなわち決定基に結合する」なる用語は、抗体がＸ（ここでＸはＥＢ６ｂ等）と「競合することができる」ことを意味する。問題のモノクローナル抗体と実質的に同一のエピトープと結合する１つ以上の抗体の同定は、抗体競合を評価することができる種々の免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを用いて容易に決定することができる。かかるアッセイは、当技術分野においては日常的である（例えば米国特許第５６６０８２７号（これは参照として本明細書に組み入れられる）参照）。抗体が結合するエピトープの実際の決定は、問題のモノクローナル抗体と同一または実質的に同一のエピトープに結合する抗体を同定する必要は全くないことは理解される。
【００５５】
例えば、試験される被験抗体が異なる供給源の動物から入手されるか、またはまさに異なる免疫グロブリンアイソタイプのものである場合、対照（例えばＧＬ１８３）および被験抗体を混合し（または予め吸収させる）、そしてエピトープ含有タンパク質、例えばＧＬ１８３の場合ＫＩＲ２ＤＳ２を含有する試料に適用する単純な競合アッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、およびビアコア（ＢＩＡＣＯＲＥ）の使用（例えば実施例のセクションで記載するように）に基づくプロトコールはかかる単純な競合研究における使用に適切であり、そして当技術分野において周知である。
【００５６】
特定の実施態様では、抗原（例えばＫＩＲ２ＤＳ２エピトープ）含有試料に適用する前に一定の時間、対照抗体（例えばＧＬ１８３）を種々の量の被験抗体（例えば１：１０または１：１００）と予め混合する。その他の実施態様では、抗原に試料を暴露する間、対照および種々の量の被験抗体を単純に混合することができる。遊離抗体から結合を（例えば非結合抗体を排除するための分離または洗浄技術を用いることにより）、および被験抗体から対照抗体を（例えば種もしくはアイソタイプ特異的二次抗体を用いることにより、または対照抗体を検出可能な標識で特異的に標識することにより）区別できる限り、被験抗体が対照抗体の抗原に対する結合を低減させるかどうかを決定することができ、これは、被験抗体が対照と実質的に同一のエピトープを認識することを示している。全く無関係の抗体の不在下での（標識された）対照抗体の結合は、高値対照である。低値対照は、標識した対照抗体（例えばＧＬ１８３）を正確に同一の型の未標識抗体（例えばＧＬ１８３）と共にインキュベートすることにより得られ、ここで競合が生じ、そして標識抗体の結合は、低減される。試験アッセイでは、被験抗体の存在下での標識抗体反応性の有意な低下は、同一のエピトープを認識する被験抗体、すなわち標識対照抗体と「交差反応する」ものの指標である。約１：１０と約１：１００との間の対照：被験抗体の任意の比率で、標識対照の各抗原に対する結合を少なくとも５０％まで、更に好ましくは、７０％まで低下する任意の被験抗体は、対照と実質的に同一のエピトープまたは決定基と結合する抗体であると考えられる。好ましくは、かかる被験抗体は、対照の抗原に対する結合を少なくとも９０％まで低下させる。
【００５７】
一実施態様では、フローサイトメトリー試験により競合を評価することができる。既定の活性化受容体を担持する細胞を最初に受容体に特異的に結合することが解っている対照抗体と共に（例えばＫＩＲ２ＤＬ２を発現するＮＫ細胞、およびＧＬ１８３抗体）、そして次に例えば蛍光色素またはビオチンで標識した被験抗体と共にインキュベートする。飽和量の対照抗体とプレインキュベートして得られた結合（蛍光の平均）が、対照とプレインキュベートせずに抗体により得られた結合の８０％、好ましくは、５０、４０またはそれより少ない場合、被験抗体は、対照と競合すると考えられる。あるいは、飽和量の被験抗体とプレインキュベートした細胞において標識対照（蛍光色素またはビオチンにより）で得られた結合が、抗体とプレインキュベートせずに得られた結合の８０％、好ましくは、５０％、４０％、またはそれより少ない場合、被験抗体は、対照と競合すると考えられる。
【００５８】
１つの好ましい実例では、被験抗体を予め吸収させ、そして抗体結合のための基質、例えばＧＬ１８３が結合することが解っているＫＩＲ２ＤＳ２タンパク質またはそのエピトープ含有部分が固定されている表面に飽和濃度で適用する単純競合アッセイを用いることができる。表面は、好ましくは、ビアコアチップである。次いで対照抗体（例えばＧＬ１８３）を基質飽和濃度で表面と接触させ、そして対照抗体の基質表面結合を測定する。この対照抗体の結合を、被験抗体不在下で基質含有表面に対する対照抗体の結合と比較する。試験アッセイでは、被験抗体の存在下での対照抗体による基質含有表面の結合の有意な低下は、同一エピトープを認識する被験抗体、すなわち対照抗体と「交差反応する」ものの指標である。対照抗体の抗原含有基質に対する結合を少なくとも３０％まで、または更に好ましくは、４０％まで低下させる任意の被験抗体は、対照抗体と実質的に同一のエピトープすなわち決定基に結合する抗体であると考えられる。好ましくは、かかる被験抗体は、基質に対する対照抗体の結合を少なくとも５０％まで低下させる。対照および被験抗体の順序を逆にすることができる、すなわち対照抗体を最初に表面に結合させ、その後被験抗体を表面と接触させる。好ましくは、基質抗原に高い親和性を有する抗体を最初に基質含有表面に結合させるが、第２の抗体で認められる結合の低下（抗体は、交差反応していると仮定する）の幅が大きくなると予測されるためである。かかるアッセイの更なる実例は、実施例およびSaunalら、J.Immunol.Meth 183: 33-41(1995)（その開示は参照として本明細書に組み入れられる）で提供される。
【００５９】
一実施態様では、特にその他の無関係なタンパク質と過剰な交差反応を示さないことが確実である場合、ＮＫ細胞表面の複数の受容体と相互作用することができる抗体、例えばＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＳ１、もしくはＫＩＲ３ＤＬ２のような２つ以上ＮＫ細胞受容体の任意の組み合わせ、またはこれらの受容体および任意の更なるＮＫ細胞受容体もしくは受容体群を包含する任意の組み合わせを得ることができる。好ましくは、ＮＫ細胞受容体からのエピトープ、例えばＫＩＲ２ＤＬ２エピトープを認識するモノクローナル抗体は、特にＮＫ−ＬＤＧＬ患者の、かなりのパーセンテージのＮＫ細胞に存在するエピトープと反応するが、ＣＤ３＋Ｔ細胞と、ＣＤ２０＋Ｂ細胞と、またはその他の免疫もしくは非免疫細胞とは有意に反応しない。好ましい実施態様では、抗体は、単球、顆粒球、血小板、および赤血球とも非反応性である。好ましい実施態様では、抗体は、単一のＮＫ細胞受容体のみを認識し、それにより処置用（例えば細胞毒性）抗体の、障害の基礎となる過剰増殖細胞への影響をできるだけ制限する。
【００６０】
一度ＮＫ細胞、好ましくは、ヒトＮＫ細胞の１つのまたは恐らく少数の受容体を特異的に認識する抗体を同定すると、ＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害を有する患者から採取したＬＧＬ（好ましくは、ＮＫ）細胞に結合するその能力に関してそれを試験することができる。
【００６１】
典型的には、抗体は、ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者から採取したＮＫ細胞に結合するその能力を試験するために免疫測定法で確認される。例えば多くの患者から採取した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、およびＮＫ細胞は、ＣＤ３のようなＮＫ細胞に存在する受容体に対する抗体を用いてＰＢＬから富化される（例えばＺａｍｂｅｌｌｏら、Ｂｌｏｏｄ １０２：１７９７（２００３）参照）。次いで既定の抗体のＮＫ細胞に結合する能力を当業者に周知の標準的な方法を用いて評価する。一実施態様では、細胞の各試料を、特定のＮＫ細胞受容体に各々特異的である種々の抗体と共に個別にインキュベートする。有意なパーセンテージの（例えば５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれより多い）患者からのかなりの比率の（例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれより多い）ＮＫ細胞に結合することが見出された抗体は、本明細書で記載するＮＫ受容体状態分類工程の間の診断目的のため、または本明細書に記載する処置方法での使用、例えばヒトに適切な細胞毒性抗体を形成する誘導体化のための双方で本発明で使用するのに適切である。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体を直接的かまたは間接的のいずれかで標識することができる。間接的に標識する場合、典型的には、二次標識抗体を加える。次いで例えばサイトフローメーター分析（例えばファックスキャン）を用いて抗体の細胞への結合を検出することができる。例えばZanibelloら、Blood 102: 1797(2003)または任意のその他の標準的な方法を参照。
【００６２】
少数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）の抗体が、ＮＫ−ＬＤＧＬのような障害を有するほとんどの患者のほとんどの過剰増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞を検出および標的化するのに十分であることが予測される。したがって本方法を用いて実際にすべての患者を分類および処置するのに一般に十分である診断用（直接的または間接的に標識された）および処置用（ヒトに適切な、場合により毒性）抗体の小型パネルを組み立てることが可能である。かかるパネルは、最終的には、キットとして利用可能になり、好ましくは、抗体を用いるための装置を伴って完成する。
【００６３】
したがって、本発明に従って生成された抗体のパネルは、１つまたは少数のＮＫ受容体型に特異的であるものを含む。加えて、いくつかの実施態様では、既定の受容体に対して複数の抗体を調製して、インビボで全患者における受容体発現細胞の最大標的化を確実にし、そしてまた最大数の患者において多型受容体が有効に標的化されることを確実にする。
【００６４】
ヒトにおいて使用するのに適切な抗体の生成
一度、一般的にヒト以外の動物においてＮＫ−ＬＤＧＬ患者のＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞に通例的に存在する１つ以上のＮＫ受容体に特異的に結合することができるモノクローナル抗体が生成されると、抗体は、一般的にそれらをヒトにおける治療的使用に適切なものにするために修飾される。例えばそれらをヒト化、キメラ化、または当技術分野において周知の方法を用いてヒト抗体のライブラリーから選択することができる。かかるヒトに適切な抗体を本処置方法において直接使用するか、または該方法での使用のために前記したように更に細胞毒性抗体に誘導体化することができる。
【００６５】
１つの好ましい実施態様では、本発明の抗体、例えばＧＬ１８３様抗体を生成するハイブリドーマのＤＮＡを、発現ベクターへの挿入の前に、例えばヒト以外の相同配列に代えてヒト重および軽鎖定常ドメインに関するコード化配列を代用することにより（例えばMorrisonら、PNAS 81: 6851(1984)）、また免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列のすべてまたは部分を共有結合させることにより修飾することができる。その様式では、元来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。典型的には、本発明の抗体の定常ドメインに代えてかかる非免疫グロブリンポリペプチドを代用する。
【００６６】
１つの特に好ましい実施態様では、本発明の抗体をヒト化する。本発明による抗体の「ヒト化」形態は、特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいはその他の抗体の抗原結合部分配列のような）そのフラグメントであり、これらはネズミまたはその他のヒト以外の免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する。大部分でヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここでレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、元来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換されているが、元来の抗体の望ましい特異性、親和性、および能力は、維持している。ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応するヒト以外の残基により置換することができる場合もある。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含み得る。抗体の性能を更に精密化および最適化するためにこれらの修飾を行う。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および典型的には、２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで元来の抗体のものに対応するＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべて、およびＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。更に詳細な記載に関しては、Jonesら、Nature 321: 522(1986); Reichmannら、Nature 332: 323(1988); Verhoeyenら、(1988)Science 239: 1534(1988); Presta、Curr.Op.Struct.Biol.2: 593(1992)（その各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照。
【００６７】
ヒト化抗体を作成するのに用いるための軽および重双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法に従って、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いでマウスの配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Simsら、J.Immun.151: 2296(1993); ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.196: 901(1987)）。別の方法は、軽または重鎖の特定のサブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列からの特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同一のフレームワークを用いることができる（Carterら、PNAS 89: 4285(1992); Prestaら、J.Immunol.51: 1993(1993)）。
【００６８】
抗体がヒト化されるが、１つ以上のＮＫ細胞受容体、好ましくは、ヒト受容体に関する高い親和性、およびその他の有益な生物学的特性を保持していることは更に重要である。好ましい方法に従ってこの目標を達成するために、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の理論的ヒト化生成物の分析方法によりヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは通例的に入手可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元コンフォメーション構造を説明および提示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの提示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能になる。このように、標的抗原に関する親和性の増加のような望ましい抗体の特徴が達成されるようにＦＲ残基をコンセンサスおよび移入配列から選択し、そして組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的におよび最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
【００６９】
また免疫化のためにヒト抗体レパートリーを発現するように操作されているその他のトランスジェニック動物を用いることによるような種々のその他の技術に従ってヒト抗体を生成することもできる。この技術では、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性重鎖および軽鎖遺伝子座が標的破壊されたマウスまたはその他の動物に導入する（例えばJakobovitzら、Nature 362: 255(1993); Greenら、Nature Genet.7: 13(1994); Lonbergら、Nature 368: 856(1994); Taylorら、Int.Immun.6: 579(1994)（そのすべての開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。あるいは、遺伝子または染色体トランスフェクション方法により、またはファージディスプレイ方法を用いる抗体レパートリーの選択を介してヒト抗体を構築することができる。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を繊維状バクテリオファージの大または小のいずれかのコートタンパク質遺伝子にフレーム内でクローン化し、そしてファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとして提示させる。繊維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択もまた結果的にこれらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択に至る。このように、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を擬似する（例えばJohnsonら、Curr Op Struct Biol 3: 5564-571(1993); McCaffertyら、Nature 348: 552-553(1990)（その全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。またヒト抗体をインビトロ活性化Ｂ細胞により作成することもできる（例えば米国特許第５５６７６１０号および第５２２９２７５号（その開示はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００７０】
一実施態様では、免疫化にＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（アブゲニックス、フレモント、カリフォルニア州）のような動物を用いて「ヒト化」モノクローナル抗体を作成する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子により置換されたその免疫グロブリン遺伝子を有するネズミ宿主である。したがって、このマウスにより生成された、またはこのマウスのＢ細胞から作成されたハイブリドーマの抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６１６２９６３号に記載されており、これはそのすべてが参照として本明細書に組み入れられる。ＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（メダレックス（Ｍｅｄａｒｅｘ））を用いて類似の方法を達成することができる。
【００７１】
本発明の抗体を「キメラ」抗体（免疫グロブリン）に誘導体化することもでき、ここで重および／または軽鎖の一部は、元来の抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、鎖の残りは、望ましい生物学的活性を呈する限り、別の種から誘導された、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびかかる抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるかまたは相同である（例えばMorrisonら、PNAS 81: 6851(1984)；米国特許第４８１６５６７号参照）。
【００７２】
とりわけＩｇＧ１またはＩｇＧ３型の、非誘導体化または非修飾形態の抗体は、過剰増殖ＮＫ細胞の増殖を阻止するか、またはＮＫ−ＬＤＧＬ患者からのもののような過剰増殖ＮＫ細胞に対して細胞毒性であると予測されるが、それらを細胞毒性にするために誘導体化された抗体を調製することも可能である。一実施態様では、一度ＮＫ細胞受容体特異的抗体を単離し、そしてヒトにおける使用に適切なものにすると、それらを細胞に対して毒性になるように誘導体化する。このように、ＮＫ−ＬＤＧＬ患者への抗体の投与により抗体の過剰増殖ＮＫ細胞への相対的特異的結合に至り、それにより障害の基礎となる細胞を直接的に死滅させるかまたは阻止する。処置の特異性のために、ほとんどのその他のＮＫ細胞および免疫系のその他の細胞を含む身体のその他の非過剰増殖細胞は、それほど処置の影響を受けない。
【００７３】
多くの毒性部分または計画のいずれかを用いて、かかる抗体を生成することができる。特定の好ましい実施態様では、抗体を放射性同位元素またはその他の毒性化合物で直接的に誘導体化する。そのような場合、標識された単一特異的抗体を患者に注射することができ、ここでそれは次に標的抗原を発現する細胞に結合しそして死滅させ、非結合抗体は、簡単に身体から除去される。また「親和性増強系」（ＡＥＳ）（例えば米国特許第５２５６３９５号；Barbetら、Cancer Biother Radiopharm 14: 153-166(1999)（その全開示は、参照として本明細書に組み入れられる）参照）のような間接的計画を用いることもできる。この特定の研究法は、放射性標識されたハプテン、ならびにＮＫ細胞受容体および放射活性ハプテンの双方を認識する抗体の使用を包含する。この場合、抗体は、最初に患者に注射され、そして標的細胞に結合することが可能になり、そして次に一度非結合抗体が血流から除去されることが可能になると、放射標識されたハプテンが投与される。ハプテンは、過剰増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞で抗体−抗原複合体に結合し、それによりそれらを死滅させ、非結合抗体ハプテンは、身体から除去される。
【００７４】
細胞毒性または細胞阻止効果を有する任意の型の部分を本抗体と組み合わせて用いて特異的ＮＫ受容体発現細胞を阻止または死滅させることができ、薬物、毒素、免疫モジュレーター、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、処置用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タクサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害剤、ＳＮ−３８、抗分裂剤、抗血管形成およびアポトーシス剤、とりわけドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ配位錯体、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素他のような放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子を含む（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、第19版（マック出版社、1995); Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics（マックグロウヒル(McGraw Hill)、2001); Pastanら、Cell 47: 641(1986); Goldenberg、Cancer Journal for Clinicians 44: 43(1994)；米国特許第６０７７４９９号（その全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。毒素は、動物、植物、菌類、または微生物起源でよいか、または化学合成によりデノボ創成できることは理解される。
【００７５】
多くの利用可能な方法を用いて毒素またはその他の化合物を抗体に直接的かまたは間接的に連結させることができる。例えばＮ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のような架橋剤を用いて、または抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介して、薬剤を還元抗体成分のヒンジ領域でジスルフィド結合形成を介して結合させることができる（例えばYuら、Int.J.Cancer 56: 244(1994); Wong、Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking（シーアールシープレス（CRC Press)、1991); Upeslacisら、「Modification of Antibodies by chemical Methods」in Monoclonal antibodies: principles and applications、Birchら（編）187〜230頁（ワイリー・リス社（Wiley-Liss,Inc)、1995); Price、「Production and Charactorization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies」in Monoclonal antibodies: Production,engineering and clinical application、Ritterら(編)、60〜84頁（ケンブリッジ大学プレス（Cambridge University Press)、1995); Cattelら、Chemistry today 7: 51-58(1989); Delprinoら、J.Pharm.Sci 82: 699-704(1993); Arpiccoら、Bioconjugate Chemistry 8: 3(1997); Reisfeldら、Antibody,Immunicon.Radiopharm.2: 217(1989)（その各々の全開示は参照として本明細書に組み入れられる）参照）。
【００７６】
１つの好ましい実施態様では、抗体は、Ｉ−１３１のような放射性同位元素で誘導体化される。限定するものではないが、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラソジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、および鉛−２１１を含むいずれかの多くの適切な放射性同位元素を用いることができる。一般的に放射性核種は、好ましくは、２０から６０００ｋｅＶの範囲、オージェ放射体に関しては、好ましくは、６０から２００ｋｅＶの範囲、ベータ放射体に関しては、１００から２５００ｋｅＶ、およびアルファ放射体に関しては、４０００から６０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有している。また実質的にアルファ粒子の作成を伴って崩壊する放射性核種もまた好ましい。
【００７７】
本方法に含まれる細胞毒性部分を選択する場合、該部分が、心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、乳房、前立腺、胸腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、またはヒト身体におけるその他の生命維持器官もしくは組織から選択される１つ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して有意なインビボ副作用を呈さないことを確実にすることが望ましい。本明細書で用いる「有意な副作用」なる用語は、インビボで投与された場合、化学療法の間に通常的に遭遇するもののような、無視できるかまたは臨床的に管理できる副作用しか生じない抗体、リガンド、または抗体抱合体を意味する。
【００７８】
結合および細胞毒性活性に関する細胞毒性抗体の試験
一度、ＮＫ−ＬＤＧＬまたは関連する障害を有する患者からの細胞のＮＫ細胞受容体に特異的に結合することが解っており、そしてヒトにおいて使用するのに適切なものになっており、そして場合により毒性部分を含むように誘導体化されている抗体が得られると、一般的にこれらは標的細胞と相互作用し、その活性に影響し、そして／または死滅させるその能力に関して評価される。一般的に、競合基盤のアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、ビアコア基盤のアッセイ、およびフローサイトメトリーを含む、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体を検出するための先に記載したアッセイを同様に適用して、細胞毒性抗体のようなヒト化、キメラ、またはその他のヒトに適切なＮＫ細胞抗体の、その標的細胞との相互作用を検出することができる。典型的には、標的細胞は、ＬＧＬ細胞、好ましくは、ＮＫ−ＬＤＧＬまたは別の免疫増殖性障害を有する患者から採取したＮＫ細胞である。
【００７９】
本アッセイでは、ヒト化またはヒトに適切な処置用（例えば細胞毒性）抗体の標的細胞またはヒトＮＫ細胞受容体に結合する能力を、対照タンパク質、例えば構造的に無関係の抗原に対して産生された抗体、または非免疫グロブリンペプチドもしくはタンパク質の同一標的に結合する能力と比較する。任意の適切なアッセイを用いて、対照タンパク質に相対して２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％、またはそれより高い親和性の上昇を伴って標的細胞またはＮＫ細胞受容体に結合する抗体またはフラグメントは、標的と「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」と考えられ、そして以下に記載する処置方法において使用するのが好ましい。
【００８０】
結合に加えて、標的細胞の増殖を阻止する、または好ましくは、標的細胞を死滅させる抗体の能力を評価することができる。一実施態様では、１つ以上の関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞、例えばＮＫ−ＬＤＧＬ患者から採取したＬＧＬまたはＮＫ細胞をプレート、例えば９６ウェルプレートに導入し、そして種々の量の関連抗体に暴露する。アラマーブルー（バイオソースインターナショナル、カマリロ、カリフォルニア州）のような生体染色色素、すなわち無傷の細胞に取り込まれる色素を加え、そして洗浄して過剰の色素除去することにより、光学密度により生存細胞の数を測定することができる（抗体により死滅した細胞が多いほど、光学密度が低くなる）（例えばConnollyら、J Pharm Exp Ther 298: 25-33(2001)（その開示は、そのすべてが参照として本明細書に組み入れられる）参照）。任意のその他の適切なインビトロ細胞毒性アッセイ、細胞増殖もしくは生存を測定するアッセイ、またはＮＫ細胞活性を検出するアッセイを同様に用いることができ、インビボアッセイ、例えば関連受容体を発現するヒトＮＫ細胞を含有する動物モデル、例えばマウスに抗体を投与すること、およびヒトＮＫ細胞の生存または活性に及ぼす抗体投与の影響を経時的に検出することもまた同様に用いることができる。また、抗体がヒト以外の受容体、例えば霊長類ＮＫ細胞受容体と交差反応する場合、処置用抗体をインビトロまたはインビボで用いて、抗体が関連受容体を発現する動物からのＮＫ細胞に結合し、そして／またはそれを死滅させる能力を評価することができる。
【００８１】
インビトロまたはインビボで過剰増殖ＮＫ細胞の増殖を検出可能なように遅延化、停止または逆行させることができる任意の抗体、好ましくは、ヒトに適切な抗体、例えば細胞毒性抗体を本方法において用いることができる。好ましくは、抗体は、増殖を停止させることが可能であり（例えばインビトロまたはインビボで標的ＮＫ細胞受容体を発現するＮＫ細胞の数の増加を妨げる）、そして最も好ましくは、抗体は、増殖を逆行させてかかる細胞の全数の低下を導くことができる。特定の実施態様では、抗体は、標的受容体を発現するＮＫ細胞の数において１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％減少を生じることが可能である。
【００８２】
１つの好ましい実施態様では、したがって本発明は、以下の工程：ａ）ＮＫ細胞の表面に存在する受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；ｂ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する抗体の能力を試験すること；ｃ）一人以上の上記患者から採取したＮＫ細胞の相当数に結合する上記複数の抗体から１つを選択すること；およびｄ）上記抗体をヒト投与に適切なものにすること；を含む、ＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害の処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を上記抗体に連結させる工程を含む。かかる方法では、「相当数」とは、細胞の例えば３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより高いパーセンテージを意味し得る。
【００８３】
本発明はまた、以下の工程：ａ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に特異的に結合する抗体を提供すること；ｂ）抗体のＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する能力を試験すること；およびｃ）抗体が、一人以上の患者から採取したＮＫ細胞の相当数に結合する場合、該抗体をヒト投与に適切なものにすること；を含む関連する方法を提供する。一実施態様では、該方法は、更に細胞毒性薬剤を該抗体に連結させる工程を含む。かかる方法および先行のパラグラフを含む本明細書で別に記載する方法を、ＮＫ細胞以外の細胞、例えばＬＧＬ細胞を用いて、そしてＮＫ−ＬＤＧＬ以外の障害、例えばＴ細胞ＬＤＧＬまたはその他の免疫増殖性障害の処置のために同様に実施することができることは理解される。
【００８４】
均等の方法を用いて動物を処置する、または動物モデルにおいて試験するのに適切な抗体を生成することができる。その場合、抗体は、関連動物からの、およびＮＫまたはその他の細胞のクローンエクスパンションを包含する動物疾患においてよく見られるＮＫ細胞受容体を特異的に認識することができることを確実にする。同様に、特定の動物への投与に適切であるように抗体を修飾する。
【００８５】
処置方法のための抗体の投与
本方法を用いて生成された抗体は、増殖性障害、特に免疫増殖性障害、更にとりわけＮＫ−ＬＤＧＬの処置においてとりわけ有効である。一般的に本方法を用いて１つまたは少数のＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞の存在または過剰により引き起こされる任意の障害を処置することができ、そしてしたがって特定のＮＫ細胞受容体を発現する細胞を選択的に死滅させるかまたは阻止することによりそれを有効に処置することができる。その他の適切な疾患には、Ｔ細胞型ＬＤＧＬ、自己免疫障害、およびＮＫまたは関係する細胞を包含する任意のその他の免疫増殖性もしくは悪性障害が含まれる。
【００８６】
本処置方法の重要な構成要素は、患者のエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞の優勢な受容体または受容体群を同定する分類工程である。一般的にこの工程では、ＮＫ細胞またはＬＧＬを患者から採取し、そして例えば免疫測定法を用いて試験して細胞の種々ＮＫ細胞受容体の相対的な優勢を測定する。この方法に関しては、ＮＫ細胞が好ましいが、ＮＫ細胞受容体を発現する任意の細胞型を使用できることは理解される。理想的には、直接的かもしくは間接的のいずれかで標識された、最も通例的にＮＫ−ＬＤＧＬまたは関連障害における増殖ＮＫ細胞において見出される種々のＮＫ細胞受容体を一緒に認識する抗体のパネルを含有するキットを用いてこの工程を実施する。しばしば１つのまたは少数の受容体が相当数の、例えば３０％、４０％、５０％の細胞、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上に存在することが見出される。この場合、次いで単一のまたは少数の処置用（例えば細胞毒性）抗体または抗体群、すなわち検出される受容体または受容体群に対して特異的に指向するものを投与することができる。このように、過剰増殖細胞が特異的に標的化される。
【００８７】
先に記載した免疫学的アッセイに加えて、またその他の方法を用いて患者から採取したＬＧＬまたはＮＫ細胞の種々のＮＫ細胞受容体の同一性および相対的発現レベルを決定することもできる。例えばＲＮＡ基盤の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングを用いて患者から採取した細胞における種々のＮＫ細胞受容体の相対転写レベルを試験することができる。多くの場合、単一または少数の受容体特異的転写物が優勢であり、それにより転写物によりコードされる特定の受容体群に特異的な細胞毒性抗体を用いる患者の処置が可能になる。
【００８８】
別の実施態様では、患者の増殖ＬＧＬ（例えばＮＫ）細胞で発現されるＮＫ細胞受容体の同一性への洞察は、遺伝子型決定により得ることができる。例えば２０またはそれ以上の異なるＫＩＲハロタイプおよび少なくとも４０の異なる遺伝子型（例えばＨｓｕら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．１９０：４０−５２（２００２）（これはそのすべてが参照として本明細書に組み入れられる）参照）が同定されている。これらのハロタイプおよび遺伝子型のいくつかはＫＩＲ受容体発現の活性化または阻止に随伴される。したがって、患者が特定のハロタイプまたは特定の遺伝子型を有していることの決定により、しばしばどの受容体が患者のＮＫ細胞において発現される可能性が最も高いかを示すことができる。患者の特定のハロタイプまたは遺伝子型が確実に特定の発現パターンまたはＮＫ受容体状態に随伴され得て、それにより本処置方法における使用のために特定の処置用（例えば細胞毒性）抗体の選択が可能になる場合もある。
【００８９】
別の実施態様では、患者におけるＬＧＬ（好ましくは、ＮＫ）細胞の活性を評価するための機能的アッセイを単独で、またはその他の方法、例えば免疫学的、ＲＮＡ基盤または遺伝子型決定方法と組み合わせて用いる。１つ以上の活性化ＮＫ細胞受容体が多くの患者で優勢であり得るので、特定の患者から採取した細胞がとりわけ活性である（任意の標準的なアッセイ、例えば細胞溶解アッセイ、サイトカイン生成、細胞内遊離カルシウム等を用いて決定されるように）という知見は、受容体が増殖細胞において発現され得るということについての重要な情報を提供する。かかる情報は、とりわけその他の結果と組み合わせた場合に、細胞毒性抗体または抗体群を用いてほとんどの特異的処置計画を達成することを決定するために用いることができる。例えば、特定のＮＫ−ＬＤＧＬ患者からの大部分のＮＫ細胞がＧＬ１８３抗体（阻止ＫＩＲ２ＤＬ２およびＫＩＲ２ＤＬ３受容体ならびに活性化ＫＩＲ２ＤＳ２受容体の双方を認識する）により特異的に認識されるという知見は、ほとんどのＮＫ細胞もまた活性であるという知見と組み合わせて用いて、理想的な処置は、ＮＫＲ２ＤＳ２に特異的であるが、ＫＩＲ２ＤＬ２またはＫＩＲ２ＤＬ３には特異的でない単一の細胞毒性抗体を包含すると結論づけることができる。理想的には、本処置方法は、最低数の処置抗体を用いて最大比率の過剰増殖ＮＫまたはＮＫ様細胞を標的とする。
【００９０】
理想的には、本抗体、それを用いるための方法およびキットの開発において、異なるＮＫ細胞に対して指向する多くの異なる抗体で多くの患者をスクリーニングする。そのように、ほとんどの患者のエクスパンションした（expanded）ＮＫ細胞の大部分を網羅する診断用および処置用（例えば細胞毒性）抗体のパネルを組み立てることができる。例えばＫＩＲ受容体の１つ（例えばＫＩＲ２ＤＳ２）がＮＫ−ＬＤＧＬを有するかなりのパーセンテージ（例えば２５％、５０％、またはそれより高い）の患者のエクスパンションした（expanded）細胞の少なくとも５０％で発現されることが決定される場合、次いで本発明に従って生成されたキットは一般的にその受容体に対する少なくとも１つの診断用抗体、および受容体に対する１つ以上の処置用抗体を含む。受容体がＮＫ細胞に特異的である、すなわち他のどの細胞型でも発現されない場合にこれはとりわけ真実であるが、その他の細胞型においても発現される受容体を含めることもできる。特に、それが患者のかなりのＮＫ細胞を標的するための唯一の方式である場合、非ＮＫ細胞特異性である受容体に特異的に結合する処置用抗体を用いることができる。包含される非ＮＫ細胞の型に依存して、ＮＫ細胞とのその相互作用を最大にし、そして非ＮＫ細胞型との相互作用を最低にするために（例えば受容体が未成熟ＢまたはＴ細胞においても発現される場合、骨髄または胸腺とのその接触を最大にするように抗体を投与すること）処置用抗体の投与の形態または時期を具体的にあつらえることができる。
【００９１】
本発明のキットは、任意の数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０の診断用および／もしくは処置用抗体または任意のその他の数の診断用および／もしくは処置用抗体を含有することができる。かかるキットでは、診断用抗体は、しばしば直接的かまたは間接的に（例えば二次抗体を用いて）標識される。処置用抗体は未修飾でよく、すなわち連結された細胞毒性またはその他の部分を何ら含まず、例えば標的細胞への単純な結合により作用し、そしてそれにより、それらを不活性化するか、細胞死を誘発するか、または免疫系によりそれらを破壊させる。その他の実施態様では、処置用抗体は、１つ以上の細胞毒性部分に連結される。キットの内容のこの記載はいかなるようにも制限するものではないことは理解される。例えば処置用抗体用には、キットは任意の組み合わせの未修飾または細胞毒性抗体を含有し得る。加えて、キットは化学療法剤または抗腫瘍薬のようなその他の型の処置用化合物を同様に含有できる。好ましくは、キットはまた抗体を使用する、例えば患者のＮＫ受容体状態を分類するための本明細書に記載する方法を詳記し、そしてそれに従って処置用抗体を投与するための指示書を含む。
【００９２】
処置用抗体の投与は、必要に応じて、特に前記した分類工程で決定されるようなＮＫ受容体状態に鑑みて、単一または複数のＮＫ細胞受容体に対して指向する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または任意の数の異なる抗体の投与を包含し得ることは理解される。例えば各々の抗体の相対的毒性、患者のＮＫ受容体状態またはその他の因子に依存して、かかる抗体の組み合わせを一緒に、または別個に投与することができる。
【００９３】
加えて、処置は、複数回の一連の処置用（例えば細胞毒性）抗体投与を包含し得る。例えば最初の一連の抗体投与の後、一般に患者のＮＫまたはＬＧＬ全数を再測定し、そして依然高い場合、更なる一連のＮＫ受容体状態分類を実施し、続いて更なる一連の処置用抗体投与を実施することができる。この更なる一連の投与で投与される細胞毒性抗体は、最初の一巡で用いるものと同一である必要はないが、主に更なる分類工程の結果に依存する。このように、複数回の一連のＮＫ受容体状態分類および処置用抗体投与を例えばＬＧＬまたはＮＫ細胞増殖が制御下に入るまで実施することができる。
【００９４】
本発明はまた、例えばそのフラグメントおよびその誘導体を含むいずれかの本抗体を任意の適切なベヒクル中、患者における標的ＮＫ細胞受容体を発現する細胞の増殖もしくは活性を阻止するか、またはそれを死滅させるのに有効な量で含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。一般に組成物は、更に医薬的に許容される担体を含む。抗体および組成物を患者に投与する本方法を用いて動物を処置するか、またはヒト疾患のための動物モデルにおいて本明細書に記載するいずれかの方法または組成物の有効性を試験することもできることは理解される。
【００９５】
これらの組成物で用いることができる医薬的に許容される担体には、限定するものではないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、硫酸プロタミンのような塩または電解質、リン酸一水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース基盤物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれる。
【００９６】
本発明の組成物を経口的、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、または移植されたリザーバーを介して投与することができる。本明細書で用いる「非経口的」なる用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、包膜内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。好ましくは、組成物を経口的、腹腔内または静脈内に投与する。
【００９７】
本発明の組成物の滅菌注射用形態は、水性または油性懸濁液でよい。適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて当技術分野において公知の技術に従ってこれらの懸濁液を調製することができる。滅菌注射用調製物はまた、無毒の非経口用に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としてでもよい。許容されるベヒクルおよび溶媒のうち、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液を用いることができる。加えて、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁溶媒として都合良く用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の混合不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注射用調製物に有用であり、オリーブ油またはヒマシ油のような天然の医薬的に許容される油、特にそのポリオキシエチル化されたものも同様である。これらの油溶液または懸濁液はまた、カルボキシメチルセルロースまたは、エマルジョンおよび懸濁液を含む医薬的に許容される投与形態の処方で通例的に用いられる類似の分散剤のような、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含有することもできる。その他の通例的に用いられる、トゥイーン、スパンのような界面活性剤、およびその他の乳化剤または医薬的に許容される固体、液体もしくはその他の投与形態の製造において通例的に用いられるバイオアベイラビリティー強化剤もまた処方の目的で使用することができる。
【００９８】
本発明の組成物を、限定するものではないが、カプセル、錠剤、水性懸濁液、または溶液を含む任意の経口用に許容される投与形態で経口投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、通例的に用いられる担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。典型的には、ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤もまた加えられる。カプセル形態で経口投与するために、有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。経口使用のために水性懸濁液が必要とされる場合、活性成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。所望により、特定の甘味剤、着香剤、または着色剤を加えることもできる。
【００９９】
あるいは、本発明の組成物を直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。薬剤を、室温では固体であるが、直腸温度では液体であり、そしてしたがって直腸で溶融して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することによりこれを調製することができる。かかる材料にはココアバター、ミツロウ、およびポリエチレングリコールが含まれる。また本発明の組成物を局所的に、眼科的に、鼻用エアロゾルまたは吸入により投与することもできる。医薬用処方の分野において周知の技術に従ってかかる組成物を調製する。
【０１００】
一実施態様では、本発明の抗体を単独でまたは患者もしくは動物に標的分配するための別の物質と一緒にリポソーム（「免疫リポソーム」）に組み込むことができる。かかるその他の物質には、遺伝子処置のための遺伝子の分配のための、またはＮＫ細胞の遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、もしくはｓｉＲＮＡの分配のための核酸、またはその他の手段によるＮＫ細胞の活性化のための毒素もしくは薬物、または本明細書に記載する、ＮＫ細胞の活性化または腫瘍もしくは感染細胞の標的化に有用であり得る任意のその他の薬剤が含まれ得る。
【０１０１】
別の実施態様では、本発明の抗体を修飾してそのバイオアベイラビリティー、インビボ半減期等を改善することができる。例えば多くの形態のポリエチレングリコールのいずれかおよび当技術分野において公知の結合の方法を用いて抗体をペグ化することができる（例えばLeeら、Bioconjug Chem.14(3): 546-53(2003); Harrisら、Nat Rev Drug Discoy.2(3): 214-21(2003); Deckertら、Int J Cancer.87(3): 382-90(2000)参照）。
【０１０２】
リツキサン（リツキシマブ）、ヘルセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリムのようないくつかのモノクローナル抗体は、臨床症状において有効であることが示されており、そして類似の投与計画（すなわち処方および／または用量および／または投与プロトコール）を本発明の抗体で用いることができる。投与のためのスケジュールおよび用量をこれらの製品に関する公知の方法に従って、例えば製造者の指示書を用いて決定することができる。例えばモノクローナル抗体を１００ｍｇ（１０ｍｌ）または５００ｍｇ（５０ｍｌ）のいずれかの使い捨てバイアル中１０ｍｇ／ｍｌの濃度で供給することができる。静脈内投与用に９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０および注射用滅菌水中で製品を処方する。ｐＨを６．５に調整する。本発明の抗体のための適切な用量範囲の実例は、約１０ｍｇ／ｍ２と５００ｍｇ／ｍ２の間でよい。しかしながら、これらのスケジュールは実例であり、そして臨床試験で決定されなければならない最適なスケジュールおよび投与計画は、抗体の親和性および抗体の耐用性を考慮に入れて適合させることができることは理解される。ＮＫ細胞を２４時間、４８時間、７２時間、または１週間もしくは１か月間飽和させるＮＫ細胞受容体に対する抗体の注射の量およびスケジュールは、抗体の親和性およびその薬物動態パラメーターを考慮して決定される。
【０１０３】
別の実施態様に従って、本発明の抗体組成物は、更に抗体が投与される特定の処置目的で通常利用される薬剤を含む、１つ以上の更なる処置剤を含み得る。通常更なる処置剤は、組成物で、典型的にはその薬剤が処置される特定の疾患または症状のための単剤療法で用いられる量で存在する。かかる処置剤には、限定するものではないが癌の処置で用いられる処置剤、感染疾患を処置するために用いられる処置剤、その他の免疫処置で用いられる処置剤、（ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような）サイトカイン、その他の抗体およびその他の抗体のフラグメントが含まれる。特定の処置研究法がそれ自体患者の症状に有害であることが解っていない限り、そしてＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置に有意に対抗しない限り、本発明とのその組み合わせが企図される。
【０１０４】
充実性腫瘍の処置と関連して、本発明を外科的手術、放射線処置、化学療法等のような古典的研究法と組み合わせて用いることができる。したがって本発明は、ＮＫ細胞受容体に対するヒト化またはヒトに適切な抗体を外科的手術もしくは放射線処置と同時に、前にもしくは後に用いるか；または従来の化学療法、放射線処置もしくは抗血管形成剤または標的免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄｓ）と共に、前にもしくは後に投与する組み合わせ処置を提供する。ＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置および抗癌剤を単一の組成物で、または異なる投与経路を用いる２つの別個の組成物としてのいずれかで患者に同時に投与することができる。
【０１０５】
１つ以上の薬剤（例えば抗癌またはその他の抗ＮＫ ＬＤＧＬ剤）を本抗体基盤処置と組み合わせて用いる場合、組み合わせの結果が、各々の処置が別個に行われたときに観察される効果に付加的であることは要求されない。一般的に少なくとも付加的な効果が望ましいが、単一の処置の１つを超えて上昇した任意の抗ＮＫ細胞増殖効果が有益である。また、組み合わせ処置が相乗効果を奏することを特に要求されるわけではないが、これは確かに可能であり、そして有利である。処置用ＮＫ受容体基盤の処置は、例えば数分から数週間および数ヶ月の範囲の間隔で、その他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤処置に先行または追随してよい。処置用ＮＫ細胞受容体抗体基盤の組成物またはその他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤のいずれかの１回以上の投与が利用されることも想定される。薬剤を交互に、隔日または隔週に投与することができるか；またはＮＫ細胞受容体抗体基盤の処置の１サイクルを行い、続いてその他の抗ＮＫ−ＬＤＧＬ剤処置の１サイクルを行うことができる。いずれにしても、組み合わせ処置を用いてＮＫ細胞過剰増殖の阻止を達成するために、必要なことは双方の薬剤を、投与回数に関わらず、抗増殖性効果を奏するのに有効な組み合わせた量で送達することである。
【０１０６】
別の態様では、免疫モデュレトリー化合物または投与計画を本発明と組み合わせて実行することができる。好ましい実例には、サイトカインとの処置が含まれる。種々のサイトカインをかかる組み合わせ研究法において用いることができる。サイトカインの実例には、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＬＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマが含まれる。患者の症状およびサイトカインの相対的毒性のような臨床適応に一致する標準的な投与計画に従ってサイトカインを投与する。
【０１０７】
本発明のものと組み合わせて実行できる化合物または投与計画のその他の好ましい実例には、ＮＫ細胞の活性をモデュレーションする組成物が含まれる。例えば、特定の好ましい実施態様では、本発明の抗体を、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体またはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ２のような阻止ＫＩＲ受容体の活性を刺激することができる天然リガンド、抗体、または小分子のような阻止ＮＫ細胞受容体を刺激することができる化合物と併せて投与する（例えばYawataら、Crit Rev Immunol.22(5-6): 463-82(2002); Middletonら、Transpl Immunol.10(2-3): 147-64(2002); Vilchesら、Annu Rev Immunol.20: 217-51(2002); またはLongら、Immunol Rev.181: 223-33(2001)（その各々の開示は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）参照）。あるいは、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、またはＮＫｐ４６のような活性化ＮＫ細胞受容体の阻害剤を用いることもできる。
【０１０８】
化学療法は、しばしばＮＫ−ＬＤＧＬのような増殖性障害、特にＮＫ−ＬＤＧＬ白血病を処置するために用いられるので、本発明のＮＫ細胞受容体抗体処置用組成物をその他の化学療法剤またはホルモン処置剤と組み合わせて投与することができる。種々のホルモン処置および化学療法剤を本明細書に開示する処置方法と組み合わせて用いることができる。企図される化学療法剤の実例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞毒性抗体、ビンカアルカロイド、例えばアドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテレ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、サイトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキセート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（類）ならびにその誘導体およびプロドラッグが含まれる。ホルモン様薬剤には、例えばロイプロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリンのようなＬＨＲＨアゴニスト；タモキシフェンおよびトレミフェンのような抗エストロゲン；フルタミド、ニルタミド、シプロテロン、およびビカルタミドのような抗アンドロゲン；アナストロゾール、エクセメスタン、レトロゾール、およびファドロゾールのようなアルマターゼ阻害剤；ならびにメドロキシ、クロルマジノン、およびメゲストロールのような黄体ホルモン剤が含まれる。
【０１０９】
当業者には理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独でまたはその他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床処置において既に用いられている用量に近い。ただ実例としては、シスプラチンのような薬剤およびその他のＤＮＡアルキル化剤を用いることができる。シスプラチンは、癌の処置に広く用いられており、臨床適用において用いられる有効用量は、２０ｍｇ／ｍ２、３週毎に５日間で、全部で３コースである。シスプラチンは、経口では吸収されず、そしてしたがって注射により静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内に送達されなければならない。
【０１１０】
更に有用な薬剤には、ＤＮＡ複製、有糸分裂、および染色体分離に干渉する化合物が含まれ、そしてポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を崩壊させる薬剤を用いることもできる。組み合わせ処置のための化学療法剤の多くの実例が米国特許第６５２４５８３号の表Ｃに列挙されている（その薬剤および指示の開示は具体的に参照として本明細書に組み入れられる）。列挙された薬剤の各々は、実例であり、そして限定するものではない。別の有用な供給源は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第15版、33章、特に624〜652頁である。用量の変更は、処置される症状に依存して生じる可能性がある。処置を投与する医師は、個々の対象のために適切な用量を決定することができる。
【０１１１】
本抗体を任意の１つ以上の抗血管形成処置と組み合わせて用いることもできる。かかる薬剤の実例には、中和抗体アンチセンス計画、ＲＮＡアプタマーおよびＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するリボザイムが含まれる（米国特許第６５２４５８３号（その開示は参照として本明細書に組み入れられる））。国際公開公報第９８／１６５５１号（具体的に参照として本明細書に組み入れられる）に記載されるように抗血管形成特性を有するＶＥＧＦの変種もまた用いることができる。組み合わせ処置に関連して有用な抗血管形成剤の更なる実例は、米国特許第６５２４５８３号の表Ｄに列挙されている（その薬剤および指示の開示は具体的に参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１１２】
またＮＫ細胞受容体抗体を、アポトーシスを誘起する方法と有利に組み合わせることもできる。例えばアポトーシスまたはプログラム細胞死を阻止する多くの発癌遺伝子が同定されている。このカテゴリーの発癌遺伝子の実例には、限定するものではないがｂｃｒ−ａｂ１、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、サイクリンＤ１とは区別される；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７；米国特許第５６５０４９１号；および第５５３９０９４号（各々は参照として本明細書に組み入れられる））およびＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーのメンバーが含まれる。ｂｃｌ−２の過剰増殖は最初にＴ細胞リンパ腫において見出された。ｂｃｌ−２は、アポトーシス経路のタンパク質であるＢａｘに結合し、そして不活性化することにより発癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能の阻止は、Ｂａｘの不活性化を妨げ、そしてアポトーシス経路を進行させることを可能にする。例えばアンチセンスヌクレオチド配列または小分子化学的化合物を用いるこのクラスの発癌遺伝子の阻止がアポトーシスを強化するための本発明における使用のために企図される（米国特許第５６５０４９１号；第５５３９０９４号；および第５５８３０３４号（各々参照として本明細書に組み入れられる））。
【０１１３】
またＮＫ細胞抗体を包含する処置を補助化合物と組み合わせて用いることもできる。補助化合物は、実例としては、セロトニンアンタゴニストのような制吐薬およびフェノチアジン、置換ベンズアミド、抗ヒスタミン、ブチロフェノン、コルチコステロイド、ベンゾジアゼピン、およびカンナビノイドのような処置；ゾレドロン酸およびパミドロン酸のようなビスホスホネート；ならびにエリトロポイエチンおよびＧ−ＣＳＦのような造血成長因子、例えばフィルグラスチム、レノグラスチム、およびダルベポエチンが含まれ得る。
本発明の更なる態様および利点を以下の実験のセクションで開示し、これは説明と見なされるべきであり、そして本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１４】
ＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体の作成
例えばMorettaら、J Exp Med.172(6): 1589-98(1990)に記載されるように、５週齢Ｂａｌｂ Ｃマウスを活性化ポリクローナルまたはモノクローナルＮＫ細胞系で免疫することにより新規モノクローナル抗体を作成する。様々な細胞融合の後、最初にＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６等のような１つ以上のＮＫ細胞受容体を特異的に認識するその能力に関してモノクローナル抗体を選択する。陽性モノクローナル抗体を更にＮＫ−ＬＤＧＬまたは類似する免疫増殖性障害を有する患者から採取したＮＫ細胞に特異的に結合するその能力に関してスクリーニングする。
【実施例２】
【０１１５】
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の精製およびポリクローナルまたはクローナルＮＫ細胞集団の作成
フィコール・ハイパック濃度勾配およびプラスチック付着細胞の消耗により末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＮＫ−ＬＤＧＬ患者または健常ドナーから誘導する。富化されたＮＫ細胞を得るために、ＰＢＬを抗ＣＤ３（ＪＴ３Ａ）、抗ＣＤ４（ＨＰ２．６）、および抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｄ１．１２）モノクローナル抗体と共にインキュベートし（４℃で３０分間）、続いてヤギ抗マウスでコートしたダイナビーズ（ダイナル、オスロ、ノルウェイ）共にインキュベートし（４℃で３０分間）、そして免疫磁性による消耗を行う（Pendeら、Eur.J.Inmmunol.28: 2384-2394(1998); Sivoriら、J.Exp.Med.186: 1129-1136(1997); Vitaleら、J.Exp.Med.187: 2065-2072(1998)）。ＣＤ３−４−ＤＲ−細胞を細胞溶解アッセイで用いるか、またはポリクローナルＮＫ細胞集団、または限界希釈後にＮＫ細クローン（Moretta、Eur.J.Immunol.151: 148-155(1985)）を得るために、１００Ｕ／ｍｌ ｒｌＬ−２（プロリューキン、カイロン社、エメリービル、米国）および１．５ｎｇ／ｍｌ ＰＨＡ（ギブコリミテッド、ペイズリー、スコットランド）の存在下、放射線照射したフィーダー細胞上で培養する。
【実施例３】
【０１１６】
フロー細胞蛍光分析
患者の細胞および対照細胞を、直接標識されているか、または続くＰＥ−もしくはＦＩＴＣ−コンジュゲーションしたアイソタイプ特異的ヤギ抗マウス二次試薬（サザンバイオテクノロジーアソシエーテッド、バーミングハム、アラバマ州）のいずれかである種々のＮＫ細胞受容体に特異的なモノクローナル抗体で染色する。１色または２色細胞蛍光分析（ファックスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）、ベクトンディキンソン社（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．）、マウンテンビュー、カリフォルニア州）により試料を分析する（Ｍｏｒｅｔｔａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：６９５−７１４（１９９０））。
【実施例４】
【０１１７】
抗体−基質相互作用のビアコア分析
組換えタンパク質の生成および精製
大腸菌で組換えタンパク質を生成する。標準的な方法を用いてＰＣＲによりＮＫ細胞受容体の全細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを増幅する。核酸配列を、ｐＭＬ１発現ベクターにビオチン化シグナルをコードする配列と共にフレーム内でクローン化する（Saulquinら、2003)。ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌株（インビトローゲン）でタンパク質発現を実施する。トランスフェクトされた細菌を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補充した培地中、３７℃でＯＤ６００＝０．６まで成長させ、そして１ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘起する。変性条件下（８Ｍ尿素）で封入体からタンパク質を回収する。Ｌ−アルギニン（４００ｍＭ、シグマ）およびβ−メルカプトエタノール（１ｍＭ）を含有する２０ｍＭトリス（ｐＨ７．８）、ＮａＣｌ １５０ｍＭバッファー中室温で６工程透析（各々４、３、２、１、０．５、および０Ｍ尿素）で尿素濃度を低下させることにより組換えタンパク質のリフォールディングを行う。０．５および０Ｍ尿素透析工程の間で還元および酸化グルタチオン（各々５ｍＭおよび０．５ｍＭ、シグマ）を加える。最後に、タンパク質を１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、ＮａＣｌ １５０ｍＭバッファーに対して十分に透析する。可溶性のリフォールディングされたタンパク質が濃縮され、そして次にスーパーデックス（Superdex）２００サイズ排除カラム（ファルマシア（Pharmacia）；ＡＫＴＡシステム）で精製される。ビアコア装置（ビアコア）で表面プラスモン共鳴測定をで実施する。すべてのビアコア実験でランニングバッファーとして０．０５％界面活性剤Ｐ２０を補充したＨＢＳバッファーを供給する。
【０１１８】
タンパク質固定
先に記載したように生成された組換え基質タンパク質をセンサーチップＣＭ５（ビアコア）のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定する。センサーチップ表面は、ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドデヒドロクロリドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミド、ビアコア）で活性化する。カップリングバッファー（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５）中タンパク質を注射した。１００ｍＭエタノールアミン（ｐＨ８）（ビアコア）を用いて残りの活性化基を失活させた。
【０１１９】
親和性測定
動態学測定のために、種々の濃度の可溶性抗体（１×１０−７〜４×１０−１０Ｍ）を固定基質アンプルに適用する。連続流速２０μｌ／分で測定を実施する。各サイクルで、センサーチップの表面を１０ｍＭ ＮａＯＨ（ｐＨ１１）の５μｌの注射により再生する。データ分析にはビアログ動態評価プログラム（ビアエバリュエーション３．１、ビアコア）を用いる。ＨＢＳバッファー中可溶性分析物（種々濃度で４０μｌ）を２０μｌ／分の流速で、例えば５００反射単位（ＲＵ）および１０００ＲＵの基質を含有するデキストラン層に注射する。
【０１２０】
本明細書に引用したすべての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願が、具体的におよび個別に、参照として本明細書に組み入れられると示されているかのように、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
上述の本発明は、理解を明確にする目的のために説明および実例によりいくらか詳細に記載してきたが、本発明の教示に鑑みて、当業者は、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、それに特定の変更および修飾を行うことができることは容易に明白になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ−ＬＤＧＬの処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法であって、
ａ）ＮＫ細胞の表面に存在する１つ以上の受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；
ｂ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する上記抗体の能力を試験すること；
ｃ）一人以上の上記患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する上記複数の抗体から１つを選択すること；および
ｄ）上記抗体をヒト投与に適切なものにすること；
を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６から成る群より選択される単一の受容体に結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体をヒト化またはキメラ化することによってヒト投与に適切なものにする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
更に細胞毒性薬剤を、上記抗体に連結する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞毒性薬剤が、放射性同位元素、毒性ポリペプチド、または毒性小分子である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも６０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも７０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも８０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を用いて生成された抗体。
【請求項１０】
請求項１〜８の一項記載の方法を用いて生成された抗体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８の一項記載の方法を用いて生成された抗体およびＮＫ−ＬＤＧＬの処置において上記抗体を使用するための指示書を含むキット。
【請求項１２】
ＮＫ−ＬＤＧＬの処置のための医薬品の製造のためのＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者からのＮＫ細胞で優勢的に発現されるＮＫ細胞受容体に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項１３】
ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体状態が決定される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体状態が、上記抗体での処置の前に決定される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記ＮＫ受容体が、活性化受容体である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記受容体が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６から成る群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体が、単一のＮＫ受容体を特異的に認識する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＮＫ受容体状態が、免疫学的アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＮＫ受容体状態が、上記ＮＫ細胞に存在する上記ＮＫ受容体の活性を決定するための機能的アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＮＫ受容体状態が、遺伝子型決定アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＮＫ受容体状態が、細胞におけるＮＫ受容体コード化ｍＲＮＡを検出するためのアッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記受容体が、上記ＮＫ細胞の少なくとも５０％で検出可能なように存在する、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体が、細胞毒性である、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞毒性抗体が、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子から成る群より選択されるエレメントを含む、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体が、ヒト化されているか、またはキメラである、請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体が、上記ＮＫ受容体のマウスまたは霊長類相同体に結合する、請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗体が、複数のＫＩＲ受容体に結合する、請求項１２〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗体が、上記免疫学的アッセイにおいて上記ＮＫ受容体状態を決定するために用いられる同一の抗体から誘導される、請求項１８記載の使用。
【請求項１】
ＮＫ−ＬＤＧＬの処置において使用するのに適切な抗体を生成する方法であって、
ａ）ＮＫ細胞の表面に存在する１つ以上の受容体に特異的に結合する複数の抗体を提供すること；
ｂ）ＮＫ−ＬＤＧＬを有する一人以上の患者から採取したＮＫ細胞に結合する上記抗体の能力を試験すること；
ｃ）一人以上の上記患者から採取したＮＫ細胞の少なくとも５０％に結合する上記複数の抗体から１つを選択すること；および
ｄ）上記抗体をヒト投与に適切なものにすること；
を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６から成る群より選択される単一の受容体に結合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体をヒト化またはキメラ化することによってヒト投与に適切なものにする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
更に細胞毒性薬剤を、上記抗体に連結する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細胞毒性薬剤が、放射性同位元素、毒性ポリペプチド、または毒性小分子である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも６０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも７０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗体が、一人以上の上記患者から採取されたＮＫ細胞の少なくとも８０％に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を用いて生成された抗体。
【請求項１０】
請求項１〜８の一項記載の方法を用いて生成された抗体および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜８の一項記載の方法を用いて生成された抗体およびＮＫ−ＬＤＧＬの処置において上記抗体を使用するための指示書を含むキット。
【請求項１２】
ＮＫ−ＬＤＧＬの処置のための医薬品の製造のためのＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者からのＮＫ細胞で優勢的に発現されるＮＫ細胞受容体に特異的に結合する抗体の使用。
【請求項１３】
ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体状態が決定される、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ＮＫ−ＬＤＧＬを有する患者内のＮＫ細胞のＮＫ受容体状態が、上記抗体での処置の前に決定される、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
前記ＮＫ受容体が、活性化受容体である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記受容体が、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、およびＮＫｐ４６から成る群より選択される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗体が、単一のＮＫ受容体を特異的に認識する、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記ＮＫ受容体状態が、免疫学的アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＮＫ受容体状態が、上記ＮＫ細胞に存在する上記ＮＫ受容体の活性を決定するための機能的アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＮＫ受容体状態が、遺伝子型決定アッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＮＫ受容体状態が、細胞におけるＮＫ受容体コード化ｍＲＮＡを検出するためのアッセイを用いて決定される、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記受容体が、上記ＮＫ細胞の少なくとも５０％で検出可能なように存在する、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記抗体が、抗体フラグメントである、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記抗体が、細胞毒性である、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記細胞毒性抗体が、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子から成る群より選択されるエレメントを含む、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
前記抗体が、ヒト化されているか、またはキメラである、請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記抗体が、上記ＮＫ受容体のマウスまたは霊長類相同体に結合する、請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記抗体が、複数のＫＩＲ受容体に結合する、請求項１２〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記抗体が、上記免疫学的アッセイにおいて上記ＮＫ受容体状態を決定するために用いられる同一の抗体から誘導される、請求項１８記載の使用。
【公表番号】特表２００８−５０２５９７（Ｐ２００８−５０２５９７Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１０１５８（Ｐ２００７−５１０１５８）
【出願日】平成１７年４月２９日（２００５．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５８４９
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０４０２２５１５）イネイト・ファーマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ
【出願人】（５０２１７４３０２）ウニヴェルシタ ディ ジェノヴァ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＩ ＧＥＮＯＶＡ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２９日（２００５．４．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１４９４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０５８４９
【国際公開日】平成１７年１１月１０日（２００５．１１．１０）
【出願人】（５０４０２２５１５）イネイト・ファーマ (5)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ
【出願人】（５０２１７４３０２）ウニヴェルシタ ディ ジェノヴァ (7)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡ ＤＩ ＧＥＮＯＶＡ
【Ｆターム（参考）】
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