ＰＣＲのための方法および組成物
熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと式Ｉの改変因子試薬の、基本的に水性条件下における反応によって産生された、改変熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ、ここでその反応は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の熱的に可逆的な不活性化をもたらし、そのポリメラーゼはホットスタートＰＣＲに適当である。改変の方法、ポリ核酸増幅方法、およびＰＣＲ反応混合物および改変熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含むキットも開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの可逆的不活性化のための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
非特異的増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用を長く悩ませてきており、そしてこの問題を最小限にするために、かなりの資源が費やされてきた（例えば非特許文献１を参照のこと）。反応の設定またはＰＣＲの最初の加熱期の間の、ミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長によって生じる非特異的増幅産物に関連する障害を克服するために、いくつかの「ホットスタート」ＰＣＲ技術が使用された。１つの方法において、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチド３リン酸塩、マグネシウムイオンまたは熱安定性核酸ポリメラーゼのような必須のＰＣＲ成分を、より高い温度でのみ加え、それによって非特異的ハイブリダイゼーションを有する可能性、またはミスプライミングしたオリゴヌクレオチドを伸長する可能性を抑制する。特許文献１において記載された、別の方法において、鋳型−プライマーミックスおよび残りの反応混合物の間に、固体ワックスバリアを用いる。このワックスバリアは、高い温度でのみ融解し、そのため、全ての反応成分は高い温度でのみ混合し、ミスプライミングおよびミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ。別の方法は、米国特許出願第２００６／００２９９５２Ａ１号において開示されたように、１本鎖結合タンパク質のような、１本鎖ＤＮＡ（プライマー）に熱可逆的な方式で特異的に結合する化合物を用いて、ミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ。核酸ポリメラーゼの、非共有結合および共有結合両方の、可逆的改変も使用された。本明細書中で全体として参考文献に組み込まれる、特許文献２は、ポリメラーゼの活性を阻害するために、核酸ポリメラーゼに特異的な抗体の使用を開示する。しかし、この方法は、操作工程の数の増加による混入のリスクを有する。これも本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｂｉｒｃｈらに対する特許文献３（「Ｂｉｒｃｈ 「１５２特許」）は、化学的または共有結合的に改変した熱安定性ポリメラーゼを用いるＰＣＲ法を記載する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼを、ジカルボン酸無水物を用いて可逆的に不活性化し、そしてその熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、高い温度で一定期間インキュベートした後活性化し得る。最後に、特許文献４は、アルデヒド、好ましくはホルムアルデヒドを用いた、熱安定性ポリメラーゼの可逆的不活性化を開示する。
【０００３】
ミスプライミングによる非特異的増幅とは別に、核酸増幅およびクローニングにおいて心配な別の領域は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度である（例えば非特許文献２を参照のこと）。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの低い忠実度のために、Ｐｆｕ、Ｖｎｅｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＫＯＤ、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、ｉＰｒｏｏｆＴＭ、Ｔｌｉ、およびＰｆｘを含む、いくつかの熱安定性ＰｏｌＢ酵素が開発および上市された。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと異なり、５０℃より低い温度におけるファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）の残存ポリメラーゼ活性は小さく、これらの酵素の有力ないくつかの製造業者は、それらはＰＣＲの「天然の」ホットスタートＤＮＡポリメラーゼであると主張する。しかし、これらの酵素は室温でかなりの３’−５’ヌクレアーゼ活性を示し、かなりのプライマーの分解およびプライマーの特異性の変化をもたらす。プライマーの分解は、後に行うＰＣＲの間に、ミスプライミングおよび／またはプライマーダイマーの形成をもたらし得る。例えば、いくつかの製造業者は、望ましい結果を得るために、その製品の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、よくコントロールしなければならないと使用者に警告する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をコントロールする方法の１つは、１つはＤＮＡポリメラーゼ活性のための、および１つは３’−５’ヌクレアーゼ活性のための、酵素に結合する２つの抗体を使用することである。例えば非特許文献３を参照のこと。同グループはまた、ＰＣＲを行う温度において過剰に活性なプルーフリーディング活性を有するＫＯＤは、ＰＣＲに対して有利ではなく、そしてより低いプルーフリーディング活性を有する変異体が、より良いＰＣＲ酵素となったことを示した（非特許文献４）。この系統単独の市販の製品も入手可能である（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、ＪａｐａｎによるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）。しかし、上記で示したように、酵素の抗体結合は混入のリスクを伴う。それに加えて、抗体は高価であり、そして調達するのが困難である。
【０００４】
よって、存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの欠点を克服する方法および組成物の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，４１１，８７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３３８，６７１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１５２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，１８３，９９８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（７）：１７１７−１７２３（１９９２）
【非特許文献２】Ｈｅｎｇｅｎ、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ＰＣＲ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０（８）：３２４−３２５
【非特許文献３】Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）、１９９９、１２６：７６２−８
【非特許文献４】Ｋｕｒｏｉｔａら、Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｒｃｈａｅａｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ。Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５、３５１：２９１−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施態様において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供し、ここでその改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、基本的に水性の条件下で、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、式Ｉの改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）試薬と反応させることによって産生し、
【０００８】
【化１】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、ここでその反応は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である。特定の実施態様において、そのＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である。その改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼはまた、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質であり得る。具体的には、本発明のために適当なその改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質であり得る。より具体的には、そのＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である。
【０００９】
ある実施態様において、本発明による改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸を改変因子試薬として用いることによって得る。ある実施態様において、その改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シスアコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である。
【００１０】
ある実施態様において、本発明の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、高い温度でインキュベートすることによって復元可能である。ある実施態様において、その高い温度は、５０℃またはそれより高い、特に９５℃またはそれより高い温度である。ある実施態様において、その高い温度は、約９８℃である。
【００１１】
ある実施態様において、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元された。
【００１２】
ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元された。ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元された。
【００１３】
ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の間の比は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼが改変因子試薬によって改変される前と基本的に同じ値まで復元される。
【００１４】
ある実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変するための方法を提供し、その方法は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと式Ｉの改変因子試薬とを反応させることを含む。
【００１５】
【化２】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであって、そしてここでその反応は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である。
【００１６】
ある実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中に含まれる標的核酸を増幅する方法を提供する：（ａ）サンプルを、標的核酸に相補的なプライマーおよび本発明による改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物と接触させる工程；および（ｂ）工程（ａ）の生じた混合物を、約５０℃より高い温度で、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを再活性化し、そしてプライマー伸長産物の形成を可能にするために十分な時間インキュベートする工程。ある実施態様において、その増幅はポリメラーゼ連鎖反応である。
【００１７】
ある実施態様において、本発明は、少なくともプライマーおよび本発明の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物を提供する。ある実施態様において、本発明は、本発明のポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物および適当な容器を含むキットを提供する。
【００１８】
本教示のこれらの特徴および他の特徴が、本明細書中の説明からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の他の目的、利点、および新規な特徴が、付随する図面を組み合わせて考える場合に、以下の詳細な説明から明らかになる。当業者は、下記で記載する図面は、説明目的のためのみであることを理解する。その図面は、いかなる方法においても、本教示の範囲を制限することを意図しない。
【図１】図１は、ＥＣＡ００１Ｇが、活性化の前に検出可能なポリメラーゼ活性（Ｐｏｌとして表される）およびエキソヌクレアーゼ活性（Ｅｘｏとして表される）を有さないが、活性化後は両方の活性を示したことを示す。（詳細は実施例２．１を参照のこと）
【図２】図２は、再活性化に対するｐＨの影響を示す。（詳細は実施例２．２を参照のこと）
【図３】図３は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが、ＥＣＡ００１Ｇｏｌｄより特異的でないＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄよりも多くの非特異的産物を産生することを示す。（詳細は実施例３を参照のこと）
【図４】図４は、それぞれのピーク活性と比較して、室温で、ＰｏｌＢ酵素が、Ｔａｑよりも低いポリメラーゼ活性を有することを示す。
【図５】図５は、改変および再活性化後、ＡｍｐｌｉＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性の比が変化したことを示す。（詳細は実施例５を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼは、当業者に公知である。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、またはＲＮＡを鋳型として用いる、逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ポリメラーゼを含む。
【００２１】
配列相同性に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼは７つの異なるファミリー：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに細分し得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、６つのファミリー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、およびＹ）のうち１つに含まれ、ほとんどが３つのファミリー（Ａ、Ｂ、およびＣ）のうち１つに含まれる。例えばＩｔｏら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５−４０５７；Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７−８０２；Ｆｉｌｅｅら（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５４：７６３−７７３；およびＡｌｂａ（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２：３００２．１−３００２．４を参照のこと。あるＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖ポリペプチド（例えばあるファミリーＡおよびファミリーＢのポリメラーゼ）、またはサブユニットの１つがポリメラーゼ活性を有する、複数サブユニットの酵素（例えばあるファミリーＣポリメラーゼ）であり得る。同上文献。融合タンパク質は、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、またはＹのポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００２２】
ファミリーＡのポリメラーゼ（「ＰｏｌＡ」）は、複製ポリメラーゼおよび修復ポリメラーゼを両方含む。このファミリーの複製メンバーは、広範囲に研究されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼおよび真核生物ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼｙを含む。修復ポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＰｏｌＩ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＰｏｌＩが含まれる。これらの修復ポリメラーゼは、切除修復およびラギング鎖合成の間に産生される岡崎フラグメントのプロセシングに関与する。ほとんどの熱安定性ＰｏｌＡ酵素は、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有さないので、それらは新規に合成された核酸鎖をプルーフリーディングすることができず、そして従って高いエラー率を有する。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、市販されているポリメラーゼの中で最も高いエラー率の１つを有することが公知である。
【００２３】
ファミリーＢのポリメラーゼ（「ＰｏｌＢ」）は主に複製ポリメラーゼを含み、そして主な真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、δ、εおよびＤＮＡポリメラーゼζも含む。ＰｏｌＢポリメラーゼはまた、いくつかの細菌およびバクテリオファージによってコードされるＤＮＡポリメラーゼを含み、そのうち最もよく特徴付けられているのがＴ４バクテリオファージ、Ｐｈｉ２９バクテリオファージ、およびＲＢ６９バクテリオファージ由来のものである。これらの酵素は、リーディング鎖およびラギング鎖両方の合成に関与する。ポリメラーゼのＰｏｌＢファミリーの特徴は、複製中のその顕著な正確性および多くが強力な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有することである（プルーフリーディング活性を有さないＤＮＡポリメラーゼαおよびζを除く）。
【００２４】
その結晶構造に基づいて、熱安定性ＰｏｌＢ酵素は、ドーナツ様の構造を有する（例えばＨｏｐｆｎｅｒら、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｔｙｐｅ Ｂ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：３６００−５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）３０６：４６９−７７を参照のこと）。その酵素は、ポリメラーゼ活性の活性部位として中心部に大きな凹部を有する。中心部から突出するが「ドーナツ」の表面上にあるのは、それぞれ２本鎖ＤＮＡの結合、１本鎖鋳型の結合、およびプライマーの３’末端におけるエラーを編集するための、それぞれ裂け目Ｄ、裂け目Ｔおよび裂け目Ｅと名付けられた３つの裂け目である（Ｈｏｐｆｎｅｒら、前出）。プルーフリーディング活性中心が存在する裂け目Ｅは、ポリメラーゼ活性中心が存在する中央の凹部よりかない狭い。
【００２５】
本発明者は、裂け目Ｅは、シトラコン酸無水物のような小さい改変試薬によって容易に接近可能であるが、ジフェニルマレイン酸無水物のような大きな対応物によっては容易に接近できないことを発見した。改変試薬を注意深く選択することによって、様々な実施態様において、本発明は、２つの酵素活性の間の適当な比を維持しながら、低い温度（例えば５０℃またはそれより低い）におけるＰｏｌＢのＤＮＡポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方の不活性化、および高い温度における両方の酵素活性の復元を達成し得る。そのような適当な比が、満足のいくＰＣＲ結果のために重要であることが容易に認識される。例えば、もしエキソヌクレアーゼ活性が、ポリメラーゼ活性と比較して高過ぎるなら、意味のある鎖の伸長を達成することは不可能であり、少なくとも十分に長いＰＣＲ産物を得ることは困難である。他方、もしエキソヌクレアーゼ活性が、ポリメラーゼ活性と比較して低過ぎるなら、不適切なプルーフリーディングおよび高いエラー率が生じる。
【００２６】
今や驚くべきことに、あるジカルボン酸無水物、特に十分に小さい置換基を環に有するジカルボン酸無水物は、プルーフリーディング活性中心が存在するＰｏｌＢポリメラーゼの裂け目Ｅに近づくことができ、そしてポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を不活性化し、ならびにＰｏｌＢ酵素の５’−３’ポリメラーゼ活性を不活性化できることが発見されている。そのヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性はどちらも熱再活性化工程後に回復が可能であり、その２つの活性の適当な比を維持して、高い忠実度および高い効率のＤＮＡ増幅を達成する。言い換えると、今や驚くべきことに、小さいジカルボン酸無水物によるＰｏｌＢ酵素の熱可逆的改変により、プライマーダイマーの形成を排除するが、高い増幅忠実度を可能にし得ることが発見された。
【００２７】
よって、様々な実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを可逆的に不活性化するための方法および組成物、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ、および「ホットスタートＰＣＲ」を行うことに関しその酵素を用いるための方法および試薬を提供する。
【００２８】
熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ
あらゆる熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、本発明の方法によって可逆的に不活性化し得る。上記で議論したように、ＤＮＡポリメラーゼのＢファミリーの特徴は、複製中のその顕著な正確性でありそして多くが強力な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、そしてＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、およびＰｆｘとして記載されるものを含むいくつかの熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは市販されているか、あるいはＶｅｎｔ（登録商標）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、ｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されており、および米国特許出願第２００６０２２８７２６号において開示された融合タンパク質である。本発明のために適当な熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＰｏｌＢポリメラーゼおよびキメラポリメラーゼまたは組換えＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００２９】
ある実施態様において、本発明のために適当なＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼであるかまたはポリメラーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含み得る。あるそのような実施態様において、そのファミリーＢのポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属由来のポリメラーゼのような、古細菌ファミリーＢのポリメラーゼである。あるそのような実施態様において、そのファミリーＢのポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼであるかまたはポリメラーゼ活性を有するその断片またはその変異体である。ある実施態様において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異体は、少なくとも５０％、７０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＰｆｕとの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３０】
ある化学的改変因子
様々な実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、それによって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性が完全にまたはほとんど完全に不活性化され、そしてその不活性化は適当な条件下で高い温度において逆転し得る方法に関連する。
【００３１】
本発明のある実施態様によって、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、適当な化学的化合物または化学的改変因子と反応することによって、可逆的に不活性化される。好ましくは、その化学的改変因子は、ジカルボン酸無水物であり得る。上記で示したように、ＤＮＡポリメラーゼ活性の可逆的不活性化は、活性部位のリシンのε−アミノ基をブロックすることによって、酵素を可逆的に不活性化することが当該技術分野で公知であった。しかし、５’−３’ポリメラーゼの活性部位および３’−５’エキソヌクレアーゼの活性部位が、ジカルボン酸無水物分子によって可逆的に不活性化され、得られた再活性化ポリメラーゼがＰＣＲにおいて機能し得るかどうかは今まで未知であった。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本発明のための化学的改変因子は、式Ｉのジカルボン酸無水物を含み：
【００３３】
【化３】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルである。Ｒ１およびＲ２は、炭素−炭素結合または炭素−酸素結合、炭素−窒素結合、または炭素−硫黄結合のような、炭素−ヘテロ原子結合によって、環に直接結合し得る。有機基（ｒａｄｉｃａｌ）も、例えば３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物におけるように、お互いに連結して環構造を形成し得る。
【００３４】
ジカルボン酸無水物は、タンパク質のアミノ基と反応して、対応するアシル化産物を生じることが公知である（例えば米国特許第５，６７７，１５２号を参照のこと）。アシル化反応および脱アシル化反応の両方の妥当なメカニズムの説明に関して、本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｐａｌａｃｉａｎら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７：１０１−１１１も参照のこと。ｃｉｓ−炭素−炭素二重結合、および潜在的に他の置換基は、アミド基との相互作用、および続く脱アシル化にとって適当な空間的配向にある、アシル化残基の末端カルボキシル基を維持するので、上記ジカルボン酸無水物の可逆性を増強すると考えられる。
【００３５】
本発明に適当な適した化学的改変試薬の例は、無水マレイン酸；シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、および２，３−ジメチルマレイン酸無水物のような置換無水マレイン酸；エキソ−シス−３，６−エンドキソ（ｅｎｄｏｘｏ）−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；および３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物を含む。その試薬は、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．)、またはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．（Ｇａｒｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。置換無水マレイン酸試薬シトラコン酸無水物およびシス−アコニット酸無水物を用いた、ＰｏｌＢ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの改変を、実施例で記載する。
【００３６】
可逆的に不活性化された熱安定性酵素の調製
いくつかの実施態様において、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼの改変は、ＰｏｌＢ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の分子を、適当な温度で、例えば４℃で、一般的に水性条件下のアルカリ性ｐＨで、酵素の活性を許容可能なレベルまで抑制するのに十分な時間、化学的改変因子と反応させる工程を含む。
【００３７】
その改変は、典型的には１時間から１２時間の反応時間内に、または６０分未満で、最も好ましくは１５分から３０分未満で行い得るが、これは使用する試薬に幾分依存して変動する。
【００３８】
適当な反応条件は当該技術分野で公知であり、そして本明細書中および本実施例においてさらに記載される。リシン残基の化学的改変は、アルカリ性ｐＨにおいて有利であることが公知である。その改変反応を、ｐＨ７−１０で、好ましくはｐＨ７．０およびｐＨ９．０の間で、またはより好ましくは７−８．５の間で、水性緩衝剤中で、室温またはそれより低い温度において行う。加水分解の速度はｐＨと共に増加するが、約９より高いｐＨで起こる加水分解は、タンパク質の最適以下のアシル化をもたらし得る。
【００３９】
その反応は約１時間のインキュベーション後実質的に完了するが、１２−２４時間の間で続き得る。
【００４０】
ジカルボン酸無水物は、水と容易に反応して対応する酸を生じる。従って、試薬の大部分はタンパク質のアミノ基の改変の間に加水分解される。
【００４１】
一般的に、タンパク質と比較してモル過剰の改変因子試薬をアシル化反応に用い、そして最適なモル比を経験的に決定する。例として、ＥＣＡ００１は、２０倍またはそれより高いモル過剰のシトラコン酸無水物との反応によって、基本的に完全に不活性化される（もとの活性の５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．１％未満）。
【００４２】
本発明の方法において、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、両方とも完全に不活性化される（そのもとの活性の１％未満）、またはほとんど完全に不活性化される（そのもとの活性の５％未満）。本発明の改変された熱安定性酵素は、３７℃でアッセイした場合、３７℃で１時間またはそれを超えてインキュベートした後でさえ、いかなる有意な検出可能な活性も有さない。他方、本化学的に改変された酵素の酵素活性は、より高い温度において、すなわち約５０℃で、好ましくは７５℃から１００℃の温度で、そして最も好ましくは９８℃でインキュベートした場合、３０分以内に３倍増加する。そのような化学的に改変された酵素を、ＤＮＡ増幅、ライゲーション、エキソヌクレアーゼ反応またはエンドヌクレアーゼ反応のような、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む全ての適用において採用し得る。
【００４３】
本発明の熱で活性化が可能な酵素の重要な局面は、その保存安定性である。一般的に、本明細書中で記載された酵素は、長期間安定であり、それは各使用直前の調製の必要性を排除する。例えば、シトラコニル化ＥＣＡ００１は、２５℃で保存した場合、少なくとも４週間不活性なままであることが見出された。
【００４４】
増幅方法
本発明の熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、プライマーに基づく核酸合成または増幅反応に使用し得る。本発明の方法は、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を使用して、その反応混合物を増幅反応の前に、または不可欠な一部として、高温インキュベーションにかける工程を含む。高温インキュベーションは、アミノ基の脱アシル化およびポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性両方の回復をもたらす。
【００４５】
改変アミノ基の脱アシル化、および酵素活性の再活性化は、温度の増加および同時に起こるｐＨの低下の両方から起こる。増幅反応は、典型的には８．０から９．０までのｐＨに調合されたＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤中で、室温で行う。室温において、アルカリ性の反応緩衝剤条件は、アミノ基のアシル化形式に有利である。反応緩衝剤のｐＨは室温で８．０から９．０までのｐＨに調整されるが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ反応緩衝剤のｐＨは、温度の増加と共に低下する。従って、反応緩衝剤のｐＨは、増幅が行われる、そして特に活性化インキュベーションが行われる高い温度において低下する。反応緩衝剤のｐＨの低下は、アミノ基の脱アシル化に有利である。
【００４６】
反応に使用する緩衝剤システムによって、高温反応条件の結果として起こるｐＨ変化を決まるということはよく認識されており、そして生物学的反応において使用される様々な緩衝剤のｐＨの温度依存性は周知である（例えばＧｏｏｄら、１９６６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５（２）：４６７−４７７を参照のこと）。増幅反応は、典型的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤中で行われるが、温度によってより小さいかまたは大きいｐＨの変化を示す緩衝剤中で増幅反応を行い得る。使用する緩衝剤に応じて、幾分安定な改変酵素が望ましいであろう。例えば、安定がより低い改変酵素を生じる改変試薬を使用する場合、より小さな緩衝剤ｐＨの変化の下での十分な酵素活性の回復が求められる。
【００４７】
改変酵素の活性化は、好ましくはプライマーの結合特異性を保証するために増幅反応において使用されるプライマーのハイブリダイゼーション（アニーリング）温度と同じかまたはそれより高い温度におけるインキュベーションによって達成される。酵素活性を回復するために必要なインキュベーションの長さは、反応混合物の温度およびｐＨ、および改変酵素の調製に使用された改変因子試薬に依存する酵素のアシル化アミノ基の安定性に依存する。広い範囲のインキュベーション条件が使用可能である；最適な条件を、各反応に関して経験的に決定し得る。一般的に、増幅反応緩衝剤中で、約５０℃より高い温度で、約１秒と約２０分の間の時間、インキュベーションを行う。例証されない酵素の再活性化、または例証されない反応混合物に関するインキュベーション条件の最適化を、本明細書中で提供されたガイダンスに従って日常的な実験によって決定し得る。
【００４８】
好ましい実施態様において、ＰＣＲ増幅を、可逆的に不活性化された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う。ＰＣＲ増幅において使用されるアニーリング温度は、典型的には約５０−７５℃であり、そして反応前インキュベーションを、アニーリング温度と同じかまたはそれより高い温度で、好ましくは約９０℃より高い温度で行う。増幅反応混合物を、好ましくは約９０−１００℃で、約１２分までインキュベートして、温度サイクリングの前にＤＮＡポリメラーゼを再活性化する。典型的なＰＣＲ増幅のための適当な反応前インキュベーション条件は、反応前インキュベーション条件を変動することの増幅に対する影響と共に、実施例において記載される。
【００４９】
典型的なＰＣＲ増幅の最初の工程は、２本鎖標的核酸の熱変性を含む。サンプル核酸の変性に必要な正確な条件は、サンプル核酸の長さおよび組成に依存する。典型的には、９０−１００℃における、約１０秒から最大約４分までのインキュベーションが、サンプル核酸を完全に変性するために有効である。最初の変性工程は、ＤＮＡポリメラーゼを再活性化するための反応前インキュベーションとなり得る。しかし、最初の変性工程の長さおよび温度に依存して、そしてＤＮＡポリメラーゼを不活性化するために使用された改変因子に依存して、ＤＮＡポリメラーゼ活性の回復は不完全であり得る。もし酵素活性の最大限の回復が望ましいなら、反応前インキュベーションを延長してよいか、あるいは、増幅サイクルの数を増やすことができる。
【００５０】
ある実施態様において、その改変酵素および最初の変性条件を、回復可能な酵素活性の一部のみが最初のインキュベーション工程の間に回復されるように選択する。それぞれ高温の変性工程を含む、続くＰＣＲのサイクルが、酵素活性のさらなる回復をもたらす。従って、酵素活性の活性化は、増幅の最初のサイクルの後まで遅れる。ＤＮＡポリメラーゼ活性のこの「持続性」により、非特異的増幅がさらに減少することが観察された。過剰なＤＮＡポリメラーゼが非特異的増幅に寄与することが公知である。本方法において、標的配列の数が少ない増幅の最初の段階の間は、存在するＤＮＡポリメラーゼ活性の量が低く、それは形成される非特異的伸長産物の量を抑制する。標的配列の数が多い増幅の後期の段階の間は、最大のＤＮＡポリメラーゼ活性が存在し、そしてそれによって高い増幅収量が可能となる。もし必要なら、最初のサイクルに存在するＤＮＡポリメラーゼ活性の量の低さを補うために、増幅サイクルの数を増加させ得る。
【００５１】
本発明の方法の利点は、その方法が、反応混合物を最初に調製した後に、その反応混合物の操作を必要としないことである。従って、その方法は、最初の変性工程後に試薬を加えること、またはワックスバリアを使用することが不便であるかまたは非実用的である、自動化増幅システムにおいて、およびインサイツ増幅方法と共に使用するために理想的である。
【００５２】
本発明の方法は、高い重合忠実度を有するＰＣＲにおいて非特異的増幅の抑制のために特に適当である。よって、本発明の組成物および方法は、ゲノミクス研究におけるような、標的核酸配列の増幅のため、およびそのような長い配列のクローニングのために特に適当である。
【００５３】
しかし、本発明の方法および組成物は、いかなる特定の増幅システムにも制限されない。本発明の可逆的に不活性化された酵素を、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、そして増幅の特異性を達成するために反応温度に依存する、あらゆるプライマーに基づく増幅システムにおいて使用し得る。本方法を、熱安定性の酵素を用いる、等温増幅システムに適用し得る。酵素活性を回復するために、高い温度における一時的なインキュベーションのみが必要である。酵素活性を回復するために反応混合物を高温インキュベーションにかけた後、適当な反応温度で反応を行う。ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，９６５，１８８号）に加えて、他の増幅方法は、以下のものを含むがこれに限らない：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９およびＢａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、１９９１、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ．１：５−１６）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９０／０１０６９号）；修復連鎖反応（欧州特許公開第４３９，１８２Ａ２号）；３ＳＲ（Ｋｗｏｈら １９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９２／０８８０Ａ号）、およびＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号）。上記の参考文献は全て、本明細書中で参考文献に組み込まれる。本発明は、いかなる特定の増幅システムにも制限されない。他のシステムが開発される場合、それらのシステムは本発明の実施によって利益を得ることができる。増幅システムの最近の調査が、本明細書中で参考文献に組み込まれる、ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４１−４７において刊行された。
【００５４】
各増幅反応のために適当なサンプル調製方法が、当該技術分野において記載される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出、および上記で引用した増幅方法を記載する参考文献を参照のこと）。標的配列のＰＣＲ増幅のためのサンプルを調製する簡単かつ迅速な方法が、Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９のＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において、およびＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１８−２０章（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）において記載されており、それらはどちらも本明細書中で参考文献に組み込まれる。当業者は、適当なプロトコールを選択しかつ経験的に最適化し得る。
【００５５】
増幅産物を検出するための方法は、文献において広範囲に記載されている。標準的な方法は、ゲル電気泳動によるかまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによる分析を含む。プローブと増幅された核酸の間に形成されたハイブリッドの検出を、Ｓａｉｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６；Ｓａｉｋｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０；ＰＣＴ特許公開第８９／１１５４８号；米国特許第５，００８，１８２号および同第５，１７６，７７５号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）：３３７−３４７を含む、ドットブロットアッセイ形式およびリバースドットブロットアッセイ形式を含む、様々な形式において行い得、それらはそれぞれ本明細書中において参考文献に組み込まれる。マイクロウェルプレートを用いるリバースドットブロット法が、例えば米国特許第５，２３２，８２９号；Ｌｏｅｆｆｅｌｈｏｌｚら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（１１）：２８４７−２８５１；Ｍｕｌｄｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２（２）：２９２−３００；およびＪａｃｋｓｏｎら、１９９１、ＡＩＤＳ ５：１４６３−１４６７において記載され、それらはそれぞれ本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００５６】
５’ヌクレアーゼアッセイと呼ばれる、別の適当なアッセイ方法が、米国特許第５，２１０，０１５号およびＨｏｌｌａｎｄら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０において記載され、それらはどちらも本明細書中で参考文献に組み込まれる。５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、標識プローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によるプライマー伸長と同時に分解される。プローブ分解産物の検出により、プローブと標的ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションが起こったこと、および増幅反応が起こったことの両方が示される。
【００５７】
反応混合物における２本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることによる、核酸の増幅を検出する代替方法が、Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０；および欧州特許公開第４８７，２１８号および同第５１２，３３４号において記載され、それらはそれぞれ本明細書中で参考文献に組み込まれる。２本鎖標的ＤＮＡの検出は、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）および他のＤＮＡ結合標識が、２本鎖ＤＮＡに結合した場合に示す蛍光の増加に依存する。標的配列の合成から生じる２本鎖ＤＮＡの増加は、蛍光の検出可能な増加をもたらす。この方法における問題は、非標的配列の合成、すなわち非特異的増幅が、蛍光の増加をもたらし、それが標的配列の合成から生じる蛍光の増加の測定を妨害することである。従って、本発明の方法は、非特異的増幅を抑制し、それによって非標的配列の増幅から生じる蛍光の増加を最小限にするので、特に有用である。
【００５８】
上記で記載したような、改変した、不活性化核酸ポリメラーゼを使用することに加えて、反応混合物における核酸の融解反応に影響を与える添加物を用いることによって、ＰＣＲ反応を改善し得る。例えば、非特異的産物を生じる反応のような、困難なＰＣＲ増幅、および特に高いＧＣ含有量を有するか、または大規模な２次構造を有する鋳型の増幅を、ＡＴ−およびＧＣ−塩基対形成をＡＴ−塩基対の安定性のレベルまで「等しく安定化する（ｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」添加物を採用することによって改善し得る。適当なそのようなＰＣＲ添加物は、多機能性ポリオール、好ましくは三機能性ポリオール、最も好ましくはグリセロール；アミド、好ましくはカルバミド、最も好ましくはホルムアミド；アルカリ性アンモニア塩、好ましくはアルキル化アンモニア塩、最も好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム；スルホキシド、好ましくはアルキル化スルホキシド、最も好ましくはジメチルスルホキシド；硫酸塩、好ましくは無機硫酸塩、最も好ましくは硫酸アンモニウムポリアルキレングリコール、最も好ましくはポリエチレングリコールを含む。さらに、ＳＳＢタンパク質（１本鎖結合タンパク質）、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１０７９（１９９０）を参照のこと）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、または酵母ＳＳＢタンパク質も使用し得る。好ましいＰＣＲ添加物はまた、仔ウシ胸腺タンパク質ＵＰ１（Ａｍｒｕｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（２７）：８２８２−８２９１（１９９４）を参照のこと）を含む。
【００５９】
この目的のために特に好ましいＰＣＲ添加物は、ベタイン（１−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メタンアミニウム分子内塩）および他の−ＯＯＣ−ＣＨ２−ＮＭｅ３＋基（集合的に「ベタイン」）によって特徴付けられる双性イオン塩基である。そのＰＣＲ添加物を、増幅産物の特異性を改善するために有効な量で、ＰＣＲ反応混合物に有利に加える。典型的には１ｍＭから５Ｍまでの、好ましくは約１Ｍの添加物の濃度を用いるが、添加物の非存在下で行ったＰＣＲ反応物と比較して、特異的増幅産物の収量を改善するあらゆる量が適当である。
【００６０】
逆転写を含むＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応において、本発明の材料および方法は、さらなる操作工程によって酵素反応を中断することなく、１つの容器において連続的な反応を行うことを可能にする。
【００６１】
本発明はまた、キット、本方法を実施するために有用な成分を含む複数容器のユニットに関連する。有用なキットは、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ、およびオリゴヌクレオチドプライマー、基質ヌクレオシド３リン酸塩、補助因子、および適当な緩衝剤のような、増幅反応を行うための１つまたはそれを超える試薬を含む。
【００６２】
ある実施態様において、本発明は、Ｔｒｉｓ緩衝化反応緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝化反応混合物と共に、そのような不活性化された熱安定性酵素を含むキットに関連する。
【００６３】
ある実施態様において、本発明は、さらなる操作工程による酵素反応の中断無しに、単一の反応チューブにおいて連続的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うための、不活性化ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせたＲＮアーゼＨ陽性逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ陰性逆転写酵素の使用に関連する。
【００６４】
下記に示す本発明の実施例は、説明目的のためのみに提供され、そして本発明の範囲を制限しない。実施例に続く特許請求の範囲内の、本発明の多くの実施態様が、前述の本文および以下の実施例を読むことより当業者に明らかである。
【００６５】
分子生物学の適用、酵素学、タンパク質化学および核酸化学の標準的なプロトコールが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、１９９５）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．のような、印刷された出版物においてよく記載されている。本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および出版物は、参考文献に組み込まれる。
【００６６】
本教示の局面は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得るが、それらはいかなる方法においても本教示の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１ ＥＣＡ００１の改変
ＥＣＡ００１と呼ばれる、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質を、本発明の方法による改変のために使用した。ＥＣＡ００１は、全長のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＣ末端に結合した、ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の核酸結合ポリペプチドＰａｅ３１９２を含む。ＥＣＡ００１は、米国特許出願第２００６０２２８７２６号において１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２と記載され、それは本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。ＥＣＡ００１を以下のように構築した。全長ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を、Ｐａｅ３１９２をコードするポリヌクレオチド配列と共にフレームに含むＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限断片を、標準的な組換え法を用いて、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）のＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた組換えベクター（ｐＤＳ２ｒ）は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙペプチドリンカーによって、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ末端に結合したＰａｅ３１９２を含む融合タンパク質をコードする。１０×Ｈｉｓ親和性タグが、融合タンパク質のＮ末端に存在する。
【００６８】
ＥＣＡ００１の改変を、以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭのシトラコン酸無水物（ＣＡＤ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＥＣＡ００１と混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合し続けてから、保存緩衝剤に移した。上記で記載したＣＡＤ対酵素比は約１００対１であり、そして酵素溶液と混合するＣＡＤの濃度を調整することによって、８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比を使用し得る。
【００６９】
得られた改変タンパク質を、ＥＣＡ００１ＧｏｌｄまたはＥＣＡ００１Ｇと呼ぶ。
【００７０】
実施例２ 改変ＥＣＡ００１Ｇは、検出可能なＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’ヌクレアーゼ活性を有さない
この実施例は、（１）改変後、活性化の前にはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’ヌクレアーゼ活性は検出されず、そして熱活性化後検出可能となること；（２）ＥＣＡ００１Ｇは、ｐＨ８において最適に活性化され、そして活性化された酵素はＰＣＲにおいて有用であること；（３）ＥＣＡ００１Ｇは、プライマーダイマーの形成を排除することによって、ＰＣＲを改善することを示す。
【００７１】
実施例２．１ この実施例は、ＥＣＡ００１Ｇは、活性化の前にはポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方において不活性であるが、そのような活性は、熱活性化の後に復活することを実証することを意図する。この目的のために、２つの活性アッセイ、ポリメラーゼ活性アッセイおよびエキソヌクレアーゼ活性アッセイを用いて、（１）改変前、（２）改変後だが再活性化前、および（３）改変してかつ再活性化後に、それぞれタンパク質サンプルを試験した。
【００７２】
活性アッセイは、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ緩衝剤、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、および５００ｎＭの基質を含む。ポリメラーゼ活性アッセイに関して、５’から３’への以下の配列を有するＰｏｌｓｕｂ１４と呼ばれる基質を用いる：
【００７３】
【化４】
ここで、ＢＨＱ１はＢｌａｃｋｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．の製品であり、そしてＦＡＭ−ｄＴは塩基にフルオレセイン（ＦＡＭ）が結合したデオキシチミンである。ＦＡＭは、５２０ｎｍで発光するフルオロフォアであり、そしてＢＨＱ１（登録商標）が近傍に留まる場合それによって消光し得る。その構造を下記に示す：
【００７４】
【化５】
Ｐｏｌｓｕｂ１４は、下記に示すように、ポリメラーゼ活性をアッセイするその天然の状態においてヘアピン構造が想定されている：
【００７５】
【化６】
最後から２番目の位置でｄＴの塩基に結合したフルオレセイン（ＦＡＭ）ＦＲＥＴドナーは、主に１本鎖領域によってＢＨＱ１から離されている。この配置は、ＢＨＱ１がフルオレセインを有効に消光することを可能にする。一旦基質がポリマー化したら、１本鎖領域は、下記に示すように２本鎖になり：
【００７６】
【化７】
それはより硬い２本鎖ＤＮＡによってＢＨＱ１をフルオレセインから離し、フルオレセインを発光させる。
【００７７】
３’−５’ヌクレアーゼアッセイに関して、基質（Ｅｘｏ−ＭＭ ＨＰ）は、配列
【００７８】
【化８】
を有し、それも天然の状態で下記に示すヘアピン構造を形成する。
【００７９】
【化９】
この基質は、２つの特徴を有する：（１）３’末端においてｄＴの塩基に結合したＦＡＭは、ＢＨＱ１によって消光される；（２）ＦＡＭが結合しているｄＴは鋳型とミスマッチである。ＰｏｌＢ酵素がこのヘアピンに結合した場合、３’−５’ヌクレアーゼ活性がそのミスマッチを認識し、そしてそれに結合したＦＡＭと共に塩基を切除し、ＦＡＭの発光をもたらす。
【００８０】
反応緩衝剤において、基質無しで、９８℃で１０分間、活性化を行った。図１は、１００μｌ中の１．５ユニットの酵素に関する活性化前および後の、６０℃において決定した活性を示す。
【００８１】
図１に示すように、ＥＣＡ００１Ｇ（００１Ｇと呼ばれる）は、活性化前には検出可能なポリメラーゼ活性を示さなかったが、活性化後には活性を示した（Ａｃｔ００１Ｇと呼ばれる）。非改変酵素、ＥＣＡ００１Ｇ（００１と呼ばれる）をコントロールとして用いた。
【００８２】
実施例２．２ この実施例は、ＥＣＡ００１ＧがｐＨ８において最適に活性化され、そして活性化された酵素はＰＣＲにおいて有用であることを実証するために役立つ。
【００８３】
ＰＣＲ反応を、ｐＨ８、ｐＨ８．５、およびｐＨ９のそれぞれにおいて、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、全長のＧＡＰＤＨｃＤＮＡクローンを含む１０５コピーのプラスミド、およびそれぞれ５００ｎＭのＧＡＰＤＨ前向き（ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ）（配列番号３）およびＧＡＰＤＨ逆向き（ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ）（配列番号４）プライマーを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ中で、５ユニット／１００μｌのＥＣＡ００１Ｇを用いて行った。サイクリング条件は、９８℃における１０分間の活性化と、それに続く９８℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであった。サイクリングが終了した後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。その結果を図２に示す。ｐＨ８における活性化が、最も高い収量を生じた；一方ｐＨ８．５は最適以下の収量を生じ、そしてｐＨ９は増幅産物を生じなかった。
【００８４】
実施例３．ＥＣＡ００１Ｇは、厳しいＰＣＲ条件下で標的核酸をうまく増幅した
この実験は、厳しいＰＣＲ条件下におけるＥＣＡ００１Ｇの有用性を実証する。これらの条件下で、もしホットスタート技術が採用されなかったら、ＰＣＲ反応混合物においてプライマーダイマーが形成する傾向がある。ホットスタートの性質によって、ＰＣＲ反応はプライマーダイマーがないか、またはプライマーダイマーによる妨害の減少を示す。
【００８５】
この実施例は、ＰＣＲ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙと呼ばれる反応を含み、それはそれぞれ３つのセットのプライマーを含む。そのプライマーのセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．から市販されている。具体的にはセット１はＨｓ００３７８３６３＿ｇ１；セット２はＨｓ００３９９５７２＿ｍ１およびセット３はＨｓ００３７２８５９＿ｍ１である。
【００８６】
その成分を下記に列挙する：
１×ＰＣＲ緩衝剤
１×ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
５０ユニット／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼ
１×プライマーミックス
および０．８ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ（ヒト）
個々のポリメラーゼの必要性のために、１×緩衝剤および１×ＭｇＣｌ２は下記に示すように異なる：
【００８７】
【表１】
ＥＣＡ００１のサイクリング条件を下記に列挙する：
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９８℃で３０秒間
４０サイクルの
９８℃で５秒間
６０℃で１分間
ＥＣＡ００１−Ｇｏｌｄのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で１０分間
４０サイクルの
９８℃で５秒間
６０℃で１分間
ＡｍｐｌｉＴａｑのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で３０秒間
４０サイクルの
９５℃で１０秒間
６０℃で１分間
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で１０分間
４０サイクルの
９５℃で１０秒間
６０℃で１分間
各反応を、２組で行った。サイクリング後、産物を図３に示すようにエチジウムブロミドアガロースゲルに流した。
【００８８】
図３は、ＡｍｐｌｉＴａｑが、記載した条件下で３つのプライマーセット全てに関して、主に非特異的／プライマーダイマー産物を産生したが、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄは主に特異的産物を産生することを示す。ＥＣＡ００１は、生来ＡｍｐｌｉＴａｑよりも非特異的産物の形成またはプライマーダイマーの形成が少なく、そしてＥＣＡ００１Ｇは非特異的産物／プライマーダイマーの産生を示さなかった。これらのＥＣＡ００１Ｇの結果は、非特異的産物を欠くことに関してＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄの結果に匹敵するが、ＥＣＡ００１Ｇからの収量は、特にプライマーセット２に関して、Ｔａｑ Ｇｏｌｄの収量より多かった。
【００８９】
実施例４ ＰｏｌＢ酵素は、室温においてＴａｑよりも低いポリメラーゼ活性を有する
ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、室温において比較的低いポリメラーゼ活性を有するが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは依然としてそのピーク活性の＞５％を保持する（図４）。
【００９０】
実施例５：エキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性比は、活性化後も変化しない
我々のデータ(図３)は、プライマーダイマーまたは非特異的産物を形成する傾向が殆どないことを示した。リシンは多くの酵素において見出し得る、よくあるアミノ酸であることは本当である。Ｂｉｒｃｈ’１５２特許における化学物質は、我々の手で、Ｔａｑの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性とは異なる）を改変し得ることが証明された。しかし、エキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性比は変化した（図５）。
【００９１】
一般的な酵素、Ｔａｑの代わりにＰｏｌＢ酵素を使用するいくつかの利点が存在する。（１）ＰｏｌＢ酵素はプルーフリーディング活性を有しており、従って、ＰＣＲ産物のエラー率は典型的には有意により低い。（２）ＰｏｌＢ酵素は、ＥＣＡ００１と同様、図３に示すように、プライマーダイマーおよび非特異的産物を形成する傾向もより少ない。（３）ＰｏｌＢ酵素は、最終ＰＣＲ産物に余分のアデノシンを付加する傾向がなく、それゆえその産物は２つのプライマーによって規定される正確な長さである。対照的に、Ｔａｑは＋１産物と正確な産物の混合物を産生する。もし均一な産物が望ましいなら、７２℃における長いＰＣＲ後のインキュベーションが必要である。
【００９２】
実施例６：不活性化ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの調製
ＫＯＤの改変を以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭシトラコン酸無水物（ＣＡＤ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＫＯＤと混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合し続けてから、保存緩衝剤に移す。上記で記載したＣＡＤ対酵素の比は、約１００対１であり、そして８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比も、酵素溶液と混合するＣＡＤの濃度を調整することによって試した。エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を、ＥＣＡ００１に関して上記で記載したようにアッセイする。
【００９３】
実施例７：２，３−ジフェニルマレイン酸無水物を用いた、不活性化ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼの調製
２，３−ジフェニルマレイン酸無水物によるＥＣＡ００１の改変を、以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭの２，３−ジフェニルマレイン酸無水物（ＤＰＭＡ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＥＣＡ００１と混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合してから、保存緩衝剤に移した。上記で記載したＤＰＭＡ対酵素の比は、約１００対１であり、そして８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比も、酵素溶液と混合するＤＰＭＡの濃度を調整することによって試した。エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を、実施例２において上記で記載したようにアッセイした。
【００９４】
我々は、ＤＰＭＡによるＥＣＡ００１の改変は、酵素の不活性化をもたらすことを見出した。９５℃で１０分間加熱することが、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を回復させた。しかし、回復した酵素は、ＰＣＲ反応において機能できなかった。
【００９５】
前述の説明および実施例は、単に本発明を説明するために述べられ、そして制限することを意図しない。本発明の精神および物質を含む、開示された実施態様の改変が当業者に起こり得るので、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲に入る全てのバリエーションを含むよう広く解釈されるべきである。さらに、本明細書中で引用された全ての参考文献の教示および開示は、その全体として参考文献に明確に組み込まれる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの可逆的不活性化のための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
非特異的増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用を長く悩ませてきており、そしてこの問題を最小限にするために、かなりの資源が費やされてきた（例えば非特許文献１を参照のこと）。反応の設定またはＰＣＲの最初の加熱期の間の、ミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長によって生じる非特異的増幅産物に関連する障害を克服するために、いくつかの「ホットスタート」ＰＣＲ技術が使用された。１つの方法において、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチド３リン酸塩、マグネシウムイオンまたは熱安定性核酸ポリメラーゼのような必須のＰＣＲ成分を、より高い温度でのみ加え、それによって非特異的ハイブリダイゼーションを有する可能性、またはミスプライミングしたオリゴヌクレオチドを伸長する可能性を抑制する。特許文献１において記載された、別の方法において、鋳型−プライマーミックスおよび残りの反応混合物の間に、固体ワックスバリアを用いる。このワックスバリアは、高い温度でのみ融解し、そのため、全ての反応成分は高い温度でのみ混合し、ミスプライミングおよびミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ。別の方法は、米国特許出願第２００６／００２９９５２Ａ１号において開示されたように、１本鎖結合タンパク質のような、１本鎖ＤＮＡ（プライマー）に熱可逆的な方式で特異的に結合する化合物を用いて、ミスプライミングしたオリゴヌクレオチドの伸長を防ぐ。核酸ポリメラーゼの、非共有結合および共有結合両方の、可逆的改変も使用された。本明細書中で全体として参考文献に組み込まれる、特許文献２は、ポリメラーゼの活性を阻害するために、核酸ポリメラーゼに特異的な抗体の使用を開示する。しかし、この方法は、操作工程の数の増加による混入のリスクを有する。これも本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｂｉｒｃｈらに対する特許文献３（「Ｂｉｒｃｈ 「１５２特許」）は、化学的または共有結合的に改変した熱安定性ポリメラーゼを用いるＰＣＲ法を記載する。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼを、ジカルボン酸無水物を用いて可逆的に不活性化し、そしてその熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを、高い温度で一定期間インキュベートした後活性化し得る。最後に、特許文献４は、アルデヒド、好ましくはホルムアルデヒドを用いた、熱安定性ポリメラーゼの可逆的不活性化を開示する。
【０００３】
ミスプライミングによる非特異的増幅とは別に、核酸増幅およびクローニングにおいて心配な別の領域は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度である（例えば非特許文献２を参照のこと）。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの低い忠実度のために、Ｐｆｕ、Ｖｎｅｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＫＯＤ、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、ｉＰｒｏｏｆＴＭ、Ｔｌｉ、およびＰｆｘを含む、いくつかの熱安定性ＰｏｌＢ酵素が開発および上市された。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと異なり、５０℃より低い温度におけるファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）の残存ポリメラーゼ活性は小さく、これらの酵素の有力ないくつかの製造業者は、それらはＰＣＲの「天然の」ホットスタートＤＮＡポリメラーゼであると主張する。しかし、これらの酵素は室温でかなりの３’−５’ヌクレアーゼ活性を示し、かなりのプライマーの分解およびプライマーの特異性の変化をもたらす。プライマーの分解は、後に行うＰＣＲの間に、ミスプライミングおよび／またはプライマーダイマーの形成をもたらし得る。例えば、いくつかの製造業者は、望ましい結果を得るために、その製品の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、よくコントロールしなければならないと使用者に警告する。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をコントロールする方法の１つは、１つはＤＮＡポリメラーゼ活性のための、および１つは３’−５’ヌクレアーゼ活性のための、酵素に結合する２つの抗体を使用することである。例えば非特許文献３を参照のこと。同グループはまた、ＰＣＲを行う温度において過剰に活性なプルーフリーディング活性を有するＫＯＤは、ＰＣＲに対して有利ではなく、そしてより低いプルーフリーディング活性を有する変異体が、より良いＰＣＲ酵素となったことを示した（非特許文献４）。この系統単独の市販の製品も入手可能である（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、ＪａｐａｎによるＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）。しかし、上記で示したように、酵素の抗体結合は混入のリスクを伴う。それに加えて、抗体は高価であり、そして調達するのが困難である。
【０００４】
よって、存在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの欠点を克服する方法および組成物の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，４１１，８７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３３８，６７１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１５２号明細書
【特許文献４】米国特許第６，１８３，９９８号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０（７）：１７１７−１７２３（１９９２）
【非特許文献２】Ｈｅｎｇｅｎ、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｆｏｒ ＰＣＲ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０（８）：３２４−３２５
【非特許文献３】Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）、１９９９、１２６：７６２−８
【非特許文献４】Ｋｕｒｏｉｔａら、Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ａｒｃｈａｅａｌ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ。Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５、３５１：２９１−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある実施態様において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを提供し、ここでその改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、基本的に水性の条件下で、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、式Ｉの改変因子（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）試薬と反応させることによって産生し、
【０００８】
【化１】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、ここでその反応は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である。特定の実施態様において、そのＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である。その改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼはまた、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質であり得る。具体的には、本発明のために適当なその改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質であり得る。より具体的には、そのＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である。
【０００９】
ある実施態様において、本発明による改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸を改変因子試薬として用いることによって得る。ある実施態様において、その改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シスアコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である。
【００１０】
ある実施態様において、本発明の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、高い温度でインキュベートすることによって復元可能である。ある実施態様において、その高い温度は、５０℃またはそれより高い、特に９５℃またはそれより高い温度である。ある実施態様において、その高い温度は、約９８℃である。
【００１１】
ある実施態様において、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元された。
【００１２】
ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元された。ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元された。
【００１３】
ある実施態様において、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の間の比は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼが改変因子試薬によって改変される前と基本的に同じ値まで復元される。
【００１４】
ある実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変するための方法を提供し、その方法は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと式Ｉの改変因子試薬とを反応させることを含む。
【００１５】
【化２】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであって、そしてここでその反応は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である。
【００１６】
ある実施態様において、本発明は、以下の工程を含む、サンプル中に含まれる標的核酸を増幅する方法を提供する：（ａ）サンプルを、標的核酸に相補的なプライマーおよび本発明による改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物と接触させる工程；および（ｂ）工程（ａ）の生じた混合物を、約５０℃より高い温度で、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを再活性化し、そしてプライマー伸長産物の形成を可能にするために十分な時間インキュベートする工程。ある実施態様において、その増幅はポリメラーゼ連鎖反応である。
【００１７】
ある実施態様において、本発明は、少なくともプライマーおよび本発明の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物を提供する。ある実施態様において、本発明は、本発明のポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物および適当な容器を含むキットを提供する。
【００１８】
本教示のこれらの特徴および他の特徴が、本明細書中の説明からより明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の他の目的、利点、および新規な特徴が、付随する図面を組み合わせて考える場合に、以下の詳細な説明から明らかになる。当業者は、下記で記載する図面は、説明目的のためのみであることを理解する。その図面は、いかなる方法においても、本教示の範囲を制限することを意図しない。
【図１】図１は、ＥＣＡ００１Ｇが、活性化の前に検出可能なポリメラーゼ活性（Ｐｏｌとして表される）およびエキソヌクレアーゼ活性（Ｅｘｏとして表される）を有さないが、活性化後は両方の活性を示したことを示す。（詳細は実施例２．１を参照のこと）
【図２】図２は、再活性化に対するｐＨの影響を示す。（詳細は実施例２．２を参照のこと）
【図３】図３は、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが、ＥＣＡ００１Ｇｏｌｄより特異的でないＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄよりも多くの非特異的産物を産生することを示す。（詳細は実施例３を参照のこと）
【図４】図４は、それぞれのピーク活性と比較して、室温で、ＰｏｌＢ酵素が、Ｔａｑよりも低いポリメラーゼ活性を有することを示す。
【図５】図５は、改変および再活性化後、ＡｍｐｌｉＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性の比が変化したことを示す。（詳細は実施例５を参照のこと）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
ＤＮＡポリメラーゼは、当業者に公知である。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを鋳型として用いるＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、またはＲＮＡを鋳型として用いる、逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性ポリメラーゼを含む。
【００２１】
配列相同性に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼは７つの異なるファミリー：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに細分し得る。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、６つのファミリー（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、およびＹ）のうち１つに含まれ、ほとんどが３つのファミリー（Ａ、Ｂ、およびＣ）のうち１つに含まれる。例えばＩｔｏら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０４５−４０５７；Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：７８７−８０２；Ｆｉｌｅｅら（２００２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．５４：７６３−７７３；およびＡｌｂａ（２００１）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．２：３００２．１−３００２．４を参照のこと。あるＤＮＡポリメラーゼは、１本鎖ポリペプチド（例えばあるファミリーＡおよびファミリーＢのポリメラーゼ）、またはサブユニットの１つがポリメラーゼ活性を有する、複数サブユニットの酵素（例えばあるファミリーＣポリメラーゼ）であり得る。同上文献。融合タンパク質は、ファミリーＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、またはＹのポリメラーゼから選択されるＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００２２】
ファミリーＡのポリメラーゼ（「ＰｏｌＡ」）は、複製ポリメラーゼおよび修復ポリメラーゼを両方含む。このファミリーの複製メンバーは、広範囲に研究されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼおよび真核生物ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼｙを含む。修復ポリメラーゼには、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ＰｏｌＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＰｏｌＩ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＰｏｌＩが含まれる。これらの修復ポリメラーゼは、切除修復およびラギング鎖合成の間に産生される岡崎フラグメントのプロセシングに関与する。ほとんどの熱安定性ＰｏｌＡ酵素は、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を有さないので、それらは新規に合成された核酸鎖をプルーフリーディングすることができず、そして従って高いエラー率を有する。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、市販されているポリメラーゼの中で最も高いエラー率の１つを有することが公知である。
【００２３】
ファミリーＢのポリメラーゼ（「ＰｏｌＢ」）は主に複製ポリメラーゼを含み、そして主な真核生物ＤＮＡポリメラーゼα、δ、εおよびＤＮＡポリメラーゼζも含む。ＰｏｌＢポリメラーゼはまた、いくつかの細菌およびバクテリオファージによってコードされるＤＮＡポリメラーゼを含み、そのうち最もよく特徴付けられているのがＴ４バクテリオファージ、Ｐｈｉ２９バクテリオファージ、およびＲＢ６９バクテリオファージ由来のものである。これらの酵素は、リーディング鎖およびラギング鎖両方の合成に関与する。ポリメラーゼのＰｏｌＢファミリーの特徴は、複製中のその顕著な正確性および多くが強力な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有することである（プルーフリーディング活性を有さないＤＮＡポリメラーゼαおよびζを除く）。
【００２４】
その結晶構造に基づいて、熱安定性ＰｏｌＢ酵素は、ドーナツ様の構造を有する（例えばＨｏｐｆｎｅｒら、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｔｙｐｅ Ｂ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６：３６００−５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ ＫＯＤ１．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）３０６：４６９−７７を参照のこと）。その酵素は、ポリメラーゼ活性の活性部位として中心部に大きな凹部を有する。中心部から突出するが「ドーナツ」の表面上にあるのは、それぞれ２本鎖ＤＮＡの結合、１本鎖鋳型の結合、およびプライマーの３’末端におけるエラーを編集するための、それぞれ裂け目Ｄ、裂け目Ｔおよび裂け目Ｅと名付けられた３つの裂け目である（Ｈｏｐｆｎｅｒら、前出）。プルーフリーディング活性中心が存在する裂け目Ｅは、ポリメラーゼ活性中心が存在する中央の凹部よりかない狭い。
【００２５】
本発明者は、裂け目Ｅは、シトラコン酸無水物のような小さい改変試薬によって容易に接近可能であるが、ジフェニルマレイン酸無水物のような大きな対応物によっては容易に接近できないことを発見した。改変試薬を注意深く選択することによって、様々な実施態様において、本発明は、２つの酵素活性の間の適当な比を維持しながら、低い温度（例えば５０℃またはそれより低い）におけるＰｏｌＢのＤＮＡポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方の不活性化、および高い温度における両方の酵素活性の復元を達成し得る。そのような適当な比が、満足のいくＰＣＲ結果のために重要であることが容易に認識される。例えば、もしエキソヌクレアーゼ活性が、ポリメラーゼ活性と比較して高過ぎるなら、意味のある鎖の伸長を達成することは不可能であり、少なくとも十分に長いＰＣＲ産物を得ることは困難である。他方、もしエキソヌクレアーゼ活性が、ポリメラーゼ活性と比較して低過ぎるなら、不適切なプルーフリーディングおよび高いエラー率が生じる。
【００２６】
今や驚くべきことに、あるジカルボン酸無水物、特に十分に小さい置換基を環に有するジカルボン酸無水物は、プルーフリーディング活性中心が存在するＰｏｌＢポリメラーゼの裂け目Ｅに近づくことができ、そしてポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を不活性化し、ならびにＰｏｌＢ酵素の５’−３’ポリメラーゼ活性を不活性化できることが発見されている。そのヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性はどちらも熱再活性化工程後に回復が可能であり、その２つの活性の適当な比を維持して、高い忠実度および高い効率のＤＮＡ増幅を達成する。言い換えると、今や驚くべきことに、小さいジカルボン酸無水物によるＰｏｌＢ酵素の熱可逆的改変により、プライマーダイマーの形成を排除するが、高い増幅忠実度を可能にし得ることが発見された。
【００２７】
よって、様々な実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを可逆的に不活性化するための方法および組成物、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ、および「ホットスタートＰＣＲ」を行うことに関しその酵素を用いるための方法および試薬を提供する。
【００２８】
熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ
あらゆる熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、本発明の方法によって可逆的に不活性化し得る。上記で議論したように、ＤＮＡポリメラーゼのＢファミリーの特徴は、複製中のその顕著な正確性でありそして多くが強力な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を持ち、そしてＰｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、およびＰｆｘとして記載されるものを含むいくつかの熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは市販されているか、あるいはＶｅｎｔ（登録商標）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、ｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されており、および米国特許出願第２００６０２２８７２６号において開示された融合タンパク質である。本発明のために適当な熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＰｏｌＢポリメラーゼおよびキメラポリメラーゼまたは組換えＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００２９】
ある実施態様において、本発明のために適当なＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼであるかまたはポリメラーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含み得る。あるそのような実施態様において、そのファミリーＢのポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属、またはＰｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ属由来のポリメラーゼのような、古細菌ファミリーＢのポリメラーゼである。あるそのような実施態様において、そのファミリーＢのポリメラーゼは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼであるかまたはポリメラーゼ活性を有するその断片またはその変異体である。ある実施態様において、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの変異体は、少なくとも５０％、７０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のＰｆｕとの同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００３０】
ある化学的改変因子
様々な実施態様において、本発明は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変して、それによって３’−５’エキソヌクレアーゼ活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性が完全にまたはほとんど完全に不活性化され、そしてその不活性化は適当な条件下で高い温度において逆転し得る方法に関連する。
【００３１】
本発明のある実施態様によって、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、適当な化学的化合物または化学的改変因子と反応することによって、可逆的に不活性化される。好ましくは、その化学的改変因子は、ジカルボン酸無水物であり得る。上記で示したように、ＤＮＡポリメラーゼ活性の可逆的不活性化は、活性部位のリシンのε−アミノ基をブロックすることによって、酵素を可逆的に不活性化することが当該技術分野で公知であった。しかし、５’−３’ポリメラーゼの活性部位および３’−５’エキソヌクレアーゼの活性部位が、ジカルボン酸無水物分子によって可逆的に不活性化され、得られた再活性化ポリメラーゼがＰＣＲにおいて機能し得るかどうかは今まで未知であった。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本発明のための化学的改変因子は、式Ｉのジカルボン酸無水物を含み：
【００３３】
【化３】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルである。Ｒ１およびＲ２は、炭素−炭素結合または炭素−酸素結合、炭素−窒素結合、または炭素−硫黄結合のような、炭素−ヘテロ原子結合によって、環に直接結合し得る。有機基（ｒａｄｉｃａｌ）も、例えば３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物におけるように、お互いに連結して環構造を形成し得る。
【００３４】
ジカルボン酸無水物は、タンパク質のアミノ基と反応して、対応するアシル化産物を生じることが公知である（例えば米国特許第５，６７７，１５２号を参照のこと）。アシル化反応および脱アシル化反応の両方の妥当なメカニズムの説明に関して、本明細書中で参考文献に組み込まれる、Ｐａｌａｃｉａｎら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７：１０１−１１１も参照のこと。ｃｉｓ−炭素−炭素二重結合、および潜在的に他の置換基は、アミド基との相互作用、および続く脱アシル化にとって適当な空間的配向にある、アシル化残基の末端カルボキシル基を維持するので、上記ジカルボン酸無水物の可逆性を増強すると考えられる。
【００３５】
本発明に適当な適した化学的改変試薬の例は、無水マレイン酸；シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、および２，３−ジメチルマレイン酸無水物のような置換無水マレイン酸；エキソ−シス−３，６−エンドキソ（ｅｎｄｏｘｏ）−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；および３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物を含む。その試薬は、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．(Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．)、またはＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．（Ｇａｒｄｅｎａ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。置換無水マレイン酸試薬シトラコン酸無水物およびシス−アコニット酸無水物を用いた、ＰｏｌＢ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの改変を、実施例で記載する。
【００３６】
可逆的に不活性化された熱安定性酵素の調製
いくつかの実施態様において、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼの改変は、ＰｏｌＢ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の分子を、適当な温度で、例えば４℃で、一般的に水性条件下のアルカリ性ｐＨで、酵素の活性を許容可能なレベルまで抑制するのに十分な時間、化学的改変因子と反応させる工程を含む。
【００３７】
その改変は、典型的には１時間から１２時間の反応時間内に、または６０分未満で、最も好ましくは１５分から３０分未満で行い得るが、これは使用する試薬に幾分依存して変動する。
【００３８】
適当な反応条件は当該技術分野で公知であり、そして本明細書中および本実施例においてさらに記載される。リシン残基の化学的改変は、アルカリ性ｐＨにおいて有利であることが公知である。その改変反応を、ｐＨ７−１０で、好ましくはｐＨ７．０およびｐＨ９．０の間で、またはより好ましくは７−８．５の間で、水性緩衝剤中で、室温またはそれより低い温度において行う。加水分解の速度はｐＨと共に増加するが、約９より高いｐＨで起こる加水分解は、タンパク質の最適以下のアシル化をもたらし得る。
【００３９】
その反応は約１時間のインキュベーション後実質的に完了するが、１２−２４時間の間で続き得る。
【００４０】
ジカルボン酸無水物は、水と容易に反応して対応する酸を生じる。従って、試薬の大部分はタンパク質のアミノ基の改変の間に加水分解される。
【００４１】
一般的に、タンパク質と比較してモル過剰の改変因子試薬をアシル化反応に用い、そして最適なモル比を経験的に決定する。例として、ＥＣＡ００１は、２０倍またはそれより高いモル過剰のシトラコン酸無水物との反応によって、基本的に完全に不活性化される（もとの活性の５％未満、好ましくは１％未満、より好ましくは０．１％未満）。
【００４２】
本発明の方法において、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、両方とも完全に不活性化される（そのもとの活性の１％未満）、またはほとんど完全に不活性化される（そのもとの活性の５％未満）。本発明の改変された熱安定性酵素は、３７℃でアッセイした場合、３７℃で１時間またはそれを超えてインキュベートした後でさえ、いかなる有意な検出可能な活性も有さない。他方、本化学的に改変された酵素の酵素活性は、より高い温度において、すなわち約５０℃で、好ましくは７５℃から１００℃の温度で、そして最も好ましくは９８℃でインキュベートした場合、３０分以内に３倍増加する。そのような化学的に改変された酵素を、ＤＮＡ増幅、ライゲーション、エキソヌクレアーゼ反応またはエンドヌクレアーゼ反応のような、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む全ての適用において採用し得る。
【００４３】
本発明の熱で活性化が可能な酵素の重要な局面は、その保存安定性である。一般的に、本明細書中で記載された酵素は、長期間安定であり、それは各使用直前の調製の必要性を排除する。例えば、シトラコニル化ＥＣＡ００１は、２５℃で保存した場合、少なくとも４週間不活性なままであることが見出された。
【００４４】
増幅方法
本発明の熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、プライマーに基づく核酸合成または増幅反応に使用し得る。本発明の方法は、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応混合物を使用して、その反応混合物を増幅反応の前に、または不可欠な一部として、高温インキュベーションにかける工程を含む。高温インキュベーションは、アミノ基の脱アシル化およびポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性両方の回復をもたらす。
【００４５】
改変アミノ基の脱アシル化、および酵素活性の再活性化は、温度の増加および同時に起こるｐＨの低下の両方から起こる。増幅反応は、典型的には８．０から９．０までのｐＨに調合されたＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤中で、室温で行う。室温において、アルカリ性の反応緩衝剤条件は、アミノ基のアシル化形式に有利である。反応緩衝剤のｐＨは室温で８．０から９．０までのｐＨに調整されるが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ反応緩衝剤のｐＨは、温度の増加と共に低下する。従って、反応緩衝剤のｐＨは、増幅が行われる、そして特に活性化インキュベーションが行われる高い温度において低下する。反応緩衝剤のｐＨの低下は、アミノ基の脱アシル化に有利である。
【００４６】
反応に使用する緩衝剤システムによって、高温反応条件の結果として起こるｐＨ変化を決まるということはよく認識されており、そして生物学的反応において使用される様々な緩衝剤のｐＨの温度依存性は周知である（例えばＧｏｏｄら、１９６６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５（２）：４６７−４７７を参照のこと）。増幅反応は、典型的にはＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤中で行われるが、温度によってより小さいかまたは大きいｐＨの変化を示す緩衝剤中で増幅反応を行い得る。使用する緩衝剤に応じて、幾分安定な改変酵素が望ましいであろう。例えば、安定がより低い改変酵素を生じる改変試薬を使用する場合、より小さな緩衝剤ｐＨの変化の下での十分な酵素活性の回復が求められる。
【００４７】
改変酵素の活性化は、好ましくはプライマーの結合特異性を保証するために増幅反応において使用されるプライマーのハイブリダイゼーション（アニーリング）温度と同じかまたはそれより高い温度におけるインキュベーションによって達成される。酵素活性を回復するために必要なインキュベーションの長さは、反応混合物の温度およびｐＨ、および改変酵素の調製に使用された改変因子試薬に依存する酵素のアシル化アミノ基の安定性に依存する。広い範囲のインキュベーション条件が使用可能である；最適な条件を、各反応に関して経験的に決定し得る。一般的に、増幅反応緩衝剤中で、約５０℃より高い温度で、約１秒と約２０分の間の時間、インキュベーションを行う。例証されない酵素の再活性化、または例証されない反応混合物に関するインキュベーション条件の最適化を、本明細書中で提供されたガイダンスに従って日常的な実験によって決定し得る。
【００４８】
好ましい実施態様において、ＰＣＲ増幅を、可逆的に不活性化された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて行う。ＰＣＲ増幅において使用されるアニーリング温度は、典型的には約５０−７５℃であり、そして反応前インキュベーションを、アニーリング温度と同じかまたはそれより高い温度で、好ましくは約９０℃より高い温度で行う。増幅反応混合物を、好ましくは約９０−１００℃で、約１２分までインキュベートして、温度サイクリングの前にＤＮＡポリメラーゼを再活性化する。典型的なＰＣＲ増幅のための適当な反応前インキュベーション条件は、反応前インキュベーション条件を変動することの増幅に対する影響と共に、実施例において記載される。
【００４９】
典型的なＰＣＲ増幅の最初の工程は、２本鎖標的核酸の熱変性を含む。サンプル核酸の変性に必要な正確な条件は、サンプル核酸の長さおよび組成に依存する。典型的には、９０−１００℃における、約１０秒から最大約４分までのインキュベーションが、サンプル核酸を完全に変性するために有効である。最初の変性工程は、ＤＮＡポリメラーゼを再活性化するための反応前インキュベーションとなり得る。しかし、最初の変性工程の長さおよび温度に依存して、そしてＤＮＡポリメラーゼを不活性化するために使用された改変因子に依存して、ＤＮＡポリメラーゼ活性の回復は不完全であり得る。もし酵素活性の最大限の回復が望ましいなら、反応前インキュベーションを延長してよいか、あるいは、増幅サイクルの数を増やすことができる。
【００５０】
ある実施態様において、その改変酵素および最初の変性条件を、回復可能な酵素活性の一部のみが最初のインキュベーション工程の間に回復されるように選択する。それぞれ高温の変性工程を含む、続くＰＣＲのサイクルが、酵素活性のさらなる回復をもたらす。従って、酵素活性の活性化は、増幅の最初のサイクルの後まで遅れる。ＤＮＡポリメラーゼ活性のこの「持続性」により、非特異的増幅がさらに減少することが観察された。過剰なＤＮＡポリメラーゼが非特異的増幅に寄与することが公知である。本方法において、標的配列の数が少ない増幅の最初の段階の間は、存在するＤＮＡポリメラーゼ活性の量が低く、それは形成される非特異的伸長産物の量を抑制する。標的配列の数が多い増幅の後期の段階の間は、最大のＤＮＡポリメラーゼ活性が存在し、そしてそれによって高い増幅収量が可能となる。もし必要なら、最初のサイクルに存在するＤＮＡポリメラーゼ活性の量の低さを補うために、増幅サイクルの数を増加させ得る。
【００５１】
本発明の方法の利点は、その方法が、反応混合物を最初に調製した後に、その反応混合物の操作を必要としないことである。従って、その方法は、最初の変性工程後に試薬を加えること、またはワックスバリアを使用することが不便であるかまたは非実用的である、自動化増幅システムにおいて、およびインサイツ増幅方法と共に使用するために理想的である。
【００５２】
本発明の方法は、高い重合忠実度を有するＰＣＲにおいて非特異的増幅の抑制のために特に適当である。よって、本発明の組成物および方法は、ゲノミクス研究におけるような、標的核酸配列の増幅のため、およびそのような長い配列のクローニングのために特に適当である。
【００５３】
しかし、本発明の方法および組成物は、いかなる特定の増幅システムにも制限されない。本発明の可逆的に不活性化された酵素を、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、そして増幅の特異性を達成するために反応温度に依存する、あらゆるプライマーに基づく増幅システムにおいて使用し得る。本方法を、熱安定性の酵素を用いる、等温増幅システムに適用し得る。酵素活性を回復するために、高い温度における一時的なインキュベーションのみが必要である。酵素活性を回復するために反応混合物を高温インキュベーションにかけた後、適当な反応温度で反応を行う。ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；および同第４，９６５，１８８号）に加えて、他の増幅方法は、以下のものを含むがこれに限らない：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９およびＢａｒａｎｙ、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ、１９９１、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ．１：５−１６）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９０／０１０６９号）；修復連鎖反応（欧州特許公開第４３９，１８２Ａ２号）；３ＳＲ（Ｋｗｏｈら １９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７；Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９２／０８８０Ａ号）、およびＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号）。上記の参考文献は全て、本明細書中で参考文献に組み込まれる。本発明は、いかなる特定の増幅システムにも制限されない。他のシステムが開発される場合、それらのシステムは本発明の実施によって利益を得ることができる。増幅システムの最近の調査が、本明細書中で参考文献に組み込まれる、ＡｂｒａｍｓｏｎおよびＭｙｅｒｓ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４１−４７において刊行された。
【００５４】
各増幅反応のために適当なサンプル調製方法が、当該技術分野において記載される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出、および上記で引用した増幅方法を記載する参考文献を参照のこと）。標的配列のＰＣＲ増幅のためのサンプルを調製する簡単かつ迅速な方法が、Ｈｉｇｕｃｈｉ、１９８９のＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において、およびＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１８−２０章（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）において記載されており、それらはどちらも本明細書中で参考文献に組み込まれる。当業者は、適当なプロトコールを選択しかつ経験的に最適化し得る。
【００５５】
増幅産物を検出するための方法は、文献において広範囲に記載されている。標準的な方法は、ゲル電気泳動によるかまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによる分析を含む。プローブと増幅された核酸の間に形成されたハイブリッドの検出を、Ｓａｉｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６；Ｓａｉｋｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０；ＰＣＴ特許公開第８９／１１５４８号；米国特許第５，００８，１８２号および同第５，１７６，７７５号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）：３３７−３４７を含む、ドットブロットアッセイ形式およびリバースドットブロットアッセイ形式を含む、様々な形式において行い得、それらはそれぞれ本明細書中において参考文献に組み込まれる。マイクロウェルプレートを用いるリバースドットブロット法が、例えば米国特許第５，２３２，８２９号；Ｌｏｅｆｆｅｌｈｏｌｚら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０（１１）：２８４７−２８５１；Ｍｕｌｄｅｒら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２（２）：２９２−３００；およびＪａｃｋｓｏｎら、１９９１、ＡＩＤＳ ５：１４６３−１４６７において記載され、それらはそれぞれ本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００５６】
５’ヌクレアーゼアッセイと呼ばれる、別の適当なアッセイ方法が、米国特許第５，２１０，０１５号およびＨｏｌｌａｎｄら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７２７６−７２８０において記載され、それらはどちらも本明細書中で参考文献に組み込まれる。５’ヌクレアーゼアッセイにおいて、標識プローブが、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性によるプライマー伸長と同時に分解される。プローブ分解産物の検出により、プローブと標的ＤＮＡの間のハイブリダイゼーションが起こったこと、および増幅反応が起こったことの両方が示される。
【００５７】
反応混合物における２本鎖ＤＮＡの全量の増加をモニターすることによる、核酸の増幅を検出する代替方法が、Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３−４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６−１０３０；および欧州特許公開第４８７，２１８号および同第５１２，３３４号において記載され、それらはそれぞれ本明細書中で参考文献に組み込まれる。２本鎖標的ＤＮＡの検出は、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）および他のＤＮＡ結合標識が、２本鎖ＤＮＡに結合した場合に示す蛍光の増加に依存する。標的配列の合成から生じる２本鎖ＤＮＡの増加は、蛍光の検出可能な増加をもたらす。この方法における問題は、非標的配列の合成、すなわち非特異的増幅が、蛍光の増加をもたらし、それが標的配列の合成から生じる蛍光の増加の測定を妨害することである。従って、本発明の方法は、非特異的増幅を抑制し、それによって非標的配列の増幅から生じる蛍光の増加を最小限にするので、特に有用である。
【００５８】
上記で記載したような、改変した、不活性化核酸ポリメラーゼを使用することに加えて、反応混合物における核酸の融解反応に影響を与える添加物を用いることによって、ＰＣＲ反応を改善し得る。例えば、非特異的産物を生じる反応のような、困難なＰＣＲ増幅、および特に高いＧＣ含有量を有するか、または大規模な２次構造を有する鋳型の増幅を、ＡＴ−およびＧＣ−塩基対形成をＡＴ−塩基対の安定性のレベルまで「等しく安定化する（ｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ）」添加物を採用することによって改善し得る。適当なそのようなＰＣＲ添加物は、多機能性ポリオール、好ましくは三機能性ポリオール、最も好ましくはグリセロール；アミド、好ましくはカルバミド、最も好ましくはホルムアミド；アルカリ性アンモニア塩、好ましくはアルキル化アンモニア塩、最も好ましくは塩化テトラメチルアンモニウム；スルホキシド、好ましくはアルキル化スルホキシド、最も好ましくはジメチルスルホキシド；硫酸塩、好ましくは無機硫酸塩、最も好ましくは硫酸アンモニウムポリアルキレングリコール、最も好ましくはポリエチレングリコールを含む。さらに、ＳＳＢタンパク質（１本鎖結合タンパク質）、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚら、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＳＢ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１０７９（１９９０）を参照のこと）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、または酵母ＳＳＢタンパク質も使用し得る。好ましいＰＣＲ添加物はまた、仔ウシ胸腺タンパク質ＵＰ１（Ａｍｒｕｔｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３（２７）：８２８２−８２９１（１９９４）を参照のこと）を含む。
【００５９】
この目的のために特に好ましいＰＣＲ添加物は、ベタイン（１−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−メタンアミニウム分子内塩）および他の−ＯＯＣ−ＣＨ２−ＮＭｅ３＋基（集合的に「ベタイン」）によって特徴付けられる双性イオン塩基である。そのＰＣＲ添加物を、増幅産物の特異性を改善するために有効な量で、ＰＣＲ反応混合物に有利に加える。典型的には１ｍＭから５Ｍまでの、好ましくは約１Ｍの添加物の濃度を用いるが、添加物の非存在下で行ったＰＣＲ反応物と比較して、特異的増幅産物の収量を改善するあらゆる量が適当である。
【００６０】
逆転写を含むＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応において、本発明の材料および方法は、さらなる操作工程によって酵素反応を中断することなく、１つの容器において連続的な反応を行うことを可能にする。
【００６１】
本発明はまた、キット、本方法を実施するために有用な成分を含む複数容器のユニットに関連する。有用なキットは、可逆的に不活性化された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ、およびオリゴヌクレオチドプライマー、基質ヌクレオシド３リン酸塩、補助因子、および適当な緩衝剤のような、増幅反応を行うための１つまたはそれを超える試薬を含む。
【００６２】
ある実施態様において、本発明は、Ｔｒｉｓ緩衝化反応緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝化反応混合物と共に、そのような不活性化された熱安定性酵素を含むキットに関連する。
【００６３】
ある実施態様において、本発明は、さらなる操作工程による酵素反応の中断無しに、単一の反応チューブにおいて連続的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うための、不活性化ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせたＲＮアーゼＨ陽性逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ陰性逆転写酵素の使用に関連する。
【００６４】
下記に示す本発明の実施例は、説明目的のためのみに提供され、そして本発明の範囲を制限しない。実施例に続く特許請求の範囲内の、本発明の多くの実施態様が、前述の本文および以下の実施例を読むことより当業者に明らかである。
【００６５】
分子生物学の適用、酵素学、タンパク質化学および核酸化学の標準的なプロトコールが、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （ＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ編、１９９５）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．のような、印刷された出版物においてよく記載されている。本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、および出版物は、参考文献に組み込まれる。
【００６６】
本教示の局面は、以下の実施例に照らしてさらに理解され得るが、それらはいかなる方法においても本教示の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６７】
実施例１ ＥＣＡ００１の改変
ＥＣＡ００１と呼ばれる、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質を、本発明の方法による改変のために使用した。ＥＣＡ００１は、全長のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼのＣ末端に結合した、ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｎ Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ由来の核酸結合ポリペプチドＰａｅ３１９２を含む。ＥＣＡ００１は、米国特許出願第２００６０２２８７２６号において１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２と記載され、それは本明細書中でその全体として参考文献に組み込まれる。ＥＣＡ００１を以下のように構築した。全長ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列を、Ｐａｅ３１９２をコードするポリヌクレオチド配列と共にフレームに含むＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限断片を、標準的な組換え法を用いて、ｐＥＴ１６ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）のＮｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位にクローニングした。得られた組換えベクター（ｐＤＳ２ｒ）は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙペプチドリンカーによって、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼのＣ末端に結合したＰａｅ３１９２を含む融合タンパク質をコードする。１０×Ｈｉｓ親和性タグが、融合タンパク質のＮ末端に存在する。
【００６８】
ＥＣＡ００１の改変を、以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭのシトラコン酸無水物（ＣＡＤ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＥＣＡ００１と混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合し続けてから、保存緩衝剤に移した。上記で記載したＣＡＤ対酵素比は約１００対１であり、そして酵素溶液と混合するＣＡＤの濃度を調整することによって、８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比を使用し得る。
【００６９】
得られた改変タンパク質を、ＥＣＡ００１ＧｏｌｄまたはＥＣＡ００１Ｇと呼ぶ。
【００７０】
実施例２ 改変ＥＣＡ００１Ｇは、検出可能なＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’ヌクレアーゼ活性を有さない
この実施例は、（１）改変後、活性化の前にはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’ヌクレアーゼ活性は検出されず、そして熱活性化後検出可能となること；（２）ＥＣＡ００１Ｇは、ｐＨ８において最適に活性化され、そして活性化された酵素はＰＣＲにおいて有用であること；（３）ＥＣＡ００１Ｇは、プライマーダイマーの形成を排除することによって、ＰＣＲを改善することを示す。
【００７１】
実施例２．１ この実施例は、ＥＣＡ００１Ｇは、活性化の前にはポリメラーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性の両方において不活性であるが、そのような活性は、熱活性化の後に復活することを実証することを意図する。この目的のために、２つの活性アッセイ、ポリメラーゼ活性アッセイおよびエキソヌクレアーゼ活性アッセイを用いて、（１）改変前、（２）改変後だが再活性化前、および（３）改変してかつ再活性化後に、それぞれタンパク質サンプルを試験した。
【００７２】
活性アッセイは、１×ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ緩衝剤、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、および５００ｎＭの基質を含む。ポリメラーゼ活性アッセイに関して、５’から３’への以下の配列を有するＰｏｌｓｕｂ１４と呼ばれる基質を用いる：
【００７３】
【化４】
ここで、ＢＨＱ１はＢｌａｃｋｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｎｏｖａｔｏ、Ｃａｌｉｆ．の製品であり、そしてＦＡＭ−ｄＴは塩基にフルオレセイン（ＦＡＭ）が結合したデオキシチミンである。ＦＡＭは、５２０ｎｍで発光するフルオロフォアであり、そしてＢＨＱ１（登録商標）が近傍に留まる場合それによって消光し得る。その構造を下記に示す：
【００７４】
【化５】
Ｐｏｌｓｕｂ１４は、下記に示すように、ポリメラーゼ活性をアッセイするその天然の状態においてヘアピン構造が想定されている：
【００７５】
【化６】
最後から２番目の位置でｄＴの塩基に結合したフルオレセイン（ＦＡＭ）ＦＲＥＴドナーは、主に１本鎖領域によってＢＨＱ１から離されている。この配置は、ＢＨＱ１がフルオレセインを有効に消光することを可能にする。一旦基質がポリマー化したら、１本鎖領域は、下記に示すように２本鎖になり：
【００７６】
【化７】
それはより硬い２本鎖ＤＮＡによってＢＨＱ１をフルオレセインから離し、フルオレセインを発光させる。
【００７７】
３’−５’ヌクレアーゼアッセイに関して、基質（Ｅｘｏ−ＭＭ ＨＰ）は、配列
【００７８】
【化８】
を有し、それも天然の状態で下記に示すヘアピン構造を形成する。
【００７９】
【化９】
この基質は、２つの特徴を有する：（１）３’末端においてｄＴの塩基に結合したＦＡＭは、ＢＨＱ１によって消光される；（２）ＦＡＭが結合しているｄＴは鋳型とミスマッチである。ＰｏｌＢ酵素がこのヘアピンに結合した場合、３’−５’ヌクレアーゼ活性がそのミスマッチを認識し、そしてそれに結合したＦＡＭと共に塩基を切除し、ＦＡＭの発光をもたらす。
【００８０】
反応緩衝剤において、基質無しで、９８℃で１０分間、活性化を行った。図１は、１００μｌ中の１．５ユニットの酵素に関する活性化前および後の、６０℃において決定した活性を示す。
【００８１】
図１に示すように、ＥＣＡ００１Ｇ（００１Ｇと呼ばれる）は、活性化前には検出可能なポリメラーゼ活性を示さなかったが、活性化後には活性を示した（Ａｃｔ００１Ｇと呼ばれる）。非改変酵素、ＥＣＡ００１Ｇ（００１と呼ばれる）をコントロールとして用いた。
【００８２】
実施例２．２ この実施例は、ＥＣＡ００１ＧがｐＨ８において最適に活性化され、そして活性化された酵素はＰＣＲにおいて有用であることを実証するために役立つ。
【００８３】
ＰＣＲ反応を、ｐＨ８、ｐＨ８．５、およびｐＨ９のそれぞれにおいて、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、全長のＧＡＰＤＨｃＤＮＡクローンを含む１０５コピーのプラスミド、およびそれぞれ５００ｎＭのＧＡＰＤＨ前向き（ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ）（配列番号３）およびＧＡＰＤＨ逆向き（ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ）（配列番号４）プライマーを含む、５０ｍＭのＴｒｉｓ中で、５ユニット／１００μｌのＥＣＡ００１Ｇを用いて行った。サイクリング条件は、９８℃における１０分間の活性化と、それに続く９８℃で１５秒間および６０℃で１分間の４０サイクルであった。サイクリングが終了した後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。その結果を図２に示す。ｐＨ８における活性化が、最も高い収量を生じた；一方ｐＨ８．５は最適以下の収量を生じ、そしてｐＨ９は増幅産物を生じなかった。
【００８４】
実施例３．ＥＣＡ００１Ｇは、厳しいＰＣＲ条件下で標的核酸をうまく増幅した
この実験は、厳しいＰＣＲ条件下におけるＥＣＡ００１Ｇの有用性を実証する。これらの条件下で、もしホットスタート技術が採用されなかったら、ＰＣＲ反応混合物においてプライマーダイマーが形成する傾向がある。ホットスタートの性質によって、ＰＣＲ反応はプライマーダイマーがないか、またはプライマーダイマーによる妨害の減少を示す。
【００８５】
この実施例は、ＰＣＲ Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙと呼ばれる反応を含み、それはそれぞれ３つのセットのプライマーを含む。そのプライマーのセットは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．から市販されている。具体的にはセット１はＨｓ００３７８３６３＿ｇ１；セット２はＨｓ００３９９５７２＿ｍ１およびセット３はＨｓ００３７２８５９＿ｍ１である。
【００８６】
その成分を下記に列挙する：
１×ＰＣＲ緩衝剤
１×ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ
５０ユニット／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼ
１×プライマーミックス
および０．８ｎｇ／μｌのｃＤＮＡ（ヒト）
個々のポリメラーゼの必要性のために、１×緩衝剤および１×ＭｇＣｌ２は下記に示すように異なる：
【００８７】
【表１】
ＥＣＡ００１のサイクリング条件を下記に列挙する：
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９８℃で３０秒間
４０サイクルの
９８℃で５秒間
６０℃で１分間
ＥＣＡ００１−Ｇｏｌｄのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で１０分間
４０サイクルの
９８℃で５秒間
６０℃で１分間
ＡｍｐｌｉＴａｑのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で３０秒間
４０サイクルの
９５℃で１０秒間
６０℃で１分間
ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄのサイクリング条件
プレインキュベーション ２５℃で６０分間
９５℃で１０分間
４０サイクルの
９５℃で１０秒間
６０℃で１分間
各反応を、２組で行った。サイクリング後、産物を図３に示すようにエチジウムブロミドアガロースゲルに流した。
【００８８】
図３は、ＡｍｐｌｉＴａｑが、記載した条件下で３つのプライマーセット全てに関して、主に非特異的／プライマーダイマー産物を産生したが、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄは主に特異的産物を産生することを示す。ＥＣＡ００１は、生来ＡｍｐｌｉＴａｑよりも非特異的産物の形成またはプライマーダイマーの形成が少なく、そしてＥＣＡ００１Ｇは非特異的産物／プライマーダイマーの産生を示さなかった。これらのＥＣＡ００１Ｇの結果は、非特異的産物を欠くことに関してＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄの結果に匹敵するが、ＥＣＡ００１Ｇからの収量は、特にプライマーセット２に関して、Ｔａｑ Ｇｏｌｄの収量より多かった。
【００８９】
実施例４ ＰｏｌＢ酵素は、室温においてＴａｑよりも低いポリメラーゼ活性を有する
ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、室温において比較的低いポリメラーゼ活性を有するが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは依然としてそのピーク活性の＞５％を保持する（図４）。
【００９０】
実施例５：エキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性比は、活性化後も変化しない
我々のデータ(図３)は、プライマーダイマーまたは非特異的産物を形成する傾向が殆どないことを示した。リシンは多くの酵素において見出し得る、よくあるアミノ酸であることは本当である。Ｂｉｒｃｈ’１５２特許における化学物質は、我々の手で、Ｔａｑの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性（プルーフリーディング活性とは異なる）を改変し得ることが証明された。しかし、エキソヌクレアーゼ活性対ポリメラーゼ活性比は変化した（図５）。
【００９１】
一般的な酵素、Ｔａｑの代わりにＰｏｌＢ酵素を使用するいくつかの利点が存在する。（１）ＰｏｌＢ酵素はプルーフリーディング活性を有しており、従って、ＰＣＲ産物のエラー率は典型的には有意により低い。（２）ＰｏｌＢ酵素は、ＥＣＡ００１と同様、図３に示すように、プライマーダイマーおよび非特異的産物を形成する傾向もより少ない。（３）ＰｏｌＢ酵素は、最終ＰＣＲ産物に余分のアデノシンを付加する傾向がなく、それゆえその産物は２つのプライマーによって規定される正確な長さである。対照的に、Ｔａｑは＋１産物と正確な産物の混合物を産生する。もし均一な産物が望ましいなら、７２℃における長いＰＣＲ後のインキュベーションが必要である。
【００９２】
実施例６：不活性化ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの調製
ＫＯＤの改変を以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭシトラコン酸無水物（ＣＡＤ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＫＯＤと混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合し続けてから、保存緩衝剤に移す。上記で記載したＣＡＤ対酵素の比は、約１００対１であり、そして８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比も、酵素溶液と混合するＣＡＤの濃度を調整することによって試した。エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を、ＥＣＡ００１に関して上記で記載したようにアッセイする。
【００９３】
実施例７：２，３−ジフェニルマレイン酸無水物を用いた、不活性化ファミリーＢ ＤＮＡポリメラーゼの調製
２，３−ジフェニルマレイン酸無水物によるＥＣＡ００１の改変を、以下のように行った：ＤＭＦ中２７ｍＭの２，３−ジフェニルマレイン酸無水物（ＤＰＭＡ）の５０ｍｌを、４℃で保持していた１リットルの精製ＥＣＡ００１と混合し、そして５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ９、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１％のＴｗｅｅｎを含む緩衝剤によって、Ａ２８０＝１の吸光度および９．０のｐＨに調整した。その混合物を、４℃で６０分間混合してから、保存緩衝剤に移した。上記で記載したＤＰＭＡ対酵素の比は、約１００対１であり、そして８００：１、４００：１、２００：１、１００：１、５０：１、および２０：１のような他の比も、酵素溶液と混合するＤＰＭＡの濃度を調整することによって試した。エキソヌクレアーゼ活性およびポリメラーゼ活性を、実施例２において上記で記載したようにアッセイした。
【００９４】
我々は、ＤＰＭＡによるＥＣＡ００１の改変は、酵素の不活性化をもたらすことを見出した。９５℃で１０分間加熱することが、ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を回復させた。しかし、回復した酵素は、ＰＣＲ反応において機能できなかった。
【００９５】
前述の説明および実施例は、単に本発明を説明するために述べられ、そして制限することを意図しない。本発明の精神および物質を含む、開示された実施態様の改変が当業者に起こり得るので、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその同等物の範囲に入る全てのバリエーションを含むよう広く解釈されるべきである。さらに、本明細書中で引用された全ての参考文献の教示および開示は、その全体として参考文献に明確に組み込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、基本的に水性の条件下で、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、式Ｉの改変因子試薬と反応させることによって産生され、
【化１０】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、ここで該反応は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である、請求項４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記改変因子試薬は、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元可能である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記高い温度が＞５０℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記高い温度が＞９５℃である、請求項１０に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記高い温度が＞９６．５℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
前記高い温度が＞９８℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元されている、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元されている、請求項１４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元されている、請求項１４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ活性と前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、改変される前と基本的に同じ値まで復元される、請求項４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変するための方法であって、該方法は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと式Ｉの改変因子試薬とを反応させる工程を含み、
【化１１】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであって、そしてここで該反応は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、ここで該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である、方法。
【請求項１９】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭ、またはＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＦｕｓｉｏｎＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変因子試薬は、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記高い温度が＞５０℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記高い温度が＞９８℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって、前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を復元する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐＨは、約８．０である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって、前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を復元する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリメラーゼ活性と前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、改変される前と基本的に同じ値まで復元される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中に含まれる標的核酸を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルを、該標的核酸に相補的なプライマーおよび請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物と接触させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）の生じた混合物を、約５０℃より高い温度で、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを再活性化し、そしてプライマー伸長産物の形成を可能にするために十分な時間インキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項３４】
前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、基本的に水性の条件下で、式Ｉの改変因子試薬と反応させており、
【化１２】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、それにより、該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方が不活性化され、そして該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方は、高い温度でインキュベートすることによって復元可能であり、それにより該ポリメラーゼ活性と該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼが該改変因子試薬と反応される前と基本的に同じ値まで復元される、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３６】
ポリメラーゼ連鎖反応において検出可能な増幅産物を産生することができる、請求項３５に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３７】
少なくとも一つのプライマーおよび請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物。
【請求項３８】
請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼおよび適切な容器を含む、キット。
【請求項１】
ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、基本的に水性の条件下で、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、式Ｉの改変因子試薬と反応させることによって産生され、
【化１０】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、ここで該反応は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、そしてここでその熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である、請求項４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記改変因子試薬は、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元可能である、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
前記高い温度が＞５０℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記高い温度が＞９５℃である、請求項１０に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記高い温度が＞９６．５℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
前記高い温度が＞９８℃である、請求項９に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元されている、請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元されている、請求項１４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって復元されている、請求項１４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼ活性と前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、改変される前と基本的に同じ値まで復元される、請求項４に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１８】
熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを改変するための方法であって、該方法は熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼと式Ｉの改変因子試薬とを反応させる工程を含み、
【化１１】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであって、そしてここで該反応は、熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の不活性化をもたらし、ここで該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は復元可能である、方法。
【請求項１９】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘであるか、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、またはＰｆｘ、またはＶｅｎｔ（登録商標）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭ、またはｉＰｒｏｏｆＴＭ、またはＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＦｕｓｉｏｎＴＭの商品名で販売されているＤＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するその断片またはその変異体を含む融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕを含む融合タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼは、１０Ｈｉｓ−Ｐｆｕ−Ｐａｅ３１９２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変因子試薬は、無水マレイン酸または置換無水マレイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物、シス−アコニット酸無水物、２，３−ジメチルマレイン酸無水物、エキソ−シス−３，６−ｅｎｄｏｘｏ−δ４−テトラヒドロフタル酸無水物；または３，４，５，６−テトラヒドロフタル酸無水物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記改変因子試薬は、シトラコン酸無水物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを高い温度でインキュベートすることによって復元する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記高い温度が＞５０℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記高い温度が＞９８℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約７．５および約８．５の間のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって、前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を復元する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｐＨは、約８．０である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、約８．０のｐＨを有する反応緩衝剤中でインキュベートすることによって、前記ポリメラーゼ活性および前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を復元する工程をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ポリメラーゼ活性と前記３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、改変される前と基本的に同じ値まで復元される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
サンプル中に含まれる標的核酸を増幅するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該サンプルを、該標的核酸に相補的なプライマーおよび請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む増幅反応混合物と接触させる工程；および
（ｂ）工程（ａ）の生じた混合物を、約５０℃より高い温度で、ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを再活性化し、そしてプライマー伸長産物の形成を可能にするために十分な時間インキュベートする工程
を含む、方法。
【請求項３４】
前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＤＮＡポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを、基本的に水性の条件下で、式Ｉの改変因子試薬と反応させており、
【化１２】
ここでＲ１およびＲ２は水素であるかまたは連結し得るＣ１−Ｃ４アルキルであり、それにより、該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方が不活性化され、そして該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ活性および該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の両方は、高い温度でインキュベートすることによって復元可能であり、それにより該ポリメラーゼ活性と該３’−５’エキソヌクレアーゼ活性との比は、該熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼが該改変因子試薬と反応される前と基本的に同じ値まで復元される、改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３６】
ポリメラーゼ連鎖反応において検出可能な増幅産物を産生することができる、請求項３５に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３７】
少なくとも一つのプライマーおよび請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼを含む、ポリメラーゼ連鎖反応増幅反応混合物。
【請求項３８】
請求項１に記載の改変された熱安定性ＰｏｌＢ ＤＮＡポリメラーゼおよび適切な容器を含む、キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５３７６３７（Ｐ２０１０−５３７６３７Ａ）
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２３１０９（Ｐ２０１０−５２３１０９）
【出願日】平成２０年８月２７日（２００８．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９６４８
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２７日（２００８．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４４３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２９６４８
【国際公開日】平成２１年３月５日（２００９．３．５）
【出願人】（５０００６９０５７）アプライド バイオシステムズ インコーポレイテッド (120)
【Ｆターム（参考）】
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