ＳＰＦＳ（表面プラズモン励起増強蛍光分光法）により測定される蛍光シグナルの補正方法およびこれを用いたアッセイ方法、並びにこれらの方法に用いられる構造体および表面プラズモン共鳴センサー
【課題】ＳＰＦＳセンサー基板に複雑な構造を導入することなく、ＳＰＦＳセンサー基板を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強のばらつきの影響を排除し、これによりＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を高めることが可能となる、測定データの補正方法、およびこれを用いたアッセイ方法を提供する。
【解決手段】表面プラズモン共鳴センサーについて測定される蛍光シグナル（Ｓm）について、金属薄膜を介することなく蛍光分子層が形成された領域（Ｐ）および金属薄膜を介して蛍光分子層が形成された領域（Ｑ）で測定されるシグナル（Ｓp）および（Ｓq）から電場増強比Ｒを算出し、この電場増強比Ｒを用いて、補正されたシグナル（Ｓm1）に変換することを特徴とする蛍光シグナルの補正方法、並びに、この方法を用いたアッセイ方法。
【解決手段】表面プラズモン共鳴センサーについて測定される蛍光シグナル（Ｓm）について、金属薄膜を介することなく蛍光分子層が形成された領域（Ｐ）および金属薄膜を介して蛍光分子層が形成された領域（Ｑ）で測定されるシグナル（Ｓp）および（Ｓq）から電場増強比Ｒを算出し、この電場増強比Ｒを用いて、補正されたシグナル（Ｓm1）に変換することを特徴とする蛍光シグナルの補正方法、並びに、この方法を用いたアッセイ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ（Localized surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法）などの測定系に関し、より具体的には、それらの測定系に用いられる手法および表面プラズモン共鳴センサーの構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳの基本的な態様は、たとえば特許文献１および２に開示されている。
【０００３】
また、ＬＰＦＳは、上記ＳＰＦＳと組み合わせて利用することのできる方法であって、コロイド液を流すなどして金属コロイド粒子を蛍光色素近傍に位置させると、この金属コロイド粒子にもプラズモンが発生して局所的な電場増強効果が得られることを利用し、さらに効率良く蛍光色素を励起させてその蛍光シグナルを測定する方法である。
【０００４】
ＳＰＦＳおよびそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳなどの測定方法（以下「ＳＰＦＳ等」と総称する。）などによれば、たとえば、血液中の極微量の腫瘍マーカーを定量することにより、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができるようになるため、医療、バイオテクノロジー等の分野における活用が期待される。
【０００５】
ところで、プラズモン共鳴により引き起こされた増強電場は、プラズモン共鳴が生じている表面からの距離が大きくなるにつれて急速に減衰する特性を有するため、プラズモン共鳴が生じている部位から離れた場所から直接観測することが困難である。そのため、プラズモン共鳴による電場増強を可視化する試みが、これまでにいくつか行われてきた。
【０００６】
例えば、非特許文献１では、ガラス基板表面に形成した金膜に格子を形成してなる構造体や、ガラス基板表面に形成した銀膜に単一のもしくは周期的に配置された複数の孔を形成してなる構造体に対して光を照射し、その格子または孔の近傍で起こる入射光と表面プラズモン分極により生じる光との干渉をフォトン走査型トンネル顕微鏡でマッピングすることによって、表面プラズモンを検出する試みがなされている。
【０００７】
また、非特許文献２では、帯状に配置された複数のシリカ突起を有するガラス基板表面に銀膜を形成してなる構造体に対し、顕微鏡の対物レンズを通じてレーザ光を照射し、予めこの構造体表面に塗布された蛍光分子からの蛍光をその顕微鏡で観測することによって、表面プラズモン分極の可視化を図る試みがなされている。
【０００８】
また、非特許文献３では、部分的にアルミ不透光膜を形成した透明誘電体基板の上に、誘電体薄膜と金膜を形成してなる構造体の裏側から光を照射し、このアルミ不透光膜を形成した部位とアルミ不透光膜を形成していない部位との界面で発生するプラズモン波の散乱を、蛍光分子からの蛍光としてあるいはフォトン走査型トンネル顕微鏡を用いて測定することによって、表面プラズモン分極の可視化を図る試みがなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２１８１６９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】William L. Barnes et al.，Nature，Vol. 424，p. 824〜830 (2003)
【非特許文献２】H. Ditlbacher, et al.，Appl. Phys. Lett.，Vol. 81(10)，p. 1762〜1764 (2002)
【非特許文献３】J. R. Krenn and J.-C. Weeber，Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2004) Vol. 362，p. 739〜756
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたり、蛍光シグナルの測定値についての信頼性を担保する必要があり、そのためには、測定値のばらつき（ＣＶ）を通常１０％以内に抑える必要がある。特に、抗体を固定化させたＳＰＦＳ基板に検体由来のアナライトを介して蛍光修飾抗体を固定化するサンドイッチ系など、アナライト濃度に応じてシグナルの絶対値が増加する系では、一般にアナライト濃度が低下するとＣＶが悪化し、検出感度および定量感度の低下につながる。そこで、蛍光シグナルの測定値におけるばらつきを減らすためには、ＳＰＦＳセンサー基板間での電場増強のばらつきを減らす必要がある。ここで、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を考えるにあたって、ＳＰＦＳセンサー基板に形成されている金属薄膜の厚さのばらつきが問題となる。ところが、すべてのＳＰＦＳセンサー基板において金属薄膜の厚さが寸分の違いもなく完全に同一となるようＳＰＦＳセンサー基板を製造することは現実的ではないことから、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を最小限とするためには、ＳＰＦＳセンサー基板で生じる電場増強を正規化し、これに基づいて測定値を補正する必要がある。その一方で、臨床検査に用いるＳＰＦＳセンサー基板には安価に製造できることも要求される。したがって、ＳＰＦＳセンサー基板に複雑な構造を形成することなく電場増強を正規化でき、これに基づいて測定値を補正することによって測定データのばらつきを最小限に抑えることが、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するうえで必要となる。
【００１２】
しかしながら、上記従来技術においては、基板表面に形成された特殊な形状の金属構造を通じて表面プラズモン分極の可視化を図るものであり、このような複雑な金属構造を、臨床検査に用いるＳＰＦＳセンサー基板に導入することは、ＳＰＦＳセンサー基板の生産工程が煩雑になるとともに、製造コストを大幅に引き上げるおそれがあり、現実的ではない。
【００１３】
そこで、本発明は、ＳＰＦＳセンサー基板に複雑な構造を導入することなく、ＳＰＦＳセンサー基板を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強のばらつきの影響を排除し、これによりＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を高めることが可能となる、測定データの補正方法、およびこれを用いたアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は本発明を完成させる過程で、誘電体部材表面の一部に金属薄膜を形成させた基板に蛍光分子層を形成してなる基板の裏側から全反射条件で入射光を照射したときの、金属薄膜を形成させていない領域での蛍光強度と金属薄膜を形成させていない領域での蛍光強度との関係に基づいて、この金属薄膜の厚さによる電場増強への影響を見積もることが可能であるとの知見を得た。そして、この知見を利用すれば上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１０］に示される、アッセイ方法、構造体、および表面プラズモン共鳴センサーを提供する。
［１］
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する対象構造体（Ｘt）について、
（i）前記領域（Ｐ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsp）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）該工程（i）の前に、該工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、前記領域（Ｑ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsq）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で該工程（i）の場合と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）該工程（i）および（ii）を経て得られる該全反射蛍光シグナル（Ｓp）と該電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる該電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2）該構造体（Ｘ）であって、該対象構造体（Ｘt）以外の構造体である参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、上記工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする蛍光シグナルの補正方法。
【００１６】
［２］
前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している前記表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される前記蛍光シグナル（Ｓm）についての前記変換が、該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる前記電場増強比Ｒを前記Ｒtとして用いることに行われる前記［１］に記載の補正方法。
【００１７】
［３］
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含み；
該工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正が、前記［１］に記載の補正方法を用いてなされることを特徴とするアッセイ方法。
【００１８】
［４］
前記（ｋ-1）で用いられる対象構造体（Ｘt）が、
前記透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）をさらに含み、且つ、該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する構造体であり、
該領域（Ａs）を前記領域（Ａm）として用いることにより、前記プラズモンセンサー構造体として供される
上記［３］に記載のアッセイ方法。
【００１９】
［５］
前記工程（ｃ）における補正が、
前記対象構造体（Ｘt）についての上記工程（i）〜（iii）を前記工程（ｂ）の直前、前記工程（ｂ）と同時、および前記工程（ｂ）の直後のいずれかにおいて行うことにより求められる前記Ｒtを用いて行われる
上記［４］に記載のアッセイ方法。
【００２０】
［６］
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒtを用いて行われる上記［３］または［４］に記載のアッセイ方法。
【００２１】
［７］
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒrを用いて行われる上記［５］または［６］に記載のアッセイ方法。
【００２２】
［８］
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少な
くとも１種の体液である上記［３］〜［７］のいずれかに記載のアッセイ方法。
【００２３】
［９］
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsp）および該蛍光分子層（Ｆsq）がともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成され、且つ、
該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する
構造体。
【００２４】
［１０］
上記［９］に記載の構造体と、アナライトと、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを含み、
前記領域（Ａs）内の前記第１のリガンドに、該アナライトを介して該蛍光修飾リガンドが結合している表面プラズモン共鳴センサー。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＳＰＦＳ基板を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強のばらつきの影響を排除することができるようになるため、ＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を従来よりも一層高めることができるとともに、臨床検査への応用に対応することにより生じるＳＰＦＳ基板の製造コスト上昇を抑えることができるため、ＳＰＦＳ等を用いた臨床検査システムの実用化に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のアッセイ方法を説明する模式図である。
【図２】図２（ａ）は、本発明で用いられる構造体を、この構造体による補正対象とするプラズモンセンサー構造体とともに示す模式図であり、図２（ｂ）および（ｃ）は、本発明で用いられる構造体の好適な実施態様を表す模式図である。
【図３】本発明で用いられる好適な構造体を応用した表面プラズモン共鳴センサーを表す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について、図１および図２を参照しながら具体的に説明する。
［補正方法］
本発明に係る蛍光シグナルの補正方法は、
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 対象構造体（Ｘt）について、以下の工程（i）〜（iii）を経て得られる電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2） 参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、以下の工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする。
【００２８】
ここで、対象構造体（Ｘt）は、
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する構造体である。
【００２９】
また、参照構造体（Ｘr）とは、構造体（Ｘ）であって、前記対象構造体（Ｘt）以外の構造体である。
対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）となる構造体（Ｘ）は、具体的には、図１に示される構造体１０のような構造を有している。
【００３０】
また、本発明において、これら対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒは、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）の各々について、図１に示すように、
（i）領域（Ｐ）に対して、
透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光６１ａを照射することにより、
領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）工程（i）の前に、工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、領域（Ｑ）に対して、
透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で工程（i）の場合と同一波長の入射光６１ｂを照射することにより、
領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）工程（i）および（ii）を経て得られる全反射蛍光シグナル（Ｓp）と電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる。
【００３１】
本発明の補正方法においては、対象構造体（Ｘt）は、蛍光シグナルの補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強を見積もるために用いられるものである。本発明では、対象構造体（Ｘt）の領域（Ｑ）で生じた電場増強の強度をもって、表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強の強度を評価するものであるであるから、対象構造体（Ｘt）を構成する金属薄膜（Ｍsq）は、表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（Ｍm）と同一の金属からなるとともに、同じ厚さを有する必要がある。この点から、本発明においては、蛍光シグナルの補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーとして、この対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化しているものを用いることが好ましい。この場合、当該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる電場増強比ＲをＲtとして用いることができ、このＲtを用いて、この表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される蛍光シグナル（Ｓm）についての補正を行うことができる。このような表面プラズモン共鳴センサーにおいて、当該対象構造体部分を構成する金属薄膜（Ｍsq）が金属薄膜（Ｍm）と一体化して単一の金属薄膜として形成されていると、さらに好ましい。
【００３２】
一方、参照構造体（Ｘr）は、対象構造体（Ｘt）の領域（Ｑ）で生じた電場増強の強度として代表された表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強を正規化するための基準として用いられるものである。この参照構造体（Ｘr）を用いることにより、異なる複数の対象構造体（Ｘt）間において、各対象構造体（Ｘt）が固有に有している電場増強の強度の相対関係を定めることができ、これに基づき各表面プラズモン共鳴センサー相互間で生じる電場増強のばらつきを補正することが可能となる。
【００３３】
なお、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒの算出については、後に詳述する。
なお、本発明において、後述する領域（Ａm），（Ａs）および（Ｑ）のように金属薄膜を有する領域での蛍光検出は表面プラズモン共鳴条件で、後述する領域（Ｐ）のように金属薄膜を有さない領域での蛍光検出は全反射減衰条件でそれぞれ行われる。ただ、本発明では、金属薄膜を有する領域での蛍光検出にあたっても、入射光の照射は全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角で行われることから、本明細書では、このような入射角についても「全反射条件となる入射角」という語を用いている。
【００３４】
〔適用対象となる表面プラズモン共鳴センサー〕
本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーは、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーであれば、特にその構成を問わず、一般に広く用いられている表面プラズモン共鳴センサーであってもよい。本発明の補正方法の適用対象となる表面プラズモン共鳴センサーにおける蛍光色素（Ｄm）の固定態様については、特に限定はなく、例えば、蛍光色素（Ｄm）が抗原−抗体反応を利用して固定化されていてもよいし、互いに相補的な配列を有する核酸における二重鎖形成反応やインターカレーションを利用して固定化されていてもよい。
【００３５】
ここで、図１に示した表面プラズモン共鳴センサー５０を例としてさらに説明すると、表面プラズモン共鳴センサーは、通常、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０において、該領域（Ａm）の第１のリガンド２３１に、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１が、アナライト４２を介して結合した形態を有している。
【００３６】
ここで、この領域（Ａm）に対して、透明誘電体部材（Ｔm）２１の、金属薄膜（Ｍm）２２とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で入射光６１ｃを照射することにより、金属薄膜（Ｍm）２２で表面プラズモンが発生し、これによりもたらされる電場増強によって蛍光分子（Ｄm）が励起し、蛍光を発する。ＳＰＦＳ等を用いたアッセイ方法では、このときの蛍光を蛍光シグナル（Ｓm）として検出することになる。
【００３７】
ところが、表面プラズモン共鳴センサー５０に固定されている蛍光分子（Ｄm）４１２の量が同じであっても、金属薄膜（Ｍm）２２の厚みに比例して電場増強の強度が増大し、その結果、蛍光シグナル（Ｓm）として検出される見かけ上の蛍光量が増大する。ここで、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたって問題となる点は、蛍光シグナル（Ｓm）としてある値が測定されたときに、どこまでが、検体に含まれるアナライトの量に基づく値であり、どこからが金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきに起因する見かけ上の増減値であるかの評価がしばしば困難になることである。そのため、臨床検査に用いられるアッセイ方法に許容される測定結果のばらつき（ＣＶ）は、通常１０％程度以内である。特に、正常値と異常値との差が小さい検査に用いる場合に問題が顕在化することから、場合によっては、ＣＶを１〜２％以内に抑える必要がある。これを考慮すると、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきによる蛍光シグナル（Ｓm）への影響は最大限に除去する必要があるものの、表面プラズモン共鳴センサー５０に用いられるプラズモンセンサー構造体２０を、全個体を通じて金属薄膜（Ｍm）２２の厚さが完全に同一になるよう製造することは困難である。したがって、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を補正により除去する必要があり、そのためには、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を見積もる必要がある。
【００３８】
本発明の補正方法では、次に述べる「構造体」を用いて金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を見積もり、これに基づき、表面プラズモン共鳴センサー５０について測定された蛍光シグナル（Ｓm）を補正して、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきによる影響を除去するのである。
【００３９】
〔構造体〕
本発明において、構造体（Ｘ）として用いられる構造体は、図２（ａ）に示すように、
透明誘電体部材（Ｔs）１１と、
該透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsq）１２を介して、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）１３ａおよび該蛍光分子層（Ｆsp）１３ｂがともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されている構造体１０である。
【００４０】
本発明において、この構造体１０は、本発明の補正方法が適用対象とする表面プラズモン共鳴センサーについての蛍光シグナルの補正に用いられるものである。
なお、以下の記載において、この構造体１０は、一般的な意味で用いられる構造体との区別のため「電場増強評価構造体」と称される場合がある。
【００４１】
本発明の好適な態様において、この構造体１０は、図２（ｂ）に示すように、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsa）３２を介して、第１のリガンド３３１を含有する固定化リガンド含有層３３が形成された領域（Ａs）をさらに含んでいる。このとき、この金属薄膜（Ｍsa）３２および金属薄膜（Ｍsq）１２がともに同一の金属からなるものであり、且つ同じ厚さを有している。
【００４２】
≪領域（Ｐ）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが形成された領域（Ｐ）を有している。ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａは、蛍光分子（Ｄs）から構成される層である。この領域（Ｐ）は、図１に示される電場増強評価構造体１０では左側に描かれている。
【００４３】
蛍光色素を含む層が表面に存在する透明誘電体部材からなる構造体について、この透明誘電体部材を通じて、蛍光色素を含む層が存在する面の反対側から、この蛍光色素を含む層が存在する面に向けて全反射条件にて入射光を照射したとき、この構造体に金属が存在しなくても蛍光色素から蛍光（以下、「全反射蛍光」と称する。）が発光することがある。そこで、本発明では、領域（Ｐ）を、金属薄膜による電場増強の影響がない状態における全反射蛍光を測定するための全反射蛍光リファレンス領域として用いる。
【００４４】
≪領域（Ｑ）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsq）１２を介して、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが形成された領域（Ｑ）をも有している。ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、蛍光分子（Ｄs）から構成される層である。ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsp）１３ｂは、ともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成されている。
【００４５】
ＳＰＦＳ等に基づいて検体中のアナライトを測定するために用いられる表面プラズモン共鳴センサーは、一般に、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより調製される。ここで、金属薄膜（Ｍm）２２における電場増強は、金属薄膜（Ｍm）２２の膜厚に比例して強くなる傾向にある。また、金属によって、電場増強に関係する光学特性も変わる。
【００４６】
本発明では、この領域（Ｑ）を、補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜における電場増強を評価するための電場増強蛍光リファレンス領域として用いる。したがって、本発明で用いられるこの構造体１０を用いてこのような表面プラズモン共鳴センサーについて検出される蛍光シグナルの補正を行うに当たっては、この構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２が、補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜と同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する必要がある。その限りにおいて、この表面プラズモン共鳴センサーと一体の構造体であってもよいし、あるいは、この表面プラズモン共鳴センサーとは別々の構造体であってもよい。
【００４７】
≪領域（Ａs）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、図２（ｂ）に示すように、好適な態様において、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsa）３２を介して、第１のリガンド３３１を含有する固定化リガンド含有層３３が形成された領域（Ａs）をさらに含んでいる。この領域（Ａs）は、表面プラズモン共鳴センサーとして用いられる領域であり、この領域（Ａs）を有することにより、電場増強評価構造体１０はプラズモンセンサー構造体としての機能を兼ね備えることとなる。言い換えれば、この態様において、電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０と一体化した構造を有することになり、この領域（Ａs）はこのプラズモンセンサー構造体２０における領域（Ａm）と同等の機能を有するアッセイ測定領域として用いられる。
【００４８】
この固定化リガンド含有層３３において、アナライト４２を捕捉するための第１のリガンド３３１は、金属薄膜（Ｍsa）３２の直上に形成してもよいし、金属薄膜（Ｍsa）３２に常法によりＳＡＭ、スペーサ層等（いずれも図示せず）を形成してからその上に形成してもよい。また、蛍光修飾リガンド４１等がセンサー表面等に非特異的に結合しないよう、通常は第１のリガンド３３１からなる層が設けられた後にブロッキング処理がなされる。
【００４９】
≪構造体の構成≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１表面のうち領域（Ｑ）となる領域および該当する場合には領域（Ａs）となる領域に、金属薄膜（Ｍsq）および金属薄膜（Ｍsa）をそれぞれ形成させた後、領域（Ｐ）となる領域および領域（Ｑ）となる領域に、蛍光分子層（Ｆsp）および（Ｆsq）をそれぞれ形成することにより作成される。ここで、領域（Ａs）をさらに有する電場増強評価構造体１０の場合には、領域（Ａs）となる金属薄膜（Ｍsa）を形成させた領域について、蛍光分子層に代えて固定化リガンド含有層３３を形成することにより作成される。
【００５０】
透明誘電体部材（Ｔs）
本発明で、電場増強評価構造体１０を構成する透明誘電体部材（Ｔs）１１は、電場増強評価構造体１０の構造の骨格を構成するとともに、電場増強評価構造体１０において、金属薄膜（Ｍsq）１２が形成されている面に入射光を導く媒体としても機能する。
【００５１】
本発明で、透明誘電体部材（Ｔs）１１として用いられる透明誘電体部材は、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はなく、例えば、ガラス製や、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製のもの、好ましくはｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が１．４０〜２．２０の範囲にある材質のものを用いることができる。
【００５２】
ただ、本発明においては、透明誘電体部材（Ｔs）１１として用いられる透明誘電体部材の材質は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーを構成する透明誘電体部材（Ｔm）と同じ材質のものである。
【００５３】
本発明において、透明誘電体部材（Ｔs）１１は、透明平面基板であってもよく、金属薄膜形成用平面のほかにプリズム部およびサンプル保持部をさらに含む一体化構造体ブロックの形態を有していてもよい。ここで、透明誘電体部材（Ｔs）１１として透明平面基板を用いる場合、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
なお、後述する金属薄膜（Ｍsq）１２を形成する前に、当該透明誘電体部材（Ｔs）１１の表面に対して酸またはプラズマによる洗浄処理を行うことが好ましい。
【００５４】
金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２、および上記領域（Ａs）が存在する場合にさらに含まれる金属薄膜（Ｍsa）３２について、一般的な表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜として一般に用いられるものと同様の金属を用いることができる。その中で、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００５５】
ここで、透明誘電体部材（Ｔs）１１としてガラス製の透明誘電体部材を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００５６】
ここで、本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２を構成する金属は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２を構成する金属と同一である必要があるし、また、上記領域（Ａs）が存在する場合に、金属薄膜（Ｍsa）３２を構成する金属と同一である必要がある。
【００５７】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２を形成するために一般に用いられている方法が挙げられ、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および金属薄膜を形成することが好ましい。
【００５８】
金属薄膜（Ｍsq）１２および金属薄膜（Ｍsa）３２の厚さは、一般に用いられている表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜と同様の厚さとすることができ、表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ５〜５００ｎｍが好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍがより好ましい。
【００５９】
ここで、本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２の厚さは、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２の厚さと同一である必要があるし、一方、上記領域（Ａs）が存在する場合には、金属薄膜（Ｍsa）３２の厚さと同一である必要がある。
【００６０】
ここで、上記領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０にあたっては、金属薄膜（Ｍsq）と金属薄膜（Ｍsa）と別々に形成してもよいが、金属薄膜（Ｍsq）１２と金属薄膜（Ｍsa）３２とが確実に同一の厚さとなるよう、図２（ｃ）に示すように、金属薄膜（Ｍsq）１２と金属薄膜（Ｍsa）３２とが一体化して一つの金属薄膜を構成するような態様で一度に形成させることが好ましい。
【００６１】
蛍光分子
本発明において、「蛍光分子」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する分子を意味し、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００６２】
本発明で、電場増強評価構造体１０を構成する蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）として用いられる蛍光分子、ならびに、後述する蛍光修飾リガンド４１を構成する蛍光分子（Ｄm）４１２として用いられる蛍光分子は、いずれも、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａを構成する蛍光分子および蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）は、同一である必要がある。ただ、蛍光分子（Ｄs）と蛍光分子（Ｄm）４１２とでは、同一であってもよいし、励起波長は同じで発光波長が異なるものであってもよい。
【００６３】
本発明で用いることのできる蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００６４】
これらのファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００６５】
【表１】
また、蛍光分子として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光分子となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００６６】
さらに、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、蛍光分子に含まれる。
【００６７】
なお、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、ＬＰＦＳに関与する金属コロイドによる吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を、標識リガンドに用いることが望ましい。たとえば金コロイドを用いる場合には、金コロイドによる吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素、たとえばＣｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、銀コロイドを用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を用いることが望ましい。
これらの蛍光色素は１種単独で用いてもよく、また２種以上併用してもよい。
【００６８】
蛍光分子層
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、上記「蛍光分子」から構成されるものであり、ともに同一の蛍光分子（Ｄs）からなる。
【００６９】
この蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、透明誘電体部材（Ｔs）１１または金属薄膜（Ｍsq）１２の表面に、上記「蛍光分子」を塗布または蒸着させることにより形成することができる。また、透明誘電体部材（Ｔs）１１または金属薄膜（Ｍsq）１２の表面に、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成された部材、または蛍光色素を含有する薄層を積層させることにより形成してもよい。
【００７０】
これらの蛍光分子層の厚さなどは、上述したような測定方法が行える範囲で適切に調整すればよい。ただ、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂとも、通常は、１０〜２０００ｎｍ程度、好ましくは２０〜２００ｎｍの厚さとなるように形成する。
【００７１】
なお、蛍光分子層を調製する際には、蛍光色素の経時安定剤を向上させるために酸化防止剤を併用してもよい。酸化防止剤としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，２'−ジオキシ−３，３'−ジ−ｔ−ブチル−５，５'−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。
【００７２】
ここで、電場増強評価構造体１０において、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａと蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂと別々に形成してもよいし、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａと蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂと一体化して全体として一つの蛍光分子層を構成するような態様で一度に形成させてもよい。
【００７３】
固定化リガンド含有層
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）を形成する場合、図２（ｂ）に示すように、前記金属薄膜（Ｍsa）３２上に固定化リガンド含有層３３が形成されている。この固定化リガンド含有層３３はリガンド３３１を含んでおり、このリガンド３３１は、検体に含まれるアナライト４２が結合する土台となる。そして、このアナライト４２に、後述する蛍光修飾リガンド４１が結合することで、この領域（Ａs）が、表面プラズモン共鳴センサーとしての機能を有することになる。
【００７４】
本発明においては、この固定化リガンド含有層３３において、リガンド３３１は、金属薄膜（Ｍsa）３２と直接結合していてもよいが、通常は、次に述べるスペーサ層およびＳＡＭのうちの少なくとも一つを介して結合している。
【００７５】
スペーサ層
本発明において、電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）が存在する場合、この電場増強評価構造体１０には、必要に応じて、金属薄膜（Ｍsa）による蛍光分子４１２の金属消光を防止するため、この金属薄膜と固定化リガンド含有層３３（あるいは、後述するＳＡＭ）の間に誘電体からなるスペーサ層を形成してもよい。
【００７６】
誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。なかでも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を用いることが好ましい。
【００７７】
スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。また、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、センサー表面（金属薄膜）と金属コロイド粒子との間に生じる電場をより効果的に増強させるため、スペーサ層の厚さは１０〜１００ｎｍであることが望ましい。
【００７８】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコーターによる塗布などが挙げられる。
【００７９】
ＳＡＭ
本発明において、電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）が存在する場合、この電場増強評価構造体１０には、必要に応じて、金属薄膜（または上記スペーサ層）と固定化リガンド含有層３３の間にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を形成してもよい。
【００８０】
ＳＡＭを構成する分子としては、分子の一方の末端に金属薄膜等と結合可能な官能基（シラノール基、チオール基等）を、もう一方の末端に反応層を構成する分子と結合可能な反応性官能基（アミノ基、カルボキシル基、グリシジル基等）を有する化合物が用いられる。このような化合物はシランカップリング剤やＳＡＭ形成試薬として容易に入手できる。たとえば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（１０−カルボキシ−１−デカンチオールなど）は、光学的な影響が少ない、つまり透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いＳＡＭを形成することができるため好適である。ＳＡＭ構成分子の溶液（エタノール溶液等）を金属薄膜等に接触させ、当該分子の一方の官能基を金属薄膜等に結合させることにより、ＳＡＭを形成することができる。
【００８１】
リガンド
アナライトと特異的に結合し得る分子を「リガンド」と称する。本発明において、この「リガンド」は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成するリガンド２３１，領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０を構成するリガンド３３１、および後述する蛍光修飾リガンド４１を構成するリガンド４１１として用いられる。特に、表面プラズモン共鳴センサー５０の表面または領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０の表面に固定化された、アナライトをセンサー表面に捕捉するためのリガンド（すなわち、リガンド２３１およびリガンド３３１）を「第１のリガンド」（リガンドが抗体であれば「第１の抗体」）、アナライトを標識するために液中に存在する、蛍光色素と結合したリガンド（すなわち、リガンド４１１）を「第２のリガンド」（リガンドが抗体であれば「第２の抗体」）と称する。なお、第１のリガンドと第２のリガンドのリガンド部分は、同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドがポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、第１のリガンドがモノクローナル抗体である場合、第２のリガンドはその第１のリガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００８２】
リガンドは捕捉しようとするアナライトに応じて適切なものを選択すればよく、アナライトの所定の部位と特異的に結合しうる抗体、受容体、その他の特定の分子（たとえばビオチン化したアナライトを捕捉するためのアビジン）などをリガンドとすることができる。
【００８３】
表面プラズモン共鳴センサー５０の表面へのリガンド２３１の固定化、および領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０の表面へのリガンド３３１の固定化は、常法を用いて行うことができる。
【００８４】
≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫
本発明において、上記領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０は、領域（Ａs）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーとして使用することができる。図３を参照すると、領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０は、表面プラズモン共鳴センサー５１として使用される。
【００８５】
すなわち、本発明では、上記領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０と、アナライト４２と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを含み、
この領域（Ａs）内の前記第１のリガンド３３１に、該アナライト４２を介して該蛍光修飾リガンド４１が結合している表面プラズモン共鳴センサーが提供される。
【００８６】
このような表面プラズモン共鳴センサーは、上記領域（Ｐ）および領域（Ｑ）も兼ね備えていることから、上記対象構造体（Ｘt）としての機能も持ち合わせており、領域（Ａs）内に形成されている表面プラズモン共鳴センサー部につき測定される蛍光シグナル（Ｓm）を補正するにあたり、対象構造体部分として機能する領域（Ｐ）および領域（Ｑ）について得られる電場増強比ＲをＲtとして用いることができる。
【００８７】
アナライト
本発明において「アナライト」４２は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する透明誘電体部材（Ｔm）２１表面に固定化された第１のリガンド２３１、または領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０を構成する透明誘電体部材（Ｔs）１１の表面に固定化された第１のリガンド３３１を特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００８８】
検体
上記「アナライト」４２を含むまたは含んでいる可能性のある、ＳＰＦＳ等に供される物質を「検体」と称す。たとえば、ヒト、ヒト以外のほ乳類（モデル動物、ペット等）、その他の動物から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが検体として挙げられる。分析の際、検体は必要に応じて、純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液などの各種の溶媒と混合して用いてもよい。このような検体の混合液または検体そのもの、あるいは所定の目的のために調製したアナライトを含有する溶液など、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するために表面プラズモン共鳴センサーの所定の領域に送液される流体（溶液、懸濁液、ゾル、その他流動性を有する物質を含む。）をいずれも「試料」と総称する。
【００８９】
なお、「標識リガンド溶液」を調製する際にも上記溶媒を用いると好都合である。また、ＳＰＦＳ等においてシグナルを測定する際、流路は通常、アナライトも標識リガンドも含まない液体で満たされた状態にされるが、そのような液体としては、試料液の調製に用いられる上記溶媒を単独で用いると好都合である。
【００９０】
蛍光修飾リガンド
本発明で用いられる蛍光修飾リガンド４１は、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２からなるものであり、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。この蛍光修飾リガンド４１は、一般的な免疫染色法でも用いられているリガンドと蛍光色素との複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができる。たとえば、リガンドとアビジン（ストレプトアビジン等を含む）との複合体、および蛍光色素とビオチンとの複合体をそれぞれ作製し、これらを反応させることにより、アビジン／ビオチンを介してリガンドに蛍光色素が結合した複合体（１のアビジンに対し最大４のビオチンが結合しうる）が得られる。上述のようなビオチンとアビジンの反応以外にも、蛍光標識法で用いられている一次抗体−二次抗体の反応様式や、カルボキシル基とアミノ基、イソチオシアネートとアミノ基、スルホニルハライドとアミノ基、ヨードアセトアミドおよびチオール基などの反応を用いてもよい。
【００９１】
本発明において、第２のリガンドは、アナライト４２に蛍光分子による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、前記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００９２】
〔蛍光シグナル（Ｓm）の補正〕
本発明において、表面プラズモン共鳴センサーについて測定される蛍光シグナル（Ｓm）の補正は、上記電場増強評価構造体１０のうち、金属薄膜（Ｍsq）が、この表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（Ｍm）を構成する金属と同一の金属からなるものを構造体（Ｘ）として用いることにより行われる。
【００９３】
電場増強比Ｒの取得
まず、補正の第１段階として、この構造体（Ｘ）のうち、金属薄膜（Ｍsq）が金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有するものを対象構造体（Ｘt）として用い、該対象構造体（Ｘt）以外の任意の構造体（Ｘ）を参照構造体（Ｘr）として用いた上で、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒを、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）の各々について、以下の（i）〜（iii）に示すステップを通じて、それぞれＲtおよびＲrとして求める。
【００９４】
（i）全反射蛍光シグナル（Ｓp）の検出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第１のステップとして、領域（Ｐ）に対して、透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが存在する面とは反対側の表面（図１においては紙面下側にある面を指す。以下、透明誘電体部材（Ｔs）・（Ｔm）に対して蛍光分子層（Ｆsp）・（Ｆsq）や金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍm）・（Ｍsa）などが存在する側を「上」と称し、これと反対側を「下」と称することがある。）から、全反射条件となる入射角で入射光６１ａを照射することにより、この領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程が行われる。
【００９５】
具体的には、図１に示すように、紙面の下側にあるレーザ光などの光源（図示せず）から、透明誘電体部材（Ｔs）１１の下部に接した形で置かれたプリズム（図示せず）を通じて、領域（Ｐ）に入射光６１ａを照射し、これにより、領域（Ｐ）で発光した蛍光を、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）の上部に設置された光検出部で検出し、蛍光量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として数値化する工程である。
【００９６】
このとき、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａの上には、水、検体を希釈するために用いられるバッファー溶液または検体溶液などが存在していてもよい。
ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａを構成する蛍光分子（Ｄs）を励起するために導入される入射光６１ａは、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光６１ｃと同一波長のものである。
【００９７】
この工程（i）により、金属薄膜による電場増強の影響を受けない状態での全反射蛍光が検出されることから、全反射蛍光シグナル（Ｓp）は、電場増強のばらつきによる影響を評価する上でブランク基準となる。
【００９８】
（ii）電場増強蛍光シグナル（Ｓq）の検出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第２のステップとして、領域（Ｑ）に対して、透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で入射光６１ｂを照射することにより、この領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程が行われる。
【００９９】
具体的には、図１に示すように、紙面の下側にあるレーザ光などの光源（図示せず）から、透明誘電体部材（Ｔs）１１の下部に接した形で置かれたプリズム（図示せず）を通じて、領域（Ｑ）に入射光６１ｂを照射し、これにより、領域（Ｑ）で発光した蛍光を、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）の上部に設置された光検出部で検出し、蛍光量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として数値化する工程である。
【０１００】
このとき、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂの上には、水、検体を希釈するために用いられるバッファー溶液または検体溶液が存在していてもよいが、この場合には、前記（i）において蛍光分子層（Ｆsp）１３ａの上に存在していたものと同じ媒体を存在させる。
【０１０１】
ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）を励起するために導入される入射光６１ｂは、工程（i）の場合と同一波長の光、すなわち、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光６１ｃと同一波長のものである。ただし、工程（ii）での全反射条件での測定に最適な入射角は、工程（i）における入射角と異なる場合がある。
【０１０２】
この工程（ii）は、前記工程（i）と同時に行ってもよいし、あるいは、前記工程（i）の前もしくは後に行ってもよい。
この工程（ii）により、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）における、金属薄膜による電場増強の影響を受けて増強された全反射蛍光が検出されることから、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）は、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）における電場増強の度合いを表すリファレンス値となる。
【０１０３】
（iii）電場増強比Ｒの算出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第３のステップとして、上記工程（i）および（ii）を経て得られる全反射蛍光シグナル（Ｓp）と電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程が行われる。この電場増強比Ｒは、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）に形成されている金属薄膜（Ｍsq）による表面プラズモンによって全反射蛍光がそれだけ増光したかを示す値、すなわち、金属薄膜（Ｍsq）による電場増強の度合いを示す値であり、本発明の補正方法では、このＲをもって、各対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）に固有の電場増強を評価するのである。すなわち、対象構造体（Ｘt）について算出される電場増強比ＲであるＲtと、参照構造体（Ｘr）について算出される電場増強比ＲであるＲrとを求めれば、各対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）に固有の電場増強特性をＲtまたはＲrの形で対比することができる。
【０１０４】
ここで、上記工程（i）〜（iii）は、表面プラズモン共鳴センサーについて蛍光シグナル（Ｓm）を測定する一連のアッセイ工程において行ってもよいし、アッセイ工程の前に事前に行ってもよい。
【０１０５】
また、上記工程（i）と上記工程（ii）とを同時に行ってもよいし、あるいは異なる時にて行ってもよい。
上記工程（i）と上記工程（ii）とを異なる時にて行う場合、全反射蛍光シグナル（Ｓp）、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を、単一の光検出部を用いて検出するとともに、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ａ，６１ｂ）を単一光源を用いて供給することができるので、測定系を簡素化できるとともに、光源および光検出部を構成する装置の性能における個体差によるばらつきを回避できる利点がある。
【０１０６】
一方、上記工程（i）と上記工程（ii）とを同時に行う場合、全反射蛍光シグナル（Ｓp）および電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を検出するために複数の光検出部を用いることになる。あるいは、ＣＣＤイメージセンサーなど多点計測が可能な撮像素子を用いてこれらのシグナルを同時に検出してもよい。これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ａ，６１ｂ）は、光学特性が同一の複数の光源を用いて供給してもよい。あるいは、単一の光源を用い、この光源から発せられる光を適当なビームスプリッターにより分割することにより、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）の各領域に同時に入射光を供給してもよい。ただし、上記工程（i）において全反射蛍光シグナル（Ｓp）を測定するために用いられる入射光６１ａの入射角と、上記工程（ii）において電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を測定するために用いられる入射光６１ｂの入射角とは異なる場合があることから、分割した光の向きを入射角の変化に応じて適宜調節する機構が必要となり、測定系が複雑になる場合がある。
【０１０７】
ところで、表面プラズモン共鳴センサー５０の材料となるプラズモンセンサー構造体２０を、１枚の大きな透明誘電体部材上に金属薄膜を形成してなるプラズモンセンサーバルク構造体を切り分けることにより製造する場合には、必ずしも全ての表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についてのＲtを実測することを要しない。例えば、同一のプラズモンセンサーバルク構造体から得られる表面プラズモン共鳴センサー５０は、お互いに膜厚が同一であるか、あるいは金属薄膜の膜厚分布に一定の傾向を有している可能性が高い。したがって、この場合には、そのうちの一部の表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についてのＲtを実測しておいて、同一のプラズモンセンサーバルク構造体から得られるほかの表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についての仮想的なＲtとして、この実測しておいたＲtの数値をそのまま流用するか、あるいは、この実測しておいたＲtの数値から推測した値を用いることもできる。
【０１０８】
蛍光シグナルの換算
そして、補正の第２段階として、対象構造体（Ｘt）と参照構造体（Ｘr）とについてそれぞれ得られた電場増強比ＲであるＲtとＲrとを用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換することにより、蛍光シグナル（Ｓm）の補正を行う。
【０１０９】
同一濃度のアナライトを含む検体溶液について、表面プラズモン共鳴センサーを用いて蛍光シグナル（Ｓm）を測定した場合でも、対象構造体（Ｘt）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０を用いて測定した場合には、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０を用いて測定した場合と比べて、見かけ上の蛍光シグナル（Ｓm）の強度が（Ｒt ／ Ｒr）倍となる。したがって、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０での測定値に換算するときには、もとの蛍光シグナル（Ｓm）に対して、その逆数を乗じる必要がある。
【０１１０】
したがって、上記式（２）により蛍光シグナル（Ｓm）を補正すれば、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さが互いに異なる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）を、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０での測定値に換算することにより正規化することができる。
【０１１１】
光学系
本発明の補正方法で用いる光源は、領域（Ｐ）での全反射蛍光および領域（Ｑ）での電場増強蛍光を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１１２】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤレーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍm）・（Ｍsa）に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１３】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン共鳴センサーに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明誘電体部材１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。なお、プリズムは、上記一体化構造体ブロックのプリズム部として上記透明誘電体部材（Ｔs）１１に組み込まれていてもよい。
【０１１４】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１１５】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン共鳴センサー表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１１６】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１１７】
「光検出部」としては、ＳＰＦＳ等に基づくアッセイ方法でＳＰＦＳを検出するために用いられる光検出装置を用いることができ、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサーも好適である。なお、本発明においては、この「光検出部」は、後述するアッセイ方法において蛍光シグナル（Ｓm）を検出するために用いられるＳＰＦＳ検出部としても機能する。
【０１１８】
［アッセイ方法］
本発明に係るアッセイ方法は、
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含む。
ここで、この工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正は、上述した補正方法を用いて行われる。
【０１１９】
＜工程（ａ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ａ）は、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程である。言い換えれば、この工程（ａ）は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程であり、図１においては、表面プラズモン共鳴センサー５０を調製する工程である。
【０１２０】
（プラズモンセンサー構造体）
工程（ａ）で用いられるプラズモンセンサー構造体２０は、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体である。このようなプラズモンセンサー構造体は、従来公知の方法により調製することができる。
【０１２１】
透明誘電体部材（Ｔm）
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する透明誘電体部材（Ｔm）２１は、プラズモンセンサー構造体２０の構造の骨格を構成するとともに、プラズモンセンサー構造体２０から調製される表面プラズモン共鳴センサー５０において、金属薄膜（Ｍm）２２が形成されている面に入射光６１ｃを導く媒体としても機能する。
【０１２２】
本発明で、透明誘電体部材（Ｔm）２１として用いられる透明誘電体部材は、前記「透明誘電体部材（Ｔs）」の項で挙げた各種材質および形態のものを用いることができる。
なお、後述する金属薄膜（Ｍm）２２を形成する前に、当該透明誘電体部材（Ｔm）２１の表面に対して酸またはプラズマによる洗浄処理を行うことが好ましい。
【０１２３】
金属薄膜（Ｍm）
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２について、前述した金属薄膜（Ｍsq）１２および金属薄膜（Ｍsa）３２と同様、一般的な表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜として一般に用いられるものと同様の金属を用いることができ、その金属種として、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項で挙げた各種金属種および形態のものを用いることができる。
【０１２４】
この金属薄膜（Ｍm）２２は、前記透明誘電体部材（Ｔm）２１のうち領域（Ａm）となる領域に対して、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項に挙げた形成方法を適用することにより形成できる。
金属薄膜（Ｍm）２２の厚さの絶対値についても、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項に挙げた範囲とすることができる。
【０１２５】
固定化リガンド含有層
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する固定化リガンド含有層２３は、第１のリガンド２３１を含んでいる。このような固定化リガンド含有層２３は、領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０を構成する固定化リガンド含有層３３と同様の構成とすることができ、また、同様の方法により形成される。
【０１２６】
（表面プラズモン共鳴センサー）
本発明で、表面プラズモン共鳴センサー５０は、前記プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより調製される。
【０１２７】
接触
本発明において、「接触」とは、表面プラズモン共鳴センサーのリガンド等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこの表面プラズモン共鳴センサーと接触させることをいう。ここで、この項および次に示す「流路」の項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１２８】
工程（ａ）では、上記検体と表面プラズモン共鳴センサーとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、表面プラズモン共鳴センサーのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、表面プラズモン共鳴センサーと検体とを接触させる態様が好ましい。
【０１２９】
送液
本発明で用いられる「送液」としては、後述する「検体」を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１３０】
流路
本発明において、「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。また、この流路の形状として、表面プラズモン共鳴センサーを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【０１３１】
その材料としては、表面プラズモン共鳴センサー部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。ここで、この「流路」の項において「表面プラズモン共鳴センサー部」とは、流路において表面プラズモン共鳴センサーのアッセイ測定領域と接する部分をいい、具体的には、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０における領域（Ａm）または図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１における領域（Ａs）と接する部分である。
【０１３２】
ただし、表面プラズモン共鳴センサー部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、表面プラズモン共鳴センサー部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。表面プラズモン共鳴センサー部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜およびＳＡＭが表面に存在する表面プラズモン共鳴センサーの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【０１３３】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、表面プラズモン共鳴センサー部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【０１３４】
表面プラズモン共鳴センサー部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、表面プラズモン共鳴センサー部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１３５】
流路において、薬物送達部から表面プラズモン共鳴センサー部に送液を導入する送液導入口、及びその送液を表面プラズモン共鳴センサー部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、表面プラズモン共鳴センサー部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
流路に表面プラズモン共鳴センサーを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【０１３６】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周が表面プラズモン共鳴センサー部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該表面プラズモン共鳴センサーとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、表面プラズモン共鳴センサーに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。
【０１３７】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路に表面プラズモン共鳴センサーを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するか或いは別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、ＳＡＭ層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１３８】
なお、本発明においては、図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１のように、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）を含む表面プラズモン共鳴センサーにおいて、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）とも接するように上記「表面プラズモン共鳴センサー部」を構成してもよい。あるいは、水など上記送液とは異なる媒体を領域（Ｐ）および領域（Ｑ）の表面に導入するために、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）と接するように第２の流路を設け、この第２の流路において、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）と接する部分に上記「表面プラズモン共鳴センサー部」と同様の構造を形成してもよい。
【０１３９】
検体
本発明で、表面プラズモン共鳴センサーを調製するために用いられる検体として、前記「≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫」の項で挙げたものを用いることができる。ここで、この項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１４０】
本発明のアッセイ方法においては、プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）への検体の接触は、通常、当該領域（Ａm）に接続された流路を通じて検体を含有する送液を当該領域（Ａm）に接触させることにより行われる。同様に、図２（ｂ）に示すような、領域（Ａs）をさらに有する構造体１０への検体の接触についても、同様に、領域（Ａs）に接続された流路を通じて検体を含有する送液を当該領域（Ａs）に接触させることにより行われる。
【０１４１】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１４２】
送液中の検体中に含有されるアナライト４２の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【０１４３】
蛍光修飾リガンド
本発明で、表面プラズモン共鳴センサーを調製するために用いられる蛍光修飾リガンド４１として、前記「≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫」の項で挙げたものを用いることができる。ここで、この項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１４４】
本発明のアッセイ方法においては、プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）への蛍光修飾リガンド４１の接触は、前記検体と接触させたプラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）に、流路を通じて蛍光修飾リガンド４１を含有する送液を接触させることにより行われる。同様に、図２（ｂ）に示すような、領域（Ａs）をさらに有する構造体１０への蛍光修飾リガンド４１の接触についても、同様に、領域（Ａs）に、流路を通じて蛍光修飾リガンド４１を含有する送液を接触させることにより行われる。
蛍光修飾リガンド４１の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記検体を含む送液の場合と同様である。
【０１４５】
洗浄工程
洗浄工程とは、プラズモンセンサー構造体２０の表面、および表面プラズモン共鳴センサー５０の表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程のうち少なくともいずれか一方が工程（ａ）に含まれることが好ましい。
【０１４６】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１４７】
送液を循環させる温度および流速は、それぞれ上記検体を含む送液の場合と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１４８】
＜工程（ｂ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｂ）は、前述の工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程である。
【０１４９】
具体的には、表面プラズモン共鳴センサーにおけるアッセイ測定領域（すなわち、図１に示す表面プラズモン共鳴センサー５０における領域（Ａm）および図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１における領域（Ａs））に対して、図１に示すように、入射光６１ｃを照射し、これにより、該アッセイ測定領域で発光した蛍光を表面プラズモン共鳴センサー上部に設置されたＳＰＦＳ検出部で検出し、蛍光量を蛍光シグナル（Ｓm）として数値化する工程である。
【０１５０】
ここで、本発明のアッセイ方法で用いられる光源、プリズム、光学フィルタ、偏光フィルタ、集光レンズとしては、上述した本発明の補正方法についての説明において「光学系」の項に挙げたものが用いられる。また、「ＳＰＦＳ検出部」についても、同じく「光学系」の項に上述した「光検出部」としてあげられている光検出装置を用いることができる。
【０１５１】
表面プラズモン共鳴センサーとして、図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１のように、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）を兼ね備えている表面プラズモン共鳴センサー、すなわち、前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している表面プラズモン共鳴センサーが用いられる場合、上述の補正方法で用いられる電場増強比Ｒtを得るための上記工程（i）〜（iii）を、この工程（ｂ）と併せて行うことができる。
【０１５２】
この工程（i）〜（iii）は、工程（ｂ）の直前に行ってもよいし、工程（ｂ）の直後に行ってもよい。これらの態様では、蛍光シグナル（Ｓm）、全反射蛍光シグナル（Ｓp）、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を、異なる時に単一のＳＰＦＳ検出部を用いて検出するとともに、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ｃ，６１ａ，６１ｂ）を単一光源を用いて供給することができるので、測定系を簡素化できるとともに、光源およびＳＰＦＳ検出部を構成する装置の性能における個体差によるばらつきを回避できる利点がある。
【０１５３】
また、この工程（i）〜（iii）は、工程（ｂ）と同時に行ってもよい。この場合、蛍光シグナル（Ｓm）と、全反射蛍光シグナル（Ｓp）および電場増強蛍光シグナル（Ｓq）のうち少なくともいずれか一方とを検出するために複数のＳＰＦＳ検出部を用いることになる。あるいは、ＣＣＤイメージセンサーなど多点計測が可能な撮像素子を用いてこれらのシグナルを同時に検出してもよい。工程（i）〜（iii）を、工程（ｂ）と同時に行う場合、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ｃ，６１ａ，６１ｂ）は、光学特性が同一の複数の光源を用いて供給してもよい。あるいは、単一の光源を用い、この光源から発せられる光を適当なビームスプリッターにより分割することにより、領域（Ａs）、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）の各領域に同時に入射光を供給してもよい。ただし、上記工程（i）において全反射蛍光シグナル（Ｓp）を測定するために用いられる入射光６１ａの入射角と、上記工程（ii）において電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を測定するために用いられる入射光６１ｂの入射角とは異なる場合があることから、分割した光の向きを入射角の変化に応じて適宜調節する機構が必要となり、測定系が複雑になる場合がある。
【０１５４】
さらに、この工程（i）〜（iii）を、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程に先だって行うことにより、この表面プラズモン共鳴センサーについて適用される電場増強比Ｒtを事前に算出してもよい。このような態様での電場増強比Ｒtの算出は、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）を有さない表面プラズモン共鳴センサーについての蛍光シグナル（Ｓm）について本発明の補正方法を適用するときにも有用である。
【０１５５】
＜工程（ｃ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｃ）は、前述の工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、上述した補正方法を用いて補正する工程である。この工程により、ＳＰＦＳ検出部で検出されたばかりの蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換することにより、表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（すなわち、図１に示す表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２、または図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１を構成する金属薄膜（Ｍsa）３２）における電場増強のばらつきを除去することができる。
【０１５６】
ここで、工程（ｃ）における補正でもちいられる上記参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒrは、通常の場合、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程に先だって事前に算出されたものが用いられる。ただ、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程と並行して、上記参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒrを算出するための上記工程（i）〜（iii）が行われることを排除するものではない。
【０１５７】
＜工程（ｄ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｄ）は、前述の工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）、すなわち、補正蛍光シグナル（Ｓm1）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程である。具体的には、前記工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）をもとに、検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１５８】
アッセイＳ／Ｎ比
工程（ｄ）においては、上記工程（ｂ）の前に測定した"ブランク蛍光シグナル"、上記工程（ｂ）での測定により得られた"アッセイ蛍光シグナル"、および何も修飾していない金属基板（本発明では、表面に金属薄膜を形成しただけで、さらなる修飾処理を行っていない透明誘電体基板も含む。）を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを"初期ノイズ"としたとき、下記式（３ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn （３ａ）
（上記式（３ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１５９】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（３ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜ （３ｂ）
（上記式（３ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（３ａ）の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１６０】
ＳＰＦＳの代わりに、共鳴角および反射光強度などを通じてＳＰＲを検出する場合には、上記ＩaおよびＩoとして、それぞれ、アッセイ蛍光シグナルおよびブランク蛍光シグナルの代わりに、対応するアッセイシグナルおよびプランクシグナルを用いることができる。
【０１６１】
〔アナライト検出装置〕
本発明で用いられるアナライト検出装置は、本発明の補正方法に用いられるとともに、上記表面プラズモン共鳴センサーを用いて、本発明のアッセイ方法を実施するためのものである。
【０１６２】
「アナライト検出装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。この「アナライト検出装置」は、本発明の補正方法を実施するために用いることができ、ビームスプリッターなどの光分離手段を備えていてもよい。なお、検体液、洗浄液、標識抗体液などを取り扱う際に、表面プラズモン共鳴センサーと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１６３】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサーとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１６４】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。本発明においては、このＳＰＦＳ検出部は、上述した本発明の補正方法を実施する際に、「光検出部」として用いることができる。
【０１６５】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【実施例】
【０１６６】
＜標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製＞
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(株)日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（(株)同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
【０１６７】
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液と、「Alexa Fluor 647」ストレプトアビジンコンジュゲート（Molecular Probes社製）の溶液とを混合し、４℃で６０分間攪拌して反応させた。
【０１６８】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を除去するため、分子量カットフィルタ（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１６９】
＜基板の作製＞
アッセイ測定領域（Ａ）、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成する基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆを以下の要領で作製した。
【０１７０】
まず、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎd〕＝１．７２）を６枚用意し、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。
【０１７１】
プラズマ洗浄された基板の片面のうち、アッセイ測定領域（Ａ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成しようとする部分に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。一方、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）を形成しようとする部分には、クロム薄膜および金薄膜の形成を行わなかった。
【０１７２】
次いで、上記工程により得られた基板を２５ｍｇ／ｍＬに調整した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
以上の工程を６枚の基板それぞれについて行うことにより、金属薄膜およびＳＡＭが形成された（反応層は未形成の）基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆを作製した。
【０１７３】
＜センサチップの作製＞
上記のようにして作製された基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記工程［１］によりセンサチップの構成とした後、下記工程［２］によりアッセイ測定領域（Ａ）を、下記工程［３］により全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）を、下記工程［４］により電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を作製し、それぞれセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆとした。
【０１７４】
［１］センサチップの構成
基板の金属薄膜およびＳＡＭが形成された側の面に、アッセイ測定領域（Ａ）、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成するための、それぞれ流路長１０ｍｍ、幅５ｍｍの３個の穴があいた、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを載せた。さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、上記領域（Ａ）、（Ｐ）および（Ｑ）それぞれの内側に位置するよう、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が形成されたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製天板を載せた。これらセンサー基板、ＰＤＭＳ製シート、およびＰＭＭＡ製天板の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、センサチップとした。
【０１７５】
［２］領域（Ａ）の作製
センサチップの領域（Ａ）の送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下に記載する各種流体の送液および循環はすべて、同様のチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。
【０１７６】
５０ｍＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および１００ｍＭの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを送液して２０分間循環させた後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(株)日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを送液して３０分間循環することで、当該抗体をＳＡＭに固定化した。その後、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳを３０分間循環送液させ、ブロッキング処理とした。
【０１７７】
［３］領域（Ｐ）および（Ｑ）の作製
以下の手順により、領域（Ｐ）および（Ｑ）の表面に蛍光分子層を形成した。
まず、丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル１００ｇを加熱還流し、さらにステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及び２−アセトアセトキシエチルメタクリレート３０ｇ、Ｎ，Ｎ′−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させて樹脂Ｒ−１の酢酸エチル溶液を得た。この樹脂溶液Ｒ−１を１ｍｌ計量し、更に蛍光色素Cy5（蛍光色素）モノNHS体を同モルのラウリルアミンと反応させたアミド体（Ｆ−１）を２０ｍＭ/ｍｌ含む酢酸エチル溶液を１ｍｌ加え撹拌して、蛍光剤塗布液を調製した。
【０１７８】
調製した蛍光剤塗布液を、上記［２］で得られたセンサー基板のＳＡＭ等が形成された面のうち、領域（Ｐ）および（Ｑ）を形成させようとする部位に、領域（Ｐ）および（Ｑ）における乾燥膜厚がともに１００ｎｍになるようにスピンコーターで塗布し、乾燥温度１００℃で５分間の乾燥を行い、蛍光分子層を形成した。
【０１７９】
＜シグナルの測定＞
上記のようにして作製されたセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記工程［４］により測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓa）の測定を、下記工程［５］により測定領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓp）の測定を、下記工程［６］により領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓq）の測定を行った。ここで、測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓa）および領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓq）の測定は表面プラズモン共鳴条件下で、領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓp）の測定は全反射減衰（ＡＴＲ）条件下でそれぞれ行われた。
【０１８０】
［４］シグナル（Ｓa）の測定
測定領域（Ａ）に、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が１０ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせて、表面プラズモン共鳴センサーとした。その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値をシグナル（Ｓa）とした。
【０１８１】
［５］シグナル（Ｓp）の測定
領域（Ｐ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。
この測定値をシグナル（Ｓp）とした。
【０１８２】
［６］シグナル（Ｓq）の測定
領域（Ｑ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。
この測定値をシグナル（Ｓq）とした。
【０１８３】
＜電場増強比Ｒならびに補正されたシグナル（Ｓa′）の算出＞
センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記のようにして補正されたシグナル（Ｓa′）を算出した。
【０１８４】
下記式（１）に基づき、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、電場増強比Ｒを算出した。
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
次に、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについて算出した電場増強比Ｒについて、センサチップＡについて算出した電場増強比Ｒでそれぞれ除算した値である補正係数ｋを算出した。
【０１８５】
そして、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについて、領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓa）の測定値に、１／ｋを乗じることにより、補正されたシグナル（Ｓa′）を算出した。
【０１８６】
結果は表２に示す通りである。ここで、シグナル（Ｓa）および（Ｓa′）において、「基板Ａ一致率」とは、センサチップＡにおけるシグナル強度を１００としたときの各センサチップにおける相対的なシグナル強度を表し、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについての値が１００に近いほどシグナルのばらつきが小さいことを示す。
【０１８７】
【表２】
【符号の説明】
【０１８８】
１０・・・電場増強評価構造体
１１・・・透明誘電体部材（Ｔｓ）
１２・・・金属薄膜（Ｍsq）
１３ａ・・・蛍光分子層（Ｆsp）
１３ｂ・・・蛍光分子層（Ｆsq）
２０・・・プラズモンセンサー構造体
２１・・・透明誘電体部材（Ｔm）
２２・・・金属薄膜（Ｍm）
３２・・・金属薄膜（Ｍsa）
２３，３３・・・固定化リガンド含有層
２３１，３３１・・・リガンド（第１のリガンド）
４１・・・蛍光修飾リガンド
４１１・・・第２のリガンド
４１２・・・蛍光色素（Ｄm）
４２・・・アナライト
５０，５１・・・表面プラズモン共鳴センサー
６１ａ，６１ｂ，６１ｃ・・・入射光
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療、バイオテクノロジー等の分野で利用されるＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）またはそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ（Localized surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：局在表面プラズモン励起増強蛍光分光法）などの測定系に関し、より具体的には、それらの測定系に用いられる手法および表面プラズモン共鳴センサーの構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＦＳは、誘電体部材上に形成された金属薄膜に全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で励起光を照射したときに、金属薄膜を透過したエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用して、金属薄膜近傍に捕捉されたアナライト（分析対象物）を標識する蛍光色素を効率的に励起させ、その蛍光シグナルを測定する方法である。このようなＳＰＦＳは、一般的な蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、サンプル中にアナライトがごく微量しか存在しない場合であってもそれを定量することができる。ＳＰＦＳの基本的な態様は、たとえば特許文献１および２に開示されている。
【０００３】
また、ＬＰＦＳは、上記ＳＰＦＳと組み合わせて利用することのできる方法であって、コロイド液を流すなどして金属コロイド粒子を蛍光色素近傍に位置させると、この金属コロイド粒子にもプラズモンが発生して局所的な電場増強効果が得られることを利用し、さらに効率良く蛍光色素を励起させてその蛍光シグナルを測定する方法である。
【０００４】
ＳＰＦＳおよびそれを利用するＳＰＦＳ−ＬＰＦＳなどの測定方法（以下「ＳＰＦＳ等」と総称する。）などによれば、たとえば、血液中の極微量の腫瘍マーカーを定量することにより、触診などによって検出することができない前臨床期の非浸潤癌（上皮内癌）の存在も高精度で予測することができるようになるため、医療、バイオテクノロジー等の分野における活用が期待される。
【０００５】
ところで、プラズモン共鳴により引き起こされた増強電場は、プラズモン共鳴が生じている表面からの距離が大きくなるにつれて急速に減衰する特性を有するため、プラズモン共鳴が生じている部位から離れた場所から直接観測することが困難である。そのため、プラズモン共鳴による電場増強を可視化する試みが、これまでにいくつか行われてきた。
【０００６】
例えば、非特許文献１では、ガラス基板表面に形成した金膜に格子を形成してなる構造体や、ガラス基板表面に形成した銀膜に単一のもしくは周期的に配置された複数の孔を形成してなる構造体に対して光を照射し、その格子または孔の近傍で起こる入射光と表面プラズモン分極により生じる光との干渉をフォトン走査型トンネル顕微鏡でマッピングすることによって、表面プラズモンを検出する試みがなされている。
【０００７】
また、非特許文献２では、帯状に配置された複数のシリカ突起を有するガラス基板表面に銀膜を形成してなる構造体に対し、顕微鏡の対物レンズを通じてレーザ光を照射し、予めこの構造体表面に塗布された蛍光分子からの蛍光をその顕微鏡で観測することによって、表面プラズモン分極の可視化を図る試みがなされている。
【０００８】
また、非特許文献３では、部分的にアルミ不透光膜を形成した透明誘電体基板の上に、誘電体薄膜と金膜を形成してなる構造体の裏側から光を照射し、このアルミ不透光膜を形成した部位とアルミ不透光膜を形成していない部位との界面で発生するプラズモン波の散乱を、蛍光分子からの蛍光としてあるいはフォトン走査型トンネル顕微鏡を用いて測定することによって、表面プラズモン分極の可視化を図る試みがなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００６−２１８１６９号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】William L. Barnes et al.，Nature，Vol. 424，p. 824〜830 (2003)
【非特許文献２】H. Ditlbacher, et al.，Appl. Phys. Lett.，Vol. 81(10)，p. 1762〜1764 (2002)
【非特許文献３】J. R. Krenn and J.-C. Weeber，Phil. Trans. R. Soc. Lond. A (2004) Vol. 362，p. 739〜756
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたり、蛍光シグナルの測定値についての信頼性を担保する必要があり、そのためには、測定値のばらつき（ＣＶ）を通常１０％以内に抑える必要がある。特に、抗体を固定化させたＳＰＦＳ基板に検体由来のアナライトを介して蛍光修飾抗体を固定化するサンドイッチ系など、アナライト濃度に応じてシグナルの絶対値が増加する系では、一般にアナライト濃度が低下するとＣＶが悪化し、検出感度および定量感度の低下につながる。そこで、蛍光シグナルの測定値におけるばらつきを減らすためには、ＳＰＦＳセンサー基板間での電場増強のばらつきを減らす必要がある。ここで、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を考えるにあたって、ＳＰＦＳセンサー基板に形成されている金属薄膜の厚さのばらつきが問題となる。ところが、すべてのＳＰＦＳセンサー基板において金属薄膜の厚さが寸分の違いもなく完全に同一となるようＳＰＦＳセンサー基板を製造することは現実的ではないことから、電場増強のばらつきによる蛍光シグナルへの影響を最小限とするためには、ＳＰＦＳセンサー基板で生じる電場増強を正規化し、これに基づいて測定値を補正する必要がある。その一方で、臨床検査に用いるＳＰＦＳセンサー基板には安価に製造できることも要求される。したがって、ＳＰＦＳセンサー基板に複雑な構造を形成することなく電場増強を正規化でき、これに基づいて測定値を補正することによって測定データのばらつきを最小限に抑えることが、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するうえで必要となる。
【００１２】
しかしながら、上記従来技術においては、基板表面に形成された特殊な形状の金属構造を通じて表面プラズモン分極の可視化を図るものであり、このような複雑な金属構造を、臨床検査に用いるＳＰＦＳセンサー基板に導入することは、ＳＰＦＳセンサー基板の生産工程が煩雑になるとともに、製造コストを大幅に引き上げるおそれがあり、現実的ではない。
【００１３】
そこで、本発明は、ＳＰＦＳセンサー基板に複雑な構造を導入することなく、ＳＰＦＳセンサー基板を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強のばらつきの影響を排除し、これによりＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を高めることが可能となる、測定データの補正方法、およびこれを用いたアッセイ方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は本発明を完成させる過程で、誘電体部材表面の一部に金属薄膜を形成させた基板に蛍光分子層を形成してなる基板の裏側から全反射条件で入射光を照射したときの、金属薄膜を形成させていない領域での蛍光強度と金属薄膜を形成させていない領域での蛍光強度との関係に基づいて、この金属薄膜の厚さによる電場増強への影響を見積もることが可能であるとの知見を得た。そして、この知見を利用すれば上記課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、下記［１］〜［１０］に示される、アッセイ方法、構造体、および表面プラズモン共鳴センサーを提供する。
［１］
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する対象構造体（Ｘt）について、
（i）前記領域（Ｐ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsp）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）該工程（i）の前に、該工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、前記領域（Ｑ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsq）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で該工程（i）の場合と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）該工程（i）および（ii）を経て得られる該全反射蛍光シグナル（Ｓp）と該電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる該電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2）該構造体（Ｘ）であって、該対象構造体（Ｘt）以外の構造体である参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、上記工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする蛍光シグナルの補正方法。
【００１６】
［２］
前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している前記表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される前記蛍光シグナル（Ｓm）についての前記変換が、該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる前記電場増強比Ｒを前記Ｒtとして用いることに行われる前記［１］に記載の補正方法。
【００１７】
［３］
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含み；
該工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正が、前記［１］に記載の補正方法を用いてなされることを特徴とするアッセイ方法。
【００１８】
［４］
前記（ｋ-1）で用いられる対象構造体（Ｘt）が、
前記透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）をさらに含み、且つ、該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する構造体であり、
該領域（Ａs）を前記領域（Ａm）として用いることにより、前記プラズモンセンサー構造体として供される
上記［３］に記載のアッセイ方法。
【００１９】
［５］
前記工程（ｃ）における補正が、
前記対象構造体（Ｘt）についての上記工程（i）〜（iii）を前記工程（ｂ）の直前、前記工程（ｂ）と同時、および前記工程（ｂ）の直後のいずれかにおいて行うことにより求められる前記Ｒtを用いて行われる
上記［４］に記載のアッセイ方法。
【００２０】
［６］
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒtを用いて行われる上記［３］または［４］に記載のアッセイ方法。
【００２１】
［７］
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒrを用いて行われる上記［５］または［６］に記載のアッセイ方法。
【００２２】
［８］
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少な
くとも１種の体液である上記［３］〜［７］のいずれかに記載のアッセイ方法。
【００２３】
［９］
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsp）および該蛍光分子層（Ｆsq）がともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成され、且つ、
該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する
構造体。
【００２４】
［１０］
上記［９］に記載の構造体と、アナライトと、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを含み、
前記領域（Ａs）内の前記第１のリガンドに、該アナライトを介して該蛍光修飾リガンドが結合している表面プラズモン共鳴センサー。
【発明の効果】
【００２５】
本発明により、ＳＰＦＳ基板を構成する金属薄膜の厚さのばらつきに由来する電場増強のばらつきの影響を排除することができるようになるため、ＳＰＦＳ等の測定精度や信頼性を従来よりも一層高めることができるとともに、臨床検査への応用に対応することにより生じるＳＰＦＳ基板の製造コスト上昇を抑えることができるため、ＳＰＦＳ等を用いた臨床検査システムの実用化に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のアッセイ方法を説明する模式図である。
【図２】図２（ａ）は、本発明で用いられる構造体を、この構造体による補正対象とするプラズモンセンサー構造体とともに示す模式図であり、図２（ｂ）および（ｃ）は、本発明で用いられる構造体の好適な実施態様を表す模式図である。
【図３】本発明で用いられる好適な構造体を応用した表面プラズモン共鳴センサーを表す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について、図１および図２を参照しながら具体的に説明する。
［補正方法］
本発明に係る蛍光シグナルの補正方法は、
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 対象構造体（Ｘt）について、以下の工程（i）〜（iii）を経て得られる電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2） 参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、以下の工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする。
【００２８】
ここで、対象構造体（Ｘt）は、
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する構造体である。
【００２９】
また、参照構造体（Ｘr）とは、構造体（Ｘ）であって、前記対象構造体（Ｘt）以外の構造体である。
対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）となる構造体（Ｘ）は、具体的には、図１に示される構造体１０のような構造を有している。
【００３０】
また、本発明において、これら対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒは、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）の各々について、図１に示すように、
（i）領域（Ｐ）に対して、
透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光６１ａを照射することにより、
領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）工程（i）の前に、工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、領域（Ｑ）に対して、
透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で工程（i）の場合と同一波長の入射光６１ｂを照射することにより、
領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）工程（i）および（ii）を経て得られる全反射蛍光シグナル（Ｓp）と電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる。
【００３１】
本発明の補正方法においては、対象構造体（Ｘt）は、蛍光シグナルの補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強を見積もるために用いられるものである。本発明では、対象構造体（Ｘt）の領域（Ｑ）で生じた電場増強の強度をもって、表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強の強度を評価するものであるであるから、対象構造体（Ｘt）を構成する金属薄膜（Ｍsq）は、表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（Ｍm）と同一の金属からなるとともに、同じ厚さを有する必要がある。この点から、本発明においては、蛍光シグナルの補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーとして、この対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化しているものを用いることが好ましい。この場合、当該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる電場増強比ＲをＲtとして用いることができ、このＲtを用いて、この表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される蛍光シグナル（Ｓm）についての補正を行うことができる。このような表面プラズモン共鳴センサーにおいて、当該対象構造体部分を構成する金属薄膜（Ｍsq）が金属薄膜（Ｍm）と一体化して単一の金属薄膜として形成されていると、さらに好ましい。
【００３２】
一方、参照構造体（Ｘr）は、対象構造体（Ｘt）の領域（Ｑ）で生じた電場増強の強度として代表された表面プラズモン共鳴センサーにおける電場増強を正規化するための基準として用いられるものである。この参照構造体（Ｘr）を用いることにより、異なる複数の対象構造体（Ｘt）間において、各対象構造体（Ｘt）が固有に有している電場増強の強度の相対関係を定めることができ、これに基づき各表面プラズモン共鳴センサー相互間で生じる電場増強のばらつきを補正することが可能となる。
【００３３】
なお、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒの算出については、後に詳述する。
なお、本発明において、後述する領域（Ａm），（Ａs）および（Ｑ）のように金属薄膜を有する領域での蛍光検出は表面プラズモン共鳴条件で、後述する領域（Ｐ）のように金属薄膜を有さない領域での蛍光検出は全反射減衰条件でそれぞれ行われる。ただ、本発明では、金属薄膜を有する領域での蛍光検出にあたっても、入射光の照射は全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角で行われることから、本明細書では、このような入射角についても「全反射条件となる入射角」という語を用いている。
【００３４】
〔適用対象となる表面プラズモン共鳴センサー〕
本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーは、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーであれば、特にその構成を問わず、一般に広く用いられている表面プラズモン共鳴センサーであってもよい。本発明の補正方法の適用対象となる表面プラズモン共鳴センサーにおける蛍光色素（Ｄm）の固定態様については、特に限定はなく、例えば、蛍光色素（Ｄm）が抗原−抗体反応を利用して固定化されていてもよいし、互いに相補的な配列を有する核酸における二重鎖形成反応やインターカレーションを利用して固定化されていてもよい。
【００３５】
ここで、図１に示した表面プラズモン共鳴センサー５０を例としてさらに説明すると、表面プラズモン共鳴センサーは、通常、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０において、該領域（Ａm）の第１のリガンド２３１に、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１が、アナライト４２を介して結合した形態を有している。
【００３６】
ここで、この領域（Ａm）に対して、透明誘電体部材（Ｔm）２１の、金属薄膜（Ｍm）２２とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で入射光６１ｃを照射することにより、金属薄膜（Ｍm）２２で表面プラズモンが発生し、これによりもたらされる電場増強によって蛍光分子（Ｄm）が励起し、蛍光を発する。ＳＰＦＳ等を用いたアッセイ方法では、このときの蛍光を蛍光シグナル（Ｓm）として検出することになる。
【００３７】
ところが、表面プラズモン共鳴センサー５０に固定されている蛍光分子（Ｄm）４１２の量が同じであっても、金属薄膜（Ｍm）２２の厚みに比例して電場増強の強度が増大し、その結果、蛍光シグナル（Ｓm）として検出される見かけ上の蛍光量が増大する。ここで、ＳＰＦＳ等を臨床検査に応用するにあたって問題となる点は、蛍光シグナル（Ｓm）としてある値が測定されたときに、どこまでが、検体に含まれるアナライトの量に基づく値であり、どこからが金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきに起因する見かけ上の増減値であるかの評価がしばしば困難になることである。そのため、臨床検査に用いられるアッセイ方法に許容される測定結果のばらつき（ＣＶ）は、通常１０％程度以内である。特に、正常値と異常値との差が小さい検査に用いる場合に問題が顕在化することから、場合によっては、ＣＶを１〜２％以内に抑える必要がある。これを考慮すると、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきによる蛍光シグナル（Ｓm）への影響は最大限に除去する必要があるものの、表面プラズモン共鳴センサー５０に用いられるプラズモンセンサー構造体２０を、全個体を通じて金属薄膜（Ｍm）２２の厚さが完全に同一になるよう製造することは困難である。したがって、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を補正により除去する必要があり、そのためには、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を見積もる必要がある。
【００３８】
本発明の補正方法では、次に述べる「構造体」を用いて金属薄膜（Ｍm）２２の厚さによる電場増強への影響を見積もり、これに基づき、表面プラズモン共鳴センサー５０について測定された蛍光シグナル（Ｓm）を補正して、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さのばらつきによる影響を除去するのである。
【００３９】
〔構造体〕
本発明において、構造体（Ｘ）として用いられる構造体は、図２（ａ）に示すように、
透明誘電体部材（Ｔs）１１と、
該透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsq）１２を介して、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）１３ａおよび該蛍光分子層（Ｆsp）１３ｂがともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されている構造体１０である。
【００４０】
本発明において、この構造体１０は、本発明の補正方法が適用対象とする表面プラズモン共鳴センサーについての蛍光シグナルの補正に用いられるものである。
なお、以下の記載において、この構造体１０は、一般的な意味で用いられる構造体との区別のため「電場増強評価構造体」と称される場合がある。
【００４１】
本発明の好適な態様において、この構造体１０は、図２（ｂ）に示すように、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsa）３２を介して、第１のリガンド３３１を含有する固定化リガンド含有層３３が形成された領域（Ａs）をさらに含んでいる。このとき、この金属薄膜（Ｍsa）３２および金属薄膜（Ｍsq）１２がともに同一の金属からなるものであり、且つ同じ厚さを有している。
【００４２】
≪領域（Ｐ）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが形成された領域（Ｐ）を有している。ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａは、蛍光分子（Ｄs）から構成される層である。この領域（Ｐ）は、図１に示される電場増強評価構造体１０では左側に描かれている。
【００４３】
蛍光色素を含む層が表面に存在する透明誘電体部材からなる構造体について、この透明誘電体部材を通じて、蛍光色素を含む層が存在する面の反対側から、この蛍光色素を含む層が存在する面に向けて全反射条件にて入射光を照射したとき、この構造体に金属が存在しなくても蛍光色素から蛍光（以下、「全反射蛍光」と称する。）が発光することがある。そこで、本発明では、領域（Ｐ）を、金属薄膜による電場増強の影響がない状態における全反射蛍光を測定するための全反射蛍光リファレンス領域として用いる。
【００４４】
≪領域（Ｑ）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsq）１２を介して、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが形成された領域（Ｑ）をも有している。ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、蛍光分子（Ｄs）から構成される層である。ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsp）１３ｂは、ともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成されている。
【００４５】
ＳＰＦＳ等に基づいて検体中のアナライトを測定するために用いられる表面プラズモン共鳴センサーは、一般に、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより調製される。ここで、金属薄膜（Ｍm）２２における電場増強は、金属薄膜（Ｍm）２２の膜厚に比例して強くなる傾向にある。また、金属によって、電場増強に関係する光学特性も変わる。
【００４６】
本発明では、この領域（Ｑ）を、補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜における電場増強を評価するための電場増強蛍光リファレンス領域として用いる。したがって、本発明で用いられるこの構造体１０を用いてこのような表面プラズモン共鳴センサーについて検出される蛍光シグナルの補正を行うに当たっては、この構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２が、補正を行おうとする表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜と同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する必要がある。その限りにおいて、この表面プラズモン共鳴センサーと一体の構造体であってもよいし、あるいは、この表面プラズモン共鳴センサーとは別々の構造体であってもよい。
【００４７】
≪領域（Ａs）≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、図２（ｂ）に示すように、好適な態様において、透明誘電体部材（Ｔs）１１上に、金属薄膜（Ｍsa）３２を介して、第１のリガンド３３１を含有する固定化リガンド含有層３３が形成された領域（Ａs）をさらに含んでいる。この領域（Ａs）は、表面プラズモン共鳴センサーとして用いられる領域であり、この領域（Ａs）を有することにより、電場増強評価構造体１０はプラズモンセンサー構造体としての機能を兼ね備えることとなる。言い換えれば、この態様において、電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔm）２１上に、金属薄膜（Ｍm）２２を介して、第１のリガンド２３１を含有する固定化リガンド含有層２３が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体２０と一体化した構造を有することになり、この領域（Ａs）はこのプラズモンセンサー構造体２０における領域（Ａm）と同等の機能を有するアッセイ測定領域として用いられる。
【００４８】
この固定化リガンド含有層３３において、アナライト４２を捕捉するための第１のリガンド３３１は、金属薄膜（Ｍsa）３２の直上に形成してもよいし、金属薄膜（Ｍsa）３２に常法によりＳＡＭ、スペーサ層等（いずれも図示せず）を形成してからその上に形成してもよい。また、蛍光修飾リガンド４１等がセンサー表面等に非特異的に結合しないよう、通常は第１のリガンド３３１からなる層が設けられた後にブロッキング処理がなされる。
【００４９】
≪構造体の構成≫
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０は、透明誘電体部材（Ｔs）１１表面のうち領域（Ｑ）となる領域および該当する場合には領域（Ａs）となる領域に、金属薄膜（Ｍsq）および金属薄膜（Ｍsa）をそれぞれ形成させた後、領域（Ｐ）となる領域および領域（Ｑ）となる領域に、蛍光分子層（Ｆsp）および（Ｆsq）をそれぞれ形成することにより作成される。ここで、領域（Ａs）をさらに有する電場増強評価構造体１０の場合には、領域（Ａs）となる金属薄膜（Ｍsa）を形成させた領域について、蛍光分子層に代えて固定化リガンド含有層３３を形成することにより作成される。
【００５０】
透明誘電体部材（Ｔs）
本発明で、電場増強評価構造体１０を構成する透明誘電体部材（Ｔs）１１は、電場増強評価構造体１０の構造の骨格を構成するとともに、電場増強評価構造体１０において、金属薄膜（Ｍsq）１２が形成されている面に入射光を導く媒体としても機能する。
【００５１】
本発明で、透明誘電体部材（Ｔs）１１として用いられる透明誘電体部材は、本発明の目的が達せられる限り、材質に特に制限はなく、例えば、ガラス製や、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのプラスチック製のもの、好ましくはｄ線（５８８ｎｍ）における屈折率〔ｎd〕が１．４０〜２．２０の範囲にある材質のものを用いることができる。
【００５２】
ただ、本発明においては、透明誘電体部材（Ｔs）１１として用いられる透明誘電体部材の材質は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーを構成する透明誘電体部材（Ｔm）と同じ材質のものである。
【００５３】
本発明において、透明誘電体部材（Ｔs）１１は、透明平面基板であってもよく、金属薄膜形成用平面のほかにプリズム部およびサンプル保持部をさらに含む一体化構造体ブロックの形態を有していてもよい。ここで、透明誘電体部材（Ｔs）１１として透明平面基板を用いる場合、厚さが好ましくは０．０１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．５〜５ｍｍであれば、大きさ（縦×横）は特に限定されない。
なお、後述する金属薄膜（Ｍsq）１２を形成する前に、当該透明誘電体部材（Ｔs）１１の表面に対して酸またはプラズマによる洗浄処理を行うことが好ましい。
【００５４】
金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２、および上記領域（Ａs）が存在する場合にさらに含まれる金属薄膜（Ｍsa）３２について、一般的な表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜として一般に用いられるものと同様の金属を用いることができる。その中で、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなることが好ましく、金からなることがより好ましい。これらの金属については、その合金の形態であってもよく、金属を積層したものであってもよい。このような金属種は、酸化に対して安定であり、かつ表面プラズモンによる電場増強が大きくなることから好適である。
【００５５】
ここで、透明誘電体部材（Ｔs）１１としてガラス製の透明誘電体部材を用いる場合には、ガラスと上記金属薄膜とをより強固に接着するため、あらかじめクロム、ニッケルクロム合金またはチタンの薄膜を形成することが好ましい。
【００５６】
ここで、本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２を構成する金属は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２を構成する金属と同一である必要があるし、また、上記領域（Ａs）が存在する場合に、金属薄膜（Ｍsa）３２を構成する金属と同一である必要がある。
【００５７】
透明平面基板上に金属薄膜を形成する方法としては、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２を形成するために一般に用いられている方法が挙げられ、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法等）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。薄膜形成条件の調整が容易なことから、スパッタリング法または蒸着法によりクロムの薄膜および金属薄膜を形成することが好ましい。
【００５８】
金属薄膜（Ｍsq）１２および金属薄膜（Ｍsa）３２の厚さは、一般に用いられている表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜と同様の厚さとすることができ、表面プラズモンが発生し易いよう、金、銀、アルミニウム、銅、白金、またはそれらの合金からなる金属薄膜の厚さはそれぞれ５〜５００ｎｍが好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜２０ｎｍが好ましい。電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍがより好ましく、クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍがより好ましい。
【００５９】
ここで、本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２の厚さは、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２の厚さと同一である必要があるし、一方、上記領域（Ａs）が存在する場合には、金属薄膜（Ｍsa）３２の厚さと同一である必要がある。
【００６０】
ここで、上記領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０にあたっては、金属薄膜（Ｍsq）と金属薄膜（Ｍsa）と別々に形成してもよいが、金属薄膜（Ｍsq）１２と金属薄膜（Ｍsa）３２とが確実に同一の厚さとなるよう、図２（ｃ）に示すように、金属薄膜（Ｍsq）１２と金属薄膜（Ｍsa）３２とが一体化して一つの金属薄膜を構成するような態様で一度に形成させることが好ましい。
【００６１】
蛍光分子
本発明において、「蛍光分子」とは、本発明において、所定の励起光を照射する、または電界効果を利用して励起することによって蛍光を発光する分子を意味し、該「蛍光」は、燐光など各種の発光も含む。
【００６２】
本発明で、電場増強評価構造体１０を構成する蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）として用いられる蛍光分子、ならびに、後述する蛍光修飾リガンド４１を構成する蛍光分子（Ｄm）４１２として用いられる蛍光分子は、いずれも、その種類に特に制限はなく、公知の蛍光色素のいずれであってもよい。一般に、単色比色計（ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｏｍｅｔｅｒ）よりむしろフィルタを備えた蛍光計の使用をも可能にし、かつ検出の効率を高める大きなストークス・シフトを有する蛍光色素が好ましい。ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａを構成する蛍光分子および蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）は、同一である必要がある。ただ、蛍光分子（Ｄs）と蛍光分子（Ｄm）４１２とでは、同一であってもよいし、励起波長は同じで発光波長が異なるものであってもよい。
【００６３】
本発明で用いることのできる蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス（株）製）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン（株）製）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン（株）製）などが挙げられ、さらに米国特許番号第６,４０６,２９７号、同第６,２２１,６０４号、同第５,９９４,０６３号、同第５,８０８,０４４号、同第５,８８０,２８７号、同第５,５５６,９５９号および同第５,１３５,７１７号に記載の蛍光色素も本発明で用いることができる。
【００６４】
これらのファミリーに含まれる代表的な蛍光色素の吸収波長（ｎｍ）および発光波長（ｎｍ）を表１に示す。
【００６５】
【表１】
また、蛍光分子として用いられる蛍光色素は、上記有機蛍光色素に限られない。例えば、例えばＥｕ、Ｔｂ等の希土類錯体系の蛍光色素も、本願発明に用いられる蛍光分子となりうる。希土類錯体は、一般的に励起波長（３１０〜３４０ｎｍ程度）と発光波長（Ｅｕ錯体で６１５ｎｍ付近、Ｔｂ錯体で５４５ｎｍ付近）との波長差が大きく、蛍光寿命が数百マイクロ秒以上と長い特徴がある。市販されている希土類錯体系の蛍光色素の一例としては、ＡＴＢＴＡ−Ｅｕ3+が挙げられる。
【００６６】
さらに、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）またはＡｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ；ＬｙｏＦｌｏｇｅｎ（登録商標））などに代表される蛍光タンパク質、ラテックスやシリカなどの蛍光微粒子なども、蛍光分子に含まれる。
【００６７】
なお、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、ＬＰＦＳに関与する金属コロイドによる吸光の少ない波長領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を、標識リガンドに用いることが望ましい。たとえば金コロイドを用いる場合には、金コロイドによる吸光による影響を最小限に抑えるため、最大蛍光波長が６００ｎｍ以上である蛍光色素、たとえばＣｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７などの近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることが望ましい。このような近赤外領域に最大蛍光波長を有する蛍光色素を用いることは、血液中の血球成分由来の鉄による吸光の影響を最小限に抑えることができる点で、検体として血液を用いる場合においても有用である。一方、銀コロイドを用いる場合には、最大蛍光波長が４００ｎｍ以上である蛍光色素を用いることが望ましい。
これらの蛍光色素は１種単独で用いてもよく、また２種以上併用してもよい。
【００６８】
蛍光分子層
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０を構成する蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、上記「蛍光分子」から構成されるものであり、ともに同一の蛍光分子（Ｄs）からなる。
【００６９】
この蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂは、透明誘電体部材（Ｔs）１１または金属薄膜（Ｍsq）１２の表面に、上記「蛍光分子」を塗布または蒸着させることにより形成することができる。また、透明誘電体部材（Ｔs）１１または金属薄膜（Ｍsq）１２の表面に、蛍光色素を含有する光透過性材料で形成された部材、または蛍光色素を含有する薄層を積層させることにより形成してもよい。
【００７０】
これらの蛍光分子層の厚さなどは、上述したような測定方法が行える範囲で適切に調整すればよい。ただ、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａおよび蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂとも、通常は、１０〜２０００ｎｍ程度、好ましくは２０〜２００ｎｍの厚さとなるように形成する。
【００７１】
なお、蛍光分子層を調製する際には、蛍光色素の経時安定剤を向上させるために酸化防止剤を併用してもよい。酸化防止剤としては、例えば、ペンタエリスリチルテトラキス［３−(３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル)］プロピオネート、２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノール、２，２'−ジオキシ−３，３'−ジ−ｔ−ブチル−５，５'−ジメチルジフェニルメタン、テトラキス［メチレン−３−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート］メタンなどが挙げられる。
【００７２】
ここで、電場増強評価構造体１０において、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａと蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂと別々に形成してもよいし、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａと蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂと一体化して全体として一つの蛍光分子層を構成するような態様で一度に形成させてもよい。
【００７３】
固定化リガンド含有層
本発明で用いられる電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）を形成する場合、図２（ｂ）に示すように、前記金属薄膜（Ｍsa）３２上に固定化リガンド含有層３３が形成されている。この固定化リガンド含有層３３はリガンド３３１を含んでおり、このリガンド３３１は、検体に含まれるアナライト４２が結合する土台となる。そして、このアナライト４２に、後述する蛍光修飾リガンド４１が結合することで、この領域（Ａs）が、表面プラズモン共鳴センサーとしての機能を有することになる。
【００７４】
本発明においては、この固定化リガンド含有層３３において、リガンド３３１は、金属薄膜（Ｍsa）３２と直接結合していてもよいが、通常は、次に述べるスペーサ層およびＳＡＭのうちの少なくとも一つを介して結合している。
【００７５】
スペーサ層
本発明において、電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）が存在する場合、この電場増強評価構造体１０には、必要に応じて、金属薄膜（Ｍsa）による蛍光分子４１２の金属消光を防止するため、この金属薄膜と固定化リガンド含有層３３（あるいは、後述するＳＡＭ）の間に誘電体からなるスペーサ層を形成してもよい。
【００７６】
誘電体としては、光学的に透明な各種無機物や、天然または合成ポリマーを用いることができる。なかでも、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を用いることが好ましい。
【００７７】
スペーサ層の厚さは、通常１０ｎｍ〜１ｍｍであり、共鳴角安定性の観点からは、好ましくは３０ｎｍ以下、より好ましくは１０〜２０ｎｍである。一方、電場増強効果の観点から、好ましくは２００ｎｍ〜１ｍｍであり、さらに電場増強効果の安定性から、４００ｎｍ〜１，６００ｎｍがより好ましい。また、ＳＰＦＳ−ＬＰＦＳ測定系においては、センサー表面（金属薄膜）と金属コロイド粒子との間に生じる電場をより効果的に増強させるため、スペーサ層の厚さは１０〜１００ｎｍであることが望ましい。
【００７８】
誘電体からなるスペーサ層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、電子線蒸着法、熱蒸着法、ポリシラザン等の材料を用いた化学反応による形成方法、またはスピンコーターによる塗布などが挙げられる。
【００７９】
ＳＡＭ
本発明において、電場増強評価構造体１０に領域（Ａs）が存在する場合、この電場増強評価構造体１０には、必要に応じて、金属薄膜（または上記スペーサ層）と固定化リガンド含有層３３の間にＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）を形成してもよい。
【００８０】
ＳＡＭを構成する分子としては、分子の一方の末端に金属薄膜等と結合可能な官能基（シラノール基、チオール基等）を、もう一方の末端に反応層を構成する分子と結合可能な反応性官能基（アミノ基、カルボキシル基、グリシジル基等）を有する化合物が用いられる。このような化合物はシランカップリング剤やＳＡＭ形成試薬として容易に入手できる。たとえば、炭素原子数４〜２０程度のカルボキシアルカンチオール（１０−カルボキシ−１−デカンチオールなど）は、光学的な影響が少ない、つまり透明性が高く、屈折率が低く、膜厚が薄いＳＡＭを形成することができるため好適である。ＳＡＭ構成分子の溶液（エタノール溶液等）を金属薄膜等に接触させ、当該分子の一方の官能基を金属薄膜等に結合させることにより、ＳＡＭを形成することができる。
【００８１】
リガンド
アナライトと特異的に結合し得る分子を「リガンド」と称する。本発明において、この「リガンド」は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成するリガンド２３１，領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０を構成するリガンド３３１、および後述する蛍光修飾リガンド４１を構成するリガンド４１１として用いられる。特に、表面プラズモン共鳴センサー５０の表面または領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０の表面に固定化された、アナライトをセンサー表面に捕捉するためのリガンド（すなわち、リガンド２３１およびリガンド３３１）を「第１のリガンド」（リガンドが抗体であれば「第１の抗体」）、アナライトを標識するために液中に存在する、蛍光色素と結合したリガンド（すなわち、リガンド４１１）を「第２のリガンド」（リガンドが抗体であれば「第２の抗体」）と称する。なお、第１のリガンドと第２のリガンドのリガンド部分は、同じでもよいし、異なっていてもよい。ただし、第１のリガンドがポリクローナル抗体である場合、第２のリガンドはモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、第１のリガンドがモノクローナル抗体である場合、第２のリガンドはその第１のリガンドが認識しないエピトープを認識するモノクローナル抗体であるか、またはポリクローナル抗体であることが望ましい。
【００８２】
リガンドは捕捉しようとするアナライトに応じて適切なものを選択すればよく、アナライトの所定の部位と特異的に結合しうる抗体、受容体、その他の特定の分子（たとえばビオチン化したアナライトを捕捉するためのアビジン）などをリガンドとすることができる。
【００８３】
表面プラズモン共鳴センサー５０の表面へのリガンド２３１の固定化、および領域（Ａs）を有する電場増強評価構造体１０の表面へのリガンド３３１の固定化は、常法を用いて行うことができる。
【００８４】
≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫
本発明において、上記領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０は、領域（Ａs）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーとして使用することができる。図３を参照すると、領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０は、表面プラズモン共鳴センサー５１として使用される。
【００８５】
すなわち、本発明では、上記領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０と、アナライト４２と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを含み、
この領域（Ａs）内の前記第１のリガンド３３１に、該アナライト４２を介して該蛍光修飾リガンド４１が結合している表面プラズモン共鳴センサーが提供される。
【００８６】
このような表面プラズモン共鳴センサーは、上記領域（Ｐ）および領域（Ｑ）も兼ね備えていることから、上記対象構造体（Ｘt）としての機能も持ち合わせており、領域（Ａs）内に形成されている表面プラズモン共鳴センサー部につき測定される蛍光シグナル（Ｓm）を補正するにあたり、対象構造体部分として機能する領域（Ｐ）および領域（Ｑ）について得られる電場増強比ＲをＲtとして用いることができる。
【００８７】
アナライト
本発明において「アナライト」４２は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する透明誘電体部材（Ｔm）２１表面に固定化された第１のリガンド２３１、または領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０を構成する透明誘電体部材（Ｔs）１１の表面に固定化された第１のリガンド３３１を特異的に認識され（または、認識し）結合し得る分子または分子断片を意味する。このような「分子」または「分子断片」として、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００８８】
検体
上記「アナライト」４２を含むまたは含んでいる可能性のある、ＳＰＦＳ等に供される物質を「検体」と称す。たとえば、ヒト、ヒト以外のほ乳類（モデル動物、ペット等）、その他の動物から採取される血液（血清・血漿）、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが検体として挙げられる。分析の際、検体は必要に応じて、純水、生理食塩水、緩衝液、試薬溶液などの各種の溶媒と混合して用いてもよい。このような検体の混合液または検体そのもの、あるいは所定の目的のために調製したアナライトを含有する溶液など、ＳＰＦＳ等によるシグナルを測定するために表面プラズモン共鳴センサーの所定の領域に送液される流体（溶液、懸濁液、ゾル、その他流動性を有する物質を含む。）をいずれも「試料」と総称する。
【００８９】
なお、「標識リガンド溶液」を調製する際にも上記溶媒を用いると好都合である。また、ＳＰＦＳ等においてシグナルを測定する際、流路は通常、アナライトも標識リガンドも含まない液体で満たされた状態にされるが、そのような液体としては、試料液の調製に用いられる上記溶媒を単独で用いると好都合である。
【００９０】
蛍光修飾リガンド
本発明で用いられる蛍光修飾リガンド４１は、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２からなるものであり、リガンドとして２次抗体を用いる場合、検体中に含有されるアナライト（標的抗原）を認識し結合し得る抗体であることが好ましい。この蛍光修飾リガンド４１は、一般的な免疫染色法でも用いられているリガンドと蛍光色素との複合体（コンジュゲート）と同様にして作製することができる。たとえば、リガンドとアビジン（ストレプトアビジン等を含む）との複合体、および蛍光色素とビオチンとの複合体をそれぞれ作製し、これらを反応させることにより、アビジン／ビオチンを介してリガンドに蛍光色素が結合した複合体（１のアビジンに対し最大４のビオチンが結合しうる）が得られる。上述のようなビオチンとアビジンの反応以外にも、蛍光標識法で用いられている一次抗体−二次抗体の反応様式や、カルボキシル基とアミノ基、イソチオシアネートとアミノ基、スルホニルハライドとアミノ基、ヨードアセトアミドおよびチオール基などの反応を用いてもよい。
【００９１】
本発明において、第２のリガンドは、アナライト４２に蛍光分子による標識化を行う目的で用いられるリガンドであり、前記第１のリガンドと同じでもよいし、異なっていてもよい。
【００９２】
〔蛍光シグナル（Ｓm）の補正〕
本発明において、表面プラズモン共鳴センサーについて測定される蛍光シグナル（Ｓm）の補正は、上記電場増強評価構造体１０のうち、金属薄膜（Ｍsq）が、この表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（Ｍm）を構成する金属と同一の金属からなるものを構造体（Ｘ）として用いることにより行われる。
【００９３】
電場増強比Ｒの取得
まず、補正の第１段階として、この構造体（Ｘ）のうち、金属薄膜（Ｍsq）が金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有するものを対象構造体（Ｘt）として用い、該対象構造体（Ｘt）以外の任意の構造体（Ｘ）を参照構造体（Ｘr）として用いた上で、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒを、対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）の各々について、以下の（i）〜（iii）に示すステップを通じて、それぞれＲtおよびＲrとして求める。
【００９４】
（i）全反射蛍光シグナル（Ｓp）の検出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第１のステップとして、領域（Ｐ）に対して、透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａが存在する面とは反対側の表面（図１においては紙面下側にある面を指す。以下、透明誘電体部材（Ｔs）・（Ｔm）に対して蛍光分子層（Ｆsp）・（Ｆsq）や金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍm）・（Ｍsa）などが存在する側を「上」と称し、これと反対側を「下」と称することがある。）から、全反射条件となる入射角で入射光６１ａを照射することにより、この領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程が行われる。
【００９５】
具体的には、図１に示すように、紙面の下側にあるレーザ光などの光源（図示せず）から、透明誘電体部材（Ｔs）１１の下部に接した形で置かれたプリズム（図示せず）を通じて、領域（Ｐ）に入射光６１ａを照射し、これにより、領域（Ｐ）で発光した蛍光を、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）の上部に設置された光検出部で検出し、蛍光量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として数値化する工程である。
【００９６】
このとき、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａの上には、水、検体を希釈するために用いられるバッファー溶液または検体溶液などが存在していてもよい。
ここで、蛍光分子層（Ｆsp）１３ａを構成する蛍光分子（Ｄs）を励起するために導入される入射光６１ａは、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光６１ｃと同一波長のものである。
【００９７】
この工程（i）により、金属薄膜による電場増強の影響を受けない状態での全反射蛍光が検出されることから、全反射蛍光シグナル（Ｓp）は、電場増強のばらつきによる影響を評価する上でブランク基準となる。
【００９８】
（ii）電場増強蛍光シグナル（Ｓq）の検出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第２のステップとして、領域（Ｑ）に対して、透明誘電体部材（Ｔs）１１の、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂが存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で入射光６１ｂを照射することにより、この領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程が行われる。
【００９９】
具体的には、図１に示すように、紙面の下側にあるレーザ光などの光源（図示せず）から、透明誘電体部材（Ｔs）１１の下部に接した形で置かれたプリズム（図示せず）を通じて、領域（Ｑ）に入射光６１ｂを照射し、これにより、領域（Ｑ）で発光した蛍光を、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）の上部に設置された光検出部で検出し、蛍光量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として数値化する工程である。
【０１００】
このとき、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂの上には、水、検体を希釈するために用いられるバッファー溶液または検体溶液が存在していてもよいが、この場合には、前記（i）において蛍光分子層（Ｆsp）１３ａの上に存在していたものと同じ媒体を存在させる。
【０１０１】
ここで、蛍光分子層（Ｆsq）１３ｂを構成する蛍光分子（Ｄs）を励起するために導入される入射光６１ｂは、工程（i）の場合と同一波長の光、すなわち、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光６１ｃと同一波長のものである。ただし、工程（ii）での全反射条件での測定に最適な入射角は、工程（i）における入射角と異なる場合がある。
【０１０２】
この工程（ii）は、前記工程（i）と同時に行ってもよいし、あるいは、前記工程（i）の前もしくは後に行ってもよい。
この工程（ii）により、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）における、金属薄膜による電場増強の影響を受けて増強された全反射蛍光が検出されることから、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）は、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）における電場増強の度合いを表すリファレンス値となる。
【０１０３】
（iii）電場増強比Ｒの算出
本発明の補正方法においては、電場増強比Ｒを算出するための第３のステップとして、上記工程（i）および（ii）を経て得られる全反射蛍光シグナル（Ｓp）と電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程が行われる。この電場増強比Ｒは、対象構造体（Ｘt）または参照構造体（Ｘr）に形成されている金属薄膜（Ｍsq）による表面プラズモンによって全反射蛍光がそれだけ増光したかを示す値、すなわち、金属薄膜（Ｍsq）による電場増強の度合いを示す値であり、本発明の補正方法では、このＲをもって、各対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）に固有の電場増強を評価するのである。すなわち、対象構造体（Ｘt）について算出される電場増強比ＲであるＲtと、参照構造体（Ｘr）について算出される電場増強比ＲであるＲrとを求めれば、各対象構造体（Ｘt）および参照構造体（Ｘr）に固有の電場増強特性をＲtまたはＲrの形で対比することができる。
【０１０４】
ここで、上記工程（i）〜（iii）は、表面プラズモン共鳴センサーについて蛍光シグナル（Ｓm）を測定する一連のアッセイ工程において行ってもよいし、アッセイ工程の前に事前に行ってもよい。
【０１０５】
また、上記工程（i）と上記工程（ii）とを同時に行ってもよいし、あるいは異なる時にて行ってもよい。
上記工程（i）と上記工程（ii）とを異なる時にて行う場合、全反射蛍光シグナル（Ｓp）、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を、単一の光検出部を用いて検出するとともに、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ａ，６１ｂ）を単一光源を用いて供給することができるので、測定系を簡素化できるとともに、光源および光検出部を構成する装置の性能における個体差によるばらつきを回避できる利点がある。
【０１０６】
一方、上記工程（i）と上記工程（ii）とを同時に行う場合、全反射蛍光シグナル（Ｓp）および電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を検出するために複数の光検出部を用いることになる。あるいは、ＣＣＤイメージセンサーなど多点計測が可能な撮像素子を用いてこれらのシグナルを同時に検出してもよい。これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ａ，６１ｂ）は、光学特性が同一の複数の光源を用いて供給してもよい。あるいは、単一の光源を用い、この光源から発せられる光を適当なビームスプリッターにより分割することにより、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）の各領域に同時に入射光を供給してもよい。ただし、上記工程（i）において全反射蛍光シグナル（Ｓp）を測定するために用いられる入射光６１ａの入射角と、上記工程（ii）において電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を測定するために用いられる入射光６１ｂの入射角とは異なる場合があることから、分割した光の向きを入射角の変化に応じて適宜調節する機構が必要となり、測定系が複雑になる場合がある。
【０１０７】
ところで、表面プラズモン共鳴センサー５０の材料となるプラズモンセンサー構造体２０を、１枚の大きな透明誘電体部材上に金属薄膜を形成してなるプラズモンセンサーバルク構造体を切り分けることにより製造する場合には、必ずしも全ての表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についてのＲtを実測することを要しない。例えば、同一のプラズモンセンサーバルク構造体から得られる表面プラズモン共鳴センサー５０は、お互いに膜厚が同一であるか、あるいは金属薄膜の膜厚分布に一定の傾向を有している可能性が高い。したがって、この場合には、そのうちの一部の表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についてのＲtを実測しておいて、同一のプラズモンセンサーバルク構造体から得られるほかの表面プラズモン共鳴センサー５０に対応する対象構造体（Ｘt）についての仮想的なＲtとして、この実測しておいたＲtの数値をそのまま流用するか、あるいは、この実測しておいたＲtの数値から推測した値を用いることもできる。
【０１０８】
蛍光シグナルの換算
そして、補正の第２段階として、対象構造体（Ｘt）と参照構造体（Ｘr）とについてそれぞれ得られた電場増強比ＲであるＲtとＲrとを用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換することにより、蛍光シグナル（Ｓm）の補正を行う。
【０１０９】
同一濃度のアナライトを含む検体溶液について、表面プラズモン共鳴センサーを用いて蛍光シグナル（Ｓm）を測定した場合でも、対象構造体（Ｘt）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０を用いて測定した場合には、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０を用いて測定した場合と比べて、見かけ上の蛍光シグナル（Ｓm）の強度が（Ｒt ／ Ｒr）倍となる。したがって、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０での測定値に換算するときには、もとの蛍光シグナル（Ｓm）に対して、その逆数を乗じる必要がある。
【０１１０】
したがって、上記式（２）により蛍光シグナル（Ｓm）を補正すれば、金属薄膜（Ｍm）２２の厚さが互いに異なる表面プラズモン共鳴センサー５０における蛍光シグナル（Ｓm）を、比較構造体（Ｘr）を構成する金属薄膜（Ｍsq）１２と同じ膜厚の金属薄膜（Ｍm）２２を有する表面プラズモン共鳴センサー５０での測定値に換算することにより正規化することができる。
【０１１１】
光学系
本発明の補正方法で用いる光源は、領域（Ｐ）での全反射蛍光および領域（Ｑ）での電場増強蛍光を生じさせることができるものであれば、特に制限がないものの、波長分布の単一性および光エネルギーの強さの点で、レーザ光を光源として用いることが好ましい。レーザ光は、光学フィルタを通して、プリズムに入射する直前のエネルギーおよびフォトン量を調節することが望ましい。
【０１１２】
「レーザ光」としては、例えば、波長２００〜９００ｎｍ、０.００１〜１,０００ｍＷのＬＤレーザ、波長２３０〜８００ｎｍ（金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍm）・（Ｍsa）に用いる金属種によって共鳴波長が決まる。）、０．０１〜１００ｍＷの半導体レーザなどが挙げられる。
【０１１３】
「プリズム」は、各種フィルタを介したレーザ光が、プラズモン共鳴センサーに効率よく入射することを目的としており、屈折率が透明誘電体部材１１と同じであることが好ましい。本発明は、全反射条件を設定できる各種プリズムを適宜選択することができることから、角度、形状に特に制限はなく、例えば、６０度分散プリズムなどであってもよい。なお、プリズムは、上記一体化構造体ブロックのプリズム部として上記透明誘電体部材（Ｔs）１１に組み込まれていてもよい。
【０１１４】
「光学フィルタ」としては、例えば、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。「減光（ＮＤ）フィルタ」（または、中性濃度フィルタ）は、入射レーザ光量を調節することを目的とするものである。特に、ダイナミックレンジの狭い検出器を使用するときには精度の高い測定を実施する上で用いることが好ましい。
【０１１５】
「偏光フィルタ」は、レーザ光を、表面プラズモンを効率よく発生させるＰ偏光とするために用いられるものである。
「カットフィルタ」は、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン共鳴センサー表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光、などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば、干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【０１１６】
「集光レンズ」は、検出器に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであり、任意の集光系でよい。簡易な集光系として、顕微鏡などで使用されている、市販の対物レンズ（例えば、（株）ニコン製またはオリンパス（株）製等）を転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【０１１７】
「光検出部」としては、ＳＰＦＳ等に基づくアッセイ方法でＳＰＦＳを検出するために用いられる光検出装置を用いることができ、超高感度の観点からは光電子増倍管（浜松ホトニクス（株）製のフォトマルチプライヤー）が好ましい。また、これらに比べると感度は下がるが、画像として見ることができ、かつノイズ光の除去が容易なことから、多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサーも好適である。なお、本発明においては、この「光検出部」は、後述するアッセイ方法において蛍光シグナル（Ｓm）を検出するために用いられるＳＰＦＳ検出部としても機能する。
【０１１８】
［アッセイ方法］
本発明に係るアッセイ方法は、
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含む。
ここで、この工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正は、上述した補正方法を用いて行われる。
【０１１９】
＜工程（ａ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ａ）は、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程である。言い換えれば、この工程（ａ）は、本発明の補正方法を適用する対象となる表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程であり、図１においては、表面プラズモン共鳴センサー５０を調製する工程である。
【０１２０】
（プラズモンセンサー構造体）
工程（ａ）で用いられるプラズモンセンサー構造体２０は、透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体である。このようなプラズモンセンサー構造体は、従来公知の方法により調製することができる。
【０１２１】
透明誘電体部材（Ｔm）
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する透明誘電体部材（Ｔm）２１は、プラズモンセンサー構造体２０の構造の骨格を構成するとともに、プラズモンセンサー構造体２０から調製される表面プラズモン共鳴センサー５０において、金属薄膜（Ｍm）２２が形成されている面に入射光６１ｃを導く媒体としても機能する。
【０１２２】
本発明で、透明誘電体部材（Ｔm）２１として用いられる透明誘電体部材は、前記「透明誘電体部材（Ｔs）」の項で挙げた各種材質および形態のものを用いることができる。
なお、後述する金属薄膜（Ｍm）２２を形成する前に、当該透明誘電体部材（Ｔm）２１の表面に対して酸またはプラズマによる洗浄処理を行うことが好ましい。
【０１２３】
金属薄膜（Ｍm）
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２について、前述した金属薄膜（Ｍsq）１２および金属薄膜（Ｍsa）３２と同様、一般的な表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜として一般に用いられるものと同様の金属を用いることができ、その金属種として、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項で挙げた各種金属種および形態のものを用いることができる。
【０１２４】
この金属薄膜（Ｍm）２２は、前記透明誘電体部材（Ｔm）２１のうち領域（Ａm）となる領域に対して、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項に挙げた形成方法を適用することにより形成できる。
金属薄膜（Ｍm）２２の厚さの絶対値についても、前記「金属薄膜（Ｍsq）・（Ｍsa）」の項に挙げた範囲とすることができる。
【０１２５】
固定化リガンド含有層
本発明で、プラズモンセンサー構造体２０を構成する固定化リガンド含有層２３は、第１のリガンド２３１を含んでいる。このような固定化リガンド含有層２３は、領域（Ａs）をさらに含む電場増強評価構造体１０を構成する固定化リガンド含有層３３と同様の構成とすることができ、また、同様の方法により形成される。
【０１２６】
（表面プラズモン共鳴センサー）
本発明で、表面プラズモン共鳴センサー５０は、前記プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンド４１１と蛍光分子（Ｄm）４１２とからなる蛍光修飾リガンド４１とを接触させることにより調製される。
【０１２７】
接触
本発明において、「接触」とは、表面プラズモン共鳴センサーのリガンド等が固定化されている面が送液中に浸漬されている状態で、この送液中に含まれる対象物をこの表面プラズモン共鳴センサーと接触させることをいう。ここで、この項および次に示す「流路」の項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１２８】
工程（ａ）では、上記検体と表面プラズモン共鳴センサーとの「接触」は、流路中に循環する送液に検体が含まれ、表面プラズモン共鳴センサーのリガンドが固定化されている片面のみが該送液中に浸漬されている状態において、表面プラズモン共鳴センサーと検体とを接触させる態様が好ましい。
【０１２９】
送液
本発明で用いられる「送液」としては、後述する「検体」を希釈した溶媒または緩衝液と同じものが好ましく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【０１３０】
流路
本発明において、「流路」とは、微量な薬液の送達を効率的に行うことができ、反応促進を行うために送液速度を変化させたり、循環させたりすることができる直方体または管状のものである。また、この流路の形状として、表面プラズモン共鳴センサーを設置する個所近傍は直方体構造を有することが好ましく、薬液を送達する個所近傍は管状を有することが好ましい。
【０１３１】
その材料としては、表面プラズモン共鳴センサー部ではメチルメタクリレート、スチレン等を原料として含有するホモポリマーまたは共重合体；ポリエチレン等のポリオレフィンなどの光透過性の材質からなり、薬液送達部ではシリコーンゴム、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリマーを用いる。ここで、この「流路」の項において「表面プラズモン共鳴センサー部」とは、流路において表面プラズモン共鳴センサーのアッセイ測定領域と接する部分をいい、具体的には、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０における領域（Ａm）または図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１における領域（Ａs）と接する部分である。
【０１３２】
ただし、表面プラズモン共鳴センサー部については、蛍光測定時に流路が一定の形状に保たれ、且つプラズモン励起により発生した蛍光の検出が妨げられない限り、必ずしもその流路構造の全てを光透過性の材質のみから構成する必要はない。すなわち、表面プラズモン共鳴センサー部の流路のうち、プラズモン励起により発生した蛍光を透過させて検出部に導くために必要な部分、具体的には蛍光の集光に必要な透光窓を含む部分については、光透過性の材質で構成する必要があるが、その他の部分については、その一部または全部を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。表面プラズモン共鳴センサー部の流路が直方体構造を有する場合、金属薄膜およびＳＡＭが表面に存在する表面プラズモン共鳴センサーの面を底面としたときに、例えば、この底面と対向する位置にある天井面を光透過性の材質で構成し、側面を光透過性の材質以外の化学的に安定な材質で構成してもよい。
【０１３３】
ここで、前記その他の部分、例えば側面は、蛍光測定時に一定の形状が保たれる限り、必ずしも剛体である必要はなく、シール性を確保するために適度な弾性を有していてもよい。例えば、表面プラズモン共鳴センサー部の流路について、天井面をポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で構成し、側面をシリコーンゴムで構成してもよい。
【０１３４】
表面プラズモン共鳴センサー部においては、検体との接触効率を高め、拡散距離を短くする観点から、表面プラズモン共鳴センサー部の流路の断面として、縦×横がそれぞれ独立に１００ｎｍ〜１ｍｍ程度が好ましい。
【０１３５】
流路において、薬物送達部から表面プラズモン共鳴センサー部に送液を導入する送液導入口、及びその送液を表面プラズモン共鳴センサー部から排出する送液排出口の位置は、いずれも、蛍光測定の妨げとならない限り特に限定されない。例えば、表面プラズモン共鳴センサー部の流路が直方体構造を有する場合、前記送液導入口及び送液排出口とも天井面に設けるのが流路の作成上簡便であるが、この送液導入口と送液排出口とのうちいずれか一方、あるいはその両方を側面に設けてもよい。
流路に表面プラズモン共鳴センサーを固定する方法は、流路が一定の形状に保たれ、且つ蛍光測定が妨げられない限り特に限定されない。
【０１３６】
このような固定方法の例としては、小規模ロット（実験室レベル）では、まず、表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている表面上に、一定の厚さを有するシリコーンゴム製シートまたはＯリングを載せることによって流路の側面構造を形成し、次いで、その上に送液導入口及び送液排出口を設けてある光透過性の天板（例えば、ＰＭＭＡ基板）を配置することによって流路の天井面を形成し、その後、これらを圧着して適当な留め具により固定する方法などが挙げられる。このとき、側面構造を構成する材料として、その中央部に任意の形状および大きさを有する穴を開けてある、適当な厚さを有するシリコーンゴム製シートを用いると、この穴の内周が表面プラズモン共鳴センサー部の流路の側面構造となることから、所要の形状および大きさを有する流路を容易に形成することができるので好ましい。例えば、まず、該表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている表面に、流路高さ０．５ｍｍを有する穴あきポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを該表面プラズモン共鳴センサーの金属薄膜が形成されている部位を囲むようにして配置し、次いで、このポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートの上に、予め送液導入口及び送液排出口を設けてあるＰＭＭＡ基板を配置し、その後、該ＰＭＭＡ基板と該ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートと該表面プラズモン共鳴センサーとを圧着し、ビス等の留め具により固定する方法が好ましい。また、表面プラズモン共鳴センサーに、シリコーンゴム製シートまたはＯリングと光透過性の天板とを圧着し、固定するにあたっては、必要に応じて、シリコーンゴムまたはステンレスなどの材質でできた適当なスペーサを併用してもよい。
【０１３７】
また、工業的に製造される大ロット（工場レベル）では、流路に表面プラズモン共鳴センサーを固定する方法としては、プラスチックの一体成形品に直接金基板を形成するか或いは別途作製した金基板を固定し、金表面に誘電体層、ＳＡＭ層およびリガンド固定化を行った後、流路の天板に相当するプラスチックの一体成形品により蓋をすることで製造できる。必要に応じてプリズムを流路に一体化することもできる。
【０１３８】
なお、本発明においては、図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１のように、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）を含む表面プラズモン共鳴センサーにおいて、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）とも接するように上記「表面プラズモン共鳴センサー部」を構成してもよい。あるいは、水など上記送液とは異なる媒体を領域（Ｐ）および領域（Ｑ）の表面に導入するために、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）と接するように第２の流路を設け、この第２の流路において、この領域（Ｐ）および領域（Ｑ）と接する部分に上記「表面プラズモン共鳴センサー部」と同様の構造を形成してもよい。
【０１３９】
検体
本発明で、表面プラズモン共鳴センサーを調製するために用いられる検体として、前記「≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫」の項で挙げたものを用いることができる。ここで、この項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１４０】
本発明のアッセイ方法においては、プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）への検体の接触は、通常、当該領域（Ａm）に接続された流路を通じて検体を含有する送液を当該領域（Ａm）に接触させることにより行われる。同様に、図２（ｂ）に示すような、領域（Ａs）をさらに有する構造体１０への検体の接触についても、同様に、領域（Ａs）に接続された流路を通じて検体を含有する送液を当該領域（Ａs）に接触させることにより行われる。
【０１４１】
送液を循環させる温度および時間としては、検体の種類などにより異なり、特に限定されるものではないが、通常２０〜４０℃×１〜６０分間、好ましくは３７℃×５〜１５分間である。
【０１４２】
送液中の検体中に含有されるアナライト４２の初期濃度は、１００μｇ／ｍＬ〜０．０００１ｐｇ／ｍＬであってもよい。
送液の総量、すなわち流路の容積としては、通常０．０００１〜２０ｍＬ、好ましくは０．０１〜１ｍＬである。
送液の流速は、通常１〜２,０００μＬ／ｍｉｎ、好ましくは５〜５００μＬ／ｍｉｎである。
【０１４３】
蛍光修飾リガンド
本発明で、表面プラズモン共鳴センサーを調製するために用いられる蛍光修飾リガンド４１として、前記「≪表面プラズモン共鳴センサーとしての使用≫」の項で挙げたものを用いることができる。ここで、この項で言及される「表面プラズモン共鳴センサー」は、図１に示される表面プラズモン共鳴センサー５０および図３に示される表面プラズモン共鳴センサー５１を包含する概念である。
【０１４４】
本発明のアッセイ方法においては、プラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）への蛍光修飾リガンド４１の接触は、前記検体と接触させたプラズモンセンサー構造体２０の領域（Ａm）に、流路を通じて蛍光修飾リガンド４１を含有する送液を接触させることにより行われる。同様に、図２（ｂ）に示すような、領域（Ａs）をさらに有する構造体１０への蛍光修飾リガンド４１の接触についても、同様に、領域（Ａs）に、流路を通じて蛍光修飾リガンド４１を含有する送液を接触させることにより行われる。
蛍光修飾リガンド４１の送液中の濃度は、０.００１〜１０,０００μｇ／ｍＬが好ましく、１〜１,０００μｇ／ｍＬがより好ましい。
送液を循環させる温度、時間および流速は、それぞれ上記検体を含む送液の場合と同様である。
【０１４５】
洗浄工程
洗浄工程とは、プラズモンセンサー構造体２０の表面、および表面プラズモン共鳴センサー５０の表面のうち少なくともいずれか一方を洗浄する工程である。この洗浄工程のうち少なくともいずれか一方が工程（ａ）に含まれることが好ましい。
【０１４６】
洗浄工程に使用される洗浄液としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などの界面活性剤を、工程（ａ）の反応で用いたものと同じ溶媒または緩衝液に溶解させ、好ましくは０．００００１〜１重量％含有するものが望ましい。
【０１４７】
送液を循環させる温度および流速は、それぞれ上記検体を含む送液の場合と同じであることが好ましい。
洗浄液を循環させる時間は、通常０．５〜１８０分間、好ましくは５〜６０分間である。
【０１４８】
＜工程（ｂ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｂ）は、前述の工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程である。
【０１４９】
具体的には、表面プラズモン共鳴センサーにおけるアッセイ測定領域（すなわち、図１に示す表面プラズモン共鳴センサー５０における領域（Ａm）および図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１における領域（Ａs））に対して、図１に示すように、入射光６１ｃを照射し、これにより、該アッセイ測定領域で発光した蛍光を表面プラズモン共鳴センサー上部に設置されたＳＰＦＳ検出部で検出し、蛍光量を蛍光シグナル（Ｓm）として数値化する工程である。
【０１５０】
ここで、本発明のアッセイ方法で用いられる光源、プリズム、光学フィルタ、偏光フィルタ、集光レンズとしては、上述した本発明の補正方法についての説明において「光学系」の項に挙げたものが用いられる。また、「ＳＰＦＳ検出部」についても、同じく「光学系」の項に上述した「光検出部」としてあげられている光検出装置を用いることができる。
【０１５１】
表面プラズモン共鳴センサーとして、図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１のように、領域（Ｐ）および領域（Ｑ）を兼ね備えている表面プラズモン共鳴センサー、すなわち、前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している表面プラズモン共鳴センサーが用いられる場合、上述の補正方法で用いられる電場増強比Ｒtを得るための上記工程（i）〜（iii）を、この工程（ｂ）と併せて行うことができる。
【０１５２】
この工程（i）〜（iii）は、工程（ｂ）の直前に行ってもよいし、工程（ｂ）の直後に行ってもよい。これらの態様では、蛍光シグナル（Ｓm）、全反射蛍光シグナル（Ｓp）、電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を、異なる時に単一のＳＰＦＳ検出部を用いて検出するとともに、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ｃ，６１ａ，６１ｂ）を単一光源を用いて供給することができるので、測定系を簡素化できるとともに、光源およびＳＰＦＳ検出部を構成する装置の性能における個体差によるばらつきを回避できる利点がある。
【０１５３】
また、この工程（i）〜（iii）は、工程（ｂ）と同時に行ってもよい。この場合、蛍光シグナル（Ｓm）と、全反射蛍光シグナル（Ｓp）および電場増強蛍光シグナル（Ｓq）のうち少なくともいずれか一方とを検出するために複数のＳＰＦＳ検出部を用いることになる。あるいは、ＣＣＤイメージセンサーなど多点計測が可能な撮像素子を用いてこれらのシグナルを同時に検出してもよい。工程（i）〜（iii）を、工程（ｂ）と同時に行う場合、これらのシグナルを得るために用いられる各入射光（すなわち、図１における入射光６１ｃ，６１ａ，６１ｂ）は、光学特性が同一の複数の光源を用いて供給してもよい。あるいは、単一の光源を用い、この光源から発せられる光を適当なビームスプリッターにより分割することにより、領域（Ａs）、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）の各領域に同時に入射光を供給してもよい。ただし、上記工程（i）において全反射蛍光シグナル（Ｓp）を測定するために用いられる入射光６１ａの入射角と、上記工程（ii）において電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を測定するために用いられる入射光６１ｂの入射角とは異なる場合があることから、分割した光の向きを入射角の変化に応じて適宜調節する機構が必要となり、測定系が複雑になる場合がある。
【０１５４】
さらに、この工程（i）〜（iii）を、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程に先だって行うことにより、この表面プラズモン共鳴センサーについて適用される電場増強比Ｒtを事前に算出してもよい。このような態様での電場増強比Ｒtの算出は、領域（Ｐ）、領域（Ｑ）を有さない表面プラズモン共鳴センサーについての蛍光シグナル（Ｓm）について本発明の補正方法を適用するときにも有用である。
【０１５５】
＜工程（ｃ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｃ）は、前述の工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、上述した補正方法を用いて補正する工程である。この工程により、ＳＰＦＳ検出部で検出されたばかりの蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換することにより、表面プラズモン共鳴センサーを構成する金属薄膜（すなわち、図１に示す表面プラズモン共鳴センサー５０を構成する金属薄膜（Ｍm）２２、または図３に示す表面プラズモン共鳴センサー５１を構成する金属薄膜（Ｍsa）３２）における電場増強のばらつきを除去することができる。
【０１５６】
ここで、工程（ｃ）における補正でもちいられる上記参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒrは、通常の場合、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程に先だって事前に算出されたものが用いられる。ただ、本発明のアッセイ方法で行われる一連のアッセイ工程と並行して、上記参照構造体（Ｘr）についての電場増強比Ｒrを算出するための上記工程（i）〜（iii）が行われることを排除するものではない。
【０１５７】
＜工程（ｄ）＞
本発明のアッセイ方法において、工程（ｄ）は、前述の工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）、すなわち、補正蛍光シグナル（Ｓm1）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程である。具体的には、前記工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）をもとに、検量線を作成し、作成された検量線に基づいて被測定検体中の標的抗原量もしくは標的抗体量を測定シグナルから算出する工程である。
【０１５８】
アッセイＳ／Ｎ比
工程（ｄ）においては、上記工程（ｂ）の前に測定した"ブランク蛍光シグナル"、上記工程（ｂ）での測定により得られた"アッセイ蛍光シグナル"、および何も修飾していない金属基板（本発明では、表面に金属薄膜を形成しただけで、さらなる修飾処理を行っていない透明誘電体基板も含む。）を流路に固定し、超純水を流しながらＳＰＦＳを測定して得られたシグナルを"初期ノイズ"としたとき、下記式（３ａ）で表されるアッセイＳ／Ｎ比を算出することができる：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa／Ｉo｜／Ｉn （３ａ）
（上記式（３ａ）において、Ｉaはアッセイ蛍光シグナル、Ｉoはブランク蛍光シグナル、Ｉnは初期ノイズである）。
【０１５９】
ただし、アッセイＳ／Ｎ比を算出するにあたっては、実用上、上記式（３ａ）に代えて、検体中に含まれるアナライトの濃度が０の場合における"アッセイノイズシグナル"を基準として、下記式（１ｂ）にしたがって算出してもよい：
アッセイＳ／Ｎ比＝｜Ｉa｜／｜Ｉan｜ （３ｂ）
（上記式（３ｂ）において、Ｉanはアッセイノイズシグナル、Ｉaは上記式（３ａ）の場合と同様にアッセイ蛍光シグナルである）。
【０１６０】
ＳＰＦＳの代わりに、共鳴角および反射光強度などを通じてＳＰＲを検出する場合には、上記ＩaおよびＩoとして、それぞれ、アッセイ蛍光シグナルおよびブランク蛍光シグナルの代わりに、対応するアッセイシグナルおよびプランクシグナルを用いることができる。
【０１６１】
〔アナライト検出装置〕
本発明で用いられるアナライト検出装置は、本発明の補正方法に用いられるとともに、上記表面プラズモン共鳴センサーを用いて、本発明のアッセイ方法を実施するためのものである。
【０１６２】
「アナライト検出装置」としては、少なくとも光源、各種光学フィルタ、プリズム、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部を含むものとする。この「アナライト検出装置」は、本発明の補正方法を実施するために用いることができ、ビームスプリッターなどの光分離手段を備えていてもよい。なお、検体液、洗浄液、標識抗体液などを取り扱う際に、表面プラズモン共鳴センサーと組み合った送液系を有することが好ましい。送液系としては、本発明の目的が達せられる限り、その種類を問わない。例えば、液ポンプと連結したマイクロ流路デバイスなどでもよい。
【０１６３】
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）検出部、すなわちＳＰＲ専用の受光センサーとしてのフォトダイオード、ＳＰＲおよびＳＰＦＳの最適角度を調製するための角度可変部（サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるためにフォトダイオードと光源とを同期して、４５〜８５°の角度変更を可能とする。分解能は０．０１°以上が好ましい。）、ＳＰＦＳ検出部に入力された情報を処理するためのコンピュータなども含んでもよい。
【０１６４】
光源、光学フィルタ、カットフィルタ、集光レンズおよびＳＰＦＳ検出部の好ましい態様は上述したものと同様である。本発明においては、このＳＰＦＳ検出部は、上述した本発明の補正方法を実施する際に、「光検出部」として用いることができる。
【０１６５】
「送液ポンプ」としては、例えば、送液が微量な場合に好適なマイクロポンプ、送り精度が高く脈動が少なく好ましいが循環することができないシリンジポンプ、簡易で取り扱い性に優れるが微量送液が困難な場合があるチューブポンプなどが挙げられる。
【実施例】
【０１６６】
＜標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の調製＞
抗αフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(株)日本医学臨床検査研究所製）を、市販のビオチン化キット（(株)同仁化学研究所製）を用いてビオチン化した。手順は、該キットに添付のプロトコールに従った。
【０１６７】
次に、得られたビオチン化抗ＡＦＰモノクローナル抗体の溶液と、「Alexa Fluor 647」ストレプトアビジンコンジュゲート（Molecular Probes社製）の溶液とを混合し、４℃で６０分間攪拌して反応させた。
【０１６８】
最後に、未反応抗体および未反応酵素を除去するため、分子量カットフィルタ（日本ミリポア(株)製）を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はタンパク定量後、４℃で保存した。
【０１６９】
＜基板の作製＞
アッセイ測定領域（Ａ）、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成する基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆを以下の要領で作製した。
【０１７０】
まず、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板「S-LAL 10」（(株)オハラ製、屈折率〔ｎd〕＝１．７２）を６枚用意し、プラズマドライクリーナー「ＰＤＣ２００」（ヤマト科学(株)製）でプラズマ洗浄した。
【０１７１】
プラズマ洗浄された基板の片面のうち、アッセイ測定領域（Ａ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成しようとする部分に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。一方、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）を形成しようとする部分には、クロム薄膜および金薄膜の形成を行わなかった。
【０１７２】
次いで、上記工程により得られた基板を２５ｍｇ／ｍＬに調整した１０−カルボキシ−１−デカンチオールのエタノール溶液１０ｍＬに２４時間浸漬し、金薄膜の表面にＳＡＭを形成した。この基板をエタノール溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで順次洗浄した後、エアガンを用いて乾燥させた。
以上の工程を６枚の基板それぞれについて行うことにより、金属薄膜およびＳＡＭが形成された（反応層は未形成の）基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆを作製した。
【０１７３】
＜センサチップの作製＞
上記のようにして作製された基板Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記工程［１］によりセンサチップの構成とした後、下記工程［２］によりアッセイ測定領域（Ａ）を、下記工程［３］により全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）を、下記工程［４］により電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を作製し、それぞれセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆとした。
【０１７４】
［１］センサチップの構成
基板の金属薄膜およびＳＡＭが形成された側の面に、アッセイ測定領域（Ａ）、全反射蛍光リファレンス領域（Ｐ）および電場増強蛍光リファレンス領域（Ｑ）を形成するための、それぞれ流路長１０ｍｍ、幅５ｍｍの３個の穴があいた、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製シートを載せた。さらに、このＰＤＭＳ製シートの周囲にシリコーンゴム製スペーサを配置した（このシリコーンゴム製スペーサは送液に触れない状態にある。）。このＰＤＭＳ製シートおよびシリコーンゴム製スペーサの上に、上記領域（Ａ）、（Ｐ）および（Ｑ）それぞれの内側に位置するよう、送液導入用の穴（送液導入口）および送液排出用の穴（送液排出口）が形成されたポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製天板を載せた。これらセンサー基板、ＰＤＭＳ製シート、およびＰＭＭＡ製天板の積層物を外周部で圧着してビスで固定し、センサチップとした。
【０１７５】
［２］領域（Ａ）の作製
センサチップの領域（Ａ）の送液導入口および送液排出口に、シリコーンゴム製のチューブおよびペリスタポンプを連結した（以下に記載する各種流体の送液および循環はすべて、同様のチューブおよびペリスタポンプを用いて行った）。
【０１７６】
５０ｍＭのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および１００ｍＭの水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを送液して２０分間循環させた後、抗ＡＦＰモノクローナル抗体（１Ｄ５、２．５ｍｇ／ｍＬ、(株)日本医学臨床検査研究所製）溶液２.５ｍＬを送液して３０分間循環することで、当該抗体をＳＡＭに固定化した。その後、１重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）および１Ｍのアミノエタノールを含むＰＢＳを３０分間循環送液させ、ブロッキング処理とした。
【０１７７】
［３］領域（Ｐ）および（Ｑ）の作製
以下の手順により、領域（Ｐ）および（Ｑ）の表面に蛍光分子層を形成した。
まず、丸底フラスコに湯浴を付し、酢酸エチル１００ｇを加熱還流し、さらにステアリルメタクリレート２０ｇ、メチルメタクリレート５０ｇ及び２−アセトアセトキシエチルメタクリレート３０ｇ、Ｎ，Ｎ′−アゾビスイソバレロニトリル０．１ｇを各々溶解した混合液を２時間かけて滴下し、同温度にて１０時間反応させて樹脂Ｒ−１の酢酸エチル溶液を得た。この樹脂溶液Ｒ−１を１ｍｌ計量し、更に蛍光色素Cy5（蛍光色素）モノNHS体を同モルのラウリルアミンと反応させたアミド体（Ｆ−１）を２０ｍＭ/ｍｌ含む酢酸エチル溶液を１ｍｌ加え撹拌して、蛍光剤塗布液を調製した。
【０１７８】
調製した蛍光剤塗布液を、上記［２］で得られたセンサー基板のＳＡＭ等が形成された面のうち、領域（Ｐ）および（Ｑ）を形成させようとする部位に、領域（Ｐ）および（Ｑ）における乾燥膜厚がともに１００ｎｍになるようにスピンコーターで塗布し、乾燥温度１００℃で５分間の乾燥を行い、蛍光分子層を形成した。
【０１７９】
＜シグナルの測定＞
上記のようにして作製されたセンサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記工程［４］により測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓa）の測定を、下記工程［５］により測定領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓp）の測定を、下記工程［６］により領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓq）の測定を行った。ここで、測定領域（Ａ）におけるシグナル（Ｓa）および領域（Ｑ）におけるシグナル（Ｓq）の測定は表面プラズモン共鳴条件下で、領域（Ｐ）におけるシグナル（Ｓp）の測定は全反射減衰（ＡＴＲ）条件下でそれぞれ行われた。
【０１８０】
［４］シグナル（Ｓa）の測定
測定領域（Ａ）に、まず、ＡＦＰ（２．０ｍｇ／ｍＬ溶液、Acris Antibodies GmbH社）が１０ｎｇ／ｍＬとなるようＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。つづいて、前述のようにして調製した標識抗体：「Alexa Fluor 647」標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体が２．５μｇ／ｍＬとなるよう１％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で希釈した溶液を、１０μＬ／ｍｉｎにて２０分間フローさせた。洗浄工程として、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＴＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を１０μＬ／ｍｉｎにて１０分間フローさせて、表面プラズモン共鳴センサーとした。その後、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で流路を満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。この測定値をシグナル（Ｓa）とした。
【０１８１】
［５］シグナル（Ｓp）の測定
領域（Ｐ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。
この測定値をシグナル（Ｓp）とした。
【０１８２】
［６］シグナル（Ｓq）の測定
領域（Ｑ）にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）を送液し、流路をこのバッファーで満たした状態にして、表面プラズモン共鳴センサーの裏側からプリズムを経由してレーザ光（６３５ｎｍ、４０μＷ）を照射し、センサー表面から発せられる蛍光量をＣＣＤで測定した。
この測定値をシグナル（Ｓq）とした。
【０１８３】
＜電場増強比Ｒならびに補正されたシグナル（Ｓa′）の算出＞
センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、下記のようにして補正されたシグナル（Ｓa′）を算出した。
【０１８４】
下記式（１）に基づき、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれについて、電場増強比Ｒを算出した。
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
次に、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについて算出した電場増強比Ｒについて、センサチップＡについて算出した電場増強比Ｒでそれぞれ除算した値である補正係数ｋを算出した。
【０１８５】
そして、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについて、領域（Ａ）で測定されたシグナル（Ｓa）の測定値に、１／ｋを乗じることにより、補正されたシグナル（Ｓa′）を算出した。
【０１８６】
結果は表２に示す通りである。ここで、シグナル（Ｓa）および（Ｓa′）において、「基板Ａ一致率」とは、センサチップＡにおけるシグナル強度を１００としたときの各センサチップにおける相対的なシグナル強度を表し、センサチップＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆについての値が１００に近いほどシグナルのばらつきが小さいことを示す。
【０１８７】
【表２】
【符号の説明】
【０１８８】
１０・・・電場増強評価構造体
１１・・・透明誘電体部材（Ｔｓ）
１２・・・金属薄膜（Ｍsq）
１３ａ・・・蛍光分子層（Ｆsp）
１３ｂ・・・蛍光分子層（Ｆsq）
２０・・・プラズモンセンサー構造体
２１・・・透明誘電体部材（Ｔm）
２２・・・金属薄膜（Ｍm）
３２・・・金属薄膜（Ｍsa）
２３，３３・・・固定化リガンド含有層
２３１，３３１・・・リガンド（第１のリガンド）
４１・・・蛍光修飾リガンド
４１１・・・第２のリガンド
４１２・・・蛍光色素（Ｄm）
４２・・・アナライト
５０，５１・・・表面プラズモン共鳴センサー
６１ａ，６１ｂ，６１ｃ・・・入射光
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する対象構造体（Ｘt）について、
（i）前記領域（Ｐ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsp）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）該工程（i）の前に、該工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、前記領域（Ｑ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsq）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で該工程（i）の場合と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）該工程（i）および（ii）を経て得られる該全反射蛍光シグナル（Ｓp）と該電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる該電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2）該構造体（Ｘ）であって、該対象構造体（Ｘt）以外の構造体である参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、上記工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする蛍光シグナルの補正方法。
【請求項２】
前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している前記表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される前記蛍光シグナル（Ｓm）についての前記変換が、該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる前記電場増強比Ｒを前記Ｒtとして用いることに行われる請求項1に記載の補正方法。
【請求項３】
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含み；
該工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正が、請求項1に記載の補正方法を用いてなされることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項４】
前記（ｋ-1）で用いられる対象構造体（Ｘt）が、
前記透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）をさらに含み、且つ、該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する構造体であり、
該領域（Ａs）を前記領域（Ａm）として用いることにより、前記プラズモンセンサー構造体として供される
請求項３に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）における補正が、
前記対象構造体（Ｘt）についての上記工程（i）〜（iii）を前記工程（ｂ）の直前、前記工程（ｂ）と同時、および前記工程（ｂ）の直後のいずれかにおいて行うことにより求められる前記Ｒtを用いて行われる
請求項４に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒtを用いて行われる請求項３または４に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒrを用いて行われる請求項５または６に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少な
くとも１種の体液である請求項３〜７のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項９】
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsp）および該蛍光分子層（Ｆsq）がともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成され、且つ、
該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する
構造体。
【請求項１０】
請求項９に記載の構造体と、アナライトと、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを含み、
前記領域（Ａs）内の前記第１のリガンドに、該アナライトを介して該蛍光修飾リガンドが結合している表面プラズモン共鳴センサー。
【請求項１】
透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して蛍光色素（Ｄm）が固定されてなる表面プラズモン共鳴センサーにつき、表面プラズモン蛍光分光法を用いて測定される蛍光色素（Ｄm）由来の蛍光シグナル（Ｓm）について、
（ｋ-1） 透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsq）および該蛍光分子層（Ｆsp）がともに同一の蛍光色素（Ｄs）から構成されており、
該透明誘電体部材（Ｔm）および該透明誘電体部材（Ｔs）がともに同一の透明誘電体からなり、
該金属薄膜（Ｍm）および該金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなる
構造体（Ｘ）であって、該金属薄膜（Ｍsq）が該金属薄膜（Ｍm）と同じ厚さを有する対象構造体（Ｘt）について、
（i）前記領域（Ｐ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsp）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で、該蛍光シグナル（Ｓm）の測定において蛍光分子（Ｄm）を励起するために用いられる入射光と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｐ）で発光した蛍光の量を全反射蛍光シグナル（Ｓp）として検出する工程と、
（ii）該工程（i）の前に、該工程（i）と同時に、あるいは該工程（i）の後に、前記領域（Ｑ）に対して、
該透明誘電体部材（Ｔs）の、該蛍光分子層（Ｆsq）が存在する面とは反対側の表面から、全反射条件となる入射角で該工程（i）の場合と同一波長の入射光を照射することにより、
該領域（Ｑ）で発光した蛍光の量を電場増強蛍光シグナル（Ｓq）として検出する工程と
（iii）該工程（i）および（ii）を経て得られる該全反射蛍光シグナル（Ｓp）と該電場増強蛍光シグナル（Ｓq）を用いて下記式（１）
Ｒ ＝ Ｓq ／ Ｓp （１）
に基づき電場増強比Ｒを算出する工程と、
を経て得られる該電場増強比ＲであるＲtと、
（ｋ-2）該構造体（Ｘ）であって、該対象構造体（Ｘt）以外の構造体である参照構造体（Ｘr）について、該対象構造体（Ｘt）の場合と同じ波長の入射光を用いて、上記工程（i）〜（iii）を経て得られる該電場増強比ＲであるＲrと
を用いて、下記式（２）
Ｓm1 ＝ Ｓm0 × （Ｒr ／ Ｒt） （２）
に基づき、補正前の蛍光シグナル（Ｓm）である未補正蛍光シグナル（Ｓm0）を補正蛍光シグナル（Ｓm1）に変換する
ことを特徴とする蛍光シグナルの補正方法。
【請求項２】
前記対象構造体（Ｘt）を対象構造体部分として一体化している前記表面プラズモン共鳴センサーにつき測定される前記蛍光シグナル（Ｓm）についての前記変換が、該対象構造体部分につき前記工程（i）〜（iii）を経て得られる前記電場増強比Ｒを前記Ｒtとして用いることに行われる請求項1に記載の補正方法。
【請求項３】
（ａ）透明誘電体部材（Ｔm）上に、金属薄膜（Ｍm）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａm）を有するプラズモンセンサー構造体において、該領域（Ａm）に、検体と、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを接触させることにより、表面プラズモン共鳴センサーを調製する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）の後、該領域（Ａm）に対して、該透明誘電体部材（Ｔm）の、該金属薄膜（Ｍm）とは反対側の表面から入射光を照射し、全反射条件となる入射角で入射光を照射し、これにより、該領域（Ａm）で発光した蛍光の量を蛍光シグナル（Ｓm）として検出する工程と、
（ｃ）該工程（ｂ）で検出された蛍光シグナル（Ｓm）を、補正する工程と、
（ｄ）該工程（ｃ）で補正された蛍光シグナル（Ｓm）に基づき検体中のアナライト量を評価する工程と
を含み；
該工程（ｃ）における蛍光シグナル（Ｓm）の補正が、請求項1に記載の補正方法を用いてなされることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項４】
前記（ｋ-1）で用いられる対象構造体（Ｘt）が、
前記透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）をさらに含み、且つ、該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する構造体であり、
該領域（Ａs）を前記領域（Ａm）として用いることにより、前記プラズモンセンサー構造体として供される
請求項３に記載のアッセイ方法。
【請求項５】
前記工程（ｃ）における補正が、
前記対象構造体（Ｘt）についての上記工程（i）〜（iii）を前記工程（ｂ）の直前、前記工程（ｂ）と同時、および前記工程（ｂ）の直後のいずれかにおいて行うことにより求められる前記Ｒtを用いて行われる
請求項４に記載のアッセイ方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒtを用いて行われる請求項３または４に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）における補正が、事前に算出済みの前記Ｒrを用いて行われる請求項５または６に記載のアッセイ方法。
【請求項８】
前記検体が、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液および唾液からなる群から選択される少な
くとも１種の体液である請求項３〜７のいずれかに記載のアッセイ方法。
【請求項９】
透明誘電体部材（Ｔs）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜を介することなく蛍光分子層（Ｆsp）が形成された領域（Ｐ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsq）を介して、蛍光分子層（Ｆsq）が形成された領域（Ｑ）と、
該透明誘電体部材（Ｔs）上に、金属薄膜（Ｍsa）を介して、第１のリガンドを含有する固定化リガンド含有層が形成された領域（Ａs）と
を含み、
該蛍光分子層（Ｆsp）および該蛍光分子層（Ｆsq）がともに同一の蛍光分子（Ｄs）から構成され、且つ、
該金属薄膜（Ｍsa）および前記金属薄膜（Ｍsq）がともに同一の金属からなり且つ同じ厚さを有する
構造体。
【請求項１０】
請求項９に記載の構造体と、アナライトと、第２のリガンドと蛍光分子（Ｄm）とからなる蛍光修飾リガンドとを含み、
前記領域（Ａs）内の前記第１のリガンドに、該アナライトを介して該蛍光修飾リガンドが結合している表面プラズモン共鳴センサー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−４２２３３（Ｐ２０１２−４２２３３Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８１３６４（Ｐ２０１０−１８１３６４）
【出願日】平成２２年８月１３日（２０１０．８．１３）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１３日（２０１０．８．１３）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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