ｉＰＳ細胞の樹立法
【課題】ｉＰＳ細胞を安全かつ迅速に作製する方法の提供。
【解決手段】ｉＰＳ細胞を作製するために分化誘導因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞に導入する方法。具体的には、分化誘導因子の少なくとも１つを膜透過ペプチドと融合させた状態で発現させ、精製を行った後、該精製融合タンパク質を目的の体細胞と共にインキュベートして細胞内に導入し、ｉＰＳ細胞を作製する。本法は、全ての分化誘導因子をタンパク質のまま細胞内に導入してもよく、ベクターによる遺伝子導入法を併用しても実施することができる。
【解決手段】ｉＰＳ細胞を作製するために分化誘導因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞に導入する方法。具体的には、分化誘導因子の少なくとも１つを膜透過ペプチドと融合させた状態で発現させ、精製を行った後、該精製融合タンパク質を目的の体細胞と共にインキュベートして細胞内に導入し、ｉＰＳ細胞を作製する。本法は、全ての分化誘導因子をタンパク質のまま細胞内に導入してもよく、ベクターによる遺伝子導入法を併用しても実施することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。
分化多能性を有する細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器などを再生する上で極めて有効な手段として期待されている。従来は、ＥＳ細胞の利用による再生医療研究が中心に行われていたが、ＥＳ細胞は生命の起源となる胚から取得されるものであるため、その使用上、倫理的な問題に直面することになる。また、ＥＳ細胞から調製した組織などは、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要もある。
【０００３】
ＥＳ細胞を用いた場合に生じ得る倫理上の問題と免疫学上の問題を解決することができる分化多能性細胞として、ｉＰＳ細胞に多くの期待が寄せられている。
マウスのｉＰＳ細胞は、Ｙａｍａｎａｋａらによって、分化多能性の維持に重要なＮａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された（非特許文献１、非特許文献２）。その後も同様の方法によるマウスｉＰＳ細胞の樹立が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。そして、ｉＰＳ細胞の癌化の問題を克服するために、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のみでも、ｉＰＳ細胞の樹立が可能であることも報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
一方、ヒトのｉＰＳ細胞に関しては、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立し（非特許文献８）、また、Ｙａｍａｎａｋａらは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入して、同じくｉＰＳ細胞を樹立した（非特許文献９）。
【０００４】
以上のように、ｉＰＳ細胞の今後の利用可能性が注目される中で、いくつかの問題点が指摘されている。
まず、分化多能性を体細胞へ付与する因子（Ｏｃｔ、Ｓｏｘなど。以下、分化多能性因子と称する）を体細胞へ導入するために、レトロウィルスベクターなどによる遺伝子導入法を用いると、細胞のゲノム中に遺伝子がランダムに導入され、その結果、遺伝子の挿入による突然変異（特に、内在性発癌遺伝子の活性化など）が引き起こされる可能性が指摘される。特に、癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入すると、作製したｉＰＳ細胞の癌化が有意に高い確率で確認されている。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いずにｉＰＳ細胞の作出に成功したことが報告されてはいるが（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、作出効率が極めて低いため、今後、臨床的な応用に利用することは難しいのではないかと考えられている。
最近、アデノウィルスベクター用いて、分化多能性因子の体細胞における発現を、一過的に大量に行うことでｉＰＳ細胞を作製する方法が報告された（非特許文献１０）。この方法で作製されたｉＰＳ細胞をマウスの胚盤胞にインジェクトすると、生まれたマウスの組織中にインジェクトしたｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞が確認され、また、少なくとも４〜１２週齢のマウスにおいて癌化は認められなかった。この方法によれば、分化多能性因子の遺伝子導入に伴うｉＰＳ細胞の癌化の問題が解決される可能性がある。
【０００５】
また、分化多能性因子を遺伝子として導入してｉＰＳ細胞を作製する方法は、多くの煩雑な工程を必要とし、スクリーニングなどに長い時間を要することから、効率性の問題が指摘される。タンパク質を細胞内で機能させるためには、その遺伝子を導入して目的の細胞内で発現させる他、タンパク質自体を細胞内に直接導入することも可能である。タンパク質自体を直接細胞へ導入する方法は、これまでに多くの方法が報告されているが、中でも、膜透過ペプチド（あるいは、タンパク導入ドメイン、細胞膜透過性ペプチド）との融合タンパク質を目的の細胞に接触させて、細胞内へ導入する方法が多く利用されている（例えば、特許文献１〜９など）。ｉＰＳ細胞を樹立するために、分化多能性因子をタンパク質のまま体細胞へ導入する方法については、その可能性を示唆する文献（特許文献１０）や、分化多能性因子のＯｃｔ４タンパク質とＳｏｘ２タンパク質を導入したとの報告はあるが（非特許文献１１）、実際にｉＰＳ細胞を作製したとの報告はこれまでに存在しない。これは、タンパク質自体を導入することの指摘は可能であっても、実際に細胞内で機能するように分化多能性因子タンパク質を導入することは多くの困難が伴うためである。
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００６，１２６：６６３−６７６．
【非特許文献２】Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１３−３１７．
【非特許文献３】Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１８−３２４．
【非特許文献４】Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００７，１：５５−７０．
【非特許文献５】Ｐａｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４５１：１４１−１４６．
【非特許文献６】Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８，２６：１０１−１０６．
【非特許文献７】Ｗｅｒｎｉｇら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００８，１０：１０−１２．
【非特許文献８】Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７，３１８：１９１７−１９２０．
【非特許文献９】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００７，１３１：８６１−８７２．
【非特許文献１０】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，オンライン公開版（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１１６２４９４／ＤＣ１）
【非特許文献１１】Ｂｏｎｓｎａｌｉ及びＥｄｅｎｈｏｆｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，３８９：８５１−８６１．
【特許文献１】ＵＳ５，８０４，６０４号
【特許文献２】ＵＳ５，７４７，６４１号
【特許文献３】ＵＳ５，６７４，９８０号
【特許文献４】ＵＳ５，６７０，６１７号
【特許文献５】ＵＳ５，６５２，１２２号
【特許文献６】ＷＯ２００２／０１８５７２
【特許文献７】特開２００５−５２０８３
【特許文献８】特開２００５−２５３４０８
【特許文献９】特開２００１−１９９９９７
【特許文献１０】ＷＯ２００７／０６９６６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行ったところ、分化多能性因子タンパク質を体細胞に導入することによってｉＰＳ細胞を作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、従来のｉＰＳ細胞作製方法に生じ得る諸問題を解決するために、分化多能性因子タンパク質を直接体細胞へ導入し、安全なｉＰＳ細胞を効率的に作製する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、分化多能性因子タンパク質を膜透過性ペプチド融合させて体細胞内へ導入したところ、安全性の高いｉＰＳ細胞を効率的に作製することに成功した。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）本発明の第１の形態は、「分化多能性因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞へ導入し、ｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（２）本発明の第２の形態は、「前記分化多能性因子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す組合せのタンパク質であり、（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つをタンパク質のまま該体細胞へ導入し、その他のタンパク質はその遺伝子を該体細胞へ導入して細胞内で発現させる、上記（１）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質」である。
（３）本発明の第３の形態は、「前記（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つを、タンパク質のまま体細胞に導入するために、該タンパク質に膜透過ペプチドを融合させることを特徴とする上記（２）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（４）本発明の第４の形態は、「前記分化多能性因子の組合せが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（５）本発明の第５の形態は、「前記ｃ−Ｍｙｃをタンパク質のまま導入する上記（４）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（６）本発明の第６の形態は、「前記体細胞がヒト由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、安全性の高い（特に、癌化しない）ｉＰＳ細胞を効率的に作製することができる。
【００１０】
また、発明の方法を用いると、細胞の種類に関係なく（従来は、ｉＰＳ細胞のソースとして線維芽細胞が中心に使用されてきた）、多くの体細胞をｉＰＳ細胞のソースとして使用することができる。
【００１１】
臨床応用を考慮するにあたり、ウィルスベクターの使用に関する制約は多く、臨床グレードの安全性の保証されたウィルス液の作製は現在まで国内ではほとんど行われていない。これに対し、ＧＭＰ基準のタンパク質合成は国内にて比較的容易に可能であり、臨床応用の面からも本発明の方法に優位性を認めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の目的の１つは、ｉＰＳ細胞の安全かつ効率的な作製方法を提供することである。
ここで、「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称される分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。「分化多能性因子」としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１３６３３（マウス）、ＮＭ＿００２７０１（ヒト）））、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１１４４３（マウス）、ＮＭ＿００３１０６（ヒト））、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０６３７（マウス）、ＮＭ＿００４２３５（ヒト））、Ｋｌｆ２など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０８４９（マウス）、ＮＭ＿００２４６７（ヒト））、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０２４８６５（マウス）、ＮＭ＿０２８０１６（ヒト））、ＬＩＮ２８（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿１４５８３３（マウス）、ＮＭ＿０２４６７４（ヒト））などを挙げることができる。また、分化多能性因子のスクリーニング方法に関する報告を参考に、当業者であれば適宜、所望の分化多能性因子を選択することができる（例えば、ＷＯ２００５／８０５９８を参照のこと）。
ｉＰＳ細胞を作製するために導入される分化多能性因子の組合せとしては、限定はしないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の組合せを使用することができる。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質
【００１３】
また、ヒト及び非ヒト動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）に存在する上掲の分化多能性因子のホモログを用いて本発明を実施することにより、所望の動物由来のｉＰＳ細胞を容易に作製することができる。また、本発明において使用される分化多能性因子は、必ずしも野生型である必要はなく、野生型のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、上掲の分化多能性因子タンパク質のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、体細胞の分化多能性の誘導を他の分化多能性因子と協働して惹起するタンパク質である。あるいは、上掲の分化多能性因子タンパク質のアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、体細胞の分化多能性の誘導を他の分化多能性因子と協働して惹起するタンパク質である。
【００１４】
分化多能性因子タンパク質と「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、野生型の分化多能性誘導能よりも優れた能力を発揮するものも含まれる。このようなより優れた能力を発揮するタンパク質は、野生型のタンパク質のアミノ酸配列中に欠失、置換若しくは付加などの改変を、当該技術分野で公知の手法により導入することで調製することが可能である。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により、分化多能性因子の遺伝子に適当な塩基置換を導入して行うことができる。
【００１５】
なお、本明細書において、「分化多能性因子」と記載する場合、特に、注記しなければ、タンパク質及び遺伝子の両方を指すものとする。特にタンパク質について議論する場合には、「分化多能性因子タンパク質」と、遺伝子について議論する場合には、「分化多能性因子遺伝子」と記載することとする。また、特定の分化多能性因子を記載する場合も、例えば、「Ｓｏｘ２」などと記載する場合、特に注記しなければ、Ｓｏｘ２タンパク質及びＳｏｘ２遺伝子の両方を意味するものとする。
【００１６】
本発明のある実施形態において、体細胞に導入する分化多能性因子の少なくとも１つ、又は全部をタンパク質のまま導入することができる。タンパク質を細胞内に導入する方法としては、例えば、「膜透過性ペプチド」、「タンパク質導入ドメイン」、あるいは「細胞膜透過性ペプチド」などと称されるペプチドを、細胞内へ導入するタンパク質に融合させる方法が容易に利用可能である。ここで、「膜透過性ペプチド」、「タンパク質導入ドメイン」、あるいは「細胞膜透過性ペプチド」とは、塩基性アミノ酸を多く含むことを特徴とする細胞膜透過性を有するペプチドのことで、例えば、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（配列番号１）、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１（配列番号２）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（配列番号３）、ｐＡｎｔｐ（配列番号４）、ＶＰ２２ペプチド（配列番号５）、ＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号６）、Ｐｅｐ−１（配列番号７）、Ｉｎｔｅｇｒｉｎβ３（配列番号８）、ＩｎｆｌｕｅｎｚａＨＡ−２（配列番号９）、Ｗ／Ｒ（配列番号１０）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（配列番号：１１）、ＢＭＶ−ｇａｇ（配列番号１２）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅｘ（配列番号１３）、Ｈｕｍａｎ ｃＦＯＳ（配列番号１４）、Ｈｕｍａｎ ｃＪＵＮ（配列番号１５）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号１６）、Ｙｅａｔ ＧＣＮ４（配列番号１７）、Ｒ９（配列番号１８）などを挙げることができるが、特に、これらのペプチドに限定されるものではなく、当業者によって容易に選択することができる細胞膜透過性を有するペプチドであれば、如何なるものでも使用することができる（より詳細には、Ｄｉｅｔｚら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４ ２７：８５−１３１及び特許文献１〜９を参照のこと）。
【００１７】
体細胞へ導入する分化多能性因子タンパク質の調製は、多くの従来技術の中から当業者によって容易に選択し、実施することができる。通常は、適当な発現ベクターを用いて適当な細胞内で発現させる方法が利用される。この場合、発現ベクター上に、適当な発現プロモーターの下流に、膜透過性ペプチドをコードする核酸と所望の分化多能性因子をコードする核酸を発現可能に（つまり、両者が機能し得る形態で連結して発現するように）組込み、適当な宿主細胞（大腸菌、枯草菌などの原核生物の他、酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核生物由来の細胞）に形質導入し、該宿主細胞内で発現した分化多能性因子タンパク質を定法に従って抽出・精製することで、所望の分化多能性因子を調製することができる。
【００１８】
本発明の実施に使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、対象とする細胞の性質に応じて選択することができる。
【００１９】
本発明の実施に使用可能なプロモーターとしては、対象タンパク質の発現を行う細胞に対応した適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２０】
対象タンパク質の発現ベクターには対象タンパク質のコード化配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
【００２１】
本発明のｉＰＳ細胞を作製する方法において、体細胞にタンパク質のまま導入する分化多能性因子以外の分化多能性因子は、その遺伝子を該体細胞中へ導入し、細胞中において発現させてもよい。この場合、導入する分化多能性因子の遺伝子は、目的の体細胞に適した発現ベクターに発現可能に挿入し、該ベクターを目的の体細胞へ形質導入し、該遺伝子の発現を体細胞中で行わせることができる。使用可能な発現ベクターは、当業者によって適宜選択することができるが、例えば、レトロウィルスベクターなどが好ましい。分化多能性因子を体細胞中で発現する方法の詳細は、前掲の非特許文献１〜１０に詳細に記載されているので、参照されたい。
また、ｉＰＳ細胞を調製するために体細胞を培養する培地についても、特に、限定されるものではなく、前掲の非特許文献１〜１０に記載される培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などに適宜必要な因子を添加して使用することができる。
【００２２】
本発明のｉＰＳ細胞を作製する方法においては、如何なる体細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、あるいは、動物検体由来の任意の細胞など）であっても使用することができ、特に、限定されるものではない。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．ＴＡＴ−融合タンパク質の精製
ｐＴＡＴ−ＨＡ大腸菌発現ベクター（ワシントン医科大学Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ．Ｄｏｗｄｙ博士より供与）に発現目的タンパク質（ｃ−Ｍｙｃなど）を挿入したもので、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧ存在下、３７℃で４時間培養し、タンパクの発現を誘導した。その後、細胞溶解バッファー中で細胞破砕を行い、遠心操作 （１２，０００回転、２０分、４℃） により可溶化タンパクを含んだ細胞溶解液を得た。これをＮｉ−ＮＴＡカラムに通し、洗浄後、結合タンパク質を５００ｍＭイミダゾール存在下にて溶出した。さらにＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｍ カラムによるバッファー交換で脱塩し、ＰＢＳ又は培養メディウム（血清不含ＤＭＥＭ）に置換後、急速凍結して使用まで−８０℃で保存した。
【００２４】
２．膜透過ペプチド融合タンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製
図１にＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３４９７９；配列番号１）を用いたＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：マウス胎児線維芽細胞）からの高効率ｉＰＳ細胞作製の模式図を示す。ｉＰＳ細胞誘導の原法では４種の転写因子をレトロウイルスによって導入する（図の上側；ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）。ｃ−Ｍｙｃの導入は必須ではないものの、高いｉＰＳ細胞誘導効率を得るために必要となる。しかしながら、ｃ−Ｍｙｃウイルスのゲノムへの挿入は再活性化による細胞の癌化の原因となる。そこで、臨床研究の安全性の向上に寄与すべく、ｃ−Ｍｙｃをタンパクの形で導入することでｉＰＳ細胞の樹立を可能にすることを試みた（図の下側；ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃ）。理論的には他の３因子も全てタンパクの形で導入し、ゲノムへの遺伝子挿入を伴わないｉＰＳ細胞作製法が可能である。
【００２５】
３．ＴＡＴ誘導タンパク質の調製
発現されるタンパク質の模式図を図２に示す。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に始まり、ヒスチジンＴａｇ（６ｘＨｉｓ：タンパク精製に必要）、ＴＡＴペプチド配列と続き、ヘマグルチニン（ＨＡ：目的タンパクのＴａｇとなり解析に利用される）に融合される形で目的タンパク質が発現される。マウスｃ−Ｍｙｃ（ｍｃ−Ｍｙｃ）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０８４９；配列番号２）と蛍光マーカーｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ（ｈｕＫＯ）（ＭＢＬ，カタログ番号：ＡＭ−Ｖ００４５）を発現するベクターをそれぞれ構築し、研究に用いた（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ、ＴＡＴ−ｈｕＫＯ）。コントロールとして、それぞれにつきＴＡＴを含まないベクターを構築し、ＴＡＴを含まない融合タンパク質を発現、精製して用いた（ｍｃ−Ｍｙｃ ｗ／ｏＴＡＴ、ｈｕＫＯ ｗ／ｏＴＡＴ）。
【００２６】
４．ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＪｕｒｋａｔ細胞への導入
精製ＴＡＴ−融合タンパク質の機能性を確認する目的で、ＴＡＴ−ｈｕＫＯを精製し、異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞培養液（１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０）に加えた。６０分後に細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。図３に示すように、用量依存性のタンパク導入が観察された。
５．ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入
ｉＰＳ細胞作製の標的細胞であるＭＥＦに対する導入キネティクスをＴＡＴ−ｈｕＫＯを用いて検討した。ＴＡＴ−ｈｕＫＯは、５μＭを用いてＭＥＦ細胞とインキュベートし、洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した（図４）。その結果、１０分後に細胞膜表面に蛍光が認められ、３０分後には細胞質内へのｈｕＫＯタンパクの導入が認められた。６０分後では、一部、１２０分では、多くの細胞でｈｕＫＯ蛍光が核（ＤＡＰＩによる二重染色）に重複して観察され、核内へのタンパク導入が確認された。
次に、タンパク導入の濃度依存性を検討した。図５に示した濃度でＴＡＴ−ｈｕＫＯをＭＥＦ細胞と１時間インキュベートした結果を示す。ＴＡＴ−ｈｕＫＯの使用量、２μＭから導入細胞が観察されるようになり、５μＭではほぼ１００％の細胞にｈｕＫＯ蛍光が認められた。一方、ＴＡＴを融合していない精製ｈｕＫＯタンパク質については、５μM使用した場合でも、ＭＥＦ細胞内に蛍光シグナルが検出されなかった。
【００２７】
６．ＴＡＴ−ｍｃ−ＭｙｃのＭＥＦ細胞への導入
上記１に記載した手順によりＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）を精製した。精製したＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を図６に示す。フロースルー（素通し）中に夾雑タンパク質が多く認められるが、精製物は、ほぼ単一バンドとなっており、高純度のＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃタンパク質を精製することができた。
精製したＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを２μＭの濃度でＭＥＦ細胞とインキュベートし、洗浄後、ウェスタンブロット法により導入タンパク質の量を解析した（図７）。導入タンパク質の検出には、抗ポリ−ヒスチジン抗体を用いた。数分のインキュベーション（０ｈｒ）においても、わずかながら導入タンパク質のシグナルを認めることができ、０．５ｈｒのインキュベーションから導入タンパク質量の明らかな増加が認められ、以後、漸増し、６ｈｒのインキュベーションでほぼプラトーに達した。内在性のコントロールとしてα−チューブリンタンパク質の量を同時に解析した。
７．ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃによる細胞毒性の評価
ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞と１時間インキュベートし、細胞毒性をＣＣＫ−８キット（ＭＴＴ法に準じた細胞毒性アッセイ法、同仁化学研究所）を用いて解析した。５μＭ以上の濃度において、わずかな細胞毒性を反映した吸光度の低下が認められたが、有意な低下ではなかった。２μＭでは吸光度の低下は見られず、細胞毒性はみられなかった（図８）。
【００２８】
８．ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製の実際
図９にｉＰＳ細胞誘導のタイムスケジュールを示す。従来法の「４因子レトロウィルスベクター法」は、図９の太実線の上側に示すように、ｄａｙ１（１日目）にウイルス感染を行い、ｄａｙ３（３日目）よりｉＰＳ細胞誘導メディウム（１５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭにｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １，０００ Ｕ／ｍｌを加えたもの）に置換後、経過観察の後、ｄａｙ７（７日目）頃からＥＳ細胞様コロニーが出現する。そして、ｄａｙ１５（１５日目）前後に、その形態的特徴に基づいてＥＳ細胞様の細胞をピックアップする。
一方、本発明の１例である、「３因子レトロウィルスベクター＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法」は、図９太実線の下側に示すように、ｄａｙ１（１日目）にｃ−Ｍｙｃ以外の３因子をウィルスベクターにより導入する。ｄａｙ２（２日目）より、１日１回、ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ導入を繰り返し、ｄａｙ１５（１５日目）前後にＥＳ細胞様コロニーをピックアップした。「３因子レトロウィルスベクター＋コントロールｃ−Ｍｙｃ」をコントロールとして用いたが、コロニーの出現は認められなかった。
上記スケジュールに従い、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＭＥＦを用いてｉＰＳ細胞の誘導を行った。レトロウィルスによる４因子導入（Ｒ４ｉＰＳ）と、３因子ウィルス導入＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法（ＴＭｉＰＳ）を行った結果、いずれの方法を用いてもＥＳ細胞様のコロニーを得ることができた。また、Ｒ４ｉＰＳ細胞（図１０、Ｒ４ｉＰＳ）とＴＭｉＰＳ細胞（図１０、ＴＭｉＰＳ）との間に形態の差を認めなかった。
【００２９】
９．樹立したｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色及び未分化マーカー発現の確認
樹立したｉＰＳ細胞についてアルカリフォスファターゼ染色を行った。Ｒ４ｉＰＳ細胞、ＴＭｉＰＳ細胞ともに染色され、細胞の未分化性の指標であるアルカリフォスファターゼ活性を有することが示された（図１１）。さらに、Ｒ４ｉＰＳ細胞、ＴＭｉＰＳ細胞は、ともに未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−１、Ｎａｎｏｇタンパクを発現することが、抗ＳＳＥＡ−１抗体及び抗Ｎａｎｏｇタンパク質抗体による免疫染色によって示された（図１２）。
以上の結果から、本発明の方法によってｉＰＳ細胞を作製することが可能であり、作製されたｉＰＳ細胞は、従来の方法によって作製されるｉＰＳ細胞と同様の特徴を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ｉＰＳ細胞を安全かつ迅速に調製する方法であるため、今後、ｉＰＳ細胞を臨床上利用する上で、極めて有効な手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】膜透過ペプチド融合タンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製法について模式的に説明した図である。
【図２】ＴＡＴ−融合タンパクの構造模式図を示す。 翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に始まり、ヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ：タンパク精製に必要）、ＴＡＴペプチド配列と続き、ヘマグルチニン（ＨＡ：目的タンパクのＴａｇとなり解析に利用される）に融合される形で目的タンパク質が発現される。ｈｕＫＯ：ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ
【図３】フローサイトメトリーによるＴＡＴ−ｈｕＫＯのＪｕｒｋａｔ細胞への導入の確認。 精製ＴＡＴ−融合タンパク質の機能性を確認する目的で、精製したＴＡＴ−ｈｕＫＯを、異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞培養液に加え、６０分後に細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。
【図４】ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入 ｉＰＳ細胞作製の標的細胞であるＭＥＦに対しての導入キネティクスをＴＡＴ−ｈｕＫＯを用いて検討した。ＴＡＴ−ｈｕＫＯ（５μＭ）を細胞に添加し、図に示した時間インキュベートし、洗浄後に蛍光顕微鏡にて観察した。
【図５】ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入 図に示した濃度でＴＡＴ−ｈｕＫＯをＭＥＦ細胞と１時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察を行った。
【図６】ＴＡＴ−融合−Ｍｙｃタンパク質の精製 精製したＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す。
【図７】ＴＡＴ−ｍｃ−ＭｙｃのＭＥＦ細胞への導入 精製したＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ（２μＭ）をＭＥＦ細胞と共に図に表示した時間インキュベートし、洗浄後、ウェスタンブロット法により導入したタンパク質の量を解析した。内在コントロールとしてa−チューブリンのタンパク量を同時に解析した。
【図８】ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃによる細胞毒性の評価 ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞と１時間インキュベートし、細胞毒性をＣＣＫ−８キット（ＭＴＴ法に準じた細胞毒性アッセイ法）を用いて解析した。グラフの縦軸は吸光度を示し、値が低くなるほど細胞への毒性の影響が強くなる。横軸の「Ｊｕｒｋａｔ」は、ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを添加しないコントロールを示す。
【図９】ｉＰＳ細胞誘導のタイムスケジュール ４因子レトロウィルスベクター法：太実線の上側に示す。 ３因子レトロウィルスベクター＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法：太実線の下側に示す。
【図１０】ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製の実際 図９に示した方法によりＣ５７ＢＬ／６マウスＭＥＦを用いてｉＰＳ細胞の誘導を行った。レトロウィルスによる４因子導入（Ｒ４ｉＰＳ）と３因子ウィルス導入＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法（ＴＭｉＰＳ）を行い、両方法によって作製されるｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図１１】樹立したｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色 樹立したｉＰＳ細胞ついてアルカリフォスファターゼ染色を行った結果である。
【図１２】樹立したｉＰＳ細胞の未分化マーカーの発現 Ｒ４ｉＰＳ細胞及びＴＭｉＰＳ細胞を、各々、抗ＳＳＥＡ−１抗体（ＳＳＥＡ−１、各パネル左側）及び抗Ｎａｎｏｇタンパク質抗体（Ｎａｎｏｇ、各パネル左側）で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した観察像を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称され、線維芽細胞などの体細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。
分化多能性を有する細胞は、生体を構成する全ての臓器や組織へ分化する能力を保持していることから、何らかの疾患で損傷した臓器などを再生する上で極めて有効な手段として期待されている。従来は、ＥＳ細胞の利用による再生医療研究が中心に行われていたが、ＥＳ細胞は生命の起源となる胚から取得されるものであるため、その使用上、倫理的な問題に直面することになる。また、ＥＳ細胞から調製した組織などは、移植の段階で拒絶反応を引き起こすおそれがあり、このような免疫的な問題を克服する必要もある。
【０００３】
ＥＳ細胞を用いた場合に生じ得る倫理上の問題と免疫学上の問題を解決することができる分化多能性細胞として、ｉＰＳ細胞に多くの期待が寄せられている。
マウスのｉＰＳ細胞は、Ｙａｍａｎａｋａらによって、分化多能性の維持に重要なＮａｎｏｇ遺伝子の発現を指標にし、マウス線維芽細胞へＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４つの遺伝子を導入することにより、初めて樹立された（非特許文献１、非特許文献２）。その後も同様の方法によるマウスｉＰＳ細胞の樹立が報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。そして、ｉＰＳ細胞の癌化の問題を克服するために、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子以外の３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）のみでも、ｉＰＳ細胞の樹立が可能であることも報告されている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。
一方、ヒトのｉＰＳ細胞に関しては、Ｔｈｏｍｓｏｎらが、ヒトの線維芽細胞に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８を導入してヒトｉＰＳ細胞を樹立し（非特許文献８）、また、Ｙａｍａｎａｋａらは、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣをヒトの線維芽細胞に導入して、同じくｉＰＳ細胞を樹立した（非特許文献９）。
【０００４】
以上のように、ｉＰＳ細胞の今後の利用可能性が注目される中で、いくつかの問題点が指摘されている。
まず、分化多能性を体細胞へ付与する因子（Ｏｃｔ、Ｓｏｘなど。以下、分化多能性因子と称する）を体細胞へ導入するために、レトロウィルスベクターなどによる遺伝子導入法を用いると、細胞のゲノム中に遺伝子がランダムに導入され、その結果、遺伝子の挿入による突然変異（特に、内在性発癌遺伝子の活性化など）が引き起こされる可能性が指摘される。特に、癌遺伝子であるｃ−Ｍｙｃ遺伝子を導入すると、作製したｉＰＳ細胞の癌化が有意に高い確率で確認されている。ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を用いずにｉＰＳ細胞の作出に成功したことが報告されてはいるが（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）、作出効率が極めて低いため、今後、臨床的な応用に利用することは難しいのではないかと考えられている。
最近、アデノウィルスベクター用いて、分化多能性因子の体細胞における発現を、一過的に大量に行うことでｉＰＳ細胞を作製する方法が報告された（非特許文献１０）。この方法で作製されたｉＰＳ細胞をマウスの胚盤胞にインジェクトすると、生まれたマウスの組織中にインジェクトしたｉＰＳ細胞に由来する分化した細胞が確認され、また、少なくとも４〜１２週齢のマウスにおいて癌化は認められなかった。この方法によれば、分化多能性因子の遺伝子導入に伴うｉＰＳ細胞の癌化の問題が解決される可能性がある。
【０００５】
また、分化多能性因子を遺伝子として導入してｉＰＳ細胞を作製する方法は、多くの煩雑な工程を必要とし、スクリーニングなどに長い時間を要することから、効率性の問題が指摘される。タンパク質を細胞内で機能させるためには、その遺伝子を導入して目的の細胞内で発現させる他、タンパク質自体を細胞内に直接導入することも可能である。タンパク質自体を直接細胞へ導入する方法は、これまでに多くの方法が報告されているが、中でも、膜透過ペプチド（あるいは、タンパク導入ドメイン、細胞膜透過性ペプチド）との融合タンパク質を目的の細胞に接触させて、細胞内へ導入する方法が多く利用されている（例えば、特許文献１〜９など）。ｉＰＳ細胞を樹立するために、分化多能性因子をタンパク質のまま体細胞へ導入する方法については、その可能性を示唆する文献（特許文献１０）や、分化多能性因子のＯｃｔ４タンパク質とＳｏｘ２タンパク質を導入したとの報告はあるが（非特許文献１１）、実際にｉＰＳ細胞を作製したとの報告はこれまでに存在しない。これは、タンパク質自体を導入することの指摘は可能であっても、実際に細胞内で機能するように分化多能性因子タンパク質を導入することは多くの困難が伴うためである。
【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００６，１２６：６６３−６７６．
【非特許文献２】Ｏｋｉｔａら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１３−３１７．
【非特許文献３】Ｗｅｒｎｉｇら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４４８：３１８−３２４．
【非特許文献４】Ｍａｈｅｒａｌｉら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００７，１：５５−７０．
【非特許文献５】Ｐａｒｋら，Ｎａｔｕｒｅ ２００７，４５１：１４１−１４６．
【非特許文献６】Ｎａｋａｇａｗａら，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００８，２６：１０１−１０６．
【非特許文献７】Ｗｅｒｎｉｇら，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００８，１０：１０−１２．
【非特許文献８】Ｙｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００７，３１８：１９１７−１９２０．
【非特許文献９】Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｃｅｌｌ ２００７，１３１：８６１−８７２．
【非特許文献１０】Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８，オンライン公開版（ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１１６２４９４／ＤＣ１）
【非特許文献１１】Ｂｏｎｓｎａｌｉ及びＥｄｅｎｈｏｆｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００８，３８９：８５１−８６１．
【特許文献１】ＵＳ５，８０４，６０４号
【特許文献２】ＵＳ５，７４７，６４１号
【特許文献３】ＵＳ５，６７４，９８０号
【特許文献４】ＵＳ５，６７０，６１７号
【特許文献５】ＵＳ５，６５２，１２２号
【特許文献６】ＷＯ２００２／０１８５７２
【特許文献７】特開２００５−５２０８３
【特許文献８】特開２００５−２５３４０８
【特許文献９】特開２００１−１９９９９７
【特許文献１０】ＷＯ２００７／０６９６６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行ったところ、分化多能性因子タンパク質を体細胞に導入することによってｉＰＳ細胞を作製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、従来のｉＰＳ細胞作製方法に生じ得る諸問題を解決するために、分化多能性因子タンパク質を直接体細胞へ導入し、安全なｉＰＳ細胞を効率的に作製する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは、分化多能性因子タンパク質を膜透過性ペプチド融合させて体細胞内へ導入したところ、安全性の高いｉＰＳ細胞を効率的に作製することに成功した。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）本発明の第１の形態は、「分化多能性因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞へ導入し、ｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（２）本発明の第２の形態は、「前記分化多能性因子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す組合せのタンパク質であり、（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つをタンパク質のまま該体細胞へ導入し、その他のタンパク質はその遺伝子を該体細胞へ導入して細胞内で発現させる、上記（１）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質」である。
（３）本発明の第３の形態は、「前記（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つを、タンパク質のまま体細胞に導入するために、該タンパク質に膜透過ペプチドを融合させることを特徴とする上記（２）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（４）本発明の第４の形態は、「前記分化多能性因子の組合せが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４である上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（５）本発明の第５の形態は、「前記ｃ−Ｍｙｃをタンパク質のまま導入する上記（４）に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
（６）本発明の第６の形態は、「前記体細胞がヒト由来である上記（１）乃至（５）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法」である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、安全性の高い（特に、癌化しない）ｉＰＳ細胞を効率的に作製することができる。
【００１０】
また、発明の方法を用いると、細胞の種類に関係なく（従来は、ｉＰＳ細胞のソースとして線維芽細胞が中心に使用されてきた）、多くの体細胞をｉＰＳ細胞のソースとして使用することができる。
【００１１】
臨床応用を考慮するにあたり、ウィルスベクターの使用に関する制約は多く、臨床グレードの安全性の保証されたウィルス液の作製は現在まで国内ではほとんど行われていない。これに対し、ＧＭＰ基準のタンパク質合成は国内にて比較的容易に可能であり、臨床応用の面からも本発明の方法に優位性を認めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の目的の１つは、ｉＰＳ細胞の安全かつ効率的な作製方法を提供することである。
ここで、「ｉＰＳ細胞」とは、人工多能性幹細胞若しくは誘導多能性幹細胞とも称される分化多能性を獲得した細胞のことで、体細胞へ分化多能性を付与する数種類の転写因子（以下、ここでは「分化多能性因子」と称する）遺伝子を導入することにより、ＥＳ細胞と同等の分化多能性を獲得した細胞である。「分化多能性因子」としては、すでに多くの因子が報告されており、限定はしないが、例えば、Ｏｃｔファミリー（例えば、Ｏｃｔ３／４（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１３６３３（マウス）、ＮＭ＿００２７０１（ヒト）））、Ｓｏｘファミリー（例えば、Ｓｏｘ２（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１１４４３（マウス）、ＮＭ＿００３１０６（ヒト））、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５及びＳｏｘ１７など）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ４（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０６３７（マウス）、ＮＭ＿００４２３５（ヒト））、Ｋｌｆ２など）、Ｍｙｃファミリー（例えば、ｃ−Ｍｙｃ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０８４９（マウス）、ＮＭ＿００２４６７（ヒト））、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃなど）、Ｎａｎｏｇ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０２４８６５（マウス）、ＮＭ＿０２８０１６（ヒト））、ＬＩＮ２８（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿１４５８３３（マウス）、ＮＭ＿０２４６７４（ヒト））などを挙げることができる。また、分化多能性因子のスクリーニング方法に関する報告を参考に、当業者であれば適宜、所望の分化多能性因子を選択することができる（例えば、ＷＯ２００５／８０５９８を参照のこと）。
ｉＰＳ細胞を作製するために導入される分化多能性因子の組合せとしては、限定はしないが、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の組合せを使用することができる。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質
【００１３】
また、ヒト及び非ヒト動物細胞（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）に存在する上掲の分化多能性因子のホモログを用いて本発明を実施することにより、所望の動物由来のｉＰＳ細胞を容易に作製することができる。また、本発明において使用される分化多能性因子は、必ずしも野生型である必要はなく、野生型のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、上掲の分化多能性因子タンパク質のアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、体細胞の分化多能性の誘導を他の分化多能性因子と協働して惹起するタンパク質である。あるいは、上掲の分化多能性因子タンパク質のアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、体細胞の分化多能性の誘導を他の分化多能性因子と協働して惹起するタンパク質である。
【００１４】
分化多能性因子タンパク質と「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」には、野生型の分化多能性誘導能よりも優れた能力を発揮するものも含まれる。このようなより優れた能力を発揮するタンパク質は、野生型のタンパク質のアミノ酸配列中に欠失、置換若しくは付加などの改変を、当該技術分野で公知の手法により導入することで調製することが可能である。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により、分化多能性因子の遺伝子に適当な塩基置換を導入して行うことができる。
【００１５】
なお、本明細書において、「分化多能性因子」と記載する場合、特に、注記しなければ、タンパク質及び遺伝子の両方を指すものとする。特にタンパク質について議論する場合には、「分化多能性因子タンパク質」と、遺伝子について議論する場合には、「分化多能性因子遺伝子」と記載することとする。また、特定の分化多能性因子を記載する場合も、例えば、「Ｓｏｘ２」などと記載する場合、特に注記しなければ、Ｓｏｘ２タンパク質及びＳｏｘ２遺伝子の両方を意味するものとする。
【００１６】
本発明のある実施形態において、体細胞に導入する分化多能性因子の少なくとも１つ、又は全部をタンパク質のまま導入することができる。タンパク質を細胞内に導入する方法としては、例えば、「膜透過性ペプチド」、「タンパク質導入ドメイン」、あるいは「細胞膜透過性ペプチド」などと称されるペプチドを、細胞内へ導入するタンパク質に融合させる方法が容易に利用可能である。ここで、「膜透過性ペプチド」、「タンパク質導入ドメイン」、あるいは「細胞膜透過性ペプチド」とは、塩基性アミノ酸を多く含むことを特徴とする細胞膜透過性を有するペプチドのことで、例えば、ＨＩＶ−１ ＴＡＴ（配列番号１）、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１（配列番号２）、ＨＩＶ−１ Ｒｅｖ（配列番号３）、ｐＡｎｔｐ（配列番号４）、ＶＰ２２ペプチド（配列番号５）、ＳＶ４０ＮＬＳ（配列番号６）、Ｐｅｐ−１（配列番号７）、Ｉｎｔｅｇｒｉｎβ３（配列番号８）、ＩｎｆｌｕｅｎｚａＨＡ−２（配列番号９）、Ｗ／Ｒ（配列番号１０）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（配列番号：１１）、ＢＭＶ−ｇａｇ（配列番号１２）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲｅｘ（配列番号１３）、Ｈｕｍａｎ ｃＦＯＳ（配列番号１４）、Ｈｕｍａｎ ｃＪＵＮ（配列番号１５）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号１６）、Ｙｅａｔ ＧＣＮ４（配列番号１７）、Ｒ９（配列番号１８）などを挙げることができるが、特に、これらのペプチドに限定されるものではなく、当業者によって容易に選択することができる細胞膜透過性を有するペプチドであれば、如何なるものでも使用することができる（より詳細には、Ｄｉｅｔｚら，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４ ２７：８５−１３１及び特許文献１〜９を参照のこと）。
【００１７】
体細胞へ導入する分化多能性因子タンパク質の調製は、多くの従来技術の中から当業者によって容易に選択し、実施することができる。通常は、適当な発現ベクターを用いて適当な細胞内で発現させる方法が利用される。この場合、発現ベクター上に、適当な発現プロモーターの下流に、膜透過性ペプチドをコードする核酸と所望の分化多能性因子をコードする核酸を発現可能に（つまり、両者が機能し得る形態で連結して発現するように）組込み、適当な宿主細胞（大腸菌、枯草菌などの原核生物の他、酵母、動物細胞、昆虫細胞などの真核生物由来の細胞）に形質導入し、該宿主細胞内で発現した分化多能性因子タンパク質を定法に従って抽出・精製することで、所望の分化多能性因子を調製することができる。
【００１８】
本発明の実施に使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、対象とする細胞の性質に応じて選択することができる。
【００１９】
本発明の実施に使用可能なプロモーターとしては、対象タンパク質の発現を行う細胞に対応した適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００２０】
対象タンパク質の発現ベクターには対象タンパク質のコード化配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
【００２１】
本発明のｉＰＳ細胞を作製する方法において、体細胞にタンパク質のまま導入する分化多能性因子以外の分化多能性因子は、その遺伝子を該体細胞中へ導入し、細胞中において発現させてもよい。この場合、導入する分化多能性因子の遺伝子は、目的の体細胞に適した発現ベクターに発現可能に挿入し、該ベクターを目的の体細胞へ形質導入し、該遺伝子の発現を体細胞中で行わせることができる。使用可能な発現ベクターは、当業者によって適宜選択することができるが、例えば、レトロウィルスベクターなどが好ましい。分化多能性因子を体細胞中で発現する方法の詳細は、前掲の非特許文献１〜１０に詳細に記載されているので、参照されたい。
また、ｉＰＳ細胞を調製するために体細胞を培養する培地についても、特に、限定されるものではなく、前掲の非特許文献１〜１０に記載される培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などに適宜必要な因子を添加して使用することができる。
【００２２】
本発明のｉＰＳ細胞を作製する方法においては、如何なる体細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、あるいは、動物検体由来の任意の細胞など）であっても使用することができ、特に、限定されるものではない。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．ＴＡＴ−融合タンパク質の精製
ｐＴＡＴ−ＨＡ大腸菌発現ベクター（ワシントン医科大学Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ．Ｄｏｗｄｙ博士より供与）に発現目的タンパク質（ｃ−Ｍｙｃなど）を挿入したもので、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、１ｍＭ ＩＰＴＧ存在下、３７℃で４時間培養し、タンパクの発現を誘導した。その後、細胞溶解バッファー中で細胞破砕を行い、遠心操作 （１２，０００回転、２０分、４℃） により可溶化タンパクを含んだ細胞溶解液を得た。これをＮｉ−ＮＴＡカラムに通し、洗浄後、結合タンパク質を５００ｍＭイミダゾール存在下にて溶出した。さらにＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｍ カラムによるバッファー交換で脱塩し、ＰＢＳ又は培養メディウム（血清不含ＤＭＥＭ）に置換後、急速凍結して使用まで−８０℃で保存した。
【００２４】
２．膜透過ペプチド融合タンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製
図１にＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０３４９７９；配列番号１）を用いたＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：マウス胎児線維芽細胞）からの高効率ｉＰＳ細胞作製の模式図を示す。ｉＰＳ細胞誘導の原法では４種の転写因子をレトロウイルスによって導入する（図の上側；ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４）。ｃ−Ｍｙｃの導入は必須ではないものの、高いｉＰＳ細胞誘導効率を得るために必要となる。しかしながら、ｃ−Ｍｙｃウイルスのゲノムへの挿入は再活性化による細胞の癌化の原因となる。そこで、臨床研究の安全性の向上に寄与すべく、ｃ−Ｍｙｃをタンパクの形で導入することでｉＰＳ細胞の樹立を可能にすることを試みた（図の下側；ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃ）。理論的には他の３因子も全てタンパクの形で導入し、ゲノムへの遺伝子挿入を伴わないｉＰＳ細胞作製法が可能である。
【００２５】
３．ＴＡＴ誘導タンパク質の調製
発現されるタンパク質の模式図を図２に示す。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に始まり、ヒスチジンＴａｇ（６ｘＨｉｓ：タンパク精製に必要）、ＴＡＴペプチド配列と続き、ヘマグルチニン（ＨＡ：目的タンパクのＴａｇとなり解析に利用される）に融合される形で目的タンパク質が発現される。マウスｃ−Ｍｙｃ（ｍｃ−Ｍｙｃ）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１０８４９；配列番号２）と蛍光マーカーｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ（ｈｕＫＯ）（ＭＢＬ，カタログ番号：ＡＭ−Ｖ００４５）を発現するベクターをそれぞれ構築し、研究に用いた（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ、ＴＡＴ−ｈｕＫＯ）。コントロールとして、それぞれにつきＴＡＴを含まないベクターを構築し、ＴＡＴを含まない融合タンパク質を発現、精製して用いた（ｍｃ−Ｍｙｃ ｗ／ｏＴＡＴ、ｈｕＫＯ ｗ／ｏＴＡＴ）。
【００２６】
４．ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＪｕｒｋａｔ細胞への導入
精製ＴＡＴ−融合タンパク質の機能性を確認する目的で、ＴＡＴ−ｈｕＫＯを精製し、異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞培養液（１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０）に加えた。６０分後に細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。図３に示すように、用量依存性のタンパク導入が観察された。
５．ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入
ｉＰＳ細胞作製の標的細胞であるＭＥＦに対する導入キネティクスをＴＡＴ−ｈｕＫＯを用いて検討した。ＴＡＴ−ｈｕＫＯは、５μＭを用いてＭＥＦ細胞とインキュベートし、洗浄後、蛍光顕微鏡にて観察した（図４）。その結果、１０分後に細胞膜表面に蛍光が認められ、３０分後には細胞質内へのｈｕＫＯタンパクの導入が認められた。６０分後では、一部、１２０分では、多くの細胞でｈｕＫＯ蛍光が核（ＤＡＰＩによる二重染色）に重複して観察され、核内へのタンパク導入が確認された。
次に、タンパク導入の濃度依存性を検討した。図５に示した濃度でＴＡＴ−ｈｕＫＯをＭＥＦ細胞と１時間インキュベートした結果を示す。ＴＡＴ−ｈｕＫＯの使用量、２μＭから導入細胞が観察されるようになり、５μＭではほぼ１００％の細胞にｈｕＫＯ蛍光が認められた。一方、ＴＡＴを融合していない精製ｈｕＫＯタンパク質については、５μM使用した場合でも、ＭＥＦ細胞内に蛍光シグナルが検出されなかった。
【００２７】
６．ＴＡＴ−ｍｃ−ＭｙｃのＭＥＦ細胞への導入
上記１に記載した手順によりＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）を精製した。精製したＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析結果を図６に示す。フロースルー（素通し）中に夾雑タンパク質が多く認められるが、精製物は、ほぼ単一バンドとなっており、高純度のＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃタンパク質を精製することができた。
精製したＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを２μＭの濃度でＭＥＦ細胞とインキュベートし、洗浄後、ウェスタンブロット法により導入タンパク質の量を解析した（図７）。導入タンパク質の検出には、抗ポリ−ヒスチジン抗体を用いた。数分のインキュベーション（０ｈｒ）においても、わずかながら導入タンパク質のシグナルを認めることができ、０．５ｈｒのインキュベーションから導入タンパク質量の明らかな増加が認められ、以後、漸増し、６ｈｒのインキュベーションでほぼプラトーに達した。内在性のコントロールとしてα−チューブリンタンパク質の量を同時に解析した。
７．ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃによる細胞毒性の評価
ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞と１時間インキュベートし、細胞毒性をＣＣＫ−８キット（ＭＴＴ法に準じた細胞毒性アッセイ法、同仁化学研究所）を用いて解析した。５μＭ以上の濃度において、わずかな細胞毒性を反映した吸光度の低下が認められたが、有意な低下ではなかった。２μＭでは吸光度の低下は見られず、細胞毒性はみられなかった（図８）。
【００２８】
８．ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製の実際
図９にｉＰＳ細胞誘導のタイムスケジュールを示す。従来法の「４因子レトロウィルスベクター法」は、図９の太実線の上側に示すように、ｄａｙ１（１日目）にウイルス感染を行い、ｄａｙ３（３日目）よりｉＰＳ細胞誘導メディウム（１５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭにｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ １，０００ Ｕ／ｍｌを加えたもの）に置換後、経過観察の後、ｄａｙ７（７日目）頃からＥＳ細胞様コロニーが出現する。そして、ｄａｙ１５（１５日目）前後に、その形態的特徴に基づいてＥＳ細胞様の細胞をピックアップする。
一方、本発明の１例である、「３因子レトロウィルスベクター＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法」は、図９太実線の下側に示すように、ｄａｙ１（１日目）にｃ−Ｍｙｃ以外の３因子をウィルスベクターにより導入する。ｄａｙ２（２日目）より、１日１回、ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ導入を繰り返し、ｄａｙ１５（１５日目）前後にＥＳ細胞様コロニーをピックアップした。「３因子レトロウィルスベクター＋コントロールｃ−Ｍｙｃ」をコントロールとして用いたが、コロニーの出現は認められなかった。
上記スケジュールに従い、Ｃ５７ＢＬ／６マウスＭＥＦを用いてｉＰＳ細胞の誘導を行った。レトロウィルスによる４因子導入（Ｒ４ｉＰＳ）と、３因子ウィルス導入＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法（ＴＭｉＰＳ）を行った結果、いずれの方法を用いてもＥＳ細胞様のコロニーを得ることができた。また、Ｒ４ｉＰＳ細胞（図１０、Ｒ４ｉＰＳ）とＴＭｉＰＳ細胞（図１０、ＴＭｉＰＳ）との間に形態の差を認めなかった。
【００２９】
９．樹立したｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色及び未分化マーカー発現の確認
樹立したｉＰＳ細胞についてアルカリフォスファターゼ染色を行った。Ｒ４ｉＰＳ細胞、ＴＭｉＰＳ細胞ともに染色され、細胞の未分化性の指標であるアルカリフォスファターゼ活性を有することが示された（図１１）。さらに、Ｒ４ｉＰＳ細胞、ＴＭｉＰＳ細胞は、ともに未分化細胞マーカーＳＳＥＡ−１、Ｎａｎｏｇタンパクを発現することが、抗ＳＳＥＡ−１抗体及び抗Ｎａｎｏｇタンパク質抗体による免疫染色によって示された（図１２）。
以上の結果から、本発明の方法によってｉＰＳ細胞を作製することが可能であり、作製されたｉＰＳ細胞は、従来の方法によって作製されるｉＰＳ細胞と同様の特徴を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ｉＰＳ細胞を安全かつ迅速に調製する方法であるため、今後、ｉＰＳ細胞を臨床上利用する上で、極めて有効な手段を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】膜透過ペプチド融合タンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製法について模式的に説明した図である。
【図２】ＴＡＴ−融合タンパクの構造模式図を示す。 翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に始まり、ヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ：タンパク精製に必要）、ＴＡＴペプチド配列と続き、ヘマグルチニン（ＨＡ：目的タンパクのＴａｇとなり解析に利用される）に融合される形で目的タンパク質が発現される。ｈｕＫＯ：ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ
【図３】フローサイトメトリーによるＴＡＴ−ｈｕＫＯのＪｕｒｋａｔ細胞への導入の確認。 精製ＴＡＴ−融合タンパク質の機能性を確認する目的で、精製したＴＡＴ−ｈｕＫＯを、異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞培養液に加え、６０分後に細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。
【図４】ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入 ｉＰＳ細胞作製の標的細胞であるＭＥＦに対しての導入キネティクスをＴＡＴ−ｈｕＫＯを用いて検討した。ＴＡＴ−ｈｕＫＯ（５μＭ）を細胞に添加し、図に示した時間インキュベートし、洗浄後に蛍光顕微鏡にて観察した。
【図５】ＴＡＴ−ｈｕＫＯのＭＥＦ細胞への導入 図に示した濃度でＴＡＴ−ｈｕＫＯをＭＥＦ細胞と１時間インキュベートし、蛍光顕微鏡観察を行った。
【図６】ＴＡＴ−融合−Ｍｙｃタンパク質の精製 精製したＴＡＴ−融合Ｃ−Ｍｙｃタンパク質（ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行った結果を示す。
【図７】ＴＡＴ−ｍｃ−ＭｙｃのＭＥＦ細胞への導入 精製したＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ（２μＭ）をＭＥＦ細胞と共に図に表示した時間インキュベートし、洗浄後、ウェスタンブロット法により導入したタンパク質の量を解析した。内在コントロールとしてa−チューブリンのタンパク量を同時に解析した。
【図８】ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃによる細胞毒性の評価 ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを異なる濃度でＪｕｒｋａｔ細胞と１時間インキュベートし、細胞毒性をＣＣＫ−８キット（ＭＴＴ法に準じた細胞毒性アッセイ法）を用いて解析した。グラフの縦軸は吸光度を示し、値が低くなるほど細胞への毒性の影響が強くなる。横軸の「Ｊｕｒｋａｔ」は、ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃを添加しないコントロールを示す。
【図９】ｉＰＳ細胞誘導のタイムスケジュール ４因子レトロウィルスベクター法：太実線の上側に示す。 ３因子レトロウィルスベクター＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法：太実線の下側に示す。
【図１０】ＴＡＴ−融合ｃ−Ｍｙｃタンパク質を用いたｉＰＳ細胞作製の実際 図９に示した方法によりＣ５７ＢＬ／６マウスＭＥＦを用いてｉＰＳ細胞の誘導を行った。レトロウィルスによる４因子導入（Ｒ４ｉＰＳ）と３因子ウィルス導入＋ＴＡＴ−ｍｃ−Ｍｙｃ法（ＴＭｉＰＳ）を行い、両方法によって作製されるｉＰＳ細胞の位相差顕微鏡像を示す。
【図１１】樹立したｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色 樹立したｉＰＳ細胞ついてアルカリフォスファターゼ染色を行った結果である。
【図１２】樹立したｉＰＳ細胞の未分化マーカーの発現 Ｒ４ｉＰＳ細胞及びＴＭｉＰＳ細胞を、各々、抗ＳＳＥＡ−１抗体（ＳＳＥＡ−１、各パネル左側）及び抗Ｎａｎｏｇタンパク質抗体（Ｎａｎｏｇ、各パネル左側）で免疫染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した観察像を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化多能性因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞へ導入し、ｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項２】
前記分化多能性因子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す組合せのタンパク質であり、（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つをタンパク質のまま該体細胞へ導入し、その他のタンパク質はその遺伝子を該体細胞へ導入して細胞内で発現させる、請求項１に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質
【請求項３】
前記（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つを、タンパク質のまま体細胞に導入するために、該タンパク質に膜透過ペプチドを融合させることを特徴とする請求項２に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項４】
前記分化多能性因子の組合せが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４である請求項１乃至３のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項５】
前記ｃ−Ｍｙｃをタンパク質のまま導入する請求項４に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項６】
前記体細胞がヒト由来である請求項１乃至５のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項１】
分化多能性因子の少なくとも１つをタンパク質のまま体細胞へ導入し、ｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項２】
前記分化多能性因子が、以下の（ａ）〜（ｃ）に示す組合せのタンパク質であり、（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つをタンパク質のまま該体細胞へ導入し、その他のタンパク質はその遺伝子を該体細胞へ導入して細胞内で発現させる、請求項１に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
（ａ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質及びＫｌｆファミリータンパク質、
（ｂ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｋｌｆファミリータンパク質及びＭｙｃファミリータンパク質、及び
（ｃ）Ｏｃｔファミリータンパク質、Ｓｏｘファミリータンパク質、Ｎａｎｏｇタンパク質及びＬＩＮ２８タンパク質
【請求項３】
前記（ａ）〜（ｃ）に示されるタンパク質の少なくとも１つを、タンパク質のまま体細胞に導入するために、該タンパク質に膜透過ペプチドを融合させることを特徴とする請求項２に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項４】
前記分化多能性因子の組合せが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４である請求項１乃至３のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項５】
前記ｃ−Ｍｙｃをタンパク質のまま導入する請求項４に記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【請求項６】
前記体細胞がヒト由来である請求項１乃至５のいずれかに記載のｉＰＳ細胞を作製する方法。
【図８】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−１１０２８９（Ｐ２０１０−１１０２８９Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８７３１１（Ｐ２００８−２８７３１１）
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度文部科学省、「科学技術試験研究委託事業」、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１０日（２００８．１１．１０）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１９年度文部科学省、「科学技術試験研究委託事業」、産業技術力強化法第１９条の適用を受けるもの）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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