ｍＲＮＡをトランスフェクションした抗原提示細胞
ＲＮＡを増幅して、大部分、センス配向であり、そしてアンチセンス配向であるＲＮＡ分子を欠いている、ＲＮＡ分子を得る方法。免疫原性抗原をコードするセンスＲＮＡを含み、そしてアンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを本質的に欠いている組成物を、抗原提示細胞にトランスフェクションする方法、並びに該方法にしたがって調製した樹状細胞もまた、提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／５２５，０７６号、２００３年１１月２５日出願に優先権を請求し、該出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本明細書に開示する主題は、ＲＮＡを増幅し、望ましい機能に応じて、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であるＲＮＡ分子を得る方法に関する。抗原提示細胞に、腫瘍抗原または微生物抗原をコードするセンスＲＮＡをトランスフェクションする方法、並びに本明細書に開示する方法にしたがって調製した抗原提示細胞もまた、提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
Ｔリンパ球は、感染性病原体および腫瘍細胞に対する免疫応答において、並びに臓器移植拒絶および自己免疫において、重要な役割を果たす。Ｔ細胞は、抗原提示細胞表面上のＭＨＣ分子に結合した小さい断片の形で、抗原が提示されている場合にのみ、抗原を認識する。Ｔ細胞が応答するためには、休止中のＴリンパ球に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、２つのシグナルが提供されなければならない。免疫応答に特異性を与える第一のシグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連して提示された外来抗原性ペプチドの認識後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第二のシグナルは、Ｔ細胞が増殖するように誘導し、そして機能させる。したがって、抗原提示は、免疫応答誘導における重要な工程である。
【０００４】
特定の抗原に対する免疫応答を誘導する試みの中で、ＡＰＣに抗原を搬送する多様なアプローチが用いられてきている。これらには、ウイルスベクターの使用、リポソーム中への抗原の挿入、および精製抗原または組換えタンパク質を用いた細胞の直接パルス処理が含まれる。
【０００５】
より最近は、ＲＮＡのＡＰＣへのトランスフェクションに基づく抗原搬送系が記載されてきている。ＲＮＡを装填した抗原提示細胞を用いて、癌および病原体感染を治療するかまたは予防する方法が、本明細書に援用される、米国特許第６，３０６，３８８号および第５，８５３，７１９号、並びに関連特許および出願に開示される。簡潔には、総腫瘍ＲＮＡまたは腫瘍抗原をコードする選択されるＲＮＡを増幅し、そして樹状細胞にトランスフェクションする。病原体由来ＲＮＡでトランスフェクションした抗原提示細胞もまた、感染性疾患の治療に使用可能である。
【０００６】
抗原で修飾した樹状細胞に基づくワクチンは、有効な抗腫瘍免疫のため非常に有望であり、そしてＲＮＡは、樹状細胞（ＤＣ）への抗原搬送のビヒクルとして広く認められている（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＮａｉｒ、２０００；ＮａｉｒおよびＢｏｃｚｋｏｗｓｋｉ、２００２；Ｐｏｎｓａｅｒｔｓら、２００３；並びにＰｏｎｓａｅｒｔｓら、２００２）。抗原をコードする腫瘍ＲＮＡは、最も広いありうる腫瘍抗原レパートリーを提供し、特定のＨＬＡハプロタイプも、また総ＲＮＡ集団中に存在する定義される腫瘍抗原の同定および性質決定も必要としないため、抗原搬送の他の方法に内在する制限を克服する。
【０００７】
ＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣが、一次細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を刺激可能であることは、現在、確実に確立されている（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、１９９６）。多くの研究によって、多様なモデルにおけるこのアプローチの実現可能性が確認されてきている。総腎細胞癌腫ＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣを用いた１つの研究によって、原発性腫瘍および転移腫瘍に対するＴ細胞反応性が有効に刺激されることが立証された（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ａ）。他のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、自家性腫瘍ＲＮＡを装填されたＤＣが、膀胱癌（Ｓｃｈｍｉｔｔら、２００１）、多発性骨髄腫（Ｍｉｌａｚｚｏら、２００３）、乳癌腫（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００３）および結腸直腸癌（Ｎｅｎｃｉｏｎｉら、２００３）に対する特異的ＣＴＬを誘導可能であることが立証されている。結腸直腸癌（Ｒａｉｎｓら、２００１）、腎細胞癌腫（Ｓｕら、２００３）および悪性神経膠腫（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００３）に対して、自家性総腫瘍ＲＮＡを装填したＤＣを用いたワクチン接種戦略を試験する臨床試験が行われている。総ＲＮＡの２〜３％という少ない割合のみが、ｍＲＮＡまたは抗原コード種に対応する。ＲＮＡのｍＲＮＡを濃縮すると、ＤＣに搬送される同量のＲＮＡ中、コードＲＮＡ種の比率が増加する。コードＲＮＡ種を濃縮する１つの方法は、物理的分離法を用いて、ポリＡ＋ ＲＮＡを単離することである。前立腺細胞株ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクションして、ＤＣに基づく臨床等級のワクチンを生成する方法が記載されてきており（Ｍｕら、２００４）、そして開発されたアプローチを用いた臨床試験が開始された（Ｍｕら、２００３）。コードＲＮＡ集団を濃縮する別の方法は、ポリアデニル化された種のみを偏向して増幅するＲＮＡ増幅である。小さい腫瘍標本からＲＮＡを多量に増幅して、コード種を濃縮可能であり、そして生物学的機能の損失を伴わずに増幅が起こることを立証する研究が行われた（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００）。総腫瘍ＲＮＡから増幅したＲＮＡが生物学的活性を保持するかどうかを決定することを目的とする研究において、黒色腫細胞株から増幅したＲＮＡをトランスフェクションしたネズミＤＣは、抗腫瘍ＣＴＬ応答を生じた。この研究に記載されるＲＮＡ増幅プロトコルはまた、顕微解剖レーザー切片由来の前立腺腫瘍細胞にも適用されており、この場合は、自家性患者材料を用いて、腫瘍特異的ＣＴＬが誘導されることが報告された（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ｂ）。したがって、腫瘍ＲＮＡを抗原供給源として用いると、ＲＮＡを抽出し、そして増幅することが可能な投入腫瘍組織を少量しか必要としないというさらなる利点が提供される。
【０００８】
ｍＲＮＡ（ポリＡ＋ ＲＮＡ）の相補ＤＮＡへの変換、およびそれに続く配列の増幅は、分子生物学分野の当業者に周知の基本的技術である。基本的技術の多様な順列の説明は、米国特許第５，９６２，２７１号、第５，９６２，２７２号および第６，５９３，０８６号に見出されることも可能であり、これら特許の内容は、本明細書に援用される。例えば、ＲＮＡ増幅の公開されているプロトコルは、テンプレート切り替え技術を利用する（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら、１９９８）。この技術の略図を図１Ａに示す。この技術は、ＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮアーゼＨ欠損突然変異体に特有の特性を利用して、さらなる残基、主にシトシンを、合成された第一鎖ｃＤＮＡの５’端に取り込む。いくつかの連続するＧ残基を３’端に含有するオリゴヌクレオチドが、第一鎖合成反応に存在する場合、ワトソン−クリック塩基対形成がＧおよびＣヌクレオチドの間に生じるであろう。逆転写酵素が転写物の５’端に到達すると、該酵素はテンプレートを切り替え、そしてアニーリングしたオリゴヌクレオチドの定義される配列からの転写を続ける。ｃＤＮＡの３’端は、他の定義される配列を含有するポリｄＴオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって定義される。第一鎖ｃＤＮＡの定義される３’端および５’端は、ＰＣＲに基づく限定されない増幅を可能にするであろう。続いて、増幅した産物中の抗原配列の転写および翻訳を可能にするため、ＰＣＲ反応に用いるＧを含有するオリゴヌクレオチドにＴ７プロモーター配列を付加する（キャップスイッチ）ことによって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列を導入する。元来はＣｈｅｎｃｈｉｋらに記載されたテンプレート切り替えプロトコルは、操作、およびそれに続くプラスミドベクターへのサブクローニングを容易にするために設計された。
【０００９】
このプロトコルでは、キャップスイッチおよびポリｄＴオリゴヌクレオチドはどちらも重複配列を含有する。これによって、ＰＣＲ反応において、単一オリゴヌクレオチドを用いた増幅が可能になる。例えば、Ｔ７含有オリゴヌクレオチドを第一鎖ｃＤＮＡ合成に用い、そしてＴ７含有オリゴヌクレオチドをＰＣＲ工程に用いる場合、このオリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡの５’端および３’端両方にアニーリングさせることも可能である。最終ＰＣＲ産物は、両端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を有するであろう。したがって、続く転写反応において、ＲＮＡポリメラーゼは、５’端および３’端両方に結合して、センス配向およびアンチセンス配向両方で、ＲＮＡを合成するであろう。
【００１０】
センス配向およびアンチセンス配向両方のＲＮＡを抗原提示細胞にトランスフェクションすると、有望な結果が生じてきている。しかし、抗原提示細胞に対するこうした方法の負の影響は、以前には認識されてきていなかった。したがって、樹状細胞および他の抗原提示細胞におけるｍＲＮＡコード抗原の発現を最適化する方法が必要である。本発明は、この必要性を満たす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
概要
本明細書に開示する主題の１つの態様において、抗原提示細胞に少なくとも１つのｍＲＮＡをトランスフェクションする方法を提供する。該方法は、アンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠き、そして少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含む調製物を：
（ｉ）試料から少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅して、ポリヌクレオチド・テンプレートを産生し、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、該ポリヌクレオチド・テンプレートのセンス鎖のみに機能可能であるように連結された、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む；そして
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド・テンプレートをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを産生する、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、クローニングされたテンプレートではない
ことによって、調製し；そして
少なくとも１つの抗原提示細胞に、調製物由来の少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡをトランスフェクションすることを含む。方法のいくつかの態様において、試料からのｍＲＮＡの増幅は、試料からｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド・テンプレートを産生し；そして第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡを増幅する、ここで第一のプライマーおよび第二のプライマーの一方のみが、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを挿入することを含む。いくつかの態様において、第一のプライマーは、ポリＴストレッチ、および第二のプライマーに配列相同性を本質的に持たない５’配列を含み、そして第二のプライマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む。
【００１２】
本明細書に開示する主題の別の態様において、上述の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞を提供する。いくつかの態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。さらに、いくつかの態様において、樹状細胞は成熟樹状細胞である。他の態様において、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。
【００１３】
さらなる態様において、キャリアー中に、上に開示する、ｍＲＮＡが装填された新規抗原提示細胞の少なくとも１つを含む、組成物を提供する。
さらなる態様において、少なくとも１つの抗原に対して、被験者において免疫応答を生じる方法を提供する。該方法は、上述のｍＲＮＡが装填された新規抗原提示細胞を被験者に導入することを含み、ここでｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞は、被験者の免疫系に少なくとも１つの抗原を提示し、それによって少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を生じる。
【００１４】
さらなる態様において、被験者において障害を治療する方法を提供する。該方法は、治療が必要な被験者に、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含み、そしてアンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠いているＲＮＡ調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした少なくとも１つの抗原提示細胞を含む、療法的有効量の組成物を投与することを含み、ここで、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが、上述の方法によって産生され、そしてポリヌクレオチド・テンプレートがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されて、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが産生され、ポリヌクレオチド・テンプレートはクローニングされたテンプレートではない。いくつかの態様において、障害は癌である。他の態様において、障害は微生物感染の結果である。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、治療される被験者から得られる、自家性抗原提示細胞である。
【００１５】
したがって、本明細書に開示する主題の目的は、ＲＮＡを増幅し、望ましい機能に応じて、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であるＲＮＡ分子を得る、新規方法を提供することである。この目的および他の目的が、本明細書に開示する主題によって、完全にまたは部分的に達成される。
【００１６】
本明細書に開示する主題の目的が、上に言及されてきているが、付随する図および以下に記載する実施例と関連付けて解釈すると、説明が進むに連れて、他の主題および側面が明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
詳細な説明
本明細書に開示する主題の実行は、別に記載しない限り、当該技術分野の技術範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技術を使用する。こうした技術は、文献に完全に説明されている。これらの方法は、以下の刊行物に記載される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， 第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ監修（１９９５））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ監修（１９８８））；ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ監修（１９９９））；およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修（１９８７））を参照されたい。
【００１８】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍および感染性疾患の治療に重要な役割を果たす。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、そして細胞表面上に提示する。抗原提示細胞に抗原を搬送する１つの方法は、ＲＮＡトランスフェクションを通じる。ＲＮＡトランスフェクションの方法は、論文に記載されている：Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００およびＧｒｕｎｅｂａｃｈら、２００３。核酸トランスフェクションのさらなる方法が当業者に知られる。
【００１９】
抗原コードＲＮＡは、定義されるＲＮＡ、総ＲＮＡ、または選択される抗原（単数または複数）をコードする増幅されたＲＮＡであることも可能である。ＡＰＣにＲＮＡが装填されたならば、ＲＮＡはＡＰＣ内で翻訳され、そして生じたタンパク質はプロセシングされて、そしてＭＨＣ分子と関連して提示される。これによって、提示されたペプチドに特異的な免疫応答が開始される。
【００２０】
ＲＮＡは、米国特許第５，９６２，２７１号および第５，９６２，２７２号に記載されるＣＡＰスイッチ技術の修飾型または５’端に定義される配列を生じる他の方法いずれかを用いて、増幅可能である。他の方法には、限定されるわけではないが、欧州特許第０ ６２５ ５７２号に記載されるものなど、ＲＮＡの５’端への定義される配列の連結を伴う方法が含まれる。上述の特許は各々、本明細書に援用される。
【００２１】
ＲＮＡを増幅する既知の方法の大部分は、センスおよびアンチセンス両方のＲＮＡ分子を含むＲＮＡ集団を生じる。しかし、先行技術は、こうしたアンチセンスｍＲＮＡが抗原提示細胞のトランスフェクションにおいて有しうる有害な影響を認識していなかった。アンチセンス配向のＰＣＲテンプレートの転写は、センス配向のテンプレートの収量の減少を導く。さらに、アンチセンス種は、センス転写物にアニーリングして、配列特異的二本鎖ＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを導きうる（ＺａｍｏｒｅおよびＡｒｏｎｉｎ、２００３およびＤｙｋｘｈｏｏｒｎら、２００３）。これらの問題を以下に詳細に論じる。
【００２２】
反対配向の転写物は、ｄｓＲＮＡセンス−アンチセンス二重鎖を形成する潜在能力を有する。ｄｓＲＮＡ二重鎖が関与すると考えられる制御現象の数および種類は、迅速に拡大しつつある。例えば、ｄｓＲＮＡは、ベータ細胞機能を阻害し、そして一酸化窒素の産生を刺激することによって、膵島損傷を誘導することが示されてきている（Ｂｌａｉｒら、２００２）。二本鎖ＲＮＡはまた、ワクシニアウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘発することも示されてきている（Ｋｉｂｌｅｒら、１９９７）。ｄｓＲＮＡが誘発する細胞死に関与する中間体に対してはかなりの研究が行われてきているが、二本鎖ＲＮＡによるアポトーシス誘導の機構は完全には性質決定されていない。
【００２３】
ｄｓＲＮＡ二重鎖の潜在的に有害な影響に加えて、アンチセンスＲＮＡは、抗原提示細胞の生存および機能に重要な遺伝子をサイレンシングする際に役割を果たすことも可能である。アンチセンスＲＮＡの存在はまた、細胞において機能するタンパク質の合成に利用可能なテンプレートの量の減少も導く。さらに、アンチセンスＲＮＡの存在は、ＴＬＲ３に活性化されるＲＮＡ依存性プロテインキナーゼによる、細胞中のタンパク質翻訳の配列非依存性阻害を促進可能である。
【００２４】
しかし、上述の影響に加えて、アンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの形のアンチセンスＲＮＡを用いて、生物学的機能を実行することも可能である。この１つの限定されない例は、ＤＣにおけるＴｏｌｌ受容体経路を誘発することによって、成熟刺激を提供することである。
【００２５】
抗原搬送の目的のため、ＡＰＣをトランスフェクションするには、センスＲＮＡ組成物が好ましく、これは、センスＲＮＡがｍＲＮＡにコードされる抗原の翻訳を導くためである。抗原提示細胞のトランスフェクションに前に使用したアンチセンスＲＮＡが、組成物中に存在すると、有害な影響が生じる可能性もある。これらの影響には、限定されるわけではないが、（ａ）細胞において機能するタンパク質の合成用のセンス配向のテンプレートの減少；（ｂ）ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ機構を介した、形質導入された細胞遺伝子の配列特異的サイレンシング、および（ｃ）ＴＬＲ３に活性化されるＲＮＡ依存性プロテインキナーゼに仲介される、細胞におけるタンパク質翻訳の配列非依存性阻害が含まれる。特定のアンチセンスＲＮＡに特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析などの多様な方法を用いて、アンチセンスＲＮＡの存在を検出することも可能である。例えば、ユビキチン・アンチセンスＲＮＡを認識するプローブを用いて、増幅法を評価することも可能である。
【００２６】
一方、特定の状況では、アンチセンス組成物が好ましい。例えば、アンチセンス組成物は、特定の遺伝子をサイレンシングするのに好ましい可能性もある。この場合、センス配向分子を本質的に欠いている組成物を得ることが望ましいであろう。
【００２７】
本明細書に開示する主題は、増幅産物の配向を調節可能な、改善されたＲＮＡ増幅プロセスを提供する。該方法は、本質的に一方向性であるＲＮＡ分子の調製物を生じる。言い換えると、ＲＮＡは、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であり、そして反対方向のＲＮＡ分子、および反対配向のＲＮＡ分子の相補的結合から生じるｄｓＲＮＡを本質的に欠いているであろう。センス配向であり、そしてアンチセンス配向の分子を本質的に欠いている定方向ＲＮＡ調製物を提供する。本明細書に開示するように、アンチセンス不含増幅ＲＮＡは、ｍＲＮＡが由来する元来の細胞、例えば癌細胞に発現される遺伝子の忠実な再現である。さらに、本明細書の実施例において立証するように、アンチセンス不含ＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、ＤＣの回収がより高くなり、これはＤＣに基づく大規模なワクチン製造に重要な意味があり、そして従来知られている方法の改善である。
【００２８】
センス配向分子を本質的に欠いているアンチセンス分子の調製物もまた、提供する。
Ｉ．定義
「増幅」は、プライマーおよび核酸ポリメラーゼを用いた核酸増幅法を指し、ターゲット核酸配列の多数のコピーを生じる。こうした増幅反応は当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｕ．Ｓ．４，６８２，１９５、４，６８３，２０２および４，９６５，１８８を参照されたい）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｕ．Ｓ． ５，３２２，７７０および５，３１０，６５２を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＥＰ ０ ３２０ ３０８を参照されたい）、ＮＡＳＢＡまたはＵ．Ｓ． ５，３９９，４９１に記載されるＴＭＡおよびギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ、Ｕ．Ｓ． ５，４２７，２０２を参照されたい）などの類似の反応が含まれる。核酸ターゲットがＲＮＡである場合、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをまず相補ＤＮＡ鎖にコピーすることも可能である（Ｕ．Ｓ． ５，３２２，７７０および５，３１０，６５２を参照されたい）。
【００２９】
「抗原」は、本明細書において、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する分子を指す。用語「抗原」は、本明細書において、全分子、および抗体またはＴＣＲに結合する全分子の特定の部分（エピトープ）の両方を含む。ＴＣＲは、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ分子と複合体形成した際のペプチド断片のみに結合し、これをＡＰＣによる「抗原提示」と称する。
【００３０】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識可能な抗原−ＭＨＣ複合体の形で、１以上の抗原を提示し、そしてそれによって提示しようとする単数または複数の抗原に対する有効な細胞性免疫応答を誘導することが可能な、細胞クラスを指す。ＡＰＣは、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞、および樹状細胞などの、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）全細胞；あるいは天然存在または合成の他の分子、例えばβ２−ミクログロブリンと複合体形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子であることも可能である。多くの種類の細胞が、Ｔ細胞認識のため、細胞表面上に抗原を提示可能であるが、樹状細胞のみが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のために未刺激（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を活性化するのに十分な量の抗原を提示する能力を有する。
【００３１】
「癌」によって、比較的自律性の増殖を示す細胞の異常な存在を意味し、したがって、癌細胞は、細胞増殖制御の重大な損失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す。癌性細胞は、良性であることもまたは悪性であることも可能である。多様な態様において、癌は、膀胱、血液、脳、乳房、結腸、消化管、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または皮膚の細胞に影響を及ぼす。癌細胞の定義は、本明細書において、原発性癌細胞のみでなく、癌細胞祖先に由来するいかなる細胞も含む。これには、転移癌細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物および癌細胞由来の細胞株が含まれる。癌には、限定されるわけではないが、固形腫瘍、液性腫瘍、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、芽腫などが含まれる。好ましくは、癌細胞は、腎癌細胞、多発性骨髄腫細胞または黒色腫細胞である。
【００３２】
「クローニング」は、本明細書において、本発明の方法にしたがってＲＮＡを増幅することによって作成したｃＤＮＡを、ベクター、たとえばプラスミドベクター内に挿入することを意味する。ベクターは、通常、ベクターを増幅するための複製起点、およびクローニングされた目的のポリヌクレオチド配列を含む。クローニングは、本明細書において、目的のポリヌクレオチド配列の増幅を一般に含まず、そして特に、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を含まない。本明細書に開示する主題の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのクローニングされたテンプレートの使用を除外する。特に、本明細書に開示する主題の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、テンプレートをクローニングする必要を伴わずに、抗原提示細胞のトランスフェクション用の、本質的にセンスであるＲＮＡを提供する手段を提供する。
【００３３】
「樹状細胞（ＤＣ）」は、多様なリンパ系組織および非リンパ系組織に見られる形態学的に類似の細胞種の多様な集団を指す（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１）。樹状細胞は、生物において、最も強力でそして好ましいＡＰＣを構成し、そしてＴ細胞活性化および増殖に必要なシグナルを提供する。樹状細胞は、骨髄前駆細胞由来であり、末梢血中、少数で循環し、そして未成熟ランゲルハンス細胞または最終分化成熟細胞のいずれかとして見られる。樹状細胞はまた、単球から分化することも可能である。樹状細胞は単球から分化することも可能であるが、これらは異なる表現型を所持する。例えば、特定の分化マーカー、ＣＤ１４抗原は、樹状細胞には見られないが、単球には存在する。また、成熟樹状細胞は、食作用を持たないが、単球は非常に食作用性の細胞である。成熟ＤＣがＴ細胞活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供可能であることが示されてきている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の単離法、並びに樹状細胞前駆体および成熟樹状細胞の産生法が当業者に知られる。例えば、本明細書にその内容が援用される、Ｂｅｒｇｅｒら、２００２；米国特許出願２００３０１９９６７３および２００２０１６４３４６；並びにＷＯ ９３／２０１８５を参照されたい。好ましい態様において、その内容が本明細書に援用される、Ｒｏｍａｎｉら、１９９４またはＳａｌｌｕｓｔｏら、１９９４に記載される方法によって、ＣＤ１４＋末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から樹状細胞を調製する。あるいは、Ｃａｕｘら、１９９６の方法によって、ＣＤ３４＋細胞から樹状細胞を調製することも可能である。
【００３４】
「本質的に欠いている」は、センスｍＲＮＡ分子の１０％未満、好ましくは５％、４％、３％、２％、または１％未満の量で、アンチセンスＲＮＡ分子およびｄｓＲＮＡが存在する調製物を指すように用いられる。好ましくは、アンチセンス分子およびｄｓＲＮＡ分子は検出不能である。
【００３５】
「ｍＲＮＡ」は、翻訳可能なＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡは、リボソーム結合性部位および開始コドンを含有するであろう。好ましくは、ｍＲＮＡはまた、５’キャップ、停止コドンおよびポリＡテールも含有するであろう。
【００３６】
「機能可能であるように連結された」および「機能的に連結された」は、本明細書において、交換可能に用いられ、そしてヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域に調節され、そして制御されるような方式で、ヌクレオチド配列に連結されているプロモーター領域を指す。同様に、ヌクレオチド配列は、機能可能であるように連結されたプロモーターの「転写調節」下にあると言う。ヌクレオチド配列にプロモーター領域を機能的に連結するための技術が当該技術分野に知られる。
【００３７】
「病原体」は、疾患の病因に関与するウイルスまたは生物いずれかを指し、そしてまた、その弱毒化派生物も指す。こうした病原体には、限定されるわけではないが、細菌、原生動物、真菌およびウイルス病原体、例えば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）などのヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）などの多様な放線菌、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）などのブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス（例えば１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、コロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス）、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスが含まれる。本発明の方法は、ＨＩＶおよびＨＣＶなどのレトロウイルス病原体に適用した際、特に有用である。
【００３８】
病原体ＲＮＡは、病原体ゲノム（例えばレトロウイルス・ゲノム）または病原体ｍＲＮＡの形であることも可能であり、スプライシングされていることもまたされていないことも可能である。例えば、ＨＩＶの場合、ＨＩＶ ＲＮＡは、ウイルス粒子から単離されたかまたはウイルス複製中に宿主細胞から単離された、ウイルスＲＮＡゲノムの形であることも可能であるし、そしてまたスプライシングされたかまたはされていないＨＩＶ ｍＲＮＡの形であることも可能である。好ましい態様において、病原体ＲＮＡは、ＨＩＶビリオンから単離されたＨＩＶゲノムＲＮＡである。病原体ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生することも可能であり、これが次いで、核酸増幅のテンプレートとして働くことも可能である。
【００３９】
好ましくは、病原体ＲＮＡは、感染個体に存在する多数の病原体種からのものであり、またはこれらに由来する。この文脈において、「由来する」は、核酸が、少なくとも部分的に、病原体、または病原体核酸を含有する細胞（単数または複数）から精製されているか、あるいは核酸が病原体核酸から増幅されていることを意味する。個体に存在する多数の病原体種から核酸を得ることによって、生じるワクチンは、個体に存在する病原体種すべてに対して、潜在的に免疫応答を誘発しうる。
【００４０】
ＩＩ． ｍＲＮＡの増幅法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法
本明細書に開示する主題の代表的な利点は、標準的増幅法に、本明細書に開示する新規方法を一般的に図式的に比較することでわかる。図１Ａにおいて、標準的増幅法に含まれる工程を図式的に例示する。本明細書に開示する主題の新規方法の一例に含まれる工程を図１Ｂに示す。
【００４１】
図１Ａを参照すると、標準的ＲＮＡ増幅は、ＳＭＡＲＴ増幅法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の修飾型であり、方法に用いられる突然変異体ＲＴ（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に特有の特性によって、１つのＲＴ反応で、第一鎖ｃＤＮＡの定義される３’端および５’端が提供される。ｍＲＮＡの５’端に連結されたオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素がｍＲＮＡの５’端に到達した際に、該酵素がテンプレートを切り替え、そして連結されたオリゴヌクレオチドの端を通じて進むように、短い伸長したテンプレートとして働く。したがって、ｃＤＮＡの５’端は、相補定義配列またはＣＤＳと呼ばれる、定義された配列を有する。
【００４２】
図１Ａに示すように、ｃＤＮＡの３’端は、定義される配列（ＣＤＳ）、並びにポリＴ伸長を含有するオリゴを供給することによって、定義される。このオリゴのポリＴ部分は、ｍＲＮＡのポリＡ領域にアニーリングし、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成のアンカーとして働く。この方式で、ｃＤＮＡの３’端はＣＤＳ定義配列を含有する。定義されるオリゴヌクレオチド配列がｃＤＮＡの両端に存在することで、ＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅することが可能になる。ＰＣＲプライマーは以下のように提供される：３’プライマーとしてＴＴＴＴ［ＣＤＳ］、および５’プライマーとしてＴ７［ＣＤＳ］。５’プライマーのＴ７部分はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位であり、該部位はＴ７プロモーターを含むポリヌクレオチド・テンプレートの産生を可能にし、該プロモーターは最終工程でポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ転写を容易にする。図１Ａに示すこの標準的プロトコルでは、元来の３’プライマーおよび５’プライマーは共通の配列を共有し、そしてしたがって、Ｔ７［ＣＤＳ］プライマーは、両端にアニーリング可能である。その結果、Ｔ７［ＣＤＳ］配列を含有するポリヌクレオチド・テンプレート、例えばｃＤＮＡは、両方の配向で合成され、そしてこれは最終的に、両方の配向のＲＮＡの形成を導く。
【００４３】
この増幅法では、望ましい産物はＲＮＡであってＤＮＡではない。したがって、ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列が、ＰＣＲ工程中にポリヌクレオチド・テンプレートの両端に取り込まれる。ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列がポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡの３’端にアニーリングすると、アンチセンスＲＮＡが産生され、そしてＲＮＡポリメラーゼ結合性ドメインがポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡの５’端にアニーリングすると、センスＲＮＡが産生される。したがって、最終産物は、両方向に配向したＲＮＡを含有する。上に論じたように、産物中にセンスおよびアンチセンス両方のＲＮＡが存在すると、ＲＮＡ産物をトランスフェクションした細胞に有害な影響を有しうる、ｄｓＲＮＡの生成が生じうる。
【００４４】
ＲＮＡの配向および方向は、目的の遺伝子をコードするもの（センス配向）またはセンス配向の反対（アンチセンス配向）のいずれかと定義される。
本明細書に開示する主題は、先行技術の方法に勝る、いくつかの利点を提供する。センスＲＮＡのみまたはアンチセンスＲＮＡのみを産生する方法を提供することによって、ｄｓＲＮＡの存在が排除される。本明細書に開示する主題の組成物は、反対配向のＲＮＡを本質的に欠いているため、他の方法によって産生される組成物より優れている。これは、互いに配列相同性を本質的に持たないプライマーを用いることによって達成される。プライマーの一方は、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を挿入する。ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を５’端にまたは３’端に挿入するかに応じて、ｃＤＮＡがＲＮＡに転写される際に、センスＲＮＡのみまたはアンチセンスＲＮＡのみが産生されるであろう。
【００４５】
ＩＩ．Ａ．アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを本質的に欠いているセンス配向ＲＮＡを産生する方法
本明細書に開示する主題の１つの側面において、アンチセンスＲＮＡの形成をブロッキングする。増幅しようとする出発ＲＮＡは、典型的にはポリＡ＋ ＲＮＡであり、該ＲＮＡは慣用法を用いることによって単離可能である（例えばポリｄＴクロマトグラフィーの使用）。細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡはどちらも、一緒にまたは別個に、本明細書に開示する主題において有用である。本明細書に開示する主題においてやはり有用なのは、腫瘍または病原体に特有の、腫瘍または病原体抗原またはエピトープに対応するＲＮＡ、および「ミニ遺伝子」に対応するＲＮＡ（すなわち定義されるエピトープをコードするＲＮＡ配列）である。腫瘍特異的ＲＮＡまたは病原体特異的ＲＮＡは、当該技術分野に一般的に知られるいくつかの方法のいずれかによって、総ＲＮＡ集団から特有の抗原を分離することによって得られうる。１つの限定されない例として、総ＲＮＡ集団から特有のＲＮＡを分離するのに、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法が利用可能である。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に知られる。例えば、本明細書にその内容が援用される、米国特許第５，２５６，５３６号および第６，８００，７３４号、並びにＵｔｔら、１９９５を参照されたい。限定されない例として、癌細胞（例えば腎細胞癌）由来の総ｍＲＮＡを基質として用いて、発現される遺伝子すべてに対応するｃＤＮＡ分子セットを調製することも可能である。ターゲット細胞に特異的でない（またはターゲット細胞で優先的に発現されていない）配列を取り除くため、ｃＤＮＡ調製物を、対応する正常細胞（例えば正常腎組織）のｍＲＮＡと徹底的にハイブリダイズさせる。この工程によって、２つの細胞種に共通の配列すべてが、ｃＤＮＡ調製物から取り除かれる。他のｍＲＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡ配列すべてを廃棄した後、残ったものは、総ｍＲＮＡ集団の選択された分画を含み、そして癌細胞のｍＲＮＡ集団に特有の配列を含有する。
【００４６】
図１Ｂは、本明細書に開示する主題の１つの態様を例示する。この例示ではＴ７ポリメラーゼが用いられるが、ＰＣＲのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したＲＮＡポリメラーゼ、および関連オリゴヌクレオチド中のその対応する結合性部位のいずれもまた、当てはまるであろう。同じ結果を達成するのに、異なるプライマーおよび異なるポリメラーゼが使用可能であることが明らかである。示す方法を修飾して、アンチセンス分子のみを産生することも可能であることもまた、明らかである。本明細書に開示する主題は、１つの配向のＲＮＡを優先的に産生するための一般化されたスキームを含む。
【００４７】
図１Ｂに示す、本明細書開示の新規方法において、アンチセンスＲＮＡの生成がブロッキングされる。これは、５’プライマーに相同性がまったくない、特有の配列を含有するように、元来のポリＴ含有プライマーを再設計することによって達成される。これによって、ポリヌクレオチド・テンプレート、好ましくはｃＤＮＡの形成が導かれ、該テンプレートは、特定のポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼによって転写されることも可能な別個のそして特有の末端を含有する。Ｔ７［ＣＤＳ］プライマーは、５’端のみにアニーリングし、そして３’端にはアニーリングせず、そしてしたがってＴ７プロモーターを含有するアンチセンスｃＤＮＡはまったく合成されない。したがって、アンチセンス配向のＲＮＡ合成が影響を受け、そしてアンチセンス配向のＲＮＡ分子を本質的に欠いているＲＮＡ調製物が合成されるということになる。
【００４８】
上述の方法は、アンチセンスＲＮＡを本質的に欠いているＲＮＡ分子の調製物を生成し、すなわち調製物にはアンチセンスＲＮＡは実質的にまったく存在しない。本明細書に開示する主題の調製物は、他のＲＮＡ調製物よりも抗原提示細胞により毒性でないという好都合な特徴を有する。この調製物をトランスフェクションした抗原提示細胞は、健康な細胞をより高い収量で生じる。理論によって限定されるのではないが、トランスフェクション細胞に対するこの驚くべき影響は、アンチセンス配向またはｄｓＲＮＡの有害な影響が排除されているためである可能性もある。これによって、定量的および定性的両方の意味で増進したトランスフェクション細胞産生を生じる。センスＲＮＡのみをトランスフェクションした細胞は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ両方をトランスフェクションした細胞集団に比較した際、より高い生存度を示し、そして得られる用量数がより多い。ＲＮＡをエレクトロポレーションするＤＣワクチン製造は、比較的高価であるため、得られる用量数が増加していることは、有意な経済的利点を有する。得られる用量数が増加していることはまた、治療される患者の健康上の利点でもある。
【００４９】
ＩＩ．Ｂ．核酸検出法
センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを定量化する多様な方法が知られ、そして限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーションアッセイ（ノーザンブロット分析）およびＰＣＲに基づくハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。
【００５０】
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示される方法にしたがって、多様な溶解酵素または化学的溶液を用いてｍＲＮＡを単離することも可能であるし、あるいは製造者に提供される付随の使用説明書にしたがって、商業的に入手可能な核酸結合性樹脂によってｍＲＮＡを抽出することも可能である。次いで、標準法にしたがって、核酸プローブおよび／またはプライマーを用いて、抽出された核酸試料に含有されるｍＲＮＡを、それぞれ、ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）および／または増幅法によって検出する。
【００５１】
少なくとも１０のヌクレオチドを有し、そして検出しようとする核酸に配列相補性または配列相同性を示す核酸分子を、診断法において、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いることも可能である。当該技術分野において、「完全にマッチした」プローブは、特異的ハイブリダイゼーションに必要でないことが知られている。少数の塩基の置換、欠失または挿入によって達成されるプローブ配列中の小規模な変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般的に２０％もの塩基対ミスマッチ（最適に並列させた場合）が許容されうる。断片全体のサイズ、並びに相補的伸長のサイズは、特定の核酸セグメントの意図される使用または適用に応じるであろう。遺伝子のより小さい断片は、一般的に、ハイブリダイゼーション態様において使用を見出し、この場合、検出しようとする相補配列にしたがって、相補領域の長さは多様であることも可能であり、例えば約１０〜約１００ヌクレオチドの間、または全長であることも可能である。
【００５２】
長さ約１０ヌクレオチドより長い伸長に渡って相補配列を有するヌクレオチド・プローブは、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それによって、得られる特定のハイブリッド分子の特異性を改善するであろう。長さ約２５ヌクレオチドより長い、そしてさらにより好ましくは約５０ヌクレオチドより長い、または望ましい場合、さらに長い、遺伝子相補性伸長を有する核酸分子を設計することも可能である。こうした断片は、例えば、化学的手段により断片を直接合成することによって、本明細書に援用される米国特許第４，６０３，１０２号に記載されるような２つのプライミング・オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲＴＭ技術などの核酸再生技術を適用することによって、または組換え産生のため、選択される配列を組換えベクターに導入することによって、容易に調製可能である。
【００５３】
特定の態様において、ハイブリダイゼーションを検出し、そしてしたがって相補配列を検出するため、標識などの適切な手段と組み合わせて、本明細書に開示する主題の核酸配列を使用することが好都合であろう。非常に多様な適切な指標手段が当該技術分野に知られ、検出可能シグナルを生じることが可能な、蛍光、放射性、酵素性または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンが含まれる。放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼもまた、使用可能である。酵素タグの場合、人間の目でまたは分光光度的に可視である手段を提供して、相補核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するのに使用可能な、比色指標基質が知られる。
【００５４】
異なる「ストリンジェンシー」の条件下で、ハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。該当する条件には、温度、イオン強度、インキュベーション時間、反応混合物中のさらなる溶質、例えばホルムアミドの存在、および洗浄法が含まれる。より高いストリンジェンシーの条件は、より高い温度およびより低いナトリウムイオン濃度などの条件であり、安定なハイブリダイゼーション複合体が形成されるためには、ハイブリダイズする要素間により高い最低相補性を必要とする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は広く知られ、そして当該技術分野に公表されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【００５５】
定量的ＰＣＲまたはハイスループット分析、例えばＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、１９９５に記載されるような遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）を用いて、ｍＲＮＡレベルまたはｍＲＮＡ発現を検出し、そして定量化することも可能である。簡潔には、該方法は、転写物を含有すると推測される細胞または組織試料から多数のｍＲＮＡを単離することを含む。場合によって、遺伝子転写物をｃＤＮＡに変換することも可能である。遺伝子転写物の試料標本を配列特異的分析に供して、そして定量化する。これらの遺伝子転写物配列の存在量を、罹患患者および健康な患者の通常のデータセットを含む参照データベース配列の存在量に比較する。患者は、患者のデータセットが最も密接に相関し、そして本出願に関しては、転写物の差異を含む、疾患（単数または複数）を有する。
【００５６】
特定の側面において、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡの増幅および／または検出用のヌクレオチド・プローブまたはプライマーとして使用することが必要である可能性もある。示差発現されるｍＲＮＡを検出するのに有用なプライマーは、遺伝子またはポリヌクレオチドの匹敵するサイズの相同領域に、少なくとも約８０％同一である。本明細書に開示する主題の目的のため、増幅は、合理的な忠実度で、ターゲット配列を複製可能なプライマー依存性ポリメラーゼを使用する、いかなる方法も意味する。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素などの天然または組換えＤＮＡポリメラーゼによって、増幅を行うことも可能である。
【００５７】
ＰＣＲの一般的な方法がＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９１に解説される。しかし、各適用反応に用いられるＰＣＲ条件は実験的に決定される。いくつかのパラメーターが、反応の成功を左右する。これらの中に、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋ ＡＴＰ濃度、ｐＨ、並びにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。
【００５８】
増幅後、アガロースゲル電気泳動を行った後にエチジウムブロミド染色および紫外線照射で視覚化することによって、生じたＤＮＡ断片を検出することも可能である。増幅されたＤＮＡ断片が、予測されるサイズを有し、予測される制限消化パターンを示し、そして／または正しくクローニングされたＤＮＡ配列にハイブリダイズすることを立証することによって、示差発現される目的の遺伝子が特異的に増幅されたことを確認することも可能である。遺伝子発現を検出する他の方法が当業者に知られる。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／１０３６５号；米国特許第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号；第５，４４５，９３４号；第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号；第５，４４５，９３４号；第５，５７８，８３２号；および第５，６３１，７３４号；およびＴｉｊｓｓｅｎ（監修）、１９９３を参照されたい。
【００５９】
ＩＩＩ． ＡＰＣにトランスフェクションする方法
本明細書に開示する主題は、センス配向ＲＮＡをトランスフェクションしたＡＰＣの組成物を提供する。抗原提示細胞を培養し、そしてトランスフェクションする方法が、一般的に知られる。典型的な方法が、係属中の米国仮特許出願第６０／５２２，５１２号に開示され、該出願の内容は本明細書に援用される。しかし、トランスフェクション法は、本発明に決定的に重要ではない。
【００６０】
ＩＩＩ．Ａ． ＡＰＣの単離および培養
抗原提示細胞を単離し、そして培養する方法が当業者に知られる。限定されない例として、未成熟ＤＣを単離するか、またはＤＣ前駆細胞を含有する適切な組織供給源から調製し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させて、未成熟ＤＣを産生することも可能である。例えば、適切な組織供給源は、骨髄細胞、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、および臍帯血細胞の１以上であることも可能である。１つの態様において、組織供給源は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。組織供給源は新鮮であることもまたは凍結されていることも可能である。別の側面において、非幹細胞または前駆細胞の増殖および分化を促進する有効量の増殖因子で、細胞または組織供給源をあらかじめ処理し、次いで、これらを目的の細胞からより容易に分離する。これらの方法は、当該技術分野に知られ、そしてＲｏｍａｎｉら、１９９４およびＣａｕｘ， Ｃ．ら、１９９６に記載される。
【００６１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）には、限定されるわけではないが、マクロファージ、内皮細胞、Ｂ細胞および樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞およびランゲルハンス細胞が含まれる。プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞両方に対する影響を通じて、細胞仲介性免疫の刺激のための、強力なビヒクルを提供する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、１９９８およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ、２０００）。その機能に本質的であることだが、ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ産物両方の上でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に提示するため、抗原を効率的にプロセシングする。表面抗原濃縮技術を通じて、末梢血または骨髄から単離されるか、あるいはＰＢＭＣの培養物から採取される樹状細胞に、特定の候補抗原を装填することも可能であるし、そして次いで、こうした樹状細胞は、未刺激Ｔ細胞または休止Ｔ細胞に、該当する抗原（単数または複数）を提示することが可能である（Ｈｅｉｓｅｒ、２０００およびＭｉｔｃｈｅｌｌ、２０００）。好ましくは、抗原提示細胞は、ワクチン接種される個体に対して自家性であり、そして病原体または癌細胞ＲＮＡもまた、患者から単離されるかまたは患者に由来する。
【００６２】
ＩＩＩ．Ａ．１． ＰＢＭＣからのＡＰＣの単離
１つの側面において、未成熟ＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好ましい態様において、ＰＢＭＣが未成熟ＤＣに分化するように、インターロイキン４（ＩＬ−４）および／またはＩＬ−１３の存在下または非存在下で、有効量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）でＰＢＭＣを処理する。最も好ましくは、本明細書に開示する主題の方法で使用するのに適した未成熟ＤＣを産生するため、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、ＰＢＭＣをおよそ６日間培養する。
【００６３】
ＩＩＩ．Ａ．２．幹細胞からのＡＰＣの単離
ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大および分化のため、幹細胞を単離する、多くの方法が当該技術分野に知られる。以下の説明は、例示目的のみのためであり、そして本明細書に開示する主題の範囲を制限することをまったく意図しない。
【００６４】
望ましくない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）およびＧＲ−１に結合する抗体で、骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から幹細胞を単離することも可能である。このプロトコルの詳細な説明に関しては、Ｉｎａｂａら、１９９２を参照されたい。
【００６５】
臍帯血、骨髄、および動員化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）末梢血を含む、多様な供給源からヒトＣＤ３４＋細胞を得ることも可能である。抗体親和性法によって、ＣＤ３４＋細胞の精製を達成することも可能である。例えば、Ｐａｃｚｅｓｎｙら、２００４；Ｈｏら、１９９５；Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９９３；およびＹｕら、１９９５を参照されたい。
【００６６】
末梢血中に頻出するが、増殖性でないＣＤ１４＋前駆体（単球）から、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の保護下で、ＤＣを生成することもまた可能である（例えば、ＷＯ ９７／２９１８２を参照されたい）。この方法は、ＳａｌｌｕｓｔｏおよびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９４、並びにＲｏｍａｎｉら、１９９４に記載される。簡潔には、ＣＤ１４＋前駆体は豊富であり、したがって大部分の場合、患者をあらかじめＧ−ＣＳＦ（末梢血において、ＣＤ３４＋細胞およびより拘束された前駆体を増加させるのに用いられる）などのサイトカインで処理することは不要と報告されている。Ｒｏｍａｎｉら、１９９６を参照されたい。他の研究者らは、このアプローチによって生成されるＤＣが、かなり均質であるようであり、そして未成熟状態または完全に分化したかもしくは成熟した状態で産生可能であると報告している。成熟刺激として、自家性単球馴化培地を用いることによって、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）などの非ヒトタンパク質を回避し、そして完全に、そして不可逆的に成熟しそして安定なＤＣを得ることが可能であることが示された。Ｒｏｍａｎｉら、１９９６；Ｂｅｎｄｅｒら、１９９６。しかし、本明細書に開示する主題とは対照的に、これらの研究は、ＩＬ−１２レベルが増加し、そして／またはＩＬ−１０レベルが減少した成熟ＤＣを生じなかった。
【００６７】
適切なサイトカインと細胞をインキュベーションすることによって、幹細胞を樹状細胞に分化させることも可能である。Ｉｎａｂａら、１９９４は、ネズミＧＭ−ＣＳＦと幹細胞をインキュベーションすることによって、ネズミ幹細胞が樹状細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ分化することを記載した。簡潔には、標準ＲＰＭＩ増殖培地中、１〜２００ｎｇ／ｍｌのネズミＧＭ−ＣＳＦ、そして好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと単離幹細胞をインキュベーションする。ほぼ１日おきに１回、培地を新鮮な培地と交換する。培養７日後、表面マーカーの発現および形態によって評価すると、大部分の細胞が樹状細胞である。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、または他の標準法によって、樹状細胞を単離する。
【００６８】
ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞から、未成熟樹状細胞を調製することも可能である。骨髄細胞、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、および臍帯血細胞からなる群より選択される組織供給源から、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を単離することも可能である。ヒト細胞ＣＤ３４＋造血幹細胞は、好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αと細胞を培養することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化される。例えばＳｚａｂｏｌｃｓら、１９９５を参照されたい。
【００６９】
マウスＤＣに関しては、培養中の幹細胞をネズミＧＭ−ＣＳＦとインキュベーションすることによって、ネズミ幹細胞を樹状細胞に分化させることも可能である。典型的には、培養中のＧＭ−ＣＳＦ濃度は、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌであり、そして好ましくは少なくとも約１ｎｇ／ｍｌである。しばしば、範囲は約２０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの間であろう。多くの好ましい態様において、用量は、約１００ｎｇ／ｍｌであろう。場合によって、ネズミＤＣを作成するため、類似の範囲でＩＬ−４を添加する。
【００７０】
ヒト細胞に形質導入する場合、ヒトＧＭ−ＣＳＦを類似の範囲で用い、そして分化を促進するため、ＴＮＦ−αもまた添加する。ＴＮＦ−αもまた、典型的には、ほぼ同じ範囲で添加される。場合によって、ＳＣＦまたは他の増殖リガンド（例えばＦｌｔ３）を類似の用量範囲で添加して、ヒトＤＣを作成する。
【００７１】
当業者には明らかであろうように、幹細胞を分化させるための上述の用量範囲はすべて、およそのものである。異なる供給者のサイトカイン、および同じ供給者由来の異なるロットのサイトカインでは、サイトカイン活性が変化する。当業者は、各サイトカインを容易に滴定可能であり、これを用いて、特定のサイトカインいずれかに関する最適用量を決定する。
【００７２】
ＩＩＩ．Ｂ． ＡＰＣのトランスフェクション
本明細書に開示する主題の新規方法を用いて、提示されるペプチドに対する免疫応答を誘導するかまたは調節することが望ましい、多様な療法適用のため、ＲＮＡをトランスフェクションした抗原提示細胞を提供することも可能である。本明細書に開示する主題の１つの態様において、腫瘍細胞由来のセンス配向ＲＮＡの調製物を用いて、抗原提示細胞にトランスフェクションして、癌免疫療法として有用な細胞組成物を提供する。本明細書に開示する主題の別の態様において、１以上の病原体由来のセンス配向ＲＮＡの調製物を用いて、細胞にトランスフェクションし、そして感染性疾患の治療および／または予防に有用な組成物を提供することも可能である。さらに、本明細書に開示する主題の別の態様において、免疫寛容誘発ペプチドをコードする、センス配向ＲＮＡもまた、自己免疫疾患の治療に有用なＡＰＣの調製物に使用可能である。
【００７３】
抗原提示細胞にトランスフェクションする方法は、当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、受動的取り込み、リポフェクション、陽イオン性試薬、ウイルス形質導入、ＣａＰＯ４、ナノ粒子仲介性トランスフェクション、ペプチド仲介性トランスフェクション等が含まれる。例えば、ペプチド仲介性トランスフェクションのための方法が、米国特許出願第２００３０１２５２４２号および第２００３００８７８１０号に開示され、該出願の内容が本明細書に援用される。ペプチド仲介性トランスフェクションの他の方法が当業者に知られる。好ましくは、ペプチドは陽イオン性ペプチドである。ナノ粒子仲介性トランスフェクションのための方法もまた、当業者に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、米国特許出願第２００４００３８４０６号を参照されたい。トランスフェクション法は、本明細書に開示する主題に決定的に重要ではなく、そしてしたがって、方法の先行するリストは例示であることを意図され、そして本明細書に開示する主題の範囲を限定することはまったく意図されない。
【００７４】
成熟または未成熟の場合、樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで装填し、そして次いで、ワクチン接種前にｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはワクチン接種後にｉｎ ｖｉｖｏで、成熟させることも可能である。あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕで核酸を抗原提示細胞に搬送することも可能である。ｉｎ ｓｉｔｕトランスフェクションの方法は当業者に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、米国特許出願第２００４００８２５３０号および第２００３００３２６１５号、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０１／２３５３７号、米国特許第６，６０３，９９８号、Ｈｏｅｒｒら、２０００、Ｌｉｕら、２００２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｓら、２００３；およびＯ’Ｈａｇｅｎ、２００１を参照されたい。
【００７５】
好ましくは、トランスフェクションされるＡＰＣは、樹状細胞またはマクロファージなどのプロフェッショナルＡＰＣである。あるいは、人工的に生成されたＡＰＣを使用することも可能である。慣用法を用いて、ＡＰＣにセンスＲＮＡをトランスフェクションすることも可能である。例えば、ＡＰＣを、陽イオン性脂質の存在下で、腫瘍由来ＲＮＡと接触させることも可能である。他の既知のトランスフェクション法を用いて、ＡＰＣにＲＮＡを導入することもまた可能である。米国特許第６，３０６，３８８号は、ＲＮＡをＡＰＣにトランスフェクションする方法を開示する。増幅法の出発材料として、本質的にいかなる種類の癌細胞または病原体由来のＲＮＡを用いることも可能である。他の状況では、免疫寛容誘発タンパク質をコードするＲＮＡを増幅することが望ましい可能性もある。
【００７６】
ＩＶ． ｉｎ ｖｉｖｏ療法
本明細書に開示する主題の方法によって産生されたＴ細胞または樹状細胞を、被験者に直接投与して、選択される免疫原に対して活性であるＴ細胞を産生することも可能である。投与は、被験者の血液または組織細胞と最終的に接触するように、成功裡に細胞を搬送する、当該技術分野に知られる方法によることも可能である。
【００７７】
薬学的に許容しうるキャリアーとしばしば一緒に、適切な方式いずれかで、細胞を投与する。本明細書に開示する主題と関連する細胞を被験者に投与する、適切な方法が利用可能であり、そして特定の細胞組成物を投与するのに、１より多い経路を用いることも可能であるが、特定の経路が、別の経路よりも、しばしばより迅速で、そしてより有効な反応を提供することも可能である。
【００７８】
薬学的に許容しうるキャリアーは、部分的に、投与される特定の組成物によって、そして組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって、決定される。したがって、本明細書に開示する主題の薬剤組成物に適した、非常に多様な配合物がある。最も典型的には、品質管理（微生物学、クローン形成アッセイ、生存度試験）を行い、そしてジフェンヒドラミンおよびヒドロコルチゾンの投与を先に行って、細胞を被験者に再注入する。例えば、Ｋｏｒｂｌｉｎｇら、１９８６およびＨａａｓら、１９９０を参照されたい。
【００７９】
関節内（関節の中）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路による投与などの非経口投与に適した配合物、並びにキャリアーには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの血液と配合物を等張にする溶質を含有することも可能な、水性等張性無菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことも可能な、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。静脈内投与または腹腔内投与が、本明細書に開示する主題の樹状細胞またはＴ細胞の投与の好ましい方法である。
【００８０】
被験者に投与する細胞（例えば活性化Ｔ細胞または樹状細胞）の用量は、有効量であり、時間とともに、被験者において望ましい有益な療法応答を達成するか、または癌細胞の増殖を阻害するか、または感染を阻害するのに有効である。
【００８１】
例示目的のみのため、後で分析し、そして比較するため、注入前に被験者から血液試料を得て、そして取り置くことによって、方法を実施することも可能である。一般的に、少なくとも約１０４〜１０６、そして典型的には１ｘ１０８〜１ｘ１０１０の細胞を、おおよそ６０〜１２０分に渡って、７０ｋｇの患者に静脈内注入するか、または腹腔内注入する。１つの側面において、投与は静脈内注入による。生命徴候を、そしてパルス酸素濃度計によって酸素飽和を、綿密に監視する。注入５分後および１時間後に血液試料を得て、そして分析のために取り置く。１年の期間中、総数１０〜１２回の処置で、おおよそ毎月、細胞再注入を反復する。最初の処置後、臨床医の自由裁量で、外来診療に基づいて、注入を行うことも可能である。再注入が外来診療で行われる場合、療法後、少なくとも４時間、被験者を監視する。
【００８２】
被験者の全体の健康状態に適用する際に、投与のため、本明細書に開示する主題の細胞を、細胞種のＬＤ−５０（または毒性の他の測定値）、および多様な濃度の細胞種の副作用によって決定した速度で、投与することも可能である。投与は単回用量または分割用量を介して達成可能である。本明細書に開示する主題の細胞は、細胞傷害性剤、ヌクレオチド類似体および生物学的応答修飾剤を含む、既知の慣用療法によって、状態の他の治療を補足することも可能である。同様に、場合によって、生物学的応答修飾剤が、本明細書に開示する主題のＤＣまたは活性化Ｔ細胞による治療に付加される。例えば、場合によって、アジュバント、あるいはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２またはＩＬ−２などのサイトカインと一緒に、細胞を投与する。
【００８３】
Ｖ．免疫原性を評価する方法
本明細書に開示する主題の方法によって産生された、抗原提示細胞または抗原に感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）Ｔ細胞の免疫原性を、周知の方法論によって決定することも可能であり、こうした方法論には、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：
５１Ｃｒ放出溶解アッセイ。抗原特異的Ｔ細胞によってペプチドパルス処理した５１Ｃｒ標識ターゲットの溶解を比較することも可能である。「より活性である」組成物は、時間の関数としてターゲットのより多い溶解を示すであろう。溶解の動力学、並びに固定した時点（例えば４時間）での全体のターゲット溶解を用いて、性能を評価することも可能である。Ｗａｒｅら、１９８３。
【００８４】
サイトカイン放出アッセイ。修飾ＡＰＣと接触させた際、Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインの種類および量の分析は、機能活性の測定値であることも可能である。サイトカインを、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定して、サイトカイン産生の速度および総量を決定することも可能である。Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら、１９９３；ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ、１９９４。
【００８５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞感作。正常ドナーまたは患者由来のＰＢＭＣから、反応性Ｔ細胞集団を誘発する能力に関して、本明細書に開示する主題の組成物をアッセイすることも可能である。この系では、溶解活性、サイトカイン放出、ポリクローナル性および抗原性エピトープに対する交差反応性に関して、誘発されたＴ細胞を試験することも可能である。Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、１９９６。
【００８６】
トランスジェニック動物モデル。本明細書に開示する主題の組成物を、ＨＬＡトランスジェニックマウスにワクチン接種し、そして誘導される免疫応答の性質および度合いを決定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性を評価することも可能である。あるいは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの養子移植によって、マウスにおいてヒト免疫系の再構築を可能にする。Ｓｈｉｒａｉら、１９９５；Ｍｏｓｉｅｒら、１９９３に先に言及されたように、これらの動物に、組成物をワクチン接種し、そして免疫応答に関して分析することも可能である。
【００８７】
増殖アッセイ。Ｔ細胞は、反応性組成物に応答して増殖するであろう。例えば３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって、増殖を定量的に監視することも可能である。Ｃａｒｕｓｏら、１９９７。
【００８８】
霊長類モデル。非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系を利用して、ＨＬＡ制限リガンドのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を監視することも可能である。チンパンジーは、ヒトＭＨＣ分子と重複するＭＨＣ−リガンド特異性を共有し、したがって相対的ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性に関して、ＨＬＡ制限リガンドを試験することが可能であることが立証されている。Ｂｅｒｔｏｎｉら、１９９８。
【００８９】
ＴＣＲシグナル伝達事象の監視。いくつかの細胞内シグナル伝達事象（例えばリン酸化）は、ＭＨＣ−リガンド複合体によるＴＣＲ結合の成功と関連する。これらの事象の定性的分析および定量的分析は、組成物がＴＣＲ結合を通じてエフェクター細胞を活性化する相対的能力と相互に関連付けられてきている。Ｓａｌａｚａｒら、２０００；Ｉｓａｋｏｖら、１９９５。
【００９０】
ＶＩ．ワクチンおよび使用法
本明細書に開示する主題は、上述の装填された抗原提示細胞を含むワクチン組成物をさらに提供する。こうしたワクチンにおいて、装填された抗原提示細胞は、被験者への療法投与に適した緩衝液中にあるであろう。ワクチンは、抗原提示細胞またはＴ細胞を刺激する因子のためのアジュバントをさらに含むことも可能である。薬剤組成物を配合する方法が当業者に知られる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅの最新版を参照されたい。
【００９１】
樹状細胞ワクチンに最適な免疫間隔を当業者が決定することも可能である。好ましい態様において、被験者は、用量あたり１ｘ１０６〜１ｘ１０７の間の、ＲＮＡが装填された生存ＤＣを５回ワクチン接種されるであろう。ワクチン接種のために選択される用量レベルは安全であり、そしてよく許容されることが期待される。
【００９２】
抗原提示細胞を単離し、調製し、トランスフェクションし、配合し、そして患者に投与する方法が当該技術分野に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、Ｆａｙら、２０００；Ｆｏｎｇら、２００１；Ｒｉｂａｓら、２００１；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒｅｔら、２００２；およびＳｔｉｆｔら、２００３を参照されたい。
【００９３】
ＡＰＣ投与を臨床的に使用する経路には、限定されるわけではないが、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、皮内（ＩＤ）、およびリンパ内が含まれる。ＩＶ、ＳＣ、およびＩＤ投薬後に、客観的な臨床応答が報告されてきている。真皮が樹状細胞の通常の常在部位であり、そこから樹状細胞が排出リンパ節に遊走することが知られるため、現在、ＩＤ投与の優先傾向が発展してきている。ネズミモデルにおいて、ＳＣ注入樹状細胞は、後に、排出リンパ節のＴ細胞領域に見られ、そしてＩＶ免疫後より優れた防御性抗腫瘍免疫を誘発する。防御性抗腫瘍免疫または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成する際、リンパ節に樹状細胞を直接注入する経路が、他の搬送経路より優れているというネズミでの証拠がある（その内容が本明細書に援用される、Ｌａｍｂｅｒｔら、２００１）。これによって、単一の排出リンパ節または流域に影響を及ぼすように（出来るだけ多くのリンパ節に関与する多数の部位に用量を分割するのではなく）、すべての樹状細胞用量を搬送しなければならないことが示唆される。
【００９４】
ワクチンの免疫原性を評価するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の成熟プロフィールを追うことによって、ワクチン接種した個体の免疫応答を監視することも可能である。例えば、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４５ ＲＡ＋ ＣＣＲ７−の表現型を発現し、そして上昇したレベルのγ−ＩＦＮおよびグランザイムＢを分泌する細胞の存在によって、癌細胞特異的または病原体特異的エフェクター細胞機能を決定することも可能である。ＨＩＶ−ＲＮＡ回復ＨＩＶ特異的記憶Ｔ細胞区画をトランスフェクションした樹状細胞で刺激した後、細胞がＩＬ−２を産生し、そしてＣＦＳＥ低となる能力によって、ＨＩＶ特異的増殖応答の回復を決定することも可能である。
【００９５】
フローサイトメトリーアッセイを用い、表面マーカーおよび細胞内マーカーを用いて、ワクチンに誘導される特異的Ｔ細胞の成熟を測定することも可能である。ＴＣＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ１０７を含む表面マーカー、あるいはグランザイムβまたはγ−ＩＦＮなどの細胞内分子を染色することによって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が監視されるであろう。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＣＲ７およびＩＬ−２は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を監視するのに使用可能である。患者由来の自家性ＨＩＶ配列を含むペプチドとインキュベーションした後、こうしたアッセイを用いて、免疫応答を監視することも可能である。ベースライン、および各回の新規ワクチン接種前の毎月の細胞性免疫応答を比較することによって、細胞性免疫応答の大きさに対するワクチンの影響を決定することが可能になる。免疫応答の大きさはまた、ＣＦＳＥ増殖アッセイを用いても測定可能である。
【００９６】
ＶＩＩ．さらなる適用
本明細書に開示する主題は、抗原提示細胞への抗原搬送に限定されない。本明細書に開示する主題を、いかなる細胞株または組織細胞への定義されるターゲットの搬送に適用することも可能である。本明細書に開示する主題のＲＮＡを用いて他の細胞種をトランスフェクションして、細胞において機能するタンパク質を合成するテンプレートを提供することもまた可能である。
【００９７】
１つの配向を優先的に増幅することが望ましい、増幅したＲＮＡまたはｃＤＮＡの使用に基づくいかなるプロセスも、本明細書に開示する新規方法から利益を得るであろう。
ターゲットが特定の供給源からＰＣＲ増幅される場合、本明細書に開示する主題を、定義される抗原ターゲットの産生に適用することもまた可能である。
【００９８】
本明細書に開示する主題の方法、ＲＮＡ調製物および細胞組成物は、先行技術に勝る重大な利点を提供する。本明細書に開示する主題は、定性的に優れたＲＮＡ調製物の産生のための非常に効率的な方法、および細胞組成物におけるその使用を提供する。
【００９９】
方法論は、センスＲＮＡの優先的な増幅に関して、より十分に、詳細に記載されてきているが、同じ概念を他方の配向に適用して、アンチセンスＲＮＡを優先的に増幅することも可能であることが明らかである。アンチセンスＲＮＡでのトランスフェクションもまた、多くの療法目的および研究目的を有する。
【０１００】
上記開示は、一般的に、本明細書に開示する主題を説明する。以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解が得られうる。これらの実施例は、単に、例示の目的のためにのみ記載され、そして本明細書に開示する主題の範囲を限定することを意図しない。状況によって、好都合であると示唆されるかまたは好都合とされうるため、形の変化および同等物での置換が意図される。本明細書において、特定の用語が使用されているが、こうした用語は説明の意味で意図され、そして限定目的には意図されない。
【実施例】
【０１０１】
実施例
（実施例１）
慣用的オリゴヌクレオチドに比較した、新規オリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ増幅
Ａ． ＲＮＡ増幅に用いるオリゴヌクレオチド
【０１０２】
【化１】
【０１０３】
Ｂ． ＲＮＡ増幅
１μＭキャップスイッチ・プライマー、１μＭのＣＤＳ６４ＴまたはＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴプライマー、１μｌ ＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ逆転写酵素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）、１ｘ第一鎖合成緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴを含有する１０μｌ逆転写酵素反応中、ＳＫＭｅｌ２８細胞株または腎細胞癌腫腫瘍標本由来の総ＲＮＡ １マイクログラムを用いた。反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。
【０１０４】
次いで、０．４μＭ ｆ Ｔ７キャップスイッチおよびＣＤＳ６４ＴまたはＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴプライマー、０．４μＭ ｄＮＴＰ、１ｘＫｌｅｎ Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液および１μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋｌｅｎ Ｔａｑポリメラーゼ混合物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物中に２μｌのＲＴ産物を希釈した。２０周期の９５℃５秒間、６５℃５秒間、６８℃６分間にしたがって、増幅を達成した。ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、米国カリフォルニア州バレンシア）を用いて、増幅されたｃＤＮＡを精製した。製造者の使用説明書にしたがって、Ｔ７ ＭＭＡＣＨＩＮＥ ＭＭＥＳＳＡＧＥ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、３μｇの各ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で転写した。ＲＮＡ清浄化のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙミニカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、最後のＲＮＡを精製した。
【０１０５】
（実施例２）
慣用的オリゴヌクレオチドを用いて増幅したＲＮＡ集団におけるアンチセンスＲＮＡの存在の決定
Ａ．ノーザンブロット分析
１．２％変性アガロースゲル上でＲＮＡを分離し、そして１０ｘＳＳＣ中のキャピラリー・トランスファーを用いて、ナイロン膜にトランスファーした。一晩トランスファーした後、ＲＮＡを膜に架橋した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）中、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温の低ストリンジェンシー洗浄、および１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃の高ストリンジェンシー洗浄で、膜を洗浄し、そしてＰｈｏｈｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露した。
【０１０６】
ヒト・ユビキチンｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２６８８０のユビキチンＮＣＢＩ ｍＲＮＡ配列に相補的であるように、センス方向およびアンチセンス方向のＲＮＡを検出するのに用いる一本鎖プローブを設計した。
【０１０７】
【化２】
【０１０８】
製造者の使用説明書を用い、Ｄｅｋａ Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、すべての二本鎖プローブの標識を行った。ＫＩＮＡＳＥＭＡＸＴＭ末端標識キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、すべての一本鎖プローブの標識を行った。
【０１０９】
Ｂ．結果
図１Ａは、慣用的オリゴヌクレオチドを用いてアンチセンスＲＮＡを生じる機構の略図を提供する。アンチセンス配向で転写されるＲＮＡが、慣用的プライマーを用いて増幅したＲＮＡ集団に存在するかどうかを実験的に決定するため、センス配向およびアンチセンス配向のユビキチンＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、ノーザンブロット分析を行った（図２）。ユビキチンｍＲＮＡのヌクレオチド１６９１−１９５３に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブは、ユビキチンｍＲＮＡアイソフォームに対応する総ＲＮＡ集団において、２．３ｋｂおよび１．３ｋｂのバンドを認識する。
【０１１０】
より高い強度であるが、増幅したＲＮＡ集団においてもまた、２つのユビキチン転写物が検出される。ノーザンブロット分析に、等量（１０μｇ）の総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡを用いたため、増幅した集団において、ユビキチンｍＲＮＡに関するより高いシグナル強度が得られたことから、増幅したＲＮＡの試料ＲＮＡには、質量あたり、より高いレベルの転写物が存在することが示される。これは、増幅法がポリアデニル化ｍＲＮＡ種を濃縮し、そして総ＲＮＡの３〜５％のみがポリＡ＋ ＲＮＡで構成されるためである。アンチセンス転写物に相補的なユビキチン・プローブを用いて行ったノーザンブロット分析によって、増幅したＲＮＡ集団にアンチセンス・ユビキチン転写物が存在することが明らかになる。予期されるように、アンチセンス配向のユビキチン転写物は、総ＲＮＡ集団には見られない（図２、右のパネル、Ｔ）。
【０１１１】
（実施例３）
アンチセンスＲＮＡの合成をブロッキングするための新規オリゴヌクレオチド配列の利用
Ａ．ノーザンブロット分析
実施例２におけるように、１．２％変性アガロースゲル上でＲＮＡを分離し、そして１０ｘＳＳＣ中のキャピラリー・トランスファーを用いて、ナイロン膜にトランスファーした。一晩トランスファーした後、ＲＮＡを膜に架橋した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）中、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温の低ストリンジェンシー洗浄、および１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃の高ストリンジェンシー洗浄で、膜を洗浄し、そしてＰｈｏｈｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露した。
【０１１２】
ヒト・ユビキチンｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２６８８０のユビキチンＮＣＢＩ ｍＲＮＡ配列に相補的であるように、センス方向およびアンチセンス方向のＲＮＡを検出するのに用いる一本鎖プローブを設計した。
【０１１３】
【化３】
【０１１４】
製造者の使用説明書を用い、Ｄｅｋａ Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、すべての二本鎖プローブの標識を行った。ＫＩＮＡＳＥＭＡＸＴＭ末端標識キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、すべての一本鎖プローブの標識を行った。
【０１１５】
Ｂ．結果
図１Ａに示し、そして実施例２で立証するように、全長転写物の３’端および５’端を定義するのに用いる慣用的プライマー中の重複オリゴヌクレオチド配列によって、ＰＣＲ中にＴ７プライマーがアニーリングすることが可能になる。新規プライマーＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴにおいて、６４Ｔ含有オリゴヌクレオチドの配列を変化させて、配列の５’端を定義するのに用いるオリゴヌクレオチドに対する相同性を除去すると、Ｔ７キャップスイッチ・プライマーのアニーリングが妨げられる。これは、最終的に、アンチセンス配向のユビキチンの転写を妨げる。キャップスイッチ・プライマーに対する相同性を排除するため、ポリＴ含有オリゴヌクレオチド（ＣＤＳ６４Ｔ）を再設計した。続いて、ＲＮＡ増幅のため、新規プライマー（ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ）を用いた。
【０１１６】
ＣＤＳ ６４ＴおよびＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡを、ノーザンブロット分析によって分析した。アンチセンスＲＮＡの存在が、特定の細胞株由来のＲＮＡ増幅法のアーティファクトである可能性を排除するため、腎細胞癌腫腫瘍標本由来の総ＲＮＡに対してもまた増幅プロトコルを実行した（図３）。
【０１１７】
ノーザンブロット分析によって、６４Ｔ含有オリゴヌクレオチドを再設計すると、細胞株および腫瘍材料から単離したＲＮＡのどちらにおいても、アンチセンス・ユビキチンＲＮＡ合成の完全なブロッキングが生じることが示される。表１に示すように、どちらのオリゴヌクレオチドを用いた増幅法で得られた増幅ＲＮＡの収量も同様であった。
【０１１８】
表１
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
（実施例４）
アンチセンスＲＮＡを含有する集団中の二本鎖ＲＮＡの検出
Ａ．リボヌクレアーゼ保護実験
ＲＰＡ ＩＩＩＴＭリボヌクレアーゼ保護アッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行い、増幅したＲＮＡ中に二本鎖種が存在するかどうかを決定した。該実験において、９０μｇの６４Ｔ＋オリゴまたはＣＤＳ６４Ｔで増幅したＲＮＡを分析した。３つの実験条件を用いて、各ＲＮＡを分析した：１）未処理（対照）、２）ＲＮアーゼＴ１消化のみ、および３）ＲＮアーゼＴ１後、ＲＮアーゼＩＩＩ消化。
【０１２１】
ＲＰＡのため、３０μｇのＲＮＡをエタノール沈殿し、１０μｌのＲＰＡ ＩＩＩハイブリダイゼーション緩衝液中で再構成し、そして５６℃で慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴヌクレオチド・プライマーと一晩インキュベーションして、相補ＲＮＡ鎖のアニーリングを可能にした。インキュベーション後、１５０μｌのＲＮアーゼＴ１消化緩衝液および８ＵのＲＮアーゼＴ１酵素を試料に添加して、そして３７℃で１時間インキュベーションした。エタノール沈殿を反復した。
【０１２２】
ＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化する試料を、１０μｌのＲＮアーゼＩＩＩ消化緩衝液および１５Ｕの酵素中に再懸濁した。３７℃で１時間インキュベーションした後、試料をエタノール沈殿した。対照試料は、いずれかのヌクレアーゼの代わりに、ヌクレアーゼ不含水を含有した。エタノール沈殿後、すべての試料を２０μｌのヌクレアーゼ不含水中で再構成し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）上でＲＮＡ ６０００ナノチップを用いて、各試料１μｌを分析した。
【０１２３】
Ｂ．結果
アンチセンスＲＮＡが存在することによって生じる懸念の１つは、アンチセンスＲＮＡがコード対応物にアニーリングして、二本鎖ＲＮＡを生じうることである。これは、続いて、有害な影響、例えばｓｉＲＮＡが仲介する機構を介した配列依存性サイレンシングを導きうる。慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＲＮＡ集団が、二本鎖ＲＮＡ種を含有するかどうかを調べるため、ＲＮアーゼ保護実験を行った。
【０１２４】
慣用的（ＣＤＳ ６４Ｔ）または新規（ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴ）ポリＴ含有オリゴヌクレオチドのいずれかを用いて増幅したＲＮＡ集団をまず、一本鎖ＲＮＡに特異的なＲＮアーゼＴ１で消化し、そして次いで、二本鎖ＲＮＡ種に特異的なＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化した（図４）。
【０１２５】
増幅されたＲＮＡは、スメアとして移動し、分子量分布は２００ｂｐ〜６ｋｂの間であり、強度ピークは１．５ｋｂ前後であった（図４、未消化の曲線）。この分子量分布は、典型的なｍＲＮＡ集団に特徴的である。これはまた、増幅プロセス中に、ポリアデニル化ｍＲＮＡ集団のみが濃縮されるという主張とも一致する。一本鎖特異的ＲＮアーゼ（Ｔ１）で消化した後、ＣＤＳ ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡ集団において、約４００ｂｐの単一ピークが検出される（図４、右のパネル）。物質は、一本鎖ＲＮアーゼによる切断から保護されていたため、二本鎖ＲＮＡ種で構成されている可能性が最も高い。
【０１２６】
保護された集団の二本鎖ＲＮＡの性質を確認するため、ＲＮＡを二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化し、そしてピークは完全に消滅した（図４、左のパネル）。これによって、４００ｂｐの物質は二本鎖ＲＮＡで構成されていることがさらに示唆される。
【０１２７】
注目すべきことに、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅した集団では、一本鎖特異的ＲＮアーゼＴ１で消化した後、保護されるＲＮＡピークがまったくなかったことから（図４、右のパネル）、増幅された集団が、二本鎖ＲＮＡ種をまったく含有しないことが示唆される。
【０１２８】
（実施例５）
増幅したＲＮＡの品質および忠実度の試験
Ａ．マイクロアレイ分析
ＳＫ Ｍｅｌ ２８細胞株由来の総ＲＮＡ、各１０μｇの４アリコット、および増幅したＲＮＡ各２μｇの４アリコットを、この研究に用いた。第一鎖ｃＤＮＡ合成後、シアニン３または５（Ｃｙ３／Ｃｙ５）蛍光分子いずれかにアミノアリル基をカップリングすることによって、アミノアリル標識ヌクレオチドでの間接的標識を用いて、総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡの２アリコットを、各々標識した。それぞれ、Ｃｙ５およびＣｙ３を用いた間接的標識プロトコルを用いて、総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡの残りのアリコットを標識して、色素交換実験を行った。製造者の使用説明書にしたがって、標識ｃＤＮＡをＡｇｉｌｅｎｔヒトゲノムＩＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）にハイブリダイズさせた。
【０１２９】
マイクロアレイ１および２を、Ｃｙ３で標識した総ＲＮＡおよびＣｙ５で標識した増幅ＲＮＡとハイブリダイズさせる、４つの反復実験を行った。マイクロアレイ３および４を、Ｃｙ５で標識した総ＲＮＡおよびＣｙ３で標識した増幅ＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【０１３０】
Ａｘｏｎスキャナーを用いて、マイクロアレイ画像を収集した。インターネット上、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．で入手可能な、ＴＩＧＲ ＴＭ４一式を用いて、データ分析を行った。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、米国カリフォルニア州レッドウッドシティ）を用いて、さらなる分析を行った。
【０１３１】
Ｂ．結果
実施例１に記載する増幅プロトコルを用いて増幅したＲＮＡの品質および忠実度の最初の実験を、マイクロアレイ技術を用いて行った。実験データの品質を評価するため、２つの最初の分析：クラスターおよび色素交換を行った。
【０１３２】
マイクロアレイをグループ分けするため、階層的クラスター形成を用いた。実験誤差が存在しなければ、反復実験（すなわちマイクロアレイ）は、一緒にクラスター形成するであろう。４つのマイクロアレイからの結果は、同一標識ＲＮＡ集団で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）マイクロアレイが一緒にクラスター形成することを示した。マイクロアレイ１および２は一緒にクラスター形成し、そしてマイクロアレイ３および４は一緒にクラスター形成した。
【０１３３】
マイクロアレイデータおよびＲＮＡの品質に関する第二の試験は、ｃＤＮＡを標識するのに用いるシアニン色素を「交換」することである。実験誤差または標識偏向（すなわち、ｃＤＮＡの一方の集団が、色素の一方で優先的に標識されること）が存在しなければ、標識ＲＮＡを比較した際に、直接の相関関係がある。図５は、色素交換比較を示す。遺伝子は堅固にグループ分けされ、そして直接の相関関係を示す。Ａｇｉｌｅｎｔヒト１Ａアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）は、〜２２，５７５のターゲット遺伝子を含有し、このうち１５，７４２が一方のＲＮＡ集団で検出され、そして１５，５９９がもう一方で検出された。ヒト１Ａマイクロアレイが、ＳＫ Ｍｅｌ ２８細胞で発現されないいくつかの遺伝子ターゲットを含有するため、どちらの集団も２２，５７５遺伝子のすべてにはハイブリダイズしないと予期される。
【０１３４】
（実施例６）
アンチセンス対応物を含有しないＲＮＡをトランスフェクションした細胞の収量および回収の分析
Ａ． ＤＣ培養物の生成およびＲＮＡでのエレクトロポレーション
健康な志願者からの白血球搬出物を、Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ（米国テネシー州メンフィス）によるＡｕｔｏＰＢＳＣ法を用いて、ＣＯＢＥ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＡＴＭ（Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ、米国コロラド州レイクウッド）上に収集した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）−１００７ ＨＹＢＲＩ−ＭＡＸ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて、フェレーシスから末梢血単核細胞を単離し、そして単球接着のため、１〜２時間培養した。非接着細胞を取り除き、そして１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）液、Ｂｅｒｌｅｘ、米国ニュージャージー州モントビル）およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）各々を補ったＸ−ＶＩＶＯ １５ＴＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ、米国ニュージャージー州イーストラザフォード）培地中で残った単球を６〜７日間培養した。
【０１３５】
生じた単球由来樹状細胞を採取し、ＡＯ／ＰＩ（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピディウム）を用いて定量化し、そして１００万細胞あたり２μｇまたは４μｇのＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４、並びにＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２の成熟カクテルを含むＸ−ＶＩＶＯ １５中、トランスフェクションした細胞を一晩培養した。成熟樹状細胞を採取し、そしてＡＯ／ＰＩ（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピディウム）を用いて定量化した。
【０１３６】
Ｂ．結果
アンチセンスＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが負の影響を引き起こすかどうか決定するため、ＤＣのＲＮＡトランスフェクションを行った。ＰＢＭＣから未成熟ＤＣを生成し、そして２つの実験群（ａｒｍ）に分けた。１つの実験群には、ＣＤＳ ６４Ｔを用いて増幅したＬＮＣａＰ細胞株由来のＲＮＡ集団をトランスフェクションし、そして第二の実験群には、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした。この実験で用いたＲＮＡ濃度は、１００万ＤＣあたり２μｇであった。成熟サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１β）およびＰＧＥ２を含有する培地に細胞を一晩戻し、採取し、そして表現型マーカー発現および生存度に関して分析した。
【０１３７】
結果によって、ＣＤＳ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした細胞よりも、ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、生存巨大細胞の割合がより高いことが示される（図６）。ＣＤＳ６４Ｔ ＲＮＡをトランスフェクションした集団は、Ｒ１ゲートの左に顕著な彗星様のテールを示した。Ｒ１ゲートは、主に樹状細胞である巨大細胞集団を含有する。Ｒ１ゲートから生じる彗星様のテールは、細胞破片および死んだ細胞を含有する。ＣＤ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした集団では、テールはより顕著でない。さらに、Ｒ１ゲート中の細胞数もまた、より多い（この例では、５４％対４８％）。これらの観察を総合すると、エレクトロポレーション後に回収される生存巨大細胞の数は、新規オリゴヌクレオチドおよび新規方法を用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣ集団において、より高い。
【０１３８】
２つの方法を用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした成熟生存ＤＣの表現型は異ならなかった（図７）。生存成熟樹状細胞の回収を比較するため、未成熟ＤＣに、異なるＲＮＡをトランスフェクションし、成熟させ、採取し、そして分析した。表２は、３人の独立した健康な志願者における、白血球搬出物質で行った３回の大規模実験からのデータを要約する。表２に要約するデータは、回収された細胞の総数が、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群におけるより、ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群において、より高いことを立証する。これは、新規オリゴヌクレオチドおよび新規増幅法を用いてトランスフェクションした細胞の回収および収量が、より高いことを示す。
【０１３９】
表２
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
実施例の考察
ＤＣへの抗原搬送のビヒクルとしてのＲＮＡは、ＤＣに基づくワクチン産生の多くの制限を克服する。少量の腫瘍から、ＲＮＡを抽出し、そして増幅して、自家性ＤＣをトランスフェクションするのに十分な量を生成することが可能であることが、利点の１つである。ワクチン試験は、最小全身腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の患者の末期疾患に対するワクチン調製および治療を可能にする。最小全身腫瘍組織量の患者は、より免疫無防備状態でないため、特に、免疫療法から利益を受ける可能性がある。
【０１４２】
少量の出発材料から十分な量のＲＮＡを生成するため、本明細書および別の箇所（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００およびＨｅｉｓｅｒら、２００１ｂ）に論じる増幅プロトコルを用いる。該プロトコルは、テンプレート切り替え原理に基づき、そして高品質の全長ＲＮＡの増幅を生じる。実施例によって、元来のプロトコルが、アンチセンスＲＮＡを含有する増幅したＲＮＡ集団を生じることが立証された。
【０１４３】
元来のプロトコルは、ｃＤＮＡライブラリー構築のために開発され、そしてセンスおよびアンチセンスｃＤＮＡ鎖の両方の増幅を必要とするため、アンチセンスＲＮＡが形成される。これは、重複配列を含有する３’端および５’端の両方にアニーリングする、単一のＰＣＲプライマーの使用によって達成された。ＲＮＡ転写を後に可能にするため、ＰＣＲプライマーは、Ｔ７プロモーター配列を含有する。その結果、３’端にアニーリングした際、該プロモーターは、３’端にＴ７を含有するｃＤＮＡを産生し、そして続いてアンチセンスＲＮＡを産生する。定量的分析によって、ＣＤＳ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡの５〜７％がアンチセンス配向であると概算される。しかし、アンチセンスＲＮＡは、新規ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡでは検出不能である。ヌクレオチド組成を変化させるのではなく、配列を変化させる（ＣＤＳ６４ＴからＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ）ことによって、５’および３’オリゴヌクレオチドの配列の重複性がなくなった場合、アンチセンス産物は排除される。あるいは、５’端を定義する（キャップスイッチ）オリゴヌクレオチドの配列変化もまた、アンチセンスＲＮＡ形成を妨げるであろう。したがって、本明細書に提示するのは、慣用法およびオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた場合にアンチセンスＲＮＡが存在する実験的証拠である。本明細書に開示する主題は、部分的に、センスＲＮＡのみが転写されるようにプライマーを修飾することによって、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを排除する解決法を考案する。
【０１４４】
新規プロトコルを用いて増幅したＲＮＡの忠実度を、マイクロアレイ分析を行って評価した。４つの技術反復を用いて、増幅したＲＮＡを出発総ＲＮＡ集団と比較した。クラスター分析によって、同一標識ＲＮＡで標識したマイクロアレイが一緒にグループ分けされ：マイクロアレイ１および２が一緒に、そしてマイクロアレイ４および３が一緒にグループ分けされた。色素交換実験によって、遺伝子が堅固にグループ分けされ、そして調べた２つのグループ間で直接の相関関係があることが明らかになった。これらの分析はどちらも、標識、ハイブリダイゼーションおよびデータ抽出が高品質であることを確認した。これらはまた、この研究に用いたＲＮＡが高品質であることも確認した。
【０１４５】
示差遺伝子発現のこの最初のマイクロアレイ分析からの最も重要な結果の１つは、２つのＲＮＡ集団（総ＲＮＡ対増幅したＲＮＡ：それぞれ１５，７４２および１５，５９９）の間に、０．９％の相違（１４３遺伝子）しかないことである。これらの相違には、総ＲＮＡ試料では検出され、そして増幅した集団では検出されない遺伝子（真の陰性）、および総ＲＮＡ試料では検出されないが、増幅した集団では検出される遺伝子（偽陽性）が含まれる。どちらの場合も、増幅法によって導入される偏向に相当しうる。最も重要なことに、この数は非常に小さく、そして出発総ＲＮＡ集団における転写物の圧倒的多数は、最終的に増幅されたＲＮＡ集団に提示される。これは、開発された新規方法を用いて増幅したＲＮＡが非常に高忠実度であることを示す。したがって、本明細書において、総腫瘍ＲＮＡから増幅したＲＮＡは、出発腫瘍材料で発現される遺伝子の定性的レベルおよび定量的レベルを正確に代表し、したがって自家性ＤＣにトランスフェクションした場合、完全に患者にマッチした特異的ワクチンが可能になることが立証される。
【０１４６】
実施例は、増幅したＲＮＡにおける、アンチセンスＲＮＡの存在およびｄｓＲＮＡ種の存在の間の相関関係を、さらに確立する。ＲＮアーゼ保護実験（ＲＰＡ）を用いて、アンチセンスＲＮＡを含有する集団がまた、二本鎖種も含有し、そしてアンチセンスＲＮＡの欠失が、二本鎖ＲＮＡの欠失と相関することもまた立証された。ｄｓＲＮＡが仲介するサイレンシングの機構がよく立証されている（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ｂおよびＣｈｅｎｃｈｉｋら、１９９８）ため、ＤＣをトランスフェクションするのに用いた集団中に二本鎖ＲＮＡが存在すると、懸念が生じる。
【０１４７】
ＲＰＡ実験で用いられるＲＮアーゼＩＩＩは、高分子量二本鎖ＲＮＡを２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡに切断するのに関与する細胞内ＲＮアーゼであるダイサーと類似の配列特異性を有する。この短い２２ヌクレオチドｄｓＲＮＡ分子は次に、配列特異的遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性構成要素を形成する。一本鎖特異的ＲＮアーゼでの消化は、１００ヌクレオチド未満の分子量分布を持つｄｓＲＮＡ種の集積を引き起こす（図４、左のパネル）。
【０１４８】
配列特異的ＲＮＡ仲介性サイレンシングは、ターゲット遺伝子の選択的サイレンシングのため、ＤＣで見られ、そして適用に成功している、進化的に保存された機構である（Ｌａｄｅｒａｃｈら、２００３）。したがって、巨大ｄｓＲＮＡを含有するＲＮＡをトランスフェクションした後、ＤＣで形成される小さいｄｓＲＮＡは、ＲＩＳＣ形成を導き、そしてＤＣ機能表現型に不都合に影響を及ぼしうる。
【０１４９】
二本鎖種を含有するＲＮＡのトランスフェクションが、負の影響を導くかどうかを決定することを目的とした実験において、単一ドナー由来のＤＣを生成し、そして次いで未成熟ＤＣを２つの実験群に分けた。元来の方法または本明細書に開示する新規方法を用いて、同じ出発総ＲＮＡから増幅したＲＮＡ、そしてしたがって、それぞれｄｓＲＮＡを含有するおよびｄｓＲＮＡを含有しないＲＮＡを、各実験群に並列してトランスフェクションした。３人の別個のドナーにおいて、研究を行った。この研究の結果によって、ｄｓＲＮＡ種を含有しないＲＮＡのトランスフェクションは、より高い細胞収量を生じることが立証された。２つのＲＮＡ集団の唯一の相違は、ｄｓＲＮＡが存在するかまたは存在しないかだけであるため、元来のプロトコルを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群において、収量が減少したのは、ｄｓＲＮＡの存在のためであると結論付けることも可能である。これは、ｄｓＲＮＡがＤＣに対して有害な影響を導きうるという、本明細書に論じる予測と一致する。しかし、いずれかのＲＮＡ集団をトランスフェクションした生存回収細胞は、表現型にいかなる相違も示さなかった。
【０１５０】
本明細書に示すデータは、明らかに、そして驚くべきことに、二本鎖種を含まない、増幅したＲＮＡが、より高い細胞回収を生じることを立証する。したがって、本明細書に開示する新規プロトコルおよびオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅したＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、予期せぬことに、成熟した自家性ＲＮＡトランスフェクション細胞の収量が増加し、これは患者ワクチン接種のために生成される用量の数に正比例する（表２）。細胞回収の増加は、したがって、ワクチン製造のコストを減少させ、そして延長された患者ワクチン接種を可能にし、これはこれまでに知られる方法に勝る、重要な利点である。
【０１５１】
参考文献
【０１５２】
【化４−１】
【０１５３】
【化４−２】
【０１５４】
【化４−３】
【０１５５】
【化４−４】
【０１５６】
【化４−５】
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、増幅プロセスの略図を示す。図１Ａは、慣用的増幅法を示す。概略図は、ｃＤＮＡの３’端および５’端を定義するオリゴヌクレオチド中に存在する重複配列が、Ｔ７含有プライマー下流でのアニーリングを導き、そしてその結果、アンチセンス配向で転写されるＲＮＡ種の形成を導くことを示す。図１Ｂは、アンチセンスＲＮＡ産生の問題に取り組む、本明細書に開示する増幅法を示す。
【図２】図２は、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに相補的なユビキチン・プローブを用いて、総ＲＮＡ試料（Ｔ）、並びに慣用的プライマーおよびプロセスを用いて増幅した試料（Ａ）に対して行った、ノーザンブロット分析を示すオートラジオグラフのデジタル画像である。等量の各ＲＮＡ（１０μｇ）を各レーンに装填した。ゲルは、ユビキチンのアンチセンスＲＮＡが、増幅したＲＮＡ集団に存在することを示す。
【図３】図３は、５’端および３’端プライマーの間の配列相同性を除去して、アンチセンスＲＮＡの形成をブロッキングした場合のノーザンブロット分析を示すオートラジオグラフのデジタル画像である。ＳＫ−Ｍｅｌ２８ ＲＮＡまたはヒト腫瘍ＲＮＡから増幅した試料に対して、ノーザンブロット分析を行った。慣用的な増幅法を用いて（レーン１）または本明細書に開示する主題を用いて（レーン２）、ＲＮＡを増幅した。センス・ユビキチンＲＮＡまたはアンチセンス・ユビキチンＲＮＡを認識するプローブを用いて、ノーザンブロット分析を行った。
【図４】図４は、慣用的プライマー（ＣＤＳ６４Ｔ）を用いて増幅したＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡを含有することを示す。ＲＮアーゼ消化前および消化後のＲＮＡ試料の電気泳動図。増幅したＲＮＡ集団を、一本鎖ＲＮＡに特異的なＲＮアーゼ（Ｔ１）で、またはさらに二本鎖ＲＮＡを認識するＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＩＩＩ）で消化した。左のパネルは、慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴを用いて増幅したＲＮＡを示し、そして右のパネルは、本明細書に開示する主題のＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡを示す。
【図５】図５は、マイクロアレイ１対マイクロアレイ３の色素フリップ（ｄｙｅ ｆｌｉｐ）である。すべての色素フリップ比較で、同一データが得られた。
【図６】図６は、異なるＲＮＡをトランスフェクションした樹状細胞のスキャッターフロープロット分析である。未成熟樹状細胞（左のパネル）に、慣用的ＣＤＳ ６４Ｔオリゴ（中央パネル）または新規ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴ（右のパネル）を用いて増幅したＬＮＣａＰ細胞株由来のＲＮＡを、１００万細胞あたり２μｇトランスフェクションした。Ｄ０３−０１７実験ゲートＲ１は、ＤＣを含有する生存巨大細胞集団の輪郭を描く。右下隅の数字は、試料に存在する巨大生存細胞のパーセントを示す。
【図７】図７は、ＲＮＡの２集団をトランスフェクションした成熟ＤＣの表現型が異ならないことを示すグラフである。未成熟樹状細胞を第６日に採取し、そして：１）慣用的増幅法（ｄｓＲＮＡ存在）；２）本明細書に開示する主題（ｄｓＲＮＡはまったく存在しない）；または３）対照としてのＧＦＰ ＲＮＡを用いて増幅したＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。細胞を馴化培地に戻して一晩成熟させ、そして表現型マーカー発現に関して分析した：ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ１４。Ｙ軸は、分析した各マーカーの陽性細胞パーセントを示す。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６０／５２５，０７６号、２００３年１１月２５日出願に優先権を請求し、該出願の開示は、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本明細書に開示する主題は、ＲＮＡを増幅し、望ましい機能に応じて、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であるＲＮＡ分子を得る方法に関する。抗原提示細胞に、腫瘍抗原または微生物抗原をコードするセンスＲＮＡをトランスフェクションする方法、並びに本明細書に開示する方法にしたがって調製した抗原提示細胞もまた、提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
Ｔリンパ球は、感染性病原体および腫瘍細胞に対する免疫応答において、並びに臓器移植拒絶および自己免疫において、重要な役割を果たす。Ｔ細胞は、抗原提示細胞表面上のＭＨＣ分子に結合した小さい断片の形で、抗原が提示されている場合にのみ、抗原を認識する。Ｔ細胞が応答するためには、休止中のＴリンパ球に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、２つのシグナルが提供されなければならない。免疫応答に特異性を与える第一のシグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と関連して提示された外来抗原性ペプチドの認識後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。第二のシグナルは、Ｔ細胞が増殖するように誘導し、そして機能させる。したがって、抗原提示は、免疫応答誘導における重要な工程である。
【０００４】
特定の抗原に対する免疫応答を誘導する試みの中で、ＡＰＣに抗原を搬送する多様なアプローチが用いられてきている。これらには、ウイルスベクターの使用、リポソーム中への抗原の挿入、および精製抗原または組換えタンパク質を用いた細胞の直接パルス処理が含まれる。
【０００５】
より最近は、ＲＮＡのＡＰＣへのトランスフェクションに基づく抗原搬送系が記載されてきている。ＲＮＡを装填した抗原提示細胞を用いて、癌および病原体感染を治療するかまたは予防する方法が、本明細書に援用される、米国特許第６，３０６，３８８号および第５，８５３，７１９号、並びに関連特許および出願に開示される。簡潔には、総腫瘍ＲＮＡまたは腫瘍抗原をコードする選択されるＲＮＡを増幅し、そして樹状細胞にトランスフェクションする。病原体由来ＲＮＡでトランスフェクションした抗原提示細胞もまた、感染性疾患の治療に使用可能である。
【０００６】
抗原で修飾した樹状細胞に基づくワクチンは、有効な抗腫瘍免疫のため非常に有望であり、そしてＲＮＡは、樹状細胞（ＤＣ）への抗原搬送のビヒクルとして広く認められている（ＭｉｔｃｈｅｌｌおよびＮａｉｒ、２０００；ＮａｉｒおよびＢｏｃｚｋｏｗｓｋｉ、２００２；Ｐｏｎｓａｅｒｔｓら、２００３；並びにＰｏｎｓａｅｒｔｓら、２００２）。抗原をコードする腫瘍ＲＮＡは、最も広いありうる腫瘍抗原レパートリーを提供し、特定のＨＬＡハプロタイプも、また総ＲＮＡ集団中に存在する定義される腫瘍抗原の同定および性質決定も必要としないため、抗原搬送の他の方法に内在する制限を克服する。
【０００７】
ＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣが、一次細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を刺激可能であることは、現在、確実に確立されている（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、１９９６）。多くの研究によって、多様なモデルにおけるこのアプローチの実現可能性が確認されてきている。総腎細胞癌腫ＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣを用いた１つの研究によって、原発性腫瘍および転移腫瘍に対するＴ細胞反応性が有効に刺激されることが立証された（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ａ）。他のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究によって、自家性腫瘍ＲＮＡを装填されたＤＣが、膀胱癌（Ｓｃｈｍｉｔｔら、２００１）、多発性骨髄腫（Ｍｉｌａｚｚｏら、２００３）、乳癌腫（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００３）および結腸直腸癌（Ｎｅｎｃｉｏｎｉら、２００３）に対する特異的ＣＴＬを誘導可能であることが立証されている。結腸直腸癌（Ｒａｉｎｓら、２００１）、腎細胞癌腫（Ｓｕら、２００３）および悪性神経膠腫（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２００３）に対して、自家性総腫瘍ＲＮＡを装填したＤＣを用いたワクチン接種戦略を試験する臨床試験が行われている。総ＲＮＡの２〜３％という少ない割合のみが、ｍＲＮＡまたは抗原コード種に対応する。ＲＮＡのｍＲＮＡを濃縮すると、ＤＣに搬送される同量のＲＮＡ中、コードＲＮＡ種の比率が増加する。コードＲＮＡ種を濃縮する１つの方法は、物理的分離法を用いて、ポリＡ＋ ＲＮＡを単離することである。前立腺細胞株ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクションして、ＤＣに基づく臨床等級のワクチンを生成する方法が記載されてきており（Ｍｕら、２００４）、そして開発されたアプローチを用いた臨床試験が開始された（Ｍｕら、２００３）。コードＲＮＡ集団を濃縮する別の方法は、ポリアデニル化された種のみを偏向して増幅するＲＮＡ増幅である。小さい腫瘍標本からＲＮＡを多量に増幅して、コード種を濃縮可能であり、そして生物学的機能の損失を伴わずに増幅が起こることを立証する研究が行われた（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００）。総腫瘍ＲＮＡから増幅したＲＮＡが生物学的活性を保持するかどうかを決定することを目的とする研究において、黒色腫細胞株から増幅したＲＮＡをトランスフェクションしたネズミＤＣは、抗腫瘍ＣＴＬ応答を生じた。この研究に記載されるＲＮＡ増幅プロトコルはまた、顕微解剖レーザー切片由来の前立腺腫瘍細胞にも適用されており、この場合は、自家性患者材料を用いて、腫瘍特異的ＣＴＬが誘導されることが報告された（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ｂ）。したがって、腫瘍ＲＮＡを抗原供給源として用いると、ＲＮＡを抽出し、そして増幅することが可能な投入腫瘍組織を少量しか必要としないというさらなる利点が提供される。
【０００８】
ｍＲＮＡ（ポリＡ＋ ＲＮＡ）の相補ＤＮＡへの変換、およびそれに続く配列の増幅は、分子生物学分野の当業者に周知の基本的技術である。基本的技術の多様な順列の説明は、米国特許第５，９６２，２７１号、第５，９６２，２７２号および第６，５９３，０８６号に見出されることも可能であり、これら特許の内容は、本明細書に援用される。例えば、ＲＮＡ増幅の公開されているプロトコルは、テンプレート切り替え技術を利用する（Ｃｈｅｎｃｈｉｋら、１９９８）。この技術の略図を図１Ａに示す。この技術は、ＭＭＬＶ逆転写酵素のＲＮアーゼＨ欠損突然変異体に特有の特性を利用して、さらなる残基、主にシトシンを、合成された第一鎖ｃＤＮＡの５’端に取り込む。いくつかの連続するＧ残基を３’端に含有するオリゴヌクレオチドが、第一鎖合成反応に存在する場合、ワトソン−クリック塩基対形成がＧおよびＣヌクレオチドの間に生じるであろう。逆転写酵素が転写物の５’端に到達すると、該酵素はテンプレートを切り替え、そしてアニーリングしたオリゴヌクレオチドの定義される配列からの転写を続ける。ｃＤＮＡの３’端は、他の定義される配列を含有するポリｄＴオリゴヌクレオチドをアニーリングさせることによって定義される。第一鎖ｃＤＮＡの定義される３’端および５’端は、ＰＣＲに基づく限定されない増幅を可能にするであろう。続いて、増幅した産物中の抗原配列の転写および翻訳を可能にするため、ＰＣＲ反応に用いるＧを含有するオリゴヌクレオチドにＴ７プロモーター配列を付加する（キャップスイッチ）ことによって、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター配列を導入する。元来はＣｈｅｎｃｈｉｋらに記載されたテンプレート切り替えプロトコルは、操作、およびそれに続くプラスミドベクターへのサブクローニングを容易にするために設計された。
【０００９】
このプロトコルでは、キャップスイッチおよびポリｄＴオリゴヌクレオチドはどちらも重複配列を含有する。これによって、ＰＣＲ反応において、単一オリゴヌクレオチドを用いた増幅が可能になる。例えば、Ｔ７含有オリゴヌクレオチドを第一鎖ｃＤＮＡ合成に用い、そしてＴ７含有オリゴヌクレオチドをＰＣＲ工程に用いる場合、このオリゴヌクレオチドを、ｃＤＮＡの５’端および３’端両方にアニーリングさせることも可能である。最終ＰＣＲ産物は、両端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を有するであろう。したがって、続く転写反応において、ＲＮＡポリメラーゼは、５’端および３’端両方に結合して、センス配向およびアンチセンス配向両方で、ＲＮＡを合成するであろう。
【００１０】
センス配向およびアンチセンス配向両方のＲＮＡを抗原提示細胞にトランスフェクションすると、有望な結果が生じてきている。しかし、抗原提示細胞に対するこうした方法の負の影響は、以前には認識されてきていなかった。したがって、樹状細胞および他の抗原提示細胞におけるｍＲＮＡコード抗原の発現を最適化する方法が必要である。本発明は、この必要性を満たす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
概要
本明細書に開示する主題の１つの態様において、抗原提示細胞に少なくとも１つのｍＲＮＡをトランスフェクションする方法を提供する。該方法は、アンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠き、そして少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含む調製物を：
（ｉ）試料から少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅して、ポリヌクレオチド・テンプレートを産生し、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、該ポリヌクレオチド・テンプレートのセンス鎖のみに機能可能であるように連結された、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む；そして
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド・テンプレートをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを産生する、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、クローニングされたテンプレートではない
ことによって、調製し；そして
少なくとも１つの抗原提示細胞に、調製物由来の少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡをトランスフェクションすることを含む。方法のいくつかの態様において、試料からのｍＲＮＡの増幅は、試料からｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド・テンプレートを産生し；そして第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡを増幅する、ここで第一のプライマーおよび第二のプライマーの一方のみが、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを挿入することを含む。いくつかの態様において、第一のプライマーは、ポリＴストレッチ、および第二のプライマーに配列相同性を本質的に持たない５’配列を含み、そして第二のプライマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む。
【００１２】
本明細書に開示する主題の別の態様において、上述の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞を提供する。いくつかの態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。さらに、いくつかの態様において、樹状細胞は成熟樹状細胞である。他の態様において、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。
【００１３】
さらなる態様において、キャリアー中に、上に開示する、ｍＲＮＡが装填された新規抗原提示細胞の少なくとも１つを含む、組成物を提供する。
さらなる態様において、少なくとも１つの抗原に対して、被験者において免疫応答を生じる方法を提供する。該方法は、上述のｍＲＮＡが装填された新規抗原提示細胞を被験者に導入することを含み、ここでｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞は、被験者の免疫系に少なくとも１つの抗原を提示し、それによって少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を生じる。
【００１４】
さらなる態様において、被験者において障害を治療する方法を提供する。該方法は、治療が必要な被験者に、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含み、そしてアンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠いているＲＮＡ調製物をｉｎ ｖｉｔｒｏでトランスフェクションした少なくとも１つの抗原提示細胞を含む、療法的有効量の組成物を投与することを含み、ここで、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが、上述の方法によって産生され、そしてポリヌクレオチド・テンプレートがｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されて、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが産生され、ポリヌクレオチド・テンプレートはクローニングされたテンプレートではない。いくつかの態様において、障害は癌である。他の態様において、障害は微生物感染の結果である。いくつかの態様において、抗原提示細胞は、治療される被験者から得られる、自家性抗原提示細胞である。
【００１５】
したがって、本明細書に開示する主題の目的は、ＲＮＡを増幅し、望ましい機能に応じて、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であるＲＮＡ分子を得る、新規方法を提供することである。この目的および他の目的が、本明細書に開示する主題によって、完全にまたは部分的に達成される。
【００１６】
本明細書に開示する主題の目的が、上に言及されてきているが、付随する図および以下に記載する実施例と関連付けて解釈すると、説明が進むに連れて、他の主題および側面が明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
詳細な説明
本明細書に開示する主題の実行は、別に記載しない限り、当該技術分野の技術範囲内にある、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技術を使用する。こうした技術は、文献に完全に説明されている。これらの方法は、以下の刊行物に記載される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， 第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら監修（１９８７））；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ監修（１９９５））；ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ監修（１９８８））；ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ監修（１９９９））；およびＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ監修（１９８７））を参照されたい。
【００１８】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍および感染性疾患の治療に重要な役割を果たす。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、そして細胞表面上に提示する。抗原提示細胞に抗原を搬送する１つの方法は、ＲＮＡトランスフェクションを通じる。ＲＮＡトランスフェクションの方法は、論文に記載されている：Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００およびＧｒｕｎｅｂａｃｈら、２００３。核酸トランスフェクションのさらなる方法が当業者に知られる。
【００１９】
抗原コードＲＮＡは、定義されるＲＮＡ、総ＲＮＡ、または選択される抗原（単数または複数）をコードする増幅されたＲＮＡであることも可能である。ＡＰＣにＲＮＡが装填されたならば、ＲＮＡはＡＰＣ内で翻訳され、そして生じたタンパク質はプロセシングされて、そしてＭＨＣ分子と関連して提示される。これによって、提示されたペプチドに特異的な免疫応答が開始される。
【００２０】
ＲＮＡは、米国特許第５，９６２，２７１号および第５，９６２，２７２号に記載されるＣＡＰスイッチ技術の修飾型または５’端に定義される配列を生じる他の方法いずれかを用いて、増幅可能である。他の方法には、限定されるわけではないが、欧州特許第０ ６２５ ５７２号に記載されるものなど、ＲＮＡの５’端への定義される配列の連結を伴う方法が含まれる。上述の特許は各々、本明細書に援用される。
【００２１】
ＲＮＡを増幅する既知の方法の大部分は、センスおよびアンチセンス両方のＲＮＡ分子を含むＲＮＡ集団を生じる。しかし、先行技術は、こうしたアンチセンスｍＲＮＡが抗原提示細胞のトランスフェクションにおいて有しうる有害な影響を認識していなかった。アンチセンス配向のＰＣＲテンプレートの転写は、センス配向のテンプレートの収量の減少を導く。さらに、アンチセンス種は、センス転写物にアニーリングして、配列特異的二本鎖ＲＮＡ仲介性遺伝子サイレンシングを導きうる（ＺａｍｏｒｅおよびＡｒｏｎｉｎ、２００３およびＤｙｋｘｈｏｏｒｎら、２００３）。これらの問題を以下に詳細に論じる。
【００２２】
反対配向の転写物は、ｄｓＲＮＡセンス−アンチセンス二重鎖を形成する潜在能力を有する。ｄｓＲＮＡ二重鎖が関与すると考えられる制御現象の数および種類は、迅速に拡大しつつある。例えば、ｄｓＲＮＡは、ベータ細胞機能を阻害し、そして一酸化窒素の産生を刺激することによって、膵島損傷を誘導することが示されてきている（Ｂｌａｉｒら、２００２）。二本鎖ＲＮＡはまた、ワクシニアウイルス感染細胞において、アポトーシスを誘発することも示されてきている（Ｋｉｂｌｅｒら、１９９７）。ｄｓＲＮＡが誘発する細胞死に関与する中間体に対してはかなりの研究が行われてきているが、二本鎖ＲＮＡによるアポトーシス誘導の機構は完全には性質決定されていない。
【００２３】
ｄｓＲＮＡ二重鎖の潜在的に有害な影響に加えて、アンチセンスＲＮＡは、抗原提示細胞の生存および機能に重要な遺伝子をサイレンシングする際に役割を果たすことも可能である。アンチセンスＲＮＡの存在はまた、細胞において機能するタンパク質の合成に利用可能なテンプレートの量の減少も導く。さらに、アンチセンスＲＮＡの存在は、ＴＬＲ３に活性化されるＲＮＡ依存性プロテインキナーゼによる、細胞中のタンパク質翻訳の配列非依存性阻害を促進可能である。
【００２４】
しかし、上述の影響に加えて、アンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡの形のアンチセンスＲＮＡを用いて、生物学的機能を実行することも可能である。この１つの限定されない例は、ＤＣにおけるＴｏｌｌ受容体経路を誘発することによって、成熟刺激を提供することである。
【００２５】
抗原搬送の目的のため、ＡＰＣをトランスフェクションするには、センスＲＮＡ組成物が好ましく、これは、センスＲＮＡがｍＲＮＡにコードされる抗原の翻訳を導くためである。抗原提示細胞のトランスフェクションに前に使用したアンチセンスＲＮＡが、組成物中に存在すると、有害な影響が生じる可能性もある。これらの影響には、限定されるわけではないが、（ａ）細胞において機能するタンパク質の合成用のセンス配向のテンプレートの減少；（ｂ）ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ機構を介した、形質導入された細胞遺伝子の配列特異的サイレンシング、および（ｃ）ＴＬＲ３に活性化されるＲＮＡ依存性プロテインキナーゼに仲介される、細胞におけるタンパク質翻訳の配列非依存性阻害が含まれる。特定のアンチセンスＲＮＡに特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析などの多様な方法を用いて、アンチセンスＲＮＡの存在を検出することも可能である。例えば、ユビキチン・アンチセンスＲＮＡを認識するプローブを用いて、増幅法を評価することも可能である。
【００２６】
一方、特定の状況では、アンチセンス組成物が好ましい。例えば、アンチセンス組成物は、特定の遺伝子をサイレンシングするのに好ましい可能性もある。この場合、センス配向分子を本質的に欠いている組成物を得ることが望ましいであろう。
【００２７】
本明細書に開示する主題は、増幅産物の配向を調節可能な、改善されたＲＮＡ増幅プロセスを提供する。該方法は、本質的に一方向性であるＲＮＡ分子の調製物を生じる。言い換えると、ＲＮＡは、大部分、センス配向またはアンチセンス配向であり、そして反対方向のＲＮＡ分子、および反対配向のＲＮＡ分子の相補的結合から生じるｄｓＲＮＡを本質的に欠いているであろう。センス配向であり、そしてアンチセンス配向の分子を本質的に欠いている定方向ＲＮＡ調製物を提供する。本明細書に開示するように、アンチセンス不含増幅ＲＮＡは、ｍＲＮＡが由来する元来の細胞、例えば癌細胞に発現される遺伝子の忠実な再現である。さらに、本明細書の実施例において立証するように、アンチセンス不含ＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、ＤＣの回収がより高くなり、これはＤＣに基づく大規模なワクチン製造に重要な意味があり、そして従来知られている方法の改善である。
【００２８】
センス配向分子を本質的に欠いているアンチセンス分子の調製物もまた、提供する。
Ｉ．定義
「増幅」は、プライマーおよび核酸ポリメラーゼを用いた核酸増幅法を指し、ターゲット核酸配列の多数のコピーを生じる。こうした増幅反応は当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、Ｕ．Ｓ．４，６８２，１９５、４，６８３，２０２および４，９６５，１８８を参照されたい）、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｕ．Ｓ． ５，３２２，７７０および５，３１０，６５２を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ、ＥＰ ０ ３２０ ３０８を参照されたい）、ＮＡＳＢＡまたはＵ．Ｓ． ５，３９９，４９１に記載されるＴＭＡおよびギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ、Ｕ．Ｓ． ５，４２７，２０２を参照されたい）などの類似の反応が含まれる。核酸ターゲットがＲＮＡである場合、逆転写酵素を用いて、ＲＮＡをまず相補ＤＮＡ鎖にコピーすることも可能である（Ｕ．Ｓ． ５，３２２，７７０および５，３１０，６５２を参照されたい）。
【００２９】
「抗原」は、本明細書において、抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に結合する分子を指す。用語「抗原」は、本明細書において、全分子、および抗体またはＴＣＲに結合する全分子の特定の部分（エピトープ）の両方を含む。ＴＣＲは、ＡＰＣ表面上のＭＨＣ分子と複合体形成した際のペプチド断片のみに結合し、これをＡＰＣによる「抗原提示」と称する。
【００３０】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識可能な抗原−ＭＨＣ複合体の形で、１以上の抗原を提示し、そしてそれによって提示しようとする単数または複数の抗原に対する有効な細胞性免疫応答を誘導することが可能な、細胞クラスを指す。ＡＰＣは、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞、および樹状細胞などの、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）全細胞；あるいは天然存在または合成の他の分子、例えばβ２−ミクログロブリンと複合体形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子であることも可能である。多くの種類の細胞が、Ｔ細胞認識のため、細胞表面上に抗原を提示可能であるが、樹状細胞のみが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のために未刺激（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を活性化するのに十分な量の抗原を提示する能力を有する。
【００３１】
「癌」によって、比較的自律性の増殖を示す細胞の異常な存在を意味し、したがって、癌細胞は、細胞増殖制御の重大な損失によって特徴付けられる異常な増殖表現型を示す。癌性細胞は、良性であることもまたは悪性であることも可能である。多様な態様において、癌は、膀胱、血液、脳、乳房、結腸、消化管、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または皮膚の細胞に影響を及ぼす。癌細胞の定義は、本明細書において、原発性癌細胞のみでなく、癌細胞祖先に由来するいかなる細胞も含む。これには、転移癌細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物および癌細胞由来の細胞株が含まれる。癌には、限定されるわけではないが、固形腫瘍、液性腫瘍、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、芽腫などが含まれる。好ましくは、癌細胞は、腎癌細胞、多発性骨髄腫細胞または黒色腫細胞である。
【００３２】
「クローニング」は、本明細書において、本発明の方法にしたがってＲＮＡを増幅することによって作成したｃＤＮＡを、ベクター、たとえばプラスミドベクター内に挿入することを意味する。ベクターは、通常、ベクターを増幅するための複製起点、およびクローニングされた目的のポリヌクレオチド配列を含む。クローニングは、本明細書において、目的のポリヌクレオチド配列の増幅を一般に含まず、そして特に、ポリメラーゼ連鎖反応増幅を含まない。本明細書に開示する主題の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのクローニングされたテンプレートの使用を除外する。特に、本明細書に開示する主題の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のため、テンプレートをクローニングする必要を伴わずに、抗原提示細胞のトランスフェクション用の、本質的にセンスであるＲＮＡを提供する手段を提供する。
【００３３】
「樹状細胞（ＤＣ）」は、多様なリンパ系組織および非リンパ系組織に見られる形態学的に類似の細胞種の多様な集団を指す（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１）。樹状細胞は、生物において、最も強力でそして好ましいＡＰＣを構成し、そしてＴ細胞活性化および増殖に必要なシグナルを提供する。樹状細胞は、骨髄前駆細胞由来であり、末梢血中、少数で循環し、そして未成熟ランゲルハンス細胞または最終分化成熟細胞のいずれかとして見られる。樹状細胞はまた、単球から分化することも可能である。樹状細胞は単球から分化することも可能であるが、これらは異なる表現型を所持する。例えば、特定の分化マーカー、ＣＤ１４抗原は、樹状細胞には見られないが、単球には存在する。また、成熟樹状細胞は、食作用を持たないが、単球は非常に食作用性の細胞である。成熟ＤＣがＴ細胞活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供可能であることが示されてきている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の単離法、並びに樹状細胞前駆体および成熟樹状細胞の産生法が当業者に知られる。例えば、本明細書にその内容が援用される、Ｂｅｒｇｅｒら、２００２；米国特許出願２００３０１９９６７３および２００２０１６４３４６；並びにＷＯ ９３／２０１８５を参照されたい。好ましい態様において、その内容が本明細書に援用される、Ｒｏｍａｎｉら、１９９４またはＳａｌｌｕｓｔｏら、１９９４に記載される方法によって、ＣＤ１４＋末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）から樹状細胞を調製する。あるいは、Ｃａｕｘら、１９９６の方法によって、ＣＤ３４＋細胞から樹状細胞を調製することも可能である。
【００３４】
「本質的に欠いている」は、センスｍＲＮＡ分子の１０％未満、好ましくは５％、４％、３％、２％、または１％未満の量で、アンチセンスＲＮＡ分子およびｄｓＲＮＡが存在する調製物を指すように用いられる。好ましくは、アンチセンス分子およびｄｓＲＮＡ分子は検出不能である。
【００３５】
「ｍＲＮＡ」は、翻訳可能なＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡは、リボソーム結合性部位および開始コドンを含有するであろう。好ましくは、ｍＲＮＡはまた、５’キャップ、停止コドンおよびポリＡテールも含有するであろう。
【００３６】
「機能可能であるように連結された」および「機能的に連結された」は、本明細書において、交換可能に用いられ、そしてヌクレオチド配列の転写がプロモーター領域に調節され、そして制御されるような方式で、ヌクレオチド配列に連結されているプロモーター領域を指す。同様に、ヌクレオチド配列は、機能可能であるように連結されたプロモーターの「転写調節」下にあると言う。ヌクレオチド配列にプロモーター領域を機能的に連結するための技術が当該技術分野に知られる。
【００３７】
「病原体」は、疾患の病因に関与するウイルスまたは生物いずれかを指し、そしてまた、その弱毒化派生物も指す。こうした病原体には、限定されるわけではないが、細菌、原生動物、真菌およびウイルス病原体、例えば、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）などのヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、ハンセン菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）などの多様な放線菌、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）などのブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヘルペスウイルス（例えば１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、コロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスおよびエプスタイン−バーウイルス）、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスが含まれる。本発明の方法は、ＨＩＶおよびＨＣＶなどのレトロウイルス病原体に適用した際、特に有用である。
【００３８】
病原体ＲＮＡは、病原体ゲノム（例えばレトロウイルス・ゲノム）または病原体ｍＲＮＡの形であることも可能であり、スプライシングされていることもまたされていないことも可能である。例えば、ＨＩＶの場合、ＨＩＶ ＲＮＡは、ウイルス粒子から単離されたかまたはウイルス複製中に宿主細胞から単離された、ウイルスＲＮＡゲノムの形であることも可能であるし、そしてまたスプライシングされたかまたはされていないＨＩＶ ｍＲＮＡの形であることも可能である。好ましい態様において、病原体ＲＮＡは、ＨＩＶビリオンから単離されたＨＩＶゲノムＲＮＡである。病原体ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを産生することも可能であり、これが次いで、核酸増幅のテンプレートとして働くことも可能である。
【００３９】
好ましくは、病原体ＲＮＡは、感染個体に存在する多数の病原体種からのものであり、またはこれらに由来する。この文脈において、「由来する」は、核酸が、少なくとも部分的に、病原体、または病原体核酸を含有する細胞（単数または複数）から精製されているか、あるいは核酸が病原体核酸から増幅されていることを意味する。個体に存在する多数の病原体種から核酸を得ることによって、生じるワクチンは、個体に存在する病原体種すべてに対して、潜在的に免疫応答を誘発しうる。
【００４０】
ＩＩ． ｍＲＮＡの増幅法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法
本明細書に開示する主題の代表的な利点は、標準的増幅法に、本明細書に開示する新規方法を一般的に図式的に比較することでわかる。図１Ａにおいて、標準的増幅法に含まれる工程を図式的に例示する。本明細書に開示する主題の新規方法の一例に含まれる工程を図１Ｂに示す。
【００４１】
図１Ａを参照すると、標準的ＲＮＡ増幅は、ＳＭＡＲＴ増幅法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の修飾型であり、方法に用いられる突然変異体ＲＴ（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に特有の特性によって、１つのＲＴ反応で、第一鎖ｃＤＮＡの定義される３’端および５’端が提供される。ｍＲＮＡの５’端に連結されたオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素がｍＲＮＡの５’端に到達した際に、該酵素がテンプレートを切り替え、そして連結されたオリゴヌクレオチドの端を通じて進むように、短い伸長したテンプレートとして働く。したがって、ｃＤＮＡの５’端は、相補定義配列またはＣＤＳと呼ばれる、定義された配列を有する。
【００４２】
図１Ａに示すように、ｃＤＮＡの３’端は、定義される配列（ＣＤＳ）、並びにポリＴ伸長を含有するオリゴを供給することによって、定義される。このオリゴのポリＴ部分は、ｍＲＮＡのポリＡ領域にアニーリングし、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成のアンカーとして働く。この方式で、ｃＤＮＡの３’端はＣＤＳ定義配列を含有する。定義されるオリゴヌクレオチド配列がｃＤＮＡの両端に存在することで、ＰＣＲ反応でｃＤＮＡを増幅することが可能になる。ＰＣＲプライマーは以下のように提供される：３’プライマーとしてＴＴＴＴ［ＣＤＳ］、および５’プライマーとしてＴ７［ＣＤＳ］。５’プライマーのＴ７部分はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位であり、該部位はＴ７プロモーターを含むポリヌクレオチド・テンプレートの産生を可能にし、該プロモーターは最終工程でポリヌクレオチド・テンプレートのＲＮＡ転写を容易にする。図１Ａに示すこの標準的プロトコルでは、元来の３’プライマーおよび５’プライマーは共通の配列を共有し、そしてしたがって、Ｔ７［ＣＤＳ］プライマーは、両端にアニーリング可能である。その結果、Ｔ７［ＣＤＳ］配列を含有するポリヌクレオチド・テンプレート、例えばｃＤＮＡは、両方の配向で合成され、そしてこれは最終的に、両方の配向のＲＮＡの形成を導く。
【００４３】
この増幅法では、望ましい産物はＲＮＡであってＤＮＡではない。したがって、ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列が、ＰＣＲ工程中にポリヌクレオチド・テンプレートの両端に取り込まれる。ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列がポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡの３’端にアニーリングすると、アンチセンスＲＮＡが産生され、そしてＲＮＡポリメラーゼ結合性ドメインがポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡの５’端にアニーリングすると、センスＲＮＡが産生される。したがって、最終産物は、両方向に配向したＲＮＡを含有する。上に論じたように、産物中にセンスおよびアンチセンス両方のＲＮＡが存在すると、ＲＮＡ産物をトランスフェクションした細胞に有害な影響を有しうる、ｄｓＲＮＡの生成が生じうる。
【００４４】
ＲＮＡの配向および方向は、目的の遺伝子をコードするもの（センス配向）またはセンス配向の反対（アンチセンス配向）のいずれかと定義される。
本明細書に開示する主題は、先行技術の方法に勝る、いくつかの利点を提供する。センスＲＮＡのみまたはアンチセンスＲＮＡのみを産生する方法を提供することによって、ｄｓＲＮＡの存在が排除される。本明細書に開示する主題の組成物は、反対配向のＲＮＡを本質的に欠いているため、他の方法によって産生される組成物より優れている。これは、互いに配列相同性を本質的に持たないプライマーを用いることによって達成される。プライマーの一方は、ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を挿入する。ＲＮＡポリメラーゼ結合性部位を５’端にまたは３’端に挿入するかに応じて、ｃＤＮＡがＲＮＡに転写される際に、センスＲＮＡのみまたはアンチセンスＲＮＡのみが産生されるであろう。
【００４５】
ＩＩ．Ａ．アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを本質的に欠いているセンス配向ＲＮＡを産生する方法
本明細書に開示する主題の１つの側面において、アンチセンスＲＮＡの形成をブロッキングする。増幅しようとする出発ＲＮＡは、典型的にはポリＡ＋ ＲＮＡであり、該ＲＮＡは慣用法を用いることによって単離可能である（例えばポリｄＴクロマトグラフィーの使用）。細胞質ＲＮＡおよび核ＲＮＡはどちらも、一緒にまたは別個に、本明細書に開示する主題において有用である。本明細書に開示する主題においてやはり有用なのは、腫瘍または病原体に特有の、腫瘍または病原体抗原またはエピトープに対応するＲＮＡ、および「ミニ遺伝子」に対応するＲＮＡ（すなわち定義されるエピトープをコードするＲＮＡ配列）である。腫瘍特異的ＲＮＡまたは病原体特異的ＲＮＡは、当該技術分野に一般的に知られるいくつかの方法のいずれかによって、総ＲＮＡ集団から特有の抗原を分離することによって得られうる。１つの限定されない例として、総ＲＮＡ集団から特有のＲＮＡを分離するのに、サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法が利用可能である。サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションのための方法は、当業者に知られる。例えば、本明細書にその内容が援用される、米国特許第５，２５６，５３６号および第６，８００，７３４号、並びにＵｔｔら、１９９５を参照されたい。限定されない例として、癌細胞（例えば腎細胞癌）由来の総ｍＲＮＡを基質として用いて、発現される遺伝子すべてに対応するｃＤＮＡ分子セットを調製することも可能である。ターゲット細胞に特異的でない（またはターゲット細胞で優先的に発現されていない）配列を取り除くため、ｃＤＮＡ調製物を、対応する正常細胞（例えば正常腎組織）のｍＲＮＡと徹底的にハイブリダイズさせる。この工程によって、２つの細胞種に共通の配列すべてが、ｃＤＮＡ調製物から取り除かれる。他のｍＲＮＡとハイブリダイズするｃＤＮＡ配列すべてを廃棄した後、残ったものは、総ｍＲＮＡ集団の選択された分画を含み、そして癌細胞のｍＲＮＡ集団に特有の配列を含有する。
【００４６】
図１Ｂは、本明細書に開示する主題の１つの態様を例示する。この例示ではＴ７ポリメラーゼが用いられるが、ＰＣＲのため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したＲＮＡポリメラーゼ、および関連オリゴヌクレオチド中のその対応する結合性部位のいずれもまた、当てはまるであろう。同じ結果を達成するのに、異なるプライマーおよび異なるポリメラーゼが使用可能であることが明らかである。示す方法を修飾して、アンチセンス分子のみを産生することも可能であることもまた、明らかである。本明細書に開示する主題は、１つの配向のＲＮＡを優先的に産生するための一般化されたスキームを含む。
【００４７】
図１Ｂに示す、本明細書開示の新規方法において、アンチセンスＲＮＡの生成がブロッキングされる。これは、５’プライマーに相同性がまったくない、特有の配列を含有するように、元来のポリＴ含有プライマーを再設計することによって達成される。これによって、ポリヌクレオチド・テンプレート、好ましくはｃＤＮＡの形成が導かれ、該テンプレートは、特定のポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼによって転写されることも可能な別個のそして特有の末端を含有する。Ｔ７［ＣＤＳ］プライマーは、５’端のみにアニーリングし、そして３’端にはアニーリングせず、そしてしたがってＴ７プロモーターを含有するアンチセンスｃＤＮＡはまったく合成されない。したがって、アンチセンス配向のＲＮＡ合成が影響を受け、そしてアンチセンス配向のＲＮＡ分子を本質的に欠いているＲＮＡ調製物が合成されるということになる。
【００４８】
上述の方法は、アンチセンスＲＮＡを本質的に欠いているＲＮＡ分子の調製物を生成し、すなわち調製物にはアンチセンスＲＮＡは実質的にまったく存在しない。本明細書に開示する主題の調製物は、他のＲＮＡ調製物よりも抗原提示細胞により毒性でないという好都合な特徴を有する。この調製物をトランスフェクションした抗原提示細胞は、健康な細胞をより高い収量で生じる。理論によって限定されるのではないが、トランスフェクション細胞に対するこの驚くべき影響は、アンチセンス配向またはｄｓＲＮＡの有害な影響が排除されているためである可能性もある。これによって、定量的および定性的両方の意味で増進したトランスフェクション細胞産生を生じる。センスＲＮＡのみをトランスフェクションした細胞は、センスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ両方をトランスフェクションした細胞集団に比較した際、より高い生存度を示し、そして得られる用量数がより多い。ＲＮＡをエレクトロポレーションするＤＣワクチン製造は、比較的高価であるため、得られる用量数が増加していることは、有意な経済的利点を有する。得られる用量数が増加していることはまた、治療される患者の健康上の利点でもある。
【００４９】
ＩＩ．Ｂ．核酸検出法
センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを定量化する多様な方法が知られ、そして限定されるわけではないが、ハイブリダイゼーションアッセイ（ノーザンブロット分析）およびＰＣＲに基づくハイブリダイゼーションアッセイが含まれる。
【００５０】
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示される方法にしたがって、多様な溶解酵素または化学的溶液を用いてｍＲＮＡを単離することも可能であるし、あるいは製造者に提供される付随の使用説明書にしたがって、商業的に入手可能な核酸結合性樹脂によってｍＲＮＡを抽出することも可能である。次いで、標準法にしたがって、核酸プローブおよび／またはプライマーを用いて、抽出された核酸試料に含有されるｍＲＮＡを、それぞれ、ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット分析）および／または増幅法によって検出する。
【００５１】
少なくとも１０のヌクレオチドを有し、そして検出しようとする核酸に配列相補性または配列相同性を示す核酸分子を、診断法において、ハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして用いることも可能である。当該技術分野において、「完全にマッチした」プローブは、特異的ハイブリダイゼーションに必要でないことが知られている。少数の塩基の置換、欠失または挿入によって達成されるプローブ配列中の小規模な変化は、ハイブリダイゼーション特異性に影響を及ぼさない。一般的に２０％もの塩基対ミスマッチ（最適に並列させた場合）が許容されうる。断片全体のサイズ、並びに相補的伸長のサイズは、特定の核酸セグメントの意図される使用または適用に応じるであろう。遺伝子のより小さい断片は、一般的に、ハイブリダイゼーション態様において使用を見出し、この場合、検出しようとする相補配列にしたがって、相補領域の長さは多様であることも可能であり、例えば約１０〜約１００ヌクレオチドの間、または全長であることも可能である。
【００５２】
長さ約１０ヌクレオチドより長い伸長に渡って相補配列を有するヌクレオチド・プローブは、ハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それによって、得られる特定のハイブリッド分子の特異性を改善するであろう。長さ約２５ヌクレオチドより長い、そしてさらにより好ましくは約５０ヌクレオチドより長い、または望ましい場合、さらに長い、遺伝子相補性伸長を有する核酸分子を設計することも可能である。こうした断片は、例えば、化学的手段により断片を直接合成することによって、本明細書に援用される米国特許第４，６０３，１０２号に記載されるような２つのプライミング・オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲＴＭ技術などの核酸再生技術を適用することによって、または組換え産生のため、選択される配列を組換えベクターに導入することによって、容易に調製可能である。
【００５３】
特定の態様において、ハイブリダイゼーションを検出し、そしてしたがって相補配列を検出するため、標識などの適切な手段と組み合わせて、本明細書に開示する主題の核酸配列を使用することが好都合であろう。非常に多様な適切な指標手段が当該技術分野に知られ、検出可能シグナルを生じることが可能な、蛍光、放射性、酵素性または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンが含まれる。放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ、例えばウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼもまた、使用可能である。酵素タグの場合、人間の目でまたは分光光度的に可視である手段を提供して、相補核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するのに使用可能な、比色指標基質が知られる。
【００５４】
異なる「ストリンジェンシー」の条件下で、ハイブリダイゼーション反応を行うことも可能である。該当する条件には、温度、イオン強度、インキュベーション時間、反応混合物中のさらなる溶質、例えばホルムアミドの存在、および洗浄法が含まれる。より高いストリンジェンシーの条件は、より高い温度およびより低いナトリウムイオン濃度などの条件であり、安定なハイブリダイゼーション複合体が形成されるためには、ハイブリダイズする要素間により高い最低相補性を必要とする。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増加させる条件は広く知られ、そして当該技術分野に公表されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【００５５】
定量的ＰＣＲまたはハイスループット分析、例えばＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、１９９５に記載されるような遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）を用いて、ｍＲＮＡレベルまたはｍＲＮＡ発現を検出し、そして定量化することも可能である。簡潔には、該方法は、転写物を含有すると推測される細胞または組織試料から多数のｍＲＮＡを単離することを含む。場合によって、遺伝子転写物をｃＤＮＡに変換することも可能である。遺伝子転写物の試料標本を配列特異的分析に供して、そして定量化する。これらの遺伝子転写物配列の存在量を、罹患患者および健康な患者の通常のデータセットを含む参照データベース配列の存在量に比較する。患者は、患者のデータセットが最も密接に相関し、そして本出願に関しては、転写物の差異を含む、疾患（単数または複数）を有する。
【００５６】
特定の側面において、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡの増幅および／または検出用のヌクレオチド・プローブまたはプライマーとして使用することが必要である可能性もある。示差発現されるｍＲＮＡを検出するのに有用なプライマーは、遺伝子またはポリヌクレオチドの匹敵するサイズの相同領域に、少なくとも約８０％同一である。本明細書に開示する主題の目的のため、増幅は、合理的な忠実度で、ターゲット配列を複製可能なプライマー依存性ポリメラーゼを使用する、いかなる方法も意味する。Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素などの天然または組換えＤＮＡポリメラーゼによって、増幅を行うことも可能である。
【００５７】
ＰＣＲの一般的な方法がＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９１に解説される。しかし、各適用反応に用いられるＰＣＲ条件は実験的に決定される。いくつかのパラメーターが、反応の成功を左右する。これらの中に、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋ ＡＴＰ濃度、ｐＨ、並びにプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度がある。
【００５８】
増幅後、アガロースゲル電気泳動を行った後にエチジウムブロミド染色および紫外線照射で視覚化することによって、生じたＤＮＡ断片を検出することも可能である。増幅されたＤＮＡ断片が、予測されるサイズを有し、予測される制限消化パターンを示し、そして／または正しくクローニングされたＤＮＡ配列にハイブリダイズすることを立証することによって、示差発現される目的の遺伝子が特異的に増幅されたことを確認することも可能である。遺伝子発現を検出する他の方法が当業者に知られる。例えば、ＰＣＴ出願第ＷＯ ９７／１０３６５号；米国特許第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号；第５，４４５，９３４号；第５，４０５，７８３号；第５，４１２，０８７号；第５，４４５，９３４号；第５，５７８，８３２号；および第５，６３１，７３４号；およびＴｉｊｓｓｅｎ（監修）、１９９３を参照されたい。
【００５９】
ＩＩＩ． ＡＰＣにトランスフェクションする方法
本明細書に開示する主題は、センス配向ＲＮＡをトランスフェクションしたＡＰＣの組成物を提供する。抗原提示細胞を培養し、そしてトランスフェクションする方法が、一般的に知られる。典型的な方法が、係属中の米国仮特許出願第６０／５２２，５１２号に開示され、該出願の内容は本明細書に援用される。しかし、トランスフェクション法は、本発明に決定的に重要ではない。
【００６０】
ＩＩＩ．Ａ． ＡＰＣの単離および培養
抗原提示細胞を単離し、そして培養する方法が当業者に知られる。限定されない例として、未成熟ＤＣを単離するか、またはＤＣ前駆細胞を含有する適切な組織供給源から調製し、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させて、未成熟ＤＣを産生することも可能である。例えば、適切な組織供給源は、骨髄細胞、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、および臍帯血細胞の１以上であることも可能である。１つの態様において、組織供給源は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。組織供給源は新鮮であることもまたは凍結されていることも可能である。別の側面において、非幹細胞または前駆細胞の増殖および分化を促進する有効量の増殖因子で、細胞または組織供給源をあらかじめ処理し、次いで、これらを目的の細胞からより容易に分離する。これらの方法は、当該技術分野に知られ、そしてＲｏｍａｎｉら、１９９４およびＣａｕｘ， Ｃ．ら、１９９６に記載される。
【００６１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）には、限定されるわけではないが、マクロファージ、内皮細胞、Ｂ細胞および樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞およびランゲルハンス細胞が含まれる。プロフェッショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞両方に対する影響を通じて、細胞仲介性免疫の刺激のための、強力なビヒクルを提供する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ、１９９８およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕ、２０００）。その機能に本質的であることだが、ＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ産物両方の上でＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞に提示するため、抗原を効率的にプロセシングする。表面抗原濃縮技術を通じて、末梢血または骨髄から単離されるか、あるいはＰＢＭＣの培養物から採取される樹状細胞に、特定の候補抗原を装填することも可能であるし、そして次いで、こうした樹状細胞は、未刺激Ｔ細胞または休止Ｔ細胞に、該当する抗原（単数または複数）を提示することが可能である（Ｈｅｉｓｅｒ、２０００およびＭｉｔｃｈｅｌｌ、２０００）。好ましくは、抗原提示細胞は、ワクチン接種される個体に対して自家性であり、そして病原体または癌細胞ＲＮＡもまた、患者から単離されるかまたは患者に由来する。
【００６２】
ＩＩＩ．Ａ．１． ＰＢＭＣからのＡＰＣの単離
１つの側面において、未成熟ＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好ましい態様において、ＰＢＭＣが未成熟ＤＣに分化するように、インターロイキン４（ＩＬ−４）および／またはＩＬ−１３の存在下または非存在下で、有効量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）でＰＢＭＣを処理する。最も好ましくは、本明細書に開示する主題の方法で使用するのに適した未成熟ＤＣを産生するため、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で、ＰＢＭＣをおよそ６日間培養する。
【００６３】
ＩＩＩ．Ａ．２．幹細胞からのＡＰＣの単離
ｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大および分化のため、幹細胞を単離する、多くの方法が当該技術分野に知られる。以下の説明は、例示目的のみのためであり、そして本明細書に開示する主題の範囲を制限することをまったく意図しない。
【００６４】
望ましくない細胞、例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（汎Ｂ細胞）およびＧＲ−１に結合する抗体で、骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から幹細胞を単離することも可能である。このプロトコルの詳細な説明に関しては、Ｉｎａｂａら、１９９２を参照されたい。
【００６５】
臍帯血、骨髄、および動員化（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）末梢血を含む、多様な供給源からヒトＣＤ３４＋細胞を得ることも可能である。抗体親和性法によって、ＣＤ３４＋細胞の精製を達成することも可能である。例えば、Ｐａｃｚｅｓｎｙら、２００４；Ｈｏら、１９９５；Ｂｒｅｎｎｅｒ、１９９３；およびＹｕら、１９９５を参照されたい。
【００６６】
末梢血中に頻出するが、増殖性でないＣＤ１４＋前駆体（単球）から、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の保護下で、ＤＣを生成することもまた可能である（例えば、ＷＯ ９７／２９１８２を参照されたい）。この方法は、ＳａｌｌｕｓｔｏおよびＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、１９９４、並びにＲｏｍａｎｉら、１９９４に記載される。簡潔には、ＣＤ１４＋前駆体は豊富であり、したがって大部分の場合、患者をあらかじめＧ−ＣＳＦ（末梢血において、ＣＤ３４＋細胞およびより拘束された前駆体を増加させるのに用いられる）などのサイトカインで処理することは不要と報告されている。Ｒｏｍａｎｉら、１９９６を参照されたい。他の研究者らは、このアプローチによって生成されるＤＣが、かなり均質であるようであり、そして未成熟状態または完全に分化したかもしくは成熟した状態で産生可能であると報告している。成熟刺激として、自家性単球馴化培地を用いることによって、ＦＣＳ（ウシ胎児血清）などの非ヒトタンパク質を回避し、そして完全に、そして不可逆的に成熟しそして安定なＤＣを得ることが可能であることが示された。Ｒｏｍａｎｉら、１９９６；Ｂｅｎｄｅｒら、１９９６。しかし、本明細書に開示する主題とは対照的に、これらの研究は、ＩＬ−１２レベルが増加し、そして／またはＩＬ−１０レベルが減少した成熟ＤＣを生じなかった。
【００６７】
適切なサイトカインと細胞をインキュベーションすることによって、幹細胞を樹状細胞に分化させることも可能である。Ｉｎａｂａら、１９９４は、ネズミＧＭ−ＣＳＦと幹細胞をインキュベーションすることによって、ネズミ幹細胞が樹状細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ分化することを記載した。簡潔には、標準ＲＰＭＩ増殖培地中、１〜２００ｎｇ／ｍｌのネズミＧＭ−ＣＳＦ、そして好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと単離幹細胞をインキュベーションする。ほぼ１日おきに１回、培地を新鮮な培地と交換する。培養７日後、表面マーカーの発現および形態によって評価すると、大部分の細胞が樹状細胞である。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、または他の標準法によって、樹状細胞を単離する。
【００６８】
ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞から、未成熟樹状細胞を調製することも可能である。骨髄細胞、末梢血前駆細胞（ＰＢＰＣ）、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、および臍帯血細胞からなる群より選択される組織供給源から、ＣＤ３４＋造血幹細胞または前駆細胞を単離することも可能である。ヒト細胞ＣＤ３４＋造血幹細胞は、好ましくは、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αと細胞を培養することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化される。例えばＳｚａｂｏｌｃｓら、１９９５を参照されたい。
【００６９】
マウスＤＣに関しては、培養中の幹細胞をネズミＧＭ−ＣＳＦとインキュベーションすることによって、ネズミ幹細胞を樹状細胞に分化させることも可能である。典型的には、培養中のＧＭ−ＣＳＦ濃度は、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌであり、そして好ましくは少なくとも約１ｎｇ／ｍｌである。しばしば、範囲は約２０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの間であろう。多くの好ましい態様において、用量は、約１００ｎｇ／ｍｌであろう。場合によって、ネズミＤＣを作成するため、類似の範囲でＩＬ−４を添加する。
【００７０】
ヒト細胞に形質導入する場合、ヒトＧＭ−ＣＳＦを類似の範囲で用い、そして分化を促進するため、ＴＮＦ−αもまた添加する。ＴＮＦ−αもまた、典型的には、ほぼ同じ範囲で添加される。場合によって、ＳＣＦまたは他の増殖リガンド（例えばＦｌｔ３）を類似の用量範囲で添加して、ヒトＤＣを作成する。
【００７１】
当業者には明らかであろうように、幹細胞を分化させるための上述の用量範囲はすべて、およそのものである。異なる供給者のサイトカイン、および同じ供給者由来の異なるロットのサイトカインでは、サイトカイン活性が変化する。当業者は、各サイトカインを容易に滴定可能であり、これを用いて、特定のサイトカインいずれかに関する最適用量を決定する。
【００７２】
ＩＩＩ．Ｂ． ＡＰＣのトランスフェクション
本明細書に開示する主題の新規方法を用いて、提示されるペプチドに対する免疫応答を誘導するかまたは調節することが望ましい、多様な療法適用のため、ＲＮＡをトランスフェクションした抗原提示細胞を提供することも可能である。本明細書に開示する主題の１つの態様において、腫瘍細胞由来のセンス配向ＲＮＡの調製物を用いて、抗原提示細胞にトランスフェクションして、癌免疫療法として有用な細胞組成物を提供する。本明細書に開示する主題の別の態様において、１以上の病原体由来のセンス配向ＲＮＡの調製物を用いて、細胞にトランスフェクションし、そして感染性疾患の治療および／または予防に有用な組成物を提供することも可能である。さらに、本明細書に開示する主題の別の態様において、免疫寛容誘発ペプチドをコードする、センス配向ＲＮＡもまた、自己免疫疾患の治療に有用なＡＰＣの調製物に使用可能である。
【００７３】
抗原提示細胞にトランスフェクションする方法は、当業者に知られ、そして限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、受動的取り込み、リポフェクション、陽イオン性試薬、ウイルス形質導入、ＣａＰＯ４、ナノ粒子仲介性トランスフェクション、ペプチド仲介性トランスフェクション等が含まれる。例えば、ペプチド仲介性トランスフェクションのための方法が、米国特許出願第２００３０１２５２４２号および第２００３００８７８１０号に開示され、該出願の内容が本明細書に援用される。ペプチド仲介性トランスフェクションの他の方法が当業者に知られる。好ましくは、ペプチドは陽イオン性ペプチドである。ナノ粒子仲介性トランスフェクションのための方法もまた、当業者に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、米国特許出願第２００４００３８４０６号を参照されたい。トランスフェクション法は、本明細書に開示する主題に決定的に重要ではなく、そしてしたがって、方法の先行するリストは例示であることを意図され、そして本明細書に開示する主題の範囲を限定することはまったく意図されない。
【００７４】
成熟または未成熟の場合、樹状細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで装填し、そして次いで、ワクチン接種前にｉｎ ｖｉｔｒｏで、またはワクチン接種後にｉｎ ｖｉｖｏで、成熟させることも可能である。あるいは、ｉｎ ｓｉｔｕで核酸を抗原提示細胞に搬送することも可能である。ｉｎ ｓｉｔｕトランスフェクションの方法は当業者に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、米国特許出願第２００４００８２５３０号および第２００３００３２６１５号、ＰＣＴ出願第ＷＯ ０１／２３５３７号、米国特許第６，６０３，９９８号、Ｈｏｅｒｒら、２０００、Ｌｉｕら、２００２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｓら、２００３；およびＯ’Ｈａｇｅｎ、２００１を参照されたい。
【００７５】
好ましくは、トランスフェクションされるＡＰＣは、樹状細胞またはマクロファージなどのプロフェッショナルＡＰＣである。あるいは、人工的に生成されたＡＰＣを使用することも可能である。慣用法を用いて、ＡＰＣにセンスＲＮＡをトランスフェクションすることも可能である。例えば、ＡＰＣを、陽イオン性脂質の存在下で、腫瘍由来ＲＮＡと接触させることも可能である。他の既知のトランスフェクション法を用いて、ＡＰＣにＲＮＡを導入することもまた可能である。米国特許第６，３０６，３８８号は、ＲＮＡをＡＰＣにトランスフェクションする方法を開示する。増幅法の出発材料として、本質的にいかなる種類の癌細胞または病原体由来のＲＮＡを用いることも可能である。他の状況では、免疫寛容誘発タンパク質をコードするＲＮＡを増幅することが望ましい可能性もある。
【００７６】
ＩＶ． ｉｎ ｖｉｖｏ療法
本明細書に開示する主題の方法によって産生されたＴ細胞または樹状細胞を、被験者に直接投与して、選択される免疫原に対して活性であるＴ細胞を産生することも可能である。投与は、被験者の血液または組織細胞と最終的に接触するように、成功裡に細胞を搬送する、当該技術分野に知られる方法によることも可能である。
【００７７】
薬学的に許容しうるキャリアーとしばしば一緒に、適切な方式いずれかで、細胞を投与する。本明細書に開示する主題と関連する細胞を被験者に投与する、適切な方法が利用可能であり、そして特定の細胞組成物を投与するのに、１より多い経路を用いることも可能であるが、特定の経路が、別の経路よりも、しばしばより迅速で、そしてより有効な反応を提供することも可能である。
【００７８】
薬学的に許容しうるキャリアーは、部分的に、投与される特定の組成物によって、そして組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって、決定される。したがって、本明細書に開示する主題の薬剤組成物に適した、非常に多様な配合物がある。最も典型的には、品質管理（微生物学、クローン形成アッセイ、生存度試験）を行い、そしてジフェンヒドラミンおよびヒドロコルチゾンの投与を先に行って、細胞を被験者に再注入する。例えば、Ｋｏｒｂｌｉｎｇら、１９８６およびＨａａｓら、１９９０を参照されたい。
【００７９】
関節内（関節の中）、静脈内、筋内、皮内、腹腔内、および皮下経路による投与などの非経口投与に適した配合物、並びにキャリアーには、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されるレシピエントの血液と配合物を等張にする溶質を含有することも可能な、水性等張性無菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことも可能な、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。静脈内投与または腹腔内投与が、本明細書に開示する主題の樹状細胞またはＴ細胞の投与の好ましい方法である。
【００８０】
被験者に投与する細胞（例えば活性化Ｔ細胞または樹状細胞）の用量は、有効量であり、時間とともに、被験者において望ましい有益な療法応答を達成するか、または癌細胞の増殖を阻害するか、または感染を阻害するのに有効である。
【００８１】
例示目的のみのため、後で分析し、そして比較するため、注入前に被験者から血液試料を得て、そして取り置くことによって、方法を実施することも可能である。一般的に、少なくとも約１０４〜１０６、そして典型的には１ｘ１０８〜１ｘ１０１０の細胞を、おおよそ６０〜１２０分に渡って、７０ｋｇの患者に静脈内注入するか、または腹腔内注入する。１つの側面において、投与は静脈内注入による。生命徴候を、そしてパルス酸素濃度計によって酸素飽和を、綿密に監視する。注入５分後および１時間後に血液試料を得て、そして分析のために取り置く。１年の期間中、総数１０〜１２回の処置で、おおよそ毎月、細胞再注入を反復する。最初の処置後、臨床医の自由裁量で、外来診療に基づいて、注入を行うことも可能である。再注入が外来診療で行われる場合、療法後、少なくとも４時間、被験者を監視する。
【００８２】
被験者の全体の健康状態に適用する際に、投与のため、本明細書に開示する主題の細胞を、細胞種のＬＤ−５０（または毒性の他の測定値）、および多様な濃度の細胞種の副作用によって決定した速度で、投与することも可能である。投与は単回用量または分割用量を介して達成可能である。本明細書に開示する主題の細胞は、細胞傷害性剤、ヌクレオチド類似体および生物学的応答修飾剤を含む、既知の慣用療法によって、状態の他の治療を補足することも可能である。同様に、場合によって、生物学的応答修飾剤が、本明細書に開示する主題のＤＣまたは活性化Ｔ細胞による治療に付加される。例えば、場合によって、アジュバント、あるいはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２またはＩＬ−２などのサイトカインと一緒に、細胞を投与する。
【００８３】
Ｖ．免疫原性を評価する方法
本明細書に開示する主題の方法によって産生された、抗原提示細胞または抗原に感作された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）Ｔ細胞の免疫原性を、周知の方法論によって決定することも可能であり、こうした方法論には、限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：
５１Ｃｒ放出溶解アッセイ。抗原特異的Ｔ細胞によってペプチドパルス処理した５１Ｃｒ標識ターゲットの溶解を比較することも可能である。「より活性である」組成物は、時間の関数としてターゲットのより多い溶解を示すであろう。溶解の動力学、並びに固定した時点（例えば４時間）での全体のターゲット溶解を用いて、性能を評価することも可能である。Ｗａｒｅら、１９８３。
【００８４】
サイトカイン放出アッセイ。修飾ＡＰＣと接触させた際、Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインの種類および量の分析は、機能活性の測定値であることも可能である。サイトカインを、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定して、サイトカイン産生の速度および総量を決定することも可能である。Ｆｕｊｉｈａｓｈｉら、１９９３；ＴａｎｑｕａｙおよびＫｉｌｌｉｏｎ、１９９４。
【００８５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞感作。正常ドナーまたは患者由来のＰＢＭＣから、反応性Ｔ細胞集団を誘発する能力に関して、本明細書に開示する主題の組成物をアッセイすることも可能である。この系では、溶解活性、サイトカイン放出、ポリクローナル性および抗原性エピトープに対する交差反応性に関して、誘発されたＴ細胞を試験することも可能である。Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、１９９６。
【００８６】
トランスジェニック動物モデル。本明細書に開示する主題の組成物を、ＨＬＡトランスジェニックマウスにワクチン接種し、そして誘導される免疫応答の性質および度合いを決定することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで免疫原性を評価することも可能である。あるいは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの養子移植によって、マウスにおいてヒト免疫系の再構築を可能にする。Ｓｈｉｒａｉら、１９９５；Ｍｏｓｉｅｒら、１９９３に先に言及されたように、これらの動物に、組成物をワクチン接種し、そして免疫応答に関して分析することも可能である。
【００８７】
増殖アッセイ。Ｔ細胞は、反応性組成物に応答して増殖するであろう。例えば３Ｈ−チミジン取り込みを測定することによって、増殖を定量的に監視することも可能である。Ｃａｒｕｓｏら、１９９７。
【００８８】
霊長類モデル。非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系を利用して、ＨＬＡ制限リガンドのｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性を監視することも可能である。チンパンジーは、ヒトＭＨＣ分子と重複するＭＨＣ−リガンド特異性を共有し、したがって相対的ｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性に関して、ＨＬＡ制限リガンドを試験することが可能であることが立証されている。Ｂｅｒｔｏｎｉら、１９９８。
【００８９】
ＴＣＲシグナル伝達事象の監視。いくつかの細胞内シグナル伝達事象（例えばリン酸化）は、ＭＨＣ−リガンド複合体によるＴＣＲ結合の成功と関連する。これらの事象の定性的分析および定量的分析は、組成物がＴＣＲ結合を通じてエフェクター細胞を活性化する相対的能力と相互に関連付けられてきている。Ｓａｌａｚａｒら、２０００；Ｉｓａｋｏｖら、１９９５。
【００９０】
ＶＩ．ワクチンおよび使用法
本明細書に開示する主題は、上述の装填された抗原提示細胞を含むワクチン組成物をさらに提供する。こうしたワクチンにおいて、装填された抗原提示細胞は、被験者への療法投与に適した緩衝液中にあるであろう。ワクチンは、抗原提示細胞またはＴ細胞を刺激する因子のためのアジュバントをさらに含むことも可能である。薬剤組成物を配合する方法が当業者に知られる。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅの最新版を参照されたい。
【００９１】
樹状細胞ワクチンに最適な免疫間隔を当業者が決定することも可能である。好ましい態様において、被験者は、用量あたり１ｘ１０６〜１ｘ１０７の間の、ＲＮＡが装填された生存ＤＣを５回ワクチン接種されるであろう。ワクチン接種のために選択される用量レベルは安全であり、そしてよく許容されることが期待される。
【００９２】
抗原提示細胞を単離し、調製し、トランスフェクションし、配合し、そして患者に投与する方法が当該技術分野に知られる。例えば、その内容が本明細書に援用される、Ｆａｙら、２０００；Ｆｏｎｇら、２００１；Ｒｉｂａｓら、２００１；Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒｅｔら、２００２；およびＳｔｉｆｔら、２００３を参照されたい。
【００９３】
ＡＰＣ投与を臨床的に使用する経路には、限定されるわけではないが、静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、皮内（ＩＤ）、およびリンパ内が含まれる。ＩＶ、ＳＣ、およびＩＤ投薬後に、客観的な臨床応答が報告されてきている。真皮が樹状細胞の通常の常在部位であり、そこから樹状細胞が排出リンパ節に遊走することが知られるため、現在、ＩＤ投与の優先傾向が発展してきている。ネズミモデルにおいて、ＳＣ注入樹状細胞は、後に、排出リンパ節のＴ細胞領域に見られ、そしてＩＶ免疫後より優れた防御性抗腫瘍免疫を誘発する。防御性抗腫瘍免疫または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生成する際、リンパ節に樹状細胞を直接注入する経路が、他の搬送経路より優れているというネズミでの証拠がある（その内容が本明細書に援用される、Ｌａｍｂｅｒｔら、２００１）。これによって、単一の排出リンパ節または流域に影響を及ぼすように（出来るだけ多くのリンパ節に関与する多数の部位に用量を分割するのではなく）、すべての樹状細胞用量を搬送しなければならないことが示唆される。
【００９４】
ワクチンの免疫原性を評価するため、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の成熟プロフィールを追うことによって、ワクチン接種した個体の免疫応答を監視することも可能である。例えば、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４５ ＲＡ＋ ＣＣＲ７−の表現型を発現し、そして上昇したレベルのγ−ＩＦＮおよびグランザイムＢを分泌する細胞の存在によって、癌細胞特異的または病原体特異的エフェクター細胞機能を決定することも可能である。ＨＩＶ−ＲＮＡ回復ＨＩＶ特異的記憶Ｔ細胞区画をトランスフェクションした樹状細胞で刺激した後、細胞がＩＬ−２を産生し、そしてＣＦＳＥ低となる能力によって、ＨＩＶ特異的増殖応答の回復を決定することも可能である。
【００９５】
フローサイトメトリーアッセイを用い、表面マーカーおよび細胞内マーカーを用いて、ワクチンに誘導される特異的Ｔ細胞の成熟を測定することも可能である。ＴＣＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７およびＣＤ１０７を含む表面マーカー、あるいはグランザイムβまたはγ−ＩＦＮなどの細胞内分子を染色することによって、ＣＤ８＋ Ｔ細胞が監視されるであろう。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＣＲ７およびＩＬ−２は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を監視するのに使用可能である。患者由来の自家性ＨＩＶ配列を含むペプチドとインキュベーションした後、こうしたアッセイを用いて、免疫応答を監視することも可能である。ベースライン、および各回の新規ワクチン接種前の毎月の細胞性免疫応答を比較することによって、細胞性免疫応答の大きさに対するワクチンの影響を決定することが可能になる。免疫応答の大きさはまた、ＣＦＳＥ増殖アッセイを用いても測定可能である。
【００９６】
ＶＩＩ．さらなる適用
本明細書に開示する主題は、抗原提示細胞への抗原搬送に限定されない。本明細書に開示する主題を、いかなる細胞株または組織細胞への定義されるターゲットの搬送に適用することも可能である。本明細書に開示する主題のＲＮＡを用いて他の細胞種をトランスフェクションして、細胞において機能するタンパク質を合成するテンプレートを提供することもまた可能である。
【００９７】
１つの配向を優先的に増幅することが望ましい、増幅したＲＮＡまたはｃＤＮＡの使用に基づくいかなるプロセスも、本明細書に開示する新規方法から利益を得るであろう。
ターゲットが特定の供給源からＰＣＲ増幅される場合、本明細書に開示する主題を、定義される抗原ターゲットの産生に適用することもまた可能である。
【００９８】
本明細書に開示する主題の方法、ＲＮＡ調製物および細胞組成物は、先行技術に勝る重大な利点を提供する。本明細書に開示する主題は、定性的に優れたＲＮＡ調製物の産生のための非常に効率的な方法、および細胞組成物におけるその使用を提供する。
【００９９】
方法論は、センスＲＮＡの優先的な増幅に関して、より十分に、詳細に記載されてきているが、同じ概念を他方の配向に適用して、アンチセンスＲＮＡを優先的に増幅することも可能であることが明らかである。アンチセンスＲＮＡでのトランスフェクションもまた、多くの療法目的および研究目的を有する。
【０１００】
上記開示は、一般的に、本明細書に開示する主題を説明する。以下の具体的な実施例を参照することによって、より完全な理解が得られうる。これらの実施例は、単に、例示の目的のためにのみ記載され、そして本明細書に開示する主題の範囲を限定することを意図しない。状況によって、好都合であると示唆されるかまたは好都合とされうるため、形の変化および同等物での置換が意図される。本明細書において、特定の用語が使用されているが、こうした用語は説明の意味で意図され、そして限定目的には意図されない。
【実施例】
【０１０１】
実施例
（実施例１）
慣用的オリゴヌクレオチドに比較した、新規オリゴヌクレオチドを用いたＲＮＡ増幅
Ａ． ＲＮＡ増幅に用いるオリゴヌクレオチド
【０１０２】
【化１】
【０１０３】
Ｂ． ＲＮＡ増幅
１μＭキャップスイッチ・プライマー、１μＭのＣＤＳ６４ＴまたはＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴプライマー、１μｌ ＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ逆転写酵素（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）、１ｘ第一鎖合成緩衝液、１μＭ ｄＮＴＰ、２ｍＭ ＤＴＴを含有する１０μｌ逆転写酵素反応中、ＳＫＭｅｌ２８細胞株または腎細胞癌腫腫瘍標本由来の総ＲＮＡ １マイクログラムを用いた。反応混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。
【０１０４】
次いで、０．４μＭ ｆ Ｔ７キャップスイッチおよびＣＤＳ６４ＴまたはＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴプライマー、０．４μＭ ｄＮＴＰ、１ｘＫｌｅｎ Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液および１μｌ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｋｌｅｎ Ｔａｑポリメラーゼ混合物（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を含有する１００μｌのＰＣＲ反応混合物中に２μｌのＲＴ産物を希釈した。２０周期の９５℃５秒間、６５℃５秒間、６８℃６分間にしたがって、増幅を達成した。ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ、米国カリフォルニア州バレンシア）を用いて、増幅されたｃＤＮＡを精製した。製造者の使用説明書にしたがって、Ｔ７ ＭＭＡＣＨＩＮＥ ＭＭＥＳＳＡＧＥ（登録商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、３μｇの各ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応で転写した。ＲＮＡ清浄化のプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙミニカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、最後のＲＮＡを精製した。
【０１０５】
（実施例２）
慣用的オリゴヌクレオチドを用いて増幅したＲＮＡ集団におけるアンチセンスＲＮＡの存在の決定
Ａ．ノーザンブロット分析
１．２％変性アガロースゲル上でＲＮＡを分離し、そして１０ｘＳＳＣ中のキャピラリー・トランスファーを用いて、ナイロン膜にトランスファーした。一晩トランスファーした後、ＲＮＡを膜に架橋した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）中、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温の低ストリンジェンシー洗浄、および１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃の高ストリンジェンシー洗浄で、膜を洗浄し、そしてＰｈｏｈｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露した。
【０１０６】
ヒト・ユビキチンｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２６８８０のユビキチンＮＣＢＩ ｍＲＮＡ配列に相補的であるように、センス方向およびアンチセンス方向のＲＮＡを検出するのに用いる一本鎖プローブを設計した。
【０１０７】
【化２】
【０１０８】
製造者の使用説明書を用い、Ｄｅｋａ Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、すべての二本鎖プローブの標識を行った。ＫＩＮＡＳＥＭＡＸＴＭ末端標識キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、すべての一本鎖プローブの標識を行った。
【０１０９】
Ｂ．結果
図１Ａは、慣用的オリゴヌクレオチドを用いてアンチセンスＲＮＡを生じる機構の略図を提供する。アンチセンス配向で転写されるＲＮＡが、慣用的プライマーを用いて増幅したＲＮＡ集団に存在するかどうかを実験的に決定するため、センス配向およびアンチセンス配向のユビキチンＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、ノーザンブロット分析を行った（図２）。ユビキチンｍＲＮＡのヌクレオチド１６９１−１９５３に相補的なオリゴヌクレオチド・プローブは、ユビキチンｍＲＮＡアイソフォームに対応する総ＲＮＡ集団において、２．３ｋｂおよび１．３ｋｂのバンドを認識する。
【０１１０】
より高い強度であるが、増幅したＲＮＡ集団においてもまた、２つのユビキチン転写物が検出される。ノーザンブロット分析に、等量（１０μｇ）の総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡを用いたため、増幅した集団において、ユビキチンｍＲＮＡに関するより高いシグナル強度が得られたことから、増幅したＲＮＡの試料ＲＮＡには、質量あたり、より高いレベルの転写物が存在することが示される。これは、増幅法がポリアデニル化ｍＲＮＡ種を濃縮し、そして総ＲＮＡの３〜５％のみがポリＡ＋ ＲＮＡで構成されるためである。アンチセンス転写物に相補的なユビキチン・プローブを用いて行ったノーザンブロット分析によって、増幅したＲＮＡ集団にアンチセンス・ユビキチン転写物が存在することが明らかになる。予期されるように、アンチセンス配向のユビキチン転写物は、総ＲＮＡ集団には見られない（図２、右のパネル、Ｔ）。
【０１１１】
（実施例３）
アンチセンスＲＮＡの合成をブロッキングするための新規オリゴヌクレオチド配列の利用
Ａ．ノーザンブロット分析
実施例２におけるように、１．２％変性アガロースゲル上でＲＮＡを分離し、そして１０ｘＳＳＣ中のキャピラリー・トランスファーを用いて、ナイロン膜にトランスファーした。一晩トランスファーした後、ＲＮＡを膜に架橋した。ＥＸＰＲＥＳＳＨＹＢＴＭ溶液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州パロアルト）中、６８℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温の低ストリンジェンシー洗浄、および１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃の高ストリンジェンシー洗浄で、膜を洗浄し、そしてＰｈｏｈｓｐｈｏｉｍａｇｅｒスクリーンに曝露した。
【０１１２】
ヒト・ユビキチンｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２６８８０のユビキチンＮＣＢＩ ｍＲＮＡ配列に相補的であるように、センス方向およびアンチセンス方向のＲＮＡを検出するのに用いる一本鎖プローブを設計した。
【０１１３】
【化３】
【０１１４】
製造者の使用説明書を用い、Ｄｅｋａ Ｐｒｉｍｅ ＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、すべての二本鎖プローブの標識を行った。ＫＩＮＡＳＥＭＡＸＴＭ末端標識キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、すべての一本鎖プローブの標識を行った。
【０１１５】
Ｂ．結果
図１Ａに示し、そして実施例２で立証するように、全長転写物の３’端および５’端を定義するのに用いる慣用的プライマー中の重複オリゴヌクレオチド配列によって、ＰＣＲ中にＴ７プライマーがアニーリングすることが可能になる。新規プライマーＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴにおいて、６４Ｔ含有オリゴヌクレオチドの配列を変化させて、配列の５’端を定義するのに用いるオリゴヌクレオチドに対する相同性を除去すると、Ｔ７キャップスイッチ・プライマーのアニーリングが妨げられる。これは、最終的に、アンチセンス配向のユビキチンの転写を妨げる。キャップスイッチ・プライマーに対する相同性を排除するため、ポリＴ含有オリゴヌクレオチド（ＣＤＳ６４Ｔ）を再設計した。続いて、ＲＮＡ増幅のため、新規プライマー（ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ）を用いた。
【０１１６】
ＣＤＳ ６４ＴおよびＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡを、ノーザンブロット分析によって分析した。アンチセンスＲＮＡの存在が、特定の細胞株由来のＲＮＡ増幅法のアーティファクトである可能性を排除するため、腎細胞癌腫腫瘍標本由来の総ＲＮＡに対してもまた増幅プロトコルを実行した（図３）。
【０１１７】
ノーザンブロット分析によって、６４Ｔ含有オリゴヌクレオチドを再設計すると、細胞株および腫瘍材料から単離したＲＮＡのどちらにおいても、アンチセンス・ユビキチンＲＮＡ合成の完全なブロッキングが生じることが示される。表１に示すように、どちらのオリゴヌクレオチドを用いた増幅法で得られた増幅ＲＮＡの収量も同様であった。
【０１１８】
表１
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
（実施例４）
アンチセンスＲＮＡを含有する集団中の二本鎖ＲＮＡの検出
Ａ．リボヌクレアーゼ保護実験
ＲＰＡ ＩＩＩＴＭリボヌクレアーゼ保護アッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ、米国テキサス州ウッドワード）を用いて、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行い、増幅したＲＮＡ中に二本鎖種が存在するかどうかを決定した。該実験において、９０μｇの６４Ｔ＋オリゴまたはＣＤＳ６４Ｔで増幅したＲＮＡを分析した。３つの実験条件を用いて、各ＲＮＡを分析した：１）未処理（対照）、２）ＲＮアーゼＴ１消化のみ、および３）ＲＮアーゼＴ１後、ＲＮアーゼＩＩＩ消化。
【０１２１】
ＲＰＡのため、３０μｇのＲＮＡをエタノール沈殿し、１０μｌのＲＰＡ ＩＩＩハイブリダイゼーション緩衝液中で再構成し、そして５６℃で慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴヌクレオチド・プライマーと一晩インキュベーションして、相補ＲＮＡ鎖のアニーリングを可能にした。インキュベーション後、１５０μｌのＲＮアーゼＴ１消化緩衝液および８ＵのＲＮアーゼＴ１酵素を試料に添加して、そして３７℃で１時間インキュベーションした。エタノール沈殿を反復した。
【０１２２】
ＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化する試料を、１０μｌのＲＮアーゼＩＩＩ消化緩衝液および１５Ｕの酵素中に再懸濁した。３７℃で１時間インキュベーションした後、試料をエタノール沈殿した。対照試料は、いずれかのヌクレアーゼの代わりに、ヌクレアーゼ不含水を含有した。エタノール沈殿後、すべての試料を２０μｌのヌクレアーゼ不含水中で再構成し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）上でＲＮＡ ６０００ナノチップを用いて、各試料１μｌを分析した。
【０１２３】
Ｂ．結果
アンチセンスＲＮＡが存在することによって生じる懸念の１つは、アンチセンスＲＮＡがコード対応物にアニーリングして、二本鎖ＲＮＡを生じうることである。これは、続いて、有害な影響、例えばｓｉＲＮＡが仲介する機構を介した配列依存性サイレンシングを導きうる。慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴヌクレオチドを用いて増幅したＲＮＡ集団が、二本鎖ＲＮＡ種を含有するかどうかを調べるため、ＲＮアーゼ保護実験を行った。
【０１２４】
慣用的（ＣＤＳ ６４Ｔ）または新規（ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴ）ポリＴ含有オリゴヌクレオチドのいずれかを用いて増幅したＲＮＡ集団をまず、一本鎖ＲＮＡに特異的なＲＮアーゼＴ１で消化し、そして次いで、二本鎖ＲＮＡ種に特異的なＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化した（図４）。
【０１２５】
増幅されたＲＮＡは、スメアとして移動し、分子量分布は２００ｂｐ〜６ｋｂの間であり、強度ピークは１．５ｋｂ前後であった（図４、未消化の曲線）。この分子量分布は、典型的なｍＲＮＡ集団に特徴的である。これはまた、増幅プロセス中に、ポリアデニル化ｍＲＮＡ集団のみが濃縮されるという主張とも一致する。一本鎖特異的ＲＮアーゼ（Ｔ１）で消化した後、ＣＤＳ ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡ集団において、約４００ｂｐの単一ピークが検出される（図４、右のパネル）。物質は、一本鎖ＲＮアーゼによる切断から保護されていたため、二本鎖ＲＮＡ種で構成されている可能性が最も高い。
【０１２６】
保護された集団の二本鎖ＲＮＡの性質を確認するため、ＲＮＡを二本鎖特異的ＲＮアーゼＩＩＩでさらに消化し、そしてピークは完全に消滅した（図４、左のパネル）。これによって、４００ｂｐの物質は二本鎖ＲＮＡで構成されていることがさらに示唆される。
【０１２７】
注目すべきことに、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅した集団では、一本鎖特異的ＲＮアーゼＴ１で消化した後、保護されるＲＮＡピークがまったくなかったことから（図４、右のパネル）、増幅された集団が、二本鎖ＲＮＡ種をまったく含有しないことが示唆される。
【０１２８】
（実施例５）
増幅したＲＮＡの品質および忠実度の試験
Ａ．マイクロアレイ分析
ＳＫ Ｍｅｌ ２８細胞株由来の総ＲＮＡ、各１０μｇの４アリコット、および増幅したＲＮＡ各２μｇの４アリコットを、この研究に用いた。第一鎖ｃＤＮＡ合成後、シアニン３または５（Ｃｙ３／Ｃｙ５）蛍光分子いずれかにアミノアリル基をカップリングすることによって、アミノアリル標識ヌクレオチドでの間接的標識を用いて、総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡの２アリコットを、各々標識した。それぞれ、Ｃｙ５およびＣｙ３を用いた間接的標識プロトコルを用いて、総ＲＮＡおよび増幅したＲＮＡの残りのアリコットを標識して、色素交換実験を行った。製造者の使用説明書にしたがって、標識ｃＤＮＡをＡｇｉｌｅｎｔヒトゲノムＩＡマイクロアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）にハイブリダイズさせた。
【０１２９】
マイクロアレイ１および２を、Ｃｙ３で標識した総ＲＮＡおよびＣｙ５で標識した増幅ＲＮＡとハイブリダイズさせる、４つの反復実験を行った。マイクロアレイ３および４を、Ｃｙ５で標識した総ＲＮＡおよびＣｙ３で標識した増幅ＲＮＡとハイブリダイズさせた。
【０１３０】
Ａｘｏｎスキャナーを用いて、マイクロアレイ画像を収集した。インターネット上、ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．で入手可能な、ＴＩＧＲ ＴＭ４一式を用いて、データ分析を行った。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、米国カリフォルニア州レッドウッドシティ）を用いて、さらなる分析を行った。
【０１３１】
Ｂ．結果
実施例１に記載する増幅プロトコルを用いて増幅したＲＮＡの品質および忠実度の最初の実験を、マイクロアレイ技術を用いて行った。実験データの品質を評価するため、２つの最初の分析：クラスターおよび色素交換を行った。
【０１３２】
マイクロアレイをグループ分けするため、階層的クラスター形成を用いた。実験誤差が存在しなければ、反復実験（すなわちマイクロアレイ）は、一緒にクラスター形成するであろう。４つのマイクロアレイからの結果は、同一標識ＲＮＡ集団で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）マイクロアレイが一緒にクラスター形成することを示した。マイクロアレイ１および２は一緒にクラスター形成し、そしてマイクロアレイ３および４は一緒にクラスター形成した。
【０１３３】
マイクロアレイデータおよびＲＮＡの品質に関する第二の試験は、ｃＤＮＡを標識するのに用いるシアニン色素を「交換」することである。実験誤差または標識偏向（すなわち、ｃＤＮＡの一方の集団が、色素の一方で優先的に標識されること）が存在しなければ、標識ＲＮＡを比較した際に、直接の相関関係がある。図５は、色素交換比較を示す。遺伝子は堅固にグループ分けされ、そして直接の相関関係を示す。Ａｇｉｌｅｎｔヒト１Ａアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国カリフォルニア州パロアルト）は、〜２２，５７５のターゲット遺伝子を含有し、このうち１５，７４２が一方のＲＮＡ集団で検出され、そして１５，５９９がもう一方で検出された。ヒト１Ａマイクロアレイが、ＳＫ Ｍｅｌ ２８細胞で発現されないいくつかの遺伝子ターゲットを含有するため、どちらの集団も２２，５７５遺伝子のすべてにはハイブリダイズしないと予期される。
【０１３４】
（実施例６）
アンチセンス対応物を含有しないＲＮＡをトランスフェクションした細胞の収量および回収の分析
Ａ． ＤＣ培養物の生成およびＲＮＡでのエレクトロポレーション
健康な志願者からの白血球搬出物を、Ｌｉｆｅｂｌｏｏｄ（米国テネシー州メンフィス）によるＡｕｔｏＰＢＳＣ法を用いて、ＣＯＢＥ（登録商標）ＳＰＥＣＴＲＡＴＭ（Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ、米国コロラド州レイクウッド）上に収集した。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配（ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）−１００７ ＨＹＢＲＩ−ＭＡＸ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて、フェレーシスから末梢血単核細胞を単離し、そして単球接着のため、１〜２時間培養した。非接着細胞を取り除き、そして１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）液、Ｂｅｒｌｅｘ、米国ニュージャージー州モントビル）およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国ミネソタ州ミネアポリス）各々を補ったＸ−ＶＩＶＯ １５ＴＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ、米国ニュージャージー州イーストラザフォード）培地中で残った単球を６〜７日間培養した。
【０１３５】
生じた単球由来樹状細胞を採取し、ＡＯ／ＰＩ（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピディウム）を用いて定量化し、そして１００万細胞あたり２μｇまたは４μｇのＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。８００Ｕ／ｍｌ ＧＭ−ＣＳＦ、５００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−４、並びにＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２の成熟カクテルを含むＸ−ＶＩＶＯ １５中、トランスフェクションした細胞を一晩培養した。成熟樹状細胞を採取し、そしてＡＯ／ＰＩ（アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピディウム）を用いて定量化した。
【０１３６】
Ｂ．結果
アンチセンスＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが負の影響を引き起こすかどうか決定するため、ＤＣのＲＮＡトランスフェクションを行った。ＰＢＭＣから未成熟ＤＣを生成し、そして２つの実験群（ａｒｍ）に分けた。１つの実験群には、ＣＤＳ ６４Ｔを用いて増幅したＬＮＣａＰ細胞株由来のＲＮＡ集団をトランスフェクションし、そして第二の実験群には、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした。この実験で用いたＲＮＡ濃度は、１００万ＤＣあたり２μｇであった。成熟サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−１β）およびＰＧＥ２を含有する培地に細胞を一晩戻し、採取し、そして表現型マーカー発現および生存度に関して分析した。
【０１３７】
結果によって、ＣＤＳ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした細胞よりも、ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした細胞で、生存巨大細胞の割合がより高いことが示される（図６）。ＣＤＳ６４Ｔ ＲＮＡをトランスフェクションした集団は、Ｒ１ゲートの左に顕著な彗星様のテールを示した。Ｒ１ゲートは、主に樹状細胞である巨大細胞集団を含有する。Ｒ１ゲートから生じる彗星様のテールは、細胞破片および死んだ細胞を含有する。ＣＤ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした集団では、テールはより顕著でない。さらに、Ｒ１ゲート中の細胞数もまた、より多い（この例では、５４％対４８％）。これらの観察を総合すると、エレクトロポレーション後に回収される生存巨大細胞の数は、新規オリゴヌクレオチドおよび新規方法を用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションしたＤＣ集団において、より高い。
【０１３８】
２つの方法を用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした成熟生存ＤＣの表現型は異ならなかった（図７）。生存成熟樹状細胞の回収を比較するため、未成熟ＤＣに、異なるＲＮＡをトランスフェクションし、成熟させ、採取し、そして分析した。表２は、３人の独立した健康な志願者における、白血球搬出物質で行った３回の大規模実験からのデータを要約する。表２に要約するデータは、回収された細胞の総数が、ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群におけるより、ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群において、より高いことを立証する。これは、新規オリゴヌクレオチドおよび新規増幅法を用いてトランスフェクションした細胞の回収および収量が、より高いことを示す。
【０１３９】
表２
【０１４０】
【表２】
【０１４１】
実施例の考察
ＤＣへの抗原搬送のビヒクルとしてのＲＮＡは、ＤＣに基づくワクチン産生の多くの制限を克服する。少量の腫瘍から、ＲＮＡを抽出し、そして増幅して、自家性ＤＣをトランスフェクションするのに十分な量を生成することが可能であることが、利点の１つである。ワクチン試験は、最小全身腫瘍組織量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）の患者の末期疾患に対するワクチン調製および治療を可能にする。最小全身腫瘍組織量の患者は、より免疫無防備状態でないため、特に、免疫療法から利益を受ける可能性がある。
【０１４２】
少量の出発材料から十分な量のＲＮＡを生成するため、本明細書および別の箇所（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら、２０００およびＨｅｉｓｅｒら、２００１ｂ）に論じる増幅プロトコルを用いる。該プロトコルは、テンプレート切り替え原理に基づき、そして高品質の全長ＲＮＡの増幅を生じる。実施例によって、元来のプロトコルが、アンチセンスＲＮＡを含有する増幅したＲＮＡ集団を生じることが立証された。
【０１４３】
元来のプロトコルは、ｃＤＮＡライブラリー構築のために開発され、そしてセンスおよびアンチセンスｃＤＮＡ鎖の両方の増幅を必要とするため、アンチセンスＲＮＡが形成される。これは、重複配列を含有する３’端および５’端の両方にアニーリングする、単一のＰＣＲプライマーの使用によって達成された。ＲＮＡ転写を後に可能にするため、ＰＣＲプライマーは、Ｔ７プロモーター配列を含有する。その結果、３’端にアニーリングした際、該プロモーターは、３’端にＴ７を含有するｃＤＮＡを産生し、そして続いてアンチセンスＲＮＡを産生する。定量的分析によって、ＣＤＳ６４Ｔを用いて増幅したＲＮＡの５〜７％がアンチセンス配向であると概算される。しかし、アンチセンスＲＮＡは、新規ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡでは検出不能である。ヌクレオチド組成を変化させるのではなく、配列を変化させる（ＣＤＳ６４ＴからＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ）ことによって、５’および３’オリゴヌクレオチドの配列の重複性がなくなった場合、アンチセンス産物は排除される。あるいは、５’端を定義する（キャップスイッチ）オリゴヌクレオチドの配列変化もまた、アンチセンスＲＮＡ形成を妨げるであろう。したがって、本明細書に提示するのは、慣用法およびオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた場合にアンチセンスＲＮＡが存在する実験的証拠である。本明細書に開示する主題は、部分的に、センスＲＮＡのみが転写されるようにプライマーを修飾することによって、アンチセンスＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを排除する解決法を考案する。
【０１４４】
新規プロトコルを用いて増幅したＲＮＡの忠実度を、マイクロアレイ分析を行って評価した。４つの技術反復を用いて、増幅したＲＮＡを出発総ＲＮＡ集団と比較した。クラスター分析によって、同一標識ＲＮＡで標識したマイクロアレイが一緒にグループ分けされ：マイクロアレイ１および２が一緒に、そしてマイクロアレイ４および３が一緒にグループ分けされた。色素交換実験によって、遺伝子が堅固にグループ分けされ、そして調べた２つのグループ間で直接の相関関係があることが明らかになった。これらの分析はどちらも、標識、ハイブリダイゼーションおよびデータ抽出が高品質であることを確認した。これらはまた、この研究に用いたＲＮＡが高品質であることも確認した。
【０１４５】
示差遺伝子発現のこの最初のマイクロアレイ分析からの最も重要な結果の１つは、２つのＲＮＡ集団（総ＲＮＡ対増幅したＲＮＡ：それぞれ１５，７４２および１５，５９９）の間に、０．９％の相違（１４３遺伝子）しかないことである。これらの相違には、総ＲＮＡ試料では検出され、そして増幅した集団では検出されない遺伝子（真の陰性）、および総ＲＮＡ試料では検出されないが、増幅した集団では検出される遺伝子（偽陽性）が含まれる。どちらの場合も、増幅法によって導入される偏向に相当しうる。最も重要なことに、この数は非常に小さく、そして出発総ＲＮＡ集団における転写物の圧倒的多数は、最終的に増幅されたＲＮＡ集団に提示される。これは、開発された新規方法を用いて増幅したＲＮＡが非常に高忠実度であることを示す。したがって、本明細書において、総腫瘍ＲＮＡから増幅したＲＮＡは、出発腫瘍材料で発現される遺伝子の定性的レベルおよび定量的レベルを正確に代表し、したがって自家性ＤＣにトランスフェクションした場合、完全に患者にマッチした特異的ワクチンが可能になることが立証される。
【０１４６】
実施例は、増幅したＲＮＡにおける、アンチセンスＲＮＡの存在およびｄｓＲＮＡ種の存在の間の相関関係を、さらに確立する。ＲＮアーゼ保護実験（ＲＰＡ）を用いて、アンチセンスＲＮＡを含有する集団がまた、二本鎖種も含有し、そしてアンチセンスＲＮＡの欠失が、二本鎖ＲＮＡの欠失と相関することもまた立証された。ｄｓＲＮＡが仲介するサイレンシングの機構がよく立証されている（Ｈｅｉｓｅｒら、２００１ｂおよびＣｈｅｎｃｈｉｋら、１９９８）ため、ＤＣをトランスフェクションするのに用いた集団中に二本鎖ＲＮＡが存在すると、懸念が生じる。
【０１４７】
ＲＰＡ実験で用いられるＲＮアーゼＩＩＩは、高分子量二本鎖ＲＮＡを２２ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡに切断するのに関与する細胞内ＲＮアーゼであるダイサーと類似の配列特異性を有する。この短い２２ヌクレオチドｄｓＲＮＡ分子は次に、配列特異的遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の活性構成要素を形成する。一本鎖特異的ＲＮアーゼでの消化は、１００ヌクレオチド未満の分子量分布を持つｄｓＲＮＡ種の集積を引き起こす（図４、左のパネル）。
【０１４８】
配列特異的ＲＮＡ仲介性サイレンシングは、ターゲット遺伝子の選択的サイレンシングのため、ＤＣで見られ、そして適用に成功している、進化的に保存された機構である（Ｌａｄｅｒａｃｈら、２００３）。したがって、巨大ｄｓＲＮＡを含有するＲＮＡをトランスフェクションした後、ＤＣで形成される小さいｄｓＲＮＡは、ＲＩＳＣ形成を導き、そしてＤＣ機能表現型に不都合に影響を及ぼしうる。
【０１４９】
二本鎖種を含有するＲＮＡのトランスフェクションが、負の影響を導くかどうかを決定することを目的とした実験において、単一ドナー由来のＤＣを生成し、そして次いで未成熟ＤＣを２つの実験群に分けた。元来の方法または本明細書に開示する新規方法を用いて、同じ出発総ＲＮＡから増幅したＲＮＡ、そしてしたがって、それぞれｄｓＲＮＡを含有するおよびｄｓＲＮＡを含有しないＲＮＡを、各実験群に並列してトランスフェクションした。３人の別個のドナーにおいて、研究を行った。この研究の結果によって、ｄｓＲＮＡ種を含有しないＲＮＡのトランスフェクションは、より高い細胞収量を生じることが立証された。２つのＲＮＡ集団の唯一の相違は、ｄｓＲＮＡが存在するかまたは存在しないかだけであるため、元来のプロトコルを用いて増幅したＲＮＡをトランスフェクションした実験群において、収量が減少したのは、ｄｓＲＮＡの存在のためであると結論付けることも可能である。これは、ｄｓＲＮＡがＤＣに対して有害な影響を導きうるという、本明細書に論じる予測と一致する。しかし、いずれかのＲＮＡ集団をトランスフェクションした生存回収細胞は、表現型にいかなる相違も示さなかった。
【０１５０】
本明細書に示すデータは、明らかに、そして驚くべきことに、二本鎖種を含まない、増幅したＲＮＡが、より高い細胞回収を生じることを立証する。したがって、本明細書に開示する新規プロトコルおよびオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて増幅したＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、予期せぬことに、成熟した自家性ＲＮＡトランスフェクション細胞の収量が増加し、これは患者ワクチン接種のために生成される用量の数に正比例する（表２）。細胞回収の増加は、したがって、ワクチン製造のコストを減少させ、そして延長された患者ワクチン接種を可能にし、これはこれまでに知られる方法に勝る、重要な利点である。
【０１５１】
参考文献
【０１５２】
【化４−１】
【０１５３】
【化４−２】
【０１５４】
【化４−３】
【０１５５】
【化４−４】
【０１５６】
【化４−５】
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、増幅プロセスの略図を示す。図１Ａは、慣用的増幅法を示す。概略図は、ｃＤＮＡの３’端および５’端を定義するオリゴヌクレオチド中に存在する重複配列が、Ｔ７含有プライマー下流でのアニーリングを導き、そしてその結果、アンチセンス配向で転写されるＲＮＡ種の形成を導くことを示す。図１Ｂは、アンチセンスＲＮＡ産生の問題に取り組む、本明細書に開示する増幅法を示す。
【図２】図２は、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに相補的なユビキチン・プローブを用いて、総ＲＮＡ試料（Ｔ）、並びに慣用的プライマーおよびプロセスを用いて増幅した試料（Ａ）に対して行った、ノーザンブロット分析を示すオートラジオグラフのデジタル画像である。等量の各ＲＮＡ（１０μｇ）を各レーンに装填した。ゲルは、ユビキチンのアンチセンスＲＮＡが、増幅したＲＮＡ集団に存在することを示す。
【図３】図３は、５’端および３’端プライマーの間の配列相同性を除去して、アンチセンスＲＮＡの形成をブロッキングした場合のノーザンブロット分析を示すオートラジオグラフのデジタル画像である。ＳＫ−Ｍｅｌ２８ ＲＮＡまたはヒト腫瘍ＲＮＡから増幅した試料に対して、ノーザンブロット分析を行った。慣用的な増幅法を用いて（レーン１）または本明細書に開示する主題を用いて（レーン２）、ＲＮＡを増幅した。センス・ユビキチンＲＮＡまたはアンチセンス・ユビキチンＲＮＡを認識するプローブを用いて、ノーザンブロット分析を行った。
【図４】図４は、慣用的プライマー（ＣＤＳ６４Ｔ）を用いて増幅したＲＮＡが、二本鎖ＲＮＡを含有することを示す。ＲＮアーゼ消化前および消化後のＲＮＡ試料の電気泳動図。増幅したＲＮＡ集団を、一本鎖ＲＮＡに特異的なＲＮアーゼ（Ｔ１）で、またはさらに二本鎖ＲＮＡを認識するＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＩＩＩ）で消化した。左のパネルは、慣用的ＣＤＳ６４Ｔオリゴを用いて増幅したＲＮＡを示し、そして右のパネルは、本明細書に開示する主題のＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴを用いて増幅したＲＮＡを示す。
【図５】図５は、マイクロアレイ１対マイクロアレイ３の色素フリップ（ｄｙｅ ｆｌｉｐ）である。すべての色素フリップ比較で、同一データが得られた。
【図６】図６は、異なるＲＮＡをトランスフェクションした樹状細胞のスキャッターフロープロット分析である。未成熟樹状細胞（左のパネル）に、慣用的ＣＤＳ ６４Ｔオリゴ（中央パネル）または新規ＣＤＳ ６４Ｔ＋オリゴ（右のパネル）を用いて増幅したＬＮＣａＰ細胞株由来のＲＮＡを、１００万細胞あたり２μｇトランスフェクションした。Ｄ０３−０１７実験ゲートＲ１は、ＤＣを含有する生存巨大細胞集団の輪郭を描く。右下隅の数字は、試料に存在する巨大生存細胞のパーセントを示す。
【図７】図７は、ＲＮＡの２集団をトランスフェクションした成熟ＤＣの表現型が異ならないことを示すグラフである。未成熟樹状細胞を第６日に採取し、そして：１）慣用的増幅法（ｄｓＲＮＡ存在）；２）本明細書に開示する主題（ｄｓＲＮＡはまったく存在しない）；または３）対照としてのＧＦＰ ＲＮＡを用いて増幅したＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。細胞を馴化培地に戻して一晩成熟させ、そして表現型マーカー発現に関して分析した：ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ１４。Ｙ軸は、分析した各マーカーの陽性細胞パーセントを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原提示細胞に少なくとも１つのｍＲＮＡをトランスフェクションする方法であって：
（ａ）アンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠き、そして少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含む調製物を：
（ｉ）試料から少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅して、ポリヌクレオチド・テンプレートを産生し、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、該ポリヌクレオチド・テンプレートのセンス鎖のみに機能可能であるように連結された、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む；そして
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド・テンプレートをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを産生する、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、クローニングされたテンプレートではない
ことによって、調製し；そして
（ｂ）少なくとも１つの抗原提示細胞に、調製物由来の少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡをトランスフェクションする
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
試料中のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来である、請求項１の方法。
【請求項３】
細胞が、癌細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
癌細胞が、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、および芽腫からなる群より選択される癌に由来する、請求項３の方法。
【請求項５】
微生物細胞が、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、およびトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項６】
ビリオンが、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスからなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが抗原をコードし、そして該抗原が、少なくとも１つのトランスフェクションされた抗原提示細胞によって、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡから翻訳される、請求項１の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのトランスフェクションされた抗原提示細胞が、発現された抗原を提示する、請求項７の方法。
【請求項９】
試料由来の少なくとも１つのｍＲＮＡが複数のｍＲＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１０】
複数のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の総ｍＲＮＡ集団を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
複数のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の総ｍＲＮＡ集団の選択される分画を含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、総ｍＲＮＡ集団の選択される分画を選択する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
総ｍＲＮＡ集団の選択される分画が癌細胞に由来し、そして選択される分画が癌細胞に特有の抗原をコードするｍＲＮＡを含む、請求項１１の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法であって、試料からのｍＲＮＡの増幅が：
（ａ）試料からｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド・テンプレートを産生し；そして
（ｂ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡを増幅する、ここで第一のプライマーおよび第二のプライマーの一方のみが、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを挿入する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写が、プロモーターに特異的なポリメラーゼを用いて、ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡをセンス配向ｍＲＮＡにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することを含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
第一のプライマーおよび第二のプライマーが、互いに配列相同性を本質的に共有しない、請求項１４の方法。
【請求項１８】
第一のプライマーが、ポリＴストレッチ、および第二のプライマーに配列相同性を本質的に持たない５’配列を含み、そして第二のプライマーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
第一のプライマーが、配列番号２の配列を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
エレクトロポレーション、ナノ粒子仲介性トランスフェクション、ペプチド仲介性トランスフェクションおよびリポフェクションからなる群より選択される方法を用いて、トランスフェクションを達成する、請求項１の方法。
【請求項２１】
抗原提示細胞が、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項２２】
樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
樹状細胞が成熟樹状細胞である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
トランスフェクションがｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１の方法。
【請求項２５】
トランスフェクションがｉｎ ｓｉｔｕである、請求項１の方法。
【請求項２６】
請求項１の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２７】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２８】
請求項２の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２９】
請求項３の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３０】
請求項４の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３１】
請求項５の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３２】
請求項６の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３３】
キャリアー中に、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つの抗原に対して、被験者において免疫応答を生じる方法であって、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞を被験者に導入することを含み、ここでｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞は、被験者の免疫系に少なくとも１つの抗原を提示し、それによって少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を生じる、前記方法。
【請求項３５】
ｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の少なくとも１つの抗原をコードする、請求項３４の方法。
【請求項３６】
細胞が、癌細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
癌細胞が、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、および芽腫からなる群より選択される癌に由来する、請求項３６の方法。
【請求項３８】
微生物細胞が、ヘリコバクター属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、エンテロバクター属種、カンピロバクター属種、マイコバクテリウム属種、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ属種、レプトスピラ・インテロガンス、ブドウ球菌属種、連鎖球菌属種、クロストリジウム属種、カンジダ・アルビカンス、プラスモディウム属種、リーシュマニア属種、およびトリパノソーマ属種からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３９】
ビリオンが、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスからなる群より選択される、請求項３５の方法。
【請求項４０】
試料由来の少なくとも１つのｍＲＮＡが複数のｍＲＮＡである、請求項３４の方法。
【請求項４１】
抗原提示細胞が、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項４２】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
抗原提示細胞が未成熟樹状細胞である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
抗原提示細胞が成熟樹状細胞である、請求項４２の方法。
【請求項４５】
抗原提示細胞が、被験者から得たかまたは被験者に由来する、自家性抗原提示細胞である、請求項４４の方法。
【請求項１】
抗原提示細胞に少なくとも１つのｍＲＮＡをトランスフェクションする方法であって：
（ａ）アンチセンス配向ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡを本質的に欠き、そして少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを含む調製物を：
（ｉ）試料から少なくとも１つのｍＲＮＡを増幅して、ポリヌクレオチド・テンプレートを産生し、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、該ポリヌクレオチド・テンプレートのセンス鎖のみに機能可能であるように連結された、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む；そして
（ｉｉ）該ポリヌクレオチド・テンプレートをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写して、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡを産生する、ここで該ポリヌクレオチド・テンプレートは、クローニングされたテンプレートではない
ことによって、調製し；そして
（ｂ）少なくとも１つの抗原提示細胞に、調製物由来の少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡをトランスフェクションする
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
試料中のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来である、請求項１の方法。
【請求項３】
細胞が、癌細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
癌細胞が、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、および芽腫からなる群より選択される癌に由来する、請求項３の方法。
【請求項５】
微生物細胞が、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、およびトリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）種からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項６】
ビリオンが、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスからなる群より選択される、請求項２の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡが抗原をコードし、そして該抗原が、少なくとも１つのトランスフェクションされた抗原提示細胞によって、少なくとも１つのセンス配向ｍＲＮＡから翻訳される、請求項１の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのトランスフェクションされた抗原提示細胞が、発現された抗原を提示する、請求項７の方法。
【請求項９】
試料由来の少なくとも１つのｍＲＮＡが複数のｍＲＮＡである、請求項１の方法。
【請求項１０】
複数のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の総ｍＲＮＡ集団を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
複数のｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の総ｍＲＮＡ集団の選択される分画を含む、請求項９の方法。
【請求項１２】
サブトラクティブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、総ｍＲＮＡ集団の選択される分画を選択する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
総ｍＲＮＡ集団の選択される分画が癌細胞に由来し、そして選択される分画が癌細胞に特有の抗原をコードするｍＲＮＡを含む、請求項１１の方法。
【請求項１４】
請求項１の方法であって、試料からのｍＲＮＡの増幅が：
（ａ）試料からｍＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡを含むポリヌクレオチド・テンプレートを産生し；そして
（ｂ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡを増幅する、ここで第一のプライマーおよび第二のプライマーの一方のみが、該ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを挿入する
ことを含む、前記方法。
【請求項１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写が、プロモーターに特異的なポリメラーゼを用いて、ポリヌクレオチド・テンプレートｃＤＮＡをセンス配向ｍＲＮＡにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写することを含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
ポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１５の方法。
【請求項１７】
第一のプライマーおよび第二のプライマーが、互いに配列相同性を本質的に共有しない、請求項１４の方法。
【請求項１８】
第一のプライマーが、ポリＴストレッチ、および第二のプライマーに配列相同性を本質的に持たない５’配列を含み、そして第二のプライマーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適したプロモーターを含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
第一のプライマーが、配列番号２の配列を含む、請求項１８の方法。
【請求項２０】
エレクトロポレーション、ナノ粒子仲介性トランスフェクション、ペプチド仲介性トランスフェクションおよびリポフェクションからなる群より選択される方法を用いて、トランスフェクションを達成する、請求項１の方法。
【請求項２１】
抗原提示細胞が、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項２２】
樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
樹状細胞が成熟樹状細胞である、請求項２１の方法。
【請求項２４】
トランスフェクションがｉｎ ｖｉｔｒｏである、請求項１の方法。
【請求項２５】
トランスフェクションがｉｎ ｓｉｔｕである、請求項１の方法。
【請求項２６】
請求項１の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２７】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２８】
請求項２の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項２９】
請求項３の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３０】
請求項４の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３１】
請求項５の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３２】
請求項６の方法によって産生される、ｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞。
【請求項３３】
キャリアー中に、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つの抗原に対して、被験者において免疫応答を生じる方法であって、請求項２６のｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞を被験者に導入することを含み、ここでｍＲＮＡが装填された抗原提示細胞は、被験者の免疫系に少なくとも１つの抗原を提示し、それによって少なくとも１つの抗原に対する免疫応答を生じる、前記方法。
【請求項３５】
ｍＲＮＡが、細胞またはビリオン由来の少なくとも１つの抗原をコードする、請求項３４の方法。
【請求項３６】
細胞が、癌細胞および微生物細胞からなる群より選択される、請求項３５の方法。
【請求項３７】
癌細胞が、血液学的悪性腫瘍、腎細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺腫、肉腫、癌腫、および芽腫からなる群より選択される癌に由来する、請求項３６の方法。
【請求項３８】
微生物細胞が、ヘリコバクター属種、サルモネラ属種、赤痢菌属種、エンテロバクター属種、カンピロバクター属種、マイコバクテリウム属種、炭疽菌、ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ属種、レプトスピラ・インテロガンス、ブドウ球菌属種、連鎖球菌属種、クロストリジウム属種、カンジダ・アルビカンス、プラスモディウム属種、リーシュマニア属種、およびトリパノソーマ属種からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３９】
ビリオンが、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、インフルエンザウイルス、コロナウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、および風疹ウイルスからなる群より選択される、請求項３５の方法。
【請求項４０】
試料由来の少なくとも１つのｍＲＮＡが複数のｍＲＮＡである、請求項３４の方法。
【請求項４１】
抗原提示細胞が、樹状細胞およびマクロファージからなる群より選択される、請求項３４の方法。
【請求項４２】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４１の方法。
【請求項４３】
抗原提示細胞が未成熟樹状細胞である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
抗原提示細胞が成熟樹状細胞である、請求項４２の方法。
【請求項４５】
抗原提示細胞が、被験者から得たかまたは被験者に由来する、自家性抗原提示細胞である、請求項４４の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２００７−５１２０３０（Ｐ２００７−５１２０３０Ａ）
【公表日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５４１７０４（Ｐ２００６−５４１７０４）
【出願日】平成１６年１１月２４日（２００４．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１２８
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０６１７５７８１）アルゴス・セラピューティクス・インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月２４日（２００４．１１．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３９５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５２１２８
【国際公開日】平成１７年６月９日（２００５．６．９）
【出願人】（５０６１７５７８１）アルゴス・セラピューティクス・インコーポレーテッド (5)
【Ｆターム（参考）】
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