ｓｉＲＮＡ発現ベクター及びそれを用いて作製したＰＩＭＴ発現抑制株
【課題】 癲癇の発症機構だけでなく老化に関わる様々な障害に関する多くの知見を得るために有用なＰＩＭＴ発現抑制真核細胞株の提供を目的とする。
【解決手段】プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター及びこれを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
【解決手段】プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター及びこれを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター及びそれを用いて作製したＰＩＭＴ発現抑制株に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質において、アスパラギンやアスパラギン酸残基は、異性化やラセミ化を非常に起こしやすく、その劣化に伴いＬ−イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）残基およびＤ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）残基が生じることが知られている。プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）は、これらの異性化したアスパラギン酸残基を特異的に認識し、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からｉｓｏＡｓｐあるいはＤ−Ａｓｐへメチル基転移を行い、Ｌ−Ａｓｐへの修復反応を促進する酵素であり、種々の動物の血液細胞や脳組織などから分離され同定されている。
【０００３】
従来、ＰＩＭＴノックアウトマウスが、生後６週齢ほどで癲癇性の発作を起こし死亡することが知られている(非特許文献１：Kim E. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 6132, 1997；非特許文献２：Yamamoto A. et al. J.Neurosci., 18, 2063, 1998)。また、癲癇患者の海馬中ではＰＩＭＴの酵素量が約５０％程度まで低下していること、さらに細胞レベルでの解析において、ＰＩＭＴを高発現させると細胞死誘導因子であるＢａｘを介したアポトーシスの誘導が抑制されることが報告されている。また、ＰＩＭＴノックアウト大腸菌が熱や過酸化水素に対して高い感受性を示す報告もある。
【０００４】
上記の報告例から、ＰＩＭＴの欠損は、生体内において老化あるいはストレスにより異性化等の変性を受けた蛋白質の蓄積を生じ、その結果、細胞機能に障害をもたらすものと考えられる。この点から、老化などに伴い自発的に生じる蛋白質中のアスパラギン酸残基の異性化ないしラセミ化と蛋白質修復系酵素としてのＰＩＭＴの重要性が注目されているが、ＰＩＭＴ欠損により生じる障害の発症機構については、殆ど明らかになっていないのが現状である。
【０００５】
このため、タンパク質の異性化とＰＩＭＴによるその修復機構が、生物学的及び病理学的にどのような意義を持っているのかについて解明が求められているが、現在までに、報告例があるのは、ＰＩＭＴノックアウトマウス（上記非特許文献１、２等）、大腸菌（非特許文献３：Li C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 15;89(20):9885-9）、及びショウジョウバエ（非特許文献４：Chavous DA. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18;98(26):14814-8. Epub 2001 Dec 11）等、個体レベルでの知見に限られており、細胞レベルにおける研究はほとんど進んでいないのが現状である。
【０００６】
【非特許文献１】Kim E., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 6132, 1997
【非特許文献２】Yamamoto A., et al. J.Neurosci., 18, 2063, 1998
【非特許文献３】Li C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 15;89(20):9885-9
【非特許文献４】Chavous DA. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18;98(26):14814-8. Epub 2001 Dec 11
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癲癇の発症機構だけでなく老化に関わる様々な障害に関する多くの知見を得るために有用なＰＩＭＴ発現抑制真核細胞株を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＩＭＴｍＲＮＡの特異的な分解を可能にするｓｉＲＮＡ発現系（以下、ＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクターという。）を構築し、それを用いてＰＩＭＴ発現抑制細胞株の樹立することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクター及びそれを用いたＰＩＭＴ発現抑制細胞株を提供する。
１．プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター。
２．配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記１に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
３．配列番号１と配列番号２の塩基配列がループ形成配列で連結された塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記２に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
４．配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記３に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
５．プロモーターがＨ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである前記２〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
６．プロモーターがＨ１プロモーターである前記５に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
７．ベクターが哺乳類細胞発現用ベクターである前記１〜６のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
８．哺乳類細胞発現用ベクターがＣＭＶプロモーターを除去したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターである前記７に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
９．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
１０．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した哺乳類動物細胞。
１１．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト細胞。
１２．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
１３．平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来、ほとんど研究の進んでいないの細胞レベルにおけるＰＩＭＴの研究が可能になる。このため、本発明のベクターを用いて形質転換した細胞株は、癲癇の発症機構だけでなく老化に関わる様々な障害に関する多くの研究で有用であると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクター
以下、ＰＩＭＴｍＲＮＡのサイレンシングを行なうためのｓｉＲＮＡ発現ベクターについて説明する。
一般に、ｓｉＲＮＡを発現系はタンデムタイプとステムループタイプ（ヘアピンタイプ）の２種類に大別されるが、いずれの場合にも、Ｕ６ＲＮＡあるいはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼIII（ＰｏｌIII）系によってｓｉＲＮＡが転写される。
【００１２】
タンデムタイプは２つのＵ６（またはＨ１）プロモーターを有し、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡがそれぞれ独立に転写される。転写されたセンス及びアンチセンスＲＮＡは、細胞内でｄｓＲＮＡを形成し、ｓｉＲＮＡとして働く。ＰｏｌIII系は転写終了後におよそ４つのＵを付加するため、この系で作られたｓｉＲＮＡは３’側に４つのＵを持つことになるが、２つのオーバーハングを持つ野生型のｓｉＲＮＡと比較して細胞培養系での活性にほとんど差がない。
【００１３】
一方、ステムループタイプは１つのプロモーターを有し、その下流にセンス鎖とアンチセンス鎖とをループでつないだ構造を有する。これより転写されたステムループＲＮＡ構造を有するＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）などによりプロセシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
いずれの場合にも、産生されたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ内でセンサーとしての役割を果たし、その配列と相補的な配列を持つＲＮＡをターゲットとして認識する。その後、未だ同定されていないＲＩＳＣ内のエンドリボヌクレアーゼによってターゲットＲＮＡが切断される。
【００１４】
本発明のＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクターではいずれのタイプも用いることができるが、一般的にｓｉＲＮＡでは、プラスミドの濃度が低い場合にはステムループタイプの方がより高い抑制効果を示すことが知られており、また、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｓｉＲＮＡとなるが、この場合、ＲＩＳＣに取り込まれやすくなることを示唆する報告もあることから、ステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現系がより好ましい。
【００１５】
また、前述の通り、ｓｉＲＮＡ発現ベクターにはＵ６プロモーターとＨ１プロモーターが利用可能である。これらは、それぞれ低分子核内ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）（Ｕ６）とヒトＲＮアーゼＰ（ｈｕｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ）ＲＮＡ Ｈ１のプロモーターであり、ＰｏｌIII転写系のＴｙｐｅIIIに属する。ＴｙｐｅIIIのプロモーターには転写に必要な保存された配列として、近位配列要素（ＰＳＥ：ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｓｔａｆ−結合サイト、遠位配列要素（ＤＳＥ：ｄｉｓｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、及びＴＡＴＡボックスが存在する。Ｈ１プロモーターにおいてはこれらの配列が約１００ｂｐ以内にあるため、このプロモーターを用いた場合にはコンパクトな構築が可能である。このため、Ｈ１プロモーターを用いてｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することが好ましい。
【００１６】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子の抑制効果は、ターゲットサイトに非常に依存的であることが知られている。特に、安定発現細胞を作成する場合には、導入するｓｉＲＮＡ発現ユニットのコピー数が少ないため、効果の高いターゲットサイトの選択が特に重要である。野生型Ｈ１プロモーターの転写開始がＡであることから、このプロモーターの転写開始はプリン塩基であることが望ましいとされている。また、ＰｏｌIII系によって転写されるＲＮＡは最後に約４個のＵが付加されることから、配列を認識するアンチセンス鎖の最後にＵＵＵＵが付加されるため、ターゲットサイトの転写開始点に相当する塩基の前の２つはＡＡである方が良い。
【００１７】
本発明者らは、その他の様々な要素を考慮して、ヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）から配列番号１の配列を選択した。
従って、本発明の好適実施態様は、配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなるＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクターを含み、特にこれら（配列番号１と配列番号２の塩基配列）がループ形成配列で連結されたステム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターを含む。ステム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおけるループ配列は限定されないが、少なくとも４以上、好ましくは７またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
従って、本発明のより好適な実施態様では、ＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクターは配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含む。
【００１８】
上述の通り、プロモーターは、通常、Ｈ１プロモーターまたはＵ６プロモーターであり、Ｈ１プロモーターが好ましい。
ｓｉＲＮＡを発現させるために好適なベクターは、一般にプラスミドであり、本発明の目的に従って、ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡ及び前記プロモーター配列を導入可能なものであれば特に限定されず、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１（−）等が挙げられる。なお、薬剤耐性遺伝子や制限酵素部位は特に限定されないのでその他、種々のプラスミドが利用可能である。但し、不要なプロモーター配列は除去する必要がある。また、ｐＨ１やｐＵ６等のベクターは市販されており、これらを用いてもよい。
【００１９】
形質転換細胞
上記ベクターを導入することにより、ＰＩＭＴのｍＲＮＡが破壊されるため、ＰＩＭＴ遺伝子のサイレンシングが実現できる。
ベクターを導入する宿主細胞は、プロモーターの種類にもよるが、哺乳類細胞が好ましく、より好ましくは、マウスもしくはラット等の齧歯類または他の動物（例えば、ヤギもしくはウシのような他の哺乳動物または鳥類）、霊長類及び非霊長類等に由来する細胞である。
【００２０】
前記Ｈ１プロモーターを用いる場合はヒト細胞が好ましいが、哺乳類細胞であれば利用可能である。ヒト細胞としては形質転換細胞が安定に培養できるものであれば特に限定されず、例えば、リンパ球、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞であることが可能である。好ましい細胞の例としては、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＡＣＯ−２、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＰ−１等が挙げられる。
【００２１】
本発明では、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）からＣＭＶプロモーターを除去し、そのマルチクローニングサイトに配列番号３の塩基配列及びＨ１プロモーターを含む配列を導入し、ＰＩＭＴ発現抑制真核細胞株（平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された。）を得ることに成功した。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。
【００２３】
実施例１
（１）Ｈ１プロモーターの作製
Ｈ１プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングし、プラスミドＨ１ｐｒｏ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を構築した。ＰＣＲで用いたプライマーは以下の通りである。なお、順方向プライマーの５’末端にはＢａｍＨＩの認識配（ＧＧＡＴＣＣ）が付加されている。それぞれのプライマー間における相補配列を下線で示した。このＰＣＲ反応においては、各プライマー内に相補配列が存在するため、互いを鋳型とした伸張反応が起こる。
Ｈ１ ｐｒｏ−Ｆ（順方向プライマー（配列番号４））
5'-aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttg-3'
Ｈ１ ｐｒｏ−Ｒ（逆方向プライマー（配列番号５））
5'-ggatccgagtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcac-3'
【００２４】
（２）ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの構築
プラスミドＨ１ｐｒｏ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の制限酵素処理（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）によりＨ１プロモーター配列を含む１００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片を哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（図１参照）のマルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部分と置換することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏを得た。次に、ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏのＣＭＶプロモーター配列を含むＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片を制限酵素処理により除去し、クレノー断片処理による末端の平滑化反応の後、ライゲーション反応を行い、プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）を構築した（図２）。
【００２５】
ｓｉＲＮＡ発現配列を含む配列（ｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｆ及びｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｒ）を合成し、二本鎖をアニールした後にＴ４キナーゼによる５’末端のリン酸化処理を行った。これをｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）のＢａｍＨＩ−ＨＩｎｄIII部分と置換することにより、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドｈＰＩＭＴｓi／ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）を構築した（図２）。なお、ｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−ＦとｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｒはアニール後、それぞれの末端がＢａｍＨＩ及びＨＩｎｄIIIによる制限酵素処理後の突出末端と同じ配列になるようにデザインした。
【００２６】
実施例２
（１）ヒト胎児腎由来培養細胞株の樹立
ヒト胎児腎由来培養細胞株（ＨＥＫ２９３）は、終濃度１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。
２０％コンフルエントな状態になるように６ウェルプレートに前記細胞を播種した。翌日、ＴｒａｎｓＩＴ２９３を用いたリポフェクション法により、１ウェルにつき２．５μｇのＤＮＡを導入した。ＤＮＡの導入は、ＴｒａｎｓＩＴ２９３のプロトコールに従い、以下の手順で行った。ＴｒａｎｓＩＴ２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ社製）５μｌと血清を含まないＤＭＥＭ １２５μｌを混合し、この混合液にｓｉＲＮＡ発現プラスミドｈＰＩＭＴｓｉ／ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）２．５μｇまたは空ベクターｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）２．５μｇを加え、優しく混和し、室温で５分反応後、培地中に添加した。２４〜４８時間培養後Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ７９８２）を加えた選択培地中にて培養し、形成されたコロニーを拾い培養することにより樹立した。
【００２７】
（２）ＲＮＡの抽出及びノーザンブロット
１０ｃｍディッシュで１００％コンフルエントな状態にまで培養した細胞より、ＩＳＯＧＥＮを用いたＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により全ＲＮＡを調製した。
全ＲＮＡをＭＭＦバッファー（０.０２ＭＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、２５％ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド）に溶解し、６５℃、１５分の反応によりＲＮＡの高次構造を変性した後、直ちに氷上にて急冷した。変性アガロースゲル（０.０２ＭＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１８％ホルムアルデヒド、１％（ｗ／ｖ）アガロースＭＥ）を用いて、２０μｇ／レーンの全ＲＮＡを１００Ｖで２時間電気泳動した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色液（１μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド、５０ｍＭ水酸化ナトリウム）及び中和・脱色液（２００ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ４.０）に連続的に浸透した後、ゲル内のＲＮを１０×ＳＳＣ（１６７ｍＭクエン酸ナトリウム、１６７ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７.０）中にてナイロントランスファーメンブレンＮｉｔｒａｎＮに毛細管現象により転写した。これを２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で洗浄した後、自然乾燥に引き続くＵＶクロスリンカーを用いた０.１２０Ｊｕｌｅ／ｃｍ2のＵＶ照射により、転写されたＲＮＡをメンブレンに固定した。
【００２８】
ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｇｒａｎｕｌｅｓ中での６８℃、１時間の振とうによりプレハイブリダイゼーションを行った後、終濃度１００ｎｇ／ｍＬのアルカリ感受性ジゴキシゲニン標識ｈＰＩＭＴ ＲＮＡをプローブとして添加したＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｇｒａｎｕｌｅｓ中での６８℃、一晩の振とうによりハイブリダイゼーションを行った。洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ）を用いて室温で５分の洗浄を３回行い、さらに洗浄バッファー２（０.１×ＳＳＣ；ｐＨ７.０、０.１％ＳＤＳ）を用いて６８℃で１５分の洗浄を３回行った。次に、マレイン酸バッファー（０.１Ｍマレイン酸、０.１５Ｍ 塩化ナトリウム；ｐＨ７.５）に１分間浸し、これをブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎをマレイン酸バッファーで１／１０に希釈した溶液）を用いて室温で３０分間ブロッキングした後、抗体溶液（７５０Ｕ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識羊由来抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメントをブロッキングバッファーで１／１０，０００に希釈した溶液）中で室温３０分間反応させた。洗浄バッファー３（０.３％Ｔｗｅｅｎ２０、０.１Ｍマレイン酸、０.１５Ｍ塩化ナトリウム；ｐＨ７.５）で１５分の洗浄を３回行い、アルカリバッファー（０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭＮａＣｌ；ｐＨ９.５）に２分間浸とうした。その後、アルカリフォスファターゼの化学発光基質であるＣＳＰＤとの反応後に、Ｘ線フィルムを用いて、プローブと反応するバンドを検出した。
【００２９】
結果を図３に示す。なお、図３においてＮＴ ＨＥＫは、本発明の発現ベクターをトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞による結果であり、Ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒはＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（空ベクター）を導入したＨＥＫ２９３細胞（対照）による結果である。これらの例も２０μｇ／レーンの全ＲＮＡを含む。対照でも、ベクターの導入操作を行っていないＨＥＫ２９３細胞と同等な量のＰＩＭＴｍＲＮＡが確認されており、本発明の細胞株によるＰＩＭＴｍＲＮＡの著しい減少はＲＮＡｉの結果であることがわかる。
また、細胞を遠心分画し、抗ＰＩＭＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、細胞質画分においてＰＩＭＴタンパク質の発現減少が確認された（図４）。
【００３０】
以上の結果から、本発明によれば、ｓｉＲＮＡによってＰＩＭＴ発現の抑制された細胞株が得られることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明で用いるｐｃＤＮＡ3.1（＋）の遺伝子マップを示す図である。
【図２】本発明で用いるｐｃＤＮＡ3.1（＋）への導入及び発現後のステム型ｓｉＲＮＡを示す模式図である。
【図３】野生型ＨＥＫ２９３細胞（図中：ＮＴ ＨＥＫ）、ＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（図中：対照）、本発明によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞（図中：ｓｉＲＮＡ。２回の結果を示す）におけるヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）、ＧＡＰＤＨ（結果を正規化するため）、各ｒＲＮＡのノーザンブロッティングの結果を示す写真。
【図４】図３と同様の実験において、野生型ＨＥＫ２９３細胞（図中：ＮＴ ＨＥＫ）、ＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（図中：ＥＶ）、本発明によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞（図中：ｓｉＲＮＡ。２回の結果を示す）におけるヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）、ＧＡＰＤＨ（結果を正規化するため）の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏ）の各画分についてのノーザンブロッティングの結果を示す写真。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター及びそれを用いて作製したＰＩＭＴ発現抑制株に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質において、アスパラギンやアスパラギン酸残基は、異性化やラセミ化を非常に起こしやすく、その劣化に伴いＬ−イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）残基およびＤ−アスパラギン酸（Ｄ−Ａｓｐ）残基が生じることが知られている。プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ）は、これらの異性化したアスパラギン酸残基を特異的に認識し、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からｉｓｏＡｓｐあるいはＤ−Ａｓｐへメチル基転移を行い、Ｌ−Ａｓｐへの修復反応を促進する酵素であり、種々の動物の血液細胞や脳組織などから分離され同定されている。
【０００３】
従来、ＰＩＭＴノックアウトマウスが、生後６週齢ほどで癲癇性の発作を起こし死亡することが知られている(非特許文献１：Kim E. et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 6132, 1997；非特許文献２：Yamamoto A. et al. J.Neurosci., 18, 2063, 1998)。また、癲癇患者の海馬中ではＰＩＭＴの酵素量が約５０％程度まで低下していること、さらに細胞レベルでの解析において、ＰＩＭＴを高発現させると細胞死誘導因子であるＢａｘを介したアポトーシスの誘導が抑制されることが報告されている。また、ＰＩＭＴノックアウト大腸菌が熱や過酸化水素に対して高い感受性を示す報告もある。
【０００４】
上記の報告例から、ＰＩＭＴの欠損は、生体内において老化あるいはストレスにより異性化等の変性を受けた蛋白質の蓄積を生じ、その結果、細胞機能に障害をもたらすものと考えられる。この点から、老化などに伴い自発的に生じる蛋白質中のアスパラギン酸残基の異性化ないしラセミ化と蛋白質修復系酵素としてのＰＩＭＴの重要性が注目されているが、ＰＩＭＴ欠損により生じる障害の発症機構については、殆ど明らかになっていないのが現状である。
【０００５】
このため、タンパク質の異性化とＰＩＭＴによるその修復機構が、生物学的及び病理学的にどのような意義を持っているのかについて解明が求められているが、現在までに、報告例があるのは、ＰＩＭＴノックアウトマウス（上記非特許文献１、２等）、大腸菌（非特許文献３：Li C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 15;89(20):9885-9）、及びショウジョウバエ（非特許文献４：Chavous DA. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18;98(26):14814-8. Epub 2001 Dec 11）等、個体レベルでの知見に限られており、細胞レベルにおける研究はほとんど進んでいないのが現状である。
【０００６】
【非特許文献１】Kim E., et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 94, 6132, 1997
【非特許文献２】Yamamoto A., et al. J.Neurosci., 18, 2063, 1998
【非特許文献３】Li C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 15;89(20):9885-9
【非特許文献４】Chavous DA. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Dec 18;98(26):14814-8. Epub 2001 Dec 11
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、癲癇の発症機構だけでなく老化に関わる様々な障害に関する多くの知見を得るために有用なＰＩＭＴ発現抑制真核細胞株を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＰＩＭＴｍＲＮＡの特異的な分解を可能にするｓｉＲＮＡ発現系（以下、ＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクターという。）を構築し、それを用いてＰＩＭＴ発現抑制細胞株の樹立することに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクター及びそれを用いたＰＩＭＴ発現抑制細胞株を提供する。
１．プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoaspartyl/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター。
２．配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記１に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
３．配列番号１と配列番号２の塩基配列がループ形成配列で連結された塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記２に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
４．配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる前記３に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
５．プロモーターがＨ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである前記２〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
６．プロモーターがＨ１プロモーターである前記５に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
７．ベクターが哺乳類細胞発現用ベクターである前記１〜６のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
８．哺乳類細胞発現用ベクターがＣＭＶプロモーターを除去したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターである前記７に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
９．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
１０．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した哺乳類動物細胞。
１１．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト細胞。
１２．前記１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
１３．平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来、ほとんど研究の進んでいないの細胞レベルにおけるＰＩＭＴの研究が可能になる。このため、本発明のベクターを用いて形質転換した細胞株は、癲癇の発症機構だけでなく老化に関わる様々な障害に関する多くの研究で有用であると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクター
以下、ＰＩＭＴｍＲＮＡのサイレンシングを行なうためのｓｉＲＮＡ発現ベクターについて説明する。
一般に、ｓｉＲＮＡを発現系はタンデムタイプとステムループタイプ（ヘアピンタイプ）の２種類に大別されるが、いずれの場合にも、Ｕ６ＲＮＡあるいはＨ１ＲＮＡの転写系であるＲＮＡポリメラーゼIII（ＰｏｌIII）系によってｓｉＲＮＡが転写される。
【００１２】
タンデムタイプは２つのＵ６（またはＨ１）プロモーターを有し、センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡがそれぞれ独立に転写される。転写されたセンス及びアンチセンスＲＮＡは、細胞内でｄｓＲＮＡを形成し、ｓｉＲＮＡとして働く。ＰｏｌIII系は転写終了後におよそ４つのＵを付加するため、この系で作られたｓｉＲＮＡは３’側に４つのＵを持つことになるが、２つのオーバーハングを持つ野生型のｓｉＲＮＡと比較して細胞培養系での活性にほとんど差がない。
【００１３】
一方、ステムループタイプは１つのプロモーターを有し、その下流にセンス鎖とアンチセンス鎖とをループでつないだ構造を有する。これより転写されたステムループＲＮＡ構造を有するＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ：ｓｈＲＮＡ）はダイサー（Ｄｉｃｅｒ）などによりプロセシングを受け、ｓｉＲＮＡが産生される。
いずれの場合にも、産生されたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ内でセンサーとしての役割を果たし、その配列と相補的な配列を持つＲＮＡをターゲットとして認識する。その後、未だ同定されていないＲＩＳＣ内のエンドリボヌクレアーゼによってターゲットＲＮＡが切断される。
【００１４】
本発明のＰＩＭＴｓｉＲＮＡ発現ベクターではいずれのタイプも用いることができるが、一般的にｓｉＲＮＡでは、プラスミドの濃度が低い場合にはステムループタイプの方がより高い抑制効果を示すことが知られており、また、ｓｈＲＮＡはＤｉｃｅｒによるプロセシングを受けてｓｉＲＮＡとなるが、この場合、ＲＩＳＣに取り込まれやすくなることを示唆する報告もあることから、ステムループタイプのｓｉＲＮＡ発現系がより好ましい。
【００１５】
また、前述の通り、ｓｉＲＮＡ発現ベクターにはＵ６プロモーターとＨ１プロモーターが利用可能である。これらは、それぞれ低分子核内ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）（Ｕ６）とヒトＲＮアーゼＰ（ｈｕｍａｎ ＲＮａｓｅ Ｐ）ＲＮＡ Ｈ１のプロモーターであり、ＰｏｌIII転写系のＴｙｐｅIIIに属する。ＴｙｐｅIIIのプロモーターには転写に必要な保存された配列として、近位配列要素（ＰＳＥ：ｐｒｏｘｉｍａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、Ｓｔａｆ−結合サイト、遠位配列要素（ＤＳＥ：ｄｉｓｔａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）、及びＴＡＴＡボックスが存在する。Ｈ１プロモーターにおいてはこれらの配列が約１００ｂｐ以内にあるため、このプロモーターを用いた場合にはコンパクトな構築が可能である。このため、Ｈ１プロモーターを用いてｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することが好ましい。
【００１６】
ｓｉＲＮＡによる遺伝子の抑制効果は、ターゲットサイトに非常に依存的であることが知られている。特に、安定発現細胞を作成する場合には、導入するｓｉＲＮＡ発現ユニットのコピー数が少ないため、効果の高いターゲットサイトの選択が特に重要である。野生型Ｈ１プロモーターの転写開始がＡであることから、このプロモーターの転写開始はプリン塩基であることが望ましいとされている。また、ＰｏｌIII系によって転写されるＲＮＡは最後に約４個のＵが付加されることから、配列を認識するアンチセンス鎖の最後にＵＵＵＵが付加されるため、ターゲットサイトの転写開始点に相当する塩基の前の２つはＡＡである方が良い。
【００１７】
本発明者らは、その他の様々な要素を考慮して、ヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）から配列番号１の配列を選択した。
従って、本発明の好適実施態様は、配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなるＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクターを含み、特にこれら（配列番号１と配列番号２の塩基配列）がループ形成配列で連結されたステム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターを含む。ステム型ｓｉＲＮＡ発現ベクターにおけるループ配列は限定されないが、少なくとも４以上、好ましくは７またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。
従って、本発明のより好適な実施態様では、ＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクターは配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含む。
【００１８】
上述の通り、プロモーターは、通常、Ｈ１プロモーターまたはＵ６プロモーターであり、Ｈ１プロモーターが好ましい。
ｓｉＲＮＡを発現させるために好適なベクターは、一般にプラスミドであり、本発明の目的に従って、ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡ及び前記プロモーター配列を導入可能なものであれば特に限定されず、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ｐｃＤＮＡ３．１（−）等が挙げられる。なお、薬剤耐性遺伝子や制限酵素部位は特に限定されないのでその他、種々のプラスミドが利用可能である。但し、不要なプロモーター配列は除去する必要がある。また、ｐＨ１やｐＵ６等のベクターは市販されており、これらを用いてもよい。
【００１９】
形質転換細胞
上記ベクターを導入することにより、ＰＩＭＴのｍＲＮＡが破壊されるため、ＰＩＭＴ遺伝子のサイレンシングが実現できる。
ベクターを導入する宿主細胞は、プロモーターの種類にもよるが、哺乳類細胞が好ましく、より好ましくは、マウスもしくはラット等の齧歯類または他の動物（例えば、ヤギもしくはウシのような他の哺乳動物または鳥類）、霊長類及び非霊長類等に由来する細胞である。
【００２０】
前記Ｈ１プロモーターを用いる場合はヒト細胞が好ましいが、哺乳類細胞であれば利用可能である。ヒト細胞としては形質転換細胞が安定に培養できるものであれば特に限定されず、例えば、リンパ球、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、血管内皮細胞、または脾臓細胞であることが可能である。好ましい細胞の例としては、ヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＡＣＯ−２、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＰ−１等が挙げられる。
【００２１】
本発明では、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）からＣＭＶプロモーターを除去し、そのマルチクローニングサイトに配列番号３の塩基配列及びＨ１プロモーターを含む配列を導入し、ＰＩＭＴ発現抑制真核細胞株（平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された。）を得ることに成功した。
【実施例】
【００２２】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限するものではない。
【００２３】
実施例１
（１）Ｈ１プロモーターの作製
Ｈ１プロモーター配列を含む二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法により作製した。ＰＣＲ産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にＴＡクローニングし、プラスミドＨ１ｐｒｏ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２を構築した。ＰＣＲで用いたプライマーは以下の通りである。なお、順方向プライマーの５’末端にはＢａｍＨＩの認識配（ＧＧＡＴＣＣ）が付加されている。それぞれのプライマー間における相補配列を下線で示した。このＰＣＲ反応においては、各プライマー内に相補配列が存在するため、互いを鋳型とした伸張反応が起こる。
Ｈ１ ｐｒｏ−Ｆ（順方向プライマー（配列番号４））
5'-aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatgtctttg-3'
Ｈ１ ｐｒｏ−Ｒ（逆方向プライマー（配列番号５））
5'-ggatccgagtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcac-3'
【００２４】
（２）ｓｉＲＮＡ発現プラスミドの構築
プラスミドＨ１ｐｒｏ／ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２の制限酵素処理（ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ）によりＨ１プロモーター配列を含む１００ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、このＤＮＡ断片を哺乳類細胞発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（図１参照）のマルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部分と置換することにより、プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏを得た。次に、ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏのＣＭＶプロモーター配列を含むＮｈｅＩ−ＢｇｌＩＩ断片を制限酵素処理により除去し、クレノー断片処理による末端の平滑化反応の後、ライゲーション反応を行い、プラスミドｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）を構築した（図２）。
【００２５】
ｓｉＲＮＡ発現配列を含む配列（ｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｆ及びｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｒ）を合成し、二本鎖をアニールした後にＴ４キナーゼによる５’末端のリン酸化処理を行った。これをｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）のＢａｍＨＩ−ＨＩｎｄIII部分と置換することにより、ｓｉＲＮＡ発現プラスミドｈＰＩＭＴｓi／ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）を構築した（図２）。なお、ｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−ＦとｈＰＩＭＴｓｉＲＮＡ−Ｒはアニール後、それぞれの末端がＢａｍＨＩ及びＨＩｎｄIIIによる制限酵素処理後の突出末端と同じ配列になるようにデザインした。
【００２６】
実施例２
（１）ヒト胎児腎由来培養細胞株の樹立
ヒト胎児腎由来培養細胞株（ＨＥＫ２９３）は、終濃度１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用い、３７℃、５％ＣＯ2存在下で培養した。
２０％コンフルエントな状態になるように６ウェルプレートに前記細胞を播種した。翌日、ＴｒａｎｓＩＴ２９３を用いたリポフェクション法により、１ウェルにつき２．５μｇのＤＮＡを導入した。ＤＮＡの導入は、ＴｒａｎｓＩＴ２９３のプロトコールに従い、以下の手順で行った。ＴｒａｎｓＩＴ２９３試薬（Ｍｉｒｕｓ社製）５μｌと血清を含まないＤＭＥＭ １２５μｌを混合し、この混合液にｓｉＲＮＡ発現プラスミドｈＰＩＭＴｓｉ／ｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）２．５μｇまたは空ベクターｐｃＤＮＡ／Ｈ１ｐｒｏ／ＣＭＶ（−）２．５μｇを加え、優しく混和し、室温で５分反応後、培地中に添加した。２４〜４８時間培養後Ｇ４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ７９８２）を加えた選択培地中にて培養し、形成されたコロニーを拾い培養することにより樹立した。
【００２７】
（２）ＲＮＡの抽出及びノーザンブロット
１０ｃｍディッシュで１００％コンフルエントな状態にまで培養した細胞より、ＩＳＯＧＥＮを用いたＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ−Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）法により全ＲＮＡを調製した。
全ＲＮＡをＭＭＦバッファー（０.０２ＭＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、２５％ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド）に溶解し、６５℃、１５分の反応によりＲＮＡの高次構造を変性した後、直ちに氷上にて急冷した。変性アガロースゲル（０.０２ＭＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１８％ホルムアルデヒド、１％（ｗ／ｖ）アガロースＭＥ）を用いて、２０μｇ／レーンの全ＲＮＡを１００Ｖで２時間電気泳動した。泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色液（１μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド、５０ｍＭ水酸化ナトリウム）及び中和・脱色液（２００ｍＭ酢酸ナトリウム；ｐＨ４.０）に連続的に浸透した後、ゲル内のＲＮを１０×ＳＳＣ（１６７ｍＭクエン酸ナトリウム、１６７ｍＭ塩化ナトリウム；ｐＨ７.０）中にてナイロントランスファーメンブレンＮｉｔｒａｎＮに毛細管現象により転写した。これを２×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）で洗浄した後、自然乾燥に引き続くＵＶクロスリンカーを用いた０.１２０Ｊｕｌｅ／ｃｍ2のＵＶ照射により、転写されたＲＮＡをメンブレンに固定した。
【００２８】
ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｇｒａｎｕｌｅｓ中での６８℃、１時間の振とうによりプレハイブリダイゼーションを行った後、終濃度１００ｎｇ／ｍＬのアルカリ感受性ジゴキシゲニン標識ｈＰＩＭＴ ＲＮＡをプローブとして添加したＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ Ｇｒａｎｕｌｅｓ中での６８℃、一晩の振とうによりハイブリダイゼーションを行った。洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ）を用いて室温で５分の洗浄を３回行い、さらに洗浄バッファー２（０.１×ＳＳＣ；ｐＨ７.０、０.１％ＳＤＳ）を用いて６８℃で１５分の洗浄を３回行った。次に、マレイン酸バッファー（０.１Ｍマレイン酸、０.１５Ｍ 塩化ナトリウム；ｐＨ７.５）に１分間浸し、これをブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎをマレイン酸バッファーで１／１０に希釈した溶液）を用いて室温で３０分間ブロッキングした後、抗体溶液（７５０Ｕ／ｍＬのアルカリフォスファターゼ標識羊由来抗ジゴキシゲニンＦａｂフラグメントをブロッキングバッファーで１／１０，０００に希釈した溶液）中で室温３０分間反応させた。洗浄バッファー３（０.３％Ｔｗｅｅｎ２０、０.１Ｍマレイン酸、０.１５Ｍ塩化ナトリウム；ｐＨ７.５）で１５分の洗浄を３回行い、アルカリバッファー（０.１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０.１ＭＮａＣｌ；ｐＨ９.５）に２分間浸とうした。その後、アルカリフォスファターゼの化学発光基質であるＣＳＰＤとの反応後に、Ｘ線フィルムを用いて、プローブと反応するバンドを検出した。
【００２９】
結果を図３に示す。なお、図３においてＮＴ ＨＥＫは、本発明の発現ベクターをトランスフェクトしていないＨＥＫ２９３細胞による結果であり、Ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒはＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（空ベクター）を導入したＨＥＫ２９３細胞（対照）による結果である。これらの例も２０μｇ／レーンの全ＲＮＡを含む。対照でも、ベクターの導入操作を行っていないＨＥＫ２９３細胞と同等な量のＰＩＭＴｍＲＮＡが確認されており、本発明の細胞株によるＰＩＭＴｍＲＮＡの著しい減少はＲＮＡｉの結果であることがわかる。
また、細胞を遠心分画し、抗ＰＩＭＴ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、細胞質画分においてＰＩＭＴタンパク質の発現減少が確認された（図４）。
【００３０】
以上の結果から、本発明によれば、ｓｉＲＮＡによってＰＩＭＴ発現の抑制された細胞株が得られることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明で用いるｐｃＤＮＡ3.1（＋）の遺伝子マップを示す図である。
【図２】本発明で用いるｐｃＤＮＡ3.1（＋）への導入及び発現後のステム型ｓｉＲＮＡを示す模式図である。
【図３】野生型ＨＥＫ２９３細胞（図中：ＮＴ ＨＥＫ）、ＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（図中：対照）、本発明によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞（図中：ｓｉＲＮＡ。２回の結果を示す）におけるヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）、ＧＡＰＤＨ（結果を正規化するため）、各ｒＲＮＡのノーザンブロッティングの結果を示す写真。
【図４】図３と同様の実験において、野生型ＨＥＫ２９３細胞（図中：ＮＴ ＨＥＫ）、ＣＭＶプロモーターを除去したのみのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを導入したＨＥＫ２９３細胞（図中：ＥＶ）、本発明によりｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入した細胞（図中：ｓｉＲＮＡ。２回の結果を示す）におけるヒトＰＩＭＴ（ｈＰＩＭＴ）、ＧＡＰＤＨ（結果を正規化するため）の細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）、膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏ）の各画分についてのノーザンブロッティングの結果を示す写真。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoasparty/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項１に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
配列番号１と配列番号２の塩基配列がループ形成配列で連結された塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項２に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項３に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項５】
プロモーターがＨ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである請求項２〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
プロモーターがＨ１プロモーターである請求項５に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項７】
ベクターが哺乳類細胞発現用ベクターである請求項１〜６のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項８】
哺乳類細胞発現用ベクターがＣＭＶプロモーターを除去したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターである請求項７に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した哺乳類動物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【請求項１３】
平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【請求項１】
プロテインＬ−イソアスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ（ＰＩＭＴ：Protein L-isoasparty/D-aspartyl O-methyltransferase）の発現抑制を行うためのｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項２】
配列番号１及びその相補鎖である配列番号２の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項１に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項３】
配列番号１と配列番号２の塩基配列がループ形成配列で連結された塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項２に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項４】
配列番号３の塩基配列と少なくとも１つのプロモーター配列を含むＤＮＡを組み込んでなる請求項３に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項５】
プロモーターがＨ１プロモーターまたはＵ６プロモーターである請求項２〜４のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項６】
プロモーターがＨ１プロモーターである請求項５に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項７】
ベクターが哺乳類細胞発現用ベクターである請求項１〜６のいずれかに記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項８】
哺乳類細胞発現用ベクターがＣＭＶプロモーターを除去したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターである請求項７に記載のＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡ発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した真核細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換した哺乳類動物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト細胞。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ発現ベクターを導入してＰＩＭＴ発現抑制用ｓｉＲＮＡを産生するように形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【請求項１３】
平成１７年４月６日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受領番号ＦＥＲＭ−ＡＰ−２０４９０号として寄託された形質転換したヒト胎児腎由来ＨＥＫ２９３細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−２８８２６３（Ｐ２００６−２８８２６３Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１２６３５（Ｐ２００５−１１２６３５）
【出願日】平成１７年４月８日（２００５．４．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１０月９日 第４８回日本薬学会関東支部大会実行委員会、日本薬学会関東支部第１８回シンポジウム実行委員会発行の「第４８回 日本薬学会関東支部大会、日本薬学会関東支部 第１８回シンポジウム 講演要旨集」に発表
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月８日（２００５．４．８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１６年１０月９日 第４８回日本薬学会関東支部大会実行委員会、日本薬学会関東支部第１８回シンポジウム実行委員会発行の「第４８回 日本薬学会関東支部大会、日本薬学会関東支部 第１８回シンポジウム 講演要旨集」に発表
【出願人】（５９８０４１５６６）学校法人北里学園 (180)
【Ｆターム（参考）】
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