腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１選択分離培地
【課題】被験試料中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別して選択、分離培養することができる選択分離培地を提供する。
【解決手段】本発明に係る腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する選択分離培地は、大腸菌を検出するための基礎培地に、鑑別剤としてラムノースとｐＨ指示薬およびグルクロニド誘導体の酵素発色基質を添加し、選択剤として亜テルル酸塩、セフィキシムならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸塩を加えたものである。
【解決手段】本発明に係る腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する選択分離培地は、大腸菌を検出するための基礎培地に、鑑別剤としてラムノースとｐＨ指示薬およびグルクロニド誘導体の酵素発色基質を添加し、選択剤として亜テルル酸塩、セフィキシムならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸塩を加えたものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒菌である腸管出血性大腸菌血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地に関するものである。また、本発明は、前記培地を用いた、被検試料からの血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌の検出方法、ならびに他の腸内細菌から識別するための識別方法、および単離するための単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸管出血性大腸菌による食中毒が世界各国で報告されており、国内においても腸管出血性大腸菌による食中毒の発生が認められた。そのため、腸管出血性大腸菌による食中毒は大きな社会問題となってきており、その原因究明と予防対策の確立が急務となっている。
【０００３】
この食中毒の原因菌となる腸管出血性大腸菌の多くは、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１に属しており、食中毒患者から得られた被検試料中からの血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１の大腸菌の検出の有無で、腸管出血性大腸菌による食中毒かどうかの判断が可能であるといえる。
【０００４】
血清型Ｏ１５７の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてノボビオシン、亜テルル酸塩、およびラウリル硫酸塩、ならびに鑑別剤として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ―ガラクトピラノシド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ソルビトール等の糖アルコール、およびセロビオース等の二糖類の糖を含有している培地が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
本培地は、前記選択剤により大腸菌以外の腸内グラム陰性桿菌の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ１５７の大腸菌はソルビトール、セロビオースを分解できずに酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ―ガラクトピラノシドを分解して濃い青緑色のコロニーを形成する。一方、一般的な大腸菌ではソルビトールを分解し、一般的な大腸菌群はセロビオースを分解するため、上記酵素基質の分解は遅延する。蛍光基質である４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドに関しては、血清型Ｏ１５７の大腸菌がβ−グルクロニダーゼを産生しないため、紫外線照射によりその他の大腸菌と鑑別できる。
【０００６】
また、血清型Ｏ２６の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてセフィキシム、亜テルル酸塩、およびラウリル硫酸塩、ならびに鑑別剤としてグルコピラノシド誘導体またはガラクトピラノシド誘導体の酵素発色基質、ｐＨ指示薬、およびラムノースを含有している培地が提案されている（特許文献２）。
【０００７】
本培地は、前記選択剤によりバチラス等のグラム陽性菌、血清型Ｏ２６以外の大腸菌、プロテウス属菌等の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ２６の大腸菌はラムノースを分解できずに酵素発色基質であるグルコピラノシド誘導体およびガラクトピラノシド誘導体を分解できることを利用し、ラムノースの分解の有無によるｐＨ変化の有無をｐＨ指示薬による培地の変色の有無で確認して、その他の大腸菌と鑑別する。
【０００８】
さらに、血清型Ｏ１１１の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてセフィキシム、テルライト、および胆汁酸、ならびに鑑別剤としてｐＨ指示薬およびＬ−ソルボースを含有している培地が提案されている（非特許文献１）。
【０００９】
本培地は、前記選択剤により血清型Ｏ１１１以外の細菌の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ１１１の大腸菌はＬ−ソルボースを分解できないためｐＨ変化が生じず、ｐＨ指示薬による変色は生じない。
【００１０】
すなわち、腸管出血性大腸菌が原因である食中毒か否かを判断する場合、例えば、前記した三種類の選択分離培地を用意し、それらの培地上で被検試料を培養して増殖の有無を確認する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−３４２２４９号公報
【特許文献２】特開２００１−８６７９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】田中 博ら、日本臨床微生物学雑誌、１９９９年、９巻、ｐ．４８−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
食中毒が、腸管出血性大腸菌に起因しているかどうかを判断するためには、各々血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌に対する選択分離培地を用意する必要があり、多大な手間と費用を要する。そこで、一種類の選択分離培地を用いることにより、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌を識別して選択、分離培養することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
細菌を鑑別する際に、その糖代謝能を利用することが一般的に知られている。血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌に関しても例に漏れず、各々、ソルビトール、ラムノース、およびソルボースの代謝能を指標として鑑別している。
【００１５】
この糖代謝能に着目して血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１、ならびにその他の大腸菌を詳細に検討した。その結果、血清型Ｏ２６の大腸菌のみが非分解で、その他の大腸菌が分解できると知られているラムノースの添加量を調節することにより、血清型Ｏ１５７の大腸菌はラムノース非分解と同等の性状を示すことがわかった。
【００１６】
さらに、種々の酵素発色基質を検討したところ、グルクロニド誘導体を用いた場合、血清型Ｏ１５７の大腸菌はその代謝酵素を産生せず、血清型Ｏ１１１の大腸菌の代謝酵素の産生量は、血清型Ｏ２６およびその他の大腸菌の産生量に比べて低いということがわかった。
【００１７】
これらの検討によって得られた知見より、ラムノースおよびグルクロニド誘導体の酵素発色基質の培地への添加量を調節することにより、単独の培地を用いて血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１、ならびにその他の大腸菌を識別することが可能になるとわかった。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）ラムノース、ｐＨ指示薬、酵素発色基質、亜テルル酸塩およびセフィキシムを含有する培地であって、酵素発色基質がグルクロニド誘導体であることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（２）さらに、胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする、（１）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（３）前記ｐＨ指示薬が、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッドより選ばれるｐＨ指示薬である、（１）または（２）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（４）前記ｐＨ指示薬が、ニュートラルレッドである、（１）または（２）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（５）前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドより選ばれる酵素発色基質である、（１）〜（４）のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（６）前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドである、（１）〜（４）のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（７）培地１，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、胆汁酸塩０．１−２ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５−０．５ｇ、ラムノース０．１−８ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、ニュートラルレッド０．００１−０．０１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（８）腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する方法において、（１）〜（７）のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別方法。
（９）腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を単離・同定する方法において、（１）〜（７）のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の単離・同定方法。
【００１９】
本発明を、一例としてｐＨ指示薬にニュートラルレッドを、グルクロニド誘導体に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いて説明するが、本例に限定されることはない。
【００２０】
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を発育させる、基礎となる培地の組成は、培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、酵母エキス３ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇを含有し、ｐＨが７．２±０．２に調製されている。
【００２１】
この基礎培地に添加するラムノース量は１Ｌあたり０．１〜８ｇが適当であり、ニュートラルレッド量は１Ｌあたり０．００１〜０．０１ｇが適当である。また、培地に添加する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド量は１Ｌあたり０．０５〜０．５ｇが適量である。
【００２２】
さらに、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１以外の大腸菌を抑制するために添加する亜テルル酸カリウム量は１Ｌあたり１〜５ｍｇ、腸内細菌であるプロテウス属菌を抑制するために添加するセフィキシム量は１Ｌあたり０．００５〜０．１ｍｇ、グラム陽性菌を抑制するために添加する胆汁酸塩は１Ｌあたり０．１〜２ｇが適当である。
【００２３】
培地のｐＨは中性付近に調製してあり、ニュートラルレッドの添加量は微量であるため、培地の色は極わずかに褐色がかかった透明である。ラムノース分解菌は培地中のラムノースを分解して酸を産生し、ｐＨを低下させることにより、コロニーは桃色を呈する。一方、ラムノース非分解菌は酸を産生しないためｐＨは中性付近にとどまり、コロニーは呈色しない。
【００２４】
また、大腸菌はグルクロニダーゼを産生することが知られており、グルクロニド誘導体の酵素活性基質を分解して発色させる。グルクロニド誘導体として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いた本例では、コロニーは緑色を呈する。しかし、血清型Ｏ１５７の大腸菌は例外的にグルクロニダーゼを産生せず、コロニーは呈色しない。
【００２５】
なお、前記したように、血清型Ｏ１１１の大腸菌はグルクロニダーゼの産生量が少なく、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを分解して発色するものの弱い反応のためコロニーは薄い緑色を呈する。
【００２６】
本例に示した、ラムノースおよびニュートラルレッドならびに５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを組み合わせて培地に添加したときの大腸菌のコロニーの色を以下に示す。
【００２７】
血清型Ｏ１５７の大腸菌は、ラムノースの添加量を調節することによりラムノース非分解菌と同等の挙動を示し、グルクロニダーゼを産生しないため、コロニーは無色である。
【００２８】
血清型Ｏ２６の大腸菌は、ラムノース非分解菌で、グルクロニダーゼを産生するため、コロニーは緑色を呈する。
【００２９】
血清型Ｏ１１１の大腸菌は、ラムノース分解菌で、グルクロニダーゼの産生が少なく弱い反応を示すため、コロニーはエンジ〜赤色を呈する。
【００３０】
これら以外の大腸菌の多くは亜テルル酸塩を添加することにより発育が抑制されるが、たとえ発育したとしてもラムノース分解菌で、グルクロニダーゼを産生するため、コロニーは紫色を呈する。
【００３１】
大腸菌以外の菌の多くは、亜テルル酸塩、セフィキシム、ならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸塩を添加することにより発育が抑制されるが、たとえ発育したとしてもコロニーは小さい。なお、発育する菌はグルクロニダーゼを産生しないため、ラムノース分解能の有無によってコロニーは無色もしくは桃色を呈する。
【００３２】
以上、本例の培地を使用することにより、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびそれ以外の大腸菌、ならびにその他の菌を一種類の培地を用いて識別することが可能となる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明を実施することにより、被検試料中に含まれる、食中毒菌として重要な腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を、一種類の培地を用いて識別する選択、分離培養が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
細菌の増殖を支持するための栄養素および塩濃度、ならびに平板培地とするためのゲル化剤を含む基礎培地に、細菌を鑑別するためのラムノースおよびｐＨ指示薬、ならびに酵素発色基質のグルクロニド誘導体、検出対象外の細菌の増殖を抑制する亜テルル酸塩、セフィキシム、ならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを加えることにより、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別して選択、分離培養することが出来る。
【実施例１】
【００３５】
対象細菌を鑑別するための薬剤の濃度の確認
１．ラムノースの濃度の違いによる発育コロニーの呈色
ラムノースの濃度の違いによるラムノースの分解性の違いを調べるために、以下の組成の培地にラムノースを添加し、ラムノースの濃度が０．１、４、８、および１５ｇ／Ｌとなるように培地を調製した。試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の各々１株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後のコロニーの桃色の呈色を確認した。
【００３６】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００３７】
ラムノース分解性を有さない血清型Ｏ２６の大腸菌はいずれの濃度でも桃色の呈色を示さなかった。一方、血清型Ｏ２６以外の大腸菌はラムノース分解性を有すると知られており、血清型Ｏ１１１およびその他の大腸菌はいずれの濃度でも桃色の呈色を示した。しかし、血清型Ｏ１５７の大腸菌は、１５ｇ／Ｌでは桃色の呈色を示したものの、８ｇ／Ｌでは薄い桃色を呈しており、０．１および４ｇ／Ｌでは桃色の呈色を示さなかった。
【００３８】
この結果から、培地中のラムノース濃度を８ｇ／Ｌ以下にすることにより、ラムノース分解性を有すると知られている、血清型Ｏ１５７の大腸菌と、血清型Ｏ１１１およびその他の大腸菌を、そのコロニーの呈色により識別できることがわかった。
【００３９】
２．５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドの濃度の違いによるグルクロニダーゼ活性
酵素発色基質として知られているグルクロニド誘導体の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドの濃度の違いによるグルクロニダーゼ活性の違いを調べるために、ハートインフュージョンブイヨン培地に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加し、１２．５および５０ｍｇ／Ｌとなるように培地を調製し、マイクロプレートに１００μＬずつ分注する。この培地に、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の、各々１株をハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養して、マクファーランド標準濁度液Ｎｏ．１に調製したものを０．０００１５ｍＬ接種し、３７℃１８時間培養した後に緑色の発色を確認した。
【００４０】
血清型Ｏ１５７の大腸菌では両濃度とも発色は見られなかった。血清型Ｏ２６の大腸菌では両濃度で発色が見られた。血清型Ｏ１１１の大腸菌では５０ｍｇ／Ｌで発色が見られ、１２．５ｍｇ／Ｌでは発色は見られなかった。その他の大腸菌では両濃度で発色が見られた。
【００４１】
この結果から、血清型Ｏ１５７の大腸菌はグルクロニダーゼを産生せず、血清型Ｏ１１１の大腸菌はグルクロニダーゼを産生しているものの、血清型Ｏ２６およびその他の大腸菌のグルクロニダーゼの産生量より低いと判断された。このことより、グルクロニダーゼの酵素発色基質であるグルクロニド誘導体の発色を指標として、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できることがわかった。
【実施例２】
【００４２】
ｐＨ指示薬と酵素発色基質であるグルクロニド誘導体の組合せ
種々のｐＨ指示薬とグルクロニド誘導体の組合わせで腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別が可能か調べるため、以下の組成の培地に０．００５ｇ／ＬのｐＨ指示薬および０．１ｇ／Ｌのグルクロニド誘導体を添加して培地を調整した。試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の各々１株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後のコロニーの呈色を確認した。
【００４３】
なお、ｐＨ指示薬としてはフェノールレッド（ＰＲ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）、ブロモフェノールレッド（ＢＰＲ）、およびクロロフェノールレッド（ＣＰＲ）を用い、グルクロニド誘導体としては５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｙ−Ｇｌｕｃ）、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵ−Ｇｌｕｃ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰ−Ｇｌｕｃ）、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｕｃ）、および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ｍａｇｅｎｔａ−Ｇｌｕｃ）を用いた。
【００４４】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
酵母エキス ３ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
胆汁酸塩 １．２ｇ
ラムノース ７ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００４５】
ｐＨ指示薬およびグルクロニド誘導体の各々の組合わせの培地における血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌のコロニーの呈色を表１に示し、各々の組合わせによる識別の可否を表２にまとめた。３種類の組合わせ（ＢＣＰとＰＮＰ−Ｇｌｕｃ、ＢＴＢとｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｕｃ、およびＢＴＢとｍａｇｅｎｔａ−Ｇｌｕｃ）でやや識別性が劣るものの識別が可能であった他は、容易に識別が可能であった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【実施例３】
【００４８】
ｐＨ指示薬としてニュートラルレッド、グルクロニド誘導体として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いたときの細菌の検出
以下の組成の培地に試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、その他の大腸菌、およびその他の細菌の、各々１０株、１２株、９株、６株、および４２株用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後の発育の有無とコロニーの呈色を調べた。
【００４９】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
酵母エキス ３ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
胆汁酸塩 １．２ｇ
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド ０．２ｇ
ラムノース ７ｇ
亜テルル酸カリウム ０．００２ｇ
セフィキシム ０．０５ｍｇ
ニュートラルレッド ０．００５ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５０】
結果を表３に示すが、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は全例で発育が認められ、コロニーの色は血清型によって異なり、各々無色、緑色、およびエンジ色であった。一方、その他の大腸菌では６株中２株で発育が認められ、コロニーの色は紫色であった。また、その他の細菌では４２株中８株で発育が認められ、コロニーの色は無色が４株、桃色が４株であり、無色の４株はコロニーの大きさが約０．１ｍｍと微小であった。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この結果から、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は、本願発明の培地上で良好な発育を示し、そのコロニーは各々無色、緑色、およびエンジ色を呈することにより、識別した検出が可能である。一方、その他の大腸菌やその他の細菌では本願発明の培地で良好な発育を示す例も少なく、たとえ発育したとしても微小かコロニーの呈色が異なることからも、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌を識別した検出が可能である。
【実施例４】
【００５３】
本願発明と従来技術の比較
本願発明の培地と従来使用している培地の発育コロニーの呈色を比較した。本願発明の培地組成は（実施例３）に記載のものとした。比較する培地としては、デソキシコレート寒天培地（ＤＥＳＯ）、ソルビトール加マッコンキー寒天培地（Ｓ−ＭＡＣ）、ラムノース加マッコンキー寒天培地（Ｒ−ＭＡＣ）、およびソルボース加マッコンキー寒天培地（ＳＢ−ＭＡＣ）とし、各々の組成を以下に示す。
【００５４】
なお、試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、その他の大腸菌、およびその他の腸内細菌の、各々１５株、１５株、９株、１０株、および９株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後の発育の有無とコロニーの呈色を調べた。
【００５５】
ＤＥＳＯの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
乳糖 １０ｇ
デソキシコール酸ナトリウム １ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
リン酸２カリウム ２ｇ
クエン酸鉄アンモニウム ２ｇ
ニュートラルレッド ０．０３３ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５６】
Ｓ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ソルビトール １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５７】
Ｒ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ラムノース １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５８】
ＳＢ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ソルボース １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５９】
結果を表４に示すが、本願発明の培地では、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は全て発育し、そのコロニーは、各々無色、緑色、およびエンジ色を呈したが、その他の大腸菌およびその他の細菌では発育した例も少なく、発育したコロニーは紫色または桃色を呈していた。
【００６０】
デソキシコレート寒天培地では、全例で発育が認められ、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
ソルビトール加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ１５７の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
【００６１】
ラムノース加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ２６の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
ソルボース加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ１１１の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
【００６２】
【表４】
【００６３】
この結果から、従来の培地を単独で用いた場合には、一種類の血清型の腸管出血性大腸菌のみしか識別検出できない上、一部のその他の細菌との識別が困難となっているが、本願発明の培地を単独で用いることで、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の三種類の腸管出血性大腸菌を識別して検出することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
従来、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の検出には、Ｏ１５７はソルビトール加マッコンキー寒天培地、Ｏ２６はラムノース加マッコンキー寒天培地、およびＯ１１１はソルボース加マッコンキー寒天培地と各々の血清型用の分離培地の３枚の平板培地が必要であった。
【００６５】
しかし、本願発明の培地では、１回の選択分離培養により腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を別々の色で発色させることができ、被験試料中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１の存在を容易に判断できる。
【００６６】
それゆえ、食品工業分野においては、原材料や製品中の腸管出血性大腸菌の有無を検証するための工程を短縮化でき、汚染品の排除や製品の出荷を速やかに行うことが可能となり、食品流通の経済性に大きく貢献できる。
【００６７】
また、医療分野においては、糞便や嘔吐物を被検試料として用いることにより、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１による食中毒患者の早期診断が可能となり、早い段階より有効な治療法の選択に寄与できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒菌である腸管出血性大腸菌血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地に関するものである。また、本発明は、前記培地を用いた、被検試料からの血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌の検出方法、ならびに他の腸内細菌から識別するための識別方法、および単離するための単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、腸管出血性大腸菌による食中毒が世界各国で報告されており、国内においても腸管出血性大腸菌による食中毒の発生が認められた。そのため、腸管出血性大腸菌による食中毒は大きな社会問題となってきており、その原因究明と予防対策の確立が急務となっている。
【０００３】
この食中毒の原因菌となる腸管出血性大腸菌の多くは、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１に属しており、食中毒患者から得られた被検試料中からの血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１の大腸菌の検出の有無で、腸管出血性大腸菌による食中毒かどうかの判断が可能であるといえる。
【０００４】
血清型Ｏ１５７の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてノボビオシン、亜テルル酸塩、およびラウリル硫酸塩、ならびに鑑別剤として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ―ガラクトピラノシド、４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ソルビトール等の糖アルコール、およびセロビオース等の二糖類の糖を含有している培地が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
本培地は、前記選択剤により大腸菌以外の腸内グラム陰性桿菌の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ１５７の大腸菌はソルビトール、セロビオースを分解できずに酵素基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ―ガラクトピラノシドを分解して濃い青緑色のコロニーを形成する。一方、一般的な大腸菌ではソルビトールを分解し、一般的な大腸菌群はセロビオースを分解するため、上記酵素基質の分解は遅延する。蛍光基質である４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドに関しては、血清型Ｏ１５７の大腸菌がβ−グルクロニダーゼを産生しないため、紫外線照射によりその他の大腸菌と鑑別できる。
【０００６】
また、血清型Ｏ２６の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてセフィキシム、亜テルル酸塩、およびラウリル硫酸塩、ならびに鑑別剤としてグルコピラノシド誘導体またはガラクトピラノシド誘導体の酵素発色基質、ｐＨ指示薬、およびラムノースを含有している培地が提案されている（特許文献２）。
【０００７】
本培地は、前記選択剤によりバチラス等のグラム陽性菌、血清型Ｏ２６以外の大腸菌、プロテウス属菌等の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ２６の大腸菌はラムノースを分解できずに酵素発色基質であるグルコピラノシド誘導体およびガラクトピラノシド誘導体を分解できることを利用し、ラムノースの分解の有無によるｐＨ変化の有無をｐＨ指示薬による培地の変色の有無で確認して、その他の大腸菌と鑑別する。
【０００８】
さらに、血清型Ｏ１１１の大腸菌の選択分離培地としては、選択剤としてセフィキシム、テルライト、および胆汁酸、ならびに鑑別剤としてｐＨ指示薬およびＬ−ソルボースを含有している培地が提案されている（非特許文献１）。
【０００９】
本培地は、前記選択剤により血清型Ｏ１１１以外の細菌の発育を抑制する。前記鑑別剤では、血清型Ｏ１１１の大腸菌はＬ−ソルボースを分解できないためｐＨ変化が生じず、ｐＨ指示薬による変色は生じない。
【００１０】
すなわち、腸管出血性大腸菌が原因である食中毒か否かを判断する場合、例えば、前記した三種類の選択分離培地を用意し、それらの培地上で被検試料を培養して増殖の有無を確認する必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０００−３４２２４９号公報
【特許文献２】特開２００１−８６７９号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】田中 博ら、日本臨床微生物学雑誌、１９９９年、９巻、ｐ．４８−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
食中毒が、腸管出血性大腸菌に起因しているかどうかを判断するためには、各々血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌に対する選択分離培地を用意する必要があり、多大な手間と費用を要する。そこで、一種類の選択分離培地を用いることにより、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌を識別して選択、分離培養することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
細菌を鑑別する際に、その糖代謝能を利用することが一般的に知られている。血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌に関しても例に漏れず、各々、ソルビトール、ラムノース、およびソルボースの代謝能を指標として鑑別している。
【００１５】
この糖代謝能に着目して血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１、ならびにその他の大腸菌を詳細に検討した。その結果、血清型Ｏ２６の大腸菌のみが非分解で、その他の大腸菌が分解できると知られているラムノースの添加量を調節することにより、血清型Ｏ１５７の大腸菌はラムノース非分解と同等の性状を示すことがわかった。
【００１６】
さらに、種々の酵素発色基質を検討したところ、グルクロニド誘導体を用いた場合、血清型Ｏ１５７の大腸菌はその代謝酵素を産生せず、血清型Ｏ１１１の大腸菌の代謝酵素の産生量は、血清型Ｏ２６およびその他の大腸菌の産生量に比べて低いということがわかった。
【００１７】
これらの検討によって得られた知見より、ラムノースおよびグルクロニド誘導体の酵素発色基質の培地への添加量を調節することにより、単独の培地を用いて血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１、ならびにその他の大腸菌を識別することが可能になるとわかった。
【００１８】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）ラムノース、ｐＨ指示薬、酵素発色基質、亜テルル酸塩およびセフィキシムを含有する培地であって、酵素発色基質がグルクロニド誘導体であることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（２）さらに、胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする、（１）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（３）前記ｐＨ指示薬が、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッドより選ばれるｐＨ指示薬である、（１）または（２）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（４）前記ｐＨ指示薬が、ニュートラルレッドである、（１）または（２）記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（５）前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドより選ばれる酵素発色基質である、（１）〜（４）のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（６）前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドである、（１）〜（４）のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（７）培地１，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、胆汁酸塩０．１−２ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５−０．５ｇ、ラムノース０．１−８ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、ニュートラルレッド０．００１−０．０１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
（８）腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する方法において、（１）〜（７）のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別方法。
（９）腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を単離・同定する方法において、（１）〜（７）のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の単離・同定方法。
【００１９】
本発明を、一例としてｐＨ指示薬にニュートラルレッドを、グルクロニド誘導体に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いて説明するが、本例に限定されることはない。
【００２０】
腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を発育させる、基礎となる培地の組成は、培地１Ｌあたり、ペプトン１０ｇ、酵母エキス３ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、寒天１５ｇを含有し、ｐＨが７．２±０．２に調製されている。
【００２１】
この基礎培地に添加するラムノース量は１Ｌあたり０．１〜８ｇが適当であり、ニュートラルレッド量は１Ｌあたり０．００１〜０．０１ｇが適当である。また、培地に添加する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド量は１Ｌあたり０．０５〜０．５ｇが適量である。
【００２２】
さらに、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１以外の大腸菌を抑制するために添加する亜テルル酸カリウム量は１Ｌあたり１〜５ｍｇ、腸内細菌であるプロテウス属菌を抑制するために添加するセフィキシム量は１Ｌあたり０．００５〜０．１ｍｇ、グラム陽性菌を抑制するために添加する胆汁酸塩は１Ｌあたり０．１〜２ｇが適当である。
【００２３】
培地のｐＨは中性付近に調製してあり、ニュートラルレッドの添加量は微量であるため、培地の色は極わずかに褐色がかかった透明である。ラムノース分解菌は培地中のラムノースを分解して酸を産生し、ｐＨを低下させることにより、コロニーは桃色を呈する。一方、ラムノース非分解菌は酸を産生しないためｐＨは中性付近にとどまり、コロニーは呈色しない。
【００２４】
また、大腸菌はグルクロニダーゼを産生することが知られており、グルクロニド誘導体の酵素活性基質を分解して発色させる。グルクロニド誘導体として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いた本例では、コロニーは緑色を呈する。しかし、血清型Ｏ１５７の大腸菌は例外的にグルクロニダーゼを産生せず、コロニーは呈色しない。
【００２５】
なお、前記したように、血清型Ｏ１１１の大腸菌はグルクロニダーゼの産生量が少なく、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを分解して発色するものの弱い反応のためコロニーは薄い緑色を呈する。
【００２６】
本例に示した、ラムノースおよびニュートラルレッドならびに５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを組み合わせて培地に添加したときの大腸菌のコロニーの色を以下に示す。
【００２７】
血清型Ｏ１５７の大腸菌は、ラムノースの添加量を調節することによりラムノース非分解菌と同等の挙動を示し、グルクロニダーゼを産生しないため、コロニーは無色である。
【００２８】
血清型Ｏ２６の大腸菌は、ラムノース非分解菌で、グルクロニダーゼを産生するため、コロニーは緑色を呈する。
【００２９】
血清型Ｏ１１１の大腸菌は、ラムノース分解菌で、グルクロニダーゼの産生が少なく弱い反応を示すため、コロニーはエンジ〜赤色を呈する。
【００３０】
これら以外の大腸菌の多くは亜テルル酸塩を添加することにより発育が抑制されるが、たとえ発育したとしてもラムノース分解菌で、グルクロニダーゼを産生するため、コロニーは紫色を呈する。
【００３１】
大腸菌以外の菌の多くは、亜テルル酸塩、セフィキシム、ならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸塩を添加することにより発育が抑制されるが、たとえ発育したとしてもコロニーは小さい。なお、発育する菌はグルクロニダーゼを産生しないため、ラムノース分解能の有無によってコロニーは無色もしくは桃色を呈する。
【００３２】
以上、本例の培地を使用することにより、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびそれ以外の大腸菌、ならびにその他の菌を一種類の培地を用いて識別することが可能となる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明を実施することにより、被検試料中に含まれる、食中毒菌として重要な腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を、一種類の培地を用いて識別する選択、分離培養が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
細菌の増殖を支持するための栄養素および塩濃度、ならびに平板培地とするためのゲル化剤を含む基礎培地に、細菌を鑑別するためのラムノースおよびｐＨ指示薬、ならびに酵素発色基質のグルクロニド誘導体、検出対象外の細菌の増殖を抑制する亜テルル酸塩、セフィキシム、ならびに胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを加えることにより、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別して選択、分離培養することが出来る。
【実施例１】
【００３５】
対象細菌を鑑別するための薬剤の濃度の確認
１．ラムノースの濃度の違いによる発育コロニーの呈色
ラムノースの濃度の違いによるラムノースの分解性の違いを調べるために、以下の組成の培地にラムノースを添加し、ラムノースの濃度が０．１、４、８、および１５ｇ／Ｌとなるように培地を調製した。試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の各々１株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後のコロニーの桃色の呈色を確認した。
【００３６】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００３７】
ラムノース分解性を有さない血清型Ｏ２６の大腸菌はいずれの濃度でも桃色の呈色を示さなかった。一方、血清型Ｏ２６以外の大腸菌はラムノース分解性を有すると知られており、血清型Ｏ１１１およびその他の大腸菌はいずれの濃度でも桃色の呈色を示した。しかし、血清型Ｏ１５７の大腸菌は、１５ｇ／Ｌでは桃色の呈色を示したものの、８ｇ／Ｌでは薄い桃色を呈しており、０．１および４ｇ／Ｌでは桃色の呈色を示さなかった。
【００３８】
この結果から、培地中のラムノース濃度を８ｇ／Ｌ以下にすることにより、ラムノース分解性を有すると知られている、血清型Ｏ１５７の大腸菌と、血清型Ｏ１１１およびその他の大腸菌を、そのコロニーの呈色により識別できることがわかった。
【００３９】
２．５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドの濃度の違いによるグルクロニダーゼ活性
酵素発色基質として知られているグルクロニド誘導体の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドの濃度の違いによるグルクロニダーゼ活性の違いを調べるために、ハートインフュージョンブイヨン培地に５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを添加し、１２．５および５０ｍｇ／Ｌとなるように培地を調製し、マイクロプレートに１００μＬずつ分注する。この培地に、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の、各々１株をハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養して、マクファーランド標準濁度液Ｎｏ．１に調製したものを０．０００１５ｍＬ接種し、３７℃１８時間培養した後に緑色の発色を確認した。
【００４０】
血清型Ｏ１５７の大腸菌では両濃度とも発色は見られなかった。血清型Ｏ２６の大腸菌では両濃度で発色が見られた。血清型Ｏ１１１の大腸菌では５０ｍｇ／Ｌで発色が見られ、１２．５ｍｇ／Ｌでは発色は見られなかった。その他の大腸菌では両濃度で発色が見られた。
【００４１】
この結果から、血清型Ｏ１５７の大腸菌はグルクロニダーゼを産生せず、血清型Ｏ１１１の大腸菌はグルクロニダーゼを産生しているものの、血清型Ｏ２６およびその他の大腸菌のグルクロニダーゼの産生量より低いと判断された。このことより、グルクロニダーゼの酵素発色基質であるグルクロニド誘導体の発色を指標として、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できることがわかった。
【実施例２】
【００４２】
ｐＨ指示薬と酵素発色基質であるグルクロニド誘導体の組合せ
種々のｐＨ指示薬とグルクロニド誘導体の組合わせで腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別が可能か調べるため、以下の組成の培地に０．００５ｇ／ＬのｐＨ指示薬および０．１ｇ／Ｌのグルクロニド誘導体を添加して培地を調整した。試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌の各々１株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後のコロニーの呈色を確認した。
【００４３】
なお、ｐＨ指示薬としてはフェノールレッド（ＰＲ）、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）、ブロモフェノールレッド（ＢＰＲ）、およびクロロフェノールレッド（ＣＰＲ）を用い、グルクロニド誘導体としては５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｙ−Ｇｌｕｃ）、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵ−Ｇｌｕｃ）、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（ＰＮＰ−Ｇｌｕｃ）、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｕｃ）、および５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（ｍａｇｅｎｔａ−Ｇｌｕｃ）を用いた。
【００４４】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
酵母エキス ３ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
胆汁酸塩 １．２ｇ
ラムノース ７ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００４５】
ｐＨ指示薬およびグルクロニド誘導体の各々の組合わせの培地における血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、およびその他の大腸菌のコロニーの呈色を表１に示し、各々の組合わせによる識別の可否を表２にまとめた。３種類の組合わせ（ＢＣＰとＰＮＰ−Ｇｌｕｃ、ＢＴＢとｓａｌｍｏｎ−Ｇｌｕｃ、およびＢＴＢとｍａｇｅｎｔａ−Ｇｌｕｃ）でやや識別性が劣るものの識別が可能であった他は、容易に識別が可能であった。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【表２】
【実施例３】
【００４８】
ｐＨ指示薬としてニュートラルレッド、グルクロニド誘導体として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドを用いたときの細菌の検出
以下の組成の培地に試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、その他の大腸菌、およびその他の細菌の、各々１０株、１２株、９株、６株、および４２株用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後の発育の有無とコロニーの呈色を調べた。
【００４９】
培地の組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
酵母エキス ３ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
胆汁酸塩 １．２ｇ
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド ０．２ｇ
ラムノース ７ｇ
亜テルル酸カリウム ０．００２ｇ
セフィキシム ０．０５ｍｇ
ニュートラルレッド ０．００５ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５０】
結果を表３に示すが、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は全例で発育が認められ、コロニーの色は血清型によって異なり、各々無色、緑色、およびエンジ色であった。一方、その他の大腸菌では６株中２株で発育が認められ、コロニーの色は紫色であった。また、その他の細菌では４２株中８株で発育が認められ、コロニーの色は無色が４株、桃色が４株であり、無色の４株はコロニーの大きさが約０．１ｍｍと微小であった。
【００５１】
【表３】
【００５２】
この結果から、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は、本願発明の培地上で良好な発育を示し、そのコロニーは各々無色、緑色、およびエンジ色を呈することにより、識別した検出が可能である。一方、その他の大腸菌やその他の細菌では本願発明の培地で良好な発育を示す例も少なく、たとえ発育したとしても微小かコロニーの呈色が異なることからも、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌を識別した検出が可能である。
【実施例４】
【００５３】
本願発明と従来技術の比較
本願発明の培地と従来使用している培地の発育コロニーの呈色を比較した。本願発明の培地組成は（実施例３）に記載のものとした。比較する培地としては、デソキシコレート寒天培地（ＤＥＳＯ）、ソルビトール加マッコンキー寒天培地（Ｓ−ＭＡＣ）、ラムノース加マッコンキー寒天培地（Ｒ−ＭＡＣ）、およびソルボース加マッコンキー寒天培地（ＳＢ−ＭＡＣ）とし、各々の組成を以下に示す。
【００５４】
なお、試験菌として血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、Ｏ１１１、その他の大腸菌、およびその他の腸内細菌の、各々１５株、１５株、９株、１０株、および９株を用い、ハートインヒュージョンブイヨン培地で１夜培養してその１白金耳を各培地に塗抹接種し、３７℃１８時間培養した後の発育の有無とコロニーの呈色を調べた。
【００５５】
ＤＥＳＯの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン １０ｇ
乳糖 １０ｇ
デソキシコール酸ナトリウム １ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
リン酸２カリウム ２ｇ
クエン酸鉄アンモニウム ２ｇ
ニュートラルレッド ０．０３３ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５６】
Ｓ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ソルビトール １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５７】
Ｒ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ラムノース １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５８】
ＳＢ−ＭＡＣの組成（培地１Ｌあたり）
ペプトン ２０ｇ
ソルボース １０ｇ
胆汁酸塩Ｎｏ２ １．５ｇ
塩化ナトリウム ５ｇ
ニュートラルレッド ０．０３ｇ
クリスタルバイオレット ０．００１ｇ
寒天 １５ｇ
ｐＨ ７．２±０．２
【００５９】
結果を表４に示すが、本願発明の培地では、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の大腸菌は全て発育し、そのコロニーは、各々無色、緑色、およびエンジ色を呈したが、その他の大腸菌およびその他の細菌では発育した例も少なく、発育したコロニーは紫色または桃色を呈していた。
【００６０】
デソキシコレート寒天培地では、全例で発育が認められ、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
ソルビトール加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ１５７の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
【００６１】
ラムノース加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ２６の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
ソルボース加マッコンキー寒天培地では、全例で発育が認められ、血清型Ｏ１１１の大腸菌のコロニーは無色を呈した反面、それ以外では、一部のその他の細菌のコロニーが無色であった以外は、赤色を呈した。
【００６２】
【表４】
【００６３】
この結果から、従来の培地を単独で用いた場合には、一種類の血清型の腸管出血性大腸菌のみしか識別検出できない上、一部のその他の細菌との識別が困難となっているが、本願発明の培地を単独で用いることで、血清型Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の三種類の腸管出血性大腸菌を識別して検出することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
従来、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の検出には、Ｏ１５７はソルビトール加マッコンキー寒天培地、Ｏ２６はラムノース加マッコンキー寒天培地、およびＯ１１１はソルボース加マッコンキー寒天培地と各々の血清型用の分離培地の３枚の平板培地が必要であった。
【００６５】
しかし、本願発明の培地では、１回の選択分離培養により腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を別々の色で発色させることができ、被験試料中の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１の存在を容易に判断できる。
【００６６】
それゆえ、食品工業分野においては、原材料や製品中の腸管出血性大腸菌の有無を検証するための工程を短縮化でき、汚染品の排除や製品の出荷を速やかに行うことが可能となり、食品流通の経済性に大きく貢献できる。
【００６７】
また、医療分野においては、糞便や嘔吐物を被検試料として用いることにより、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、またはＯ１１１による食中毒患者の早期診断が可能となり、早い段階より有効な治療法の選択に寄与できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラムノース、ｐＨ指示薬、酵素発色基質、亜テルル酸塩およびセフィキシムを含有する培地であって、酵素発色基質がグルクロニド誘導体であることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項２】
さらに、胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項３】
前記ｐＨ指示薬が、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッドより選ばれるｐＨ指示薬である、請求項１または２記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項４】
前記ｐＨ指示薬が、ニュートラルレッドである、請求項１または２記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項５】
前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドより選ばれる酵素発色基質である、請求項１〜４のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項６】
前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドである、請求項１〜４のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項７】
培地１，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、胆汁酸塩０．１−２ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５−０．５ｇ、ラムノース０．１−８ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、ニュートラルレッド０．００１−０．０１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項８】
腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する方法において、請求項１〜７のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別方法。
【請求項９】
腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を単離・同定する方法において、請求項１〜７のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の単離・同定方法。
【請求項１】
ラムノース、ｐＨ指示薬、酵素発色基質、亜テルル酸塩およびセフィキシムを含有する培地であって、酵素発色基質がグルクロニド誘導体であることを特徴とする、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項２】
さらに、胆汁酸塩および／またはラウリル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする、請求項１記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項３】
前記ｐＨ指示薬が、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、ブロモフェノールレッド、クロロフェノールレッドより選ばれるｐＨ指示薬である、請求項１または２記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項４】
前記ｐＨ指示薬が、ニュートラルレッドである、請求項１または２記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項５】
前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、４−メチル−ウムベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド、６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドより選ばれる酵素発色基質である、請求項１〜４のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項６】
前記グルクロニド誘導体が、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドである、請求項１〜４のいずれかに記載の腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項７】
培地１，０００ｍＬあたり、ペプトン５−１５ｇ、酵母エキス２−５ｇ、塩化ナトリウム０．１−１０ｇ、胆汁酸塩０．１−２ｇ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド０．０５−０．５ｇ、ラムノース０．１−８ｇ、亜テルル酸カリウム１−５ｍｇ、セフィキシム０．００５−０．１ｍｇ、ニュートラルレッド０．００１−０．０１ｇ、寒天１０−２０ｇを含有する、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別できる選択分離培地。
【請求項８】
腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を識別する方法において、請求項１〜７のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の識別方法。
【請求項９】
腸内細菌から腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１を単離・同定する方法において、請求項１〜７のいずれかに記載の選択分離培地を用いて試料を培養する工程を少なくとも含む、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、Ｏ２６、およびＯ１１１の単離・同定方法。
【公開番号】特開２０１１−１９４６２（Ｐ２０１１−１９４６２Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６８３５４（Ｐ２００９−１６８３５４）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（０００１２０４５６）栄研化学株式会社 (67)
【Ｆターム（参考）】
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