ＨＰＶタンパクに対する新規なモノクローナル抗体
本発明の実施形態は、ＨＰＶ感染、および様々なＨＰＶ遺伝子型、初期および／もしくは後期段階の、ＨＰＶ関連またはＨＰＶ特異性の癌による感染を含むＨＰＶに関連する癌の診断を検出する方法、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、分析ならびにキットを提供する。特異的なＨＰＶタンパク質またはＨＰＶ型に特異的なエピトープ、様々なＨＰＶタンパク質またはＨＰＶ型の共通のエピトープを認識する様々なモノクローナル抗体を得る。得られるモノクローナル抗体は、ＨＰＶ感染の初期の臨床的検出およびＨＰＶに関連する疾患の一般的な検出、侵襲的子宮頸癌の特異的な検出、他のＨＰＶに関連する癌初期段階の前癌病変ならびに後期段階の癌進行の検出において有効な手段である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は、２００８年６月１３日に開示された米国仮出願特許第６１／１３１９９１号明細書および２００８年９月２２日に開示された米国仮出願特許第６１／１９２９１２号明細書の利益を要求する。前述した各関連明細書は、参照して全体に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
上皮特異細胞での上皮の増殖を誘起するヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頸癌に対して重要な役割を果たす。約９９パーセントの確認された子宮癌は、生検確認した扁平上皮病変（ＳＩＬ）または子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を有するＨＰＶ感染に関連する。約１％の人口は陰部疣贅を有し、女性の約４％は、軽度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）もしくは重度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）または異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）等の子宮頸癌前駆病変を有する。一般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の持続感染は、子宮頸癌前駆病変の発達に関して重要であると考えられている。ＬＳＩＬを有する女性に対して高リスクなＨＰＶの感染は、ＨＳＩＬに進行することがある。事実、いくつかはＨＳＩＬまで進行するが、ＬＳＩＬヒト対象の多くが寛解する。９９．７％の子宮頸癌はＨＰＶ陽性であるが、宿主遺伝子内へのウイルス遺伝子の統合は、ＨＳＩＬまたは癌へ進行する発現に重要な遺伝子を促進するために必要である。持続ＨＰＶ感染した１０人の女性のうち１人だけが、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）グレード２およびグレード３（それぞれＣＩＮ２，ＣＩＮ３）等の重度のＣＩＮ病変に進行し、これらの内皮病変の場合の一部は最終的に子宮頸癌に進行する。
【０００３】
過去において、子宮頸癌のスクリーニングは、細胞染色法に関するパパニコロー（パップ）スメアを得る等の従来の細胞学的スクリーニングに基づき、疑わしいスメアは、腸内視鏡検査および／または組織学的生検で検査する。しかし、主観的試験基準のために、パップスメア試験には様々な欠点があり：サンプル獲得の困難性、観測者内同意、高確率の偽陰性および偽陽性、高度な訓練を受けた特別な研究員の必要性、および多くのＨＰＶ感染ヒト対象の特定の不可能性である。より再現可能な分析が現在のスクリーニングテストを改良して、感染した女性の不必要な医学的介入および精神的苦痛をなくす必要がある。
【０００４】
「ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ」等の核酸試験によるＨＰＶ感染の検査は、高感度の分析で発展したが、高コストの分析操作手順、設備および高度な訓練の研究員だけでなく、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）試験サンプルにおける非常に低い陽性予測値のために、まだ理想的でない。Ｐｒｅ Ｔｅｃｔ ＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）等の分析は、高い陽性予測値のＨＰＶ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ試験と等しい高感度でＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出を提供するが；Ｅ６／Ｅ７癌タンパクをｉｎ ｓｉｔｕで直接検出できない。加えて、ＤＮＡ試験は、ＨＰＶ感染後の疾患段階を識別できず、また、異なる細胞病変の診断もできない（例えば、ＨＳＩＬとＬＳＩＬの識別ができず、また、非形質転換の潜在または寛解ウイルス感染からＣＩＮ病変を識別できない）。臨床検査質または医局の繰り返しの練習で行うことができ、初期の内皮病変を検出し、ＬＳＩＬをＨＳＩＬと識別でき、または子宮頸癌への進行の危険性を予測することができる、低コスト、簡単、高感度および特異的な分析が必要である。
【０００５】
モノクローナル抗体の生成の既知のプロトコールは、概して、抗ＨＰＶモノクローナル抗体の生成に適切でなく、一般集団のヒト対象に行う免疫組織化学的診断試験において用いることができない。これは、これらのプロトコールによって生成した抗体が感染したヒト細胞における自然発生的なＨＰＶウイルスタンパクに必ずしも反応しないからである。加えて、これらの問題は、臨床的ＨＰＶ検出に存在する。一つは、臨床サンプルにおけるＨＰＶタンパク質は非常に少ない量である。第２に、臨床サンプルにおいて存在する多くのＨＰＶ型およびほとんどのＨＰＶ型は、利用可能な抗体がないため、わかっていなく、合成的に識別できない。したがって、抗ＨＰＶ抗体を生成する免疫原として多量に精製した利用可能なＨＰＶたんぱくがなく、臨床ＨＰＶ検出に対する臨床サンプルにおいて存在する抗ウイルス抗体またはウイルスタンパク質を認識する利用可能なＨＰＶタンパク質または精製した抗ＨＰＶ抗体がない。
【０００６】
たった約１５種類のＨＰＶ型による感染（１００以上の利用可能なＨＰＶ型のうちの一つ）は、高リスクで子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）または子宮頸癌に進行する。それらのうち、報告された約７０％の子宮頸癌および報告されたＣＩＮ２およびＣＩＮ３の５０％は、２つの高リスクＨＰＶ型、すなわち、ＨＰＶタイプ１６およびＨＰＶタイプ１８によって起こる。しかし、いくつかの進行性子宮頸癌の場合は、低リスクのＨＰＶ型によって感染したと報告されているが、いくつかの高リスクのＨＰＶ型の感染は、子宮頸癌に決して進行しない。これらの２個の一般的な高リスクＨＰＶ型による感染は、腫瘍成長または癌の進行に関連しない。高リスク型によるＨＰＶ感染を特定するだけでなく特定の発癌タンパク質を発現するそれらのＨＰＶ感染ヒト対象を特定するのが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、これらの発癌タンパク質は、高いグレードの細胞病変もしくは子宮頸癌に関連する疾患に発展するリスクを予測する子宮頸癌バイオマーカーとして機能するため、臨床サンプルにおけるＨＰＶに関連する発癌タンパク質の発現を検出する必要がある。また、子宮頸癌バイオマーカーとしての侵襲性子宮頸癌および／またはＨＰＶに関連する発癌タンパク質の存在を検出し、また、子宮頸癌となる内皮病変の悪性転換に対するリスクを予測する抗ＨＰＶ抗体および適切なＨＰＶ免疫学的分析を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、概して、一般的なＨＰＶ感染症および様々なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染等のＨＰＶ感染を検出するのに有効な、様々な方法、検出分析、キット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＨＰＶ抗体、ポリペプチド、組み換え型ＨＰＶタンパク質および核酸に関連するものとする。バイオマーカーとして有効およびＨＰＶウイルスタンパク質を検出するツールとして有効な、ＨＰＶタンパク質に対する様々な新規のモノクローナル抗体、ＨＰＶ発癌タンパク質、子宮頸癌の初期スクリーニングおよびＣＩＮ、形成異常、および／または浸潤子宮頸癌および他の癌の診断を提供する。本発明のツールはまた、ＨＰＶ感染に関する初期臨床検出、および子宮頸癌および他の癌の一般的な診断、浸潤子宮頸癌の特異的な検出、他のＨＰＶに関連する癌、初期段階の前癌病変および晩期の癌進行の検出においても用いることができる。
【０００９】
モノクローナル抗体の生成方法は、様々なＨＰＶタンパク質またはＨＰＶ型、例えばｐａｎ 抗ＨＰＶ抗体の中のＨＰＶタンパク質の１個以上の一般的なエピトープを認識するモノクローナル抗体を得るために提供する。加えて、本願明細書で得られるいくつかのモノクローナル抗体は、ＨＰＶ型特異性であるが、本願明細書で得られるいくつかのモノクローナル抗体は、非ＨＰＶ型特異性である。非ＨＰＶ特異性ｐａｎ抗体は、臨床サンプルにおいて存在する最も一般的なＨＰＶ型からＨＰＶタンパク質を認識および結合する。本発明のいくつかの態様において、これらのｐａｎモノクローナル抗体の結合能は、１個以上の臨床サンプルにおけるＨＰＶ感染を検出する１個の便利な分析において用いるのに適切である。他の態様において、２個以上のＨＰＶ免疫学的分析も用いることができる。他の態様において、単一のＨＰＶタンパク質に特異的な抗ＨＰＶ抗体（１個のＨＰＶ型からの１個のタンパク質だけであり、他のＨＰＶ型、他のＨＰＶタンパク質ではない）も得ることができる。
【００１０】
本発明の一つの実施形態は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマをスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体を提供する。このスクリーニング工程は、２個およびそれ以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマを選択して、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。様々なＨＰＶに関連する抗体には、１個のＨＰＶ遺伝子型または２個以上の遺伝子型からの初期遺伝子および／または後期遺伝子によってコードした１個以上のＨＰＶタンパク質に対して特異性を示すポリクロ―ナルおよびモノクローナル抗体も含む。本願明細書で記載する抗体は、異なるヒト対象に対する免疫学的分析を行い、また、陽性および陰性対照を比較するのに用いることができる。
【００１１】
一つの実施形態において、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、モノクローナル抗体が同じまたは異なるＨＰＶ型からヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識できるようにする。他の実施形態において、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得て、モノクローナル抗体が他の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質ではなく、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のうち１個のみの特異的なエピトープを認識できるようにする、モノクローナル抗体を提供する。
【００１２】
他の実施形態において、同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質を結合することができるモノクローナル抗体を提供し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、同じＨＰＶ型および／または異なるＨＰＶ型からのものであり、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、同じ型からの２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質に対応する２個以上のＨＰＶ初期タンパク質に結合することができるようにする。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質を有し、モノクローナル抗体が精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できるようにする。
【００１３】
他の実施形態において、異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、スクリーニング工程は、異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択し、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。
【００１４】
さらに他の実施形態において、異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。さらに他の実施形態において、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質だけでなく第１ＨＰＶウイルス性タンパク質からの第２ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供し、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、第１および第２ウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡ（酵素免疫測定）で分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６Ｅ７組み換え型タンパク質（同じＨＰＶ型からの異なるＨＰＶタンパク質）の両方に反応でき、同じＨＰＶ１６型からの異なるＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６Ｅ７組み換え型タンパク質の両方に反応でき、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できる他のモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質（同じＨＰＶ型からの異なるＨＰＶタンパク質）に反応でき、同じＨＰＶ１６型からのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ｂにおいて示すモノクローナル抗体のウエスタンブロットを示す図であり、全てのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１組み換え型タンパク質への結合を確認する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮癌細胞株からの細胞溶解物のウエスタンブロットの結果を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在する全てのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１組み換え型タンパク質への結合を確認する。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、全ての組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１ Ｎ末端タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７タンパク質（異なるＨＰＶ型からのＨＰＶタンパク質）に結合することができ、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からのＥ６，Ｅ７，Ｌ１ Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａにおいて示したモノクローナル抗体のウエスタンブロットの結果を示す図であり、異なる組み換え型タンパク質への結合および異なるＨＰＶ型であるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からの異なるＥ６，Ｅ７，Ｌ１−Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープの認識を確認する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮頸癌細胞株からのウエスタンブロット細胞溶解物を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１−Ｎ末端ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、２個のＥ６組み換え型タンパク質（ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６，異なるＨＰＶ型からのＥ６タンパク質）に結合することができ、異なるＨＰＶ型からの２個のＥ６タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を分析するウエスタンブロットの結果を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図５】図５は、ＥＩＡで分析したときの、２個の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質（異なるＨＰＶ型からのＥ７タンパク質）に反応することができ、異なるＨＰＶ型からの２個のＥ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた異なる子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を分析するウエスタンブロットの結果を示す図であり、Ｈｅｌａ癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６ウイルス性タンパク質だけでなくＨＰＶ Ｅ７ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図８】図８は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図９】図９は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができる他のモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の一つの実施形態に従った免疫組織細胞化学染色（ＩＨＣ）分析における、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＣＩＮ２組織の形成異常細胞の染色画像を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の他の実施形態に従った図１２ＡのＣＩＮ２サンプルの形成異常組織から隣接した正常上皮形態の染色画像を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＩＨＣ分析において図１２Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体によって染色したＣＩＮ３サンプルの形成異常内皮の染色画像を示す図であり、本発明の他の実施形態に従った抗Ｅ６モノクローナル抗体による核および形成異常細胞における特異的なＩＨＣ染色を実証する。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＩＨＣ分析において図１２Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体によって染色した他のＣＩＮ３サンプルの形成異常細胞の染色画像を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の他の実施形態に従った免疫組織細胞化学染色（ＩＨＣ）分析における、抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いた組織マイクロアレイからの扁平上皮癌（ＳＣＣ）組織の染色画像を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３ＡのＳＣＣ組織に隣接した正常上皮（腫瘍組織から約１５ｍｍ離れた）の染色画像を示す図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＩＨＣ分析において図１３Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ７モノクローナル抗体によって染色した異なるＳＣＣ組織サンプルの染色画像を示す図であり、抗Ｅ７モノクローナル抗体による腫瘍細胞における特異的なＩＨＣ染色を実証する。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、腫瘍細胞の細胞質を染色する図１３Ｃからの腫瘍細胞の拡大した画像を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本発明の他の実施形態に従った免疫組織細胞化学（ＩＣＣ）分析における、マウスモノクローナル抗Ｅ７抗体によって染色したＣＩＮ２子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の染色画像を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における、マウスモノクローナル抗Ｅ６抗体によって染色したＣＩＮ３子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の染色画像を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＩＣＣ分析において図１４Ｂにおいて示した同じ抗Ｅ６抗体によって染色した腺癌線維腫（ＡＤＣ）子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態は、ＨＰＶタンパク質に対する様々なモノクローナル抗体を提供し、高リスクおよび低リスクのＨＰＶによる感染が１個のモノクローナル抗体によって検出できるようにする。本発明はまた、高リスクのＨＰＶ型のみを検出するＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体も提供する。加えて、１個のＨＰＶタンパク質に高く特異的なモノクローナル抗体も提供する。
【００１７】
本発明の一つの態様は、モノクローナル抗体の生成方法を提供する。この方法は、様々な精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を獲得する工程および２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および生物学的および臨床的サンプルにおける対応するパピローマウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を獲得する工程を有する。
【００１８】
加えて、２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞の陽性選択および非ＨＰＶタンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞の陰性選択を有する方法を用いることによって生成する。例えば、この方法は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択することによって、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせがある。
【００１９】
本発明の他の態様は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、２個以上の異なるＨＰＶ型からのヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を得る工程を有する。また、本発明の他の方法は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、他の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質ではなく、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のうち１個のみの特異的なエピトープを認識できるモノクローナル抗体を獲得する工程を有する。
【００２０】
例えば、同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体は、同じＨＰＶ型および／または異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって本発明の方法によって生成する。一つの実施例において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体を生成し、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質に対応する２個以上のＨＰＶ初期タンパク質に結合できるようにする。他の実施例において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質であり、他のモノクローナル抗体を生成し、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できるようにする。
【００２１】
得られた例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合することができるモノクローナル抗体の種類があり；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，およびＨＰＶ１６ Ｌ１ウイルス性タンパク質の全てに結合することができるモノクローナル抗体の種類があり；ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合することができるモノクローナル抗体の種類がある。したがって、本発明の方法を用いて生成したモノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６およびそれらの組み合わせからなる群から選択した同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる。
【００２２】
これらのモノクローナル抗体は、ＨＰＶ感染およびＨＰＶに関連する子宮頸癌および他の疾患を検出する１個以上の免疫分析に用いることができる。適切な免疫分析には、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体の分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞の免疫組織化学、およびフローサイトメトリによる免疫化学分析がある。
【００２３】
本発明の他の態様は、異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる方法およびモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択することによって、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合できるモノクローナル抗体を生成するようにして得る。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合することができる種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合することができる他の種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質に結合することができる他の種類のモノクローナル抗体があり、様々な免疫学的分析に用いることができる。
【００２４】
本発明のさらに他の態様は、異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、１個のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および他のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、スクリーニング工程は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択し、抗体生成ハイブリドーマ細胞から生成したモノクローナル抗体が異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるようにする。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質およびそれらの組み合わせがあり、精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせがある。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の全てに結合することができる種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の全てに結合することができる他の種類のモノクローナル抗体がある。本発明の方法によって生成したこの種類のモノクローナル抗体は、１個以上の免疫学的分析においてこれらのウイルス性タンパク質のいずれかの存在を検出するのに用いることができる。
【００２５】
本発明のさらに他の態様は、第１ウイルス性タンパク質とは異なる第２ウイルス性タンパク質ではなく第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合することができるＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得ることができ、第１および第２ウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。ＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体は、第１ウイルス性タンパク質の１個のウイルス性タンパク質のみにしか結合できない。第１ウイルス性タンパク質には、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６およびそれらの組み合わせ等のＨＰＶ型からのウイルス性タンパク質がある。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質からなる群から選択した１個のウイルス性タンパク質しか認識しないモノクローナル抗体がある。本発明の方法によって生成したこの種類のモノクローナル抗体は、１個以上の免疫学的分析における特異的なウイルス性タンパク質の存在を検出するのに用いる。
【００２６】
一つの実施形態において、様々な組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を、パピローマウイルス性タンパク質を発現する細胞を溶解後に、可溶化各分から精製して、可溶な精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質となるようにする。例えば、組み換え型タンパク質は、溶液において陰性の折り畳みとなるように精製する。他の実施例として、組み換え型タンパク質は、そのリン脂質または中性ｐＨまたはＰＢＳ緩衝液に分類されるｐＨ値で緩衝液と共に精製する。実施例として、様々な組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、例えば、中性ｐＨでの緩衝溶液においてまたはＰＢＳ緩衝液における溶解によって、スピンカラムもしくは濃縮器による濃縮などによって、その陰性折り畳みとなるように精製し、その溶解度を維持し高濃度を得る。ＨＰＶ組み換え型タンパク質の精製方法の一つは、米国特許第１１／５５９３６６号明細書「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその用途」において開示され、参照して組み込む。
【００２７】
モノクローナル抗体を作成するＨＰＶタンパク質のソースは、限定されていない；様々なＨＰＶ遺伝子および様々なＨＰＶ型／種からの様々なタンパク質がある。本発明のＨＰＶウイルス性タンパク質および／または癌タンパク質には、限定することはないが、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質、ＨＰＶ Ｅ３タンパク質、ＨＰＶ Ｅ４タンパク質、ＨＰＶ Ｅ５タンパク質、ＨＰＶ Ｌ２タンパク質がある。
【００２８】
ＨＰＶ型は限定しない。一般的に、ＨＰＶは、少なくとも３個の群に分けられる：（１）ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８などで、子宮頸癌および他の癌の癌タンパク質である；（２）低リスクＨＰＶ型（α−パピローマウイルスＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−１３，ＨＰＶ−３４，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５５，ＨＰＶ−７３，ＨＰＶ−２７；ＰＣＰＶ１，ＨＰＶ−２ａ，ＨＰＶ５７などで、子宮頸癌および他の癌に発展するリスクが低い）；（３）他の非発癌タンパク質α−パピローマウイルス（ＨＰＶ−６６，ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５９，ＨＰＶ−３０，ＨＰＶ−２６，ＨＰＶ−１０，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−３２，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−３，ＨＰＶ−２９，ＨＰＶ−７０など）。一人のヒト対象において多くのＨＰＶ感染が、これらのＨＰＶ群（高リスク、低リスクおよび／または非発癌性）のうち２個以上のＨＰＶによって起こる。
【００２９】
２個の問題が存在し、臨床ＨＰＶ診断に利用できる抗体がない。第１に、臨床サンプルにおけるＨＰＶタンパク質が非常に少量であることである。第２に、臨床サンプルにおけるＨＰＶ型は概して知られていないことである。したがって、当業者は失敗し、長年にわたって切実に必要であっても、様々な臨床ＨＰＶ型を認識するＨＰＶ抗体の大量の生成を行うことができず、この必要性は満たされていない。診断試験における抗体の良い用途に対して、抗体は、免疫原上に存在するエピトープだけでなく、エピトープが分析のために準備した試験サンプルにおいて露呈した（すなわち、低温保存、切開および固定等の組織のいずれの予処理後に露呈した）エピトープも認識する。したがって、多量のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングするように選択した方法は、診断に有効な抗体の選択を目的とする。組み換え型ＨＰＶタンパク質の精製および獲得において、およびＨＰＶ感染を検出する精製組み換え型タンパク質からの抗体の生成において既知の失敗があり、人々はその必要性を解決することができていない。本発明は、抗ＨＰＶ抗体を生成し、抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする免疫原として用いることができる精製組み換え型ＨＰＶタンパク質を提供し、生成した抗ＨＰＶ抗体を臨床サンプルに用いることができるようにする。
【００３０】
ＨＰＶタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成する方法を本願明細書で提供し、１個以上の抗体を獲得し、各モノクローナル抗体は、様々なＨＰＶタンパク質および／もしくはＨＰＶ型の中でＨＰＶタンパク質の共通のエピトープまたは特定のエピトープを認識することができる。加えて、本願明細書で得られるモノクローナル抗体のいくつかは、ＨＰＶ型特異性であるが、本願明細書で得られるモノクローナル抗体のいくつかは非ＨＰＶ特異性である。非ＨＰＶ特異性抗体は、臨床サンプルにおいて存在する一般的なＨＰＶ型を検出するのに有効である。その結果、これらのモノクローナル抗体は、１個以上のサンプルにおけるＨＰＶ感染を検出する分析において用いるのに適切である。これらの非ＨＰＶ特異性抗体のエピトープマッピングは、これらのモノクローナル抗体を結合するＨＰＶ特異性タンパク質の共通のエピトープを特定し配置する。
【００３１】
一つの実施形態において、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。２個以上の精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせ等の適切なＨＰＶタンパク質のいずれかがある。
【００３２】
他の実施形態において、２個以上のＨＰＶタンパク質は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。例えば、２個以上のＨＰＶタンパク質がＥ６およびＥ７初期タンパク質であるとき、Ｅ６およびＥ７初期タンパク質の両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６および／もしくはＨＰＶ１８、または他のＨＰＶ型からの２個以上の精製Ｅ６およびＥ７タンパク質をスクリーニングすることによって得る。他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は２個以上の組み換え型ＨＰＶ初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が、２個以上の精製組み換え型初期タンパク質に対応するＨＰＶ初期タンパク質の共通のエピトープを認識できる。
【００３３】
一つの実施例は、精製ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。他の実施例は、精製ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。
【００３４】
他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質があり、モノクローナル抗体は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期および後期ウイルス性タンパク質の共通のエピトープを認識できる。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質およびそれらの組み合わせ等の、パピローマウイルス型のいずれかからの初期パピローマウイルス性タンパク質のいずれかである。精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質Ｈは、ＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせ等のいずれかの後期パピローマウイルス性タンパク質である。例えば、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質でスクリーニングすることにって得て、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質上の共通のエピトープを認識できる。
【００３５】
さらに他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、少なくとも２個の異なるパピローマウイルス型からの２個以上の組み換え型パピローマウイルス性タンパク質である。例えば、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。パピローマウイルス型は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６等のいずれかのパピローマウイルス型である。第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１組み換え型タンパク質およびそれらの組み合わせである。
【００３６】
したがって、一つの実施例は、２個の異なるＨＰＶ型、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方からのＥ６タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体であり、精製ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。他の実施例は、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。さらに他の実施例は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。
【００３７】
さらに他の実施形態において、他のＨＰＶタンパク質でなく一つのＨＰＶタンパク質のみの特定のエピトープを認識できるモノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって核と岸、１個または他のウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。
【００３８】
一つの実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を認識または相互作用しない。他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を認識または相互作用しない。
【００３９】
他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ７の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を認識または相互作用しない。他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ７の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を認識または相互作用しない。
【００４０】
他の実施形態において、ＨＰＶタンパク質、Ｅ６、Ｅ７またはＬ１に対する様々なモノクローナル抗体（抗ＨＰＶ Ｅ６，抗ＨＰＶ Ｅ７，抗ＨＰＶ Ｌ１）は、抗体を引き上げた免疫原に関連するＨＰＶ型を特異的に検出するモノクローナル抗体および非ＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体がある。本発明の抗体には、限定することはないが、抗Ｅ６，抗Ｅ７および抗Ｌ１などがあり、１個以上の免疫学的分析において用いる。例えば、モノクローナル抗体は、様々な生物学的サンプル、細胞株、および／また様々な重症度の内皮病変（ＣＩＮ２，ＣＩＮ３，ＬＳＩＬ，ＨＳＩＬ，ＡＳＣＩＩＳ）および異なる子宮頸癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ，共通の癌型）および腺癌（ＡＤＣ，腺癌型）の臨床サンプルの試験に用いることができる。
【００４１】
一つの実施形態において、パピローマウイルス感染したヒト対象のスクリーニング方法は、ヒト対象から臨床サンプルを獲得する工程と、様々なＨＰＶ組み換え型タンパク質およびＨＰＶタンパク質に特異的な研究室で作成した抗体を用いてヒト対象からの臨床サンプルで１個以上の免疫学的分析を行い、ヒト対象におけるＨＰＶ抗体およびＨＰＶタンパク質の存在からＨＰＶ感染を検出およびスクリーニングする工程を有する。他の実施形態において、ヒト対象におけるＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ組み換え型タンパク質に対する抗体を用いて検出し、限定することはないが、様々なＨＰＶ初期および後期タンパク質に対する様々なポリクロ―ナルおよびモノクローナル抗体がある。
【００４２】
本願明細書で開発した抗体は、高品質であり、または、高感度およびＨＰＶ感染をスクリーニングし子宮頸癌の検出に特異的な免疫学的分析をにおいて有効な、ＨＰＶ初期および後期遺伝子によってコードした正確に精製組み換え型タンパク質である。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体の分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞の免疫組織化学、およびフローサイトメトリによる免疫化学分析からなる群から選択した１個以上の免疫学的分析に用いることができる。一つの実施形態において、１個以上の免疫学的分析は、最小またはさらなる装置を必要としない非侵襲的である。
【００４３】
免疫学的分析を行う基本技術は、Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989； "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および他の本および当該技術において既知のマニュアルにおいてわかる。関連する免疫学的分析、組織および／もしくは子宮頸部細胞に対する免疫化学分析、および／またはフローサイトメトリによる免疫染色分析も、２００６年１１月１３日に開示された米国特許第１１／５５９３６６号明細書「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその用途」；２００８年４月１４日に開示された米国特許第１２／０８２７４０号明細書「ＨＰＶ検出のためのタンパク質チップ」；２００８年６月１３日に開示された米国特許第６１／１３１９９１号明細書「ＨＰＶ検出のための抗体および分析」；２００８年９月２２日に開示された米国特許第６１／１９２９１２号明細書「ＨＰＶに関連する子宮頸癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニングおよび診断に有効なＨＰＶタンパク質に対する新規のモノクローナル抗体」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０１）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０２）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０２）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」においてわかる。上述の参照文献は全て参照して組み込む。
【００４４】
一つの実施形態において、本発明はまた、一般的なＨＰＶ感染症および様々なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染を検出するのに有効な、様々な方法、検出分析およびキット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ポリペプチド、組み換え型タンパク質および核酸も提供する。加えて、ＨＰＶタンパク質の存在を検出する分析またはサンプルフォーマットは限定されず、子宮頸部組織、子宮頸部細胞、子宮頸部のこすり取ったもの、血清、体液などに用いることができる。有効なスクリーニングまたは診断分析は、ＩＨＣ，ＩＣＣ、フローサイトメトリ、ビーズに結合した抗体、迅速試験、タンパク質チップ、ドットプロット、スロット、および従来のＥＬＩＳＡ分析である。ＨＰＶタンパク質は、病理学者による分類後ＩＨＣ染色によって示すように上皮組織において存在する本発明の抗体によって検出できる。
【００４５】
本発明において説明する抗体は、様々なソースの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶタンパク質を検出するツールを提供する。実施例として、本願明細書で記載する抗体は、マイクロタイタープレート上にコーティングする捕捉抗体として用いることができ、および／またはＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定）のサンドウィッチフォーマットとして検出抗体として用いることができる。ＨＰＶタンパク質および／またはＨＰＶ型の検出によって、抗体は、特定のＨＰＶタンパク質もしくはＨＰＶ型、またはそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体の本願明細書で記載する特異性に基づいた用途に対して選択する。本願明細書で記載するモノクローナル抗体の選択した特異性からの検出抗体は、ビオチン、アルカリリン酸塩、ＨＲＰ，読み取るための色測定、化学発光または蛍光基質に基づいた蛍光試薬などの標識と直接結合することができる。検出抗体はまた、ビオチン、アルカリリン酸塩、ＨＲＰ，蛍光試薬などの標識に結合した２次抗体によって本願明細書で記載したポリクローナル抗体から選択する。捕捉および検出抗体としてのサンドウィッチＥＬＩＳＡに対して用いるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組み合わせは、結合を検出するシグナルを増幅する二次抗体を組み込むことによって分析感度を上げる。直接的ＥＩＡ（酵素免疫測定）に対して、試験する細胞、サンプルまたは培養細胞を収集し溶解して、検体としての細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化し、各ウェルに対して各サンプルをコーティングするために同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコートし、その後、本願明細書で記載する特異性を有する抗体を検出した。
【００４６】
様々なＨＰＶ遺伝子型からのＨＰＶ ＤＮＡ、遺伝子、初期ウイルス性タンパク質、後期ウイルス性タンパク質、発癌タンパク質および／またはカプシドタンパク質の検出は、"Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989; "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,および他の本およびマニュアルに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法および検出分析によって行い、ＨＰＶ感染の一般的な臨床スクリーニングにおいて非常に有効である。
【００４７】
加えて、免疫学的分析によるＨＰＶ抗体および／または発癌タンパク質の検出は、ＨＰＶ感染に対する一般的な臨床スクリーニングおよび子宮頸癌に対する初期診断において用いることができ、１個の迅速試験または多重試験において行うことができる。
【００４８】
異なる濃度のＨＰＶタンパク質および宿主タンパク質の比較検出は、本発明の抗体を用いた同一のまたは異なる免疫学的分析において行うことができる。また、子宮頸部のＨＳＶに関連する癌の診断において用いることができ、ＨＰＶ感染によって誘起した内皮細胞の異常に関連する場合、前癌状態および癌状態のＨＰＶに関連する内皮細胞病変、およびＨＰＶに関連する子宮頸癌および腺癌に発展するリスクがある場合も用いることができる。本願明細書で記載する方法は、独立して用いることができる、または、従来の細胞パパニコロースメア試験または組織学試験に付属するスクリーニングツールとして用いることができ、その結果を経過観察する患者の管理と比較することができる。
【００４９】
本発明の抗体は、ＨＰＶ感染によって発生した病期を検出する免疫学的分析において用いることができる。これらの病期は、例えば、初期ＨＰＶ感染、後期ＨＰＶ感染、初期子宮頸部細胞病変、後期子宮頸部細胞病変、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、重度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部上皮内癌段階１，２，３（それぞれＣＩＮ１，ＣＩＮ２，ＣＩＮ３）、発展した子宮頸癌、腺癌（ＡＤＣ）または扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）である。
【実施例】
【００５０】
１．抗血清および抗ＨＰＶ抗体を生成し、モノクローナル抗体に対してハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために免疫原として用いるＨＰＶ組み換え型タンパク質の発現、精製および準備
ＨＰＶ組み換え型タンパク質は、限定することはないが、Ｅ２，Ｅ６、Ｅ７，Ｌ１，Ｌ２等の初期遺伝子および／または後期遺伝子のＨＰＶタンパク質である、いずれかの種類のＨＰＶタンパク質であり、様々なＨＰＶ型からでよい。全長Ｅ６，Ｅ７および／またはＬ１ポリペプチド配列は、タンパク質精製間の望ましくない凝集化、タンパク質の不安定性、低度の発現、精製タンパク質の低い免疫原反応のために獲得および精製が非常に難しいと考えられている。例えば、多くの初期Ｅ６発癌タンパク質が、多くのシステインアミノ酸を有し、これによってＥ６発癌タンパク質の正しいトポグラフィー（地図）は、多くのジスルフィド結合特性の形成を必要とする。加えて、初期Ｅ６およびＥ７タンパク質の小ペプチドを用いた特定の免疫学的分析の結果、非常に低い分析特異性および感度となり、臨床的ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のツールとして望ましくない。したがって、本発明は、部分配列または全長配列のＨＰＶ発癌タンパク質を有する組み換え型ハイブリッドタンパク質等の組み換え型タンパク質を提供する。
【００５１】
１）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ６初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子の１５７アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた４７４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ６タンパク質も得た。全てのクローン化手順は、"Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989において開示されたプロトコールに従って行う。加えて、ＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子もクローン化し、ＤＮＡ配列を確認した。
【００５２】
２）ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子の９９アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた２９４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＥ７ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。
【００５３】
３）ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７後期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子の５３１アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた１５９６塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＬ１ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。
【００５４】
ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の組み換え型Ｎ−末端フラグメントもＨｉｓタグした発現システムから得た。ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｎ−末端組み換え型タンパク質の分子量は、約３４ｋＤである。Ｌ１ Ｃ−末端フラグメントも得た。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｌ１タンパク質も得て、抗血清、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対する免疫原として用いた。
【００５５】
本願明細書で記載する１個以上の組み換え型タンパク質は、例えば、当該技術において既知の、大腸菌、酵母、バキュロウイルス、および／または哺乳動物細胞培養等における細菌発現システム、ウイルス発現システム、酵母発現システム、哺乳動物発現システム等の様々な適切なシステムにおいて発現する。ポリペプチドは、他の方法によって得ることができるが、本発明の実施形態は、それらの天然形である１個以上の組み換え型タンパク質を提供し、免疫学的分析におけるＨＰＶ感染したヒト対象の組織からの抗体に結合を確認するのに望ましい。例えば、ＧＳＴ，ＭＢＰ，またはＨｉｓタグしたＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１組み換え型タンパク質は、ＩＰＴＧ駆動誘導を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現した。タンパク質の発現を誘導後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質は、培養した細胞の溶解後の可溶画分から得て、約０．１〜１ｍｇ／ｍＬ以上の最終濃度まで精製した。組み換え型ＨＰＶタンパク質の純度は、ＰＡＧＥ分析を基にして９０％以上であると推測した。組み換え型ＨＰＶタンパク質は、臨床サンプルにおけるＨＰＶ抗体の存在を検出し、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を生成する免疫原としても用いた。
【００５６】
本願明細書で記載する様々な発現ベクターにおける様々な組み換え型パピローマウイルスタンパク質を得る細胞培養液を、その後最大１リットルもしくは１０リットル、または１００リットル以上まで増やし、多量の精製する可溶組み換え型タンパク質を得た。細胞溶解後の可溶画分は、適切な発現システムで様々なクロマトグラフィーに通して、ＨＰＶ組み換え型タンパク質に沿って発現したタグに結合させた。その後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質をカラムから溶出し、１００ｍＬまたは１０ｍＬから１ｍＬまで濃縮した。精製可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質をさらに濃縮し、中性ｐＨでの緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で透析し、ＨＰＶタンパク質に対する抗血清を生成する免疫原として用いた。このように、可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質を、可溶画分から精製し、ｉｎ ｖｉｖｏの性質のそのままの折り畳み状態に近いように折り畳んだ。
【００５７】
高品質な精製組み換え型ＨＰＶタンパク質の獲得は、ＨＰＶ感染を検出する共通のエピトープまたは特定のエピトープを認識する様々な種類のモノクローナル抗体の生成において重要である。精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ感染臨床サンプルからのＨＰＶ抗体への結合を確認するために試験した。したがって、この精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、抗血清を上げる免疫原として用いるのに適切であり、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＰＶウイルス性タンパク質を認識できる抗体を生成する。
【００５８】
２．抗ＨＰＶポリクローナル抗体生成
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。適切な滴定量からの生成出血を収集した；処理した血清をタンパク質Ａカラムまたは親和カラムを介して免疫グロブリン（ｌｇ）精製を行うのに用いた。精製ｌｇＧをＨＰＶ免疫分析に対する抗ＨＰＶ抗体として用いた。
【００５９】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗血清を獲得、精製および試験して、ＨＰＶ感染、細胞病変、炎症または癌疾患発展の発病に関係なくＨＰＶ感染を検出した。他の研究者は、抗ＨＰＶモノクローナル抗体を開発しようと試みたが、モノクローナル抗体の生成に十分なＨＰＶタンパク質の生成に失敗したため失敗してきた；彼らは免疫原が免疫原性でなかったため高い特異性を有するモノクローナル抗体の生成に失敗した；または、初期段階ＨＰＶ感染した臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶタンパク質の天然形を認識できない抗体を生成した。変異ペプチドに対して上昇するいくつかの抗体の未、後期段階子宮頸がんを認識できるが、それらの抗体が野生型ＨＰＶ天然タンパク質またはいずれかの初期段階ＨＰＶ感染かどうかは確証できない。加えて、後期段階ＨＰＶ検出は、疾患の医療介入および治療するには遅すぎる。
【００６０】
本願明細書で記載する抗体の臨床的用途は、適切な臨床サンプルを用いて、ＥＬＩＳＡ分析、免疫細胞化学分析、免疫組織化学分析等のＨＰＶ免疫学的分析によって評価した。本発明の方法から得た新規のモノクローナル抗体および抗血清は、臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶウイルス性タンパク質に相互作用および結合することができ、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）等の初期段階細胞病変および後期段階ＨＰＶに関連した子宮頸癌を有することを確認する。本願明細書で記載するモノクローナル抗体および抗血清は、ＨＰＶに関連する発病および初期および後期の両方における子宮頸癌の発展を検出およびスクリーニングする有効なツールを提供し；疾患の進行に介入する手段および初期治療を提供する機械を提供する。
【００６１】
３．ＨＰＶモノクローナル抗体の開発
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。マウスの免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清の滴定をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。マウスの血清の滴定は最適となり、腫瘍細胞を有するマウスの脾臓細胞の融合を標準的なプロトコールにしたがって行った。融合細胞、例えばハイブリドーマ細胞のクローン化をさらに培養した。
【００６２】
１）ハイブリドーマのスクリーニング
本発明において記載する、ｐａｎを有するハイブリドーマ細胞を生成し、様々なＨＰＶタンパク質に特異的に結合する抗ＨＰＶ抗体生成ハイブリドーマ細胞を得るため、ハイブリドーマクローンを、元の免疫原だけでなく陽性スクリーニングのさらなるＨＰＶタンパク質および陰性スクリーニングの無関係のタンパク質等の様々なタンパク質でスクリーニングした。例えば２個以上の精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質を、各ハイブリドーマクローンに対してスクリーニングして、抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよび獲得し、こうして得られた各抗体生成ハイブリドーマ細胞株の特異性を試験および理解するために用いた。
【００６３】
ハイブリドーマスクリーニングの実施例として、抗体生成ハイブリドーマ細胞を２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングして、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に反応できるようにした。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、限定することはないが、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質および様々なＨＰＶ型からの他のＨＰＶ初期および後期タンパク質がある。
【００６４】
抗体生成ハイブリドーマ細胞は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の全てに陽性反応を示し、ＢＳＡ，ｈｉｓ６タグ、ＧＳＴタンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、組み換え型タンパク質において用いる他のタグまたはタンパク質、他の容易に利用できる非ＨＰＶタンパク質等の非ＨＳＶタンパク質に陰性反応を示すようにスクリーニングする。このように、このハイブリドーマスクリーニングから生成したモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に対応する、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質全てに結合することができる（例えば、臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶウイルス性タンパク質）。
【００６５】
２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の一つの実施例は、ＨＰＶ初期タンパク質であり、モノクローナル抗体は、２個以上のヒトパピローマウイルス性初期タンパク質に反応することができる。例えば、このようにスクリーニングおよび獲得した一つのハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。このようにスクリーニングおよび獲得した他のハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。
【００６６】
２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の他の実施例には、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質があり、生成したモノクローナル抗体は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質の共通のエピトープを認識できる。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質および他のＨＰＶ組み換え型初期タンパク質であり、精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、および他のＨＰＶ組み換え型後期タンパク質である。例えば、このようにスクリーニングおよび獲得したハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１６Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。多くの実施形態を本発明の図面において提供する。
【００６７】
抗体生成ハイブリドーマ細胞はまた、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングし、モノクローナル抗体が２個以上の異なるＨＰＶ型からのヒトパピローマウイルス性タンパク質の共通のエピトープを反応できるようにする。第１および第２ＨＰＶ型は、ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８および他のＨＰＶ型である。２個以上の異なるＨＰＶ型は、例えば、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６である。例として、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質および組み換え型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質である。
【００６８】
ハイブリドーマスクリーニングの他の実施例として、抗体生成ハイブリドーマ細胞を、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のいくつかに陽性反応を示し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のいくつかおよび／または非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示すタンパク質でスクリーニングする。このように、このハイブリドーマスクリーニングから生成したモノクローナル抗体は、他のＨＰＶウイルス性タンパク質ではなくいくつかのＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる。
【００６９】
例えば、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングすることによって獲得し、モノクローナル抗体は、他の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質ではなく第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の一つの特定のエピトープに反応する。得られた特異的なモノクローナル抗体には、他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体がある。
【００７０】
２）ハイブリドーマ細胞株ストック：免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ，ＥＩＡおよび他の分析）によって判断した所定の陽性反応および所定の陰性反応を示すハイブリドーマ細胞株クローンを選択して単一細胞にクローン化した。各単一細胞クローンをその後、組織培養によって成長した。細胞数はｍＬ当たり百万に到達し、細胞を凍結して−８０°Ｃまたは強力ストックとして液体窒素においた。
【００７１】
３）腹水生成：各ハイブリドーマ細胞株を組織培養において成長させ、マウスに腹水生成させるように注射した。腹水を収集して、タンパク質Ｇカラムによって免疫グロブリン精製に対して処理した。各ハイブリドーマ細胞株からの精製免疫グロブリンをイソタイプして、ＨＰＶ免疫学的分析に用いた。
【００７２】
４．各抗ＨＰＶ抗体の特異性
１個以上の免疫学的分析を用いて、２個以上のＨＰＶ組み換え型タンパク質でハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体の特異性を試験した。ＥＩＡ（酵素免疫測定）および／またはウエスタンブロットを、本願明細書で記載するＨＰＶ抗体の特異性を試験する分析フォーマットとして用いた。様々な精製組み換え型ＨＰＶタンパク質には、抗ＨＰＶ抗体を得るのに用いる元のスクリーニングタンパク質およびスクリーニングに用いない他のタンパク質があり、ＥＩＡ上で得られた抗ＨＰＶ抗体の特異性を試験するマイクロタイタープレート上にコーティングするのに用いた。（ＨＰＶ感染しているまたはしていない）子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物も、ウエスタンブロットによる抗ＨＰＶ抗体の特異性を試験するのに用いた。ＨＰＶ抗体のＨＰＶ感染した細胞株からのタンパク質との結合および反応性を確認するため、ウエスタンブロットは、ＨＰＶ感染した細胞株において存在するタンパク質に対応する特異的なタンパク質結合を証明するのに非常に有効である。これらのウエスタンブロットタンパク質結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル状のそれらの期待した分子量で組み換え型ＨＰＶタンパク質と比較することができる。Ｈｅｌａ細胞株（ＨＰＶ陽性）、ＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６陽性）およびＣ３３Ａ細胞株（ＨＰＶ感染なし）等の子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いて、ウエスタンブロットで本発明の抗ＨＰＶモノクローナル抗体によってＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１の検出を行うのに用いた。
【００７３】
それらの天然形の様々な組み換え型タンパク質をマイクロタイタープレートの底部にコートして、ＥＩＡ分析を行い、本発明の方法によって生成した各抗体の特異性を試験する。同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を得る。図１Ａおよび図１Ｂは、ハイブリドーマ細胞の２個の異なるクローンを示し、各クローンは、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体を生成することができる。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、ＥＩＡの陽性反応は、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７でのみ観察され、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ Ｌ１ Ｎ−末端、ＨＰＶ１６ Ｌ１および６ｘ−Ｈｉｓタンパク質では陰性反応を示すまたは反応が観察されない。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７に特異的に結合するが、ＨＰＶ１６ Ｌ１またはＨＰＶ１８ Ｅ７には結合しないことを実証する。
【００７４】
同じＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体を得る。図２Ａは、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質の全てに結合でき、ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７および６ｘ−Ｈｉｓタンパク質に陰性反応を示すモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６およびＬ１タンパク質の天然系に強く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７の天然系には弱く反応するが、ＨＰＶ１８ Ｅ６またはＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の天然系には反応しないことを示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体が、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の全ての天然形によって認識されるＨＰＶ１６型特異の共通のエピトープを有することを示す。
【００７５】
図２Ｂは、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質に反応できるモノクローナル抗体のウエスタンブロット分析の結果を示す。本願明細書で記載する抗体を用いてウエスタンブロットによって検出した組み換え型タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６（約１８〜２０ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｌ１（約５５ｋＤａ）タンパク質の検出を行う。期待した分子量を示した各組み換え型タンパク質は、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７には検出可能な反応性を示さないことを示す。図２Ａおよび図２Ｂにおける結果を比較すると、これらのデータは、この抗ＨＰＶモノクローナル抗体が天然形のＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質および変性形のＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質によって認識できるＨＰＶ共通エピトープを有することを示す。
【００７６】
図２Ｃは、図２Ｂにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。各細胞株からの子宮頸癌細胞株の細胞溶解物および変性形の組み換え型タンパク質の両方を比較してここに示す。このモノクローナル抗体のＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質との特異性は、モノクローナル抗体がＨＰＶ感染した子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶウイルス性タンパク質を認識できるが、ＨＰＶ感染していない細胞株のは認識できないことから確認できる。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した二重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８感染）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６感染）細胞株における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｅ７（約１５ｋＤａ）タンパク質の検出を行う。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７には検出可能な反応性を示さないことを示す。
【００７７】
異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体も得る。図３Ａは、ＥＩＡで、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８型からの組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質に反応できるモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６の組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６およびＥ７タンパク質の全てに特異的に反応するが、ｈｉｓ−タグペプチドには反応しない（組み換え型タンパク質が発現および精製に対して６ｘ−Ｈｉｓに溶解しても）ことを示す。これらのデータは、この抗体が、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の全てに反応することができる能力によって示すように、異なるＨＰＶ型のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８によって共有された共通のエピトープを認識することを示す。
【００７８】
図３Ｂは、図３Ａにおいて用いたモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。このモノクローナル抗体のこれらの組み換え型タンパク質（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質）に対する陽性反応は、モノクローナル抗体が、Ｅ６（約１８ｋＤａ）、Ｅ７（約１５ｋＤａ）およびＬ１（約５５ｋＤａ）タンパク質を認識できることを示す。ウエスタンブロット分析の各組み換え型タンパク質レーンから結果できた結合は、期待した分子量を示し、このモノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からの変性したＥ６およびＥ７タンパク質に強く反応し、変性したＬ１タンパク質に弱く反応することを示す。図３Ａおよび図３Ｂの結果は、このモノクローナル抗体が、ＨＰＶ共通のエピトープを認識し、天然形および変性形のＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質と反応できることを示す。
【００７９】
図３Ｃは、図３Ａおよび図３Ｂにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。細胞溶解物および変性形の組み換え型タンパク質の両方を試験してここに示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した二重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６）細胞株における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｅ７（約１５ｋＤａ）タンパク質の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７には検出可能な結合を示さないことを示す。
【００８０】
異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体も得る。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６タンパク質に反応できるモノクローナル抗体を得る。図４Ａは、ＥＩＡで、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の共通のエピトープを認識でき反応できるモノクローナル抗体の特異性を示す。天然形の組み換え型タンパク質を、マイクロタイタープレート上にコーティングする。これらのデータは、モノクローナル抗体が天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質に反応性を示さないことを示す。
【００８１】
図４Ｂは、ＨＰＶ感染した子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６ウイルス性タンパク質に特異的に結合する、図４Ａにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した一重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）タンパク質の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、変性したＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質に強く反応することを示す。
【００８２】
異なるＨＰＶからの１個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる他の例示的なモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。図５は、ＥＩＡ分析したときのこのモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形のＨＰＶ Ｅ６および組み換え型ＨＰＶ Ｌ１には反応を示さないことを示す。これらのデータは、この抗体がＨＰＶ型に関わらず、Ｅ７のみの共通のエピトープを認識することを示す。
【００８３】
第１ＨＰＶウイルス性タンパク質だけ結合でき、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合できないモノクローナル抗体も得る。図６は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６に反応でき、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ６のみに反応でき、ＨＰＶ１８ Ｅ６または他の組み換え型ＨＰＶタンパク質に反応できない特異的なエピトープを有するこのモノクローナル抗体が見られる。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が天然形のＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ７またはＬ１タンパク質には反応しないことを示す。これらのデータは、この抗体が、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のみに反応でき、ＨＰＶ１６ Ｅ６特異性エピトープを認識することを示す。
【００８４】
他の例として、図７は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。このモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質のみに特異性を有し、ＨＰＶ１６ Ｅ６または他の組み換え型タンパク質には交差反応性を示さない。これらのデータは、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質のみに反応できる抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６特異的なエピトープを認識することを示す。
【００８５】
図７Ｂは、図７Ａにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した一重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）子宮頸癌細胞株におけるＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、このモノクローナル抗体も、変性したＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質に強く反応することを示す。
【００８６】
他の実施例として、図８は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。ＥＩＡで、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質または他の組み換え型タンパク質には交差反応性がない。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＬ１タンパク質には検出可能な結合をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｅ７エピトープを認識することを示す。
【００８７】
他の実施例として、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合できるが、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合できないモノクローナル抗体を示し、図９は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形のＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＬ１タンパク質には反応しないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質のみに反応できるこの抗体が、ＨＰＶ１８ Ｅ７特異性エピトープを認識することを示す。
【００８８】
他の実施例として、図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１Ｎ−末端タンパク質のみに反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できない２個のモノクローナル抗体クローンの特異性を示す。ＥＩＡで、ＨＰＶ１６ Ｈ１または他の組み換え型タンパク質には交差反応性がない。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＥ７タンパク質には反応をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端エピトープを認識することを示す。
【００８９】
他の実施例として、図１１は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。このモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端タンパク質上に存在する特異的なエピトープを認識する。他のＨＰＶ初期タンパク質との交差反応性は見られなかった。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に強く反応するが、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８からの天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＥ７タンパク質に反応をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端特異性エピトープを認識することを示す。
【００９０】
本発明において記載する抗体は、様々な免疫学的分析において用いることができる。免疫学的分析の一つの実施例は、２個以上の抗ＨＰＶ抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析である。サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を行うとき、まず、一次抗ＨＰＶ抗体をマイクロタイタープレート上にコートし、ＨＰＶウイルス性タンパク質または組み換え型ＨＰＶタンパク質を有するサンプルを試験して、マイクロタイタープレートの各ウェルに加え、一次抗ＨＰＶ抗体と反応させ、マイクロタイタープレートの底部表面上のＨＰＶタンパク質を捕捉する。第３に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または他の検出剤を結合させた二次抗ＨＰＶ抗体を加える。抗体−タンパク質複合体の検出は、通常、ＨＲＰに対してはＴＭＢ基質等の検出剤に対する基質を加えることによって行い、例えばＥＬＩＳＡリーダー等の検出装置によって、検出剤を付けた抗体−タンパク質複合体の存在を報告する（これによって、ＨＰＶタンパク質との抗ＨＰＶ抗体の結合活性に影響を与える）。サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析は、一次および二次抗ＨＰＶ抗体によるＨＰＶタンパク質の特異的結合を提供し、これによって、２個の抗ＨＰＶ抗体の特異性を特定または確認する。本発明において、様々な抗体を、抗体特異性を示すためにコーティングする抗体および検出抗体として用いた。
【００９１】
【表１】
【００９２】
実施例として、表１は、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の存在を検出するためのＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）の実験設定および結果を示す（抗原試験）。この結果は、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質は、コーティングおよび検出抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６に反応できるとき検出できるが、コーティング抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６に結合できるが検出抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６のみに特異的に反応するにも関わらず、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質は検出できないことを示す。同様の結果は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６の両方に結合できる検出抗体によってコーティングした特異的抗ＨＰＶ１８ Ｅ６を用いたときに得られた。データは、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質をサンドウィッチ分析における試験タンパク質として用いるときに抗体の特異性がＨＰＶ１８ Ｅ６を認識するが、サンドウィッチ分析の抗原としての組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質には反応性を示さないことを示す。本願明細書で記載する分析フォーマットは、限定することはないが、子宮頸癌細胞からの細胞溶解物、子宮頸部をかき取ったサンプル、組織、体液、血清などの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を検出するのに用いた。この特異的なサンドウィッチ分析は、ＨＰＶ１８に特異的な型を提供し、この分析において検出可能なＨＰＶ１６ Ｅ６の結合を排除する。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本発明において記載する抗体を示す他の実施例として、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質を用いることができ、表２は、コーティングおよび検出抗体に対してＨＰＶ１８ Ｅ７に対するモノクローナル抗体（ＨＰＶ１８ Ｅ７を認識する）を用いてＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質の存在を検出するＥＬＩＳＡの結果を示す。データは、抗体の特異性が、サンドウィッチ分析の抗原としてＨＰＶ１８ Ｅ７を用いてＨＰＶ18 Ｅ７を認識するが、サンドウィッチ分析の抗原としてＨＰＶ１６ Ｅ７を用いると反応しない。本願明細書で記載するこの分析フォーマットは、限定することはないが、子宮頸癌細胞からの細胞溶解物、子宮頸部をかき取ったサンプル、組織、体液、血清などの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出するのに用いた。このサンドウィッチ分析は、ＨＰＶ１８に対するＥ７特異性を提供し、ＨＰＶ感染のスクリーニングおよびＨＰＶ Ｅ７発癌タンパク質の検出に有効である。
５．抗ＨＰＶ抗体の用途
【００９５】
本発明において記載するＨＰＶ抗体は、一般的なＨＰＶ感染および様々な特異的なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染に対する様々な免疫学的分析において用いることができる。ＨＰＶタンパク質の存在の検出において用いるサンプルは限定されず、子宮頸部組織、子宮頸部かき取り、血清、体液などから得ることができる。子宮頸癌もしくはＨＰＶ感染のスクリーニングまたは診断に有効な免疫学的分析は、ＩＨＣ分析、ＩＣＣ分析、フローサイトメトリ分析、ビーズに結合した抗体を用いる分析、迅速試験、タンパク質チップ分析、ドットプロットを有する免疫学的分析、スロットを用いる免疫学的分析、および従来のＥＬＩＳＡ分析がある。スクリーニング試験として、ＨＰＶ抗体は、有資格の細胞学者によって行われたＩＣＣによって証明されるように、子宮頸癌スクリーニングにおいて一般集団からの子宮頸部かき取りの内皮細胞においてｉｎ ｓｉｔｕ存在するＨＰＶタンパク質を検出するのに用いることができる。確認試験として、ＨＰＶ抗体はまた、有資格の病理学者によって行われたＩＨＣ染色によって証明されるように、内皮組織においてｉｎ ｓｉｔｕ存在するＨＰＶタンパク質を検出するのに用いることができる。
【００９６】
１）精製抗ＨＰＶ抗体の生物学的サンプルにおいて見つかるＨＰＶタンパク質との反応性
ＨＰＶ抗体のＨＰＶタンパク質との反応活性を確認するため、精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質および／または生物学的サンプルからの細胞溶解物を含むＨＰＶをＥＬＩＳＡまたは直接ＥＩＡで試験する。生物学的サンプルには、限定することはないが、培養細胞からの細胞または臨床サンプルがある。
【００９７】
【表３】
【００９８】
実施例として、表３において示すデータのように、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７またはＨＰＶ Ｌ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、陰性対照としてＨＥＣ−１Ａを用いるとき、直接ＥＩＡにおける様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物と特異的に反応できる。Ｃａｓｋｉ，Ｓｉｎａ，Ｃｘｃａ、Ｈｅｌａ等の子宮頸癌細胞株、およびＨＥＣ−１Ａ（非ＨＰＶ感染）等の子宮内膜癌細胞からの細胞溶解物を用いて、表３において示すようにそれぞれ、ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１に特異的なＨＰＶモノクローナル抗体によるＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７，またはＬ１の検出を行うのに用いた。
【００９９】
本願明細書で試験し記載する培養細胞には、限定することはないが、Ｃａｓｋｉ（ＨＰＶ１６陽性），Ｓｉｎａ（ＨＰＶ１６陽性），Ｃｘｃａ、Ｈｅｌａ（ＨＰＶ１８陽性）等の子宮頸癌細胞およびＨＥＣ−１Ａ（非ＨＰＶ感染）等の子宮内膜癌細胞株がある。直接ＥＩＡに対して、細胞を回収、遠心、洗浄および溶解して、検体として細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を、定量化し、各ウェルにおける各サンプルをコーティングするための同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコーティングした。プレートを遮断し、示したように各ＨＰＶモノクローナル抗体およびその後ＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによって検出した。ＴＭＢ基質を加え、その後、標準的な反応停止溶液を加えた。ＯＤ４５０をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって行った。
【０１００】
２）精製抗ＨＰＶ抗体のＨＰＶタンパク質との反応性を臨床サンプルにおいて見つけた。
本願明細書で試験し記載する臨床サンプルは、限定することはないが、子宮頸部かき取り、体液または血清サンプルである。子宮頸部かき取りからの臨床生検も、ＥＩＡでＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質の検出をするために得た。
【０１０１】
液体の溶液、培養液（ＨＰＶ ＤＮＡ試験サンプルに対して用いた）、またはパップスメアにおいて子宮頸部かき取りを含む様々なサンプルソースからの細胞溶解物は、本発明において記載する様々なＨＰＶモノクローナル抗体を用いてＥＩＡフォーマット上で臨床サンプルからのＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１の検出を行う。本願明細書で記載する直接ＥＩＡを行うため、生検を処理、遠心分離、洗浄および溶解して、検体として細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化し、各ウェルにおける各サンプルをコーティングするための同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコーティングした。プレートを遮断し、示したように各ＨＰＶモノクローナル抗体およびその後ＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによって検出した。ＴＭＢ基質を加え、その後、標準的な反応停止溶液を加えた。ＯＤ４５０をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって行った。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４において示す結果は、各モノクローナル抗体が、分析の陰性対照としてパップスメア正常（ＨＰＶネガ）を用いて、ＳＣＣサンプルからそれぞれＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質を検出することを示す。高度ＨＰＶ ＤＮＡ位置からのサンプルに対して、ＥＩＡで３個のうち１個がＥ６，Ｅ７およびＬ１で陽性である。これらのデータは、ＳＣＣ溶解物からのＥ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質は本願明細書で記載するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって検出できるが、高度ＨＰＶ ＤＮＡ位置のサンプル（ＣＩＮ１／２）は、検出可能なＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質を含むまたは含まないことを示す。この研究において用いた高度ＨＰＶ ＤＮＡ試験はｈｃであり、ＦＤＡしかＨＰＶ ＤＮＡ試験を承認しなかった。それらのＨＰＶ ＤＮＡ陽性であるがＨＰＶ ＥＩＡ陰性であるサンプルに対して、ＨＰＶ ＤＮＡ分析の陽性、またはＨＰＶ発癌タンパク質を発現しないそれらのＨＰＶ ＤＮＡ検出の陽性を偽ることができる。これらのデータは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＥＩＡ分析が子宮頸癌のスクリーニングのさらなる臨床的妥当性を提供することを示す。
【０１０４】
３）免疫組織化学（ＩＨＣ）による精製抗ＨＰＶ抗体のｉｎ ｓｉｔｕＨＰＶタンパク質との反応性
４ミクロンに切断したパラフィン組織をスライドガラスガラス上に置き、６０°Ｃで一晩焼いた。脱パラフィン水和物の切片を脱マスクし、その後標準的なＩＨＣ染色手順に従った。本発明において記載するＨＰＶタンパク質精製モノクローナル抗体を希釈して、一次抗体として用いた。染色手順は、二次抗体溶液、洗浄後、各切片に対して適切な試薬を入れた。切片ができたらすぐ、精製水にスライドガラスを浸し、ヘマトキシン、脱水物で切片を対比染色し、カバースリップを載せた。
【０１０５】
実施例として、様々な段階のＣＩＮからの様々な子宮頸部組織を準備して、本願明細書で記載するラビットポリクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いてＩＨＣ分析を行った。他の実施例として、多くの子宮頸部生検サンプルを、様々なＨＰＶ型（ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型によって確認）からのＨＰＶタンパク質を検出するモノクローナル抗体を用いて組織マイクロアレイフォーマットとして共に免疫組織化学的分析において試験した。ＨＰＶウイルス性タンパク質および／または発癌タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて、本発明は、１個のＨＰＶ感染または複数のＨＰＶ感染のいずれかを有する臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１ウイルス性タンパク質およびＥ６，Ｅ７発癌タンパク質の存在を検出する抗体を提供する。本願明細書で記載する１個の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、少なくとも癌に関連するＨＰＶ型（高リスクＨＰＶ型または低リスクＨＰＶ型のいずれか）であるＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−５２などによって１個のＨＰＶ感染を検出できる。１個の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、高リスク、低リスク、および非発癌性α−パピローマウイルスを含む、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−５９などで；ＰＣＰＶ１，ＨＰＶ−２ａ，ＨＰＶ５７などの組み合わせ等の２個以上のＨＰＶ型によるＨＰＶ感染を検出できる。
【０１０６】
実施例として、本発明において記載するＨＰＶ抗体は、臨床用途において適用できる。ＩＨＣ分析の結果は、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いた、様々な段階の子宮頸部組織からのｉｎ ｓｉｔｕに存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質の検出を行う。他の実施例として、本願明細書で記載する抗体はまた、様々な段階のＣＩＮからの子宮頸部組織を用いてＩＣＣ分析において用いることができる。他の実施例として、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いるＩＨＣ染色の結果は、様々な段階のＣＩＮからｉｎ ｓｉｔｕにおいて存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質の検出を示す。これらの結果は、形成不全細胞において過剰に発現したＨＰＶＥ６およびＨＰＶ Ｅ７発癌タンパク質が、特異的なＨＰＶ抗体と用いたＩＨＣ染色によって特異的に検出できることを示す。
【０１０７】
実施例として、図１２Ａ~１２Ｄは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体によって行ったＣＩＮ組織のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ６発癌タンパク質の発現は、ＣＩＮ前癌段階において初期に検出できることを示す。黒色矢印は、形成不全細胞におけるＥ６タンパク質の特異的な染色を示すが、白色透明矢印は、染色されていない正常細胞を示す。拡大した画像は、形成不全細胞の核において初期に発現したＥ６タンパク質の位置を示す。
【０１０８】
図１２Ａは、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色（ＩＨＣ）によって染色したＣＩＮ組織の形成不全細胞の画像である。図１２Ｂは、図１２ＡのＣＩＮ２サンプルの形成不全細胞に隣接した正常上皮細胞の画像である。図１２Ｃ〜Ｄは、同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した２個のＣＩＮ３サンプルの形成不全上皮細胞の画像である。これらのデータは、Ｅ６モノクローナル抗体によるＩＨＣ染色が形成不全細胞において核および細胞質において特異的であることを示す。
【０１０９】
他の実施例として、図１３Ａ~１３Ｄは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって行った扁平上皮細胞癌のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ７発癌タンパク質は、ＳＣＣ組織の腫瘍細胞において検出できることを示す。黒色矢印は、形成不全細胞におけるＥ７タンパク質の特異的な染色を示すが、白色透明矢印は、染色されていない正常細胞を示す。拡大した画像は、正常上皮または基質細胞においてではなく、腫瘍細胞の細胞質において発現したＥ６タンパク質の位置を示す。これらのデータは、Ｅ７モノクローナル抗体によるＩＨＣ染色が腫瘍細胞の細胞質において特異的であることを示す。図１３Ａは、抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）組織の画像である。図１３Ｂは、図１３ＡからのＳＣＣ対象の正常な上皮（腫瘍組織から１５ｍｍ離れた）の画像である。図１３Ｃは、同じ抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した他のＳＣＣサンプルの画像である。図１３Ｄは、図１３Ｃからの細胞質において染色した腫瘍細胞の拡大画像である。
４）免疫化学（ＩＣＣ）による精製抗ＨＰＶ抗体のｉｎ ｓｉｔｕのＨＰＶタンパク質との反応性
【０１１０】
液体ベースの溶液によって回収した子宮頸部のかき取りを製造装置に従って処理した。準備した細胞を２群に分け、１個を従来のパップスメア用で、もう一方は、免疫染色用である。スライドガラス上の子宮頸部細胞の単層を細胞スピンまたは薄処理技術によって処理した。その後、細胞を固定して免疫染色プロトコールにしたがって染色した。染色した細胞を顕微鏡で可視化した。
【０１１１】
実施例として、図１４Ａ〜１４Ｃは、抗ＨＰＶ抗体を用いた免疫化学分析を示す。図１４Ａは、薄準備によって準備し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いてＩＣＣによって染色したＣＩＮ２子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像である。図１４Ｂは、薄準備によって準備し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いてＩＣＣによって染色したＣＩＮ２子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像である。図１４Ｃは、薄準備によって準備し図１４Ｂにおいて示したのと同じ抗Ｅ６抗体を用いてＩＣＣによって染色した腺癌（ＡＤＣ）子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像を示す。
【０１１２】
本願明細書で記載するように、抗体およびＨＰＶ初期および／または後期遺伝子由来の精製組み換え型タンパク質を用いた１個以上の免疫学的分析は、ＨＰＶ感染が起こったかどうかを示す信頼のおける指標として機能する。加えて、ＨＰＶに関連する悪性腫瘍または前癌細胞形質転換を分析できる。本発明の最も有効な態様のうち一つは、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌および腺癌の両方および、空細胞症；過角化症；上皮内または上皮癌または上皮内病変を含む前癌状態；重度の形成不全；および浸潤癌または悪性癌等の発癌性ＨＰＶ感染に関連するいずれかの上皮細胞の非正常の診断である。
【０１１３】
重度のＣＩＮ病変において、Ｅ６およびＥ７は、宿主ベースの上皮細胞において強く発現し、これらの複製能力宿主細胞の細胞周期制御を大きく妨げる。ＨＰＶ発癌タンパク質の発現は、宿主細胞におけるＧ１−Ｓ Ｐｈａｓｅを妨げる。ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、Ｅ７によるｐＲＢの不活性およびＥ６によるｐ５３の分解等、過剰の細胞相互作用を標的とする。高濃度のＨＰＶ Ｅ７タンパク質はｐＲＢを不活性にし、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ結合を妨げる。通常、ｐＲＢのＥ２Ｆへの結合は、Ｅ２Ｆ駆動細胞周期活性を遮断する。細胞の複製において、Ｅ２Ｆは、ＲＢのリン酸化によって制御される。リン酸化は、通常いくつかのキナーゼ阻害剤（ＩＮＫｓ）によって制御されるサイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ４，ＣＤＫ６）によって仲介される。
【０１１４】
Ｒｂ／Ｅ２Ｆ抑制の損失および遊離Ｅ２Ｆによる強活性の結果として、宿主細胞タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現が過剰に発現する。加えて、Ｃｄｋ４／６のｐ１６ＩＮＫ４ａ仲介抑制は、ｐＲｂ宿主細胞タンパク質上に下流効果を与えないため、Ｓ−相遺伝子が連続的に活性化される。Ｅ７依存Ｅ２Ｆ放出はｐＲｂのリン酸化によって仲介されるため、逆調節ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現は活性化細胞周期に効果を示さない。物理学的条件下でｐ１６ＩＮＫ４ａは、細胞が老化組織におけるテロメアの短縮化等の遺伝子ストレス状態となるとき発現する。また、アポトーシスはｐ５３のＨＰＶ Ｅ６仲介分解によって無効になる。サイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰の発現は、非制御ＨＰＶ癌遺伝子発現の直接的な結果である。
【０１１５】
加えて、増殖に重要な宿主細胞タンパク質および宿主細胞ゲノム複製は、ＨＰＶ感染の結果として過剰に発現する。これらの宿主細胞タンパク質には、ｋｉ６７（ＭｌＢ−１），ＭＹＣ細胞癌遺伝子、サイクリンタンパク質（例えばサイクリンＡ，Ｂ，Ｅなど），ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ，テロメアーゼ（例えばＴＥＲＣ）、複製複合タンパク質（例えばＭＣＭ５、ＣＤＣ６、トポイソメラーゼIIα（ＴＯＰ２Ａ）、ＭＣＭ２、ミンクロモソン維持タンパク質２，４，５などがある。
【０１１６】
本願明細書で与える１個以上の免疫学的分析は、簡単な装置でまたはさらなる装置なしに易しい手順を用いて、短い時間で行うことを目指す。様々な免疫学的分析の結果と比較して、ヒト対象に対する細胞学的および病理学的データを用いた核酸ハイブリダイゼーション分析および人口学的情報は、ＨＰＶ感染および／または子宮頸癌の診断における正確性を評価する。
【０１１７】
ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象のスクリーニング方法の他の実施例は、ヒト対象から臨床サンプルを獲得する工程と、臨床サンプル上で核酸ハイブリダイゼーション分析を行う工程と、ヒト対象からの臨床サンプルにおいてパピローマウイルスゲノムの存在を検出する工程と、初期パピローマウイルス性タンパク質の初期組み換え型タンパク質を用いて、臨床サンプルにおける初期パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の存在または初期パピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程と、後期パピローマウイルス性タンパク質の後期組み換え型タンパク質を用いて、臨床サンプルにおける後期パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の存在または後期パピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程を有する。
【０１１８】
本願明細書で記載するような１個以上の診断的免疫学的分析はまた、本願明細書で記載して得られるような一個以上の組換え型タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および／または抗血清を得る工程と、ＨＰＶに関連するタンパク質および／または抗原を含みそうな臨床サンプルを取る工程と、それを獲得した１個以上の組み換え型タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および／または抗血清と反応させる工程と、適切な検出システムによっていずれかの抗体−抗原複合体の存在を分析する工程を有する。適切な検出システムは、各免疫学的分析において二次抗体に対して特異な発色、化学発光、蛍光基質などを用いる。
【０１１９】
ＨＰＶ感染の初期診断は、子宮頸癌の予防および治療に重要である。子宮頸がんを予防する方法は、過去もしくは現在のＨＰＶ感染および／または前癌病変を有する対象に加えて世界中で幅広い範囲で改良したＨＰＶ試験／スクリーニングを必要とする。重要なことに、１２〜１５年間の女性におけるＨＰＶの感染は侵襲性癌に発達する前に必要であることがわかっている。したがって、前癌を治療する化学療法または放射線に頼るよりも、ＨＰＶ感染に対するバイオマーカーを分析して初期に女性を前もってスクリーニングし、初期にＨＰＶ感染を治療し、子宮頸癌への進行を予防することができるのが重要である。
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は、２００８年６月１３日に開示された米国仮出願特許第６１／１３１９９１号明細書および２００８年９月２２日に開示された米国仮出願特許第６１／１９２９１２号明細書の利益を要求する。前述した各関連明細書は、参照して全体に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
上皮特異細胞での上皮の増殖を誘起するヒトパピローマ（乳頭腫）ウイルス（ＨＰＶ）による感染は、子宮頸癌に対して重要な役割を果たす。約９９パーセントの確認された子宮癌は、生検確認した扁平上皮病変（ＳＩＬ）または子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）を有するＨＰＶ感染に関連する。約１％の人口は陰部疣贅を有し、女性の約４％は、軽度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）もしくは重度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）または異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）等の子宮頸癌前駆病変を有する。一般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の持続感染は、子宮頸癌前駆病変の発達に関して重要であると考えられている。ＬＳＩＬを有する女性に対して高リスクなＨＰＶの感染は、ＨＳＩＬに進行することがある。事実、いくつかはＨＳＩＬまで進行するが、ＬＳＩＬヒト対象の多くが寛解する。９９．７％の子宮頸癌はＨＰＶ陽性であるが、宿主遺伝子内へのウイルス遺伝子の統合は、ＨＳＩＬまたは癌へ進行する発現に重要な遺伝子を促進するために必要である。持続ＨＰＶ感染した１０人の女性のうち１人だけが、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）グレード２およびグレード３（それぞれＣＩＮ２，ＣＩＮ３）等の重度のＣＩＮ病変に進行し、これらの内皮病変の場合の一部は最終的に子宮頸癌に進行する。
【０００３】
過去において、子宮頸癌のスクリーニングは、細胞染色法に関するパパニコロー（パップ）スメアを得る等の従来の細胞学的スクリーニングに基づき、疑わしいスメアは、腸内視鏡検査および／または組織学的生検で検査する。しかし、主観的試験基準のために、パップスメア試験には様々な欠点があり：サンプル獲得の困難性、観測者内同意、高確率の偽陰性および偽陽性、高度な訓練を受けた特別な研究員の必要性、および多くのＨＰＶ感染ヒト対象の特定の不可能性である。より再現可能な分析が現在のスクリーニングテストを改良して、感染した女性の不必要な医学的介入および精神的苦痛をなくす必要がある。
【０００４】
「ＤＮＡ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ」等の核酸試験によるＨＰＶ感染の検査は、高感度の分析で発展したが、高コストの分析操作手順、設備および高度な訓練の研究員だけでなく、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）試験サンプルにおける非常に低い陽性予測値のために、まだ理想的でない。Ｐｒｅ Ｔｅｃｔ ＨＰＶ−Ｐｒｏｏｆｅｒ（登録商標）等の分析は、高い陽性予測値のＨＰＶ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ試験と等しい高感度でＥ６／Ｅ７ ｍＲＮＡの検出を提供するが；Ｅ６／Ｅ７癌タンパクをｉｎ ｓｉｔｕで直接検出できない。加えて、ＤＮＡ試験は、ＨＰＶ感染後の疾患段階を識別できず、また、異なる細胞病変の診断もできない（例えば、ＨＳＩＬとＬＳＩＬの識別ができず、また、非形質転換の潜在または寛解ウイルス感染からＣＩＮ病変を識別できない）。臨床検査質または医局の繰り返しの練習で行うことができ、初期の内皮病変を検出し、ＬＳＩＬをＨＳＩＬと識別でき、または子宮頸癌への進行の危険性を予測することができる、低コスト、簡単、高感度および特異的な分析が必要である。
【０００５】
モノクローナル抗体の生成の既知のプロトコールは、概して、抗ＨＰＶモノクローナル抗体の生成に適切でなく、一般集団のヒト対象に行う免疫組織化学的診断試験において用いることができない。これは、これらのプロトコールによって生成した抗体が感染したヒト細胞における自然発生的なＨＰＶウイルスタンパクに必ずしも反応しないからである。加えて、これらの問題は、臨床的ＨＰＶ検出に存在する。一つは、臨床サンプルにおけるＨＰＶタンパク質は非常に少ない量である。第２に、臨床サンプルにおいて存在する多くのＨＰＶ型およびほとんどのＨＰＶ型は、利用可能な抗体がないため、わかっていなく、合成的に識別できない。したがって、抗ＨＰＶ抗体を生成する免疫原として多量に精製した利用可能なＨＰＶたんぱくがなく、臨床ＨＰＶ検出に対する臨床サンプルにおいて存在する抗ウイルス抗体またはウイルスタンパク質を認識する利用可能なＨＰＶタンパク質または精製した抗ＨＰＶ抗体がない。
【０００６】
たった約１５種類のＨＰＶ型による感染（１００以上の利用可能なＨＰＶ型のうちの一つ）は、高リスクで子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）または子宮頸癌に進行する。それらのうち、報告された約７０％の子宮頸癌および報告されたＣＩＮ２およびＣＩＮ３の５０％は、２つの高リスクＨＰＶ型、すなわち、ＨＰＶタイプ１６およびＨＰＶタイプ１８によって起こる。しかし、いくつかの進行性子宮頸癌の場合は、低リスクのＨＰＶ型によって感染したと報告されているが、いくつかの高リスクのＨＰＶ型の感染は、子宮頸癌に決して進行しない。これらの２個の一般的な高リスクＨＰＶ型による感染は、腫瘍成長または癌の進行に関連しない。高リスク型によるＨＰＶ感染を特定するだけでなく特定の発癌タンパク質を発現するそれらのＨＰＶ感染ヒト対象を特定するのが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、これらの発癌タンパク質は、高いグレードの細胞病変もしくは子宮頸癌に関連する疾患に発展するリスクを予測する子宮頸癌バイオマーカーとして機能するため、臨床サンプルにおけるＨＰＶに関連する発癌タンパク質の発現を検出する必要がある。また、子宮頸癌バイオマーカーとしての侵襲性子宮頸癌および／またはＨＰＶに関連する発癌タンパク質の存在を検出し、また、子宮頸癌となる内皮病変の悪性転換に対するリスクを予測する抗ＨＰＶ抗体および適切なＨＰＶ免疫学的分析を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、概して、一般的なＨＰＶ感染症および様々なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染等のＨＰＶ感染を検出するのに有効な、様々な方法、検出分析、キット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗ＨＰＶ抗体、ポリペプチド、組み換え型ＨＰＶタンパク質および核酸に関連するものとする。バイオマーカーとして有効およびＨＰＶウイルスタンパク質を検出するツールとして有効な、ＨＰＶタンパク質に対する様々な新規のモノクローナル抗体、ＨＰＶ発癌タンパク質、子宮頸癌の初期スクリーニングおよびＣＩＮ、形成異常、および／または浸潤子宮頸癌および他の癌の診断を提供する。本発明のツールはまた、ＨＰＶ感染に関する初期臨床検出、および子宮頸癌および他の癌の一般的な診断、浸潤子宮頸癌の特異的な検出、他のＨＰＶに関連する癌、初期段階の前癌病変および晩期の癌進行の検出においても用いることができる。
【０００９】
モノクローナル抗体の生成方法は、様々なＨＰＶタンパク質またはＨＰＶ型、例えばｐａｎ 抗ＨＰＶ抗体の中のＨＰＶタンパク質の１個以上の一般的なエピトープを認識するモノクローナル抗体を得るために提供する。加えて、本願明細書で得られるいくつかのモノクローナル抗体は、ＨＰＶ型特異性であるが、本願明細書で得られるいくつかのモノクローナル抗体は、非ＨＰＶ型特異性である。非ＨＰＶ特異性ｐａｎ抗体は、臨床サンプルにおいて存在する最も一般的なＨＰＶ型からＨＰＶタンパク質を認識および結合する。本発明のいくつかの態様において、これらのｐａｎモノクローナル抗体の結合能は、１個以上の臨床サンプルにおけるＨＰＶ感染を検出する１個の便利な分析において用いるのに適切である。他の態様において、２個以上のＨＰＶ免疫学的分析も用いることができる。他の態様において、単一のＨＰＶタンパク質に特異的な抗ＨＰＶ抗体（１個のＨＰＶ型からの１個のタンパク質だけであり、他のＨＰＶ型、他のＨＰＶタンパク質ではない）も得ることができる。
【００１０】
本発明の一つの実施形態は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマをスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体を提供する。このスクリーニング工程は、２個およびそれ以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマを選択して、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。様々なＨＰＶに関連する抗体には、１個のＨＰＶ遺伝子型または２個以上の遺伝子型からの初期遺伝子および／または後期遺伝子によってコードした１個以上のＨＰＶタンパク質に対して特異性を示すポリクロ―ナルおよびモノクローナル抗体も含む。本願明細書で記載する抗体は、異なるヒト対象に対する免疫学的分析を行い、また、陽性および陰性対照を比較するのに用いることができる。
【００１１】
一つの実施形態において、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、モノクローナル抗体が同じまたは異なるＨＰＶ型からヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識できるようにする。他の実施形態において、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得て、モノクローナル抗体が他の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質ではなく、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のうち１個のみの特異的なエピトープを認識できるようにする、モノクローナル抗体を提供する。
【００１２】
他の実施形態において、同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質を結合することができるモノクローナル抗体を提供し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、同じＨＰＶ型および／または異なるＨＰＶ型からのものであり、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、同じ型からの２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質に対応する２個以上のＨＰＶ初期タンパク質に結合することができるようにする。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質を有し、モノクローナル抗体が精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できるようにする。
【００１３】
他の実施形態において、異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶタンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、スクリーニング工程は、異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択し、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。
【００１４】
さらに他の実施形態において、異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供する。さらに他の実施形態において、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質だけでなく第１ＨＰＶウイルス性タンパク質からの第２ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を提供し、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、第１および第２ウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡ（酵素免疫測定）で分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６Ｅ７組み換え型タンパク質（同じＨＰＶ型からの異なるＨＰＶタンパク質）の両方に反応でき、同じＨＰＶ１６型からの異なるＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６Ｅ７組み換え型タンパク質の両方に反応でき、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できる他のモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質（同じＨＰＶ型からの異なるＨＰＶタンパク質）に反応でき、同じＨＰＶ１６型からのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ｂにおいて示すモノクローナル抗体のウエスタンブロットを示す図であり、全てのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１組み換え型タンパク質への結合を確認する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、図２Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮癌細胞株からの細胞溶解物のウエスタンブロットの結果を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在する全てのＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１組み換え型タンパク質への結合を確認する。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、全ての組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７，Ｌ１ Ｎ末端タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｅ６およびＥ７タンパク質（異なるＨＰＶ型からのＨＰＶタンパク質）に結合することができ、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からのＥ６，Ｅ７，Ｌ１ Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａにおいて示したモノクローナル抗体のウエスタンブロットの結果を示す図であり、異なる組み換え型タンパク質への結合および異なるＨＰＶ型であるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からの異なるＥ６，Ｅ７，Ｌ１−Ｎ末端タンパク質上の共通のエピトープの認識を確認する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮頸癌細胞株からのウエスタンブロット細胞溶解物を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｅ６，Ｅ７およびＬ１−Ｎ末端ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、２個のＥ６組み換え型タンパク質（ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６，異なるＨＰＶ型からのＥ６タンパク質）に結合することができ、異なるＨＰＶ型からの２個のＥ６タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を分析するウエスタンブロットの結果を示す図であり、これらの子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図５】図５は、ＥＩＡで分析したときの、２個の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質（異なるＨＰＶ型からのＥ７タンパク質）に反応することができ、異なるＨＰＶ型からの２個のＥ７タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図６】図６は、本発明の一つの実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａにおいて示したモノクローナル抗体を用いた異なる子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を分析するウエスタンブロットの結果を示す図であり、Ｈｅｌａ癌細胞株において存在するＨＰＶ１６ Ｅ６ウイルス性タンパク質だけでなくＨＰＶ Ｅ７ウイルス性タンパク質への結合を確認する。
【図８】図８は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図９】図９は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができる他のモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１１】図１１は、本発明の他の実施形態に従ったＥＩＡで分析したときの、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＬ１ Ｎ末端組み換え型タンパク質だけでなくいずれの他のＨＰＶ組み換え型タンパク質にも特異的に反応することができるモノクローナル抗体の特異性を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、本発明の一つの実施形態に従った免疫組織細胞化学染色（ＩＨＣ）分析における、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＣＩＮ２組織の形成異常細胞の染色画像を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、本発明の他の実施形態に従った図１２ＡのＣＩＮ２サンプルの形成異常組織から隣接した正常上皮形態の染色画像を示す図である。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＩＨＣ分析において図１２Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体によって染色したＣＩＮ３サンプルの形成異常内皮の染色画像を示す図であり、本発明の他の実施形態に従った抗Ｅ６モノクローナル抗体による核および形成異常細胞における特異的なＩＨＣ染色を実証する。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＩＨＣ分析において図１２Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体によって染色した他のＣＩＮ３サンプルの形成異常細胞の染色画像を示す図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本発明の他の実施形態に従った免疫組織細胞化学染色（ＩＨＣ）分析における、抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いた組織マイクロアレイからの扁平上皮癌（ＳＣＣ）組織の染色画像を示す図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３ＡのＳＣＣ組織に隣接した正常上皮（腫瘍組織から約１５ｍｍ離れた）の染色画像を示す図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＩＨＣ分析において図１３Ａにおいて用いたのと同じ抗Ｅ７モノクローナル抗体によって染色した異なるＳＣＣ組織サンプルの染色画像を示す図であり、抗Ｅ７モノクローナル抗体による腫瘍細胞における特異的なＩＨＣ染色を実証する。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、腫瘍細胞の細胞質を染色する図１３Ｃからの腫瘍細胞の拡大した画像を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本発明の他の実施形態に従った免疫組織細胞化学（ＩＣＣ）分析における、マウスモノクローナル抗Ｅ７抗体によって染色したＣＩＮ２子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の染色画像を示す図である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本発明の他の実施形態に従ったＩＣＣ分析における、マウスモノクローナル抗Ｅ６抗体によって染色したＣＩＮ３子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の染色画像を示す図である。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＩＣＣ分析において図１４Ｂにおいて示した同じ抗Ｅ６抗体によって染色した腺癌線維腫（ＡＤＣ）子宮頸部のこすり取ったサンプルからの子宮頸部細胞の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施形態は、ＨＰＶタンパク質に対する様々なモノクローナル抗体を提供し、高リスクおよび低リスクのＨＰＶによる感染が１個のモノクローナル抗体によって検出できるようにする。本発明はまた、高リスクのＨＰＶ型のみを検出するＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体も提供する。加えて、１個のＨＰＶタンパク質に高く特異的なモノクローナル抗体も提供する。
【００１７】
本発明の一つの態様は、モノクローナル抗体の生成方法を提供する。この方法は、様々な精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を獲得する工程および２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および生物学的および臨床的サンプルにおける対応するパピローマウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を獲得する工程を有する。
【００１８】
加えて、２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞の陽性選択および非ＨＰＶタンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞の陰性選択を有する方法を用いることによって生成する。例えば、この方法は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択することによって、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するようにする工程を有する。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせがある。
【００１９】
本発明の他の態様は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、２個以上の異なるＨＰＶ型からのヒトパピローマウイルス性タンパク質上の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を得る工程を有する。また、本発明の他の方法は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、他の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質ではなく、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のうち１個のみの特異的なエピトープを認識できるモノクローナル抗体を獲得する工程を有する。
【００２０】
例えば、同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体は、同じＨＰＶ型および／または異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって本発明の方法によって生成する。一つの実施例において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体を生成し、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質に対応する２個以上のＨＰＶ初期タンパク質に結合できるようにする。他の実施例において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質であり、他のモノクローナル抗体を生成し、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できるようにする。
【００２１】
得られた例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合することができるモノクローナル抗体の種類があり；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，およびＨＰＶ１６ Ｌ１ウイルス性タンパク質の全てに結合することができるモノクローナル抗体の種類があり；ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合することができるモノクローナル抗体の種類がある。したがって、本発明の方法を用いて生成したモノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６およびそれらの組み合わせからなる群から選択した同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる。
【００２２】
これらのモノクローナル抗体は、ＨＰＶ感染およびＨＰＶに関連する子宮頸癌および他の疾患を検出する１個以上の免疫分析に用いることができる。適切な免疫分析には、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体の分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞の免疫組織化学、およびフローサイトメトリによる免疫化学分析がある。
【００２３】
本発明の他の態様は、異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる方法およびモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、異なるＨＰＶ型からの２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択することによって、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、抗体生成ハイブリドーマ細胞が２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合できるモノクローナル抗体を生成するようにして得る。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合することができる種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合することができる他の種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質に結合することができる他の種類のモノクローナル抗体があり、様々な免疫学的分析に用いることができる。
【００２４】
本発明のさらに他の態様は、異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、１個のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および他のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、スクリーニング工程は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に陽性反応を示し、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択し、抗体生成ハイブリドーマ細胞から生成したモノクローナル抗体が異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるようにする。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質およびそれらの組み合わせがあり、精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせがある。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の全てに結合することができる種類のモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の全てに結合することができる他の種類のモノクローナル抗体がある。本発明の方法によって生成したこの種類のモノクローナル抗体は、１個以上の免疫学的分析においてこれらのウイルス性タンパク質のいずれかの存在を検出するのに用いることができる。
【００２５】
本発明のさらに他の態様は、第１ウイルス性タンパク質とは異なる第２ウイルス性タンパク質ではなく第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合することができるＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体を提供する。このモノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応を示し第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応を示す抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得ることができ、第１および第２ウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。ＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体は、第１ウイルス性タンパク質の１個のウイルス性タンパク質のみにしか結合できない。第１ウイルス性タンパク質には、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６およびそれらの組み合わせ等のＨＰＶ型からのウイルス性タンパク質がある。例示的なモノクローナル抗体には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質からなる群から選択した１個のウイルス性タンパク質しか認識しないモノクローナル抗体がある。本発明の方法によって生成したこの種類のモノクローナル抗体は、１個以上の免疫学的分析における特異的なウイルス性タンパク質の存在を検出するのに用いる。
【００２６】
一つの実施形態において、様々な組み換え型パピローマウイルス性タンパク質を、パピローマウイルス性タンパク質を発現する細胞を溶解後に、可溶化各分から精製して、可溶な精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質となるようにする。例えば、組み換え型タンパク質は、溶液において陰性の折り畳みとなるように精製する。他の実施例として、組み換え型タンパク質は、そのリン脂質または中性ｐＨまたはＰＢＳ緩衝液に分類されるｐＨ値で緩衝液と共に精製する。実施例として、様々な組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、例えば、中性ｐＨでの緩衝溶液においてまたはＰＢＳ緩衝液における溶解によって、スピンカラムもしくは濃縮器による濃縮などによって、その陰性折り畳みとなるように精製し、その溶解度を維持し高濃度を得る。ＨＰＶ組み換え型タンパク質の精製方法の一つは、米国特許第１１／５５９３６６号明細書「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその用途」において開示され、参照して組み込む。
【００２７】
モノクローナル抗体を作成するＨＰＶタンパク質のソースは、限定されていない；様々なＨＰＶ遺伝子および様々なＨＰＶ型／種からの様々なタンパク質がある。本発明のＨＰＶウイルス性タンパク質および／または癌タンパク質には、限定することはないが、ＨＰＶ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ Ｅ２タンパク質、ＨＰＶ Ｅ３タンパク質、ＨＰＶ Ｅ４タンパク質、ＨＰＶ Ｅ５タンパク質、ＨＰＶ Ｌ２タンパク質がある。
【００２８】
ＨＰＶ型は限定しない。一般的に、ＨＰＶは、少なくとも３個の群に分けられる：（１）ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８などで、子宮頸癌および他の癌の癌タンパク質である；（２）低リスクＨＰＶ型（α−パピローマウイルスＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−１３，ＨＰＶ−３４，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５５，ＨＰＶ−７３，ＨＰＶ−２７；ＰＣＰＶ１，ＨＰＶ−２ａ，ＨＰＶ５７などで、子宮頸癌および他の癌に発展するリスクが低い）；（３）他の非発癌タンパク質α−パピローマウイルス（ＨＰＶ−６６，ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５９，ＨＰＶ−３０，ＨＰＶ−２６，ＨＰＶ−１０，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−３２，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−３，ＨＰＶ−２９，ＨＰＶ−７０など）。一人のヒト対象において多くのＨＰＶ感染が、これらのＨＰＶ群（高リスク、低リスクおよび／または非発癌性）のうち２個以上のＨＰＶによって起こる。
【００２９】
２個の問題が存在し、臨床ＨＰＶ診断に利用できる抗体がない。第１に、臨床サンプルにおけるＨＰＶタンパク質が非常に少量であることである。第２に、臨床サンプルにおけるＨＰＶ型は概して知られていないことである。したがって、当業者は失敗し、長年にわたって切実に必要であっても、様々な臨床ＨＰＶ型を認識するＨＰＶ抗体の大量の生成を行うことができず、この必要性は満たされていない。診断試験における抗体の良い用途に対して、抗体は、免疫原上に存在するエピトープだけでなく、エピトープが分析のために準備した試験サンプルにおいて露呈した（すなわち、低温保存、切開および固定等の組織のいずれの予処理後に露呈した）エピトープも認識する。したがって、多量のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングするように選択した方法は、診断に有効な抗体の選択を目的とする。組み換え型ＨＰＶタンパク質の精製および獲得において、およびＨＰＶ感染を検出する精製組み換え型タンパク質からの抗体の生成において既知の失敗があり、人々はその必要性を解決することができていない。本発明は、抗ＨＰＶ抗体を生成し、抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする免疫原として用いることができる精製組み換え型ＨＰＶタンパク質を提供し、生成した抗ＨＰＶ抗体を臨床サンプルに用いることができるようにする。
【００３０】
ＨＰＶタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成する方法を本願明細書で提供し、１個以上の抗体を獲得し、各モノクローナル抗体は、様々なＨＰＶタンパク質および／もしくはＨＰＶ型の中でＨＰＶタンパク質の共通のエピトープまたは特定のエピトープを認識することができる。加えて、本願明細書で得られるモノクローナル抗体のいくつかは、ＨＰＶ型特異性であるが、本願明細書で得られるモノクローナル抗体のいくつかは非ＨＰＶ特異性である。非ＨＰＶ特異性抗体は、臨床サンプルにおいて存在する一般的なＨＰＶ型を検出するのに有効である。その結果、これらのモノクローナル抗体は、１個以上のサンプルにおけるＨＰＶ感染を検出する分析において用いるのに適切である。これらの非ＨＰＶ特異性抗体のエピトープマッピングは、これらのモノクローナル抗体を結合するＨＰＶ特異性タンパク質の共通のエピトープを特定し配置する。
【００３１】
一つの実施形態において、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。２個以上の精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質には、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせ等の適切なＨＰＶタンパク質のいずれかがある。
【００３２】
他の実施形態において、２個以上のＨＰＶタンパク質は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。例えば、２個以上のＨＰＶタンパク質がＥ６およびＥ７初期タンパク質であるとき、Ｅ６およびＥ７初期タンパク質の両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６および／もしくはＨＰＶ１８、または他のＨＰＶ型からの２個以上の精製Ｅ６およびＥ７タンパク質をスクリーニングすることによって得る。他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は２個以上の組み換え型ＨＰＶ初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が、２個以上の精製組み換え型初期タンパク質に対応するＨＰＶ初期タンパク質の共通のエピトープを認識できる。
【００３３】
一つの実施例は、精製ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。他の実施例は、精製ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。
【００３４】
他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質があり、モノクローナル抗体は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する初期および後期ウイルス性タンパク質の共通のエピトープを認識できる。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質およびそれらの組み合わせ等の、パピローマウイルス型のいずれかからの初期パピローマウイルス性タンパク質のいずれかである。精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質Ｈは、ＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質およびそれらの組み合わせ等のいずれかの後期パピローマウイルス性タンパク質である。例えば、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質でスクリーニングすることにって得て、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質上の共通のエピトープを認識できる。
【００３５】
さらに他の実施形態において、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、少なくとも２個の異なるパピローマウイルス型からの２個以上の組み換え型パピローマウイルス性タンパク質である。例えば、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。パピローマウイルス型は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６等のいずれかのパピローマウイルス型である。第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１組み換え型タンパク質およびそれらの組み合わせである。
【００３６】
したがって、一つの実施例は、２個の異なるＨＰＶ型、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方からのＥ６タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体であり、精製ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質および精製ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得る。他の実施例は、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。さらに他の実施例は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体である。
【００３７】
さらに他の実施形態において、他のＨＰＶタンパク質でなく一つのＨＰＶタンパク質のみの特定のエピトープを認識できるモノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって核と岸、１個または他のウイルス性タンパク質は、第１および第２ＨＰＶ型の第１および第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する。
【００３８】
一つの実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を認識または相互作用しない。他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質を認識または相互作用しない。
【００３９】
他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ７の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を認識または相互作用しない。他の実施例は、精製組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質および精製組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を有する抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体であり、モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ７の特定のエピトープを認識し、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質を認識または相互作用しない。
【００４０】
他の実施形態において、ＨＰＶタンパク質、Ｅ６、Ｅ７またはＬ１に対する様々なモノクローナル抗体（抗ＨＰＶ Ｅ６，抗ＨＰＶ Ｅ７，抗ＨＰＶ Ｌ１）は、抗体を引き上げた免疫原に関連するＨＰＶ型を特異的に検出するモノクローナル抗体および非ＨＰＶ型特異性モノクローナル抗体がある。本発明の抗体には、限定することはないが、抗Ｅ６，抗Ｅ７および抗Ｌ１などがあり、１個以上の免疫学的分析において用いる。例えば、モノクローナル抗体は、様々な生物学的サンプル、細胞株、および／また様々な重症度の内皮病変（ＣＩＮ２，ＣＩＮ３，ＬＳＩＬ，ＨＳＩＬ，ＡＳＣＩＩＳ）および異なる子宮頸癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ，共通の癌型）および腺癌（ＡＤＣ，腺癌型）の臨床サンプルの試験に用いることができる。
【００４１】
一つの実施形態において、パピローマウイルス感染したヒト対象のスクリーニング方法は、ヒト対象から臨床サンプルを獲得する工程と、様々なＨＰＶ組み換え型タンパク質およびＨＰＶタンパク質に特異的な研究室で作成した抗体を用いてヒト対象からの臨床サンプルで１個以上の免疫学的分析を行い、ヒト対象におけるＨＰＶ抗体およびＨＰＶタンパク質の存在からＨＰＶ感染を検出およびスクリーニングする工程を有する。他の実施形態において、ヒト対象におけるＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ組み換え型タンパク質に対する抗体を用いて検出し、限定することはないが、様々なＨＰＶ初期および後期タンパク質に対する様々なポリクロ―ナルおよびモノクローナル抗体がある。
【００４２】
本願明細書で開発した抗体は、高品質であり、または、高感度およびＨＰＶ感染をスクリーニングし子宮頸癌の検出に特異的な免疫学的分析をにおいて有効な、ＨＰＶ初期および後期遺伝子によってコードした正確に精製組み換え型タンパク質である。モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体の分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞の免疫組織化学、およびフローサイトメトリによる免疫化学分析からなる群から選択した１個以上の免疫学的分析に用いることができる。一つの実施形態において、１個以上の免疫学的分析は、最小またはさらなる装置を必要としない非侵襲的である。
【００４３】
免疫学的分析を行う基本技術は、Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989； "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989および他の本および当該技術において既知のマニュアルにおいてわかる。関連する免疫学的分析、組織および／もしくは子宮頸部細胞に対する免疫化学分析、および／またはフローサイトメトリによる免疫染色分析も、２００６年１１月１３日に開示された米国特許第１１／５５９３６６号明細書「ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の検出方法および子宮頸癌におけるその用途」；２００８年４月１４日に開示された米国特許第１２／０８２７４０号明細書「ＨＰＶ検出のためのタンパク質チップ」；２００８年６月１３日に開示された米国特許第６１／１３１９９１号明細書「ＨＰＶ検出のための抗体および分析」；２００８年９月２２日に開示された米国特許第６１／１９２９１２号明細書「ＨＰＶに関連する子宮頸癌の初期段階および後期段階の検出、スクリーニングおよび診断に有効なＨＰＶタンパク質に対する新規のモノクローナル抗体」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０１）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０２）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」；本明細書で開示している（ＮＥＯＤ／０００５．０２）「初期および後期ＨＰＶ感染のｉｎ ｓｉｔｕ検出」においてわかる。上述の参照文献は全て参照して組み込む。
【００４４】
一つの実施形態において、本発明はまた、一般的なＨＰＶ感染症および様々なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染を検出するのに有効な、様々な方法、検出分析およびキット、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ポリペプチド、組み換え型タンパク質および核酸も提供する。加えて、ＨＰＶタンパク質の存在を検出する分析またはサンプルフォーマットは限定されず、子宮頸部組織、子宮頸部細胞、子宮頸部のこすり取ったもの、血清、体液などに用いることができる。有効なスクリーニングまたは診断分析は、ＩＨＣ，ＩＣＣ、フローサイトメトリ、ビーズに結合した抗体、迅速試験、タンパク質チップ、ドットプロット、スロット、および従来のＥＬＩＳＡ分析である。ＨＰＶタンパク質は、病理学者による分類後ＩＨＣ染色によって示すように上皮組織において存在する本発明の抗体によって検出できる。
【００４５】
本発明において説明する抗体は、様々なソースの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶタンパク質を検出するツールを提供する。実施例として、本願明細書で記載する抗体は、マイクロタイタープレート上にコーティングする捕捉抗体として用いることができ、および／またはＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定）のサンドウィッチフォーマットとして検出抗体として用いることができる。ＨＰＶタンパク質および／またはＨＰＶ型の検出によって、抗体は、特定のＨＰＶタンパク質もしくはＨＰＶ型、またはそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体の本願明細書で記載する特異性に基づいた用途に対して選択する。本願明細書で記載するモノクローナル抗体の選択した特異性からの検出抗体は、ビオチン、アルカリリン酸塩、ＨＲＰ，読み取るための色測定、化学発光または蛍光基質に基づいた蛍光試薬などの標識と直接結合することができる。検出抗体はまた、ビオチン、アルカリリン酸塩、ＨＲＰ，蛍光試薬などの標識に結合した２次抗体によって本願明細書で記載したポリクローナル抗体から選択する。捕捉および検出抗体としてのサンドウィッチＥＬＩＳＡに対して用いるポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組み合わせは、結合を検出するシグナルを増幅する二次抗体を組み込むことによって分析感度を上げる。直接的ＥＩＡ（酵素免疫測定）に対して、試験する細胞、サンプルまたは培養細胞を収集し溶解して、検体としての細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化し、各ウェルに対して各サンプルをコーティングするために同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコートし、その後、本願明細書で記載する特異性を有する抗体を検出した。
【００４６】
様々なＨＰＶ遺伝子型からのＨＰＶ ＤＮＡ、遺伝子、初期ウイルス性タンパク質、後期ウイルス性タンパク質、発癌タンパク質および／またはカプシドタンパク質の検出は、"Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989; "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,および他の本およびマニュアルに従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法および検出分析によって行い、ＨＰＶ感染の一般的な臨床スクリーニングにおいて非常に有効である。
【００４７】
加えて、免疫学的分析によるＨＰＶ抗体および／または発癌タンパク質の検出は、ＨＰＶ感染に対する一般的な臨床スクリーニングおよび子宮頸癌に対する初期診断において用いることができ、１個の迅速試験または多重試験において行うことができる。
【００４８】
異なる濃度のＨＰＶタンパク質および宿主タンパク質の比較検出は、本発明の抗体を用いた同一のまたは異なる免疫学的分析において行うことができる。また、子宮頸部のＨＳＶに関連する癌の診断において用いることができ、ＨＰＶ感染によって誘起した内皮細胞の異常に関連する場合、前癌状態および癌状態のＨＰＶに関連する内皮細胞病変、およびＨＰＶに関連する子宮頸癌および腺癌に発展するリスクがある場合も用いることができる。本願明細書で記載する方法は、独立して用いることができる、または、従来の細胞パパニコロースメア試験または組織学試験に付属するスクリーニングツールとして用いることができ、その結果を経過観察する患者の管理と比較することができる。
【００４９】
本発明の抗体は、ＨＰＶ感染によって発生した病期を検出する免疫学的分析において用いることができる。これらの病期は、例えば、初期ＨＰＶ感染、後期ＨＰＶ感染、初期子宮頸部細胞病変、後期子宮頸部細胞病変、軽度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、重度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、子宮頸部上皮内癌段階１，２，３（それぞれＣＩＮ１，ＣＩＮ２，ＣＩＮ３）、発展した子宮頸癌、腺癌（ＡＤＣ）または扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）である。
【実施例】
【００５０】
１．抗血清および抗ＨＰＶ抗体を生成し、モノクローナル抗体に対してハイブリドーマ細胞をスクリーニングするために免疫原として用いるＨＰＶ組み換え型タンパク質の発現、精製および準備
ＨＰＶ組み換え型タンパク質は、限定することはないが、Ｅ２，Ｅ６、Ｅ７，Ｌ１，Ｌ２等の初期遺伝子および／または後期遺伝子のＨＰＶタンパク質である、いずれかの種類のＨＰＶタンパク質であり、様々なＨＰＶ型からでよい。全長Ｅ６，Ｅ７および／またはＬ１ポリペプチド配列は、タンパク質精製間の望ましくない凝集化、タンパク質の不安定性、低度の発現、精製タンパク質の低い免疫原反応のために獲得および精製が非常に難しいと考えられている。例えば、多くの初期Ｅ６発癌タンパク質が、多くのシステインアミノ酸を有し、これによってＥ６発癌タンパク質の正しいトポグラフィー（地図）は、多くのジスルフィド結合特性の形成を必要とする。加えて、初期Ｅ６およびＥ７タンパク質の小ペプチドを用いた特定の免疫学的分析の結果、非常に低い分析特異性および感度となり、臨床的ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のツールとして望ましくない。したがって、本発明は、部分配列または全長配列のＨＰＶ発癌タンパク質を有する組み換え型ハイブリッドタンパク質等の組み換え型タンパク質を提供する。
【００５１】
１）ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ６初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子の１５７アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた４７４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ６タンパク質も得た。全てのクローン化手順は、"Molecular Cloning", A Laboratory Manual, eds. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989において開示されたプロトコールに従って行う。加えて、ＨＰＶ１８ Ｅ６遺伝子もクローン化し、ＤＮＡ配列を確認した。
【００５２】
２）ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７初期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子の９９アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた２９４塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＥ７ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。
【００５３】
３）ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１遺伝子によってコードした様々な組み換え型タンパク質のクローン化および生成
例示的なＨＰＶ型であるＨＰＶ−１６からの例示的な発癌性Ｅ７後期遺伝子はクローンであった。本願明細書でクローン化したＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子は、全ＨＰＶ−１６ Ｌ１遺伝子の５３１アミノ酸コーディング領域を有し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって得られた１５９６塩基対（ｂ．ｐ．）ＤＮＡフラグメントである。独立したＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列は、遺伝子バンクのデータベースからの配列と比較することによって確認した。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｅ７タンパク質も得た。加えて、異なるＨＰＶ型からのＬ１ ＤＮＡフラグメントも異なる臨床サンプルまたはソースからクローン化した。
【００５４】
ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の組み換え型Ｎ−末端フラグメントもＨｉｓタグした発現システムから得た。ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｎ−末端組み換え型タンパク質の分子量は、約３４ｋＤである。Ｌ１ Ｃ−末端フラグメントも得た。組み換え型ＨＰＶ−１８ Ｌ１タンパク質も得て、抗血清、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体に対する免疫原として用いた。
【００５５】
本願明細書で記載する１個以上の組み換え型タンパク質は、例えば、当該技術において既知の、大腸菌、酵母、バキュロウイルス、および／または哺乳動物細胞培養等における細菌発現システム、ウイルス発現システム、酵母発現システム、哺乳動物発現システム等の様々な適切なシステムにおいて発現する。ポリペプチドは、他の方法によって得ることができるが、本発明の実施形態は、それらの天然形である１個以上の組み換え型タンパク質を提供し、免疫学的分析におけるＨＰＶ感染したヒト対象の組織からの抗体に結合を確認するのに望ましい。例えば、ＧＳＴ，ＭＢＰ，またはＨｉｓタグしたＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１組み換え型タンパク質は、ＩＰＴＧ駆動誘導を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現した。タンパク質の発現を誘導後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質は、培養した細胞の溶解後の可溶画分から得て、約０．１〜１ｍｇ／ｍＬ以上の最終濃度まで精製した。組み換え型ＨＰＶタンパク質の純度は、ＰＡＧＥ分析を基にして９０％以上であると推測した。組み換え型ＨＰＶタンパク質は、臨床サンプルにおけるＨＰＶ抗体の存在を検出し、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を生成する免疫原としても用いた。
【００５６】
本願明細書で記載する様々な発現ベクターにおける様々な組み換え型パピローマウイルスタンパク質を得る細胞培養液を、その後最大１リットルもしくは１０リットル、または１００リットル以上まで増やし、多量の精製する可溶組み換え型タンパク質を得た。細胞溶解後の可溶画分は、適切な発現システムで様々なクロマトグラフィーに通して、ＨＰＶ組み換え型タンパク質に沿って発現したタグに結合させた。その後、タグＨＰＶ組み換え型タンパク質をカラムから溶出し、１００ｍＬまたは１０ｍＬから１ｍＬまで濃縮した。精製可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質をさらに濃縮し、中性ｐＨでの緩衝液またはＰＢＳ緩衝液で透析し、ＨＰＶタンパク質に対する抗血清を生成する免疫原として用いた。このように、可溶組み換え型ＨＰＶタンパク質を、可溶画分から精製し、ｉｎ ｖｉｖｏの性質のそのままの折り畳み状態に近いように折り畳んだ。
【００５７】
高品質な精製組み換え型ＨＰＶタンパク質の獲得は、ＨＰＶ感染を検出する共通のエピトープまたは特定のエピトープを認識する様々な種類のモノクローナル抗体の生成において重要である。精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ感染臨床サンプルからのＨＰＶ抗体への結合を確認するために試験した。したがって、この精製組み換え型ＨＰＶタンパク質は、抗血清を上げる免疫原として用いるのに適切であり、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＰＶウイルス性タンパク質を認識できる抗体を生成する。
【００５８】
２．抗ＨＰＶポリクローナル抗体生成
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。適切な滴定量からの生成出血を収集した；処理した血清をタンパク質Ａカラムまたは親和カラムを介して免疫グロブリン（ｌｇ）精製を行うのに用いた。精製ｌｇＧをＨＰＶ免疫分析に対する抗ＨＰＶ抗体として用いた。
【００５９】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗血清を獲得、精製および試験して、ＨＰＶ感染、細胞病変、炎症または癌疾患発展の発病に関係なくＨＰＶ感染を検出した。他の研究者は、抗ＨＰＶモノクローナル抗体を開発しようと試みたが、モノクローナル抗体の生成に十分なＨＰＶタンパク質の生成に失敗したため失敗してきた；彼らは免疫原が免疫原性でなかったため高い特異性を有するモノクローナル抗体の生成に失敗した；または、初期段階ＨＰＶ感染した臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶタンパク質の天然形を認識できない抗体を生成した。変異ペプチドに対して上昇するいくつかの抗体の未、後期段階子宮頸がんを認識できるが、それらの抗体が野生型ＨＰＶ天然タンパク質またはいずれかの初期段階ＨＰＶ感染かどうかは確証できない。加えて、後期段階ＨＰＶ検出は、疾患の医療介入および治療するには遅すぎる。
【００６０】
本願明細書で記載する抗体の臨床的用途は、適切な臨床サンプルを用いて、ＥＬＩＳＡ分析、免疫細胞化学分析、免疫組織化学分析等のＨＰＶ免疫学的分析によって評価した。本発明の方法から得た新規のモノクローナル抗体および抗血清は、臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶウイルス性タンパク質に相互作用および結合することができ、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）等の初期段階細胞病変および後期段階ＨＰＶに関連した子宮頸癌を有することを確認する。本願明細書で記載するモノクローナル抗体および抗血清は、ＨＰＶに関連する発病および初期および後期の両方における子宮頸癌の発展を検出およびスクリーニングする有効なツールを提供し；疾患の進行に介入する手段および初期治療を提供する機械を提供する。
【００６１】
３．ＨＰＶモノクローナル抗体の開発
大腸菌において発現した組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１を精製、濃縮およびＰＢＳで透析し、免疫原として用いた。マウスの免疫付与を標準的なプロトコールにしたがって行った。得られた各血清の滴定をＥＬＩＳＡ分析によって試験し、その後定期的なブースティングおよび出血させた。マウスの血清の滴定は最適となり、腫瘍細胞を有するマウスの脾臓細胞の融合を標準的なプロトコールにしたがって行った。融合細胞、例えばハイブリドーマ細胞のクローン化をさらに培養した。
【００６２】
１）ハイブリドーマのスクリーニング
本発明において記載する、ｐａｎを有するハイブリドーマ細胞を生成し、様々なＨＰＶタンパク質に特異的に結合する抗ＨＰＶ抗体生成ハイブリドーマ細胞を得るため、ハイブリドーマクローンを、元の免疫原だけでなく陽性スクリーニングのさらなるＨＰＶタンパク質および陰性スクリーニングの無関係のタンパク質等の様々なタンパク質でスクリーニングした。例えば２個以上の精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質を、各ハイブリドーマクローンに対してスクリーニングして、抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングおよび獲得し、こうして得られた各抗体生成ハイブリドーマ細胞株の特異性を試験および理解するために用いた。
【００６３】
ハイブリドーマスクリーニングの実施例として、抗体生成ハイブリドーマ細胞を２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングして、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に反応できるようにした。２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質には、限定することはないが、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質および様々なＨＰＶ型からの他のＨＰＶ初期および後期タンパク質がある。
【００６４】
抗体生成ハイブリドーマ細胞は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の全てに陽性反応を示し、ＢＳＡ，ｈｉｓ６タグ、ＧＳＴタンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、組み換え型タンパク質において用いる他のタグまたはタンパク質、他の容易に利用できる非ＨＰＶタンパク質等の非ＨＳＶタンパク質に陰性反応を示すようにスクリーニングする。このように、このハイブリドーマスクリーニングから生成したモノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質に対応する、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質全てに結合することができる（例えば、臨床サンプルにおいて存在するＨＰＶウイルス性タンパク質）。
【００６５】
２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の一つの実施例は、ＨＰＶ初期タンパク質であり、モノクローナル抗体は、２個以上のヒトパピローマウイルス性初期タンパク質に反応することができる。例えば、このようにスクリーニングおよび獲得した一つのハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。このようにスクリーニングおよび獲得した他のハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。
【００６６】
２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の他の実施例には、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質があり、生成したモノクローナル抗体は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質の共通のエピトープを認識できる。精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質および他のＨＰＶ組み換え型初期タンパク質であり、精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性後期タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、および他のＨＰＶ組み換え型後期タンパク質である。例えば、このようにスクリーニングおよび獲得したハイブリドーマ細胞株は、ＨＰＶ１６Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体；ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の共通のエピトープを認識できるモノクローナル抗体を生成する。多くの実施形態を本発明の図面において提供する。
【００６７】
抗体生成ハイブリドーマ細胞はまた、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングし、モノクローナル抗体が２個以上の異なるＨＰＶ型からのヒトパピローマウイルス性タンパク質の共通のエピトープを反応できるようにする。第１および第２ＨＰＶ型は、ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８および他のＨＰＶ型である。２個以上の異なるＨＰＶ型は、例えば、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６である。例として、第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質は、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質および組み換え型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質である。
【００６８】
ハイブリドーマスクリーニングの他の実施例として、抗体生成ハイブリドーマ細胞を、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のいくつかに陽性反応を示し、２個以上の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質のいくつかおよび／または非ＨＰＶタンパク質に陰性反応を示すタンパク質でスクリーニングする。このように、このハイブリドーマスクリーニングから生成したモノクローナル抗体は、他のＨＰＶウイルス性タンパク質ではなくいくつかのＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができる。
【００６９】
例えば、モノクローナル抗体は、第１ＨＰＶ型からの第１精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質および第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質でスクリーニングすることによって獲得し、モノクローナル抗体は、他の精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質ではなく第１および第２精製組み換え型ヒトパピローマウイルス性タンパク質の一つの特定のエピトープに反応する。得られた特異的なモノクローナル抗体には、他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体；他のＨＰＶタンパク質ではなくＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質にのみ結合することができるモノクローナル抗体がある。
【００７０】
２）ハイブリドーマ細胞株ストック：免疫学的分析（例えば、ＥＬＩＳＡ，ＥＩＡおよび他の分析）によって判断した所定の陽性反応および所定の陰性反応を示すハイブリドーマ細胞株クローンを選択して単一細胞にクローン化した。各単一細胞クローンをその後、組織培養によって成長した。細胞数はｍＬ当たり百万に到達し、細胞を凍結して−８０°Ｃまたは強力ストックとして液体窒素においた。
【００７１】
３）腹水生成：各ハイブリドーマ細胞株を組織培養において成長させ、マウスに腹水生成させるように注射した。腹水を収集して、タンパク質Ｇカラムによって免疫グロブリン精製に対して処理した。各ハイブリドーマ細胞株からの精製免疫グロブリンをイソタイプして、ＨＰＶ免疫学的分析に用いた。
【００７２】
４．各抗ＨＰＶ抗体の特異性
１個以上の免疫学的分析を用いて、２個以上のＨＰＶ組み換え型タンパク質でハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得たモノクローナル抗体の特異性を試験した。ＥＩＡ（酵素免疫測定）および／またはウエスタンブロットを、本願明細書で記載するＨＰＶ抗体の特異性を試験する分析フォーマットとして用いた。様々な精製組み換え型ＨＰＶタンパク質には、抗ＨＰＶ抗体を得るのに用いる元のスクリーニングタンパク質およびスクリーニングに用いない他のタンパク質があり、ＥＩＡ上で得られた抗ＨＰＶ抗体の特異性を試験するマイクロタイタープレート上にコーティングするのに用いた。（ＨＰＶ感染しているまたはしていない）子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物も、ウエスタンブロットによる抗ＨＰＶ抗体の特異性を試験するのに用いた。ＨＰＶ抗体のＨＰＶ感染した細胞株からのタンパク質との結合および反応性を確認するため、ウエスタンブロットは、ＨＰＶ感染した細胞株において存在するタンパク質に対応する特異的なタンパク質結合を証明するのに非常に有効である。これらのウエスタンブロットタンパク質結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル状のそれらの期待した分子量で組み換え型ＨＰＶタンパク質と比較することができる。Ｈｅｌａ細胞株（ＨＰＶ陽性）、ＳｉＨａ細胞株（ＨＰＶ１６陽性）およびＣ３３Ａ細胞株（ＨＰＶ感染なし）等の子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いて、ウエスタンブロットで本発明の抗ＨＰＶモノクローナル抗体によってＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１の検出を行うのに用いた。
【００７３】
それらの天然形の様々な組み換え型タンパク質をマイクロタイタープレートの底部にコートして、ＥＩＡ分析を行い、本発明の方法によって生成した各抗体の特異性を試験する。同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合することができるモノクローナル抗体を得る。図１Ａおよび図１Ｂは、ハイブリドーマ細胞の２個の異なるクローンを示し、各クローンは、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７の両方の共通のエピトープを認識するモノクローナル抗体を生成することができる。図１Ａおよび図１Ｂにおいて、ＥＩＡの陽性反応は、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７でのみ観察され、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７，ＨＰＶ Ｌ１ Ｎ−末端、ＨＰＶ１６ Ｌ１および６ｘ−Ｈｉｓタンパク質では陰性反応を示すまたは反応が観察されない。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ Ｅ７に特異的に結合するが、ＨＰＶ１６ Ｌ１またはＨＰＶ１８ Ｅ７には結合しないことを実証する。
【００７４】
同じＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体を得る。図２Ａは、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質の全てに結合でき、ＨＰＶ１８ Ｅ６，ＨＰＶ１８ Ｅ７および６ｘ−Ｈｉｓタンパク質に陰性反応を示すモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６およびＬ１タンパク質の天然系に強く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７の天然系には弱く反応するが、ＨＰＶ１８ Ｅ６またはＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の天然系には反応しないことを示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体が、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質の全ての天然形によって認識されるＨＰＶ１６型特異の共通のエピトープを有することを示す。
【００７５】
図２Ｂは、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質に反応できるモノクローナル抗体のウエスタンブロット分析の結果を示す。本願明細書で記載する抗体を用いてウエスタンブロットによって検出した組み換え型タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６（約１８〜２０ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｌ１（約５５ｋＤａ）タンパク質の検出を行う。期待した分子量を示した各組み換え型タンパク質は、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７には検出可能な反応性を示さないことを示す。図２Ａおよび図２Ｂにおける結果を比較すると、これらのデータは、この抗ＨＰＶモノクローナル抗体が天然形のＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質および変性形のＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質によって認識できるＨＰＶ共通エピトープを有することを示す。
【００７６】
図２Ｃは、図２Ｂにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。各細胞株からの子宮頸癌細胞株の細胞溶解物および変性形の組み換え型タンパク質の両方を比較してここに示す。このモノクローナル抗体のＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質との特異性は、モノクローナル抗体がＨＰＶ感染した子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶウイルス性タンパク質を認識できるが、ＨＰＶ感染していない細胞株のは認識できないことから確認できる。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した二重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８感染）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６感染）細胞株における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｅ７（約１５ｋＤａ）タンパク質の検出を行う。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７には検出可能な反応性を示さないことを示す。
【００７７】
異なるＨＰＶ型からの初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体も得る。図３Ａは、ＥＩＡで、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８型からの組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質に反応できるモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、この種類のモノクローナル抗体がＨＰＶ１６の組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６およびＥ７タンパク質の全てに特異的に反応するが、ｈｉｓ−タグペプチドには反応しない（組み換え型タンパク質が発現および精製に対して６ｘ−Ｈｉｓに溶解しても）ことを示す。これらのデータは、この抗体が、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７，ＨＰＶ１６ Ｌ１，ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の全てに反応することができる能力によって示すように、異なるＨＰＶ型のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８によって共有された共通のエピトープを認識することを示す。
【００７８】
図３Ｂは、図３Ａにおいて用いたモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの結果を示す。このモノクローナル抗体のこれらの組み換え型タンパク質（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６，Ｅ７およびＬ１タンパク質）に対する陽性反応は、モノクローナル抗体が、Ｅ６（約１８ｋＤａ）、Ｅ７（約１５ｋＤａ）およびＬ１（約５５ｋＤａ）タンパク質を認識できることを示す。ウエスタンブロット分析の各組み換え型タンパク質レーンから結果できた結合は、期待した分子量を示し、このモノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８からの変性したＥ６およびＥ７タンパク質に強く反応し、変性したＬ１タンパク質に弱く反応することを示す。図３Ａおよび図３Ｂの結果は、このモノクローナル抗体が、ＨＰＶ共通のエピトープを認識し、天然形および変性形のＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質と反応できることを示す。
【００７９】
図３Ｃは、図３Ａおよび図３Ｂにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。細胞溶解物および変性形の組み換え型タンパク質の両方を試験してここに示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した二重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）およびＳｉＨａ（ＨＰＶ１６）細胞株における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）およびＨＰＶ Ｅ７（約１５ｋＤａ）タンパク質の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、ウエスタンブロットのとき、変性したＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質に強く反応し、変性したＨＰＶ Ｌ１組み換え型タンパク質に弱く反応し、ＨＰＶ１６ Ｅ７には検出可能な結合を示さないことを示す。
【００８０】
異なるＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体も得る。例えば、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み換え型Ｅ６タンパク質に反応できるモノクローナル抗体を得る。図４Ａは、ＥＩＡで、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の共通のエピトープを認識でき反応できるモノクローナル抗体の特異性を示す。天然形の組み換え型タンパク質を、マイクロタイタープレート上にコーティングする。これらのデータは、モノクローナル抗体が天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１タンパク質に反応性を示さないことを示す。
【００８１】
図４Ｂは、ＨＰＶ感染した子宮頸癌細胞株において存在するＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ Ｅ６ウイルス性タンパク質に特異的に結合する、図４Ａにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した一重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）における子宮頸癌細胞株からのＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）タンパク質の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、モノクローナル抗体が、変性したＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質に強く反応することを示す。
【００８２】
異なるＨＰＶからの１個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる他の例示的なモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体である。図５は、ＥＩＡ分析したときのこのモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形のＨＰＶ Ｅ６および組み換え型ＨＰＶ Ｌ１には反応を示さないことを示す。これらのデータは、この抗体がＨＰＶ型に関わらず、Ｅ７のみの共通のエピトープを認識することを示す。
【００８３】
第１ＨＰＶウイルス性タンパク質だけ結合でき、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合できないモノクローナル抗体も得る。図６は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６に反応でき、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。ＨＰＶ１６ Ｅ６のみに反応でき、ＨＰＶ１８ Ｅ６または他の組み換え型ＨＰＶタンパク質に反応できない特異的なエピトープを有するこのモノクローナル抗体が見られる。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が天然形のＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ７またはＬ１タンパク質には反応しないことを示す。これらのデータは、この抗体が、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質のみに反応でき、ＨＰＶ１６ Ｅ６特異性エピトープを認識することを示す。
【００８４】
他の例として、図７は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。このモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質のみに特異性を有し、ＨＰＶ１６ Ｅ６または他の組み換え型タンパク質には交差反応性を示さない。これらのデータは、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質のみに反応できる抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６特異的なエピトープを認識することを示す。
【００８５】
図７Ｂは、図７Ａにおいて用いたのと同じモノクローナル抗体と反応する様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物を用いたウエスタンブロットの結果を示す。１７ｋＤａの標準的な分子量マーカーの周囲でモノクローナル抗体によって検出した一重結合は、ＨｅＬａ（ＨＰＶ１８）子宮頸癌細胞株におけるＨＰＶ Ｅ６タンパク質（約１８ｋＤａ）の検出を行うが、Ｃ３３Ａ（非ＨＰＶ感染）細胞株の検出は行わない。期待した分子量を有する組み換え型タンパク質レーン上の結合は、このモノクローナル抗体も、変性したＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質に強く反応することを示す。
【００８６】
他の実施例として、図８は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。ＥＩＡで、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質または他の組み換え型タンパク質には交差反応性がない。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＬ１タンパク質には検出可能な結合をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｅ７エピトープを認識することを示す。
【００８７】
他の実施例として、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合できるが、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合できないモノクローナル抗体を示し、図９は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１８ Ｅ７に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形のＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＬ１タンパク質には反応しないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質のみに反応できるこの抗体が、ＨＰＶ１８ Ｅ７特異性エピトープを認識することを示す。
【００８８】
他の実施例として、図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１Ｎ−末端タンパク質のみに反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できない２個のモノクローナル抗体クローンの特異性を示す。ＥＩＡで、ＨＰＶ１６ Ｈ１または他の組み換え型タンパク質には交差反応性がない。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に強く反応するが、天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＥ７タンパク質には反応をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端エピトープを認識することを示す。
【００８９】
他の実施例として、図１１は、ＥＩＡで、組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に反応できるが、他の組み換え型ＨＰＶタンパク質には反応できないモノクローナル抗体の特異性を示す。このモノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端タンパク質上に存在する特異的なエピトープを認識する。他のＨＰＶ初期タンパク質との交差反応性は見られなかった。これらのデータは、本願明細書で記載するモノクローナル抗体が、天然形の組み換え型ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１−Ｎ末端タンパク質に強く反応するが、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８からの天然形の組み換え型ＨＰＶ Ｅ６またはＥ７タンパク質に反応をしないことを示す。これらのデータは、ＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端タンパク質のみに反応できるこの抗体がＨＰＶ１６ Ｌ１ Ｎ−末端特異性エピトープを認識することを示す。
【００９０】
本発明において記載する抗体は、様々な免疫学的分析において用いることができる。免疫学的分析の一つの実施例は、２個以上の抗ＨＰＶ抗体を用いるサンドウィッチＥＬＩＳＡ分析である。サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析を行うとき、まず、一次抗ＨＰＶ抗体をマイクロタイタープレート上にコートし、ＨＰＶウイルス性タンパク質または組み換え型ＨＰＶタンパク質を有するサンプルを試験して、マイクロタイタープレートの各ウェルに加え、一次抗ＨＰＶ抗体と反応させ、マイクロタイタープレートの底部表面上のＨＰＶタンパク質を捕捉する。第３に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または他の検出剤を結合させた二次抗ＨＰＶ抗体を加える。抗体−タンパク質複合体の検出は、通常、ＨＲＰに対してはＴＭＢ基質等の検出剤に対する基質を加えることによって行い、例えばＥＬＩＳＡリーダー等の検出装置によって、検出剤を付けた抗体−タンパク質複合体の存在を報告する（これによって、ＨＰＶタンパク質との抗ＨＰＶ抗体の結合活性に影響を与える）。サンドウィッチＥＬＩＳＡ分析は、一次および二次抗ＨＰＶ抗体によるＨＰＶタンパク質の特異的結合を提供し、これによって、２個の抗ＨＰＶ抗体の特異性を特定または確認する。本発明において、様々な抗体を、抗体特異性を示すためにコーティングする抗体および検出抗体として用いた。
【００９１】
【表１】
【００９２】
実施例として、表１は、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質の存在を検出するためのＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定）の実験設定および結果を示す（抗原試験）。この結果は、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質は、コーティングおよび検出抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６に反応できるとき検出できるが、コーティング抗体がＨＰＶ１６ Ｅ６に結合できるが検出抗体がＨＰＶ１８ Ｅ６のみに特異的に反応するにも関わらず、ＨＰＶ１６ Ｅ６組み換え型タンパク質は検出できないことを示す。同様の結果は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６の両方に結合できる検出抗体によってコーティングした特異的抗ＨＰＶ１８ Ｅ６を用いたときに得られた。データは、ＨＰＶ１８ Ｅ６組み換え型タンパク質をサンドウィッチ分析における試験タンパク質として用いるときに抗体の特異性がＨＰＶ１８ Ｅ６を認識するが、サンドウィッチ分析の抗原としての組み換え型ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質には反応性を示さないことを示す。本願明細書で記載する分析フォーマットは、限定することはないが、子宮頸癌細胞からの細胞溶解物、子宮頸部をかき取ったサンプル、組織、体液、血清などの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質を検出するのに用いた。この特異的なサンドウィッチ分析は、ＨＰＶ１８に特異的な型を提供し、この分析において検出可能なＨＰＶ１６ Ｅ６の結合を排除する。
【００９３】
【表２】
【００９４】
本発明において記載する抗体を示す他の実施例として、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質を用いることができ、表２は、コーティングおよび検出抗体に対してＨＰＶ１８ Ｅ７に対するモノクローナル抗体（ＨＰＶ１８ Ｅ７を認識する）を用いてＨＰＶ１８ Ｅ７組み換え型タンパク質の存在を検出するＥＬＩＳＡの結果を示す。データは、抗体の特異性が、サンドウィッチ分析の抗原としてＨＰＶ１８ Ｅ７を用いてＨＰＶ18 Ｅ７を認識するが、サンドウィッチ分析の抗原としてＨＰＶ１６ Ｅ７を用いると反応しない。本願明細書で記載するこの分析フォーマットは、限定することはないが、子宮頸癌細胞からの細胞溶解物、子宮頸部をかき取ったサンプル、組織、体液、血清などの生物学的サンプルにおいて存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を検出するのに用いた。このサンドウィッチ分析は、ＨＰＶ１８に対するＥ７特異性を提供し、ＨＰＶ感染のスクリーニングおよびＨＰＶ Ｅ７発癌タンパク質の検出に有効である。
５．抗ＨＰＶ抗体の用途
【００９５】
本発明において記載するＨＰＶ抗体は、一般的なＨＰＶ感染および様々な特異的なＨＰＶ遺伝子型、高リスクＨＰＶおよび低リスクＨＰＶによる感染に対する様々な免疫学的分析において用いることができる。ＨＰＶタンパク質の存在の検出において用いるサンプルは限定されず、子宮頸部組織、子宮頸部かき取り、血清、体液などから得ることができる。子宮頸癌もしくはＨＰＶ感染のスクリーニングまたは診断に有効な免疫学的分析は、ＩＨＣ分析、ＩＣＣ分析、フローサイトメトリ分析、ビーズに結合した抗体を用いる分析、迅速試験、タンパク質チップ分析、ドットプロットを有する免疫学的分析、スロットを用いる免疫学的分析、および従来のＥＬＩＳＡ分析がある。スクリーニング試験として、ＨＰＶ抗体は、有資格の細胞学者によって行われたＩＣＣによって証明されるように、子宮頸癌スクリーニングにおいて一般集団からの子宮頸部かき取りの内皮細胞においてｉｎ ｓｉｔｕ存在するＨＰＶタンパク質を検出するのに用いることができる。確認試験として、ＨＰＶ抗体はまた、有資格の病理学者によって行われたＩＨＣ染色によって証明されるように、内皮組織においてｉｎ ｓｉｔｕ存在するＨＰＶタンパク質を検出するのに用いることができる。
【００９６】
１）精製抗ＨＰＶ抗体の生物学的サンプルにおいて見つかるＨＰＶタンパク質との反応性
ＨＰＶ抗体のＨＰＶタンパク質との反応活性を確認するため、精製ＨＰＶ組み換え型タンパク質および／または生物学的サンプルからの細胞溶解物を含むＨＰＶをＥＬＩＳＡまたは直接ＥＩＡで試験する。生物学的サンプルには、限定することはないが、培養細胞からの細胞または臨床サンプルがある。
【００９７】
【表３】
【００９８】
実施例として、表３において示すデータのように、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７またはＨＰＶ Ｌ１タンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、陰性対照としてＨＥＣ−１Ａを用いるとき、直接ＥＩＡにおける様々な子宮頸癌細胞株からの細胞溶解物と特異的に反応できる。Ｃａｓｋｉ，Ｓｉｎａ，Ｃｘｃａ、Ｈｅｌａ等の子宮頸癌細胞株、およびＨＥＣ−１Ａ（非ＨＰＶ感染）等の子宮内膜癌細胞からの細胞溶解物を用いて、表３において示すようにそれぞれ、ＨＰＶ Ｅ６，ＨＰＶ Ｅ７およびＨＰＶ Ｌ１に特異的なＨＰＶモノクローナル抗体によるＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７，またはＬ１の検出を行うのに用いた。
【００９９】
本願明細書で試験し記載する培養細胞には、限定することはないが、Ｃａｓｋｉ（ＨＰＶ１６陽性），Ｓｉｎａ（ＨＰＶ１６陽性），Ｃｘｃａ、Ｈｅｌａ（ＨＰＶ１８陽性）等の子宮頸癌細胞およびＨＥＣ−１Ａ（非ＨＰＶ感染）等の子宮内膜癌細胞株がある。直接ＥＩＡに対して、細胞を回収、遠心、洗浄および溶解して、検体として細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を、定量化し、各ウェルにおける各サンプルをコーティングするための同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコーティングした。プレートを遮断し、示したように各ＨＰＶモノクローナル抗体およびその後ＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによって検出した。ＴＭＢ基質を加え、その後、標準的な反応停止溶液を加えた。ＯＤ４５０をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって行った。
【０１００】
２）精製抗ＨＰＶ抗体のＨＰＶタンパク質との反応性を臨床サンプルにおいて見つけた。
本願明細書で試験し記載する臨床サンプルは、限定することはないが、子宮頸部かき取り、体液または血清サンプルである。子宮頸部かき取りからの臨床生検も、ＥＩＡでＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質の検出をするために得た。
【０１０１】
液体の溶液、培養液（ＨＰＶ ＤＮＡ試験サンプルに対して用いた）、またはパップスメアにおいて子宮頸部かき取りを含む様々なサンプルソースからの細胞溶解物は、本発明において記載する様々なＨＰＶモノクローナル抗体を用いてＥＩＡフォーマット上で臨床サンプルからのＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１の検出を行う。本願明細書で記載する直接ＥＩＡを行うため、生検を処理、遠心分離、洗浄および溶解して、検体として細胞溶解物を生成した。細胞溶解物におけるタンパク質を定量化し、各ウェルにおける各サンプルをコーティングするための同量のタンパク質を用いてマイクロタイタープレートにコーティングした。プレートを遮断し、示したように各ＨＰＶモノクローナル抗体およびその後ＨＲＰ結合した抗マウスＩｇＧによって検出した。ＴＭＢ基質を加え、その後、標準的な反応停止溶液を加えた。ＯＤ４５０をＥＬＩＳＡプレートリーダーによって行った。
【０１０２】
【表４】
【０１０３】
表４において示す結果は、各モノクローナル抗体が、分析の陰性対照としてパップスメア正常（ＨＰＶネガ）を用いて、ＳＣＣサンプルからそれぞれＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質を検出することを示す。高度ＨＰＶ ＤＮＡ位置からのサンプルに対して、ＥＩＡで３個のうち１個がＥ６，Ｅ７およびＬ１で陽性である。これらのデータは、ＳＣＣ溶解物からのＥ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質は本願明細書で記載するモノクローナル抗体を用いてＥＩＡによって検出できるが、高度ＨＰＶ ＤＮＡ位置のサンプル（ＣＩＮ１／２）は、検出可能なＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７またはＬ１タンパク質を含むまたは含まないことを示す。この研究において用いた高度ＨＰＶ ＤＮＡ試験はｈｃであり、ＦＤＡしかＨＰＶ ＤＮＡ試験を承認しなかった。それらのＨＰＶ ＤＮＡ陽性であるがＨＰＶ ＥＩＡ陰性であるサンプルに対して、ＨＰＶ ＤＮＡ分析の陽性、またはＨＰＶ発癌タンパク質を発現しないそれらのＨＰＶ ＤＮＡ検出の陽性を偽ることができる。これらのデータは、本願明細書で記載するＨＰＶ ＥＩＡ分析が子宮頸癌のスクリーニングのさらなる臨床的妥当性を提供することを示す。
【０１０４】
３）免疫組織化学（ＩＨＣ）による精製抗ＨＰＶ抗体のｉｎ ｓｉｔｕＨＰＶタンパク質との反応性
４ミクロンに切断したパラフィン組織をスライドガラスガラス上に置き、６０°Ｃで一晩焼いた。脱パラフィン水和物の切片を脱マスクし、その後標準的なＩＨＣ染色手順に従った。本発明において記載するＨＰＶタンパク質精製モノクローナル抗体を希釈して、一次抗体として用いた。染色手順は、二次抗体溶液、洗浄後、各切片に対して適切な試薬を入れた。切片ができたらすぐ、精製水にスライドガラスを浸し、ヘマトキシン、脱水物で切片を対比染色し、カバースリップを載せた。
【０１０５】
実施例として、様々な段階のＣＩＮからの様々な子宮頸部組織を準備して、本願明細書で記載するラビットポリクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いてＩＨＣ分析を行った。他の実施例として、多くの子宮頸部生検サンプルを、様々なＨＰＶ型（ＨＰＶ ＤＮＡ遺伝子型によって確認）からのＨＰＶタンパク質を検出するモノクローナル抗体を用いて組織マイクロアレイフォーマットとして共に免疫組織化学的分析において試験した。ＨＰＶウイルス性タンパク質および／または発癌タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いて、本発明は、１個のＨＰＶ感染または複数のＨＰＶ感染のいずれかを有する臨床サンプルにおけるＨＰＶ Ｌ１ウイルス性タンパク質およびＥ６，Ｅ７発癌タンパク質の存在を検出する抗体を提供する。本願明細書で記載する１個の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、少なくとも癌に関連するＨＰＶ型（高リスクＨＰＶ型または低リスクＨＰＶ型のいずれか）であるＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−５２などによって１個のＨＰＶ感染を検出できる。１個の抗ＨＰＶモノクローナル抗体は、高リスク、低リスク、および非発癌性α−パピローマウイルスを含む、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−５９などで；ＰＣＰＶ１，ＨＰＶ−２ａ，ＨＰＶ５７などの組み合わせ等の２個以上のＨＰＶ型によるＨＰＶ感染を検出できる。
【０１０６】
実施例として、本発明において記載するＨＰＶ抗体は、臨床用途において適用できる。ＩＨＣ分析の結果は、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いた、様々な段階の子宮頸部組織からのｉｎ ｓｉｔｕに存在するＨＰＶ Ｅ７タンパク質の検出を行う。他の実施例として、本願明細書で記載する抗体はまた、様々な段階のＣＩＮからの子宮頸部組織を用いてＩＣＣ分析において用いることができる。他の実施例として、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いるＩＨＣ染色の結果は、様々な段階のＣＩＮからｉｎ ｓｉｔｕにおいて存在するＨＰＶ Ｅ６タンパク質の検出を示す。これらの結果は、形成不全細胞において過剰に発現したＨＰＶＥ６およびＨＰＶ Ｅ７発癌タンパク質が、特異的なＨＰＶ抗体と用いたＩＨＣ染色によって特異的に検出できることを示す。
【０１０７】
実施例として、図１２Ａ~１２Ｄは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体によって行ったＣＩＮ組織のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ６発癌タンパク質の発現は、ＣＩＮ前癌段階において初期に検出できることを示す。黒色矢印は、形成不全細胞におけるＥ６タンパク質の特異的な染色を示すが、白色透明矢印は、染色されていない正常細胞を示す。拡大した画像は、形成不全細胞の核において初期に発現したＥ６タンパク質の位置を示す。
【０１０８】
図１２Ａは、抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学染色（ＩＨＣ）によって染色したＣＩＮ組織の形成不全細胞の画像である。図１２Ｂは、図１２ＡのＣＩＮ２サンプルの形成不全細胞に隣接した正常上皮細胞の画像である。図１２Ｃ〜Ｄは、同じ抗Ｅ６モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した２個のＣＩＮ３サンプルの形成不全上皮細胞の画像である。これらのデータは、Ｅ６モノクローナル抗体によるＩＨＣ染色が形成不全細胞において核および細胞質において特異的であることを示す。
【０１０９】
他の実施例として、図１３Ａ~１３Ｄは、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体によって行った扁平上皮細胞癌のＩＨＣ染色を示す。結果は、Ｅ７発癌タンパク質は、ＳＣＣ組織の腫瘍細胞において検出できることを示す。黒色矢印は、形成不全細胞におけるＥ７タンパク質の特異的な染色を示すが、白色透明矢印は、染色されていない正常細胞を示す。拡大した画像は、正常上皮または基質細胞においてではなく、腫瘍細胞の細胞質において発現したＥ６タンパク質の位置を示す。これらのデータは、Ｅ７モノクローナル抗体によるＩＨＣ染色が腫瘍細胞の細胞質において特異的であることを示す。図１３Ａは、抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）組織の画像である。図１３Ｂは、図１３ＡからのＳＣＣ対象の正常な上皮（腫瘍組織から１５ｍｍ離れた）の画像である。図１３Ｃは、同じ抗Ｅ７モノクローナル抗体を用いたＩＨＣによって染色した他のＳＣＣサンプルの画像である。図１３Ｄは、図１３Ｃからの細胞質において染色した腫瘍細胞の拡大画像である。
４）免疫化学（ＩＣＣ）による精製抗ＨＰＶ抗体のｉｎ ｓｉｔｕのＨＰＶタンパク質との反応性
【０１１０】
液体ベースの溶液によって回収した子宮頸部のかき取りを製造装置に従って処理した。準備した細胞を２群に分け、１個を従来のパップスメア用で、もう一方は、免疫染色用である。スライドガラス上の子宮頸部細胞の単層を細胞スピンまたは薄処理技術によって処理した。その後、細胞を固定して免疫染色プロトコールにしたがって染色した。染色した細胞を顕微鏡で可視化した。
【０１１１】
実施例として、図１４Ａ〜１４Ｃは、抗ＨＰＶ抗体を用いた免疫化学分析を示す。図１４Ａは、薄準備によって準備し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ７抗体を用いてＩＣＣによって染色したＣＩＮ２子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像である。図１４Ｂは、薄準備によって準備し、マウスモノクローナル抗ＨＰＶ Ｅ６抗体を用いてＩＣＣによって染色したＣＩＮ２子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像である。図１４Ｃは、薄準備によって準備し図１４Ｂにおいて示したのと同じ抗Ｅ６抗体を用いてＩＣＣによって染色した腺癌（ＡＤＣ）子宮頸部かき取りサンプルからの子宮頸部細胞の画像を示す。
【０１１２】
本願明細書で記載するように、抗体およびＨＰＶ初期および／または後期遺伝子由来の精製組み換え型タンパク質を用いた１個以上の免疫学的分析は、ＨＰＶ感染が起こったかどうかを示す信頼のおける指標として機能する。加えて、ＨＰＶに関連する悪性腫瘍または前癌細胞形質転換を分析できる。本発明の最も有効な態様のうち一つは、子宮頸癌、扁平上皮細胞癌および腺癌の両方および、空細胞症；過角化症；上皮内または上皮癌または上皮内病変を含む前癌状態；重度の形成不全；および浸潤癌または悪性癌等の発癌性ＨＰＶ感染に関連するいずれかの上皮細胞の非正常の診断である。
【０１１３】
重度のＣＩＮ病変において、Ｅ６およびＥ７は、宿主ベースの上皮細胞において強く発現し、これらの複製能力宿主細胞の細胞周期制御を大きく妨げる。ＨＰＶ発癌タンパク質の発現は、宿主細胞におけるＧ１−Ｓ Ｐｈａｓｅを妨げる。ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７タンパク質は、Ｅ７によるｐＲＢの不活性およびＥ６によるｐ５３の分解等、過剰の細胞相互作用を標的とする。高濃度のＨＰＶ Ｅ７タンパク質はｐＲＢを不活性にし、Ｅ２Ｆ−Ｒｂ結合を妨げる。通常、ｐＲＢのＥ２Ｆへの結合は、Ｅ２Ｆ駆動細胞周期活性を遮断する。細胞の複製において、Ｅ２Ｆは、ＲＢのリン酸化によって制御される。リン酸化は、通常いくつかのキナーゼ阻害剤（ＩＮＫｓ）によって制御されるサイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ４，ＣＤＫ６）によって仲介される。
【０１１４】
Ｒｂ／Ｅ２Ｆ抑制の損失および遊離Ｅ２Ｆによる強活性の結果として、宿主細胞タンパク質ｐ１６ＩＮＫ４ａの発現が過剰に発現する。加えて、Ｃｄｋ４／６のｐ１６ＩＮＫ４ａ仲介抑制は、ｐＲｂ宿主細胞タンパク質上に下流効果を与えないため、Ｓ−相遺伝子が連続的に活性化される。Ｅ７依存Ｅ２Ｆ放出はｐＲｂのリン酸化によって仲介されるため、逆調節ｐ１６ＩＮＫ４ａ発現は活性化細胞周期に効果を示さない。物理学的条件下でｐ１６ＩＮＫ４ａは、細胞が老化組織におけるテロメアの短縮化等の遺伝子ストレス状態となるとき発現する。また、アポトーシスはｐ５３のＨＰＶ Ｅ６仲介分解によって無効になる。サイクリン依存キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ１６ＩＮＫ４ａの過剰の発現は、非制御ＨＰＶ癌遺伝子発現の直接的な結果である。
【０１１５】
加えて、増殖に重要な宿主細胞タンパク質および宿主細胞ゲノム複製は、ＨＰＶ感染の結果として過剰に発現する。これらの宿主細胞タンパク質には、ｋｉ６７（ＭｌＢ−１），ＭＹＣ細胞癌遺伝子、サイクリンタンパク質（例えばサイクリンＡ，Ｂ，Ｅなど），ＣＤＫＮ２Ａ／ｐ１６ＩＮＫ４ａ，テロメアーゼ（例えばＴＥＲＣ）、複製複合タンパク質（例えばＭＣＭ５、ＣＤＣ６、トポイソメラーゼIIα（ＴＯＰ２Ａ）、ＭＣＭ２、ミンクロモソン維持タンパク質２，４，５などがある。
【０１１６】
本願明細書で与える１個以上の免疫学的分析は、簡単な装置でまたはさらなる装置なしに易しい手順を用いて、短い時間で行うことを目指す。様々な免疫学的分析の結果と比較して、ヒト対象に対する細胞学的および病理学的データを用いた核酸ハイブリダイゼーション分析および人口学的情報は、ＨＰＶ感染および／または子宮頸癌の診断における正確性を評価する。
【０１１７】
ヒトパピローマウイルスに感染したヒト対象のスクリーニング方法の他の実施例は、ヒト対象から臨床サンプルを獲得する工程と、臨床サンプル上で核酸ハイブリダイゼーション分析を行う工程と、ヒト対象からの臨床サンプルにおいてパピローマウイルスゲノムの存在を検出する工程と、初期パピローマウイルス性タンパク質の初期組み換え型タンパク質を用いて、臨床サンプルにおける初期パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の存在または初期パピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程と、後期パピローマウイルス性タンパク質の後期組み換え型タンパク質を用いて、臨床サンプルにおける後期パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の存在または後期パピローマウイルス性タンパク質の存在を検出する工程を有する。
【０１１８】
本願明細書で記載するような１個以上の診断的免疫学的分析はまた、本願明細書で記載して得られるような一個以上の組換え型タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および／または抗血清を得る工程と、ＨＰＶに関連するタンパク質および／または抗原を含みそうな臨床サンプルを取る工程と、それを獲得した１個以上の組み換え型タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および／または抗血清と反応させる工程と、適切な検出システムによっていずれかの抗体−抗原複合体の存在を分析する工程を有する。適切な検出システムは、各免疫学的分析において二次抗体に対して特異な発色、化学発光、蛍光基質などを用いる。
【０１１９】
ＨＰＶ感染の初期診断は、子宮頸癌の予防および治療に重要である。子宮頸がんを予防する方法は、過去もしくは現在のＨＰＶ感染および／または前癌病変を有する対象に加えて世界中で幅広い範囲で改良したＨＰＶ試験／スクリーニングを必要とする。重要なことに、１２〜１５年間の女性におけるＨＰＶの感染は侵襲性癌に発達する前に必要であることがわかっている。したがって、前癌を治療する化学療法または放射線に頼るよりも、ＨＰＶ感染に対するバイオマーカーを分析して初期に女性を前もってスクリーニングし、初期にＨＰＶ感染を治療し、子宮頸癌への進行を予防することができるのが重要である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の生成方法であって、
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程を含み、このスクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法。
【請求項２】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なるＨＰＶ型から２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合でき、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体であって、前記スクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するモノクローナル抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体は、初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に異なるＨＰＶ型から結合でき、１個のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質、および他のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質をスクリーニングすることによって得られ、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７のタンパク質の全てに結合できる請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の全てに結合できる請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析で用いる請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
同じＨＰＶ型から２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、前記スクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合できるモノクローナル抗体を生成する請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は同じＨＰＶ型からである請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は異なるＨＰＶ型からである請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択する請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質の各々は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する、２個以上の精製組み換え型ＨＰＶ初期タンパク質に結合できる請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質であり、モノクローナル抗体が精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する、初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できる請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１ウイルス性タンパク質の全てに結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
モノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質に関する抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析に用いる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合でき、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合せず、第１ＨＰＶ型から第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体であって、第１および第２のウイルス性タンパク質は、第１および第２のＨＰＶ型の、第１および第２の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
第１のウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＰＶ型から第１ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質に関する抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析に用いる請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１】
２個以上のヒトパピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体の生成方法であって、
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングする工程を含み、このスクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法。
【請求項２】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異なるＨＰＶ型から２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合でき、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体であって、前記スクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するモノクローナル抗体。
【請求項４】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体はＨＰＶ１６ Ｌ１およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質に結合できる請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体は、初期ＨＰＶウイルス性タンパク質および後期ＨＰＶウイルス性タンパク質に異なるＨＰＶ型から結合でき、１個のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質、および他のＨＰＶ型からの精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質をスクリーニングすることによって得られ、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項８】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７のタンパク質の全てに結合できる請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７、ＨＰＶ１６ Ｌ１、ＨＰＶ１８ Ｅ６、ＨＰＶ１８ Ｅ７およびＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の全てに結合できる請求項７に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１０】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質の抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析で用いる請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
同じＨＰＶ型から２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できるモノクローナル抗体。
【請求項１２】
モノクローナル抗体は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られ、前記スクリーニング工程は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、非ＨＰＶタンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞を選択する工程を含み、抗体生成ハイブリドーマ細胞が、２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に特異的に結合できるモノクローナル抗体を生成する請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は同じＨＰＶ型からである請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１４】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は異なるＨＰＶ型からである請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択する請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１６】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質の各々は、２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質であり、モノクローナル抗体が２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応する、２個以上の精製組み換え型ＨＰＶ初期タンパク質に結合できる請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１７】
２個以上の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質は、精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質であり、モノクローナル抗体が精製組み換え型パピローマウイルス性初期タンパク質および精製組み換え型パピローマウイルス性後期タンパク質に対応する、初期ウイルス性タンパク質および後期ウイルス性タンパク質に結合できる請求項１２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１８】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＨＰＶ１６ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１６ Ｅ６，ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＰＶ１６ Ｌ１ウイルス性タンパク質の全てに結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体は、ＨＰＶ１８ Ｅ６およびＨＰＶ１８ Ｅ７ウイルス性タンパク質の両方に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
モノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される同じＨＰＶ型からの２個以上のＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２２】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質に関する抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析に用いる請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２３】
第１ＨＰＶウイルス性タンパク質のみに結合でき、第１ＨＰＶウイルス性タンパク質とは異なる第２ＨＰＶウイルス性タンパク質には結合せず、第１ＨＰＶ型から第１精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陽性反応で、第２ＨＰＶ型からの第２精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に陰性反応で抗体生成ハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることによって得られるモノクローナル抗体であって、第１および第２のウイルス性タンパク質は、第１および第２のＨＰＶ型の、第１および第２の精製組み換え型パピローマウイルス性タンパク質に対応するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
第１のウイルス性タンパク質は、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ６タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２５】
モノクローナル抗体は、高リスクＨＰＶ型、低リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ−１６，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−５９およびＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−５６、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるＨＰＶ型から第１ＨＰＶウイルス性タンパク質に結合できる請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項２６】
モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ（抗原捕捉免疫測定法）、パピローマウイルス性タンパク質に関する抗原分析、パピローマウイルス性タンパク質に対する抗体の抗体分析、パピローマウイルス性免疫複合体に関する分析、タンパク質チップ分析、放射免疫沈降分析、迅速膜放射免疫沈降分析、迅速スティック免疫クロマトグラフィー、組織および／または子宮頸部細胞に関する免疫組織化学、フローサイトメトリによる免疫化学分析、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１個以上の免疫学的分析に用いる請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１３Ｃ】
【図１３Ｄ】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１４Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５２３８６０（Ｐ２０１１−５２３８６０Ａ）
【公表日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１３５０５（Ｐ２０１１−５１３５０５）
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１６３３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３２６７９５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月２５日（２０１１．８．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月１２日（２００９．６．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００３５３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１５１６３３
【国際公開日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【出願人】（５１０３２６７９５）
【Ｆターム（参考）】
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