α−グルコシダーゼ活性を用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅの検出方法
【課題】α−グルコシダーゼ活性を用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出方法の提供。
【解決手段】本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用することを特徴とする方法に関する。
【解決手段】本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用することを特徴とする方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出及び識別の分野に関する。具体的には、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを検出及び識別するためのα−グルコシダーゼ酵素基質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
連鎖球菌属は、自然界において、ヒト及び動物の粘膜の皮膚上に非常に広く存在しており、多くの感染の原因である。この細菌は遍在しており、外部環境（土、空気、水）では遊離した状態で見られ、ヒト及び動物においては腐生植物の状態又は共生状態で見られる。この細菌は、Ａ群、Ｃ群、Ｇ群及びＨ群連鎖球菌及びｓａｌｉｖａｒｉｕｓは鼻咽腔に、Ｄ群のｆｅｔａｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉは腸に、並びに、Ｂ群連鎖球菌は膣腔に存在する。この細菌の病原性は非常に多様であり、当該種、及び、生体における位置に依存する。
【０００３】
連鎖球菌はグラム陽性球菌であり、直径０．５〜１μｍで、短鎖の形で群が区別され、かつ、移動しない。この菌はカタラーゼ陰性であって、発酵代謝性であり、任意に嫌気性であって、温度（最適増殖３７℃）及びｐＨ（最適ｐＨ７）の変化に感受性を有する。
【０００４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（又は、Ｂ群連鎖球菌）は、牛の乳腺炎の原因となる主要な病原菌の１つと認識されている。ヒトにおいては、本質的に女性の生殖管（膣）の腐生植物であるが、鼻咽腔及び腸、特に直腸にも見られる。成人においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅはコロニー化しても無症候性のままであることが多いが、敗血症、肺炎、脳膜炎、関節炎、尿路感染及び深刻な化膿を引き起こす可能性がある。妊娠中又は出産後の女性が感染すると、子宮内膜炎及び不妊につながる可能性もある。
【０００５】
新生児においては、子宮内で、最も一般的には出産中に子宮内で、羊水又は膣分泌物の吸入により雑菌が混入する。初期感染は、誕生直後又は誕生初期に生じることが多い。初期感染は、早産、母親の膣の膜の破裂及び強固なコロニー化によって進行する。この種の感染における死亡率は非常に高い（＞５０％）。晩期感染は一般的に、脳膜炎（幼児脳膜炎）及び関節炎としてあらわれる。
【０００６】
特に臨月期間における罹患率（フランスでは１０％、すなわち年間で妊婦少なくとも７５０００人）及び重篤度は公衆衛生上の問題であり、これらの理由から、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの媒介についての系統的検査を、妊娠終期、理想的には３４〜３８週間の無月経の期間（妊娠３５〜３７週）に実施することが推奨される。
【０００７】
選択培地、及び／又は、診断を示唆できる培地は市販されている。しかし、これらの培地には、単独ではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの診断において不十分であること、並びに、Ｂ群Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ抗原（ラムノースが主要である多糖）の存在の実証及び馬尿酸塩加水分解（馬尿酸塩培地）等の補足試験を実施する必要があること、といった欠点がある。
【０００８】
最も一般に使用される選択培地はＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地であり、これは妊婦においてＢ群連鎖球菌を探索するための増菌培地である。この培地には、付随する植物相のグラム陰性微生物を非常に良好に阻害する、ナリキシディック酸（ｎａｌｉｘｉｄｉｃ ａｃｉｄ）及びゲンタマイシン、又は、ナリキシディック酸、ポリミキシン及びクリスタルバイオレット等の様々な抗生物質が含まれている。
【０００９】
増殖過程の終了後、抗生物質を補足したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地を連鎖球菌探索用の培地上で経代培養する必要がある（非特許文献１参照）。
【００１０】
Ｌｉｍ培地はＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地から派生したものであり、酵母エキス、ナリキシディック酸及びコリスチンを１％含む。
【００１１】
血液を５％含むコロンビア寒天も使用することができ、これを使用すれば、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのβ−溶血特性を実証することができる。しかし、この特性は常に明白であるわけではない：コロニーのまわりの溶血輪が狭いと、α−溶血性又はγ−溶血性の外観を示す場合がある。一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのコロニー内においては、黄色ブドウ球菌のコロニー（Ｃａｍｐ因子）があるために上記の特性は明らかである。
【００１２】
これらの選択培地には、生化学的な試験及び／又は免疫アッセイを補助的に実施する必要があるという欠点がある。
【００１３】
現在、市販されている使用準備済みの選択培地はＧｒａｎａｄａ培地（Ｂｉｏｌｙｓ社）のみであり、これを使用すれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを直腸膣サンプルから直接分離及び識別することができる。この培地は、培地中に可溶性デンプン、プロテオースペプトンＮｏ．３、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、メトトレキサート、コリスチン、クリスタルバイオレット、寒天、ウマ血清、無水Ｎａ２ＨＰＯ４、メトロニダゾール、ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）半ナトリウム塩及び蒸留水を含み、かつ、嫌気条件下でインキュベートすると、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ株によるカロテノイド顔料の生成を促進する特性を有している。従って、この培地には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの直接の検出は嫌気状態下で実施されるが、これは容易ではないという欠点がある。また、１つ以上の酵素基質を含む検出培地で、利用できるものはない。
【非特許文献１】ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ， ＭＭＷＲ（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ），Ａｕｇｕｓｔ １６，２００２，Ｖｏｌ．５１， Ｎｏ．ＲＲ−１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
予想外にも、本出願人は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出して識別する際に、酵素基質、特にα−グルコシダーゼ酵素基質を使用できるということを実証した。
【００１５】
とりわけ、予想外にも、上記酵素基質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅに消費され、例えば発色性酵素基質が消費された際に培地中でのコロニー着色が変化し、着色が反応培地中に拡散せずコロニーの中に集まるために、その存在を顕現化することができ、かつ、この物質は上記細菌の増殖に害を及ぼさない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明の主題は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用することを特徴とする方法である。
【００１７】
本発明の目的について好適なα−グルコシダーゼ酵素基質は、上記の酵素活性を実証できる、当業者に公知の任意の基質である。例えば、このような基質は、発色性であっても蛍光性であってもよく、例えば、Ｐ． Ｒｉｃｅら（２０００）． Ａ ｒａｐｉｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ａｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｍａｌｌ ｃｏｌｏｎｙ （ＳＣ） ｓｔｒａｉｎｓ． Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：７０−７４の文献、又は、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社のカタログ（“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ”又はｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎｔｈ．ｃｏｍ）若しくはＧＬＹＣＯＳＹＮＴＨ社のカタログ（“ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｃａｔａｌｏｇ”又はｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ．ｃｏ．ｕｋ）に記載されている。
【００１８】
例えば、インドキシル誘導体に基づく基質、ウンベリフェロン誘導体に基づく基質及びナフトール誘導体に基づく基質を挙げることができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の目的について好適な酵素基質は、インドキシル誘導体に基づく基質である。
【００２０】
上記インドキシル誘導体の例としては、３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド誘導体、好ましくはこれらの化合物のハロゲン化誘導体が含まれる。
【００２１】
３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシドのハロゲン化誘導体の例としては、６−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを挙げることができ、後者の化合物が特に好ましい。
【００２２】
従って、本発明の方法において使用される反応培地は、酵素基質の存在による検出用反応培地である。
【００２３】
この反応培地は、視覚化培地としてのみ使用してもよいし、培養基及び視覚化培地の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応培地が培養基でもある。
【００２４】
反応培地は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形又は半固形培地」という用語は、例えばゲル化培地を意味するものとする。
【００２５】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用される固形培地は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースも使用可能である。例えば、コロンビア寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ）、トリプカーゼ大豆寒天（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ａｇａｒ）、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。
【００２６】
反応培地中の寒天の量は２〜４０ｇ／ｌである。固形培地については、寒天の量は、好ましくは９〜２５ｇ／ｌ、より好ましくは１２〜１４ｇ／ｌである。半固形培地については、寒天の量は２〜６ｇ／ｌであることが好ましい。
【００２７】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。
【００２８】
反応培地中の酵素基質の濃度は１０〜２０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｌであり、これは本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００２９】
言うまでもなく、当業者であれば、選択された基質に応じて、上記範囲内において培地中の酵素基質の濃度を決定できるであろう。従って、酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用する場合には、濃度は１３０〜３００ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００３０】
本発明の目的について使用できる反応培地は、本発明の方法の特異性及び感度の改良に有用な他の成分をさらに含んでいてよい。
【００３１】
反応培地は、カンジダ又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓといった偽陽性反応株等の望ましくない菌株の増殖を、培地の検出感度を変えずに阻害又は制限するための阻害剤の混合物をさらに含んでいてよい。
【００３２】
この点で、反応混合物は、抗生物質の混合物を含んでいてもよい。反応培地に抗生物質を添加することによって、とりわけ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの識別が直接実施されるので時間が短縮される。
【００３３】
本発明の目的について好適な抗生物質の例としては、アズトレオナム及びアンホテリシンＢが含まれる。これらの抗生物質は、ＩＣＮ社、Ｓｑｕｉｂｂ社又はシグマ社から市販されている。
【００３４】
従って、本発明の一実施形態によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法において使用される反応培地は、アズトレオナム及びアンホテリシンＢの混合物をさらに含む。
【００３５】
反応培地中における各抗生物質の量は、その抗生物質によって異なり、当業者であれば容易に決定できるであろう。
【００３６】
従って、例えば、アズトレオナムの濃度は０．０１〜０．０８ｇ／ｌであってよく、アンホテリシンＢの濃度は０．００２〜０．００６ｇ／ｌであってよい。
【００３７】
これらの抗生物質の好ましい混合物は、アズトレオナム０．０６４ｇ／ｌ及びアンホテリシンＢ ０．００４ｇ／ｌを含む。
【００３８】
本発明の方法において使用される反応培地は、α−グルコシダーゼ基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも１つの他の基質をさらに含んでいてよい。この他の基質の酵素加水分解により、α−グルコシダーゼ基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、実証の特異性が改良されて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【００３９】
別の特定の基質としては、β−セロビオシダーゼ基質、β−グルコシダーゼ基質、β−グルコサミニダーゼ基質、及び、偽陽性を排除できる当業者に公知の他の任意の酵素基質を挙げることができる。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、上記反応培地は、好ましくはβ−セロビオシダーゼ基質及びβ−グルコサミニダーゼ基質から選択される、異なる酵素活性に対する少なくとも１つの他の基質をさらに含む。
【００４１】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ等のβ−セロビオシダーゼ基質を使用することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのα−グルコシダーゼ活性の検出感度を下げることなく、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌａｏｃａｅ等の偽陽性種を排除できる。
【００４２】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド又は５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド等のグルコサミニダーゼ基質を使用することによって、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌａｏｃａｅの検出を排除できる。
【００４３】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【００４４】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ又は６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニドが使用される場合、培地中のその濃度は好ましくは０．４ｇ／ｌである。
【００４５】
また、反応培地は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてよい。培地の例が、本出願人によるヨーロッパ特許出願ＥＰ６５６４２１号及びＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０９２０７号中に記載されている。
【００４６】
本発明の方法の実施は、次の工程によって実施することができる：
ａ） サンプルのすべて又は一部を上記反応培地に播種すること、
ｂ） 播種した培地をインキュベートすること、
ｃ） 少なくとも１つのα−グルコシダーゼ活性の存在を、単独で、又は、α−グルコシダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること
（本発明の別の主題を構成する）。
【００４７】
上記播種段階及びインキュベート段階は、当業者に広く知られている。
【００４８】
例えば、インキュベート時の温度は３７℃であってよい。また、インキュベート時の雰囲気は好気的であることが好ましい。
【００４９】
上記顕現は、反応培地中に拡散せずにコロニーの中に集まる着色の変化を視覚化することにより、肉眼で実施される。蛍光を顕現化する際、当業者に公知の蛍光読み取り装置が使用される。
【００５０】
分析する生体試料は、膣試料若しくは尿試料といった、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを含んでいることが多い任意の臨床試料、又は、その分析が臨床医による診断を援助可能な他の任意の試料である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明は以下の実施例によってより明瞭に理解されるであろう。しかし、これらの実施例はいかなる制限を加えるものでもない。
【実施例１】
【００５２】
＜α−グルコシダーゼ酵素基質を使用するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出＞
１．１ 反応培地の調製
反応培地は、心臓−脳抽出物（４．８４ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、肉汁（１．９６ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、ビオチン（ｂｉｏｔｈｉｏｎｅ）（１ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、ビオトリプカーゼ（ｂｉｏｔｒｙｐｃａｓｅ）（７．２ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、炭酸ナトリウム（０．３ｇ／ｌ；ＶＷＲ社）、ピルビン酸ナトリウム（２ｇ／ｌ；Ｆｌｕｋａ社）、ＨＥＰＥＳバッファー（０．４ｇ／ｌ；シグマ社）、ラクトアルブミンペプトン（２ｇ／ｌ；ＤＭＶ）、グルコース（１ｇ／ｌ；メルク社）、アメリカ寒天（２ｇ／ｌ；Ｓｏｂｉｇｅｌ社）及びヨーロッパ寒天（１２ｇ／ｌ；Ｒｏｋｏ社）を混合することによって調製した。
【００５３】
１２１℃で１５分間オートクレーブした後、α−グルコシダーゼ酵素基質を下記のように０．１ｇ／ｌの割合で添加した。続いて、５０℃の水槽中で冷却した。
＊ ６−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＲｅｄＡ−α−Ｇｌｕ； Ｉｎａｌｃｏ社）
＊ ６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｒｏｓｅ−α−Ｇｌｕ； Ｉｎａｌｃｏ社）
＊ ５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｍａｇｅｎｔａ−α−Ｇｌｕ；Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ社）
＊ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−α−Ｇｌｕ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）
＊ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕ；Ｉｎａｌｃｏ社）
【００５４】
その後、次の細菌を播種するために培地をペトリ皿に注いだ。
【００５５】
１．２ 微生物株の播種
本出願人が保存している株に由来するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ株８つを生理食塩水中に懸濁して播種し、各培地上に別々にコロニーを形成させる。その後、培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。１８時間、２４時間又は４０時間以上インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べる。このコロニーの着色、増殖、及び、この着色の濃さについて記録した。
【００５６】
１．３ 結果
得られた結果を、下記表１中に示し、以下のように示す。
− 増殖（Ｇ）について、大きさはｍｍで示される。
− 着色の濃さ（Ｉ）について、０〜４の任意のスケールに基づいて、０は活性がないことに相当し、４は非常に濃い着色があることに相当する。
− 色（Ｃｏ）について、Ｔ＝青緑色、Ｒ＝ピンク色又は赤色、Ｇｒ＝緑色、Ｍｇ＝赤紫色である。
− インキュベート時間について、時間（Ｔ）である。
【００５７】
表１中に示される結果から、α−グルコシダーゼ酵素基質を使用して、少なくとも１８時間インキュベートすることによって、連鎖球菌Ｂを検出できることが実証される。
【００５８】
【表１】
【実施例２】
【００５９】
＜α−グルコシダーゼ酵素基質濃度の変化＞
酵素基質の濃度を変える以外は上記プロトコルを繰り返した。
【００６０】
下記表２から、基質濃度に対する検出菌株数（Ｉ≧０．６である場合に陽性であると考える）が示される。
【００６１】
【表２】
【００６２】
この表から、２００又は３００ｍｇ／ｌの濃度であれば良好に検出できることが実証される。
【実施例３】
【００６３】
＜α−グルコシダーゼ基質及び異なる酵素活性に対する基質の使用＞
この基質１３３ｍｇ／ｌを使用し、かつ、オートクレーブした後でアズトレオナム（ＩＣＮ社）０．０４７ｇ／ｌ、アンホテリシンＢ（Ｓｑｕｉｂｂ社）０．００４ｇ／ｌ及び次の成分を培地に添加する以外は、ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕを使用して、実施例１中に記載されるプロトコルを繰り返した。
培地１；実施例１の培地に対応するコントロール培地とＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕとを、上述のように改変したもの。
培地２；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ（Ｒｏｓｅ−β−セロビオシダーゼ）４００ｍｇ／ｌ。
培地３；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Ｒｏｓｅ−β−ＮＡＧｌｕ）４００ｍｇ／ｌ及びＮ−アセチルグルコサミニド０．５ｇ／ｌ。
【００６４】
結果を下記表３中に示すが、表中、Ｇ、Ｃｏ及びＴは上記に定義し、Ｃｏ段については、Ｇｒ＝緑色、Ｇ＝灰色、Ｍｖ＝藤色、Ｍｇ＝赤紫色、Ｂ＝青色、Ｖｉ＝青紫色及びＲ＝ピンク色である。
【００６５】
すべての菌株は本出願人が保存している株に由来する。
【００６６】
【表３】
【００６７】
この表から、第二の酵素基質を使用すると、連鎖球菌Ｂの検出感度を下げることなく検出の特異性を改善できること、及び、関連方法で遭遇することの多い近接種と連鎖球菌Ｂとを、２４時間のインキュベート後に区別できることが実証される。
【実施例４】
【００６８】
＜本発明によるα−グルコシダーゼ基質を含む培地及び市販の培地を使用するＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出の感度の比較＞
この感度試験において、上記実施例中に記載されるように調製した、ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕ ０．１３０ｇ／ｌと、Ｒｏｓｅ−β−Ｄ−セロビオシダーゼ０．２５０ｇ／ｌ、アズトレオナム０．０６４ｇ／ｌ及びアンホテリシンＢ（α−Ｇｌｕ培地）０．００４ｇ／ｌを含む本発明による培地を使用した。
【００６９】
比較用の培地として、Ｇｒａｎａｄａ ｍｅｄｉｕｍ（品番１００７７、ＢＩＯＬＹＳ社（フランス））（Ｇｒａｎａｄａ培地）を使用した。
【００７０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ１４株を含む微生物６９株を播種し、３７℃で最長２４時間、及び、室温でそれ以上の時間インキュベートした。上述のようにコロニーを視覚化した。Ｂ群連鎖球菌の特性を有する疑いのあるコロニー（すなわち外観色が緑色のコロニー）の確認は、供給元の推薦（ビオメリュー社（フランス））に従ってＳｌｉｄｅｘ Ｓｔｒｅｐｔｏキット試薬を使用し、凝集アッセイを用いて実施した。特有でないコロニー（すなわち、緑色以外のコロニー、又は、特有の着色を有するものの凝集アッセイでの応答が陰性であるコロニー（偽陽性株））を、Ｇａｌｅｒｉｅ ＩＤ ３２ Ｓｔｒｅｐ（ビオメリュー社（フランス））を用いて識別した。
【００７１】
結果は、感度及び特異性について全試験に対する正確な診断の％で表し、下記表４中に、培地上における真の陽性の検出数を真の陽性の総検出数で割った値（＊１００）に相当する％感度、及び、培地上における真の陰性の検出数を真の陰性の総検出数で割った値（＊１００）に相当する％特異性で表す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
この表中に示される結果から、本発明の方法を使用すれば、連鎖球菌Ｂの検出感度が改良されることが実証される。また、本発明の検出用培地は特異性が良好であり、この特異性は、寒天播種の前に、５％ ＣＯ２の存在下又は非存在下で、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地を３５〜３７℃で１８〜２４時間通して強化すると改良されることも示される（参照：ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ， ＭＭＷＲ（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ）， Ａｕｇｕｓｔ １６， ２００２， ｖｏｌ．５１， Ｎｏ．ＲＲ−１１）。
【実施例５】
【００７４】
＜臨床サンプルに基づく培地の使用＞
この試験には、上記実施例４中で調製された本発明による培地を使用した。
【００７５】
この試験では、妊婦の膣又は子宮頚管の試料に由来するサンプル／綿球を計１３４個使用した。
【００７６】
綿球はそれぞれ、無菌生理食塩水１ｍｌ中で乳化し、まずこの溶液１００μｌをウマ血液５％を含むコロンビア寒天上に置いて、次に本発明の方法を使用する培地上に置いた。続いて、上記溶液１００μｌを使用してＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地に播種した。好気性条件下において３７℃で２０時間インキュベートした後、血液−寒天培地及び本発明の培地をＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地を使用して播種し、その後、好気性条件下で３７℃で２０時間インキュベートした。
【００７７】
Ｂ群連鎖球菌の特性を有する疑いのあるコロニー（すなわち外観色が緑色のもの）の確認は、供給元の推薦（ビオメリュー社（フランス））に従ってＳｌｉｄｅｘ Ｓｔｒｅｐｔｏキット試薬を使用し、凝集アッセイを用いて実施した。
【００７８】
サンプル１３４個のうち１１２個を、まず、生理食塩水懸濁液から寒天培地上に直接播種し、次にＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で強化した後で播種した。残りのサンプル２２個は、生理食塩水懸濁液から寒天培地上に単に直接播種した。
【００７９】
結果は平均％感度及び特異性として算出し、下記表５中に示す。
【００８０】
【表５】
【００８１】
表中の結果から、臨床サンプルと共に使用されると培地の感度は良好であること（１８／２０のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅが検出された）、及び、検出の特異性が標準培地と比較して改善されていること（コロンビア血液培地について、偽陽性は２４中１０）が示される（これらの結果は、研究所の菌株を使用して得られた結果と本質的に同等である）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出及び識別の分野に関する。具体的には、本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを検出及び識別するためのα−グルコシダーゼ酵素基質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
連鎖球菌属は、自然界において、ヒト及び動物の粘膜の皮膚上に非常に広く存在しており、多くの感染の原因である。この細菌は遍在しており、外部環境（土、空気、水）では遊離した状態で見られ、ヒト及び動物においては腐生植物の状態又は共生状態で見られる。この細菌は、Ａ群、Ｃ群、Ｇ群及びＨ群連鎖球菌及びｓａｌｉｖａｒｉｕｓは鼻咽腔に、Ｄ群のｆｅｔａｌ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉは腸に、並びに、Ｂ群連鎖球菌は膣腔に存在する。この細菌の病原性は非常に多様であり、当該種、及び、生体における位置に依存する。
【０００３】
連鎖球菌はグラム陽性球菌であり、直径０．５〜１μｍで、短鎖の形で群が区別され、かつ、移動しない。この菌はカタラーゼ陰性であって、発酵代謝性であり、任意に嫌気性であって、温度（最適増殖３７℃）及びｐＨ（最適ｐＨ７）の変化に感受性を有する。
【０００４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（又は、Ｂ群連鎖球菌）は、牛の乳腺炎の原因となる主要な病原菌の１つと認識されている。ヒトにおいては、本質的に女性の生殖管（膣）の腐生植物であるが、鼻咽腔及び腸、特に直腸にも見られる。成人においては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅはコロニー化しても無症候性のままであることが多いが、敗血症、肺炎、脳膜炎、関節炎、尿路感染及び深刻な化膿を引き起こす可能性がある。妊娠中又は出産後の女性が感染すると、子宮内膜炎及び不妊につながる可能性もある。
【０００５】
新生児においては、子宮内で、最も一般的には出産中に子宮内で、羊水又は膣分泌物の吸入により雑菌が混入する。初期感染は、誕生直後又は誕生初期に生じることが多い。初期感染は、早産、母親の膣の膜の破裂及び強固なコロニー化によって進行する。この種の感染における死亡率は非常に高い（＞５０％）。晩期感染は一般的に、脳膜炎（幼児脳膜炎）及び関節炎としてあらわれる。
【０００６】
特に臨月期間における罹患率（フランスでは１０％、すなわち年間で妊婦少なくとも７５０００人）及び重篤度は公衆衛生上の問題であり、これらの理由から、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの媒介についての系統的検査を、妊娠終期、理想的には３４〜３８週間の無月経の期間（妊娠３５〜３７週）に実施することが推奨される。
【０００７】
選択培地、及び／又は、診断を示唆できる培地は市販されている。しかし、これらの培地には、単独ではＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの診断において不十分であること、並びに、Ｂ群Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ抗原（ラムノースが主要である多糖）の存在の実証及び馬尿酸塩加水分解（馬尿酸塩培地）等の補足試験を実施する必要があること、といった欠点がある。
【０００８】
最も一般に使用される選択培地はＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地であり、これは妊婦においてＢ群連鎖球菌を探索するための増菌培地である。この培地には、付随する植物相のグラム陰性微生物を非常に良好に阻害する、ナリキシディック酸（ｎａｌｉｘｉｄｉｃ ａｃｉｄ）及びゲンタマイシン、又は、ナリキシディック酸、ポリミキシン及びクリスタルバイオレット等の様々な抗生物質が含まれている。
【０００９】
増殖過程の終了後、抗生物質を補足したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地を連鎖球菌探索用の培地上で経代培養する必要がある（非特許文献１参照）。
【００１０】
Ｌｉｍ培地はＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地から派生したものであり、酵母エキス、ナリキシディック酸及びコリスチンを１％含む。
【００１１】
血液を５％含むコロンビア寒天も使用することができ、これを使用すれば、特にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのβ−溶血特性を実証することができる。しかし、この特性は常に明白であるわけではない：コロニーのまわりの溶血輪が狭いと、α−溶血性又はγ−溶血性の外観を示す場合がある。一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのコロニー内においては、黄色ブドウ球菌のコロニー（Ｃａｍｐ因子）があるために上記の特性は明らかである。
【００１２】
これらの選択培地には、生化学的な試験及び／又は免疫アッセイを補助的に実施する必要があるという欠点がある。
【００１３】
現在、市販されている使用準備済みの選択培地はＧｒａｎａｄａ培地（Ｂｉｏｌｙｓ社）のみであり、これを使用すれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを直腸膣サンプルから直接分離及び識別することができる。この培地は、培地中に可溶性デンプン、プロテオースペプトンＮｏ．３、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、メトトレキサート、コリスチン、クリスタルバイオレット、寒天、ウマ血清、無水Ｎａ２ＨＰＯ４、メトロニダゾール、ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸）半ナトリウム塩及び蒸留水を含み、かつ、嫌気条件下でインキュベートすると、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ株によるカロテノイド顔料の生成を促進する特性を有している。従って、この培地には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの直接の検出は嫌気状態下で実施されるが、これは容易ではないという欠点がある。また、１つ以上の酵素基質を含む検出培地で、利用できるものはない。
【非特許文献１】ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ， ＭＭＷＲ（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ），Ａｕｇｕｓｔ １６，２００２，Ｖｏｌ．５１， Ｎｏ．ＲＲ−１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
予想外にも、本出願人は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出して識別する際に、酵素基質、特にα−グルコシダーゼ酵素基質を使用できるということを実証した。
【００１５】
とりわけ、予想外にも、上記酵素基質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅに消費され、例えば発色性酵素基質が消費された際に培地中でのコロニー着色が変化し、着色が反応培地中に拡散せずコロニーの中に集まるために、その存在を顕現化することができ、かつ、この物質は上記細菌の増殖に害を及ぼさない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明の主題は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用することを特徴とする方法である。
【００１７】
本発明の目的について好適なα−グルコシダーゼ酵素基質は、上記の酵素活性を実証できる、当業者に公知の任意の基質である。例えば、このような基質は、発色性であっても蛍光性であってもよく、例えば、Ｐ． Ｒｉｃｅら（２０００）． Ａ ｒａｐｉｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｔｏ ａｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｙｃｏｉｄｅｓ ｓｍａｌｌ ｃｏｌｏｎｙ （ＳＣ） ｓｔｒａｉｎｓ． Ｌｅｔｔ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：７０−７４の文献、又は、ＢＩＯＳＹＮＴＨ社のカタログ（“Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅａｇｅｎｔｓ”又はｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎｔｈ．ｃｏｍ）若しくはＧＬＹＣＯＳＹＮＴＨ社のカタログ（“ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｃａｔａｌｏｇ”又はｗｗｗ．ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ．ｃｏ．ｕｋ）に記載されている。
【００１８】
例えば、インドキシル誘導体に基づく基質、ウンベリフェロン誘導体に基づく基質及びナフトール誘導体に基づく基質を挙げることができる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の目的について好適な酵素基質は、インドキシル誘導体に基づく基質である。
【００２０】
上記インドキシル誘導体の例としては、３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド誘導体、好ましくはこれらの化合物のハロゲン化誘導体が含まれる。
【００２１】
３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシドのハロゲン化誘導体の例としては、６−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを挙げることができ、後者の化合物が特に好ましい。
【００２２】
従って、本発明の方法において使用される反応培地は、酵素基質の存在による検出用反応培地である。
【００２３】
この反応培地は、視覚化培地としてのみ使用してもよいし、培養基及び視覚化培地の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応培地が培養基でもある。
【００２４】
反応培地は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形又は半固形培地」という用語は、例えばゲル化培地を意味するものとする。
【００２５】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用される固形培地は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースも使用可能である。例えば、コロンビア寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ）、トリプカーゼ大豆寒天（ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ａｇａｒ）、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。
【００２６】
反応培地中の寒天の量は２〜４０ｇ／ｌである。固形培地については、寒天の量は、好ましくは９〜２５ｇ／ｌ、より好ましくは１２〜１４ｇ／ｌである。半固形培地については、寒天の量は２〜６ｇ／ｌであることが好ましい。
【００２７】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用可能である。
【００２８】
反応培地中の酵素基質の濃度は１０〜２０００ｍｇ／ｌ、好ましくは５０〜５００ｍｇ／ｌ、より好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｌであり、これは本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００２９】
言うまでもなく、当業者であれば、選択された基質に応じて、上記範囲内において培地中の酵素基質の濃度を決定できるであろう。従って、酵素基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシドを使用する場合には、濃度は１３０〜３００ｍｇ／ｌであることが好ましい。
【００３０】
本発明の目的について使用できる反応培地は、本発明の方法の特異性及び感度の改良に有用な他の成分をさらに含んでいてよい。
【００３１】
反応培地は、カンジダ又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓといった偽陽性反応株等の望ましくない菌株の増殖を、培地の検出感度を変えずに阻害又は制限するための阻害剤の混合物をさらに含んでいてよい。
【００３２】
この点で、反応混合物は、抗生物質の混合物を含んでいてもよい。反応培地に抗生物質を添加することによって、とりわけ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの識別が直接実施されるので時間が短縮される。
【００３３】
本発明の目的について好適な抗生物質の例としては、アズトレオナム及びアンホテリシンＢが含まれる。これらの抗生物質は、ＩＣＮ社、Ｓｑｕｉｂｂ社又はシグマ社から市販されている。
【００３４】
従って、本発明の一実施形態によれば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法において使用される反応培地は、アズトレオナム及びアンホテリシンＢの混合物をさらに含む。
【００３５】
反応培地中における各抗生物質の量は、その抗生物質によって異なり、当業者であれば容易に決定できるであろう。
【００３６】
従って、例えば、アズトレオナムの濃度は０．０１〜０．０８ｇ／ｌであってよく、アンホテリシンＢの濃度は０．００２〜０．００６ｇ／ｌであってよい。
【００３７】
これらの抗生物質の好ましい混合物は、アズトレオナム０．０６４ｇ／ｌ及びアンホテリシンＢ ０．００４ｇ／ｌを含む。
【００３８】
本発明の方法において使用される反応培地は、α−グルコシダーゼ基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に対して特異的な少なくとも１つの他の基質をさらに含んでいてよい。この他の基質の酵素加水分解により、α−グルコシダーゼ基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、実証の特異性が改良されて、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【００３９】
別の特定の基質としては、β−セロビオシダーゼ基質、β−グルコシダーゼ基質、β−グルコサミニダーゼ基質、及び、偽陽性を排除できる当業者に公知の他の任意の酵素基質を挙げることができる。
【００４０】
好ましい実施形態によれば、上記反応培地は、好ましくはβ−セロビオシダーゼ基質及びβ−グルコサミニダーゼ基質から選択される、異なる酵素活性に対する少なくとも１つの他の基質をさらに含む。
【００４１】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ等のβ−セロビオシダーゼ基質を使用することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅのα−グルコシダーゼ活性の検出感度を下げることなく、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌａｏｃａｅ等の偽陽性種を排除できる。
【００４２】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド又は５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド等のグルコサミニダーゼ基質を使用することによって、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｃｏｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ及びＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌａｏｃａｅの検出を排除できる。
【００４３】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【００４４】
６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ又は６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニドが使用される場合、培地中のその濃度は好ましくは０．４ｇ／ｌである。
【００４５】
また、反応培地は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、無機物、ビタミン、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてよい。培地の例が、本出願人によるヨーロッパ特許出願ＥＰ６５６４２１号及びＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／０９２０７号中に記載されている。
【００４６】
本発明の方法の実施は、次の工程によって実施することができる：
ａ） サンプルのすべて又は一部を上記反応培地に播種すること、
ｂ） 播種した培地をインキュベートすること、
ｃ） 少なくとも１つのα−グルコシダーゼ活性の存在を、単独で、又は、α−グルコシダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること
（本発明の別の主題を構成する）。
【００４７】
上記播種段階及びインキュベート段階は、当業者に広く知られている。
【００４８】
例えば、インキュベート時の温度は３７℃であってよい。また、インキュベート時の雰囲気は好気的であることが好ましい。
【００４９】
上記顕現は、反応培地中に拡散せずにコロニーの中に集まる着色の変化を視覚化することにより、肉眼で実施される。蛍光を顕現化する際、当業者に公知の蛍光読み取り装置が使用される。
【００５０】
分析する生体試料は、膣試料若しくは尿試料といった、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを含んでいることが多い任意の臨床試料、又は、その分析が臨床医による診断を援助可能な他の任意の試料である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明は以下の実施例によってより明瞭に理解されるであろう。しかし、これらの実施例はいかなる制限を加えるものでもない。
【実施例１】
【００５２】
＜α−グルコシダーゼ酵素基質を使用するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出＞
１．１ 反応培地の調製
反応培地は、心臓−脳抽出物（４．８４ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、肉汁（１．９６ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、ビオチン（ｂｉｏｔｈｉｏｎｅ）（１ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、ビオトリプカーゼ（ｂｉｏｔｒｙｐｃａｓｅ）（７．２ｇ／ｌ；Ｓｏｌａｂｉａ社）、炭酸ナトリウム（０．３ｇ／ｌ；ＶＷＲ社）、ピルビン酸ナトリウム（２ｇ／ｌ；Ｆｌｕｋａ社）、ＨＥＰＥＳバッファー（０．４ｇ／ｌ；シグマ社）、ラクトアルブミンペプトン（２ｇ／ｌ；ＤＭＶ）、グルコース（１ｇ／ｌ；メルク社）、アメリカ寒天（２ｇ／ｌ；Ｓｏｂｉｇｅｌ社）及びヨーロッパ寒天（１２ｇ／ｌ；Ｒｏｋｏ社）を混合することによって調製した。
【００５３】
１２１℃で１５分間オートクレーブした後、α−グルコシダーゼ酵素基質を下記のように０．１ｇ／ｌの割合で添加した。続いて、５０℃の水槽中で冷却した。
＊ ６−ブロモ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＲｅｄＡ−α−Ｇｌｕ； Ｉｎａｌｃｏ社）
＊ ６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｒｏｓｅ−α−Ｇｌｕ； Ｉｎａｌｃｏ社）
＊ ５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｍａｇｅｎｔａ−α−Ｇｌｕ；Ｇｌｙｃｏｓｙｎｔｈ社）
＊ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−α−Ｇｌｕ；Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社）
＊ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｎ−メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕ；Ｉｎａｌｃｏ社）
【００５４】
その後、次の細菌を播種するために培地をペトリ皿に注いだ。
【００５５】
１．２ 微生物株の播種
本出願人が保存している株に由来するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ株８つを生理食塩水中に懸濁して播種し、各培地上に別々にコロニーを形成させる。その後、培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。１８時間、２４時間又は４０時間以上インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べる。このコロニーの着色、増殖、及び、この着色の濃さについて記録した。
【００５６】
１．３ 結果
得られた結果を、下記表１中に示し、以下のように示す。
− 増殖（Ｇ）について、大きさはｍｍで示される。
− 着色の濃さ（Ｉ）について、０〜４の任意のスケールに基づいて、０は活性がないことに相当し、４は非常に濃い着色があることに相当する。
− 色（Ｃｏ）について、Ｔ＝青緑色、Ｒ＝ピンク色又は赤色、Ｇｒ＝緑色、Ｍｇ＝赤紫色である。
− インキュベート時間について、時間（Ｔ）である。
【００５７】
表１中に示される結果から、α−グルコシダーゼ酵素基質を使用して、少なくとも１８時間インキュベートすることによって、連鎖球菌Ｂを検出できることが実証される。
【００５８】
【表１】
【実施例２】
【００５９】
＜α−グルコシダーゼ酵素基質濃度の変化＞
酵素基質の濃度を変える以外は上記プロトコルを繰り返した。
【００６０】
下記表２から、基質濃度に対する検出菌株数（Ｉ≧０．６である場合に陽性であると考える）が示される。
【００６１】
【表２】
【００６２】
この表から、２００又は３００ｍｇ／ｌの濃度であれば良好に検出できることが実証される。
【実施例３】
【００６３】
＜α−グルコシダーゼ基質及び異なる酵素活性に対する基質の使用＞
この基質１３３ｍｇ／ｌを使用し、かつ、オートクレーブした後でアズトレオナム（ＩＣＮ社）０．０４７ｇ／ｌ、アンホテリシンＢ（Ｓｑｕｉｂｂ社）０．００４ｇ／ｌ及び次の成分を培地に添加する以外は、ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕを使用して、実施例１中に記載されるプロトコルを繰り返した。
培地１；実施例１の培地に対応するコントロール培地とＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕとを、上述のように改変したもの。
培地２；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−セロビオシダーゼ（Ｒｏｓｅ−β−セロビオシダーゼ）４００ｍｇ／ｌ。
培地３；６−クロロ−３−インドリル−β−Ｎ−アセチルグルコサミニド（Ｒｏｓｅ−β−ＮＡＧｌｕ）４００ｍｇ／ｌ及びＮ−アセチルグルコサミニド０．５ｇ／ｌ。
【００６４】
結果を下記表３中に示すが、表中、Ｇ、Ｃｏ及びＴは上記に定義し、Ｃｏ段については、Ｇｒ＝緑色、Ｇ＝灰色、Ｍｖ＝藤色、Ｍｇ＝赤紫色、Ｂ＝青色、Ｖｉ＝青紫色及びＲ＝ピンク色である。
【００６５】
すべての菌株は本出願人が保存している株に由来する。
【００６６】
【表３】
【００６７】
この表から、第二の酵素基質を使用すると、連鎖球菌Ｂの検出感度を下げることなく検出の特異性を改善できること、及び、関連方法で遭遇することの多い近接種と連鎖球菌Ｂとを、２４時間のインキュベート後に区別できることが実証される。
【実施例４】
【００６８】
＜本発明によるα−グルコシダーゼ基質を含む培地及び市販の培地を使用するＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅの検出の感度の比較＞
この感度試験において、上記実施例中に記載されるように調製した、ＧｒｅｅｎＡ−α−Ｇｌｕ ０．１３０ｇ／ｌと、Ｒｏｓｅ−β−Ｄ−セロビオシダーゼ０．２５０ｇ／ｌ、アズトレオナム０．０６４ｇ／ｌ及びアンホテリシンＢ（α−Ｇｌｕ培地）０．００４ｇ／ｌを含む本発明による培地を使用した。
【００６９】
比較用の培地として、Ｇｒａｎａｄａ ｍｅｄｉｕｍ（品番１００７７、ＢＩＯＬＹＳ社（フランス））（Ｇｒａｎａｄａ培地）を使用した。
【００７０】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ１４株を含む微生物６９株を播種し、３７℃で最長２４時間、及び、室温でそれ以上の時間インキュベートした。上述のようにコロニーを視覚化した。Ｂ群連鎖球菌の特性を有する疑いのあるコロニー（すなわち外観色が緑色のコロニー）の確認は、供給元の推薦（ビオメリュー社（フランス））に従ってＳｌｉｄｅｘ Ｓｔｒｅｐｔｏキット試薬を使用し、凝集アッセイを用いて実施した。特有でないコロニー（すなわち、緑色以外のコロニー、又は、特有の着色を有するものの凝集アッセイでの応答が陰性であるコロニー（偽陽性株））を、Ｇａｌｅｒｉｅ ＩＤ ３２ Ｓｔｒｅｐ（ビオメリュー社（フランス））を用いて識別した。
【００７１】
結果は、感度及び特異性について全試験に対する正確な診断の％で表し、下記表４中に、培地上における真の陽性の検出数を真の陽性の総検出数で割った値（＊１００）に相当する％感度、及び、培地上における真の陰性の検出数を真の陰性の総検出数で割った値（＊１００）に相当する％特異性で表す。
【００７２】
【表４】
【００７３】
この表中に示される結果から、本発明の方法を使用すれば、連鎖球菌Ｂの検出感度が改良されることが実証される。また、本発明の検出用培地は特異性が良好であり、この特異性は、寒天播種の前に、５％ ＣＯ２の存在下又は非存在下で、Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地を３５〜３７℃で１８〜２４時間通して強化すると改良されることも示される（参照：ＣＤＣ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ） ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ， ＭＭＷＲ（Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔ）， Ａｕｇｕｓｔ １６， ２００２， ｖｏｌ．５１， Ｎｏ．ＲＲ−１１）。
【実施例５】
【００７４】
＜臨床サンプルに基づく培地の使用＞
この試験には、上記実施例４中で調製された本発明による培地を使用した。
【００７５】
この試験では、妊婦の膣又は子宮頚管の試料に由来するサンプル／綿球を計１３４個使用した。
【００７６】
綿球はそれぞれ、無菌生理食塩水１ｍｌ中で乳化し、まずこの溶液１００μｌをウマ血液５％を含むコロンビア寒天上に置いて、次に本発明の方法を使用する培地上に置いた。続いて、上記溶液１００μｌを使用してＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地に播種した。好気性条件下において３７℃で２０時間インキュベートした後、血液−寒天培地及び本発明の培地をＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地を使用して播種し、その後、好気性条件下で３７℃で２０時間インキュベートした。
【００７７】
Ｂ群連鎖球菌の特性を有する疑いのあるコロニー（すなわち外観色が緑色のもの）の確認は、供給元の推薦（ビオメリュー社（フランス））に従ってＳｌｉｄｅｘ Ｓｔｒｅｐｔｏキット試薬を使用し、凝集アッセイを用いて実施した。
【００７８】
サンプル１３４個のうち１１２個を、まず、生理食塩水懸濁液から寒天培地上に直接播種し、次にＴｏｄｄ Ｈｅｗｉｔｔ培地中で強化した後で播種した。残りのサンプル２２個は、生理食塩水懸濁液から寒天培地上に単に直接播種した。
【００７９】
結果は平均％感度及び特異性として算出し、下記表５中に示す。
【００８０】
【表５】
【００８１】
表中の結果から、臨床サンプルと共に使用されると培地の感度は良好であること（１８／２０のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅが検出された）、及び、検出の特異性が標準培地と比較して改善されていること（コロンビア血液培地について、偽陽性は２４中１０）が示される（これらの結果は、研究所の菌株を使用して得られた結果と本質的に同等である）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、
少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素基質はインドキシル誘導体に基づく基質である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応培地中の酵素基質の濃度は１０〜２０００ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応培地は、アズトレオナム及びアンホテリシンＢの混合物をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
反応培地は、好ましくはβ−セロビオシダーゼ基質及びβ−グルコサミニダーゼ基質から選択される、異なる酵素活性に対する少なくとも１つの他の基質をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ種の細菌を含んでいることが多い試料中においてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ種の細菌を特異的に検出及び識別する方法であって、
次の工程：
ｄ） サンプルのすべて又は一部を請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応培地に播種すること、
ｅ） 播種した培地をインキュベートすること、
ｆ） 少なくとも１つのα−グルコシダーゼ活性の存在を、単独で、又は、α−グルコシダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅを特異的に検出及び識別する方法であって、
少なくとも１つのα−グルコシダーゼ酵素基質を含む反応培地を使用する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
酵素基質はインドキシル誘導体に基づく基質である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応培地中の酵素基質の濃度は１０〜２０００ｍｇ／ｌである
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応培地は、アズトレオナム及びアンホテリシンＢの混合物をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
反応培地は、好ましくはβ−セロビオシダーゼ基質及びβ−グルコサミニダーゼ基質から選択される、異なる酵素活性に対する少なくとも１つの他の基質をさらに含む
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ種の細菌を含んでいることが多い試料中においてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ種の細菌を特異的に検出及び識別する方法であって、
次の工程：
ｄ） サンプルのすべて又は一部を請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応培地に播種すること、
ｅ） 播種した培地をインキュベートすること、
ｆ） 少なくとも１つのα−グルコシダーゼ活性の存在を、単独で、又は、α−グルコシダーゼ活性以外の少なくとも１つの他の酵素活性と共に顕現させること：を含む
ことを特徴とする方法。
【公表番号】特表２００８−５１３００１（Ｐ２００８−５１３００１Ａ）
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５３１８０８（Ｐ２００７−５３１８０８）
【出願日】平成１７年９月１４日（２００５．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０５０７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３２８１０
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年５月１日（２００８．５．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１４日（２００５．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００５／０５０７４０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０３２８１０
【国際公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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