αウイルスレプリコンパッケージング構築物
不完全なパッケージングシグナルである、改変されかつ機能的な５’増幅配列が提供される。これらの改変された５’増幅配列を含む組成物および方法もまた提供される。一局面において、本発明は、改変された５’増幅配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含み、この改変された配列は、（相補的なマイナス鎖ＲＮＡ中間体由来の）ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に薬学的組成物に関する。詳細には、本発明は、パッケージングシグナルとして不完全な、改変されたシス作用性、機能性の増幅配列に関し、そしてこれらの配列を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
αウイルスは、トガウイルス科ファミリーの遺伝学的、構造的および血清学的に関連する節足動物媒介ウイルスの集合を含む。２６種の公知のウイルスおよびウイルス亜型が、αウイルス属内に分類され、これらとしては、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ロス川ウイルス（ＲＲＶ）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）が挙げられる。
【０００３】
αウイルス属のいくつかのメンバーは、ワクチンおよび治療薬としての使用のための「レプリコン」発現ベクターとして開発されている。レプリコンベクターは、いくつかの様式（ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる）で利用され得、そしてレプリコンベクター（レプリコン粒子）を含む組換えウイルス様粒子を作製するために利用され得る。このようなレプリコンベクターはαウイルスに由来しており、これらのαウイルスとしては、例えば、ＳＩＮ（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、セムリキ森林熱ウイルス（非特許文献５；非特許文献６）およびＶＥＥ（非特許文献７）が挙げられる。現在、広範な多数の文献は、ワクチン（例えば、非特許文献２；非特許文献６；非特許文献３；非特許文献７；非特許文献４；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと）のような適用のために、αウイルスレプリコンベクターを使用する効力を実証している。
【０００４】
核酸ベースのワクチンとしての、αウイルスレプリコンベクターの使用は、他の核酸発現ベクターと比較して、特定の利点を提供し得る。数年を通して、いくつかの用語（αウイルスベクター、αウイルスベクター構築物、αウイルスレプリコン、αウイルスＲＮＡレプリコン、αウイルスベクターレプリコン、真核生物用層状のベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＬＶＩＳ）およびαウイルスプラスミドレプリコンなどが挙げられる）は、αウイルスレプリコンベクターを記載するように現れている。
【０００５】
遺伝子送達ビヒクルとしてのそれらの使用に加えて、αウイルスレプリコンベクターはまた、それら自身で予防適用および治療適用において有用な、組換えウイルス粒子またはウイルス様粒子（レプリコン粒子）を生成するための使用について記載されている。例えば、非特許文献４を参照のこと。αウイルスレプリコン粒子は、代表的に粒子形成に必要とされる種々のエレメントを分割する、マルチコンポーネントシステム（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して生成される。種々のエレメントの分割は、所望されない複製能を有するウイルスを生成する危険を減らす。このシステムは、代表的に１）レプリコンベクター（それ自身の細胞内複製に必要なエレメント（例えば、非構造タンパク質をコードする配列）を含むが、子孫粒子の産生に必要な、１つ以上の構造タンパク質をコードするエレメントを欠く）、および２）パッケージングに必要とされるαウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシド、糖タンパク質）をコードする、１つ以上の構造タンパク質発現カセット構築物（例えば、不完全なヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ））を含む。レプリコン構築物および不完全なヘルパー構築物は、ＲＮＡとして細胞に直接導入されても、または一過的にトランスフェクトされた細胞または安定にトランスフェクトされた細胞（例えば、パッケージング細胞株またはＰＣＬ）のいずれかにおけるＤＮＡから送り出してもよい。例えば、非特許文献４；特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６、非特許文献２、非特許文献１１を参照のこと。
【０００６】
理想的には、予防適用または治療適用において使用されるαウイルスレプリコン粒子の集団は、実質的に均一であり得、レプリコンＲＮＡのみを含む。しかしながら、パッケージングエレメントが分割される場合でさえも、さらなるＲＮＡ種（例えば、不完全なヘルパーＲＮＡ）を含む粒子が生じ得る。非レプリコンＲＮＡ種の、この望ましくないパッケージングはまた、「同時パッケージング（ｃｏ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ）」と称される。
【０００７】
したがって、αウイルスベクター技術における進歩にもかかわらず、例えば、同時パッケージングを減らすための、αウイルスベクターおよびαウイルスレプリコン粒子を含む薬学的組成物、ならびにαウイルスベクターおよびαウイルスレプリコン粒子を作製および使用する方法に対する必要性が依然として存在する。
【特許文献１】米国特許第６，４６５，６３４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４２６，１９６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３７６，２３６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３４２，３７２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０１５，６８６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８４３，７２３号明細書
【非特許文献１】Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：１１８８〜１１９１
【非特許文献２】Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ＴＷら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０（１）：５０８〜５１９
【非特許文献３】Ｈａｒｉｈａｒａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：９５０〜９５８
【非特許文献４】Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６（８）：４５９８〜４６０３
【非特許文献５】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３５６〜１３６１
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）１６：５６２〜５６５
【非特許文献７】Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３９：３８９〜４０１
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：３７１〜３７８
【非特許文献９】ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１０：４３４〜４３９
【非特許文献１０】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：４９７〜５０７
【非特許文献１１】Ｆｒｏｌｏｖら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（１９９６）９３（２１）：１１３７１〜１１３７７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、パッケージングシグナルとして不完全であるように改変される増幅配列を含む組成物および、これらの組成物を作製および使用する方法を含む。
【０００９】
一局面において、本発明は、改変された５’増幅配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含み、この改変された配列は、（相補的なマイナス鎖ＲＮＡ中間体由来の）ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない。特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列は、一次配列レベルにおいて、パッケージングシグナルに対し低い相同性（配列同一性）を示す配列を含むが、その二次構造は、元の増幅配列のものを維持する。特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列はＲＮＡである。さらに、特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列は、配列番号４〜１６のうちの任意の一つ、または配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約５０％〜約６０％（または、これらの間の任意の値（例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約６０％〜約７０％（または、これらの間の任意の値（例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約７０％〜約８０％（または、これらの間の任意の値（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約８０％〜約９０％（または、これらの間の任意の値（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％））の配列同一性を示す配列、もしくは配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約９０％〜９９％（または、これらの間の任意の値（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％））の配列同一性を示す配列を含む。
【００１０】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列のいずれかにおいて、この改変された配列が、ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない限り、この配列は、合成物であってもよいし、ならびに／または、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ由来の配列からなる群から選択される配列に由来してもよい。特定の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し９０％未満の同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し８０％未満の配列同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し７０％未満の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し少なくとも６０％未満の配列同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し、少なくとも約４０％と約５０％との間（または、これらの間の任意の値（例えば、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％））の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し少なくとも約３０％と約４０％（または、これらの間の任意の値（例えば、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％））の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し、約３０％未満の配列同一性を示す配列を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の５’増幅配列のいずれかを含むＲＮＡベクター構築物を含む。特定の実施形態において、ベクター構築物はさらに、αウイルスの接合領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）プロモーターをコードする核酸配列、１つ以上のαウイルスの構造タンパク質（例えば、糖タンパク質Ｅ１および／または糖タンパク質Ｅ２；キャプシドタンパク質など）をコードする核酸配列および／またはＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含み得る。さらに、ベクター構築物はまた、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含み得る。本明細書に記載のＲＮＡベクター構築物のいずれかは、必ずしも生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質をコードし得ない。さらに、本明細書に記載のベクター構築物のいずれかは、２種以上のαウイルスに由来する配列を含み得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、核酸分子に作動可能に連結された５’プロモーターを含むαウイルスベクター構築物を含み、この核酸分子は、本明細書に記載のＲＮＡベクターに対し、相補的なＤＮＡである。特定の実施形態において、ベクター構築物はさらに、転写終結を制御する３’配列を含み得る。５’プロモーターは、原核生物のプロモーターまたは真核生物のプロモーターであり得る。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、本明細書に記載のαウイルスベクター構築物のいずれかを含む細胞を含む。
【００１４】
なお別の局面において、本発明は、宿主細胞と１つ以上の本明細書に記載のαウイルスベクターとを含む、αウイルスパッケージング細胞株を含む。
【００１５】
なおさらなる局面において、本発明は、感染性かつ不完全な（複製に欠陥のある）αウイルス粒子を産生するためのヘルパー細胞を含み、この細胞は、αウイルスレプリコンベクターとレプリコンベクターに存在しないαウイルスの構造タンパク質をコードする１つ以上の個別の発現カセット（例えば、ヘルパー構築物）とを、αウイルス許容性細胞中に含む。上記の個別のヘルパー構築物のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含む。そしてさらに、レプリコンベクターと個別の構造タンパク質発現カセット（例えば、ヘルパーベクター）との組み合わせた発現は、１つ以上の異種配列を含む構築されたαウイルス粒子を産生し、このαウイルス粒子は、細胞に感染し得、かつウイルス複製を完結し得ない。特定の実施形態において、ヘルパー細胞は、２つの個別の構造タンパク質発現カセット構築物（例えば、ヘルパー構築物）を含み、ここで第一の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物はαウイルスキャプシドタンパク質をコードし、第二の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物はαウイルス糖タンパク質をコードする。１つ以上の個別の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物は、改変された５’増幅配列を含み得る。好ましくは、ヘルパー細胞は、αウイルスレプリコンベクターと１つ以上の個別の構造タンパク質発現カセットヘルパー構築物とによってトランスフェクトされる。
【００１６】
別の局面において、本発明は、感染性かつ不完全な（複製に欠陥のある）αウイルス粒子を作製する方法を包含し、この方法は：（ａ）本明細書に記載されるヘルパー細胞を提供する工程；（ｂ）このヘルパー細胞内でαウイルス粒子を産生させる工程；そして（ｃ）このヘルパー細胞から産生されたαウイルス粒子を収集する工程を包含する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかにしたがって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む組成物を含み、この組成物は、検出可能な複製能のあるαウイルス粒子を含まない。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む薬学的処方物を含む。
【００１９】
なおさらなる局面において、本発明は、本明細書に記載の改変された５’増幅配列のいずれかを作製する方法を含み、この方法は、（ａ）公知の５’増幅配列とウイルスパッケージングシグナルを含む配列との間の配列相同性の領域を決定する工程；および（ｂ）ウイルスパッケージングシグナルを含む配列への相同性が減らされるが、増幅機能は維持されるように、公知の５’増幅配列の一次配列を改変し、それによって改変された５’増幅配列を作製する工程を包含する。特定の実施形態において、公知の５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルスの５’末端、αウイルス由来ではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ由来の配列からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のこれらの局面および実施形態ならびに他の局面および実施形態は、以下の詳細な説明および本明細書に示され、特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、配列など）をより詳細に記載する種々の参考文献への参照により明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
組成物およびαウイルス粒子（レプリコン粒子）を生成するための方法が、本明細書に記載される。特に、改変された５’増幅配列が記載される。この改変された５’増幅配列は、αウイルス構造タンパク質構築物（例えば、ヘルパー構築物）およびパッケージング細胞株などにおける使用を見出される。
【００２２】
その他に示されない限り、本発明の実施は、当該分野の技術の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬物学の従来方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照のこと。
【００２３】
本明細書に引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的についてそれら全体が参考として、本明細書に援用される。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がその他を明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「配列」への言及は、２つ以上のこのような配列を含む。
【００２５】
（定義）
本発明を示すより前に、以後使用される特定の用語の定義が示される。
【００２６】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」分子としては、原核生物のＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列、真核生物のｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列または合成ＲＮＡ配列、上記のＤＮＡのいずれかから転写されたＲＮＡおよび上記の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、任意の公知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログを含む配列、ならびに天然の配列への改変（例えば、欠失、付加および（一般的に天然において保存的な）置換）を含む配列も捕捉する。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介して意図され得るか、または偶発的であり得る。ポリヌクレオチドの改変は、多数の影響（例えば、宿主細胞におけるポリペプチド産物の発現を促進することが挙げられる）を有し得る。ポリヌクレオチドとしては、二本鎖配列および一本鎖配列の両方が挙げられ得る。ポリヌクレオチドは、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物のｍＲＮＡまたは真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）または原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、ならびに合成ＤＮＡ配列または合成ＲＮＡ配列をいうが、これらに限定されない。この用語はまた、任意の公知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログを含む配列も捕捉する。
【００２７】
「単離された核酸分子」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが通常関連する完全な生物から独立かつ分離した、あらゆるポリヌクレオチド、および／または、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から離された、あらゆるポリヌクレオチドをいう。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは単離されないが、天然の系に同時に存在する物質のいくつかまたは全てから独立した同一のポリヌクレオチドが単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／または、このようなポリヌクレオチドは、組成物の一部であり得る。このようなポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物が、それらの天然の環境の一部ではない場合に、なお単離される。単離された核酸分子の例は、生物のゲノムＤＮＡに一体化されていない核酸分子、またはウイルスの場合、完全なウイルスゲノムおよび化学合成された核酸分子から分離される核酸分子、または組換え技術（例えば、ＰＣＲ）により生成される核酸分子である。
【００２８】
「サブゲノムの（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ」は、それが由来するゲノムＲＮＡよりも短い長さまたは小さいサイズのＲＮＡ分子をいう。サブゲノムのＲＮＡは、内部プロモーター（この配列はゲノムＲＮＡまたはその相補体内に存在する）から転写される。好ましい実施形態において、サブゲノムのＲＮＡは、αウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコンまたは不完全なヘルパー構築物から産生され、１つ以上のαウイルス構造タンパク質または他の目的の異種配列をコードする。一般的に、サブゲノムのＲＮＡは、５’末端非翻訳領域および３’末端非翻訳領域ならびにタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、代表的なｍＲＮＡに類似する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、句「ベクター構築物」は、一般的に、目的の核酸配列または遺伝子の発現を誘導し得る、あらゆるアセンブリをいう。ベクター構築物は、代表的に、転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座を規定する（ｌｏｃｕｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ）エレメントまたは、他の手段（例えば、可変（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシング、核内ＲＮＡの搬出、メッセンジャーの翻訳後の改変またはタンパク質の転写後の改変）により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。さらに、ベクター構築物は、代表的に、転写される場合に、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、翻訳開始配列として作用する配列を含む。例えば、ベクターは、合成を開始する１つ以上の５’プロモーター配列（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含み得、これらとしては、原核生物および真核生物の両方に由来するプロモーター（例えば、細菌のβ−ガラクトシダーゼプロモーターおよびｔｒｐＥプロモーター、ならびに真核生物のウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時初期）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターおよび単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター）が挙げられる。ベクター構築物はまた、必要に応じて、ポリアデニル化を誘導するシグナル、選択可能なマーカー、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終止配列を含み得る。ベクター構築物の例としては、ＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補体を含むＥＬＶＩＳベクター、ＲＮＡベクター構築物それ自身、αウイルスベクター構築物およびＣＭＶベクター構築物などが挙げられる。
【００３０】
「αウイルスベクター構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を誘導し得るアセンブリをいう。このようなベクター構築物は、αウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（αウイルスＲＮＡの転写を開始し得る、保存された５’ヌクレオチド配列エレメント（ＣＳＥ）または５’シス複製配列とも呼ばれる）、および発現される場合に、生物学的に活性なαウイルスの非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、αウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（３’ＣＳＥまたは３’シス複製配列とも呼ばれる）、そして必要に応じて、ポリアデニル化トラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ ｔｒａｃｔ）から構成される。さらに、ベクター構築物は、ウイルスのサブゲノムの「接合領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、ウイルス様粒子（例えば、レプリコン粒子）の産生を可能にするのに十分なサイズの外来の核酸分子、インビトロまたはインビボ（例えば、真核生物の細胞内）でｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、発現されるべき異種配列、および異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含み得る。
【００３１】
「αウイルスＲＮＡレプリコンベクター」、「ＲＮＡレプリコンベクター」、「レプリコンベクター」または「レプリコン」は、標的細胞内で、インビボでのそれ自身の増幅または自己複製を誘導し得るＲＮＡ分子をいう。それ自身の増幅を誘導するために、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ増幅を触媒するのに必要な酵素（例えば、αウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードすべきであり、このコードされる酵素により認識および利用される、複製のために必要なシスＲＮＡ配列も含むべきである。αウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、以下の調整されたエレメントを含むべきである：非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列（５’ＣＳＥまたは５’シス複製配列、または複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列、またはαウイルスの転写を開始し得る５’配列とも呼ばれる）、発現される場合に、生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）。αウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、例えば、特定の実施形態において、サブゲノムのフラグメントのウイルスの転写を増大もしくは減少させるためにか、または不完全なヘルパーもしくは構造タンパク質発現カセットとの相同性を減らすために改変され得るＩＲＥＳあるいはウイルス（例えば、αウイルス）サブゲノムのプロモーター（例えば、接合領域プロモーター）のような、１つ以上の異種配列を発現するための手段と、発現されるべき１つ以上の異種配列とを含み得る。レプリコンはまた、さらなる配列（例えば、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種配列（例えば、タンパク質をコードする遺伝子または３’近位の遺伝子）および／またはポリアデニル化トラクト）も含み得る。レプリコンは、αウイルス構造タンパク質（キャプシド、Ｅ１、Ｅ２）の全てをコードする配列を含むべきではない。レプリコンベクターにより発現され得る異種配列の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号（その全体が、本明細書において参考として援用される）に記載され、これらの例は、例えば、抗原、リンホカイン、サイトカインなどを含む。
【００３２】
「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」は、ウイルス粒子（ビリオン）へヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り込むことに関与するシス作用性配列をいう。多くのウイルス由来のパッケージングシグナルが記載されている。例えば、Ｙｏｕｉｌ Ｒ．ら（２００３）Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １４（１０）：１０１７〜１０３４；Ｂｅａｓｌｅｙ ＢＥら（２００２）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：４９５０〜４９６０；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔら（２００３）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（１９）：１０５７５〜１０５８３を参照のこと。
【００３３】
「組換えαウイルス粒子」または「レプリコン粒子」は、αウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン様構造単位をいう。一般的に、組換えαウイルス粒子は、１つ以上のαウイルス構造タンパク質、脂質膜およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えαウイルス粒子は、宿主細胞由来の脂質二重層（例えば、原形質膜）内に含まれるヌクレオキャプシド構造を含み、この構造に、αウイルスにコードされるエンベロープ糖タンパク質が包埋される。この粒子はまた、このαウイルスが由来する粒子の親和性を誘導する、他の構成要素（例えば、標的化するエレメント、他のウイルス構造タンパク質または他のレセプター結合リガンド）を含み得る。
【００３４】
「αウイルス構造タンパク質発現カセット」は、１つ以上のαウイルス構造タンパク質を発現しうるベクター構築物をいう。αウイルス構造タンパク質発現カセットは、ＲＮＡ増幅または複製が可能な「不完全なヘルパー構築物」であり得、そしてトランスで供給される生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質に応答して、１つ以上のαウイルス構造タンパク質を発現し得る。不完全なヘルパー構築物は、代表的に、以下の調整されたエレメントを含む：５’増幅配列または５’シス複製配列、ウイルスのサブゲノムの接合領域プロモーター、発現される場合に、１つ以上の生物学的に活性なαウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、３’増幅配列または３’シス複製配列およびポリアデニル化トラクト。不完全なヘルパー構築物はまた、インビトロまたはインビボ（例えば、真核生物の細胞）でｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、転写終結を制御する３’配列、スプライス認識（ｓｐｌｉｃｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）配列、触媒リボザイムプロセシング（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）配列、選択可能なマーカーをコードする配列および／または核外移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｓｉｇｎａｌ）を含み得る。不完全なヘルパー構築物は、４種全ての機能性αウイルス非構造タンパク質をコードすべきではない。
【００３５】
用語「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列」および「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’配列」および「増幅配列」および「５’増幅配列」および「５’ＣＳＥ」および「複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列」および「αウイルスの転写を開始し得る５’配列」は、ウイルスまたはウイルス由来のベクターがポジティブ鎖ＲＮＡを合成する認識部位を提供する機能性エレメントをいうために交換可能に使用される。それゆえ、これは、このウイルスまたはベクター内に含まれる実際の配列の相補体であり得、マイナス鎖ＲＮＡコピーの３’末端に一致し得る。そして、これは、非構造タンパク質レプリカーゼ複合体と、おそらくさらなる宿主細胞因子とにより結合され、これから、ポジティブ鎖ＲＮＡの転写が開始される。広範な種類の配列が、増幅配列として利用されており、これらとしては、例えば、αウイルス５’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）および、例えば、αウイルスゲノムのヌクレオチド２１０、ヌクレオチド２５０、ヌクレオチド３００、ヌクレオチド３５０、ヌクレオチド４００またはヌクレオチド４５０までの配列のような他の隣接する配列が挙げられる。あるいは、例えば、シンドビス（ＳＩＮ）ベクターの場合に、ｔＲＮＡアスパラギン（ｔＲＮＡａｓｐ）のためのαウイルスではないヌクレオチド１０〜７５が使用された（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）。
【００３６】
本明細書で使用される、用語「５’改変された増幅配列」は、先に定義される増幅配列を含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子をいい、この改変された配列が、パッケージングシグナルとしては不完全だが、それらの増幅（複製）機能性は維持するように、公知の増幅シグナルと比較して、それらの一次構造（配列）が改変（例えば、置換、付加、欠失）されている。例えば、改変された増幅配列は、一次配列レベルにおいて、パッケージングシグナルに対し低い相同性を含み得る一方で、その二次構造は元の増幅配列のものを維持する。改変された増幅配列は、さらに、二次構造および／またはシス作用性増幅能力が維持される限り、さらなる配列を含み得る。
【００３７】
用語「３’近位の遺伝子」は、レプリコンベクター、真核生物用層状のベクター開始システム、不完全なヘルパーＲＮＡまたは構造タンパク質発現カセット内に含まれ、かつ別のエレメントに関して特定の位置内に配置される、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。この３’近位の遺伝子の位置は、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列（先に定義される）に関して決定されねばならず、この３’近位の遺伝子は、このエレメントの５’（上流）かつ直前の、タンパク質をコードする配列である。
【００３８】
用語「ウイルス性サブゲノムのプロモーター」は、必要とされるウイルスポリメラーゼおよび細胞ポリメラーゼならびに他の因子とともにゲノム長未満のＲＮＡ分子の転写を可能にする、ウイルス起源の配列をいう。αウイルス（αウイルス性）サブゲノムのプロモーターまたはαウイルス（αウイルス性）サブゲノムの接合領域プロモーターについて、この配列は、一般的に、非構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と構造タンパク質のオープンリーディングフレームとの間の領域から得られ、通常、サブゲノムのｍＲＮＡの転写を制御する。代表的に、αウイルスサブゲノムのプロモーターは、大半のプロモーター関連活性を提供するコア配列、およびプロモーター関連活性をさらに増強する隣接領域（例えば、伸長されたプロモーターまたは天然のプロモーター）からなる。サブゲノムのプロモーターは、ウイルスまたはベクター内に含まれる実際の配列の相補体であり得、これは、マイナス鎖ＲＮＡコピー内の領域に一致し得、ポジティブ鎖サブゲノムのｍＲＮＡの転写開始を促進し得る。例えば、αウイルス基本型である、シンドビスウイルスの場合に、通常のサブゲノムの接合領域プロモーターは、代表的に、おおよそヌクレオチド番号７５７９から始まり、少なくともヌクレオチド番号７６１２まで続く（そしておそらく、それを越えて続く）。最小でも、ヌクレオチド７５７９〜ヌクレオチド７６０２は、サブゲノムのフラグメントの転写のために必要なコア配列として働くと考えられる。
【００３９】
用語「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス性配列または３’細胞性配列」または「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列」は、複製のためにシスで必要とされる、用語３’ＣＳＥもしくは３’シス複製配列もしくは３’ウイルス性配列、またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列と交換可能に使用される。この配列は、ウイルスまたはウイルス由来のベクターが負のＲＮＡ鎖の合成による複製（増幅）を開始する認識部位を提供する、機能性エレメントである。広範な種類の配列が、この機能のために利用され得る。例えば、この配列は、完全なαウイルス３’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）を含み得、例えば、ＳＩＮについては、ヌクレオチド１１，６４７〜ヌクレオチド１１，７０３を含み得る領域、または、依然として認識配列としての機能を維持する３’ＮＴＲの短縮された領域（例えば、ヌクレオチド１１，６８４〜ヌクレオチド１１，７０３）であり得る。例えば、米国特許第６，３２９，２１０号を参照のこと。この文脈で利用され得る配列の他の例としては、αウイルスではない配列または負鎖ＲＮＡ合成の開始を可能にする類似の機能性を維持する他の配列（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５に記載の配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「安定な形質転換」は、生細胞への核酸分子の導入、かつ細胞分裂の連続的なサイクルを通しての子孫細胞におけるこの核酸分子の長期間の維持または恒久的な維持をいう。核酸分子は、あらゆる細胞構成要素（核、ミトコンドリアまたは細胞質が挙げられるが、これらに限定されない）内に維持され得る。好ましい実施形態において、核酸分子は、核内に維持される。維持は、エピソーム事象のように染色体内（一体化され得る）であり得るか、または染色体外であり得る。
【００４１】
「αウイルスパッケージング細胞株」は、αウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、αウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物用層状のベクター開始システム（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号）または組換えαウイルス粒子の導入後に、組換えαウイルス粒子を産生する細胞をいう。この親細胞は、哺乳動物起源であり得るか、または哺乳動物起源ではなくあり得る。好ましい実施形態内において、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットにより安定に形質転換される。
【００４２】
「作動可能に連結された」は、記載される構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される、エレメントの配置をいう。コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にコード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、それがコード配列の発現を誘導するように機能する限り、必ずしもコード配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、介在性の翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在し得ても、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」とみなされ得る。
【００４３】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較され得る。同様に、２つ以上のアミノ酸配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、核酸配列であろうとペプチド配列であろうと、一般的に、２つの整列された配列間の正確な一致の数（短い方の配列の長さによって割り、１００を乗じた数）として記載される。核酸配列のためのおおよそのアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５〜６７６３（１９８６）により正規化されたスコア付けマトリックスを使用するペプチド配列における使用に拡大され得る。核酸配列およびペプチド配列に対するこのアルゴリズムの実行は、そのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。この方法のための初期設定のパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから利用可能）に記載される。配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性を計算するための、他の同等に適切なプログラムは、一般的に当該分野において公知である。
【００４４】
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント同一性は、初期設定のスコア付けテーブル（ｓｃｏｒｉｎｇ ｔａｂｌｅ）および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。本発明の文脈においてパーセント同一性を確立する別の方法は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により頒布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージの一式から、初期設定のパラメータがスコア付けテーブル（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよび６のギャップ）について使用される場合に、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用され得る。生成されたデータから、「一致」の値は「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性を計算するための、他の適切なプログラムは、一般的に当該分野において公知である（例えば、初期設定のパラメータを用いても使用され得る、アラインメントプログラムＢＬＡＳＴ）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定のパラメータを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４５】
当業者は、上記のプログラムにおいて、所定の配列のために使用する適切な探索パラメータを容易に決定し得る。例えば、探索パラメータは、当該の配列のサイズに基づいて変動し得る。したがって、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個隣接するヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチドを含み得、ここで、（ｉ）Ｘ個隣接するヌクレオチドは、本明細書に記載の配列のいずれかに由来するＹ個隣接するヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸはＹと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上かつ５０００ヌクレオチドまでであり、好ましくは８ヌクレオチド以上かつ５０００ヌクレオチドまでであり、より好ましくは１０〜１２ヌクレオチドかつ５０００ヌクレオチドまでであり、そしてさらにより好ましくは１５〜２０ヌクレオチド、本明細書に記載の全長配列（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照のこと）に存在するヌクレオチドの数までであり、上記の範囲内の全ての整数値を含む。
【００４６】
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載されるように「選択的にハイブリダイズする」とみなされる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に一致する核酸配列は、完全に一致する配列が標的分子へハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する。完全に一致する配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノザンブロットまたは溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、選択性の変動する程度（例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーに変化する条件を使用すること）を使用して実施され得る。低ストリンジェンシーの条件が利用される場合、非特異的な結合が存在しないことは、配列同一性の部分的な程度さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価され得、その結果、非特異的な結合事象が存在しない場合において、この二次プローブは、標的にハイブリダイズしない。
【００４７】
ハイブリダイゼーションベースの検出システムを利用する場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に、適切な条件の選択により、プローブと標的とは互いに「選択的にハイブリダイズする」か、または結合し、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下で、ハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と約９０％〜９５％より高い配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的とが配列同一性の特定の程度を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野において公知であるように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４８】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関して、多くの同等の条件が、例えば、以下の因子を変更することにより特定のストリンジェンシーを確立するために利用され得ることが当該分野において周知である：プローブと標的配列との長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤の存在または不在（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度パラメータおよびハイブリダイゼーション反応時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変更すること。ハイブリダイゼーション条件の特定の設定の選択は、当該分野において標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００４９】
用語「二次構造」は、ポリヌクレオチドの立体配座（二次構造または三次構造）をいう。例えば、一本鎖ＲＮＡ分子は、一般的に、二次構造（ヘアピン構造およびステム−アンド−ループ構造など）をとる。任意の所定のポリヌクレオチドの二次構造は、多くのアルゴリズム（例えば、Ｚｕｃｋｅｒら「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ」（インターネット上で利用可能）に記載されるＲＮＡ二次構造予測およびＤＮＡ二次構造予測のためのｍｆｏｌｄパッケージ）を使用して、その一次配列から予測され得る。
【００５０】
用語「に由来する」は、分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド）のαウイルス性供給源を同定するために使用される。第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同一の塩基対配列もしくは実質的に同一な塩基対配列を有する場合、第一のポリヌクレオチドが先に記載される配列同一性を示す場合、または第一のポリヌクレオチドが第二のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同一のポリペプチドもしくは実質的に同一なポリペプチドをコードする場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチド「に由来する」。したがって、ポリヌクレオチドが、（ｉ）特定のαウイルス配列の少なくとも一部と同一の配列もしくは実質的に同一な配列を有する場合、または（ｉｉ）先に記載されるαウイルスのポリペプチドのいずれかに対し、配列同一性（例えば、５０％より高いパーセント同一性（先に記載される））示すポリペプチドをコードする場合に、ポリヌクレオチドは特定のαウイルス（例えば、種）「に由来する」。したがって、本明細書に記載の配列は、１種以上のαウイルス（ＳＩＮ、ＶＥＥ、ＳＦＶなど）に由来し得、それは、本明細書に提供される開示を考慮して、天然に存在する供給源または受託者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から容易に取得され得る。適切なαウイルスの代表的な例は、より詳細に米国特許第５，８４３，７２３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３８０８７に記載される。
【００５１】
代表的な「制御エレメント」としては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンに対して３’に配置される）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に配置される）、翻訳終止配列、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’配列、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列および１つ以上の異種配列を発現させる手段（例えば、サブゲノムの接合領域プロモーター）（例えば、ＭｃＣａｕｇｈａｎら（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：５４３１〜５４３５；Ｋｏｃｈｅｔｏｖら（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１〜３５５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
「真核生物用層状のベクター開始システム」は、目的の配列または遺伝子の発現を誘導し得るアセンブリを含むポリヌクレオチドをいう。真核生物用層状のベクター開始システムは、ｃＤＮＡからのＲＮＡの合成をインビボ（すなわち、真核生物の細胞内）で開始し得る５’プロモーター、および、真核生物の細胞内でそれ自身の複製を誘導し得、かつまた異種配列を発現し得る核酸ベクター配列（例えば、ウイルス性ベクター）を含むべきである。好ましくは、核酸ベクター配列は、αウイルス由来の配列であり、これは、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列（５’ＣＳＥまたは５’シス複製配列または複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス性配列またはαウイルスの転写を開始し得る５’配列とも呼ばれる）、ならびに発現される場合に、生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス性配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥまたは複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス性配列またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）からなる。さらに、ベクター配列は、例えば、特定の実施形態において、サブゲノムのフラグメントのウイルス性の転写を防止、増大もしくは減少させるためにか、あるいは不完全なヘルパーまたは構造タンパク質発現カセットとの相同性を減らすために改変され得るウイルス性（例えば、αウイルス性）サブゲノムのプロモーター（例えば、接合領域プロモーター）のような異種配列を発現するための手段、および発現されるべき１つ以上の異種配列を含み得る。好ましくは、異種配列はタンパク質をコードする遺伝子を含み、この遺伝子はベクター配列内の３’近位の遺伝子である。真核生物用層状のベクター開始システムはまた、ポリアデニル化配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、核外移行シグナルおよび転写終結配列を含み得る。好ましくは、真核生物用層状のベクター開始システムは、全てのαウイルス構造タンパク質（キャプシド、Ｅ２およびＥ１）をコードする配列を含む。「ハイブリッド」ＥＬＶＩＳは、２種以上のαウイルスに由来するポリヌクレオチド配列を含むアセンブリをいう。
【００５３】
以下でより詳細に議論されるように、本発明は、αウイルス構築物における使用のために適切な配列；これらの配列を含む構築物；パッケージング細胞株；組換えαウイルス粒子をパッケージングする方法；ベクターのパッケージングの間、同時パッケージングを抑制する方法を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
（一般的な概要）
本発明は、αウイルスベースの粒子の生成における使用のための改変された５’増幅配列、構造タンパク質発現カセットにおける使用のために操作された特定の配列に関する。本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、αウイルスレプリコン粒子の生成の間の、同時パッケージング事象を減らし、それゆえ、パッケージング細胞株における使用およびαウイルスレプリコン粒子を生成する方法を見出される。
【００５５】
現在、αウイルスレプリコン粒子は、代表的に、粒子形成のために必要とされる種々のエレメントを分割する複数の構築物系を使用して生成される。異なる構築物へのこれらのエレメントの分割は、野生型の感染性ウイルスを生成する危険を減らす。この系は、代表的にレプリコンベクターとパッケージングのために必要とされる構造タンパク質（例えば、キャプシド、糖タンパク質）をコードする１つ以上の構造タンパク質発現カセット（例えば、不完全なヘルパー構築物）とを含み、このレプリコンベクターは、その自己細胞内複製のために必要なエレメント（例えば、非構造タンパク質をコードする配列）を含むが、子孫粒子の産生のために必要なエレメント（例えば、構造タンパク質コード配列）を欠く。レプリコン構築物および不完全なヘルパー構築物は、ＤＮＡベースおよび／またはＲＮＡベースであり得る。例えば、Ｐｏｌｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４５９８〜４６０３；米国特許第６，４６５，６３４号；同第６，４２６，１９６号；同第６，３７６，２３６号；同第６，３４２，３７２号；同第６，０１５，６８６号；および同第５，８４３，７２３号を参照のこと。
【００５６】
図１に示されるように、２つの不完全なヘルパー構築物が、レプリコンＲＮＡのパッケージングのための構造遺伝子を提供するために使用され得る。複製能のあるウイルス（ＲＣＶ）を生成する危険が低減されるので、２つの個別の不完全なヘルパーの使用が好ましくあり得る。例えば、米国特許第６，４２６，１９６号を参照のこと。ヘルパー構築物は、トランスで産生される非構造タンパク質によるそれ自身の増幅のため、および構造タンパク質遺伝子の発現のために必要なシスエレメントを含むが、αウイルス非構造タンパク質遺伝子を欠く。レプリコン粒子へのヘルパーの同時パッケージングを減らすために、シス作用性αウイルスパッケージングシグナルはまた、代表的にヘルパー構築物から欠失される。同時パッケージングは、１つ以上のヘルパーＲＮＡを含むがレプリコンＲＮＡ構築物は含まない粒子（「不全型」粒子とも呼ばれる）の生成、およびレプリコン配列に加えて１つ以上のヘルパー配列を含む粒子の生成をいう。同時パッケージングの両方の形態が望ましくない。特に、不全型粒子の存在は、レプリコン粒子の感染性を妨害し得、粒子感染の効率を有効に減少し得る。同様に、レプリコンとヘルパー配列との同時パッケージングは、未処置の細胞の感染に際して新規粒子の産生をもたらし得、これらの粒子は、むしろ複製能のあるウイルス（ＲＣＶ）に近くふるまい得、ウイルスの望ましくない影響を含み得る。
【００５７】
複製に関与する種々のシスエレメント（すなわち、５’増幅配列）は、不完全なヘルパー構築物に取り込まれ得、これらとしては、例えば、同種のウイルス由来の天然（野生型）αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の天然αウイルス５’配列、同種のウイルス由来の非天然の不完全干渉（ＤＩ）αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）および細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡエレメント）が挙げられる（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、ＰＮＡＳ ８０：３２７９〜３２８３、１９８３；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４１６２〜４１６８、１９９０；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１６３９〜１６４７、１９９０；Ｔｓｉａｎｇら、（１９８８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６２（１）：４７〜５３）。
【００５８】
これらの５’増幅配列は複製を媒介するように働き得るが、５’増幅配列（ｔＲＮＡａｓｐ配列のような、αウイルス由来ではない配列が挙げられる）の各々もまた、望ましくない同時パッケージング効果を示し得る。例えば、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：６４３９〜６４４６；Ｔｓａｉｎｇら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：３８〜４４を参照のこと。
【００５９】
αウイルスレプリコン粒子への望ましくない配列のパッケージングを減らすか、またはなくす一方で、同時に、αウイルスベクターの有効な複製を可能にする組成物および方法が、本明細書に記載される。この点について、本発明者らは、αウイルスレプリコン粒子のパッケージングにおいて使用されるαウイルス構造タンパク質カセットに対する複製シグナルとして、代表的に使用される配列が、しばしば、パッケージングシグナルとして望ましくなく働き得る配列を含むことを発見した。具体的には、５’増幅配列の一次構造（配列）は、望ましくない同時パッケージング機能において役割を果たすが、望ましい複製（増幅）機能において役割を果たさず、このことは、主に同一の領域の二次構造に依存するようである（図４Ａおよび図４Ｂ）。機能的な増幅配列の特徴である二次構造を維持するが、公知のパッケージングシグナルに対する一次配列の相同性をなくす分子を設計することにより、本発明は、有効かつ効率的に、αウイルスのパッケージングのために必要な構造タンパク質のヘルパー構築物の複製を達成し、かつヘルパー構築物の同時パッケージングを減らすか、またはなくす新規組成物および新規方法を可能にする。さらに、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物は、レプリコン粒子を産生し、このレプリコン粒子は、ｔＲＮＡ含有配列を含むヘルパー構築物により産生されたものよりも強力な感染性を有する（図６）。
【００６０】
（改変された５’増幅配列）
本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、機能的な増幅配列であるが、本質的にパッケージングシグナルとして働き得ない配列である。したがって、本明細書に記載の改変された５’増幅配列の特定の配列は、それらが本質的にパッケージングシグナルとして働き得ずかつ増幅（複製）シグナルとして機能的である限り、大幅に変更され得る。
【００６１】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、代表的に１０ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）、より好ましくは約３０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）、さらにより好ましくは約４０ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）である。
【００６２】
一般的に、改変された５’配列の作製は、ポリヌクレオチドの配列分析と構造分析との両方を伴う。代表的に、このプロセスは、公知のパッケージングシグナルに対して、公知の５’増幅配列（例えば、ｔＲＮＡａｓｐ）の一次配列を比較することにより始める。本明細書に記載のシス作用性５’増幅配列、多くの供給源（例えば、任意のウイルス由来の天然αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の天然αウイルス５’末端、同種のウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’末端、異種ウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’末端、αウイルス由来ではないウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）および細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡエレメント））に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、ＰＮＡＳ ８０：３２７９〜３２８３、１９８３；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４１６２〜４１６８、１９９０；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１６３９〜１６４７、１９９０）。これらの配列および他の機能的な５’増幅配列の配列およびパッケージングシグナルは、公知であり、多くのデータベースにおいて公に利用可能である。
【００６３】
したがって、所定の二次構造を有する改変された５’増幅配列を得るプロセスは、公知の５’増幅配列の分析により開始され得る。パッケージングシグナルとして機能する５’増幅配列内の配列は、任意の適切な手段（例えば、相同性の高い領域を決定するための、公知のパッケージングシグナルとのアラインメント）により同定され得る。例えば、図２に示されるように、公知のｔＲＮＡ−ａｓｐ配列のヌクレオチド３７〜ヌクレオチド５８（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：３２７９〜３２８２）は、シンドビス（ＳＩＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ ００１５４７、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９８４）Ｖｉｒｏｌ １３３：９２〜１１０）のヌクレオチド１０２９〜ヌクレオチド１０５０（これらのヌクレオチドは、パッケージングに関与することが公知である）に対し、有意な相同性（＞８０％）を示す。本発明の局面を例示する目的のためだけに野生型ＳＩＮが使用され、あらゆるパッケージングシグナル配列が、比較のために選択され得ることが理解されるべきである。
【００６４】
一度同定されると、パッケージングシグナルは、任意の適切な手段（例えば、公知のパッケージングシグナルに対する相同性を減らすように、５’増幅シグナルの一次配列を変更すること（実施例１））により不完全にされ得る。配列は、その一次配列がパッケージングシグナルとして機能しないように、１つ以上のヌクレオチドの突然変異誘発、置換、挿入および／または欠失によって変更され得る。
【００６５】
改変されていない配列と改変された配列との間の一次配列レベルにおける相同性の程度は、そのパッケージングシグナルが不完全である限り、大幅に変動し得る。例えば、推定パッケージングシグナルとして同定された領域において、公知のパッケージングシグナルの同一の長さの領域に対して、好ましくは約９０％と９９％との間の相同性または約９０％と９５％との間の相同性、より好ましくは約９０％未満の相同性、より好ましくは８０％未満の相同性、そしてさらにより好ましくは７０％未満の相同性であるが、改変された配列と改変されていない配列ととの間の一次配列レベルにおける相同性は、９９％ほどでもあり得る。例えば、図３に示されるように、例示的な改変された５’増幅配列（配列番号４〜１６）は、野生型ＳＩＮパッケージングシグナルに対して相同性を示したｔＲＮＡ−ａｓｐの領域を改変することによって生成された。その結果、この領域における相同性は、大幅に減少される（例えば、全ての場合において８０％より大きいから７０％未満へ、いくつかの場合において４０％未満へ（例えば、配列番号４、１１、１４および１５））。図３の配列はＤＮＡ配列として示されるが、ＲＮＡベースのベクターにおける使用のために、この配列は対応するＲＮＡ残基により置換される（すなわち、ＴはＵにより置換される）ことが明らかである。
【００６６】
一次配列への改変は、好ましくは、このポリヌクレオチドの二次構造が改変されていない５’増幅配列に実質的に類似したままにするようになされる。先に記載されるように、一本鎖核酸分子（例えば、ＲＮＡ）は、一般的に、二次構造（ヘアピン構造およびステム−アンド−ループ構造など）をとる。任意の所定の核酸配列の二次構造を予測するための技術は、容易に利用可能であり、そして例えば、Ｚｕｃｋｅｒら「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ」およびＭａｃｋｅら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９（２２）：４７２４〜４７３５に記載される。
【００６７】
したがって、突然変異は、推定パッケージングシグナル配列に導入され、異なる一次配列を有するが、公知の５’増幅配列の二次構造（例えば、図４Ａに示されるｔＲＮＡａｓｐの二次構造）を有する配列を生成する。
【００６８】
あるいは、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、公知の増幅配列に類似する二次構造を有するように生成された合成配列であり得る。
【００６９】
それゆえ、本明細書に記載の改変された５’増幅配列はシス作用性５’増幅配列の特徴を有する二次構造を形成するが、おそらく、その一次構造レベルにおける公知のパッケージングシグナルに対する相同性の減少に起因して、これらは、パッケージングシグナルとして不完全である。
【００７０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、パッケージングシグナルの外側の領域におけるさらなる改変を含む。本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、不完全なヘルパー構築物およびパッケージング細胞株などの生成において使用され得る。
【００７１】
（構造タンパク質カセットのさらなる構成要素（例えば、ヘルパー構築物））
特定の局面において、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、構造タンパク質カセットまたは不完全なヘルパー構築物の一部を形成する。したがって、改変された５’増幅配列に加えて、本明細書に記載のヘルパー構築物は、代表的に種々の核酸配列（コード配列および非コード領域の両方）を含む。本明細書に記載の組成物が、一般的に、単一のポリヌクレオチドで不完全なαウイルスゲノム（例えば、αウイルスのゲノムに含まれる、全てではないコード配列および／または非コード配列）を含むことが明らかである。
【００７２】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物はまた、代表的に、種々のαウイルスポリペプチド（例えば、１つ以上のαウイルス構造ポリペプチド（例えば、キャプシド、エンベロープ糖タンパク質）をコードする１つ以上の配列を含む。αウイルスレプリコンまたはベクターポリヌクレオチド構成要素を囲む（そしていくつかの場合において、これらと相互作用する）構造タンパク質は、キャプシドおよびエンベロープ糖タンパク質の両方を含む。例えば、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２を参照のこと。大半の場合において、ポリヌクレオチド構成要素は、ヌクレオキャプシドを形成するキャプシドタンパク質により囲まれる。今度は、そのヌクレオキャプシドタンパク質は、エンベロープタンパク質を含む脂質エンベロープにより囲まれる。キャプシドタンパク質は、αウイルス構造ポリタンパク質のＮ末端タンパク質であり、そしてポリタンパク質からのプロセシングに続いて、パッケージングシグナルおよび他のキャプシドタンパク質モノマーを含むαウイルスＲＮＡと相互作用して、ヌクレオキャプシド構造を形成する。αウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、Ｅ２、Ｅ１）は、覆われた粒子から表面「スパイク」のように突出し、これは、レセプター結合に機能的に関与し、標的細胞へ侵入する。
【００７３】
さらなる配列は、コード配列または非コード配列であり得る。非コード配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：３’近位遺伝子を発現するための手段（プロモーターなどのような制御エレメント（例えば、同種のウイルス由来の天然αウイルスサブゲノムのプロモーター、異種ウイルス由来の天然αウイルスサブゲノムのプロモーター、コアαウイルスサブゲノムのプロモーター（同種または異種）、コアサブゲノムのプロモーターから上流または下流の最小配列、コアサブゲノムのプロモーターまたは天然サブゲノムのプロモーターの突然変異／欠失／付加、αウイルス由来ではない適合性のサブゲノムのプロモーター（例えば、植物ウイルス）、内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）および／またはリボソームリードスルー（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）エレメント（例えば、ＢｉＰ））；サブゲノムのｍＲＮＡ５’末端非翻訳領域（サブゲノムの５’ＮＴＲ）、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる１つ以上のさらなる５’配列または３’配列（米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６９４号；同第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８０８７；ＷＯ００／６１７７２）、３’近位遺伝子（例えば、異種配列、ポリペプチドコード配列）。Ｋｕｈｎら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１４６５〜１４７６；ならびに／あるいはポリアデニル化配列（例えば、３’配列内の、例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６〜９７８５を参照のこと）もまた参照のこと。
【００７４】
本明細書に記載のヘルパー構築物において使用されるコード配列および非コード配列は、１種以上のαウイルスおよび／またはαウイルスではない供給源（例えば、αウイルス、トガウイルス、植物ウイルス）に由来する配列を含み得る。ポリタンパク質の長さにおけるわずかな差異に主に起因して、一般的にヌクレオチド番号付けおよびアミノ酸番号付けは、αウイルスの間で幾分異なるが、異なるαウイルス由来の間でのアラインメントは、他のαウイルス中の類似の領域を同定するための手段を提供する（Ｋｉｎｎｅｙら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：１９〜３０およびＳｔｒａｕｓｓら（１９８４）Ｖｉｒｏｌ １３３：９２〜１１０において、任意の他のαウイルスゲノムが整列され得る、１１，７０３ヌクレオチド長の例示的な野生型ＳＩＮゲノムについての代表的なアラインメントを参照のこと）。特定の実施形態において、ヘルパー構築物は、αウイルス属の２種またはメンバー由来の配列を含む。本明細書に記載の特定のαウイルス配列は、共有される国際公開ＷＯ ０２／０９９０３５（この開示は、その全体について参考として本明細書において援用される）においてさらに詳細に記載される。
【００７５】
さらに、１つ以上のヘルパー構築物配列は、野生型と比較して１つ以上の改変を含み得る。αウイルスコード配列への改変としては、例えば、１種以上のαウイルスおよび／または他のウイルス（例えば、αウイルス、他のトガウイルス、植物ウイルス）由来の配列を含むハイブリッド非構造タンパク質のように、全体または一部における、ヌクレオチド突然変異、欠失、付加または配列置換が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７６】
（αウイルスパッケージング細胞株）
本発明のさらなる実施形態内で、αウイルスパッケージング細胞株が提供される。特に、本発明の一局面内で、αウイルスパッケージング細胞株が提供され、ここで、１つ以上の本明細書に記載の改変された５’増幅配列を保持する１つ以上の発現ベクター（好ましくは、安定的に一定化される）からトランスで供給されるαウイルス構造タンパク質は、細胞質内で、トランスフェクト、形質導入または細胞内で産生されたベクターＲＮＡ転写物をキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）し得、細胞膜を通して感染性のパッケージングされたレプリコンベクター粒子を放出し得、それによりαウイルスベクター産生（パッケージング）細胞株（ＰＣＬ）を生成し得る。
【００７７】
例えば、αウイルスパッケージング細胞株が提供され、ここで、ウイルス性構造タンパク質は、本明細書に記載の１つ以上の安定的に形質転換された発現ベクター（構造タンパク質発現カセット）（例えば、改変された５’増幅配列を含む）からトランスで供給され、細胞質内で、トランスフェクト、形質導入または細胞内で産生されたベクターＲＮＡ転写物をキャプシド形成し得、細胞膜を通して感染性のパッケージングされたレプリコンベクター粒子を放出し得る。特定の実施形態において、パッケージングのために必要な構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコンそれ自身による誘導またはいくつかの他に提供される刺激の後にのみ、高いレベルで合成され、そしてこれらの構造タンパク質をコードする転写物は、天然のウイルス性感染の細胞質増幅を模倣するのに十分な発現レベルを許容する様式で、細胞質増幅を可能にする。さらに、他の実施形態において、選択可能なマーカーの発現は、構造タンパク質発現カセットに作動可能に連結される。このように連結された選択可能なマーカーは、機能的かつ安定的に形質転換されたＰＣＬの有効な生成を可能にする。
【００７８】
例えば、パッケージングされるべき所望の表現型のαウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子（それら自身で、細胞の細胞質内での自触反応複製を可能にする）（例えば、このレプリコンは、許容性細胞内での複製のために必要とされる全てのエレメント（シスおよびトランス）を含む）は、インビトロで転写されたＲＮＡ、組換えαウイルス粒子またはαウイルスｃＤＮＡベクター構築物として、パッケージング細胞へ導入され得る。したがって、ＲＮＡベクターレプリコン分子は、高いレベルまで複製し、構造タンパク質遺伝子転写物の増幅およびそれに続く構造タンパク質の発現を刺激し、そして続いて、これらは、ウイルス性構造タンパク質によりパッケージングされ、感染性のベクター粒子をもたらす。上記の特定のレベルでのαウイルスタンパク質および／またはベクターＲＮＡの細胞内発現は、パッケージング細胞株または産生側細胞株における細胞毒性効果をもたらし得る。したがって、本発明の特定の実施形態内で、これらのエレメントは、それらの発現される構造タンパク質の細胞毒性の軽減、宿主の高分子合成の阻害の軽減および／または持続性の感染を確立する能力について選択されるウイルス改変体に由来すべきことが望ましくあり得る。
【００７９】
ベクターパッケージング細胞株の性能および最終的なベクター力価を最適化するために、米国特許第６，３９１，６３２号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に詳細に記載されるように、遺伝子移入およびベクターのパッケージングの連続的なサイクルが実行され得る。同様に、ＰＣＬは、米国特許第６，３９１，６３２号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に詳細に記載されるように、安定的に一体化されるか、またはエピソームに維持されるＤＮＡ発現ベクターを使用して産生され得る。
【００８０】
パッケージング細胞の細胞質内で複製し得るαウイルスＲＮＡベクター分子は、例えば、インビトロで、機能的な非構造タンパク質を含むαウイルスレプリコンベクター内の目的の遺伝子をコードするｃＤＮＡベクタークローンを転写するためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ系を利用して、最初は産生され得る。したがって、ベクターＲＮＡ転写物は、αウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクトされ、その結果、ベクターＲＮＡは、高いレベルまで複製し、そして続いて、これらは、ウイルス性構造タンパク質によりパッケージングされ、感染性のレプリコンベクター粒子をもたらす。
【００８１】
他の実施形態内で、ＰＣＬは、米国特許第５，７８９，２４５号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に記載されるように、シュード型に分類される（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）αウイルスベクター粒子を使用して産生され得る。米国特許第５，７８９，２４５号はまた、ＰＣＬになされ得るさらなる改変（例えば、改変により、パッケージングのために必要な構造タンパク質が、ＲＮＡベクターそれ自身による誘導またはいくつかの他の刺激の後にのみ合成される、改変）も記載する。
【００８２】
当該分野において公知の種々の異なる細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、バキュロウイルス、細菌および酵母細胞）は、本発明の実施において使用され得る。昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス）は当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキットの形態で市販されている。鳥類細胞発現系もまた当業者に公知であり、そして例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号；ＷＯ ０３／０４３４１５；およびＷＯ ０３／０７６６０１に記載される。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系もまた当業者に公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎに記載される。
【００８３】
上記の系による使用のための多くの適切な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株が当該分野において公知であり、それらとしては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（以下のものに限定されないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞）およびその他のものが挙げられる。細胞の哺乳動物の供給源としては、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、例えばＷＯ ０１／３８３６２とＷＯ ０２／４０６６５（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）とに記載され、かつＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０のもとで受託されたＰＥＲＣ．６細胞）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎児肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０）、ヒト胎児由来腎臓細胞（代表的に、剪断された（ｓｈｅａｒｅｄ）アデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換された２９３細胞）、サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）ヒツジ、イヌ（例えば、ＷＯ ９７／３７００１に記載される、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ ３３０１６、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコおよびげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞のようなハムスター細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が挙げられるが、これらに限定されない。そして、これらの供給源は、広範な種類の発生段階（例えば、成体、新生児、胎児および胚が挙げられる）から取得され得る。
【００８４】
細胞の鳥類の供給源としては、ニワトリ細胞（例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、上記発現構築物による使用を見出される。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターによる使用のための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
【００８５】
（組換えαウイルス粒子をパッケージングする方法）
本発明により提供されるように、組換えαウイルスベクター粒子（レプリコン粒子）の生成（パッケージング）は、例えば、レプリコンベクターと、インビトロで転写されたＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来する構造タンパク質発現カセット、相補するベクターおよび不完全なヘルパー（ＤＨ）分子との同時トランスフェクションによってか、あるいはウイルスによる同時感染によって容易に達成され得る（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６、１９９３、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：５０８〜５１９、１９９６ならびに米国特許第５，８１４，４８２号、同第５，７３９，０２６号、同第５，７６６，６０２号、同第５，７８９，２４５号および同第５，７９２，４６２号（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）。αウイルスベクターのパッケージングのための組成物および方法はまた、米国特許第６，３２９，２０１号および同第６，２４２，２５９号（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）に記載される。
【００８６】
あるいは、ベクター粒子は、先に記載される安定的なαウイルスパッケージング細胞株へのベクターＲＮＡの導入によって生成され得る。簡潔に述べると、このようなＰＣＬおよびその安定的に形質転換された構造タンパク質発現カセットは、米国特許第５，７８９，２４５号内に本質的に記載される方法を使用して（特に、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含む構築物を使用して）取得され得る。例えば、ＰＣＬによる組換えαウイルスベクター粒子の産生は、ＰＣＬへのαウイルスベースのベクター分子（インビトロで転写されたＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来するベクターまたは先に取得された組換えαウイルス粒子）の導入、ベクター粒子のパッケージングに必要な条件下、かつそれに必要な時間、ＰＣＬをインキュベートする工程、およびパッケージングされたベクター粒子を収集する工程に従って達成され得る。本明細書に提供される詳細な実施例に示されるように、このようなアプローチにおける、有効なベクターのパッケージングのための本発明の新規の５’増幅配列の利用は、容易に達成される。
【００８７】
同時パッケージングは、未処理の培養細胞（例えば、パッケージング細胞ではない細胞）におけるレプリコン粒子の連続継代によってアッセイされ得る。同時パッケージングによらないレプリコン粒子は、未処理の細胞に感染した後、新規の子孫レプリコン粒子を産生しないが、同時パッケージングを伴うレプリコン粒子は、新規のレプリコン粒子を連続的に産生する。顕微鏡下においても、レプリコンを含む同時パッケージングは、隣接する細胞からの粒子の直接伝播に起因する細胞変性効果（ＣＰＥ）の病巣様のパターンを生成し得る。同時パッケージングはまた、レプリコン粒子による未処理の細胞の感染、そして感染細胞において、１つ以上のαウイルス構造タンパク質の発現について試験すること（例えば、ウェスタンブロット）により決定され得る。
【００８８】
（異種配列）
上記のように、本明細書に記載される改変された５’増幅配列（およびこれらの配列を含む構築物）は、広範囲の用途に使用され得る。例えば、改変された５’増幅配列は、αウイルスレプリコン粒子を産生するためのヘルパー構築物において使用され得る。このレプリコン粒子は、広範囲の異種配列（例えば、リンフォカインまたはサイトカイン、トキシン、および酵素を変換するプロドラッグのような緩和剤をコードする配列、免疫応答を刺激する抗原をコードする配列、リボザイムまたはアンチセンス配列、増殖因子または制御因子のような治療用途のためのタンパク質をコードする配列、および免疫応答を補助または阻害するタンパク質をコードする配列）を含み得る。
【００８９】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能なベクター粒子を効果的に産生させ得るのに十分なサイズであるべきである。本発明の文脈内で、適切な感受性の単層での任意の測定可能な力価（例えば、発現の転写アッセイ、力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）細胞株アッセイ、レポーターアッセイ、またはプラークアッセイによる）の組換えαウイルス粒子の産生は、「生存可能なベクター粒子の産生」と考えられる。これは、最小の場合、任意のさらなる異種配列を含まないαウイルスベクター構築物であり得る。しかしながら、他の実施形態内で、ベクター構築物は、さらなる異種配列または外来配列を含み得る。好ましい実施形態内で、異種配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂの異種配列、または少なくとも約８ｋｂの異種配列でさえ含み得る。上記の異種配列は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）のような受託機関を含む）、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような市販の供給源から容易に得られ得る。あるいは、上記の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、当該分野において公知の標準的な手順を利用して、その配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。さらに、異種配列はまた、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＤＮＡシンセサイザーで合成され得る。
【００９０】
適切な異種配列の代表的な例は、より詳細に米国特許第５，８４３，７２３号に議論されている。
【００９１】
免疫原性タンパク質をコードする異種配列の非限定的な例としては、以下に記載する１種以上由来のタンパク質が挙げられる：
細菌性抗原（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙおよび／またはＢ由来のタンパク質抗原（１〜７）；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（８、９、１０、１１）；糖類抗原（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のＬＰＳ（例えば、血清群Ｃ由来のオリゴ糖）が挙げられる）（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３を参照のこと）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：糖類またはタンパク質抗原、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：特に、Ｂ群連鎖球菌抗原；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：特に、Ａ群連鎖球菌抗原；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（特に、三糖類繰返しまたは米国特許第６，７５６，３６１号に提供される抗原由来の他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ抗原が挙げられる；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じてまた、ペルタクチンならびに／または凝集原２および３抗原との組み合わせ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：必要に応じて、無毒性の組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌体外毒素Ａに結合されるＳ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖類（例えば、ＳｔａｐｈＶＡＸＴＭ）、または表面タンパク質、インベーシン（ロイコチジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の飲み込みを阻害する表面因子（莢膜、プロテインＡ）、カロチノイド、カタラーゼ産物、プロテインＡ、コアグラーゼ、凝固因子、および／もしくは真核細胞膜を溶解する膜を損傷する毒素（溶血素、ロイコトキシン、ロイコチジン）（必要に応じて無毒化される）由来の抗原が挙げられる；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：特に、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ粘液関連抗原（ＳＡＡ）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ：特に、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原の１６０ｋＤａ血球凝集素（尿路感染症を引き起こす）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：特に、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＬＰＳ、より特には、ＰＡＯ１から単離されたＬＰＳ（Ｏ５血清型）、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）が挙げられる）（Ｐｒｉｃｅら（２００１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６９（５）：３５１０〜３５１５）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）：例えば、Ａ−成分（致死因子（ＬＦ）および水腫因子（ＥＦ））（その両方は、防御抗原（ＰＡ）として公知の共通のＢ−成分を共有し得る）由来のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原（必要に応じて、無毒化される）；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ：（呼吸性）外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ−抗原、および／またはＬＰＳが挙げられる；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）：例えば、Ｆ１莢膜抗原（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら（２００３）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７１（１）：３７４〜３８３）、ＬＰＳ（Ｆｉｅｌｄｓら（１９９９）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６７（１０）：５３９５）、ペスト菌Ｖ抗原（Ｈｉｌｌら（１９９７）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６５（１１）：４４７６〜４４８２）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（胃腸の病原体）：特に、ＬＰＳ（Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７０（８）：４４１４〜４４２０）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：胃腸の病原体抗原；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：例えば、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）の融合タンパク質および／または必要に応じて、陽イオン性脂質小胞中に処方されるＥＳＡＴ−６（Ｏｌｓｅｎら（２００４）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７２（１０）：６１４８〜６１５０）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｂａｎｅｒｊｅｅら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（３４）：１２６５２〜１２６５７）および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｓｕｚｕｋｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７２（７）：３８２９〜３８３７）；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ症）：必要に応じて、分裂したａｓｄ遺伝子を有する細胞株由来のＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原（Ｈａｒｂら（１９９８）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６６（５）：１８９８〜１９０３；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ：外膜タンパク質（外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００４年１１月１日；１７０２（２）：１４５）を含む）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）が挙げられる（Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９年６月２日、補遺：８１）；Ｅ．ｃｏｌｉ：腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、散在性に付着するＥ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、および／または腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）由来の抗原が挙げられる；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ：プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特に、コレラ菌ＩＩのリポ多糖、Ｏ１ Ｉｎａｂａ Ｏ−特異的多糖類、コレラ菌Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００３年１０月；７１（１０）：５４９８〜５０４）、および／または閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が挙げられる；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（腸チフス）：好ましくは、莢膜多糖類結合体（Ｖｉ、すなわち、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）が挙げられる；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（胃腸炎）：それ由来の抗原は、微生物治療および癌治療（脈管形成阻害およびｆｌｋの調節が挙げられる）のために企図される；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（免疫無防備状態または高齢者における全身（ｓｙｔｅｍｉｃ）感染、胎児の感染）：好ましくは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の抗原は、本発明の結合体／関連組成物の細胞質内送達のためのキャリア／ベクターとして使用される；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ外膜タンパク質（ＯＭＰ）；Ｔｅｔａｎｕｓ：例えば、好ましくは、破傷風毒素（ＴＴ）抗原は、本発明の組成物との結合／結合体化におけるキャリアタンパク質として使用される；Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ：例えば、ジフテリア毒素、好ましくは、ＣＲＭ１９７、さらにＡＤＰリボシル化を調節、阻害または関連し得る抗原が、本発明の組成物との組み合わせ／同時投与／結合体のために企図され、好ましくは、ジフテリア毒素は、キャリアタンパク質として使用される；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）：例えば、Ｐ３９およびｐ１３に関連する抗原（完全な膜タンパク質、（Ｎｏｐｐａら（２００１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６９（５）：３３２３）、ＶｌｓＥ抗原性変化タンパク質（Ｌａｗｒｅｎｚら、（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１２）：３９９７）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ：例えば、それ由来の糖抗原；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ：例えば、ＯＭＰ（ＯＭＰ Ａが挙げられる）、または必要に応じて、破傷風毒素に結合された多糖類；Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：Ｐｏｒ（またはポーリン（ｐｏｒｉｎ））タンパク質（例えば、ＰｏｒＢ）（Ｚｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０〜６６９を参照のこと）、転移結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７〜２８３を参照のこと）、不透明タンパク質（例えば、Ｏｐａ）、還元修正タンパク質（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が挙げられる（Ｐｌａｎｔｅら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８〜８５５を参照のこと）、例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ０２／０７９２４３もまた参照のこと）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：特に、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質抗原；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ（失明の原因である、トラコーマ因子）、血清型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３（性病性リンパ肉芽腫に関連する）、ならびに血清型Ｄ〜Ｋ由来の抗原が挙げられる；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）：特に、ＴｍｐＡ抗原；およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）：外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が挙げられる。
【００９２】
具体的に参照されない場合、本発明の細菌性抗原をコードするさらなる配列は、上記の任意の莢膜抗原、多糖類抗原またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌性抗原としてはまた、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が挙げられ得る。さらに、抗原としては、生存している型、弱毒化された型、分裂した型、および／または精製された型の任意の上述の細菌が挙げられる。本発明の抗原由来の細菌または微生物は、グラム陰性またはグラム陽性および好気性または嫌気性であり得る。
【００９３】
さらに、任意の上述の細菌由来の糖類（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳまたはオリゴ糖）は、別の因子または抗原（例えば、キャリアタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７））に結合され得る。このような結合は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８４年５月；６２（５）：２７０〜５に提供されるように、糖類上のカルボニル部分の還元的アミノ化によってもたらされる、タンパク質上のアミノ基への直接的な結合であり得る。あるいは、糖類は、リンカー（例えば、コハク酸アミドを有する）またはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６およびＣＲＣ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、１９９３に提供される他の結合を介して結合され得る。
【００９４】
異種配列はまた、例えば、以下の１種以上のウイルス抗原をコードし得る：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：完全なウイルス粒子（減弱化された）、分裂、または血球凝集素（ＨＡ）および／もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面タンパク質を含むサブユニットが挙げられ、インフルエンザ抗原は、ニワトリ胚由来であり得るか、または細胞培養で増殖され得、そして／またはインフルエンザ抗原は、特にインフルエンザＡ型、Ｂ型、および／もしくはＣ型由来である；Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）：ＲＳＶのＡ２株のＦタンパク質（Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００４年１１月；８５（Ｐｔ１１）：３２２９）および／またはＧ糖タンパク質が挙げられる；Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＩＶ）：好ましくは、血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび／または融合糖タンパク質を含むＰＩＶ１型、２型および３型が挙げられる；Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ：ピコルナウイルス科のファミリー由来の抗原、好ましくは、ポリオウイルス抗原（例えば、ＯＰＶまたは好ましくはＩＰＶ）が挙げられる；Ｍｅａｓｌｅｓ：必要に応じて、プロトリン（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）およびまたはＭＭＲワクチン中に存在する抗原と組み合わされる分裂麻疹ウイルス（ＭＶ）抗原が挙げられる；Ｍｕｍｐｓ：ＭＭＲワクチンに存在する抗原が挙げられる；Ｒｕｂｅｌｌａ：ＭＭＲワクチンに存在する抗原、およびトガウイルス科（デング熱ウイルスが挙げられる）由来の他の抗原が挙げられる；Ｒａｂｉｅｓ：例えば、凍結乾燥した不活性化ウイルス（ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ｖｉｒｕｓｅｓ：例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス（１型、２型、３型または４型）、ダニ媒介脳炎ウイルス、および西ナイルウイルス（およびそれら由来の抗原）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；それ由来の抗原；ＨＩＶ：ＨＩＶ−１株またはＨＩＶ−２株の抗原（例えば、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ ｖｐｕ、ミニタンパク質（好ましくは、ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖを取り除く））および単離されたＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、ＨＩＶ−２由来の抗原が挙げられる；数ある中でもサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ：ＶＰ４タンパク質、ＶＰ５タンパク質、ＶＰ６タンパク質、ＶＰ７タンパク質、ＶＰ８タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００４年１２月；３８（２）：２０５）および／またはＮＳＰ４が挙げられる；Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ：例えば、古典的ブタ熱ウイルス、牛ウイルス性下痢症ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来の抗原；Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：例えば、パルボウイルスＢ１９；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＳＡＲＳウイルス抗原、特にスパイクタンパク質またはそれら由来のプロテアーゼ、およびＷＯ０４／９２３６０に含まれる抗原が挙げられる；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ：例えば、不活性化ウイルス；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：例えば、表面および／またはコア抗原（ｓＡｇ）、ならびにプレ表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列、ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前はｐｒｅ−Ｓと呼ばれた）、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）（例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」、ｐｐ．１５９〜１７６；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３〜６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９〜３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１を参照のこと）、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域由来のペプチド（国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６）；Ｄｅｌｔａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＨＤＶ）：それら由来の抗原、特にＨＤＶ由来のδ−抗原（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ（ＨＥＶ）；それら由来の抗原；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ ｖｉｒｕｓ（ＨＧＶ）；それら由来の抗原；Ｖａｒｃｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ：水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）由来の抗原（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９）；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ由来の抗原（Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７）；Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ抗原（ｇｂおよびｇＨ）が挙げられる（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）ｐｐ．１２５〜１６９）；Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ：ＨＳＶ−１株またはＨＳＶ−２株由来の抗原ならびに糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨが挙げられる（ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１および米国特許第５，１７１，５６８号）；Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ：他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原；ならびにＨＰＶ：ヒト乳頭腫ウイルス属（ＨＰＶ）（例えば、１つ以上のＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２およびそれらの融合物）に関連するか、それら由来の抗原が挙げられ、特に、本発明の組成物は、Ｌ１主要キャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み得、より特にはさらに、ＨＰＶ抗原は、１種以上のＨＰＶ血清型６、１１、１６および／または１８に対して防御性がある。
【００９５】
さらに、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第４版（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ｍｕｒｒａｙら編、２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）に含まれる抗原、組成物、方法および微生物が提供され、それらは、本発明の組成物と併せて企図される。
【００９６】
さらに、異種配列は、以下の１種以上の真菌抗原をコードし得る：Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓによって引き起こされるトリコピトシス（ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｓｉｓ）の予防および処置について米国特許第４，２２９，４３４号および同第４，３６８，１９１号；動物（例えば、モルモット、ネコ、ウサギ、ウマおよび子ヒツジ）における皮膚糸状菌感染の予防のための広範囲の皮膚糸状菌ワクチン（これらの抗原は、必要に応じてアジュバントと組み合わされた有効量の死滅させられたＴ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ｖａｒ．ｇｒａｎｕｌａｒｅ）、Ｍ．ｃａｎｉｓおよび／またはＭ．ｇｙｐｓｅｕｍの懸濁液を含む）について米国特許第５，２７７，９０４号および同第５，２８４，６５２号；有効量のホモジナイズされて、ホルムアルデヒドで死滅させられた真菌類（すなわち、キャリア中のＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ培養物）を含む白癬ワクチンについて米国特許第５，４５３，２７３号および同第６，１３２，７３３号；ピシウム感染症（ｐｙｔｈｉｏｓｉｓ）のための細胞外タンパク質および細胞内タンパク質に関連する米国特許第５，９４８，４１３号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌ワクチンに同定されたさらなる抗原としては、Ｒｉｎｇｖａｃ ｂｏｖｉｓ ＬＴＦ−１３０およびＢｉｏｖｅｔａが挙げられる。
【００９７】
さらに、本明細書中で使用するための真菌抗原は、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ、ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、および／またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅが挙げられる）由来であり得る。
【００９８】
本発明の組成物と併せる抗原または抗原の誘導として使用するための真菌病原体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ、Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ、およびＳａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐを含む。
【００９９】
抗原が由来する他の菌類としては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ、Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、およびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐが挙げられる。
【０１００】
本明細書中に記載されるような異種配列は、１種以上の腫瘍抗原または癌抗原（糖類含有腫瘍抗原（例えば、糖脂質腫瘍抗原またはガングリオシド腫瘍抗原）が挙げられるが、これらに限定されない）をコードし得る。多数の腫瘍抗原は、当該分野で公知であり、以下が挙げられる：（ａ）癌−精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２）（例えば、これらは、黒色腫、肺、頭部および頚部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍を処置するために使用され得る））、（ｂ）変異抗原（例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸癌、肺癌、頭部および頚部の癌）に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌および結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭部および頚部の癌に関連する）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ）、（ｃ）過剰発現抗原（例えば、Ｇａｌｅｃｔｉｎ４（例えば、結腸直腸癌に関連する）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関連する）、カルボニックアンヒドラーゼ（例えば、腎臓癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌および卵巣癌に関連する）、α−フェトプロテイン（例えば、肝臓癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、膵臓癌および胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳癌および卵巣癌に関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳癌および結腸癌に関連する）、および癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌および結腸直腸癌のような胃腸管の癌に関連する））、（ｄ）共有抗原（例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ）、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色種に関連する））、（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺癌に関連する））、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）、および（ｇ）他の腫瘍抗原（例えば、ポリペプチド含有抗原および糖類含有抗原（（ｉ）糖タンパク質（例えば、シアリルＴｎおよびシアリルＬｅｘ（例えば、乳癌および結腸直腸癌に関連する）および種々のムチン）；糖タンパク質は、キャリアタンパク質に結合され得る（例えば、ＭＵＣ−１は、ＫＬＨに結合され得る）；（ｉｉ）リポポリペプチド（例えば、ＭＵＣ−１は、脂質部分に結合する）；（ｉｉｉ）多糖類（例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈ合成ヘキササッカリド）（これは、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合され得る）；（ｉｖ）ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３（例えば、脳腫瘍、肺癌、黒色種に関連する））（これもまた、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合され得る）が挙げられる）。
【０１０１】
当該分野で公知であるさらなる腫瘍抗原としては、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７が挙げられる）、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。これらおよび他の細胞成分は、例えば、米国特許出願第２００２０００７１７３号およびその中に引用される参考文献に記載されている。
【０１０２】
癌抗原または腫瘍抗原についてのさらなる情報は、例えば、Ｍｏｉｎｇｅｏｎ Ｐ、「Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００１、１９：１３０５〜１３２６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１：３８０〜３８４；Ｄｅｒｍｉｎｅ，Ｓら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、２００２、６２、１４９〜１６２；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｉ．、「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、２００２、７（補遺３）：２０〜３３；Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｄ．ら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３、２３：３〜２９；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ Ｂら、「Ｎｅｗ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、７：６７４〜８１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９９７、１８：１７５〜８２；Ｏｆｆｒｉｎｇａ Ｒら、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、２：５７６〜５８２；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、１０：２８１〜７；Ｓａｈｉｎ Ｕら、「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、９：７０９〜１６；Ｏｌｄ ＬＪら、「Ｎｅｗ ｐａｔｈｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｏｌｏｇｙ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７：１１６３〜７；Ｃｈａｕｘ Ｐら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＧＥ−３ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ−ＤＲ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＣＤ４（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１８９：７６７〜７８；Ｇｏｌｄ Ｐら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９６５、１２２：４６７〜８；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ」：Ｒａｔｉｏｎａｌｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９９７、４５：１〜６；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｌａｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９９７、４５：１０〜９；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ Ｊ、「Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｕｃｉｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９９７、１８：１０５〜７；Ｚｈａｏ Ｘ−Ｊら、「ＧＤ２ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８２：６７〜７４；Ｔｈｅｏｂａｌｄ Ｍら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐ５３ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２：１１９９３〜７；Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ Ｇ、「Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｔａｎｔ ｒａｓ：ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、２：３〜９；ＷＯ９１／０２０６２；米国特許第６，０１５，５６７号；ＷＯ０１／０８６３６；ＷＯ９６／３０５１４；米国特許第５，８４６，５３８号；および米国特許第５，８６９，４４５号に見出され得る。
【０１０３】
（処方物）
本明細書中に記載されるこれらの分子を使用して、生成される配列、ベクターおよび粒子を含む薬学的組成物（例えば、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、またはレシピエントと組み合わせた改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物を使用して生成されるαウイルスレプリコン粒子の集団）もまた提供される。
【０１０４】
本明細書中に記載される組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節因子などを含み得る。上記のように、本発明の組成物はまた、個々または組み合わせて液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど）、および物質（例えば、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤）を含み得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版 ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において得られる。
【０１０５】
薬学的に受容可能な塩（例えば、無機塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩）および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩））もまた、本発明の組成物に使用され得る。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される組成物（例えば、粒子）は、未精製または精製された形態のいずれかで保存され得、その組成物はまた、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号に詳細に記載されるように、凍結乾燥、噴霧乾燥またはエバポレートされ得る。
【０１０７】
上記のように、本明細書中に記載される処方物はさらに、他の免疫調節性因子を含み得るか、または他の免疫調節性因子と併せて投与され得る。特に、組成物は、通常、アジュバントを含む。本発明で使用するためのアジュバントとしては、以下に示す１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：
（無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な無機質含有組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、無機塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩など）（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．．．の第８章および第９章（１９９５）版、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．を参照のこと）、または異なる無機化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物、必要に応じて、過剰のリン酸塩との混合物）を含み、上記組成物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして、塩への吸着が好ましい。上記無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として処方され得る（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１０８】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋が、用量あたり０．２ｍｇと１．０ｍｇとの間の用量であるように、本発明のワクチンに含まれ得る。
【０１０９】
１つの実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバンを含むリン酸緩衝液中の抗原を混合し、その後、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウム）での滴定および沈殿によってインサイチュで形成されるように、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバン誘導体である。
【０１１０】
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するための別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）（これは、優れた吸着質であり、約５００ｍ２／ｇの表面積を有する）である。あるいは、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはアルミニウムヒドロキシホスフェート（水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたは全ての水酸基の代わりにリン酸基を含む）が、提供される。本明細書中に提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性培地、塩基性培地および中性培地において非晶質および可溶性である。
【０１１１】
別の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのより特定の実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムより多い量のリン酸アルミニウム（例えば、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの重量で、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１より大きい比）を有する。さらにより特定には、ワクチン中のアルミニウム塩は、ワクチン用量当たり０．４ｍｇ〜１．０ｍｇ、ワクチン用量当たり０．４ｍｇ〜０．８ｍｇ、またはワクチン用量当たり０．５ｍｇ〜０．７ｍｇ、またはワクチン用量当たり約０．６ｍｇで存在する。
【０１１２】
一般に、好ましいアルミニウムベースのアジュバント、または多数のアルミニウムベースのアジュバントの比（例えば、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウム）は、抗原が、所望のｐＨにおけるアジュバントと反対の電荷を保有するように、分子間の静電引力の最適化によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームに吸着するが、アルブミンに吸着しない。アルブミンが標的であるならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ １１．４）。あるいは、より低い等電点のリン酸塩を用いる水酸化アルミニウムの前処理は、水酸化アルミニウムを、より塩基性の抗原についての好ましいアジュバントにさせる。
【０１１３】
（Ａ．油エマルジョン）
アジュバントとしての使用のために適切な油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン（例えば、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子に処方される））が挙げられる。ＷＯ９０／１４８３７を参照のこと。Ｐｏｄｄａ、「Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３〜２６８０；Ｆｒｅｙら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ ａｄｕｌｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４〜４２３７もまた、参照のこと。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【０１１４】
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するための特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油エマルジョンである。本明細書中に使用するための好ましいサブミクロン水中油エマルジョンは、スクアレン／水エマルジョンであり、必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（例えば、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ ８５ＴＭ（ソルビタントリオレート）、および必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油エマルジョン）を含むサブミクロン水中油エマルジョン）を含む（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．２７７〜２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、および０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５ＴＭならびに必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を使用してサブミクロン粒子に処方される。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量および最も好ましくは、０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。本明細書中に使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」とは、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロン水中油エマルジョンをいうが、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」とは、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を意味する。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥなどを含む。ＭＦ６９（本明細書中に使用するための別のサブミクロン水中油エマルジョン）は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、および０．７５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５ＴＭならびに必要に応じて、ＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油エマルジョンは、ＳＡＦとしてもまた公知のＭＦ７５であり、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、５％プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ）ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、これもまたサブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰ（例えば、用量あたり１００μｇ〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥ）を含むＭＦ７５処方物を意味する。
【０１１５】
組成物中に使用するためのサブミクロン水中油エマルジョン、それを作製する方法および免疫刺激因子（例えば、ムラミルペプチド）は、国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７および米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号に詳細に記載されている。
【０１１６】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、本発明のアジュバントとして使用され得る。
【０１１７】
（Ｂ．サポニン処方物）
サポニン処方物もまた、アジュバントとして使用される。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえ見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ（モリナの木（Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅ））の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）および液体処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。
【０１１８】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されている。これらの技術を用いて、特定の精製画分が同定され、これらの画分としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る（ＷＯ９６／３３７３９を参照のこと）。
【０１１９】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが、使用され得、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る。ＩＳＣＯＭとしてはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、上記ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９にさらに記載されている。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは、さらなる洗剤を含まなくてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照のこと。
【０１２０】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、Ｂａｒｒら、「ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７〜２７１に見られ得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、「Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１〜３３８もまた、参照のこと。
【０１２１】
（Ｃ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般に、必要に応じてリン脂質と組み合わされるかまたはリン脂質とともに処方されたウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは、一般に、非病原性、非複製性であり、そして、一般に、あらゆる天然ウイルスゲノムを含まない。上記ウイルスタンパク質は、ウイルス全体から、組換え的に生成さ得るかまたは単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために適切なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１およびＮｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３〜２８０；Ｌｅｎｚら、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６〜５３５５；Ｐｉｎｔｏら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６ Ｌ１ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７〜３３８；およびＧｅｒｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｒｉｓｕ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２〜４７６０においてさらに議論されている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら、「Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０〜Ｂ１６においてさらに議論されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内三価ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品｛ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ２０補遺５：Ｂ１７〜２３｝およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳＴＭ製品においてサブユニット抗原送達システムとして使用される。
【０１２２】
（Ｄ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、以下のような細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられる：
（１）腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の無毒性誘導体
このような誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５または６アシル化鎖との混合物である。３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」形態は、ＥＰ０ ６８９ ４５４に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小さい粒子」は、０．２２ミクロンのメンブレンを通って滅菌濾過されるのに充分小さい（ＥＰ０ ６８９ ４５４を参照のこと）。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ９：２２７３〜２２７８を参照のこと。
【０１２３】
（２）リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、「ＯＭ−１７４，ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２〜３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５〜２４９１；およびＰａｊａｋら、「Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６〜８４２に記載されている。
【０１２４】
（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのホスフェート結合により連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む、細菌の二本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１２５】
ＣｐＧは、ヌクレオチド改変体／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変体）を含み得、そして、二本鎖または一本鎖であり得る。必要に応じて、グアノシンは、アナログ（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン）と置換され得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３〜２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３（例えば、可能なアナログ置換）を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ、「ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１〜８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ」、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９〜１８５；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号および同第６，４２９，１９９号において、さらに考察されている。
【０１２６】
このＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ）は、ＴＬＲ９に導かれ得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ３）：６５４〜６５８を参照のこと。このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）は、Ｔｈ１免疫応答誘導に特異的であってもよく、または、このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）は、Ｂ細胞応答誘導に、より特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、「ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１〜４０６８；Ｋｒｉｅｇ、「Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４〜６５およびＷＯ０１／９５９３５において考察されている。好ましくは、このＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１２７】
好ましくは、このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５'末端がレセプター認識のために接近可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３'末端で結合されて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８〜９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６６４〜６５８；Ｂｈａｇａｔら、「ＣｐＧ ｐｅｎｔａ− ａｎｄ ｈｅｘａ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３〜８６１およびＷＯ０３／０３５８３６を参照のこと。
【０１２８】
（４）ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体
細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ由来（「ＣＴ」）または百日咳由来（「ＰＴ」）である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、ＷＯ９５／１７２１１に記載されており、そして、非経口的アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、ＷＯ９８／４２３７５に記載されている。好ましくは、このアジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴＲ１９２Ｇ）である。ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献において見出され得る：Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎａｈｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２〜３０１９；Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４〜２５４１；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２，ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４〜５）：４５５〜４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６〜５３１３；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０〜６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴＫ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒｅｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９〜２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５〜２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）」Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１〜３）：２６３〜２７０。アミノ酸置換についての多くの参考文献は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５〜１１６７に記載のＡＤＰ−リボシル化トキシンのＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１２９】
（Ｆ．生体接着因子および粘膜接着因子）
生体接着因子および粘膜接着因子もまた、アジュバントとして使用され得る。適切な生体接着因子としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７〜２７６）または粘膜接着因子（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、アジュバントとして使用され得る。例えば、ＷＯ９９／２７９６０を参照のこと。
【０１３０】
（Ｇ．微粒子）
微粒子もまた、アジュバントとして使用され得る。生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）と、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とから形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて処理されて、（例えば、ＳＤＳによって）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）によって）正に荷電した表面を有する。
【０１３１】
（Ｈ．リポソーム）
アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、同第５，９１６，５８８号、ＥＰ０ ６２６ １６９に記載されている。
【０１３２】
（Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するために適切なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。ＷＯ９９／５２５４９。このような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、ならびに少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）をさらに含む。
【０１３３】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１３４】
（Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１〜３）：１０９〜１１５およびＰａｙｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５〜１９６において記載されている。
【０１３５】
（Ｋ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１'，２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１３６】
（Ｌ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、Ｓｔａｎｌｅｙ、「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１〜５７７；Ｊｏｎｅｓ、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４〜２１８；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号および同第５，５２５，６１２号にさらに記載される、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄおよびそのアナログが挙げられる。
【０１３７】
（Ｍ．チオセミカルバゾン化合物）
チオセミカルバゾン化合物の例、ならびに処方、製造、および本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な全ての化合物をスクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６０３０８に記載されるものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に効果的である。
【０１３８】
（Ｎ．トリプタンスリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化合物）
トリプタンスリン化合物の例、ならびに処方、製造、および本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な全ての化合物をスクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６４７５９に記載されるものが挙げられる。トリプタンスリン化合物は、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に効果的である。
【０１３９】
本発明はまた、上記に同定した１種以上のアジュバントの局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：
（１）サポニンおよび水中油エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒素ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照のこと）
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒素ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、同第０７３５８９８号および同第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされるか、大きい粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ；
（７）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１種以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ免疫化学）；および
（８）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）；
（９）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１４０】
（Ｏ．ヒト免疫調節因子）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なヒト免疫調節因子としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子）が挙げられる。
【０１４１】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用のインフルエンザワクチンとの使用のために好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着因子は、粘膜送達ワクチン（例えば、鼻のワクチン）との使用のために好ましいアジュバントである。
【０１４２】
上記で引用した特許、特許出願および論文の記事の全ての内容は、本明細書中に完全に記載される場合、参考として援用される。
【０１４３】
（キット）
本明細書中に記載される組成物はまた、キット（例えば、本明細書中に記載されるヘルパー構築物またはパッケージング細胞株を含むキット）として提供され得る。この組成物の１種以上は、キットへのパッケージングのために凍結乾燥および／または噴霧乾燥され得る。この成分は、単一の組成物として提供され得るか、または別々に提供され得る。さらに、この組成物は、それらが、粘膜投与に適切であるように、使用前に再構成され得る。
本明細書中に記載されるキットはさらに、さらなる成分（例えば、シリンジ、再構成溶液、取扱い説明書など）を含み得る。
【０１４４】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために含まれる。さらに、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を提供し、それらの範囲に限定することを意図しない。さらに、本明細書中の値の範囲の列挙は、単に、その範囲内の各々の別の値に関して個々に参照する簡潔な方法を与えることを意図し、本明細書中で他に指示しない限り、各々の個々の値は、本明細書中に個々に列挙されるように、明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示しない限り、または文脈で明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意および全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に、本発明をより良く例示することを意図し、本発明、そうでなければ特許請求の範囲の範囲の限定を示していない。明細書中にない言語は、本発明の実施に関して本質的に特許請求されない要素を示すものと解釈されるべきである。
【０１４５】
本明細書中に開示される本発明の代替のエレメントまたは実施形態の群は、限定として解釈されるべきではない。各群の部分は、個々または本明細書中に見出される群の他の部分あるいは他のエレメントとの任意の組み合わせで参照され得、そして特許請求され得る。群の１つ以上の部分が、便宜および／または特許性の理由のために、群に包含され得るか、または群から削除され得ることが予想される。任意のこのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を本明細書中に含むと判断され、それによって、添付の特許請求の範囲に使用される全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たす。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載され、本発明を実施するために発明者らが知るところの最良の様式を包含する。もちろん、これらの好ましい実施形態についての変更は、上記の説明を読むと、当業者に明白である。本発明者らは、適切な変更を当業者が使用することを予想し、本発明者らは、本発明が、本明細書中に具体的に記載されるより別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用可能な法によって容認されるように、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の内容の全ての改変および等価物を包含する。さらに、それらの全ての可能な変更における上記のエレメントの任意の組み合わせが、本明細書中で他に指示しない限り、または文脈で明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１：改変された５'増幅配列の調製）
ｔＲＮＡａｓｐの５'領域を、推定ＳＩＮパッケージングシグナルを用いて整列させて、高ホモロジーの領域を同定した（図２）。特に、推定ＳＩＮパッケージングシグナルのヌクレオチド１０２９〜１０５０によって規定された領域（ヌクレオチド９４５〜１０７６として特定の参考文献で記載した）は、ｔＲＮＡａｓｐ増幅配列の残基３７〜５９に対して８０％より高いホモロジー（２２ヌクレオチドのうちの１８）を示した。
【０１４８】
ｍｆｏｌｄプログラム（Ｚｕｃｋｅｒら）を使用して、野生型ｔＲＮＡａｓｐの二次構造を、予測した（図４Ａおよび図４Ｂ）。変異を、ヘルパーｔＤＨ−ＨＲｃａｐ（ｔＤＨ骨格に挿入されたＳＩＮ ＨＲ株由来のキャプシド遺伝子、ＷＯ０２／０９９０３５を参照のこと）およびｔＤＨ−ＶｕｔｒＳＧｌｙ（ＷＯ０２／０９９０３５；Ｐｅｒｒｉら、（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（１９）：１０３９〜４０３）に含まれるｔＲＮＡ構造に導入した。具体的には、この変異を、特定部位の突然変異誘発によってＳＩＮパッケージングシグナルに対するホモロジーの領域内に導入して、一次ヌクレオチド配列を変化させたが、野生型ｔＲＮＡＡＳＰの二次構造と類似の完全な二次構造を維持した。改変された５'配列は図３に示され、これらの改変された配列を含むヘルパー構築物を、ｔＭＯＤ−ＨＲｃａｐおよびｔＭＯＤ−ＶｕｔｒＳＧｌｙと呼んだ。改変された５'増幅配列を図３に示す。
【０１４９】
（実施例２：改変された５'増幅配列を有する構造カセットを使用するαウイルスレプリコン粒子のパッケージング）
ｍｏｄ＃１に指定された改変された５'増幅配列を、実施例１に記載されるように生成し、ＧＦＰ発現レプリコンベクター（本質的にＧａｒｄｎｅｒら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４（２４）：１１８４９〜１１８５７に記載されるように）をパッケージするために使用した。
【０１５０】
改変されたヘルパー、レプリコンをコードするプラスミドＳＩＮＣＲ−ＧＦＰ、野生型ｔＲＮＡまたは単一の制限酵素ＰｍｅＩおよびＲＮＡを用いて直線化された改変された配列の両方を有するヘルパーの機能性を試験するために、インビトロで転写した。レプリコンＲＮＡを、ＳＩＮキャプシドおよび表１に記載されるような構築物由来の糖タンパク質をコードする不完全なヘルパーＲＮＡとともに同時トランスフェクトした。
【０１５１】
トランスフェクトされた細胞を、培養上清を回収し、遠心分離によって清澄にし、連続希釈した時間に３４℃で２４時間インキュベートし、約１４時間ナイーブＢＨＫ−２１細胞を感染させるために使用した。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）粒子力価を使用して、測定した。結果を表１に示す。
【０１５２】
【表１】
この粒子をまた、それらの感染性およびナイーブ細胞の感染に対する新しい粒子を生成する能力について試験し、不完全なヘルパー同時パッケージングを測定する。高ＭＯＩ感染にて、改変された増幅配列を含む構築物を使用して生成された粒子は、改変されていない増幅配列を含む構築物を使用して生成された粒子より非常に効果的にナイーブ細胞に感染した。従って、改変された５'増幅配列を含む構造カセットを使用して生成された粒子は、少数の不全型の粒子を含んだ。
【０１５３】
さらに、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、改変された５'増幅配列を含む構造カセットを使用して生成された粒子は、改変されていない増幅配列を使用して生成された粒子と比較して少なくとも１０倍少ない同時パッケージされた粒子を有する。
【０１５４】
最後に、ｔＲＮＡ構造を含む少なくとも１つのヘルパーを用いて生成された粒子の感染性を、改変された５'配列を含むヘルパーで調製した粒子の感染性と比較した。ナイーブ細胞を、４５分間３７℃で種々のＭＯＩ（０．５、１、５および１０）にて感染させた。次いで、この細胞を洗浄して、一晩、培地中でインキュベートした。感染された細胞の数を、感染の１６時間後に、ＦＡＣＳによって評価した。図６に示すように、改変されたヘルパーを用いて調製された粒子で感染された細胞の数は、ＭＯＩを増加するにつれて、増加するが、１つのｔＲＮＡを有するヘルパー由来の粒子で感染された細胞の数は、比較的低いＭＯＩ＝１にて一定状態に達する。この結果は、ｔＲＮＡを有するヘルパー由来の粒子調製物が、感染細胞と競合する多くの不全型の粒子を有することを示唆し、それによって、測定可能な感染性（例えば、ＧＦＰポジティブ細胞の割合）は、初期に一定状態に達する。対照的に、改変されたヘルパー由来の粒子は、減少した数の不全型の粒子を有し、感染された細胞の数は、Ｍ．Ｏ．Ｉの範囲にわたって増加する。
【０１５５】
従って、不完全なパッケージングシグナルである、改変された増幅配列を含む構造的ヘルパー構築物を使用することは、同時パッケージングを顕著に減少するが、レプリコン粒子を効果的にパッケージングする。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態は、ある程度詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに明らかな変更がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、αウイルスレプリコン粒子を産生するための、複合的な構築物システムの模式図である。レプリコンベクターは、５’末端および３’末端シス複製配列、αウイルス非構造遺伝子、サブゲノムの接合領域（ＪＲ）プロモーターおよび目的の異種遺伝子（ＧＯＩ）を含む。示される構造タンパク質発現カセット（不完全なヘルパー）は、シス作用性ｔＲＮＡ−アスパラギン（ｔＲＮＡａｓｐまたはｔＲＮＡＡｓｐ）５’増幅配列、サブゲノムの接合領域（ＪＲ）プロモーター、３’末端シス複製配列およびキャプシドタンパク質をコードする配列または糖タンパク質をコードする配列を含む。
【図２】図２は、推定シンドビス（ＳＩＮ）パッケージングシグナル（配列番号１）の一部とｔＲＮＡＡｓｐ５’配列（配列番号２）とのアラインメントを示す。最下行は、コンセンサス配列（配列番号３）を示し、ＳＩＮゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００１５４７）の、おおよそヌクレオチド１０２９からヌクレオチド１０５０に及ぶ、相同性の高い領域を示す。
【図３】図３は、改変されていないｔＲＮＡ５’配列（配列番号２）と種々の例示的な改変されたｔＲＮＡ配列（配列番号４〜１５）とのアラインメントを示す。野生型ｔＲＮＡａｓｐ配列について、改変されるヌクレオチドに下線を引いた。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、改変されていない５’増幅配列および改変された５’増幅配列により形成される二次構造の模式図である。図４Ａは、改変されていない（野生型）のｔＲＮＡａｓｐ（配列番号２）の二次構造を示し、図４Ｂは、例示的な改変された５’増幅配列（ｍｏｄ＃１と称される）（配列番号４）の二次構造を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、粒子へのヘルパー構築物の同時パッケージングを示すグラフであり、改変された５’増幅配列が、改変された配列を含むヘルパー構築物の同時パッケージングを効果的に減少させながら、粒子の収量に最小限の影響しか与えないことを示す。図５Ａは、感染の多重度２（ＭＯＩ ２）における結果を示す。図５Ｂは、ＭＯＩ ４における結果を示す。
【図６】図６は、改変された増幅配列（明灰色）または改変されていないｔＲＮＡ配列（暗灰色）のいずれかを含む構造カセット（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を使用して作製された粒子の感染性を示すグラフである。ＭＯＩは、横軸に沿って示される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に薬学的組成物に関する。詳細には、本発明は、パッケージングシグナルとして不完全な、改変されたシス作用性、機能性の増幅配列に関し、そしてこれらの配列を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
αウイルスは、トガウイルス科ファミリーの遺伝学的、構造的および血清学的に関連する節足動物媒介ウイルスの集合を含む。２６種の公知のウイルスおよびウイルス亜型が、αウイルス属内に分類され、これらとしては、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）、ロス川ウイルス（ＲＲＶ）およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＥ）が挙げられる。
【０００３】
αウイルス属のいくつかのメンバーは、ワクチンおよび治療薬としての使用のための「レプリコン」発現ベクターとして開発されている。レプリコンベクターは、いくつかの様式（ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる）で利用され得、そしてレプリコンベクター（レプリコン粒子）を含む組換えウイルス様粒子を作製するために利用され得る。このようなレプリコンベクターはαウイルスに由来しており、これらのαウイルスとしては、例えば、ＳＩＮ（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）、セムリキ森林熱ウイルス（非特許文献５；非特許文献６）およびＶＥＥ（非特許文献７）が挙げられる。現在、広範な多数の文献は、ワクチン（例えば、非特許文献２；非特許文献６；非特許文献３；非特許文献７；非特許文献４；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと）のような適用のために、αウイルスレプリコンベクターを使用する効力を実証している。
【０００４】
核酸ベースのワクチンとしての、αウイルスレプリコンベクターの使用は、他の核酸発現ベクターと比較して、特定の利点を提供し得る。数年を通して、いくつかの用語（αウイルスベクター、αウイルスベクター構築物、αウイルスレプリコン、αウイルスＲＮＡレプリコン、αウイルスベクターレプリコン、真核生物用層状のベクター開始システム（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｌａｙｅｒｅｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＬＶＩＳ）およびαウイルスプラスミドレプリコンなどが挙げられる）は、αウイルスレプリコンベクターを記載するように現れている。
【０００５】
遺伝子送達ビヒクルとしてのそれらの使用に加えて、αウイルスレプリコンベクターはまた、それら自身で予防適用および治療適用において有用な、組換えウイルス粒子またはウイルス様粒子（レプリコン粒子）を生成するための使用について記載されている。例えば、非特許文献４を参照のこと。αウイルスレプリコン粒子は、代表的に粒子形成に必要とされる種々のエレメントを分割する、マルチコンポーネントシステム（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を使用して生成される。種々のエレメントの分割は、所望されない複製能を有するウイルスを生成する危険を減らす。このシステムは、代表的に１）レプリコンベクター（それ自身の細胞内複製に必要なエレメント（例えば、非構造タンパク質をコードする配列）を含むが、子孫粒子の産生に必要な、１つ以上の構造タンパク質をコードするエレメントを欠く）、および２）パッケージングに必要とされるαウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシド、糖タンパク質）をコードする、１つ以上の構造タンパク質発現カセット構築物（例えば、不完全なヘルパー（ｈｅｌｐｅｒ））を含む。レプリコン構築物および不完全なヘルパー構築物は、ＲＮＡとして細胞に直接導入されても、または一過的にトランスフェクトされた細胞または安定にトランスフェクトされた細胞（例えば、パッケージング細胞株またはＰＣＬ）のいずれかにおけるＤＮＡから送り出してもよい。例えば、非特許文献４；特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６、非特許文献２、非特許文献１１を参照のこと。
【０００６】
理想的には、予防適用または治療適用において使用されるαウイルスレプリコン粒子の集団は、実質的に均一であり得、レプリコンＲＮＡのみを含む。しかしながら、パッケージングエレメントが分割される場合でさえも、さらなるＲＮＡ種（例えば、不完全なヘルパーＲＮＡ）を含む粒子が生じ得る。非レプリコンＲＮＡ種の、この望ましくないパッケージングはまた、「同時パッケージング（ｃｏ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ）」と称される。
【０００７】
したがって、αウイルスベクター技術における進歩にもかかわらず、例えば、同時パッケージングを減らすための、αウイルスベクターおよびαウイルスレプリコン粒子を含む薬学的組成物、ならびにαウイルスベクターおよびαウイルスレプリコン粒子を作製および使用する方法に対する必要性が依然として存在する。
【特許文献１】米国特許第６，４６５，６３４号明細書
【特許文献２】米国特許第６，４２６，１９６号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３７６，２３６号明細書
【特許文献４】米国特許第６，３４２，３７２号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０１５，６８６号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８４３，７２３号明細書
【非特許文献１】Ｘｉｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４３：１１８８〜１１９１
【非特許文献２】Ｄｕｂｅｎｓｋｙ，ＴＷら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）７０（１）：５０８〜５１９
【非特許文献３】Ｈａｒｉｈａｒａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：９５０〜９５８
【非特許文献４】Ｐｏｌｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９９）９６（８）：４５９８〜４６０３
【非特許文献５】Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）９：１３５６〜１３６１
【非特許文献６】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９８）１６：５６２〜５６５
【非特許文献７】Ｐｕｓｈｋｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９７）２３９：３８９〜４０１
【非特許文献８】Ｄａｖｉｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：３７１〜３７８
【非特許文献９】ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９）１０：４３４〜４３９
【非特許文献１０】Ｂｅｒｇｌｕｎｄら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：４９７〜５０７
【非特許文献１１】Ｆｒｏｌｏｖら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．（１９９６）９３（２１）：１１３７１〜１１３７７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（要旨）
本発明は、パッケージングシグナルとして不完全であるように改変される増幅配列を含む組成物および、これらの組成物を作製および使用する方法を含む。
【０００９】
一局面において、本発明は、改変された５’増幅配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを含み、この改変された配列は、（相補的なマイナス鎖ＲＮＡ中間体由来の）ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない。特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列は、一次配列レベルにおいて、パッケージングシグナルに対し低い相同性（配列同一性）を示す配列を含むが、その二次構造は、元の増幅配列のものを維持する。特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列はＲＮＡである。さらに、特定の実施形態において、この改変された５’増幅配列は、配列番号４〜１６のうちの任意の一つ、または配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約５０％〜約６０％（または、これらの間の任意の値（例えば、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約６０％〜約７０％（または、これらの間の任意の値（例えば、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約７０％〜約８０％（または、これらの間の任意の値（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％））の配列同一性を示す配列、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約８０％〜約９０％（または、これらの間の任意の値（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％））の配列同一性を示す配列、もしくは配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約９０％〜９９％（または、これらの間の任意の値（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％））の配列同一性を示す配列を含む。
【００１０】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列のいずれかにおいて、この改変された配列が、ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない限り、この配列は、合成物であってもよいし、ならびに／または、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ由来の配列からなる群から選択される配列に由来してもよい。特定の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し９０％未満の同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し８０％未満の配列同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し７０％未満の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し少なくとも６０％未満の配列同一性を示す配列を含む。他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し、少なくとも約４０％と約５０％との間（または、これらの間の任意の値（例えば、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％））の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し少なくとも約３０％と約４０％（または、これらの間の任意の値（例えば、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％））の配列同一性を示す配列を含む。なお他の実施形態において、改変された５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列または細胞ＲＮＡ由来の配列に対し、約３０％未満の配列同一性を示す配列を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の５’増幅配列のいずれかを含むＲＮＡベクター構築物を含む。特定の実施形態において、ベクター構築物はさらに、αウイルスの接合領域（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）プロモーターをコードする核酸配列、１つ以上のαウイルスの構造タンパク質（例えば、糖タンパク質Ｅ１および／または糖タンパク質Ｅ２；キャプシドタンパク質など）をコードする核酸配列および／またはＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含み得る。さらに、ベクター構築物はまた、選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含み得る。本明細書に記載のＲＮＡベクター構築物のいずれかは、必ずしも生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質をコードし得ない。さらに、本明細書に記載のベクター構築物のいずれかは、２種以上のαウイルスに由来する配列を含み得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、核酸分子に作動可能に連結された５’プロモーターを含むαウイルスベクター構築物を含み、この核酸分子は、本明細書に記載のＲＮＡベクターに対し、相補的なＤＮＡである。特定の実施形態において、ベクター構築物はさらに、転写終結を制御する３’配列を含み得る。５’プロモーターは、原核生物のプロモーターまたは真核生物のプロモーターであり得る。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、本明細書に記載のαウイルスベクター構築物のいずれかを含む細胞を含む。
【００１４】
なお別の局面において、本発明は、宿主細胞と１つ以上の本明細書に記載のαウイルスベクターとを含む、αウイルスパッケージング細胞株を含む。
【００１５】
なおさらなる局面において、本発明は、感染性かつ不完全な（複製に欠陥のある）αウイルス粒子を産生するためのヘルパー細胞を含み、この細胞は、αウイルスレプリコンベクターとレプリコンベクターに存在しないαウイルスの構造タンパク質をコードする１つ以上の個別の発現カセット（例えば、ヘルパー構築物）とを、αウイルス許容性細胞中に含む。上記の個別のヘルパー構築物のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含む。そしてさらに、レプリコンベクターと個別の構造タンパク質発現カセット（例えば、ヘルパーベクター）との組み合わせた発現は、１つ以上の異種配列を含む構築されたαウイルス粒子を産生し、このαウイルス粒子は、細胞に感染し得、かつウイルス複製を完結し得ない。特定の実施形態において、ヘルパー細胞は、２つの個別の構造タンパク質発現カセット構築物（例えば、ヘルパー構築物）を含み、ここで第一の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物はαウイルスキャプシドタンパク質をコードし、第二の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物はαウイルス糖タンパク質をコードする。１つ以上の個別の構造タンパク質発現カセットまたはヘルパー構築物は、改変された５’増幅配列を含み得る。好ましくは、ヘルパー細胞は、αウイルスレプリコンベクターと１つ以上の個別の構造タンパク質発現カセットヘルパー構築物とによってトランスフェクトされる。
【００１６】
別の局面において、本発明は、感染性かつ不完全な（複製に欠陥のある）αウイルス粒子を作製する方法を包含し、この方法は：（ａ）本明細書に記載されるヘルパー細胞を提供する工程；（ｂ）このヘルパー細胞内でαウイルス粒子を産生させる工程；そして（ｃ）このヘルパー細胞から産生されたαウイルス粒子を収集する工程を包含する。
【００１７】
別の局面において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかにしたがって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む組成物を含み、この組成物は、検出可能な複製能のあるαウイルス粒子を含まない。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に、本明細書に記載の方法のいずれかによって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む薬学的処方物を含む。
【００１９】
なおさらなる局面において、本発明は、本明細書に記載の改変された５’増幅配列のいずれかを作製する方法を含み、この方法は、（ａ）公知の５’増幅配列とウイルスパッケージングシグナルを含む配列との間の配列相同性の領域を決定する工程；および（ｂ）ウイルスパッケージングシグナルを含む配列への相同性が減らされるが、増幅機能は維持されるように、公知の５’増幅配列の一次配列を改変し、それによって改変された５’増幅配列を作製する工程を包含する。特定の実施形態において、公知の５’増幅配列は、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルスの５’末端、αウイルス由来ではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ由来の配列からなる群から選択される。
【００２０】
本発明のこれらの局面および実施形態ならびに他の局面および実施形態は、以下の詳細な説明および本明細書に示され、特定の手順または組成物（例えば、プラスミド、配列など）をより詳細に記載する種々の参考文献への参照により明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（詳細な説明）
組成物およびαウイルス粒子（レプリコン粒子）を生成するための方法が、本明細書に記載される。特に、改変された５’増幅配列が記載される。この改変された５’増幅配列は、αウイルス構造タンパク質構築物（例えば、ヘルパー構築物）およびパッケージング細胞株などにおける使用を見出される。
【００２２】
その他に示されない限り、本発明の実施は、当該分野の技術の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬物学の従来方法を使用する。このような技術は、文献に十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ〜ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９９、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ（Ｒｅａｍら編、１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），第２版（ＮｅｗｔｏｎおよびＧｒａｈａｍ編、１９９７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；ＰｅｔｅｒｓおよびＤａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第２版），Ｆｉｅｌｄｓら（編），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．を参照のこと。
【００２３】
本明細書に引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的についてそれら全体が参考として、本明細書に援用される。
【００２４】
本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がその他を明確に指示しない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「配列」への言及は、２つ以上のこのような配列を含む。
【００２５】
（定義）
本発明を示すより前に、以後使用される特定の用語の定義が示される。
【００２６】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」分子としては、原核生物のＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列、真核生物のｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、合成ＤＮＡ配列または合成ＲＮＡ配列、上記のＤＮＡのいずれかから転写されたＲＮＡおよび上記の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この用語はまた、任意の公知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログを含む配列、ならびに天然の配列への改変（例えば、欠失、付加および（一般的に天然において保存的な）置換）を含む配列も捕捉する。これらの改変は、部位特異的突然変異誘発を介して意図され得るか、または偶発的であり得る。ポリヌクレオチドの改変は、多数の影響（例えば、宿主細胞におけるポリペプチド産物の発現を促進することが挙げられる）を有し得る。ポリヌクレオチドとしては、二本鎖配列および一本鎖配列の両方が挙げられ得る。ポリヌクレオチドは、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物のｍＲＮＡまたは真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）または原核生物のＤＮＡ由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、ならびに合成ＤＮＡ配列または合成ＲＮＡ配列をいうが、これらに限定されない。この用語はまた、任意の公知のＤＮＡおよびＲＮＡの塩基アナログを含む配列も捕捉する。
【００２７】
「単離された核酸分子」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが通常関連する完全な生物から独立かつ分離した、あらゆるポリヌクレオチド、および／または、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から離された、あらゆるポリヌクレオチドをいう。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドは単離されないが、天然の系に同時に存在する物質のいくつかまたは全てから独立した同一のポリヌクレオチドが単離される。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、および／または、このようなポリヌクレオチドは、組成物の一部であり得る。このようなポリヌクレオチドは、ベクターまたは組成物が、それらの天然の環境の一部ではない場合に、なお単離される。単離された核酸分子の例は、生物のゲノムＤＮＡに一体化されていない核酸分子、またはウイルスの場合、完全なウイルスゲノムおよび化学合成された核酸分子から分離される核酸分子、または組換え技術（例えば、ＰＣＲ）により生成される核酸分子である。
【００２８】
「サブゲノムの（ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ）ＲＮＡ」は、それが由来するゲノムＲＮＡよりも短い長さまたは小さいサイズのＲＮＡ分子をいう。サブゲノムのＲＮＡは、内部プロモーター（この配列はゲノムＲＮＡまたはその相補体内に存在する）から転写される。好ましい実施形態において、サブゲノムのＲＮＡは、αウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコンまたは不完全なヘルパー構築物から産生され、１つ以上のαウイルス構造タンパク質または他の目的の異種配列をコードする。一般的に、サブゲノムのＲＮＡは、５’末端非翻訳領域および３’末端非翻訳領域ならびにタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む、代表的なｍＲＮＡに類似する。
【００２９】
本明細書で使用される場合、句「ベクター構築物」は、一般的に、目的の核酸配列または遺伝子の発現を誘導し得る、あらゆるアセンブリをいう。ベクター構築物は、代表的に、転写プロモーター／エンハンサーもしくは遺伝子座を規定する（ｌｏｃｕｓ ｄｅｆｉｎｉｎｇ）エレメントまたは、他の手段（例えば、可変（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシング、核内ＲＮＡの搬出、メッセンジャーの翻訳後の改変またはタンパク質の転写後の改変）により遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。さらに、ベクター構築物は、代表的に、転写される場合に、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、翻訳開始配列として作用する配列を含む。例えば、ベクターは、合成を開始する１つ以上の５’プロモーター配列（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含み得、これらとしては、原核生物および真核生物の両方に由来するプロモーター（例えば、細菌のβ−ガラクトシダーゼプロモーターおよびｔｒｐＥプロモーター、ならびに真核生物のウイルスのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、即時初期）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）プロモーターまたはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターおよび単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター）が挙げられる。ベクター構築物はまた、必要に応じて、ポリアデニル化を誘導するシグナル、選択可能なマーカー、ならびに１つ以上の制限部位および翻訳終止配列を含み得る。ベクター構築物の例としては、ＲＮＡベクター構築物のｃＤＮＡ相補体を含むＥＬＶＩＳベクター、ＲＮＡベクター構築物それ自身、αウイルスベクター構築物およびＣＭＶベクター構築物などが挙げられる。
【００３０】
「αウイルスベクター構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を誘導し得るアセンブリをいう。このようなベクター構築物は、αウイルスＲＮＡの転写を開始し得る５’配列（αウイルスＲＮＡの転写を開始し得る、保存された５’ヌクレオチド配列エレメント（ＣＳＥ）または５’シス複製配列とも呼ばれる）、および発現される場合に、生物学的に活性なαウイルスの非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、αウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列（３’ＣＳＥまたは３’シス複製配列とも呼ばれる）、そして必要に応じて、ポリアデニル化トラクト（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ ｔｒａｃｔ）から構成される。さらに、ベクター構築物は、ウイルスのサブゲノムの「接合領域」プロモーター、１つ以上の構造タンパク質遺伝子またはその一部由来の配列、ウイルス様粒子（例えば、レプリコン粒子）の産生を可能にするのに十分なサイズの外来の核酸分子、インビトロまたはインビボ（例えば、真核生物の細胞内）でｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、発現されるべき異種配列、および異種配列の挿入のための１つ以上の制限部位を含み得る。
【００３１】
「αウイルスＲＮＡレプリコンベクター」、「ＲＮＡレプリコンベクター」、「レプリコンベクター」または「レプリコン」は、標的細胞内で、インビボでのそれ自身の増幅または自己複製を誘導し得るＲＮＡ分子をいう。それ自身の増幅を誘導するために、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ増幅を触媒するのに必要な酵素（例えば、αウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードすべきであり、このコードされる酵素により認識および利用される、複製のために必要なシスＲＮＡ配列も含むべきである。αウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、以下の調整されたエレメントを含むべきである：非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列（５’ＣＳＥまたは５’シス複製配列、または複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列、またはαウイルスの転写を開始し得る５’配列とも呼ばれる）、発現される場合に、生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥ、または複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）。αウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、例えば、特定の実施形態において、サブゲノムのフラグメントのウイルスの転写を増大もしくは減少させるためにか、または不完全なヘルパーもしくは構造タンパク質発現カセットとの相同性を減らすために改変され得るＩＲＥＳあるいはウイルス（例えば、αウイルス）サブゲノムのプロモーター（例えば、接合領域プロモーター）のような、１つ以上の異種配列を発現するための手段と、発現されるべき１つ以上の異種配列とを含み得る。レプリコンはまた、さらなる配列（例えば、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種配列（例えば、タンパク質をコードする遺伝子または３’近位の遺伝子）および／またはポリアデニル化トラクト）も含み得る。レプリコンは、αウイルス構造タンパク質（キャプシド、Ｅ１、Ｅ２）の全てをコードする配列を含むべきではない。レプリコンベクターにより発現され得る異種配列の非限定的な例は、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号（その全体が、本明細書において参考として援用される）に記載され、これらの例は、例えば、抗原、リンホカイン、サイトカインなどを含む。
【００３２】
「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」は、ウイルス粒子（ビリオン）へヌクレオチド（例えば、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ）を取り込むことに関与するシス作用性配列をいう。多くのウイルス由来のパッケージングシグナルが記載されている。例えば、Ｙｏｕｉｌ Ｒ．ら（２００３）Ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ １４（１０）：１０１７〜１０３４；Ｂｅａｓｌｅｙ ＢＥら（２００２）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７６（１０）：４９５０〜４９６０；Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔら（２００３）Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７（１９）：１０５７５〜１０５８３を参照のこと。
【００３３】
「組換えαウイルス粒子」または「レプリコン粒子」は、αウイルスＲＮＡベクターレプリコンを含むビリオン様構造単位をいう。一般的に、組換えαウイルス粒子は、１つ以上のαウイルス構造タンパク質、脂質膜およびＲＮＡベクターレプリコンを含む。好ましくは、組換えαウイルス粒子は、宿主細胞由来の脂質二重層（例えば、原形質膜）内に含まれるヌクレオキャプシド構造を含み、この構造に、αウイルスにコードされるエンベロープ糖タンパク質が包埋される。この粒子はまた、このαウイルスが由来する粒子の親和性を誘導する、他の構成要素（例えば、標的化するエレメント、他のウイルス構造タンパク質または他のレセプター結合リガンド）を含み得る。
【００３４】
「αウイルス構造タンパク質発現カセット」は、１つ以上のαウイルス構造タンパク質を発現しうるベクター構築物をいう。αウイルス構造タンパク質発現カセットは、ＲＮＡ増幅または複製が可能な「不完全なヘルパー構築物」であり得、そしてトランスで供給される生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質に応答して、１つ以上のαウイルス構造タンパク質を発現し得る。不完全なヘルパー構築物は、代表的に、以下の調整されたエレメントを含む：５’増幅配列または５’シス複製配列、ウイルスのサブゲノムの接合領域プロモーター、発現される場合に、１つ以上の生物学的に活性なαウイルス構造タンパク質（例えば、Ｃ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、Ｅ１）をコードする配列、３’増幅配列または３’シス複製配列およびポリアデニル化トラクト。不完全なヘルパー構築物はまた、インビトロまたはインビボ（例えば、真核生物の細胞）でｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始し得る５’プロモーター、転写終結を制御する３’配列、スプライス認識（ｓｐｌｉｃｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）配列、触媒リボザイムプロセシング（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）配列、選択可能なマーカーをコードする配列および／または核外移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｏｒｔ ｓｉｇｎａｌ）を含み得る。不完全なヘルパー構築物は、４種全ての機能性αウイルス非構造タンパク質をコードすべきではない。
【００３５】
用語「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列」および「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’配列」および「増幅配列」および「５’増幅配列」および「５’ＣＳＥ」および「複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス配列」および「αウイルスの転写を開始し得る５’配列」は、ウイルスまたはウイルス由来のベクターがポジティブ鎖ＲＮＡを合成する認識部位を提供する機能性エレメントをいうために交換可能に使用される。それゆえ、これは、このウイルスまたはベクター内に含まれる実際の配列の相補体であり得、マイナス鎖ＲＮＡコピーの３’末端に一致し得る。そして、これは、非構造タンパク質レプリカーゼ複合体と、おそらくさらなる宿主細胞因子とにより結合され、これから、ポジティブ鎖ＲＮＡの転写が開始される。広範な種類の配列が、増幅配列として利用されており、これらとしては、例えば、αウイルス５’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）および、例えば、αウイルスゲノムのヌクレオチド２１０、ヌクレオチド２５０、ヌクレオチド３００、ヌクレオチド３５０、ヌクレオチド４００またはヌクレオチド４５０までの配列のような他の隣接する配列が挙げられる。あるいは、例えば、シンドビス（ＳＩＮ）ベクターの場合に、ｔＲＮＡアスパラギン（ｔＲＮＡａｓｐ）のためのαウイルスではないヌクレオチド１０〜７５が使用された（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒら、米国特許第５，０９１，３０９号）。
【００３６】
本明細書で使用される、用語「５’改変された増幅配列」は、先に定義される増幅配列を含むヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）分子をいい、この改変された配列が、パッケージングシグナルとしては不完全だが、それらの増幅（複製）機能性は維持するように、公知の増幅シグナルと比較して、それらの一次構造（配列）が改変（例えば、置換、付加、欠失）されている。例えば、改変された増幅配列は、一次配列レベルにおいて、パッケージングシグナルに対し低い相同性を含み得る一方で、その二次構造は元の増幅配列のものを維持する。改変された増幅配列は、さらに、二次構造および／またはシス作用性増幅能力が維持される限り、さらなる配列を含み得る。
【００３７】
用語「３’近位の遺伝子」は、レプリコンベクター、真核生物用層状のベクター開始システム、不完全なヘルパーＲＮＡまたは構造タンパク質発現カセット内に含まれ、かつ別のエレメントに関して特定の位置内に配置される、タンパク質をコードするヌクレオチド配列をいう。この３’近位の遺伝子の位置は、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列（先に定義される）に関して決定されねばならず、この３’近位の遺伝子は、このエレメントの５’（上流）かつ直前の、タンパク質をコードする配列である。
【００３８】
用語「ウイルス性サブゲノムのプロモーター」は、必要とされるウイルスポリメラーゼおよび細胞ポリメラーゼならびに他の因子とともにゲノム長未満のＲＮＡ分子の転写を可能にする、ウイルス起源の配列をいう。αウイルス（αウイルス性）サブゲノムのプロモーターまたはαウイルス（αウイルス性）サブゲノムの接合領域プロモーターについて、この配列は、一般的に、非構造タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と構造タンパク質のオープンリーディングフレームとの間の領域から得られ、通常、サブゲノムのｍＲＮＡの転写を制御する。代表的に、αウイルスサブゲノムのプロモーターは、大半のプロモーター関連活性を提供するコア配列、およびプロモーター関連活性をさらに増強する隣接領域（例えば、伸長されたプロモーターまたは天然のプロモーター）からなる。サブゲノムのプロモーターは、ウイルスまたはベクター内に含まれる実際の配列の相補体であり得、これは、マイナス鎖ＲＮＡコピー内の領域に一致し得、ポジティブ鎖サブゲノムのｍＲＮＡの転写開始を促進し得る。例えば、αウイルス基本型である、シンドビスウイルスの場合に、通常のサブゲノムの接合領域プロモーターは、代表的に、おおよそヌクレオチド番号７５７９から始まり、少なくともヌクレオチド番号７６１２まで続く（そしておそらく、それを越えて続く）。最小でも、ヌクレオチド７５７９〜ヌクレオチド７６０２は、サブゲノムのフラグメントの転写のために必要なコア配列として働くと考えられる。
【００３９】
用語「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス性配列または３’細胞性配列」または「非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列」は、複製のためにシスで必要とされる、用語３’ＣＳＥもしくは３’シス複製配列もしくは３’ウイルス性配列、またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列と交換可能に使用される。この配列は、ウイルスまたはウイルス由来のベクターが負のＲＮＡ鎖の合成による複製（増幅）を開始する認識部位を提供する、機能性エレメントである。広範な種類の配列が、この機能のために利用され得る。例えば、この配列は、完全なαウイルス３’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）を含み得、例えば、ＳＩＮについては、ヌクレオチド１１，６４７〜ヌクレオチド１１，７０３を含み得る領域、または、依然として認識配列としての機能を維持する３’ＮＴＲの短縮された領域（例えば、ヌクレオチド１１，６８４〜ヌクレオチド１１，７０３）であり得る。例えば、米国特許第６，３２９，２１０号を参照のこと。この文脈で利用され得る配列の他の例としては、αウイルスではない配列または負鎖ＲＮＡ合成の開始を可能にする類似の機能性を維持する他の配列（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６−９７８５に記載の配列）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
「安定な形質転換」は、生細胞への核酸分子の導入、かつ細胞分裂の連続的なサイクルを通しての子孫細胞におけるこの核酸分子の長期間の維持または恒久的な維持をいう。核酸分子は、あらゆる細胞構成要素（核、ミトコンドリアまたは細胞質が挙げられるが、これらに限定されない）内に維持され得る。好ましい実施形態において、核酸分子は、核内に維持される。維持は、エピソーム事象のように染色体内（一体化され得る）であり得るか、または染色体外であり得る。
【００４１】
「αウイルスパッケージング細胞株」は、αウイルス構造タンパク質発現カセットを含み、αウイルスベクター構築物、ＲＮＡベクターレプリコン、真核生物用層状のベクター開始システム（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号）または組換えαウイルス粒子の導入後に、組換えαウイルス粒子を産生する細胞をいう。この親細胞は、哺乳動物起源であり得るか、または哺乳動物起源ではなくあり得る。好ましい実施形態内において、パッケージング細胞株は、構造タンパク質発現カセットにより安定に形質転換される。
【００４２】
「作動可能に連結された」は、記載される構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される、エレメントの配置をいう。コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合にコード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、それがコード配列の発現を誘導するように機能する限り、必ずしもコード配列と隣接する必要はない。それゆえ、例えば、介在性の翻訳されないが転写される配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在し得ても、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」とみなされ得る。
【００４３】
２つ以上のポリヌクレオチド配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較され得る。同様に、２つ以上のアミノ酸配列は、それらの「パーセント同一性」を決定することにより比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、核酸配列であろうとペプチド配列であろうと、一般的に、２つの整列された配列間の正確な一致の数（短い方の配列の長さによって割り、１００を乗じた数）として記載される。核酸配列のためのおおよそのアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２〜４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムにより提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡにより開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５〜６７６３（１９８６）により正規化されたスコア付けマトリックスを使用するペプチド配列における使用に拡大され得る。核酸配列およびペプチド配列に対するこのアルゴリズムの実行は、そのＢｅｓｔＦｉｔユーティリティアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により提供される。この方法のための初期設定のパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから利用可能）に記載される。配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性を計算するための、他の同等に適切なプログラムは、一般的に当該分野において公知である。
【００４４】
例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列のパーセント同一性は、初期設定のスコア付けテーブル（ｓｃｏｒｉｎｇ ｔａｂｌｅ）および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。本発明の文脈においてパーセント同一性を確立する別の方法は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）により頒布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。このパッケージの一式から、初期設定のパラメータがスコア付けテーブル（例えば、１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティおよび６のギャップ）について使用される場合に、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用され得る。生成されたデータから、「一致」の値は「配列同一性」を反映する。配列間のパーセント同一性またはパーセント類似性を計算するための、他の適切なプログラムは、一般的に当該分野において公知である（例えば、初期設定のパラメータを用いても使用され得る、アラインメントプログラムＢＬＡＳＴ）。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下の初期設定のパラメータを用いて使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ；ｓｏｒｔ ｂｙ＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４５】
当業者は、上記のプログラムにおいて、所定の配列のために使用する適切な探索パラメータを容易に決定し得る。例えば、探索パラメータは、当該の配列のサイズに基づいて変動し得る。したがって、例えば、本発明の代表的な実施形態は、Ｘ個隣接するヌクレオチドを有する、単離されたポリヌクレオチドを含み得、ここで、（ｉ）Ｘ個隣接するヌクレオチドは、本明細書に記載の配列のいずれかに由来するＹ個隣接するヌクレオチドに対して少なくとも５０％の同一性を有し、（ｉｉ）ＸはＹと等しく、そして（ｉｉｉ）Ｘは、６ヌクレオチド以上かつ５０００ヌクレオチドまでであり、好ましくは８ヌクレオチド以上かつ５０００ヌクレオチドまでであり、より好ましくは１０〜１２ヌクレオチドかつ５０００ヌクレオチドまでであり、そしてさらにより好ましくは１５〜２０ヌクレオチド、本明細書に記載の全長配列（例えば、配列表および特許請求の範囲を参照のこと）に存在するヌクレオチドの数までであり、上記の範囲内の全ての整数値を含む。
【００４６】
２つの核酸フラグメントは、本明細書に記載されるように「選択的にハイブリダイズする」とみなされる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に一致する核酸配列は、完全に一致する配列が標的分子へハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する。完全に一致する配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野において周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザンブロット、ノザンブロットまたは溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）を使用して評価され得る。このようなアッセイは、選択性の変動する程度（例えば、低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーに変化する条件を使用すること）を使用して実施され得る。低ストリンジェンシーの条件が利用される場合、非特異的な結合が存在しないことは、配列同一性の部分的な程度さえも欠く二次プローブ（例えば、標的分子との約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を使用して評価され得、その結果、非特異的な結合事象が存在しない場合において、この二次プローブは、標的にハイブリダイズしない。
【００４７】
ハイブリダイゼーションベースの検出システムを利用する場合、標的核酸配列に相補的な核酸プローブが選ばれ、次に、適切な条件の選択により、プローブと標的とは互いに「選択的にハイブリダイズする」か、または結合し、ハイブリッド分子を形成する。「中程度のストリンジェント」下で標的配列に選択的にハイブリダイズし得る核酸分子は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下で、ハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、選択された核酸プローブの配列と約９０％〜９５％より高い配列同一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと標的とが配列同一性の特定の程度を有するプローブ／標的ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野において公知であるように決定され得る（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、編者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４８】
ハイブリダイゼーションのためのストリンジェンシー条件に関して、多くの同等の条件が、例えば、以下の因子を変更することにより特定のストリンジェンシーを確立するために利用され得ることが当該分野において周知である：プローブと標的配列との長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤の存在または不在（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度パラメータおよびハイブリダイゼーション反応時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変更すること。ハイブリダイゼーション条件の特定の設定の選択は、当該分野において標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。
【００４９】
用語「二次構造」は、ポリヌクレオチドの立体配座（二次構造または三次構造）をいう。例えば、一本鎖ＲＮＡ分子は、一般的に、二次構造（ヘアピン構造およびステム−アンド−ループ構造など）をとる。任意の所定のポリヌクレオチドの二次構造は、多くのアルゴリズム（例えば、Ｚｕｃｋｅｒら「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ」（インターネット上で利用可能）に記載されるＲＮＡ二次構造予測およびＤＮＡ二次構造予測のためのｍｆｏｌｄパッケージ）を使用して、その一次配列から予測され得る。
【００５０】
用語「に由来する」は、分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド）のαウイルス性供給源を同定するために使用される。第一のポリヌクレオチドが、第二のポリヌクレオチド、そのｃＤＮＡ、その相補体の領域と同一の塩基対配列もしくは実質的に同一な塩基対配列を有する場合、第一のポリヌクレオチドが先に記載される配列同一性を示す場合、または第一のポリヌクレオチドが第二のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと同一のポリペプチドもしくは実質的に同一なポリペプチドをコードする場合、第一のポリヌクレオチドは第二のポリヌクレオチド「に由来する」。したがって、ポリヌクレオチドが、（ｉ）特定のαウイルス配列の少なくとも一部と同一の配列もしくは実質的に同一な配列を有する場合、または（ｉｉ）先に記載されるαウイルスのポリペプチドのいずれかに対し、配列同一性（例えば、５０％より高いパーセント同一性（先に記載される））示すポリペプチドをコードする場合に、ポリヌクレオチドは特定のαウイルス（例えば、種）「に由来する」。したがって、本明細書に記載の配列は、１種以上のαウイルス（ＳＩＮ、ＶＥＥ、ＳＦＶなど）に由来し得、それは、本明細書に提供される開示を考慮して、天然に存在する供給源または受託者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から容易に取得され得る。適切なαウイルスの代表的な例は、より詳細に米国特許第５，８４３，７２３号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ ９７／３８０８７に記載される。
【００５１】
代表的な「制御エレメント」としては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳終止コドンに対して３’に配置される）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’に配置される）、翻訳終止配列、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’配列、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’配列および１つ以上の異種配列を発現させる手段（例えば、サブゲノムの接合領域プロモーター）（例えば、ＭｃＣａｕｇｈａｎら（１９９５）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９２：５４３１〜５４３５；Ｋｏｃｈｅｔｏｖら（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．４４０：３５１〜３５５を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
「真核生物用層状のベクター開始システム」は、目的の配列または遺伝子の発現を誘導し得るアセンブリを含むポリヌクレオチドをいう。真核生物用層状のベクター開始システムは、ｃＤＮＡからのＲＮＡの合成をインビボ（すなわち、真核生物の細胞内）で開始し得る５’プロモーター、および、真核生物の細胞内でそれ自身の複製を誘導し得、かつまた異種配列を発現し得る核酸ベクター配列（例えば、ウイルス性ベクター）を含むべきである。好ましくは、核酸ベクター配列は、αウイルス由来の配列であり、これは、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる５’ウイルス性配列または５’細胞配列（５’ＣＳＥまたは５’シス複製配列または複製のためにシスで必要とされる５’ウイルス性配列またはαウイルスの転写を開始し得る５’配列とも呼ばれる）、ならびに発現される場合に、生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする配列、および、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる３’ウイルス性配列または３’細胞配列（３’ＣＳＥまたは複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス性配列またはαウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれる）からなる。さらに、ベクター配列は、例えば、特定の実施形態において、サブゲノムのフラグメントのウイルス性の転写を防止、増大もしくは減少させるためにか、あるいは不完全なヘルパーまたは構造タンパク質発現カセットとの相同性を減らすために改変され得るウイルス性（例えば、αウイルス性）サブゲノムのプロモーター（例えば、接合領域プロモーター）のような異種配列を発現するための手段、および発現されるべき１つ以上の異種配列を含み得る。好ましくは、異種配列はタンパク質をコードする遺伝子を含み、この遺伝子はベクター配列内の３’近位の遺伝子である。真核生物用層状のベクター開始システムはまた、ポリアデニル化配列、スプライス認識配列、触媒リボザイムプロセシング配列、核外移行シグナルおよび転写終結配列を含み得る。好ましくは、真核生物用層状のベクター開始システムは、全てのαウイルス構造タンパク質（キャプシド、Ｅ２およびＥ１）をコードする配列を含む。「ハイブリッド」ＥＬＶＩＳは、２種以上のαウイルスに由来するポリヌクレオチド配列を含むアセンブリをいう。
【００５３】
以下でより詳細に議論されるように、本発明は、αウイルス構築物における使用のために適切な配列；これらの配列を含む構築物；パッケージング細胞株；組換えαウイルス粒子をパッケージングする方法；ベクターのパッケージングの間、同時パッケージングを抑制する方法を含むが、これらに限定されない。
【００５４】
（一般的な概要）
本発明は、αウイルスベースの粒子の生成における使用のための改変された５’増幅配列、構造タンパク質発現カセットにおける使用のために操作された特定の配列に関する。本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、αウイルスレプリコン粒子の生成の間の、同時パッケージング事象を減らし、それゆえ、パッケージング細胞株における使用およびαウイルスレプリコン粒子を生成する方法を見出される。
【００５５】
現在、αウイルスレプリコン粒子は、代表的に、粒子形成のために必要とされる種々のエレメントを分割する複数の構築物系を使用して生成される。異なる構築物へのこれらのエレメントの分割は、野生型の感染性ウイルスを生成する危険を減らす。この系は、代表的にレプリコンベクターとパッケージングのために必要とされる構造タンパク質（例えば、キャプシド、糖タンパク質）をコードする１つ以上の構造タンパク質発現カセット（例えば、不完全なヘルパー構築物）とを含み、このレプリコンベクターは、その自己細胞内複製のために必要なエレメント（例えば、非構造タンパク質をコードする配列）を含むが、子孫粒子の産生のために必要なエレメント（例えば、構造タンパク質コード配列）を欠く。レプリコン構築物および不完全なヘルパー構築物は、ＤＮＡベースおよび／またはＲＮＡベースであり得る。例えば、Ｐｏｌｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４５９８〜４６０３；米国特許第６，４６５，６３４号；同第６，４２６，１９６号；同第６，３７６，２３６号；同第６，３４２，３７２号；同第６，０１５，６８６号；および同第５，８４３，７２３号を参照のこと。
【００５６】
図１に示されるように、２つの不完全なヘルパー構築物が、レプリコンＲＮＡのパッケージングのための構造遺伝子を提供するために使用され得る。複製能のあるウイルス（ＲＣＶ）を生成する危険が低減されるので、２つの個別の不完全なヘルパーの使用が好ましくあり得る。例えば、米国特許第６，４２６，１９６号を参照のこと。ヘルパー構築物は、トランスで産生される非構造タンパク質によるそれ自身の増幅のため、および構造タンパク質遺伝子の発現のために必要なシスエレメントを含むが、αウイルス非構造タンパク質遺伝子を欠く。レプリコン粒子へのヘルパーの同時パッケージングを減らすために、シス作用性αウイルスパッケージングシグナルはまた、代表的にヘルパー構築物から欠失される。同時パッケージングは、１つ以上のヘルパーＲＮＡを含むがレプリコンＲＮＡ構築物は含まない粒子（「不全型」粒子とも呼ばれる）の生成、およびレプリコン配列に加えて１つ以上のヘルパー配列を含む粒子の生成をいう。同時パッケージングの両方の形態が望ましくない。特に、不全型粒子の存在は、レプリコン粒子の感染性を妨害し得、粒子感染の効率を有効に減少し得る。同様に、レプリコンとヘルパー配列との同時パッケージングは、未処置の細胞の感染に際して新規粒子の産生をもたらし得、これらの粒子は、むしろ複製能のあるウイルス（ＲＣＶ）に近くふるまい得、ウイルスの望ましくない影響を含み得る。
【００５７】
複製に関与する種々のシスエレメント（すなわち、５’増幅配列）は、不完全なヘルパー構築物に取り込まれ得、これらとしては、例えば、同種のウイルス由来の天然（野生型）αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の天然αウイルス５’配列、同種のウイルス由来の非天然の不完全干渉（ＤＩ）αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルス由来ではないウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）および細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡエレメント）が挙げられる（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、ＰＮＡＳ ８０：３２７９〜３２８３、１９８３；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４１６２〜４１６８、１９９０；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１６３９〜１６４７、１９９０；Ｔｓｉａｎｇら、（１９８８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６２（１）：４７〜５３）。
【００５８】
これらの５’増幅配列は複製を媒介するように働き得るが、５’増幅配列（ｔＲＮＡａｓｐ配列のような、αウイルス由来ではない配列が挙げられる）の各々もまた、望ましくない同時パッケージング効果を示し得る。例えば、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：６４３９〜６４４６；Ｔｓａｉｎｇら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：３８〜４４を参照のこと。
【００５９】
αウイルスレプリコン粒子への望ましくない配列のパッケージングを減らすか、またはなくす一方で、同時に、αウイルスベクターの有効な複製を可能にする組成物および方法が、本明細書に記載される。この点について、本発明者らは、αウイルスレプリコン粒子のパッケージングにおいて使用されるαウイルス構造タンパク質カセットに対する複製シグナルとして、代表的に使用される配列が、しばしば、パッケージングシグナルとして望ましくなく働き得る配列を含むことを発見した。具体的には、５’増幅配列の一次構造（配列）は、望ましくない同時パッケージング機能において役割を果たすが、望ましい複製（増幅）機能において役割を果たさず、このことは、主に同一の領域の二次構造に依存するようである（図４Ａおよび図４Ｂ）。機能的な増幅配列の特徴である二次構造を維持するが、公知のパッケージングシグナルに対する一次配列の相同性をなくす分子を設計することにより、本発明は、有効かつ効率的に、αウイルスのパッケージングのために必要な構造タンパク質のヘルパー構築物の複製を達成し、かつヘルパー構築物の同時パッケージングを減らすか、またはなくす新規組成物および新規方法を可能にする。さらに、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物は、レプリコン粒子を産生し、このレプリコン粒子は、ｔＲＮＡ含有配列を含むヘルパー構築物により産生されたものよりも強力な感染性を有する（図６）。
【００６０】
（改変された５’増幅配列）
本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、機能的な増幅配列であるが、本質的にパッケージングシグナルとして働き得ない配列である。したがって、本明細書に記載の改変された５’増幅配列の特定の配列は、それらが本質的にパッケージングシグナルとして働き得ずかつ増幅（複製）シグナルとして機能的である限り、大幅に変更され得る。
【００６１】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、代表的に１０ヌクレオチド長〜１５０ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）、より好ましくは約３０ヌクレオチド長〜１００ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）、さらにより好ましくは約４０ヌクレオチド長〜８０ヌクレオチド長（または、それらの間の任意の長さ）である。
【００６２】
一般的に、改変された５’配列の作製は、ポリヌクレオチドの配列分析と構造分析との両方を伴う。代表的に、このプロセスは、公知のパッケージングシグナルに対して、公知の５’増幅配列（例えば、ｔＲＮＡａｓｐ）の一次配列を比較することにより始める。本明細書に記載のシス作用性５’増幅配列、多くの供給源（例えば、任意のウイルス由来の天然αウイルス５’配列、異種ウイルス由来の天然αウイルス５’末端、同種のウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’末端、異種ウイルス由来の非天然ＤＩαウイルス５’末端、αウイルス由来ではないウイルス配列（例えば、トガウイルス、植物ウイルス）および細胞ＲＮＡ由来の配列（例えば、ｔＲＮＡエレメント））に由来し得る（例えば、Ｍｏｎｒｏｅら、ＰＮＡＳ ８０：３２７９〜３２８３、１９８３；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４１６２〜４１６８、１９９０；Ｎｉｅｓｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１６３９〜１６４７、１９９０）。これらの配列および他の機能的な５’増幅配列の配列およびパッケージングシグナルは、公知であり、多くのデータベースにおいて公に利用可能である。
【００６３】
したがって、所定の二次構造を有する改変された５’増幅配列を得るプロセスは、公知の５’増幅配列の分析により開始され得る。パッケージングシグナルとして機能する５’増幅配列内の配列は、任意の適切な手段（例えば、相同性の高い領域を決定するための、公知のパッケージングシグナルとのアラインメント）により同定され得る。例えば、図２に示されるように、公知のｔＲＮＡ−ａｓｐ配列のヌクレオチド３７〜ヌクレオチド５８（Ｍｏｎｒｏｅら（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：３２７９〜３２８２）は、シンドビス（ＳＩＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ ００１５４７、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９８４）Ｖｉｒｏｌ １３３：９２〜１１０）のヌクレオチド１０２９〜ヌクレオチド１０５０（これらのヌクレオチドは、パッケージングに関与することが公知である）に対し、有意な相同性（＞８０％）を示す。本発明の局面を例示する目的のためだけに野生型ＳＩＮが使用され、あらゆるパッケージングシグナル配列が、比較のために選択され得ることが理解されるべきである。
【００６４】
一度同定されると、パッケージングシグナルは、任意の適切な手段（例えば、公知のパッケージングシグナルに対する相同性を減らすように、５’増幅シグナルの一次配列を変更すること（実施例１））により不完全にされ得る。配列は、その一次配列がパッケージングシグナルとして機能しないように、１つ以上のヌクレオチドの突然変異誘発、置換、挿入および／または欠失によって変更され得る。
【００６５】
改変されていない配列と改変された配列との間の一次配列レベルにおける相同性の程度は、そのパッケージングシグナルが不完全である限り、大幅に変動し得る。例えば、推定パッケージングシグナルとして同定された領域において、公知のパッケージングシグナルの同一の長さの領域に対して、好ましくは約９０％と９９％との間の相同性または約９０％と９５％との間の相同性、より好ましくは約９０％未満の相同性、より好ましくは８０％未満の相同性、そしてさらにより好ましくは７０％未満の相同性であるが、改変された配列と改変されていない配列ととの間の一次配列レベルにおける相同性は、９９％ほどでもあり得る。例えば、図３に示されるように、例示的な改変された５’増幅配列（配列番号４〜１６）は、野生型ＳＩＮパッケージングシグナルに対して相同性を示したｔＲＮＡ−ａｓｐの領域を改変することによって生成された。その結果、この領域における相同性は、大幅に減少される（例えば、全ての場合において８０％より大きいから７０％未満へ、いくつかの場合において４０％未満へ（例えば、配列番号４、１１、１４および１５））。図３の配列はＤＮＡ配列として示されるが、ＲＮＡベースのベクターにおける使用のために、この配列は対応するＲＮＡ残基により置換される（すなわち、ＴはＵにより置換される）ことが明らかである。
【００６６】
一次配列への改変は、好ましくは、このポリヌクレオチドの二次構造が改変されていない５’増幅配列に実質的に類似したままにするようになされる。先に記載されるように、一本鎖核酸分子（例えば、ＲＮＡ）は、一般的に、二次構造（ヘアピン構造およびステム−アンド−ループ構造など）をとる。任意の所定の核酸配列の二次構造を予測するための技術は、容易に利用可能であり、そして例えば、Ｚｕｃｋｅｒら「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ」およびＭａｃｋｅら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９（２２）：４７２４〜４７３５に記載される。
【００６７】
したがって、突然変異は、推定パッケージングシグナル配列に導入され、異なる一次配列を有するが、公知の５’増幅配列の二次構造（例えば、図４Ａに示されるｔＲＮＡａｓｐの二次構造）を有する配列を生成する。
【００６８】
あるいは、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、公知の増幅配列に類似する二次構造を有するように生成された合成配列であり得る。
【００６９】
それゆえ、本明細書に記載の改変された５’増幅配列はシス作用性５’増幅配列の特徴を有する二次構造を形成するが、おそらく、その一次構造レベルにおける公知のパッケージングシグナルに対する相同性の減少に起因して、これらは、パッケージングシグナルとして不完全である。
【００７０】
特定の実施形態において、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、パッケージングシグナルの外側の領域におけるさらなる改変を含む。本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、不完全なヘルパー構築物およびパッケージング細胞株などの生成において使用され得る。
【００７１】
（構造タンパク質カセットのさらなる構成要素（例えば、ヘルパー構築物））
特定の局面において、本明細書に記載の改変された５’増幅配列は、構造タンパク質カセットまたは不完全なヘルパー構築物の一部を形成する。したがって、改変された５’増幅配列に加えて、本明細書に記載のヘルパー構築物は、代表的に種々の核酸配列（コード配列および非コード領域の両方）を含む。本明細書に記載の組成物が、一般的に、単一のポリヌクレオチドで不完全なαウイルスゲノム（例えば、αウイルスのゲノムに含まれる、全てではないコード配列および／または非コード配列）を含むことが明らかである。
【００７２】
本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物はまた、代表的に、種々のαウイルスポリペプチド（例えば、１つ以上のαウイルス構造ポリペプチド（例えば、キャプシド、エンベロープ糖タンパク質）をコードする１つ以上の配列を含む。αウイルスレプリコンまたはベクターポリヌクレオチド構成要素を囲む（そしていくつかの場合において、これらと相互作用する）構造タンパク質は、キャプシドおよびエンベロープ糖タンパク質の両方を含む。例えば、Ｓｔｒａｕｓｓら（１９９４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５８：４９１〜５６２を参照のこと。大半の場合において、ポリヌクレオチド構成要素は、ヌクレオキャプシドを形成するキャプシドタンパク質により囲まれる。今度は、そのヌクレオキャプシドタンパク質は、エンベロープタンパク質を含む脂質エンベロープにより囲まれる。キャプシドタンパク質は、αウイルス構造ポリタンパク質のＮ末端タンパク質であり、そしてポリタンパク質からのプロセシングに続いて、パッケージングシグナルおよび他のキャプシドタンパク質モノマーを含むαウイルスＲＮＡと相互作用して、ヌクレオキャプシド構造を形成する。αウイルスエンベロープ糖タンパク質（例えば、Ｅ２、Ｅ１）は、覆われた粒子から表面「スパイク」のように突出し、これは、レセプター結合に機能的に関与し、標的細胞へ侵入する。
【００７３】
さらなる配列は、コード配列または非コード配列であり得る。非コード配列の非限定的な例としては、以下が挙げられる：３’近位遺伝子を発現するための手段（プロモーターなどのような制御エレメント（例えば、同種のウイルス由来の天然αウイルスサブゲノムのプロモーター、異種ウイルス由来の天然αウイルスサブゲノムのプロモーター、コアαウイルスサブゲノムのプロモーター（同種または異種）、コアサブゲノムのプロモーターから上流または下流の最小配列、コアサブゲノムのプロモーターまたは天然サブゲノムのプロモーターの突然変異／欠失／付加、αウイルス由来ではない適合性のサブゲノムのプロモーター（例えば、植物ウイルス）、内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）および／またはリボソームリードスルー（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ）エレメント（例えば、ＢｉＰ））；サブゲノムのｍＲＮＡ５’末端非翻訳領域（サブゲノムの５’ＮＴＲ）、非構造タンパク質媒介性の増幅のために必要とされる１つ以上のさらなる５’配列または３’配列（米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６９４号；同第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３８０８７；ＷＯ００／６１７７２）、３’近位遺伝子（例えば、異種配列、ポリペプチドコード配列）。Ｋｕｈｎら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１４６５〜１４７６；ならびに／あるいはポリアデニル化配列（例えば、３’配列内の、例えば、Ｇｅｏｒｇｅら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：９７７６〜９７８５を参照のこと）もまた参照のこと。
【００７４】
本明細書に記載のヘルパー構築物において使用されるコード配列および非コード配列は、１種以上のαウイルスおよび／またはαウイルスではない供給源（例えば、αウイルス、トガウイルス、植物ウイルス）に由来する配列を含み得る。ポリタンパク質の長さにおけるわずかな差異に主に起因して、一般的にヌクレオチド番号付けおよびアミノ酸番号付けは、αウイルスの間で幾分異なるが、異なるαウイルス由来の間でのアラインメントは、他のαウイルス中の類似の領域を同定するための手段を提供する（Ｋｉｎｎｅｙら（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：１９〜３０およびＳｔｒａｕｓｓら（１９８４）Ｖｉｒｏｌ １３３：９２〜１１０において、任意の他のαウイルスゲノムが整列され得る、１１，７０３ヌクレオチド長の例示的な野生型ＳＩＮゲノムについての代表的なアラインメントを参照のこと）。特定の実施形態において、ヘルパー構築物は、αウイルス属の２種またはメンバー由来の配列を含む。本明細書に記載の特定のαウイルス配列は、共有される国際公開ＷＯ ０２／０９９０３５（この開示は、その全体について参考として本明細書において援用される）においてさらに詳細に記載される。
【００７５】
さらに、１つ以上のヘルパー構築物配列は、野生型と比較して１つ以上の改変を含み得る。αウイルスコード配列への改変としては、例えば、１種以上のαウイルスおよび／または他のウイルス（例えば、αウイルス、他のトガウイルス、植物ウイルス）由来の配列を含むハイブリッド非構造タンパク質のように、全体または一部における、ヌクレオチド突然変異、欠失、付加または配列置換が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００７６】
（αウイルスパッケージング細胞株）
本発明のさらなる実施形態内で、αウイルスパッケージング細胞株が提供される。特に、本発明の一局面内で、αウイルスパッケージング細胞株が提供され、ここで、１つ以上の本明細書に記載の改変された５’増幅配列を保持する１つ以上の発現ベクター（好ましくは、安定的に一定化される）からトランスで供給されるαウイルス構造タンパク質は、細胞質内で、トランスフェクト、形質導入または細胞内で産生されたベクターＲＮＡ転写物をキャプシド形成（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅ）し得、細胞膜を通して感染性のパッケージングされたレプリコンベクター粒子を放出し得、それによりαウイルスベクター産生（パッケージング）細胞株（ＰＣＬ）を生成し得る。
【００７７】
例えば、αウイルスパッケージング細胞株が提供され、ここで、ウイルス性構造タンパク質は、本明細書に記載の１つ以上の安定的に形質転換された発現ベクター（構造タンパク質発現カセット）（例えば、改変された５’増幅配列を含む）からトランスで供給され、細胞質内で、トランスフェクト、形質導入または細胞内で産生されたベクターＲＮＡ転写物をキャプシド形成し得、細胞膜を通して感染性のパッケージングされたレプリコンベクター粒子を放出し得る。特定の実施形態において、パッケージングのために必要な構造タンパク質は、ＲＮＡベクターレプリコンそれ自身による誘導またはいくつかの他に提供される刺激の後にのみ、高いレベルで合成され、そしてこれらの構造タンパク質をコードする転写物は、天然のウイルス性感染の細胞質増幅を模倣するのに十分な発現レベルを許容する様式で、細胞質増幅を可能にする。さらに、他の実施形態において、選択可能なマーカーの発現は、構造タンパク質発現カセットに作動可能に連結される。このように連結された選択可能なマーカーは、機能的かつ安定的に形質転換されたＰＣＬの有効な生成を可能にする。
【００７８】
例えば、パッケージングされるべき所望の表現型のαウイルスＲＮＡベクターレプリコン分子（それら自身で、細胞の細胞質内での自触反応複製を可能にする）（例えば、このレプリコンは、許容性細胞内での複製のために必要とされる全てのエレメント（シスおよびトランス）を含む）は、インビトロで転写されたＲＮＡ、組換えαウイルス粒子またはαウイルスｃＤＮＡベクター構築物として、パッケージング細胞へ導入され得る。したがって、ＲＮＡベクターレプリコン分子は、高いレベルまで複製し、構造タンパク質遺伝子転写物の増幅およびそれに続く構造タンパク質の発現を刺激し、そして続いて、これらは、ウイルス性構造タンパク質によりパッケージングされ、感染性のベクター粒子をもたらす。上記の特定のレベルでのαウイルスタンパク質および／またはベクターＲＮＡの細胞内発現は、パッケージング細胞株または産生側細胞株における細胞毒性効果をもたらし得る。したがって、本発明の特定の実施形態内で、これらのエレメントは、それらの発現される構造タンパク質の細胞毒性の軽減、宿主の高分子合成の阻害の軽減および／または持続性の感染を確立する能力について選択されるウイルス改変体に由来すべきことが望ましくあり得る。
【００７９】
ベクターパッケージング細胞株の性能および最終的なベクター力価を最適化するために、米国特許第６，３９１，６３２号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に詳細に記載されるように、遺伝子移入およびベクターのパッケージングの連続的なサイクルが実行され得る。同様に、ＰＣＬは、米国特許第６，３９１，６３２号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に詳細に記載されるように、安定的に一体化されるか、またはエピソームに維持されるＤＮＡ発現ベクターを使用して産生され得る。
【００８０】
パッケージング細胞の細胞質内で複製し得るαウイルスＲＮＡベクター分子は、例えば、インビトロで、機能的な非構造タンパク質を含むαウイルスレプリコンベクター内の目的の遺伝子をコードするｃＤＮＡベクタークローンを転写するためのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ系を利用して、最初は産生され得る。したがって、ベクターＲＮＡ転写物は、αウイルスパッケージング細胞株にトランスフェクトされ、その結果、ベクターＲＮＡは、高いレベルまで複製し、そして続いて、これらは、ウイルス性構造タンパク質によりパッケージングされ、感染性のレプリコンベクター粒子をもたらす。
【００８１】
他の実施形態内で、ＰＣＬは、米国特許第５，７８９，２４５号（その全体が、本明細書において、参考として援用される）に記載されるように、シュード型に分類される（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）αウイルスベクター粒子を使用して産生され得る。米国特許第５，７８９，２４５号はまた、ＰＣＬになされ得るさらなる改変（例えば、改変により、パッケージングのために必要な構造タンパク質が、ＲＮＡベクターそれ自身による誘導またはいくつかの他の刺激の後にのみ合成される、改変）も記載する。
【００８２】
当該分野において公知の種々の異なる細胞（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、バキュロウイルス、細菌および酵母細胞）は、本発明の実施において使用され得る。昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス）は当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡからキットの形態で市販されている。鳥類細胞発現系もまた当業者に公知であり、そして例えば、米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号；ＷＯ ０３／０４３４１５；およびＷＯ ０３／０７６６０１に記載される。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系もまた当業者に公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎに記載される。
【００８３】
上記の系による使用のための多くの適切な宿主細胞もまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株が当該分野において公知であり、それらとしては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株（以下のものに限定されないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞）およびその他のものが挙げられる。細胞の哺乳動物の供給源としては、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えば、例えばＷＯ ０１／３８３６２とＷＯ ０２／４０６６５（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）とに記載され、かつＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０のもとで受託されたＰＥＲＣ．６細胞）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−７５）、アカゲザル胎児肺細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ−１６０）、ヒト胎児由来腎臓細胞（代表的に、剪断された（ｓｈｅａｒｅｄ）アデノウイルス５型ＤＮＡにより形質転換された２９３細胞）、サル腎臓由来のＶＥＲＯ細胞）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）ヒツジ、イヌ（例えば、ＷＯ ９７／３７００１に記載される、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４ ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ ３３０１６、受託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９）、ネコおよびげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞のようなハムスター細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が挙げられるが、これらに限定されない。そして、これらの供給源は、広範な種類の発生段階（例えば、成体、新生児、胎児および胚が挙げられる）から取得され得る。
【００８４】
細胞の鳥類の供給源としては、ニワトリ細胞（例えば、ニワトリ胚性幹細胞（例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、上記発現構築物による使用を見出される。本発明において有用な酵母宿主としては、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターによる使用のための昆虫細胞としては、特に、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
【００８５】
（組換えαウイルス粒子をパッケージングする方法）
本発明により提供されるように、組換えαウイルスベクター粒子（レプリコン粒子）の生成（パッケージング）は、例えば、レプリコンベクターと、インビトロで転写されたＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来する構造タンパク質発現カセット、相補するベクターおよび不完全なヘルパー（ＤＨ）分子との同時トランスフェクションによってか、あるいはウイルスによる同時感染によって容易に達成され得る（Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９〜６４４６、１９９３、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：５０８〜５１９、１９９６ならびに米国特許第５，８１４，４８２号、同第５，７３９，０２６号、同第５，７６６，６０２号、同第５，７８９，２４５号および同第５，７９２，４６２号（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）を参照のこと）。αウイルスベクターのパッケージングのための組成物および方法はまた、米国特許第６，３２９，２０１号および同第６，２４２，２５９号（それらの全体が、本明細書において、参考として援用される）に記載される。
【００８６】
あるいは、ベクター粒子は、先に記載される安定的なαウイルスパッケージング細胞株へのベクターＲＮＡの導入によって生成され得る。簡潔に述べると、このようなＰＣＬおよびその安定的に形質転換された構造タンパク質発現カセットは、米国特許第５，７８９，２４５号内に本質的に記載される方法を使用して（特に、本明細書に記載の改変された５’増幅配列を含む構築物を使用して）取得され得る。例えば、ＰＣＬによる組換えαウイルスベクター粒子の産生は、ＰＣＬへのαウイルスベースのベクター分子（インビトロで転写されたＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡに由来するベクターまたは先に取得された組換えαウイルス粒子）の導入、ベクター粒子のパッケージングに必要な条件下、かつそれに必要な時間、ＰＣＬをインキュベートする工程、およびパッケージングされたベクター粒子を収集する工程に従って達成され得る。本明細書に提供される詳細な実施例に示されるように、このようなアプローチにおける、有効なベクターのパッケージングのための本発明の新規の５’増幅配列の利用は、容易に達成される。
【００８７】
同時パッケージングは、未処理の培養細胞（例えば、パッケージング細胞ではない細胞）におけるレプリコン粒子の連続継代によってアッセイされ得る。同時パッケージングによらないレプリコン粒子は、未処理の細胞に感染した後、新規の子孫レプリコン粒子を産生しないが、同時パッケージングを伴うレプリコン粒子は、新規のレプリコン粒子を連続的に産生する。顕微鏡下においても、レプリコンを含む同時パッケージングは、隣接する細胞からの粒子の直接伝播に起因する細胞変性効果（ＣＰＥ）の病巣様のパターンを生成し得る。同時パッケージングはまた、レプリコン粒子による未処理の細胞の感染、そして感染細胞において、１つ以上のαウイルス構造タンパク質の発現について試験すること（例えば、ウェスタンブロット）により決定され得る。
【００８８】
（異種配列）
上記のように、本明細書に記載される改変された５’増幅配列（およびこれらの配列を含む構築物）は、広範囲の用途に使用され得る。例えば、改変された５’増幅配列は、αウイルスレプリコン粒子を産生するためのヘルパー構築物において使用され得る。このレプリコン粒子は、広範囲の異種配列（例えば、リンフォカインまたはサイトカイン、トキシン、および酵素を変換するプロドラッグのような緩和剤をコードする配列、免疫応答を刺激する抗原をコードする配列、リボザイムまたはアンチセンス配列、増殖因子または制御因子のような治療用途のためのタンパク質をコードする配列、および免疫応答を補助または阻害するタンパク質をコードする配列）を含み得る。
【００８９】
好ましくは、ヌクレオチド配列は、生存可能なベクター粒子を効果的に産生させ得るのに十分なサイズであるべきである。本発明の文脈内で、適切な感受性の単層での任意の測定可能な力価（例えば、発現の転写アッセイ、力価測定（ｔｉｔｅｒｉｎｇ）細胞株アッセイ、レポーターアッセイ、またはプラークアッセイによる）の組換えαウイルス粒子の産生は、「生存可能なベクター粒子の産生」と考えられる。これは、最小の場合、任意のさらなる異種配列を含まないαウイルスベクター構築物であり得る。しかしながら、他の実施形態内で、ベクター構築物は、さらなる異種配列または外来配列を含み得る。好ましい実施形態内で、異種配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂの異種配列、または少なくとも約８ｋｂの異種配列でさえ含み得る。上記の異種配列は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）のような受託機関を含む）、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような市販の供給源から容易に得られ得る。あるいは、上記の異種配列をコードするｃＤＮＡ配列は、当該分野において公知の標準的な手順を利用して、その配列を発現するか、または含む細胞から得られ得る。さらに、異種配列はまた、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ＤＮＡシンセサイザーで合成され得る。
【００９０】
適切な異種配列の代表的な例は、より詳細に米国特許第５，８４３，７２３号に議論されている。
【００９１】
免疫原性タンパク質をコードする異種配列の非限定的な例としては、以下に記載する１種以上由来のタンパク質が挙げられる：
細菌性抗原（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）：Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙおよび／またはＢ由来のタンパク質抗原（１〜７）；Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ｂ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（８、９、１０、１１）；糖類抗原（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のＬＰＳ（例えば、血清群Ｃ由来のオリゴ糖）が挙げられる）（ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９３４６；ＰＣＴ ＩＢ９８／０１６６５；およびＰＣＴ ＩＢ９９／００１０３を参照のこと）；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：糖類またはタンパク質抗原、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の糖類；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ：特に、Ｂ群連鎖球菌抗原；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ：特に、Ａ群連鎖球菌抗原；Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（特に、三糖類繰返しまたは米国特許第６，７５６，３６１号に提供される抗原由来の他のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ：Ｃａｇ、Ｖａｃ、Ｎａｐ、ＨｏｐＸ、ＨｏｐＹおよび／またはウレアーゼ抗原が挙げられる；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ：例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じてまた、ペルタクチンならびに／または凝集原２および３抗原との組み合わせ；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：必要に応じて、無毒性の組み換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌体外毒素Ａに結合されるＳ．ａｕｒｅｕｓ５型および８型莢膜多糖類（例えば、ＳｔａｐｈＶＡＸＴＭ）、または表面タンパク質、インベーシン（ロイコチジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食細胞の飲み込みを阻害する表面因子（莢膜、プロテインＡ）、カロチノイド、カタラーゼ産物、プロテインＡ、コアグラーゼ、凝固因子、および／もしくは真核細胞膜を溶解する膜を損傷する毒素（溶血素、ロイコトキシン、ロイコチジン）（必要に応じて無毒化される）由来の抗原が挙げられる；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ：特に、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ粘液関連抗原（ＳＡＡ）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ：特に、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原の１６０ｋＤａ血球凝集素（尿路感染症を引き起こす）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ：特に、内毒素Ａ、Ｗｚｚタンパク質、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＬＰＳ、より特には、ＰＡＯ１から単離されたＬＰＳ（Ｏ５血清型）、および／または外膜タンパク質（外膜タンパク質Ｆ（ＯｐｒＦ）が挙げられる）（Ｐｒｉｃｅら（２００１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６９（５）：３５１０〜３５１５）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）：例えば、Ａ−成分（致死因子（ＬＦ）および水腫因子（ＥＦ））（その両方は、防御抗原（ＰＡ）として公知の共通のＢ−成分を共有し得る）由来のＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原（必要に応じて、無毒化される）；Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ：（呼吸性）外膜タンパク質抗原（ＨＭＷ−ＯＭＰ）、Ｃ−抗原、および／またはＬＰＳが挙げられる；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（ペスト）：例えば、Ｆ１莢膜抗原（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら（２００３）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７１（１）：３７４〜３８３）、ＬＰＳ（Ｆｉｅｌｄｓら（１９９９）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６７（１０）：５３９５）、ペスト菌Ｖ抗原（Ｈｉｌｌら（１９９７）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６５（１１）：４４７６〜４４８２）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ（胃腸の病原体）：特に、ＬＰＳ（Ｘｕら（２００２）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７０（８）：４４１４〜４４２０）；Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：胃腸の病原体抗原；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：例えば、リポタンパク質、ＬＰＳ、ＢＣＧ抗原、抗原８５Ｂ（Ａｇ８５Ｂ）の融合タンパク質および／または必要に応じて、陽イオン性脂質小胞中に処方されるＥＳＡＴ−６（Ｏｌｓｅｎら（２００４）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７２（１０）：６１４８〜６１５０）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）イソクエン酸デヒドロゲナーゼ関連抗原（Ｂａｎｅｒｊｅｅら（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（３４）：１２６５２〜１２６５７）および／またはＭＰＴ５１抗原（Ｓｕｚｕｋｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．７２（７）：３８２９〜３８３７）；Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ（レジオネラ症）：必要に応じて、分裂したａｓｄ遺伝子を有する細胞株由来のＬ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原（Ｈａｒｂら（１９９８）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６６（５）：１８９８〜１９０３；Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ：外膜タンパク質（外膜タンパク質Ａおよび／またはＢ（ＯｍｐＢ）（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．２００４年１１月１日；１７０２（２）：１４５）を含む）、ＬＰＳ、および表面タンパク質抗原（ＳＰＡ）が挙げられる（Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．１９８９年６月２日、補遺：８１）；Ｅ．ｃｏｌｉ：腸毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸凝集性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＡｇｇＥＣ）、散在性に付着するＥ．ｃｏｌｉ（ＤＡＥＣ）、腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、および／または腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）由来の抗原が挙げられる；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ：プロテイナーゼ抗原、ＬＰＳ、特に、コレラ菌ＩＩのリポ多糖、Ｏ１ Ｉｎａｂａ Ｏ−特異的多糖類、コレラ菌Ｏ１３９、ＩＥＭ１０８ワクチンの抗原（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００３年１０月；７１（１０）：５４９８〜５０４）、および／または閉鎖帯毒素（Ｚｏｔ）が挙げられる；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（腸チフス）：好ましくは、莢膜多糖類結合体（Ｖｉ、すなわち、ｖａｘ−ＴｙＶｉ）が挙げられる；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（胃腸炎）：それ由来の抗原は、微生物治療および癌治療（脈管形成阻害およびｆｌｋの調節が挙げられる）のために企図される；Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（免疫無防備状態または高齢者における全身（ｓｙｔｅｍｉｃ）感染、胎児の感染）：好ましくは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来の抗原は、本発明の結合体／関連組成物の細胞質内送達のためのキャリア／ベクターとして使用される；Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ：特に、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ外膜タンパク質（ＯＭＰ）；Ｔｅｔａｎｕｓ：例えば、好ましくは、破傷風毒素（ＴＴ）抗原は、本発明の組成物との結合／結合体化におけるキャリアタンパク質として使用される；Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ：例えば、ジフテリア毒素、好ましくは、ＣＲＭ１９７、さらにＡＤＰリボシル化を調節、阻害または関連し得る抗原が、本発明の組成物との組み合わせ／同時投与／結合体のために企図され、好ましくは、ジフテリア毒素は、キャリアタンパク質として使用される；Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ライム病）：例えば、Ｐ３９およびｐ１３に関連する抗原（完全な膜タンパク質、（Ｎｏｐｐａら（２００１）Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．６９（５）：３３２３）、ＶｌｓＥ抗原性変化タンパク質（Ｌａｗｒｅｎｚら、（１９９９）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７（１２）：３９９７）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ：例えば、それ由来の糖抗原；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ：例えば、ＯＭＰ（ＯＭＰ Ａが挙げられる）、または必要に応じて、破傷風毒素に結合された多糖類；Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：Ｐｏｒ（またはポーリン（ｐｏｒｉｎ））タンパク質（例えば、ＰｏｒＢ）（Ｚｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）２２：６６０〜６６９を参照のこと）、転移結合タンパク質（例えば、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢ）（Ｐｒｉｃｅら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００４）７１（１）：２７７〜２８３を参照のこと）、不透明タンパク質（例えば、Ｏｐａ）、還元修正タンパク質（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｒｍｐ）、および外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が挙げられる（Ｐｌａｎｔｅら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ（２０００）１８２：８４８〜８５５を参照のこと）、例えば、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ０２／０７９２４３もまた参照のこと）；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：特に、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質抗原；Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：血清型Ａ、Ｂ、ＢａおよびＣ（失明の原因である、トラコーマ因子）、血清型Ｌ１、Ｌ２およびＬ３（性病性リンパ肉芽腫に関連する）、ならびに血清型Ｄ〜Ｋ由来の抗原が挙げられる；Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ（Ｓｙｐｈｉｌｉｓ）：特に、ＴｍｐＡ抗原；およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ（軟性下疳を引き起こす）：外膜タンパク質（ＤｓｒＡ）が挙げられる。
【００９２】
具体的に参照されない場合、本発明の細菌性抗原をコードするさらなる配列は、上記の任意の莢膜抗原、多糖類抗原またはタンパク質抗原であり得る。さらなる細菌性抗原としてはまた、外膜小胞（ＯＭＶ）調製物が挙げられ得る。さらに、抗原としては、生存している型、弱毒化された型、分裂した型、および／または精製された型の任意の上述の細菌が挙げられる。本発明の抗原由来の細菌または微生物は、グラム陰性またはグラム陽性および好気性または嫌気性であり得る。
【００９３】
さらに、任意の上述の細菌由来の糖類（多糖類、ＬＰＳ、ＬＯＳまたはオリゴ糖）は、別の因子または抗原（例えば、キャリアタンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７））に結合され得る。このような結合は、米国特許第５，３６０，８９７号およびＣａｎ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９８４年５月；６２（５）：２７０〜５に提供されるように、糖類上のカルボニル部分の還元的アミノ化によってもたらされる、タンパク質上のアミノ基への直接的な結合であり得る。あるいは、糖類は、リンカー（例えば、コハク酸アミドを有する）またはＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６およびＣＲＣ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、１９９３に提供される他の結合を介して結合され得る。
【００９４】
異種配列はまた、例えば、以下の１種以上のウイルス抗原をコードし得る：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ：完全なウイルス粒子（減弱化された）、分裂、または血球凝集素（ＨＡ）および／もしくはノイラミニダーゼ（ＮＡ）表面タンパク質を含むサブユニットが挙げられ、インフルエンザ抗原は、ニワトリ胚由来であり得るか、または細胞培養で増殖され得、そして／またはインフルエンザ抗原は、特にインフルエンザＡ型、Ｂ型、および／もしくはＣ型由来である；Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）：ＲＳＶのＡ２株のＦタンパク質（Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２００４年１１月；８５（Ｐｔ１１）：３２２９）および／またはＧ糖タンパク質が挙げられる；Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｖｉｒｕｓ（ＰＩＶ）：好ましくは、血球凝集素、ノイラミニダーゼおよび／または融合糖タンパク質を含むＰＩＶ１型、２型および３型が挙げられる；Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ：ピコルナウイルス科のファミリー由来の抗原、好ましくは、ポリオウイルス抗原（例えば、ＯＰＶまたは好ましくはＩＰＶ）が挙げられる；Ｍｅａｓｌｅｓ：必要に応じて、プロトリン（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）およびまたはＭＭＲワクチン中に存在する抗原と組み合わされる分裂麻疹ウイルス（ＭＶ）抗原が挙げられる；Ｍｕｍｐｓ：ＭＭＲワクチンに存在する抗原が挙げられる；Ｒｕｂｅｌｌａ：ＭＭＲワクチンに存在する抗原、およびトガウイルス科（デング熱ウイルスが挙げられる）由来の他の抗原が挙げられる；Ｒａｂｉｅｓ：例えば、凍結乾燥した不活性化ウイルス（ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ｖｉｒｕｓｅｓ：例えば、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デング熱ウイルス（１型、２型、３型または４型）、ダニ媒介脳炎ウイルス、および西ナイルウイルス（およびそれら由来の抗原）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；それ由来の抗原；ＨＩＶ：ＨＩＶ−１株またはＨＩＶ−２株の抗原（例えば、ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ｅｎｖ（ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｒｅｖ ｖｐｕ、ミニタンパク質（好ましくは、ｐ５５ｇａｇおよびｇｐ１４０ｖを取り除く））および単離されたＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、ＨＩＶ−２由来の抗原が挙げられる；数ある中でもサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ：ＶＰ４タンパク質、ＶＰ５タンパク質、ＶＰ６タンパク質、ＶＰ７タンパク質、ＶＰ８タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００４年１２月；３８（２）：２０５）および／またはＮＳＰ４が挙げられる；Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ：例えば、古典的ブタ熱ウイルス、牛ウイルス性下痢症ウイルス、および／またはボーダー病ウイルス由来の抗原；Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：例えば、パルボウイルスＢ１９；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ＳＡＲＳウイルス抗原、特にスパイクタンパク質またはそれら由来のプロテアーゼ、およびＷＯ０４／９２３６０に含まれる抗原が挙げられる；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ：例えば、不活性化ウイルス；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ：例えば、表面および／またはコア抗原（ｓＡｇ）、ならびにプレ表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列、ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前はｐｒｅ−Ｓと呼ばれた）、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）（例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」、ｐｐ．１５９〜１７６；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３〜６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９〜３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ１／Ｅ２（Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１を参照のこと）、ＮＳ３４５ポリタンパク質、ＮＳ３４５−コアポリタンパク質、コア、および／または非構造領域由来のペプチド（国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６）；Ｄｅｌｔａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＨＤＶ）：それら由来の抗原、特にＨＤＶ由来のδ−抗原（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ ｖｉｒｕｓ（ＨＥＶ）；それら由来の抗原；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｇ ｖｉｒｕｓ（ＨＧＶ）；それら由来の抗原；Ｖａｒｃｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ：水疱瘡ウイルス（ＶＺＶ）由来の抗原（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９）；Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ由来の抗原（Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７）；Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ抗原（ｇｂおよびｇＨ）が挙げられる（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）ｐｐ．１２５〜１６９）；Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ：ＨＳＶ−１株またはＨＳＶ−２株由来の抗原ならびに糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨが挙げられる（ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１および米国特許第５，１７１，５６８号）；Ｈｕｍａｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ：他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原；ならびにＨＰＶ：ヒト乳頭腫ウイルス属（ＨＰＶ）（例えば、１つ以上のＥ１〜Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２およびそれらの融合物）に関連するか、それら由来の抗原が挙げられ、特に、本発明の組成物は、Ｌ１主要キャプシドタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含み得、より特にはさらに、ＨＰＶ抗原は、１種以上のＨＰＶ血清型６、１１、１６および／または１８に対して防御性がある。
【００９５】
さらに、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、第４版（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編、２００４）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第４版（Ｍｕｒｒａｙら編、２００２）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）に含まれる抗原、組成物、方法および微生物が提供され、それらは、本発明の組成物と併せて企図される。
【００９６】
さらに、異種配列は、以下の１種以上の真菌抗原をコードし得る：Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓによって引き起こされるトリコピトシス（ｔｒｉｃｈｏｐｙｔｏｓｉｓ）の予防および処置について米国特許第４，２２９，４３４号および同第４，３６８，１９１号；動物（例えば、モルモット、ネコ、ウサギ、ウマおよび子ヒツジ）における皮膚糸状菌感染の予防のための広範囲の皮膚糸状菌ワクチン（これらの抗原は、必要に応じてアジュバントと組み合わされた有効量の死滅させられたＴ．ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ｖａｒ．ｇｒａｎｕｌａｒｅ）、Ｍ．ｃａｎｉｓおよび／またはＭ．ｇｙｐｓｅｕｍの懸濁液を含む）について米国特許第５，２７７，９０４号および同第５，２８４，６５２号；有効量のホモジナイズされて、ホルムアルデヒドで死滅させられた真菌類（すなわち、キャリア中のＭｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ培養物）を含む白癬ワクチンについて米国特許第５，４５３，２７３号および同第６，１３２，７３３号；ピシウム感染症（ｐｙｔｈｉｏｓｉｓ）のための細胞外タンパク質および細胞内タンパク質に関連する米国特許第５，９４８，４１３号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌ワクチンに同定されたさらなる抗原としては、Ｒｉｎｇｖａｃ ｂｏｖｉｓ ＬＴＦ−１３０およびＢｉｏｖｅｔａが挙げられる。
【００９７】
さらに、本明細書中で使用するための真菌抗原は、皮膚糸状菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｒｅｓ）（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ、ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ、ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、および／またはＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅが挙げられる）由来であり得る。
【００９８】
本発明の組成物と併せる抗原または抗原の誘導として使用するための真菌病原体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．、Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ、Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ、およびＳａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐを含む。
【００９９】
抗原が由来する他の菌類としては、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ、Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ、Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ、およびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐが挙げられる。
【０１００】
本明細書中に記載されるような異種配列は、１種以上の腫瘍抗原または癌抗原（糖類含有腫瘍抗原（例えば、糖脂質腫瘍抗原またはガングリオシド腫瘍抗原）が挙げられるが、これらに限定されない）をコードし得る。多数の腫瘍抗原は、当該分野で公知であり、以下が挙げられる：（ａ）癌−精巣抗原（例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１ならびにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥおよびＭＡＧＥファミリーポリペプチド（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６およびＭＡＧＥ−１２）（例えば、これらは、黒色腫、肺、頭部および頚部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、および膀胱の腫瘍を処置するために使用され得る））、（ｂ）変異抗原（例えば、ｐ５３（種々の固形腫瘍（例えば、結腸直腸癌、肺癌、頭部および頚部の癌）に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌および結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ−８（例えば、頭部および頚部の癌に関連する）、ＣＩＡ ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＫＩＡ ０２０５、ＣＤＣ−２７、およびＬＤＬＲ−ＦＵＴ）、（ｃ）過剰発現抗原（例えば、Ｇａｌｅｃｔｉｎ４（例えば、結腸直腸癌に関連する）、Ｇａｌｅｃｔｉｎ９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、種々の白血病に関連する）、カルボニックアンヒドラーゼ（例えば、腎臓癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌および卵巣癌に関連する）、α−フェトプロテイン（例えば、肝臓癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、結腸直腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、膵臓癌および胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（例えば、乳癌および卵巣癌に関連する）、Ｇ−２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳癌および結腸癌に関連する）、および癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌および結腸直腸癌のような胃腸管の癌に関連する））、（ｄ）共有抗原（例えば、黒色腫−メラノサイト分化抗原（例えば、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ Ａ）、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモンレセプター、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質−１／ＴＲＰ１およびチロシナーゼ関連タンパク質−２／ＴＲＰ２（例えば、黒色種に関連する））、（ｅ）前立腺関連抗原（例えば、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２（例えば、前立腺癌に関連する））、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫に関連する）、および（ｇ）他の腫瘍抗原（例えば、ポリペプチド含有抗原および糖類含有抗原（（ｉ）糖タンパク質（例えば、シアリルＴｎおよびシアリルＬｅｘ（例えば、乳癌および結腸直腸癌に関連する）および種々のムチン）；糖タンパク質は、キャリアタンパク質に結合され得る（例えば、ＭＵＣ−１は、ＫＬＨに結合され得る）；（ｉｉ）リポポリペプチド（例えば、ＭＵＣ−１は、脂質部分に結合する）；（ｉｉｉ）多糖類（例えば、Ｇｌｏｂｏ Ｈ合成ヘキササッカリド）（これは、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合され得る）；（ｉｖ）ガングリオシド（例えば、ＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３（例えば、脳腫瘍、肺癌、黒色種に関連する））（これもまた、キャリアタンパク質（例えば、ＫＬＨ）に結合され得る）が挙げられる）。
【０１０１】
当該分野で公知であるさらなる腫瘍抗原としては、ｐ１５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原（Ｅ６およびＥ７が挙げられる）、Ｂ型肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞白血病ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３Ｈ１、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳなどが挙げられる。これらおよび他の細胞成分は、例えば、米国特許出願第２００２０００７１７３号およびその中に引用される参考文献に記載されている。
【０１０２】
癌抗原または腫瘍抗原についてのさらなる情報は、例えば、Ｍｏｉｎｇｅｏｎ Ｐ、「Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、２００１、１９：１３０５〜１３２６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１１：３８０〜３８４；Ｄｅｒｍｉｎｅ，Ｓら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、２００２、６２、１４９〜１６２；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ Ｉ．、「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、２００２、７（補遺３）：２０〜３３；Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｄ．ら、「Ｒａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３、２３：３〜２９；Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ Ｂら、「Ｎｅｗ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔｃｅｌｌｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、７：６７４〜８１；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９９７、１８：１７５〜８２；Ｏｆｆｒｉｎｇａ Ｒら、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、２：５７６〜５８２；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＳＡ、「Ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、１０：２８１〜７；Ｓａｈｉｎ Ｕら、「Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、９：７０９〜１６；Ｏｌｄ ＬＪら、「Ｎｅｗ ｐａｔｈｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｓｅｒｏｌｏｇｙ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８７：１１６３〜７；Ｃｈａｕｘ Ｐら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＧＥ−３ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｂｙ ＨＬＡ−ＤＲ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＣＤ４（＋）Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１８９：７６７〜７８；Ｇｏｌｄ Ｐら、「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９６５、１２２：４６７〜８；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ」：Ｒａｔｉｏｎａｌｅ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９９７、４５：１〜６；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ ＰＯら、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｄｕｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｌａｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、１９９７、４５：１０〜９；Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ Ｊ、「Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｕｃｉｎｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１９９７、１８：１０５〜７；Ｚｈａｏ Ｘ−Ｊら、「ＧＤ２ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ：ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８２：６７〜７４；Ｔｈｅｏｂａｌｄ Ｍら、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐ５３ ａｓ ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２：１１９９３〜７；Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ Ｇ、「Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｔａｎｔ ｒａｓ：ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６、２：３〜９；ＷＯ９１／０２０６２；米国特許第６，０１５，５６７号；ＷＯ０１／０８６３６；ＷＯ９６／３０５１４；米国特許第５，８４６，５３８号；および米国特許第５，８６９，４４５号に見出され得る。
【０１０３】
（処方物）
本明細書中に記載されるこれらの分子を使用して、生成される配列、ベクターおよび粒子を含む薬学的組成物（例えば、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、またはレシピエントと組み合わせた改変された５’増幅配列を含むヘルパー構築物を使用して生成されるαウイルスレプリコン粒子の集団）もまた提供される。
【０１０４】
本明細書中に記載される組成物は、種々の賦形剤、アジュバント、キャリア、補助物質、調節因子などを含み得る。上記のように、本発明の組成物はまた、個々または組み合わせて液体または賦形剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど）、および物質（例えば、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤）を含み得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な議論は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版 ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において得られる。
【０１０５】
薬学的に受容可能な塩（例えば、無機塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩）および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩））もまた、本発明の組成物に使用され得る。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知の他のタンパク質である。
【０１０６】
特定の実施形態において、本明細書中に記載される組成物（例えば、粒子）は、未精製または精製された形態のいずれかで保存され得、その組成物はまた、例えば、米国特許第６，０１５，６８６号に詳細に記載されるように、凍結乾燥、噴霧乾燥またはエバポレートされ得る。
【０１０７】
上記のように、本明細書中に記載される処方物はさらに、他の免疫調節性因子を含み得るか、または他の免疫調節性因子と併せて投与され得る。特に、組成物は、通常、アジュバントを含む。本発明で使用するためのアジュバントとしては、以下に示す１種以上が挙げられるが、これらに限定されない：
（無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な無機質含有組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、無機塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、硫酸塩など）（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．．．の第８章および第９章（１９９５）版、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ．ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍ．を参照のこと）、または異なる無機化合物の混合物（例えば、リン酸塩および水酸化物アジュバントの混合物、必要に応じて、過剰のリン酸塩との混合物）を含み、上記組成物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして、塩への吸着が好ましい。上記無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として処方され得る（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１０８】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋が、用量あたり０．２ｍｇと１．０ｍｇとの間の用量であるように、本発明のワクチンに含まれ得る。
【０１０９】
１つの実施形態において、アルミニウムベースのアジュバントは、ミョウバンを含むリン酸緩衝液中の抗原を混合し、その後、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウム）での滴定および沈殿によってインサイチュで形成されるように、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２））、またはミョウバン誘導体である。
【０１１０】
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するための別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）（これは、優れた吸着質であり、約５００ｍ２／ｇの表面積を有する）である。あるいは、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはアルミニウムヒドロキシホスフェート（水酸化アルミニウムアジュバントのいくつかまたは全ての水酸基の代わりにリン酸基を含む）が、提供される。本明細書中に提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性培地、塩基性培地および中性培地において非晶質および可溶性である。
【０１１１】
別の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのより特定の実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムより多い量のリン酸アルミニウム（例えば、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの重量で、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または９：１より大きい比）を有する。さらにより特定には、ワクチン中のアルミニウム塩は、ワクチン用量当たり０．４ｍｇ〜１．０ｍｇ、ワクチン用量当たり０．４ｍｇ〜０．８ｍｇ、またはワクチン用量当たり０．５ｍｇ〜０．７ｍｇ、またはワクチン用量当たり約０．６ｍｇで存在する。
【０１１２】
一般に、好ましいアルミニウムベースのアジュバント、または多数のアルミニウムベースのアジュバントの比（例えば、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウム）は、抗原が、所望のｐＨにおけるアジュバントと反対の電荷を保有するように、分子間の静電引力の最適化によって選択される。例えば、リン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームに吸着するが、アルブミンに吸着しない。アルブミンが標的であるならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ １１．４）。あるいは、より低い等電点のリン酸塩を用いる水酸化アルミニウムの前処理は、水酸化アルミニウムを、より塩基性の抗原についての好ましいアジュバントにさせる。
【０１１３】
（Ａ．油エマルジョン）
アジュバントとしての使用のために適切な油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン（例えば、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０および０．５％Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子に処方される））が挙げられる。ＷＯ９０／１４８３７を参照のこと。Ｐｏｄｄａ、「Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３〜２６８０；Ｆｒｅｙら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ ａｄｕｌｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４〜４２３７もまた、参照のこと。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤＴＭインフルエンザウイルス三価サブユニットワクチンにおけるアジュバントとして使用される。
【０１１４】
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するための特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油エマルジョンである。本明細書中に使用するための好ましいサブミクロン水中油エマルジョンは、スクアレン／水エマルジョンであり、必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（例えば、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％Ｓｐａｎ ８５ＴＭ（ソルビタントリオレート）、および必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロン水中油エマルジョン）を含むサブミクロン水中油エマルジョン）を含む（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５、ｐｐ．２７７〜２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、および０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５ＴＭならびに必要に応じて、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を使用してサブミクロン粒子に処方される。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量および最も好ましくは、０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。本明細書中に使用される場合、用語「ＭＦ５９−０」とは、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロン水中油エマルジョンをいうが、用語「ＭＦ５９−ＭＴＰ」とは、ＭＴＰ−ＰＥを含む処方物を意味する。例えば、「ＭＦ５９−１００」は、用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥなどを含む。ＭＦ６９（本明細書中に使用するための別のサブミクロン水中油エマルジョン）は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、および０．７５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５ＴＭならびに必要に応じて、ＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに別のサブミクロン水中油エマルジョンは、ＳＡＦとしてもまた公知のＭＦ７５であり、１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ ８０ＴＭ、５％プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ）ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、これもまたサブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰ（例えば、用量あたり１００μｇ〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥ）を含むＭＦ７５処方物を意味する。
【０１１５】
組成物中に使用するためのサブミクロン水中油エマルジョン、それを作製する方法および免疫刺激因子（例えば、ムラミルペプチド）は、国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７および米国特許第６，２９９，８８４号および同第６，４５１，３２５号に詳細に記載されている。
【０１１６】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、本発明のアジュバントとして使用され得る。
【０１１７】
（Ｂ．サポニン処方物）
サポニン処方物もまた、アジュバントとして使用される。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえ見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ（モリナの木（Ｍｏｌｉｎａ ｔｒｅｅ））の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ根（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から商業的に得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）および液体処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。
【０１１８】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製されている。これらの技術を用いて、特定の精製画分が同定され、これらの画分としては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、米国特許第５，０５７，５４０号に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含み得る（ＷＯ９６／３３７３９を参照のこと）。
【０１１９】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが、使用され得、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る。ＩＳＣＯＭとしてはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、上記ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９にさらに記載されている。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは、さらなる洗剤を含まなくてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照のこと。
【０１２０】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、Ｂａｒｒら、「ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７〜２７１に見られ得る。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、「Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１〜３３８もまた、参照のこと。
【０１２１】
（Ｃ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ））
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般に、必要に応じてリン脂質と組み合わされるかまたはリン脂質とともに処方されたウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは、一般に、非病原性、非複製性であり、そして、一般に、あらゆる天然ウイルスゲノムを含まない。上記ウイルスタンパク質は、ウイルス全体から、組換え的に生成さ得るかまたは単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために適切なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１およびＮｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３〜２８０；Ｌｅｎｚら、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６〜５３５５；Ｐｉｎｔｏら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６ Ｌ１ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ−１６ Ｌ１ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７〜３３８；およびＧｅｒｂｅｒら、「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｒｉｓｕ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２〜４７６０においてさらに議論されている。ビロソームは、例えば、Ｇｌｕｃｋら、「Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０〜Ｂ１６においてさらに議論されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、鼻腔内三価ＩＮＦＬＥＸＡＬＴＭ製品｛ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ２０補遺５：Ｂ１７〜２３｝およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳＴＭ製品においてサブユニット抗原送達システムとして使用される。
【０１２２】
（Ｄ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、以下のような細菌誘導体または微生物誘導体が挙げられる：
（１）腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の無毒性誘導体
このような誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５または６アシル化鎖との混合物である。３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」形態は、ＥＰ０ ６８９ ４５４に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小さい粒子」は、０．２２ミクロンのメンブレンを通って滅菌濾過されるのに充分小さい（ＥＰ０ ６８９ ４５４を参照のこと）。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ９：２２７３〜２２７８を参照のこと。
【０１２３】
（２）リピドＡ誘導体
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、「ＯＭ−１７４，ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２〜３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：２４８５〜２４９１；およびＰａｊａｋら、「Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６〜８４２に記載されている。
【０１２４】
（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのホスフェート結合により連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む、細菌の二本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１２５】
ＣｐＧは、ヌクレオチド改変体／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変体）を含み得、そして、二本鎖または一本鎖であり得る。必要に応じて、グアノシンは、アナログ（例えば、２’−デオキシ−７−デアザグアノシン）と置換され得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１（９）：２３９３〜２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３（例えば、可能なアナログ置換）を参照のこと。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ、「ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１〜８３５；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ」、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９〜１８５；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；同第６，２３９，１１６号および同第６，４２９，１９９号において、さらに考察されている。
【０１２６】
このＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ）は、ＴＬＲ９に導かれ得る。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ３）：６５４〜６５８を参照のこと。このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ）は、Ｔｈ１免疫応答誘導に特異的であってもよく、または、このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮ）は、Ｂ細胞応答誘導に、より特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、「ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１〜４０６８；Ｋｒｉｅｇ、「Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４〜６５およびＷＯ０１／９５９３５において考察されている。好ましくは、このＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。
【０１２７】
好ましくは、このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５'末端がレセプター認識のために接近可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３'末端で結合されて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８〜９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６６４〜６５８；Ｂｈａｇａｔら、「ＣｐＧ ｐｅｎｔａ− ａｎｄ ｈｅｘａ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３〜８６１およびＷＯ０３／０３５８３６を参照のこと。
【０１２８】
（４）ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体
細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ由来（「ＣＴ」）または百日咳由来（「ＰＴ」）である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、ＷＯ９５／１７２１１に記載されており、そして、非経口的アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、ＷＯ９８／４２３７５に記載されている。好ましくは、このアジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴＲ１９２Ｇ）である。ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献において見出され得る：Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎａｈｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２〜３０１９；Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４〜２５４１；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２，ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４〜５）：４５５〜４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６〜５３１３；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０〜６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴＫ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒｅｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９〜２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５〜２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）」Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１〜３）：２６３〜２７０。アミノ酸置換についての多くの参考文献は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５〜１１６７に記載のＡＤＰ−リボシル化トキシンのＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。
【０１２９】
（Ｆ．生体接着因子および粘膜接着因子）
生体接着因子および粘膜接着因子もまた、アジュバントとして使用され得る。適切な生体接着因子としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７〜２７６）または粘膜接着因子（例えば、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、アジュバントとして使用され得る。例えば、ＷＯ９９／２７９６０を参照のこと。
【０１３０】
（Ｇ．微粒子）
微粒子もまた、アジュバントとして使用され得る。生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）と、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とから形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて処理されて、（例えば、ＳＤＳによって）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）によって）正に荷電した表面を有する。
【０１３１】
（Ｈ．リポソーム）
アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム処方物の例は、米国特許第６，０９０，４０６号、同第５，９１６，５８８号、ＥＰ０ ６２６ １６９に記載されている。
【０１３２】
（Ｉ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本明細書中に記載される免疫原性組成物とともに使用するために適切なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。ＷＯ９９／５２５４９。このような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、ならびに少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）をさらに含む。
【０１３３】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１３４】
（Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（１〜３）：１０９〜１１５およびＰａｙｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１（３）：１８５〜１９６において記載されている。
【０１３５】
（Ｋ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１'，２'−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１３６】
（Ｌ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、Ｓｔａｎｌｅｙ、「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１〜５７７；Ｊｏｎｅｓ、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４〜２１８；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号、同第５，３８９，６４０号、同第５，２６８，３７６号、同第４，９２９，６２４号、同第５，２６６，５７５号、同第５，３５２，７８４号、同第５，４９４，９１６号、同第５，４８２，９３６号、同第５，３４６，９０５号、同第５，３９５，９３７号、同第５，２３８，９４４号および同第５，５２５，６１２号にさらに記載される、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄおよびそのアナログが挙げられる。
【０１３７】
（Ｍ．チオセミカルバゾン化合物）
チオセミカルバゾン化合物の例、ならびに処方、製造、および本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な全ての化合物をスクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６０３０８に記載されるものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に効果的である。
【０１３８】
（Ｎ．トリプタンスリン（ｔｒｙｐｔａｎｔｈｒｉｎ）化合物）
トリプタンスリン化合物の例、ならびに処方、製造、および本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な全ての化合物をスクリーニングする方法は、ＷＯ０４／６４７５９に記載されるものが挙げられる。トリプタンスリン化合物は、特に、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激に効果的である。
【０１３９】
本発明はまた、上記に同定した１種以上のアジュバントの局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：
（１）サポニンおよび水中油エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒素ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照のこと）
（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒素ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（欧州特許出願第０８３５３１８号、同第０７３５８９８号および同第０７６１２３１号を参照のこと）；
（６）サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされるか、大きい粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかである、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ；
（７）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群由来の１種以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ免疫化学）；および
（８）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＰＭＬ）；
（９）１種以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１４０】
（Ｏ．ヒト免疫調節因子）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なヒト免疫調節因子としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子）が挙げられる。
【０１４１】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用のインフルエンザワクチンとの使用のために好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着因子は、粘膜送達ワクチン（例えば、鼻のワクチン）との使用のために好ましいアジュバントである。
【０１４２】
上記で引用した特許、特許出願および論文の記事の全ての内容は、本明細書中に完全に記載される場合、参考として援用される。
【０１４３】
（キット）
本明細書中に記載される組成物はまた、キット（例えば、本明細書中に記載されるヘルパー構築物またはパッケージング細胞株を含むキット）として提供され得る。この組成物の１種以上は、キットへのパッケージングのために凍結乾燥および／または噴霧乾燥され得る。この成分は、単一の組成物として提供され得るか、または別々に提供され得る。さらに、この組成物は、それらが、粘膜投与に適切であるように、使用前に再構成され得る。
本明細書中に記載されるキットはさらに、さらなる成分（例えば、シリンジ、再構成溶液、取扱い説明書など）を含み得る。
【０１４４】
以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために含まれる。さらに、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を提供し、それらの範囲に限定することを意図しない。さらに、本明細書中の値の範囲の列挙は、単に、その範囲内の各々の別の値に関して個々に参照する簡潔な方法を与えることを意図し、本明細書中で他に指示しない限り、各々の個々の値は、本明細書中に個々に列挙されるように、明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示しない限り、または文脈で明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中に提供される任意および全ての実施例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、単に、本発明をより良く例示することを意図し、本発明、そうでなければ特許請求の範囲の範囲の限定を示していない。明細書中にない言語は、本発明の実施に関して本質的に特許請求されない要素を示すものと解釈されるべきである。
【０１４５】
本明細書中に開示される本発明の代替のエレメントまたは実施形態の群は、限定として解釈されるべきではない。各群の部分は、個々または本明細書中に見出される群の他の部分あるいは他のエレメントとの任意の組み合わせで参照され得、そして特許請求され得る。群の１つ以上の部分が、便宜および／または特許性の理由のために、群に包含され得るか、または群から削除され得ることが予想される。任意のこのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を本明細書中に含むと判断され、それによって、添付の特許請求の範囲に使用される全てのマーカッシュ群の記載された説明を満たす。
【０１４６】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書中に記載され、本発明を実施するために発明者らが知るところの最良の様式を包含する。もちろん、これらの好ましい実施形態についての変更は、上記の説明を読むと、当業者に明白である。本発明者らは、適切な変更を当業者が使用することを予想し、本発明者らは、本発明が、本明細書中に具体的に記載されるより別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用可能な法によって容認されるように、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の内容の全ての改変および等価物を包含する。さらに、それらの全ての可能な変更における上記のエレメントの任意の組み合わせが、本明細書中で他に指示しない限り、または文脈で明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１：改変された５'増幅配列の調製）
ｔＲＮＡａｓｐの５'領域を、推定ＳＩＮパッケージングシグナルを用いて整列させて、高ホモロジーの領域を同定した（図２）。特に、推定ＳＩＮパッケージングシグナルのヌクレオチド１０２９〜１０５０によって規定された領域（ヌクレオチド９４５〜１０７６として特定の参考文献で記載した）は、ｔＲＮＡａｓｐ増幅配列の残基３７〜５９に対して８０％より高いホモロジー（２２ヌクレオチドのうちの１８）を示した。
【０１４８】
ｍｆｏｌｄプログラム（Ｚｕｃｋｅｒら）を使用して、野生型ｔＲＮＡａｓｐの二次構造を、予測した（図４Ａおよび図４Ｂ）。変異を、ヘルパーｔＤＨ−ＨＲｃａｐ（ｔＤＨ骨格に挿入されたＳＩＮ ＨＲ株由来のキャプシド遺伝子、ＷＯ０２／０９９０３５を参照のこと）およびｔＤＨ−ＶｕｔｒＳＧｌｙ（ＷＯ０２／０９９０３５；Ｐｅｒｒｉら、（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７７（１９）：１０３９〜４０３）に含まれるｔＲＮＡ構造に導入した。具体的には、この変異を、特定部位の突然変異誘発によってＳＩＮパッケージングシグナルに対するホモロジーの領域内に導入して、一次ヌクレオチド配列を変化させたが、野生型ｔＲＮＡＡＳＰの二次構造と類似の完全な二次構造を維持した。改変された５'配列は図３に示され、これらの改変された配列を含むヘルパー構築物を、ｔＭＯＤ−ＨＲｃａｐおよびｔＭＯＤ−ＶｕｔｒＳＧｌｙと呼んだ。改変された５'増幅配列を図３に示す。
【０１４９】
（実施例２：改変された５'増幅配列を有する構造カセットを使用するαウイルスレプリコン粒子のパッケージング）
ｍｏｄ＃１に指定された改変された５'増幅配列を、実施例１に記載されるように生成し、ＧＦＰ発現レプリコンベクター（本質的にＧａｒｄｎｅｒら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４（２４）：１１８４９〜１１８５７に記載されるように）をパッケージするために使用した。
【０１５０】
改変されたヘルパー、レプリコンをコードするプラスミドＳＩＮＣＲ−ＧＦＰ、野生型ｔＲＮＡまたは単一の制限酵素ＰｍｅＩおよびＲＮＡを用いて直線化された改変された配列の両方を有するヘルパーの機能性を試験するために、インビトロで転写した。レプリコンＲＮＡを、ＳＩＮキャプシドおよび表１に記載されるような構築物由来の糖タンパク質をコードする不完全なヘルパーＲＮＡとともに同時トランスフェクトした。
【０１５１】
トランスフェクトされた細胞を、培養上清を回収し、遠心分離によって清澄にし、連続希釈した時間に３４℃で２４時間インキュベートし、約１４時間ナイーブＢＨＫ−２１細胞を感染させるために使用した。フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）粒子力価を使用して、測定した。結果を表１に示す。
【０１５２】
【表１】
この粒子をまた、それらの感染性およびナイーブ細胞の感染に対する新しい粒子を生成する能力について試験し、不完全なヘルパー同時パッケージングを測定する。高ＭＯＩ感染にて、改変された増幅配列を含む構築物を使用して生成された粒子は、改変されていない増幅配列を含む構築物を使用して生成された粒子より非常に効果的にナイーブ細胞に感染した。従って、改変された５'増幅配列を含む構造カセットを使用して生成された粒子は、少数の不全型の粒子を含んだ。
【０１５３】
さらに、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、改変された５'増幅配列を含む構造カセットを使用して生成された粒子は、改変されていない増幅配列を使用して生成された粒子と比較して少なくとも１０倍少ない同時パッケージされた粒子を有する。
【０１５４】
最後に、ｔＲＮＡ構造を含む少なくとも１つのヘルパーを用いて生成された粒子の感染性を、改変された５'配列を含むヘルパーで調製した粒子の感染性と比較した。ナイーブ細胞を、４５分間３７℃で種々のＭＯＩ（０．５、１、５および１０）にて感染させた。次いで、この細胞を洗浄して、一晩、培地中でインキュベートした。感染された細胞の数を、感染の１６時間後に、ＦＡＣＳによって評価した。図６に示すように、改変されたヘルパーを用いて調製された粒子で感染された細胞の数は、ＭＯＩを増加するにつれて、増加するが、１つのｔＲＮＡを有するヘルパー由来の粒子で感染された細胞の数は、比較的低いＭＯＩ＝１にて一定状態に達する。この結果は、ｔＲＮＡを有するヘルパー由来の粒子調製物が、感染細胞と競合する多くの不全型の粒子を有することを示唆し、それによって、測定可能な感染性（例えば、ＧＦＰポジティブ細胞の割合）は、初期に一定状態に達する。対照的に、改変されたヘルパー由来の粒子は、減少した数の不全型の粒子を有し、感染された細胞の数は、Ｍ．Ｏ．Ｉの範囲にわたって増加する。
【０１５５】
従って、不完全なパッケージングシグナルである、改変された増幅配列を含む構造的ヘルパー構築物を使用することは、同時パッケージングを顕著に減少するが、レプリコン粒子を効果的にパッケージングする。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態は、ある程度詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに明らかな変更がなされ得ることが、理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】図１は、αウイルスレプリコン粒子を産生するための、複合的な構築物システムの模式図である。レプリコンベクターは、５’末端および３’末端シス複製配列、αウイルス非構造遺伝子、サブゲノムの接合領域（ＪＲ）プロモーターおよび目的の異種遺伝子（ＧＯＩ）を含む。示される構造タンパク質発現カセット（不完全なヘルパー）は、シス作用性ｔＲＮＡ−アスパラギン（ｔＲＮＡａｓｐまたはｔＲＮＡＡｓｐ）５’増幅配列、サブゲノムの接合領域（ＪＲ）プロモーター、３’末端シス複製配列およびキャプシドタンパク質をコードする配列または糖タンパク質をコードする配列を含む。
【図２】図２は、推定シンドビス（ＳＩＮ）パッケージングシグナル（配列番号１）の一部とｔＲＮＡＡｓｐ５’配列（配列番号２）とのアラインメントを示す。最下行は、コンセンサス配列（配列番号３）を示し、ＳＩＮゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００１５４７）の、おおよそヌクレオチド１０２９からヌクレオチド１０５０に及ぶ、相同性の高い領域を示す。
【図３】図３は、改変されていないｔＲＮＡ５’配列（配列番号２）と種々の例示的な改変されたｔＲＮＡ配列（配列番号４〜１５）とのアラインメントを示す。野生型ｔＲＮＡａｓｐ配列について、改変されるヌクレオチドに下線を引いた。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、改変されていない５’増幅配列および改変された５’増幅配列により形成される二次構造の模式図である。図４Ａは、改変されていない（野生型）のｔＲＮＡａｓｐ（配列番号２）の二次構造を示し、図４Ｂは、例示的な改変された５’増幅配列（ｍｏｄ＃１と称される）（配列番号４）の二次構造を示す。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、粒子へのヘルパー構築物の同時パッケージングを示すグラフであり、改変された５’増幅配列が、改変された配列を含むヘルパー構築物の同時パッケージングを効果的に減少させながら、粒子の収量に最小限の影響しか与えないことを示す。図５Ａは、感染の多重度２（ＭＯＩ ２）における結果を示す。図５Ｂは、ＭＯＩ ４における結果を示す。
【図６】図６は、改変された増幅配列（明灰色）または改変されていないｔＲＮＡ配列（暗灰色）のいずれかを含む構造カセット（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を使用して作製された粒子の感染性を示すグラフである。ＭＯＩは、横軸に沿って示される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された５’増幅配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該改変された配列は、ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記改変された５’増幅配列が、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約８０％の同一性を示す配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記改変された５’増幅配列が、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルスではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ配列からなる群から選択される配列由来である、請求項１、請求項２または請求項３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記改変された増幅配列が、合成物である、請求項１、請求項２または請求項３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の５’増幅配列を含む、ＲＮＡベクター構築物。
【請求項７】
αウイルス接合領域プロモーターをコードする核酸配列；１つ以上のαウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列；およびＲＮＡポリメラーゼ認識配列をさらに含む、請求項５に記載のベクター構築物。
【請求項８】
選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項７に記載のベクター構築物。
【請求項９】
前記ベクターが、必ずしも生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質をコードしない、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１０】
前記αウイルスの構造タンパク質が、糖タンパク質Ｅ２および糖タンパク質Ｅ１である、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１１】
前記αウイルスの構造タンパク質が、キャプシドタンパク質である、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１２】
前記配列が、２種以上のαウイルスに由来する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のベクター構築物。
【請求項１３】
核酸分子に作動可能に連結された５’プロモーターを含む、αウイルスベクター構築物であって、該核酸分子は、請求項６〜１２に記載のＲＮＡベクターに相補的なＤＮＡである、αウイルスベクター構築物。
【請求項１４】
転写終結を制御する３’配列をさらに含む、請求項１３に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１５】
前記５’プロモーターが、真核生物のプロモーターである、請求項１４に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１６】
前記５’プロモーターが、原核生物のプロモーターである、請求項１４に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれか１項に記載のαウイルスベクター構築物を含む、細胞。
【請求項１８】
宿主細胞と、１つ以上の請求項６〜１３のいずれか１項に記載のαウイルスベクターとを含む、αウイルスパッケージング細胞株。
【請求項１９】
感染性かつ不完全なαウイルス粒子を産生するためのヘルパー細胞であって、該細胞は、
αウイルスレプリコンベクター；および
該レプリコンベクターに存在しない該αウイルスの構造タンパク質をコードする、１つ以上の個別のヘルパー構築物、をαウイルス許容性細胞中に含み、
少なくとも１つの該個別のヘルパー構築物は、請求項１〜５に記載の改変された５’増幅配列を含み、
さらに、該レプリコンベクターと該個別のヘルパーベクターとの組み合わせた発現は、１つ以上の異種配列を含む構築されたαウイルス粒子を産生し、該αウイルス粒子は、細胞に感染し得、かつウイルス複製を完結し得ない、ヘルパー細胞。
【請求項２０】
２つの個別のヘルパー構築物を含む請求項１９に記載のヘルパー細胞であって、ここで、第一のヘルパー構築物はαウイルスキャプシドタンパク質をコードし、第二のヘルパー構築物はαウイルス糖タンパク質をコードする、ヘルパー細胞。
【請求項２１】
前記１つ以上の個別のヘルパー構築物の全てが、改変された５’増幅配列を含む、請求項１９または請求項２０に記載のヘルパー細胞。
【請求項２２】
請求項１９〜２１に記載のヘルパー細胞であって、該ヘルパー細胞が、前記αウイルスレプリコンベクターと前記１つ以上の個別のヘルパー構築物とによってトランスフェクトされる、ヘルパー細胞。
【請求項２３】
感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１９〜２２に記載のヘルパー細胞を提供する工程；
（ｂ）該ヘルパー細胞中で該αウイルス粒子を産生させる工程；および
（ｃ）該ヘルパー細胞から産生された該αウイルス粒子を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法にしたがって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む組成物であって、該組成物は、検出可能な複製能のあるαウイルス粒子を含まない、組成物。
【請求項２５】
薬学的に受容可能なキャリア中に、請求項２３に記載の方法によって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む、薬学的処方物。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変された５’増幅配列を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）公知の５’増幅配列とウイルスパッケージングシグナルを含む配列との間の配列相同性の領域を決定する工程；および
（ｂ）該ウイルスパッケージングシグナルを含む配列への相同性が減らされるが、増幅機能は維持されるように、該公知の５’増幅配列の一次配列を改変し、それによって改変された５’増幅配列を作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記公知の５’増幅配列が、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルスの５’末端、αウイルスではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ配列からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項１】
改変された５’増幅配列を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、該改変された配列は、ポジティブ鎖αウイルスＲＮＡの合成のための認識部位を提供するが、ＲＮＡパッケージングのための認識部位を提供しない、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、ＲＮＡである、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記改変された５’増幅配列が、配列番号４〜１６のいずれかに対し少なくとも約８０％の同一性を示す配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記改変された５’増幅配列が、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルス５’配列、αウイルスではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ配列からなる群から選択される配列由来である、請求項１、請求項２または請求項３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記改変された増幅配列が、合成物である、請求項１、請求項２または請求項３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の５’増幅配列を含む、ＲＮＡベクター構築物。
【請求項７】
αウイルス接合領域プロモーターをコードする核酸配列；１つ以上のαウイルスの構造タンパク質をコードする核酸配列；およびＲＮＡポリメラーゼ認識配列をさらに含む、請求項５に記載のベクター構築物。
【請求項８】
選択可能なマーカーをコードする核酸配列をさらに含む、請求項７に記載のベクター構築物。
【請求項９】
前記ベクターが、必ずしも生物学的に活性なαウイルス非構造タンパク質をコードしない、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１０】
前記αウイルスの構造タンパク質が、糖タンパク質Ｅ２および糖タンパク質Ｅ１である、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１１】
前記αウイルスの構造タンパク質が、キャプシドタンパク質である、請求項７または請求項８に記載のベクター構築物。
【請求項１２】
前記配列が、２種以上のαウイルスに由来する、請求項６〜１１のいずれか１項に記載のベクター構築物。
【請求項１３】
核酸分子に作動可能に連結された５’プロモーターを含む、αウイルスベクター構築物であって、該核酸分子は、請求項６〜１２に記載のＲＮＡベクターに相補的なＤＮＡである、αウイルスベクター構築物。
【請求項１４】
転写終結を制御する３’配列をさらに含む、請求項１３に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１５】
前記５’プロモーターが、真核生物のプロモーターである、請求項１４に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１６】
前記５’プロモーターが、原核生物のプロモーターである、請求項１４に記載のαウイルスベクター構築物。
【請求項１７】
請求項６〜１６のいずれか１項に記載のαウイルスベクター構築物を含む、細胞。
【請求項１８】
宿主細胞と、１つ以上の請求項６〜１３のいずれか１項に記載のαウイルスベクターとを含む、αウイルスパッケージング細胞株。
【請求項１９】
感染性かつ不完全なαウイルス粒子を産生するためのヘルパー細胞であって、該細胞は、
αウイルスレプリコンベクター；および
該レプリコンベクターに存在しない該αウイルスの構造タンパク質をコードする、１つ以上の個別のヘルパー構築物、をαウイルス許容性細胞中に含み、
少なくとも１つの該個別のヘルパー構築物は、請求項１〜５に記載の改変された５’増幅配列を含み、
さらに、該レプリコンベクターと該個別のヘルパーベクターとの組み合わせた発現は、１つ以上の異種配列を含む構築されたαウイルス粒子を産生し、該αウイルス粒子は、細胞に感染し得、かつウイルス複製を完結し得ない、ヘルパー細胞。
【請求項２０】
２つの個別のヘルパー構築物を含む請求項１９に記載のヘルパー細胞であって、ここで、第一のヘルパー構築物はαウイルスキャプシドタンパク質をコードし、第二のヘルパー構築物はαウイルス糖タンパク質をコードする、ヘルパー細胞。
【請求項２１】
前記１つ以上の個別のヘルパー構築物の全てが、改変された５’増幅配列を含む、請求項１９または請求項２０に記載のヘルパー細胞。
【請求項２２】
請求項１９〜２１に記載のヘルパー細胞であって、該ヘルパー細胞が、前記αウイルスレプリコンベクターと前記１つ以上の個別のヘルパー構築物とによってトランスフェクトされる、ヘルパー細胞。
【請求項２３】
感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）請求項１９〜２２に記載のヘルパー細胞を提供する工程；
（ｂ）該ヘルパー細胞中で該αウイルス粒子を産生させる工程；および
（ｃ）該ヘルパー細胞から産生された該αウイルス粒子を収集する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法にしたがって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む組成物であって、該組成物は、検出可能な複製能のあるαウイルス粒子を含まない、組成物。
【請求項２５】
薬学的に受容可能なキャリア中に、請求項２３に記載の方法によって産生された、感染性かつ複製に欠陥のあるαウイルス粒子を含む、薬学的処方物。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の改変された５’増幅配列を作製する方法であって、該方法は、
（ａ）公知の５’増幅配列とウイルスパッケージングシグナルを含む配列との間の配列相同性の領域を決定する工程；および
（ｂ）該ウイルスパッケージングシグナルを含む配列への相同性が減らされるが、増幅機能は維持されるように、該公知の５’増幅配列の一次配列を改変し、それによって改変された５’増幅配列を作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記公知の５’増幅配列が、天然αウイルス５’配列、非天然ＤＩαウイルスの５’末端、αウイルスではないウイルス配列および細胞ＲＮＡ配列からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００８−５０００４４（Ｐ２００８−５０００４４Ａ）
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１５２１２（Ｐ２００７−５１５２１２）
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８９０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６０３２
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月２０日（２００５．５．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１７８９０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７６０３２
【国際公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】
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